VOLBA OPTIMÁLNÍ METODY Jak nalézt z velkého množství metod nejlepší („fit for purpose“) postup?
„Jak na to?“ 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Identifikovat problém – požadovaná informace (kvalitativní či kvantitativní analýza, …). Nalézt faktory, které je nutné posuzovat (kritéria: jaká přesnost, správnost, …). Identifikace interferencí. Volba metody (vyhledání vhodných metod v literatuře, normách, modifikace existujících metod). Provedení validace metody. Volba strategie vzorkování.
1
Zvažované faktory I PŘESNOST a SPRÁVNOST – obvykle nejsou limitujícím faktorem pro stopovou analýzu. Důležitou roli hrají u výsledků blízko limitní hodnoty. MEZ DETEKCE A STANOVITELNOSTI – důležité zejména u stopové analýzy. Mez detekce by měla být 10x menší než běžně analyzované koncentrace. Naopak nehrají roli u analýzy makrosložek. CITLIVOST – míra schopnosti metody rozlišit dva vzorky – směrnice kalibrační přímky. PRACOVNÍ ROZSAH ROZSAH OPERACÍ, POŽADOVANÉ VYBAVENÍ
Zvažované faktory II RYCHLOST ANALÝZY CENA ANALÝZY BEZPEČNOST – radiochemické analýzy a experimenty, toxická rozpouštědla, KCN, klinické a biologické vzorky, … ROBUSTNOST – necitlivost metody na „malé“ odchylky v postupu či složení vzorků. SELEKTIVITA – selektivní metoda: stanovení analytu v určité matrici není závislé na přítomnosti omezeného množství určitých příměsí. Zcela selektivní metoda pro analyt nebo skupinu analytů – specifická.
2
Selektivita Signál vzorku: Ssamp = k.cA – citlivost x koncentrace analytu Ssamp = SA + SI = kA.cA + kI.cI citlivosti a koncentrace Analytu a Interferentu
Koeficient selektivity – míra citlivosti metody na přítomnost interferentu (může nabývat kladných i záporných hodnot) KA,I = kI/kA Je-li KA,I větší než +1 či menší než –1 je metoda selektivnější k interferentu než analytu.
Ssamp = kA(cA + KA,I.cI)
Je nutné rozhodnout, které faktory jsou nezbytné, které užitečné a které nedůležité. Užitečná je konzultace se zadavatelem .
VYHLEDÁVÁNÍ METOD (postupů): Odborná literatura, časopisy. z Aplikační listy dodávané s přístrojem. z Postupy od profesních organizací (Association of z
Official Analytical Chemists).
Standardizační orgány: ČSN, ISO, EPA, SÚKL. z Metody vyvinuté v laboratoři – jejich modifikace. z
3
VÝVOJ POSTUPU Po zvolení optimální metody je nezbytné vyvinout postup pro konkrétní podmínky
1.
Eliminace interferencí (z matrice vzorku): většinou nesnadný úkol, protože interferent ani jeho koncentrace není předem známa. Obvykle se se vzorky zpracovává slepý pokus.
2.
Kalibrace a standardizace. Standardizace = potvrzení matematického vztahu mezi množstvím analytu a signálem metody.
3.
Vypracování strategie vzorkování: správné vzorkování zabezpečuje, že vzorek je reprezentativní.
4.
Validace: proces ověřující, že postup či metoda poskytuje přijatelné výsledky.
4
VALIDACE (analytické) METODY
Validace = potvrzení platnosti
VALIDACE proces, při němž se určuje vhodnost použití daného (analytického) systému pro získání relevantních dat. Při validaci posuzujeme, zda jsou parametry metody srovnatelné s požadavky na výsledky. Hledáme vztah mezi požadavky na výsledek a vlastnostmi metody. Jsou-li požadavky na výsledek špatně definovány nebo nerealistické, může se stát, že i validovaná metoda neposkytne žádoucí výsledky.
5
Validační plán Specifikace požadavků Volba metody Nalezení validačních údajů (standardizovaná metoda) Volba rozsahu validace Validační experimenty + vyhodnocení Při splnění požadavků bezpečné používání metody
Validované parametry Konfirmace identity – tzn. že měřená odezva může být přiřazena danému analytu a že nepochází od interferujících složek. Specifičnost metody – udává rozsah, do kterého může být analyt stanoven v komplexní směsi, aniž by došlo k interferenci s ostatními složkami směsi. Pracovní rozsah (u kvantitativní analýzy) + linearita kalibrační závislosti. Mez detekce a mez stanovitelnosti. Přesnost metody. Odchylka (pravdivost) metody, výtěžnost. Robustnost – vliv malých odchylek v postupu na výsledek.
6
Specifičnost metody Selektivita metody se mění v závislosti na koncentraci stanovovaného analytu, v závislosti na koncentraci ostatních komponent matrice. Použitelnost metody by měla být studována pomocí různých vzorků od čistých etalonů po směsi s komplexními matricemi. Metodický postup: 1. Analyzujeme n-krát (n > 10) vzorek čistého analytu ⇒ střední hodnota. 2. Analyzujeme n-krát vzorek čistého analytu s přídavkem příměsi v takových koncentracích, které jsou přibližně stejné jako v reálné matrici ⇒ střední hodnota. 3. Testování shody středních hodnot. Pokud je zamítnuta hypotéza o shodě, vypočteme korekční faktor.
Pracovní rozsah kalibrace, linearita Kalibrace (metrologický slovník) – Soubor úkonů, kterými se stanoví za specifikovaných podmínek vztah mezi hodnotami veličin, které jsou indikovány přístrojem nebo měřícím systémem a odpovídajícími hodnotami, které jsou realizovány etalony. V praxi má kalibrační závislost obecně sigmoidní charakter, přičemž na počátku (v blízkosti 0) a při vysokých koncentracích limituje k rovnoběžce s osou koncentrace. Metodický postup (pro pracovní rozsah): 1. 2. 3. 4.
Změříme závislost analytického signálu na koncentraci v nejširším možném intervalu koncentrací včetně slepého pokusu. Zobrazíme závislost vhodným statistickým programem. Na základě subjektivní úvahy zvolíme předpokládanou lineární oblast. V této oblasti znovu experimentálně metodu kalibrujeme, přičemž uvažujeme vliv matrice a kalibrujeme při optimální kombinaci významných faktorů.
7
Pracovní a lineární rozsah
Linearita Zjištění lineární části kalibrační závislosti se provádí s využitím regresní diagnostiky. Po vyhodnocení získáme přímkový regresní model Yreg = b0 + b1c. 1.
Metodický postup Proměření kalibrace dle experimentálního plánu: i 1 2 3 … n-1 n
2. 3.
c c1 c2 c3 … cn-1 cn
Y1 * * * * * *
Y2 *
Y3 *
Y4 *
Y5 *
Y6 *
Y7 *
Y8 *
Y9 *
Y10 *
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Testování homogenity rozptylů s12 a sn2. V části kalibrační křivky, kde je prokázána shoda rozptylů se testuje linearita nejčastěji některým z F testů.
8
Mez detekce a stanovitelnosti Mez detekce (Limit of Detection) – nejnižší množství analytu ve vzorku, které jsme schopni detekovat, ale které není nutně kvantifikovatelné jako exaktní hodnota. Mez stanovitelnosti (Limit of Quanification) – nejnižší množství analytu ve vzorku, které jsme schopni stanovit jako exaktní hodnotu se stanovenou přesností. K odhadu mezí lze využít několika experimentálních přístupů: z
z
z
Odhad na základě experimentálního vyhodnocení variability měření slepých vzorků. Opakovaně se měří signál slepého vzorku nebo vzorku s velmi malým množstvím analytu. Mez detekce je vázána ke koncentraci analytu ve vzorku, který v použitém detekčním systému vykazuje zvolený poměr signál k šumu (hodnota 2 až 5). Vyhodnocení na základě statistického testování hypotéz rizika chyby 1. a 2. druhu u regresní závislosti
Mez detekce a stanovitelnosti yLOD = yblank + (1,64sblank + 1,64sblank
9
Mez detekce a stanovitelnosti Pro výpočet meze detekce ze směrodatné odchylky měření slepého vzorku s0 se často používá konvence zpracovaná Kaiserem (zejména ve spektroskopických metodách): yLOD = yblank + 3sblank / yLOQ = yblank + 10sblank Novější koncepce (doporučení IUPAC 1995): při interpretaci měření je nežádoucí uvádět přítomnost analytu, když ve vzorku není (chyba 1. druhu) a rovněž neuvádět negativní výsledek, když vzorek analyt obsahuje (chyba 2. druhu). z
V normě DIN 32 645 je předpokladem pro využití kalibrační závislosti k odhadu meze detekce skutečnost, že poměr koncentrace nejvyššího bodu kalibrační přímky a kritické úrovně nepřesahuje 10!
Při uvádění meze detekce metody je bezpodmínečně nutné, aby byla jasně uvedena použitá konvence pro výpočet této hodnoty !!!
Kvalitativní metody: prahová koncentrace Prahová koncentrace – pod ní, je pozitivní identifikace zkoušky nespolehlivá. Koncentrace [µg/g] 200
Počet opakování
Pozitivní/negativní
10
10/0
100
10
10/0
75
10
5/5
50
10
1/9
25
10
0/10
0
10
0/10
10
Odchylka – bias (pravdivost) Pravdivost v laboratoři zjišťujeme: pomocí CRM nebo pomocí laboratorního etalonu, jehož referenční hodnota byla získána primární metodou, testováním výtěžnosti, Srovnáním s nezávislou (primární) metodou. Metodický postup (CRM): 1. Analýza slepého pokusu (s matricí!) a CRM opakována 10x. 2. Korekce analytického signálu CRM o hodnotu signálu slepého pokusu. 3. Výpočet obsahu (koncentrace) analytu v CRM a vyhodnocení: -2σD ≤ x - µ ≤ 2σD
σ =σ 2 D
2 CRM
2 s lab + n
Odchylka (pravdivost) Testování výtěžnosti (spike recovery): Výtěžnost: R = csp − cb ⋅100 [%] cref
csp je pozorovaná koncentrace po přídavku standardu (spike), cb je koncentrace analytu ve vzorku, cref je skutečná koncentrace (z údajů o referenčním materiálu, změřená definitní metodou). Výtěžnost je třeba zásadně sledovat při několika koncentracích a provést několik opakování.
11
Přesnost Metodický postup: Provádí se opakovaná analýza (alespoň 10x) CRM či vnitrolaboratorních etalonů při různých koncentracích analytu, obvykle následovně: 1. Stejný analytik, stejný přístroj, stejná laboratoř, krátké časové rozmezí. Výpočet směrodatné odchylky opakovatelnosti. 2. Různí analytikové, popř. různé přístroje, stejná laboratoř, různé koncentrace, dlouhé časové rozpětí. Výpočet směrodatné odchylky a zanesení do RD přesnosti ⇒ vnitrolaboratorní reprodukovatelnost pro každou koncentraci. 3. Různé laboratoře v režimu mezilaboratorního testu, různé koncentrace. Vyhodnocení výsledků ANOVA pro každou koncentraci ⇒ mezilaboratorní reprodukovatelnost (udaná směrodatnou odchylkou).
Různé míry přesnosti
12
Robustnost Test robustnosti – Yodenův test (7 parametrů) Kritické parametry měření a jejich tolerance musí být známy pro každý analytický postup (např.: pH, teplota, čistota a stáří činidel, vlhkost). V testu se zkoušejí pozměněné objemy, časy, navážky, vlivy různých šarží činidel apod. Parametry
1
2
3
4
5
6
7
8
A/a
A
A
A
A
a
a
a
a
B/b
B
B
b
b
B
B
b
b
C/c
C
c
C
c
C
c
C
c
D/d
D
D
d
d
d
d
D
D
E/e
E
e
E
e
e
E
e
E
F/f
F
f
f
F
F
f
f
F
G/g
G
g
g
G
g
G
G
g
Výsledky měření
s
t
u
v
w
x
y
z
Testování robustnosti Schéma pro test robustnosti: VA = 1/4(s + t + u + v) – 1/4(w + x + y + z) VB = 1/4(s + t + w + x) – 1/4 (u + v + y + z) VC = 1/4(s + u + w + y) – 1/4(t + v + x + z) VD = 1/4(s + t + y + z) – 1/4(u + v + w + x) VE = 1/4(s + u + x + z) – 1/4(t + v + w + y) VF = 1/4(s + v + w + z) – 1/4(t + u + x + y) VG = 1/4(s + v + x + y) – 1/4(t + u + w + z) Test robustnosti spočívá v testu hypotézy H0: Vi = 0; oproti H1: Vi ≠ 0 předpokládá, že všechny kontrasty V jsou nulové.
13
Testování robustnosti Test robustnosti spočívá v testu hypotézy H0: Vi = 0; oproti H1: Vi ≠ 0 předpokládá, že všechny kontrasty V jsou nulové. Vypočteme-li IS kontrastu jako s L1,2 = Vi ± t (1−α / 2;7) ⋅ 2 a obsahuje-li IS bod nula, potom je kontrast statisticky nevýznamný a metoda je pro daný parametr robustní. z
t(1-α/2;7) = 2,365 pro α = 0,05
Validované parametry u různých typů analýz Parametr
Kvalitativní analýza
Přesnost Odchylka Selektivita Robustnost
+ +
Linearita / citlivost LOD
+
LOQ
Hlavní složky
Stopová analýza
Fyzikální vlastnosti
+ + + + +
+ + + + +
+ + + + +
+ +
14
Plánování validace u různých typů metod Parametr
Standardní metoda (ČSN)
Metoda vyvinutá v laboratoři
Empirická metoda
Validovaná metoda s jinou matricí
Přesnost
+ +
+ +
+ + +
(+) ?
+ + + + +
+
+
(+) ? (+) ?
+ +
+ +
+ +
Odchylka Selektivita Robustnost Linearita / citlivost LOD LOQ
VÝVOJ analytické metody
VALIDACE analytické metody
„Zlatá pravidla validace“ validovat celou metodu před analýzou reálných vzorků lze provádět již při vývoji metody
validovat celý rozsah koncentrací validovat v rozsahu všech uvažovaných matric (pesticidy: jablka a jahody – jiná matrice)
15
Shrnutí Validace metod je nezbytná, abychom získali smysluplné výsledky. Rozsah validovaných parametrů se může lišit. Validační studii je třeba plánovat a provádět v souladu s analytickými požadavky. Vhodné způsoby validování závisí na aplikační oblasti. Pracovníci by měli rozumět jednotlivým validačním parametrům.
16
