Vliv vybraných pesticidů na živočišné buňky L929 in vitro

Vliv vybraných pesticidů na živočišné buňky L929 in vitro

Autor: Lucie Draslarová Škola: Česko-anglické gymnázium, Třebízského 1010, České Budějovice Kraj: Jihočeský Konzultant:

RNDr: Květa Tůmová Šárka Beranová

České Budějovice 2016

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svou práci vypracovala samostatně a použila jsem pouze podklady (literaturu, projekty, SW atd.) uvedené v seznamu vloženém v práci. Prohlašuji, že tištěná verze a elektronická verze soutěžní práce jsou shodné. Nemám závažný důvod proti zpřístupňování této práce v souladu se zákonem č. 121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon) v platném znění. V …………………………….. dne ………………… podpis: ……………………………

Poděkování Chtěla bych moc poděkovat paní Beranové, která mě zasvětila do tajů laboratorní práce v průběhu letní školy pořádané Ústavem komplexních systémů FROV JU v Nových Hradech. Zároveň bych chtěla poděkovat mojí interní konzultantce, paní profesorce RNDr. Květě Tůmové za obětavost a její volný čas strávený při korektuře mé práce. Bez jejíchž připomínek by tato práce nemohla vzniknout.

ANOTACE Cílem mé práce je otestovat vliv vybraných pesticidů na živočišné buňky L929 in vitro. Práce popisuje podrobný postup všech úkonů, spojených s tímto projektem, jako příprava média, kultivace buněk, nasazování a vyhodnocování samotných testů. Klíčová slova: monolinuron, terbutryn, L929, PBS, trypsinizace, dilatační test, specifická růstová rychlost

ANOTATION The goal of this work is to test the influence of selected pesticides on cells L929 i vitro. This work describes in detail proceeding of all the transaction connected with this project, for example preparation of medium, cultivation of the cells and evaluation of the very tests. Key words: monolinuron, terbutryn, L929, PBS, trypsinization, dilatation test, specific growth rate

Obsah Úvod ................................................................................................................................................. 6 1

Vysvětlení pojmů ..................................................................................................................... 7 1.1

Buňky L92 ......................................................................................................................... 7

1.2

Dilatace .............................................................................................................................. 7

1.3

Kultivace buněk ................................................................................................................. 8

1.4

Trypsinizace....................................................................................................................... 8

1.5

Vybrané pesticidy .............................................................................................................. 8

1.1.1

Monolinuron ............................................................................................................... 9

1.1.2

Terbutryn .................................................................................................................... 9

1.6

2

3

Příprava roztoků OASE a Terbutrynu ............................................................................... 9

1.6.1

Roztoky OASE ........................................................................................................... 9

1.6.2

Roztoky terbutrynu ................................................................................................... 10

Metodika a zpracování ........................................................................................................... 11 2.1

Příprava DMEM .............................................................................................................. 11

2.2

Phosphate-buffered saline (PBS) ..................................................................................... 12

2.2.1

Postup při přípravě PBS ........................................................................................... 13

2.2.2

Práce ve flow-boxu................................................................................................... 13

2.2.3

Postup při trypsinizaci .............................................................................................. 13

2.2.4

Praktické nasazení buněk na pokus .......................................................................... 14

2.3

Dilatační test .................................................................................................................... 15

2.4

Specifická růstová rychlost .............................................................................................. 15

Výsledky................................................................................................................................. 17 3.1

Výsledky pro dilatační test OASE ................................................................................... 17

3.2

Výsledky pro specifickou růstovou rychlost OASE ........................................................ 19

3.3

Výsledky pro dilatační test terbutrynu ............................................................................. 23

3.4

Výsledky pro specifickou růstovou rychlost terburynu ................................................... 25

4

Závěr....................................................................................................................................... 28

5

Použité zdroje ......................................................................................................................... 29

6

Přílohy: ..................................................................................................................................... 6

Úvod K práci zabývající se vlivem vybraných pesticidů na živočišné buňky L929 in vitro mě přivedl projekt na Letní škole pořádané na Ústavu komplexních systémů FROV JU v Nových Hradech. Této Letní školy jsem se zúčastnila letos již podruhé a to díky iniciaci paní profesorky RNDr. Květy Tůmové, která mě na myšlenku účasti na Letní škole přivedla a nyní je mým konzultantem. Na Letní škole jsem získala mnoho znalostí, zkušeností a dovedností, které bych v běžných školních podmínkách nezískala. Zároveň mě práce v tkáňové laboratoři nadchla natolik, že doufám, že se v podobném oboru budu pracovat i v budoucnu. Během projektu Vliv vybraných pesticidů na živočišné buňky L929 in vitro bychom chtěli pomocí myších buněk zmapovat vliv určitých pesticidů na tyto buňky. Budeme používat kmenové buňky, jelikož jejich použití je ohleduplnější metoda, než užívání zvolených látek přímo na zvířatech. Výzkum probíhá za sterilních podmínek v laboratoři, kde se simulují pro buňky přirozené podmínky, za kterých by se podobné reakce děly na zvířatech v přírodě. Je to šetrnější a podle mého názoru i rychlejší metoda, neboť pokud bychom měli pouze zjistit, zda tyto pesticidy zabíjí savce, odpověď by zněla pouze ano nebo ne. Pokud bychom však chtěli zjistit, zda mají námi vybrané látky nějaké mutagenní nebo chorobotvorné účinky, potřebovali bychom na projekt mnohem více času, než jsme měli k dispozici. Cílem mé práce je otestovat vliv vybraných pesticidů na živočišné buňky L929 in vitro. Práce popisuje podrobný postup všech úkonů, spojených s tímto projektem, jako příprava média, kultivace buněk, nasazování a vyhodnocování samotných testů. Jako hlavní zdroj výsledků mi poslouží má vlastní laboratorní činnost v laboratořích Ústavu komplexních systémů FROV JU v Nových Hradech. Budu porovnávat vliv různých koncentrací účinných látek v chemikáliích na přirozený buněčný cyklus a zjišťovat, do jaké míry tyto látky ovlivňují dělení a dilataci buněk. Námi vypracovaný projekt by mohl být součástí i dalších výzkumů vlivu pesticidů na živočišné buňky a možná někdy v budoucnu pomůže najít látky, které budou likvidovat nežádoucí řasy, ale nebudou mít nežádoucí vliv na živočišné buňky. Nejprve vysvětlím používané odborné termíny v následujícím textu. Poté popíšu komponenty, které jsou potřebné pro vlastní laboratorní práci. Dále budu pokračovat metodikou, kterou jsme k práci používali, a nakonec sepíšu a vyhodnotím výsledky našeho bádání.

6

1 Vysvětlení pojmů 1.1

Buňky L92

Buňky L929 jsou živočišné buňky (Obrázek 1), jinak nazývané také myší fibroblasty1. Tyto buňky jsou základními buňkami vazivové tkáně2. Používali jsme buňky od společnosti ECACC, která je označuje slovy Mouse C34/An connective tissue s katalogovým číslem 85011425.3 Použili jsme tyto buňky pro menší náchylnost na prostředí a hlavně pro jejich vlastnost udržení permanentní buněčné linie. To v praxi nabízí šanci využívat tyto buňky i po několik generací a stále budou mít tutéž genetickou informaci bez jakékoliv mutace. Dále jsou tyto buňky nesmírnou výhodou pro jejich rychlost růstu a dilatace a tudíž získáme stejný výsledek za kratší dobu. Při použití samotných buněk musíme pracovat velice opatrně, protože buňky jsou zvyklé žít v konkrétním prostředí. Naším úkolem je nasimulovat buňkám podobné podmínky, a tak je nevystavovat zbytečnému stresu. Samotné buňky se rychle množí, a tak v jedné zásobní lahvičce může žít dostatek buněk na více než 3 pokusy najednou. Užití Používání sledovaných pesticidů na samotných zvířatech s sebou nese i určitá rizika. Předně musíme před každým pokusem důkladně zvážit, jestli to zvíře přežije, jelikož při úhynu myši musíme pořídit novou, kdežto při zlikvidování buněk na jedné misce naočkujeme ze zásobní lahvičky do čisté misky buňky nové. Zároveň je jednodušší pozorovat a zaznamenávat změny v misce, která je snímaná pod mikroskopem než živá zvířata. I kdyby některé pokusy přinášely prokazatelnější výsledky testováním na samotných zvířatech, bylo by praktičtější aplikovat onu látku nejprve na kmenové buňky.

1.2

Dilatace

Dilatace buněk je proces, při kterém se buňky usadí na dně nádoby určené pro pokus. Při testu, klíčovém pro tuto práci, byly použity NUNC misky (Obrázek 2). V praxi se dilatace využívá pro zjištění náchylnosti buněk na tu či onu látku, kterou na misku naneseme spolu s kulturou buněk. Pokud jsou nanesené buňky v prostředí, které odpovídá jejich přirozenému, dilatují se mnohem rychleji než buňky, které jsou nějakým způsobem ohrožovány nepřirozenou látkou.4

1

http://www.pheculturecollections.org.uk/products/celllines/generalcell/detail.jsp?refId=85011425&collection=ecacc_gc 5.12.2015 2 http://ghr.nlm.nih.gov/glossary=fibroblast 5.12.2015 3 Viz. Příbalový leták buněk L929/ECCAC, 5.12.2015 4 Viz. Úvodní přednáška Ing. Vítězslava Březiny, CSc. na Nových Hradech, 6.7.2016

7

1.3

Kultivace buněk

Kultivace buněk neboli pasážování je proces (Obrázek 3), při kterém se buňky uvolní ze dna nádoby, aby následně mohly být přeneseny do jiné nádoby. Proces se opakuje minimálně jednou za 2-3 dny. Buňky jsou uchovávány v kultivační lahvičce v inkubátoru, který je nastavený na 37°C a určitou koncentraci CO2 (5,2%) nezbytnou pro tyto buňky. Těmito podmínkami jsme simulovali přirozené podmínky, aby náš výzkum nebyl zkreslený vnějšími vlivy na buňky. Zajišťujeme tím, že stres působící na buňky při pracování s nimi je minimální. Zároveň živočišné buňky žijí v živném médiu, v našem případě DMEM médium, které musí být měněné každé 2-3 dny, neboť buňky velmi rychle spotřebují živiny obsažené v médiu DMEM.

1.4

Trypsinizace

Trypsinizace je proces, který je součástí kultivace buněk. Využívá se při něm Trypsin5, nebo také Versen Trypsin (Obrázek 4), což je enzym produkovaný ve slinivce břišní umožňující štěpení peptidů. Trypsin působí na buňky, které reagují smrštěním cytoplazmatické membrány a tím se odtrhnou ode dna. Buňky poté plavou v roztoku obsahující tento enzym a my s nimi můžeme dále pracovat. Buňky však v této látce nesmí zůstat dlouho, neboť v tu chvíli nemají k dispozici živiny potřebné k životu. Versen Trypsin se uchovává, jako jediná z látek, se kterými při těchto pokusech pracujeme, v mrazáku, čímž se zabrání nechtěnému přeměnění účinné látky na neúčinnou.

1.5

Vybrané pesticidy

Pro splnění našeho cíle jsme vybrali dva pesticidy s označením Algo Univerzal a Terbutryn. Pesticid nazývaný Algo Univerzal je ovšem pouze obchodní název, látka sama se nazývá Monolinuron a je firmou OASE prodávaná pod výše zmíněným názvem Algo Univerzal. Tyto dva pesticidy byly vybrány, protože jejich základní chemické sloučeniny se používaly jako účinná látka do fasádních barev na panelové domy. Fasádní barvy obsahující tyto látky pak lépe odolávaly plísním a houbám, avšak při deštích se tyto látky mohou dostat do vody a již v malé koncentraci mít negativní vliv na živé organismy ve vodě a v povodí řek. Problém se pak může vyskytnout díky potravnímu řetězci i u vyšších organismů.6 Pesticid Monolinuron se doposud používá jako účinná látka při hubení řas v zahradních jezírkách (např. přípravkem AlGo univerzal). Naopak Terbutryn byl využit pouze jako čistá, krystalická látka.

5 6

http://www.worthington-biochem.com/try/ 5.12.2015 http://ekolist.cz/cz/zpravodajstvi/zpravy/chemie-ochrani-fasady-proti-plisni-ale-ohrozuje-zivot-v-rekach 13.2.2016

8

1.1.1 Monolinuron Monolinuron je chemická látka, kterou můžeme nalézt také pod názvy: Monorotox, Arezin, Premalin, Aresin. Jedná se o látku se sumárním vzorcem C9H11ClN2O2.7 (Obrázek 5) Pro náš výzkum jsme použili komerčně prodávaný prostředek na hubení řas v zahradních jezírkách, jménem Algo Univerzal. Algo Univerzal (Obrázek 6) vyrábí firma OASE a dodává ho v podobě tekutého gelu. Tento gel se následně aplikue 1.1.2 Terbutryn Terbutryn je chemická látka se sumárním vzorcem C10H19N5S (Obrázek 7), jinak také známa pod anglickými názvy Shortstop, Clarosan, Terbutrex a Prebane. Pro pokus byla využita bílá, krystalická, pevná látka, rozpouštějící se v různém množství do média. V rostlinných buňkách blokuje fotosyntézu8, a tím dochází k úhynu rostlin. Na odkazu9 můžeme vidět návrh zákona omezující využití tohoto pesticidu, jakožto i dalších chemických látek. Dále jsem našla bezpečnostní list k fasádní barvě, která tuto látku stále obsahuje.10

1.6

Příprava roztoků OASE a Terbutrynu

1.6.1 Roztoky OASE Jako základní koncentrace tohoto přípravku byla vybrána koncentrace, doporučená přímo výrobcem této látky. Příbalový leták přípravku udává koncentraci 500ml gelu OASE na 10 000 litrů vody11. Zmíněná koncentrace přepočítaná na laboratorní podmínky je 5µl na 100ml živného média. Tuto koncentraci jsme zvolili jako základní pro náš výzkum. Postup při vytváření roztoků OASE byl prostý. Naším záměrem bylo vytvoření vzorku o základní koncentraci a následně dvou dalších vzorků obsahujících 10x a 100x vyšší koncentraci OASE. Při samotné přípravě jsme však postupovali obráceně. Nejprve jsme vytvořili roztok, který byl 100x silnější než základní koncentrace a poté jsme tento roztok naředili v poměru 1:9 s médiem DMEM, čímž jsme dostali koncentraci 10x. Postup jsme ještě jednou zopakovali, abychom dostali základní koncentraci. Pro všechny roztoky je důležitá mikrobiální filtrace a sterilní prostředí. Kontaminované vzorky by živočišné buňky stoprocentně zahubily a pokus by bylo nutné zopakovat.

7

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/monolinuron 13.2.2016 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Terbutryn#section=Top 13.2.2016 9 http://kurim.cz/filemanager/files/file.php?file=185677 6.2.2016 10 http://www.coleman.cz/ImgGalery/Img6/Soubory-Ke-Stazeni/03_Bezpecnostni-Listy/110_03-017.pdf 13.2.2016 11 Pozn. 100 ml gelu OASE obsahuje 0,75 g monolinuronu (viz příbalový leták) 8

9

1.6.2 Roztoky terbutrynu Jelikož terbutryn (Obrázek 8) není komerčně prodávaná směs, ale samotná účinná látka, neexistuje výrobcem doporučené dávkování. Pro pokus jsme tedy chtěli použít vypočítanou molární hmotnost této sloučeniny tj. Mr=241,36g/cm3. Toto množství však rozpustit nelze a tudíž jsme postupovali dle doporučení na internetu.12 Do 50ml DMEM nám vyšlo 0,00125g, což je moc malé číslo, aby to mohlo být přesně naměřeno. Použili jsme 0,0125g na 50 ml, což je 10x víc. Jelikož se však tato látka jen velmi špatně rozpouští ve vodě, musela být rozpuštěna v ethanolu. Náš zásobní roztok se nyní skládal z 0,0125g terbutrynu rozpuštěného v 500µl ethanolu a poté rozmícháno v 50ml DMEM.13 Aby nebyly výsledky ovlivněny tím, zda je, či není přítomen ethanol, musela být kontrola pro tento pokus také modifikována a to přidáním adekvátního množství ethanolu.

12 13

http://www.chemnet.com/cas/cz/886-50-0/terbutryn.html 13.2.2016 Viz. Poznámky vedoucí projektu na Letní škole Šárky Beranové ze dne 19.6.2015-21.7.2015, 13.2.2016

10

2 Metodika a zpracování Při provádění samotného pokusu jsme postupovali dle metod stanovených pro akreditovaná střediska tkáňových laboratoří. Nasazovali jsme vždy adekvátní počet buněk do příslušného typu kultivační misky (NUNC pro dilatační test, nebo 4ibida pro Specifickou růstovou rychlost), načež po skončení lhůty pro pokus jsme dostali sérii fotografií pro daný pokus. Při práci s buňkami L929 je nutné pracovat rychle a sterilně. Buňky jsou uchovávány v živném médiu DMEM, které musíme obohatit o určité látky nezbytné pro kultivaci těchto buněk, protože tyto látky v syrovém médiu obsaženy nejsou.

2.1

Příprava DMEM

Pro přípravu kompletního DMEM pro náš typ buněk (L929) jsme do surového, komerčně dodávaného DMEM přidávali látky, kterými se DMEM musí obohatit, aby bunky měli dostatek živin a ochranných látek. Kupované kompletní DMEM je bohaté na obsah glukosy. V níže uvedené tabulce jsou uvedena množství přidávaných komponentů. Bofes14 je látka, která napomáhá buňkám po trypsinizaci zpět do původního režimu. Antibiotika pro dané buňky, ve zkratce ATBM, která aplikujeme z důvodu předejití případným infekcím již v zárodku. L-Glutamin15 je aminokyselina, která buňkám napomáhá obnovit membránu a vrátit se do běžného režimu. A jako poslední látku přidáme Gentamicin, patřící do skupiny aminoglykosidů, který se v lidském těle v kombinaci s jinými antibiotiky využívá k léčbě otravy krve a jiných závažných infekcí16. Naše buňky alespoň částečně chrání před nežádoucími patogeny.

14

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/f2442?lang=en®ion=CZ 5.12.2015 http://www.aktin.cz/clanek/3230-aminokyseliny-l-glutamin 5.12.2015 16 http://www.stefajir.cz/?q=gentamicin 5.12.2015 15

11

Na 1 ml kompletního DMEM média pro L929 buňky musíme připravit (Tabulka 1): Tabulka 1

Komponent

Množství

DMEM with Hign Glukose

877 µl

10% Bofes

100 µl

1% ATBM

10 µl

1% L-Glutamin

10 µl

0,3% Gentamicin

3 µl

2.2

Phosphate-buffered saline (PBS)

Další z roztoků potřebných pro naši práci je Phosphate-buffered saline, dále už jen PBS17. PBS je solný roztok používaný na oplach buněk. Připravuje se ze čtyř solí, konkrétně chloridu sodného (NaCl), chloridu draselného (KCl), dodekahydrátu hydrogenforforečnanu sodného (Na2HPO4 . 12H2O) a dihydrogenfosforečnanu draselného (KH2PO4) v tomto složení (Tabulka 2): Tabulka 2

Název soli

Molární hmotnost

Potřebná koncentrace

Přepočet na gramy

NaCl

58,44 g·mol-1

140 mM

8,18 g

KCl

74,55 g·mol-1

2,7 mM

0,201g

Na2HPO4 . 12H2O

358,14 g·mol-1

10 mM

2,89 g

KH2PO4

136,09 g·mol-1

1,8 mM

0,24g

17

http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.rec8247 31.1.2016

12

2.2.1 Postup při přípravě PBS Na analytických vahách odvážíme uvedené množství látek a přesypeme do odměrné baňky o objemu 2 dm3. Po rozpuštění těchto látek v destilované vodě doplníme roztok do celkového objemu 2 dm3. Vše promícháme za pomocí magnetické míchačky (Obrázek 9) a změříme pH, které musí být v rozmezí od 7,3- 7,4 (Obrázek 10). Pokud pH nevyhovuje, upravíme ho pomocí kyseliny chlorovodíkové. Roztok PBS se používá na oplach buněk, čímž je zajištěna očista buněk od případných nečistot a zbytků látek, které by při pokusu mohly ovlivnit kvalitu snímků či výsledné údaje. Tento olný roztok se na oplach buněk používá také kvůli osmotickým jevům, díky kterým by mohly buňky, které byly opláchnuty destilovanou vodou bez přidaných solí, popraskat. Naopak vyšší množství iontů ve vodě by vytáhlo z buněk vodu a výsledky by byly zkreslené nepřirozeným tvarem buněk. Přidáním adekvátního množství solí do vody dojde k vyvážení osmotického tlaku na obou dvou stranách membrány, což znamená možnost oplachu buněk bez zásahu do jejich běžného cyklu. 2.2.2 Práce ve flow-boxu Všechny interakce spojené se samotným pokusem provádíme ve sterilním flow-boxu, který umožňuje práci na buňkách jen s minimálními riziky kontaminace. Všechny komponenty, tj. Versen Trypsin, DMEM a PBS, potřebné pro naši práci, musíme nejprve ohřát na teplotu 37°C, což je pro buňky přijatelnější než pokojová teplota a tím pádem jsou méně stresované. Po zahřání přesuneme látky do flow-boxu. Kdykoliv vkládáme cokoliv do flow-boxu, musíme si být jisti, že nedojde ke kontaminaci. Proto pracujeme s ethanolem, kterým si vždy důkladně přestříkáme ruce a který nežádoucí patogeny zahubí. V samotném flow-boxu pak všechny interakce provádíme s předchozím opálením (např. nástavce na odsávací zařízení= pasterky, hrdla kultivační lahvičky, kraje kádinky s PBS) přes kahan, který nám zajistí zabití bakterií, které by případně kontaminovaly vzorek. Pracujeme v rukavicích a co nejrychleji, protože rychlost a preciznost práce může zásadně ovlivnit výsledky vyplývající z našeho výzkumu. 2.2.3 Postup při trypsinizaci Buňky, skladované v inkubátoru při stálé teplotě a koncentraci oxidu uhličitého, vyjmeme z inkubátoru a přesuneme do flow-boxu. Přesuneme i nahřáté komponenty, tj. médium, PBS a Versen Trypsin.

13

Z lahvičky s buňkami odsajeme všechno médium pomocí skleněné pasterky, která předtím prošla spolu s hrdlem lahvičky buněk přes kahan, do odpadní nádoby (zbavíme se starého média). Propláchneme buňky solným roztokem PBS, který následně také odsajeme do odpadní nádoby. Naaplikujeme dané množství Versen Trypsinu a přeneseme buňky v kultivační lahvičce zpět z flow-boxu do inkubátoru, aby byly po dobu působení Trypsinu v teplém prostředí. Po zhruba půl až minutě vyjmeme lahvičku z inkubátoru a pomocí optického mikroskopu zkontrolujeme, v jaké fázi se nacházejí buňky. Nyní pomocí Versen Trypsinu přimějeme buňky stáhnout svoji cytoplazmatickou membránu, a tím se i odlepit ode dna. V této fázi přesuneme buňky opět do flow-boxu, kde nabereme accu-jet pipetou malé množství DMEM média, které přidáme do lahvičky. Médium deaktivuje Versen Trypsin a buňkám dodá živiny. Takto rozmíchané buňky přesuneme accu-jet pipetou do malé, plastové nádobky zvané eppendorfka, kde jsou připravené k dalšímu použití. 2.2.4 Praktické nasazení buněk na pokus Buňkám, které se uvolnily ode sna a byly tozmíchané v malém množství média, se říká inoculum. Toto inoculum je základem pro nasazování do konkrétního pokusu. Na každý pokus je potřeba určitý počet buněk, který musí být při každém nasazení stejný. Dosáhne se toho pomocí Bürkerovy komůrky (Obrázek 11), která se skládá z malých čtverců, kdy pomocí počtu buněk v 25 čtvercích můžeme s jistou přesností říct, kolik buněk inoculum obsahuje, což je důležité pro výpočet množství inocula potřebného na pokus. Pro každý pokus potřebujeme jiný počet buněk. Cílem nápočtu buněk je získat množství, které za daný časový úsek pokryje celou plochu nádoby, ve které pokus provádíme, což se nazývá vytvoření monolayeru.

14

2.3

Dilatační test

V průběhu tohoto testu zjišťujeme, jak se dokáží buňky za krátký časový úsek dilatovat, neboli roztáhnout a přimknout k ploše dna nádoby. Používá se NUNC miska s obsahem 8,8 cm2, na kterou naneseme 500 000 buněk. Tyto buňky jsou po dobu 90 minut každé 2 minuty snímány na časosběrné sestavě Olympus (Obrázek 12), která pořizuje snímek vždy jen jednoho bodu, avšak s velmi dobrou kvalitou. Na NUNC misku s obsahem dna 8,8cm2 naneseme 4 ml DMEM média, do kterého napočítáme buňky pomocí vzorečku: 500 000 × 1000 = 𝑛 µ𝑙 𝑥𝑥𝑥0000 Kde xxx představuje počet buněk napočítaných pomocí Bürkerovy komůrky. Vypočítané množství n napipetujeme a přeneseme do NUNC misky, kde toto množství rozmícháme v přítomném DMEM. Při této činnosti je pravděpodobný výskyt bublin vytvořených z DMEM. Tyto bubliny by při snímání vzorku mohly překážet, tudíž je musíme odstranit pomocí nažhavené železné jehly zlikvidovat. V tuto chvíli není třeba obávat se kontaminace, neboť oheň případné patogeny na jehle zlikvidoval.

2.4

Specifická růstová rychlost

Dále označovaná pouze zkratkou SRR je test nasazovaný po dobu 72 hodin, v jehož průběhu pozorujeme několik generací nasazených buněk a jejich množení. K pokusu slouží miska, nazývající se 4ibida (dle jejího tvaru, neboť je rozdělena na 4 části), umožňující nasadit 4 různé koncentrace zkoumané látky najednou. Nasazuje se pouze 200 000 buněk na stejnou plochu 8,8 cm2 a to proto, abychom docílili stejného výsledku, tj. buňky pokryly celou plochu, ale ještě se nezačaly pro přílišnou koncentraci odlepovat ode dna. V přepočtu na 1 cm2 je počet buněk roven 22 727. Toto číslo poté vynásobíme obsahem ¼ ibidy, abychom dostali počet buněk potřebný na ¼ o obsahu 0,82 cm2. Vyjde nám, že počet buněk na ¼ je 18 636 buněk. Abychom ale předešli případné chybě, připravíme médium i s buňkami jako na 2×¼ ibidy (tj. potřebujeme 2×18 636=37 272 buněk). Pro nápočet buněk použijeme vzoreček: 37 272 × 1000 = 𝑛 µ𝑙 𝑥𝑥𝑥0000 Kde xxx je počet buněk napočítaných v Bürkerově komůrce. Tento počet µl poté aplikujeme do 600 µl média, neboť do ¼ ibidy se vejde 300 µl a my připravujeme dvojnásobek. SRR je prováděna na časosběrné sestavě Biostation (Obrázek 13), která díky své speciální vlastnosti může snímat až 8 bodů nádoby.

15

Těchto 8 bodů se nastavuje tak, aby každé 2 body byly na jedné z částí 4ibidy. Biostation také napomáhá snižovat možnost chyby při nasazování pokusu. Pokud by k chybě došlo, byla by stejná pro všechny 4 části a tudíž i se stejně pravděpodobnou odchylkou výsledků závislých na koncentraci dané látky. Zároveň také vycházíme ze stejné koncentraci inocula a to může hrát velkou roli při vyhodnocování výsledků.18

18

Viz. Poznámky vedoucí projektu na Letní škole Šárky Beranové ze dne 19.6.2015-21.7.2015, 13.2.2016

16

3 Výsledky Po skončení pokusu jsme získali sérii fotografií vždy o jedné koncentraci. Buňky jsme počítaly pomocí programu ImageJ vždy v určité fázi pokusu. Dilatační test pro OASE se nachází pod těmito čísly pokusu: Kontrolní vzorek (tzn. bez jakéhokoliv přídavku pesticidu - jen čisté médium): OASE 1x OASE 10x OASE 100x

847 845 846 848

Specifická růstová rychlost pro OASE - číslo pokusu:

512

3.1

Výsledky pro dilatační test OASE

Tabulka 3

pokus 847- čas po 10 minutách čas(min) DIL NEDIL celkem index 0 0 53 53 0 10 30 22 52 0,576923 20 51 3 54 0,944444 30 54 0 54 1 40 54 0 54 1 50 54 0 54 1 60 54 0 54 1 70 54 0 54 1 80 54 0 54 1 88 54 0 54 1

Zde (Tabulka 3) můžeme pozorovat, že do půl hodiny od začátku pokusu byly všechny buňky již zcela dilatované. Podíl indexů dilatovaných a nedilatovaných buněk je tudíž jedna.

17

Tabulka 4

pokus 845 čas (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 88

DIL 0 11 19 23 28 31 41 49 54 59

NEDIL celkem 67 67 53 64 42 61 40 63 36 64 28 59 24 65 17 66 13 67 9 68

index 0 0,171875 0,311475 0,365079 0,4375 0,525424 0,630769 0,742424 0,80597 0,867647

U pokusu číslo 845 (Tabulka 4) zjistíme, že buňky dilatují mnohem pomaleji, než když v médiu OASE nebylo. Povšimnout si můžeme i faktu, že ani po dobu 88 minut se všechny buňky dilatovat nestihly. Tabulka 5

pokus 846 čas(min) DIL NEDIL celkem 0 0 85 85 10 47 35 82 20 73 16 89 30 78 18 96 40 84 14 98 50 93 7 100 60 94 6 100 70 98 3 101 80 102 0 102 88 103 0 103

index 0 0,573171 0,820225 0,8125 0,857143 0,93 0,94 0,970297 1 1

V pokusu číslo 846 (Tabulka 5) je vyšší koncentrace OASE než u předchozího vzorku, a přesto se buňky dilatují rychleji, než při nižší koncentraci - byla by potřeba prověřit pravdivost výsledku opakováním pokusu. Je však vidět, že stále se buňky dilatují pomaleji, než v samotném DMEM. Chyba může být také způsobena rozdílným množstvím buněk na fotografii, jenž naznačuje, že na těchto fotkách je přibližně dvakrát víc buněk než na kontrole a nejslabší koncentraci OASE.

18

Tabulka 6

pokus 848 čas(min) DIL 0 10 20 30 40 50 60 70 80 88

0 13 59 56 76 83 90 92 94 95

NEDIL celkem 88 88 73 86 24 83 25 81 13 89 12 95 8 98 6 98 4 98 3 98

index 0 0,151163 0,710843 0,691358 0,853933 0,873684 0,918367 0,938776 0,959184 0,969388

Pokus číslo 848 (Tabulka 6) představuje nejsilnější koncentraci OASE, kterou jsme použili. Můžeme zde pozorovat, že na rozdíl od pokusu uvedeného v předchozí tabulce (Tabulka 5) se zde všechny buňky dilatovat nestihly.

3.2

Výsledky pro specifickou růstovou rychlost OASE

Pro časosběrnou sestavu Biostation je typických 8 snímaných bodů najednou. Vznikne nám 8 tabulek obsahujících 4 koncentrace, jako při dilatačním testu. Zprůměrováním hodnot SRR nám poté vyjde hodnota, kterou následně porovnáváme s ostatními koncentracemi. Pro konečný výsledek je nejdůležitější průměr modře vyznačených hodnot. Tabulka 7

varianta P1 0-24hod 24-48 hod

48-72 hod 0-72 hod

POČET BUNĚK START KONEC 17,00 68,00 134,00 17,00

68,00 134,00 222,00 222,00

ČAS v hod

LN KONEC

LN START

24 4,219508 2,833213 24 4,89784 4,219508 24 5,402677 4,89784 72 5,402677 2,833213

19

index SRR 0,0578 0,0283 0,0210 0,0357

Tabulka 8


48-72 hod 0-72 hod


64,00 102,00 156,00 156,00

ČAS v hod 24 24 24 72

LN KONEC

LN START

4,158883 4,624973 5,049856 5,049856

2,995732 4,158883 4,624973 2,995732

index SRR 0,0485 0,0194 0,0177 0,0285

Varianta P1 (Tabulka 7) a P2 (Tabulka 8) je kontrolní varianta pro OASE. Tabulka je rozdělená do 4 řádků a 6 sloupců. V prvním až třetím řádku vidíme aktivitu buněk během prvního až třetího dne. V posledním řádku pak můžeme pozorovat růst buněk za celých 72h. Pomocí programu ImageJ se zhodnotily vždy obrázky na konci periody- vždy po 24 hodinách. Počet buněk na začátku a na konci se poté zadal do tabulky, kde se z těchto čísel vygeneroval přirozený logaritmus, který se od sebe odečetl a následně vydělil počtem hodin (tzn. 24, nebo 72) adekvátním k dané řádce. SRR nám poté vyjde jako index, neboli bezrozměrné číslo, které poté průměrně pro obě varianty dané koncentrace porovnáváme s ostatními průměry koncentrací. Tabulka 9


48-72 hod 0-72 hod


61,00 123,00 245,00 245,00

ČAS v hod 24 24 24 72

LN KONEC

LN START

4,110874 4,812184 5,501258 5,501258

2,772589 4,110874 4,812184 2,772589

LN KONEC

LN START

3,555348 4,304065 5,043425 5,043425

2,890372 3,555348 4,304065 2,890372

index SRR 0,0558 0,0292 0,0287 0,0379

Tabulka 10


48-72 hod 0-72 hod


35,00 74,00 155,00 155,00

ČAS v hod 24 24 24 72

index SRR 0,0277 0,0312 0,0308 0,0299

Nápočet buněk a mechanismus výpočtu pro koncentraci OASE 1x, jakožto i u ostatních koncentrací, je stejný, jako u kontroly. Tuto koncentraci zastupují na 4ibidě body P3 (Tabulka 9) 20

a P4 (Tabulka 10). Ve srovnání s kontrolou nám vychází nepatrně vyšší čísla, což by mohlo indikovat lehčí stimulační efekt, na druhou stranu to není prokazatelný výsledek- pro jeho vyšší procento pravděpodobnosti bychom museli pokus zopakovat. Tabulka 11


48-72 hod 0-72 hod


35,00 61,00 119,00 119,00

ČAS v hod 24 24 24 72

LN KONEC

LN START

3,555348 4,110874 4,779123 4,779123

3,044522 3,555348 4,110874 3,044522

LN KONEC

LN START

index SRR 0,0213 0,0231 0,0278 0,0241

Tabulka 12


48-72 hod 0-72 hod


18,00 45,00 90,00 90,00

ČAS v hod

24 2,890372 2,833213 24 3,806662 3,332205 24 4,49981 3,806662 72 4,49981 2,833213

index SRR 0,0024 0,0198 0,0289 0,0231

Zde si můžeme povšimnout, že v porovnání s kontrolou nám OASE o koncentraci 10x silnější, než udává výrobce, ukazuje znatelně nižší čísla, než u kontroly. V tomto případě nám koncentraci roztoku OASE 10x zastupují body P5 (Tabulka 11) a P6 (Tabulka 12) na 4ibidě. Projevuje se tu již inhibiční účinek působící na buňky v médiu o této koncentraci OASE. Tabulka 13


48-72 hod 0-72 hod


21,00 34,00 59,00 59,00

ČAS v hod 24 24 24 72

LN KONEC

LN START

3,044522 3,526361 4,077537 4,077537

2,995732 3,044522 3,526361 2,995732

21

index SRR 0,0020 0,0201 0,0230 0,0150

Tabulka 14


48-72 hod 0-72 hod


18,00 33,00 65,00 65,00

ČAS v hod 24 24 24 72

LN KONEC

LN START

2,890372 3,496508 4,174387 4,174387

2,772589 2,890372 3,496508 2,772589

index SRR 0,0049 0,0253 0,0282 0,0195

Poslední varianta, tzn. varianta OASE 100x silnější, kterou zastupují body P7 (Tabulka 13) a P8 (Tabulka 14) už vykazuje značný útlum v růstu buněk, než u předchozích koncentrací. Zároveň si ale musíme povšimnout, že ani tato koncentrace OASE buňky nezačala hubit, pouze značně inhibovala jejich růst.

22

Dilatační test pro terbutryn se nachází pod těmito čísly pokusu: Kontrolní vzorek (taktéž bez pesticidu, obsahující ethanol): terbutryn 0,0025g/1000ml terbutryn 0,025g/1000ml terbutryn 0,25g/1000ml

851 854 852 856

Specifická růstová rychlost pro terbutryn - číslo pokusu:

507

3.3

Výsledky pro dilatační test terbutrynu

Tabulka 15

čas(min) DIL 0 10 20 30 40 50 60 70 80 88

0 0 3 26 34 53 68 76 83 85

NEDIL celkem 93 93 93 93 90 93 69 95 61 95 40 93 27 95 19 95 14 97 12 97

index 0 0 0,032258 0,273684 0,357895 0,569892 0,715789 0,8 0,85567 0,876289

Kontrola pro terbutryn (Tabulka 15) vychází samozřejmě jinak, než kontrola pro OASE. Na srovnání těchto dvou tabulek je zřetelné, že alkohol buňky do určité míry také ovlivňuje, a proto je důležitý fakt, že pro tento pokus byl do kontroly také přidán ethanol. Tabulka 16

čas(min) DIL 0 10 20 30 40 50 60 70 80 88

0 1 9 9 11 14 16 19 22 22

NEDIL celkem 83 83 97 98 87 96 87 96 88 99 74 88 78 94 71 90 67 89 69 91

index 0 0,010204 0,09375 0,09375 0,111111 0,159091 0,170213 0,211111 0,247191 0,241758

23

Je velmi zajímavé, že již tak malá koncentrace, jako je 0,0025g/1000ml (Tabulka 16) vykazuje tak značný vliv na buňky. Nejspíše byly buňky až příliš vystaveny stresu, a proto nemohly správně reagovat na terbutryn. Tabulka 17

čas(min) DIL 0 10 20 30 40 50 60 70 80 88

0 39 64 72 78 80 84 85 87 89

NEDIL celkem 75 75 35 74 15 79 10 82 6 84 4 84 3 87 3 88 1 88 0 89

index 0 0,527027 0,810127 0,878049 0,928571 0,952381 0,965517 0,965909 0,988636 1

Při základní koncentraci 0,025g/1000ml (Tabulka 17) vidíme, že na buňky působí kladně a tudíž se dokonce za daný časový úsek stihly všechny dilatovat. Tabulka 18

čas(min) DIL 0 10 20 30 40 50 60 70 80 88

0 0 7 10 14 18 22 39 40 42

NEDIL celkem 74 74 89 89 83 90 82 92 78 92 73 91 70 92 51 90 50 90 49 91

index 0 0 0,077778 0,108696 0,152174 0,197802 0,23913 0,433333 0,444444 0,461538

Naproti tomu při 10x silnější koncentraci roztoku terbutrynu (Tabulka 18) buňky dilatují mnohem pomaleji a my tudíž můžeme pozorovat inhibiční účinek na tyto buňky.

24

3.4

Výsledky pro specifickou růstovou rychlost terburynu

Tabulka 19


48-72 hod 0-72 hod


208,00 327,00 330,00 330,00

ČAS v hod

LN KONEC

LN START

24 5,337538 3,401197 24 5,78996 5,337538 24 5,799093 5,78996 72 5,799093 3,401197

index SRR 0,0807 0,0189 0,0004 0,0333

Tabulka 20


48-72 hod 0-72 hod


107,00 206,00 310,00 310,00

ČAS v hod 24 24 24 72

LN KONEC

LN START

4,672829 5,327876 5,736572 5,736572

3,367296 4,672829 5,327876 3,367296

index SRR 0,0544 0,0273 0,0170 0,0329

Opět zaujímají první dva body P1 (Tabulka 19) a P2 (Tabulka 20) polohu na kontrolním vzorku terbutrynu, který obsahoval ethanol. Buňky rostou mnohem pomaleji, než bez ethanolu, což potvrdil i dilatační test. Tabulka 21


48-72 hod 0-72 hod


109,00 192,00 271,00 271,00

ČAS v hod 24 24 24 72

LN KONEC

LN START

4,691348 5,257495 5,602119 5,602119

3,258097 4,691348 5,257495 3,258097

25

index SRR 0,0597 0,0236 0,0144 0,0326

Tabulka 22


48-72 hod 0-72 hod


53,00 131,00 222,00 222,00

ČAS v hod 24 24 24 72

LN KONEC

LN START

3,970292 4,875197 5,402677 5,402677

3,218876 3,970292 4,875197 3,218876

index SRR 0,0313 0,0377 0,0220 0,0303

Naopak biostation ukázal, že při koncentraci roztoku terbutrynu 0,00025g/1000ml, kterou reprezentují body P3 (Tabulka 21) a P4 (Tabulka 22), sice terbutryn vykazuje jisté inhibiční účinky, není to však tak markantní, jako u dilatačního testu a je to více pravděpodobný závěr. Ano, vliv má, ale rozhodně ne tak radikální. Tabulka 23


48-72 hod 0-72 hod


168,00 255,00 301,00 301,00

ČAS v hod

LN KONEC

LN START

24 5,123964 3,401197 24 5,541264 5,123964 24 5,70711 5,541264 72 5,70711 3,401197

index SRR 0,0718 0,0174 0,0069 0,0320

Tabulka 24


48-72 hod 0-72 hod


63,00 123,00 182,00 182,00

ČAS v hod 24 24 24 72

LN KONEC

LN START

4,143135 4,812184 5,204007 5,204007

3,044522 4,143135 4,812184 3,044522

index SRR 0,0458 0,0279 0,0163 0,0300

S rostoucí koncentrací roztoku terbutrynu klesá hodnota indexu a to i v případě bodů P5 (Tabulka 23) a P6 (Tabulka 24), které zaujímají koncentraci 0,0025g/1000ml.

26

Tabulka 25


48-72 hod 0-72 hod


34,00 65,00 110,00 110,00

ČAS v hod

LN KONEC

LN START

24 3,526361 2,995732 24 4,174387 3,526361 24 4,70048 4,174387 72 4,70048 2,995732

index SRR 0,0221 0,0270 0,0219 0,0237

Tabulka 26


48-72 hod 0-72 hod


19,00 45,00 78,00 78,00

ČAS v hod 24 24 24 72

LN KONEC

LN START

2,944439 3,806662 4,356709 4,356709

2,772589 2,944439 3,806662 2,772589

index SRR 0,0072 0,0359 0,0229 0,0220

Při nejvyšší koncentraci, tj. 0,025g/1000ml, zastoupenou body P7 (Tabulka 25) a P8 (Tabulka 26), již hodnota indexu nabývá mnohem nižší hodnoty, než u kontrolního vzorku. Z nahromaděných dat lze vyvodit závěr, že terbutryn, rovněž tak i monolinuron, mají vliv na přirozený buněčný cyklus buněk, který se aplikací těchto dvou látek stává narušeným a případně by to na živých organismech mohlo vyvodit i větší zdravotní problémy.

27

4 Závěr Dle výsledku výzkumu Vliv vybraných pesticidů na živočišné buňky L929 in vitro lze tvrdit, že vybrané pesticidy, tj. terbutryn a OASE, vliv na živočišné buňky mají. O jaký druh vlivu se jedná, lze nejlépe pozorovat na cytoplazmatické membráně obklopující každou buňku. Přítomnost pesticidů naruší přirozený cyklus buněk poškozením cytoplazmatické membrány, na což buňky reagují smrštěním do kuličky a dle koncentrace pesticidu lze pozorovat rychlost navrácení se buňky zpět do původního stavu. V koncentracích monolinuronu a terbutrynu, které jsme testovaly, byl přirozený buněčný cyklus buněk L929 narušen a tudíž se buňky dilatovaly a množily mnohem pomaleji. Avšak při testování terbutrynu jsme přišli na zajímavý úkaz, který zřejmě naznačuje vliv terbutrynu na nervovou soustavu. Dle (Obrázek 14) můžeme pozorovat, že po aplikaci terbutrynu, se buňky začaly řadit do nepřirozených útvarů, v tomto případě do řady. Monolinuron sám pouze inhyboval růst a zpomaloval navrácení buněk do přirozeného buněčného cyklu. Výsledkem těchto pokusů je základ pro následný výzkum míry vlivu terbutrynu a monolinuronu na buněčnou kulturu. Míru vlivu těchto pesticidů na živočišné buňky musí potvrdit až další výzkum v této oblasti.

28

5 Použité zdroje Úvodní přednáška Ing. Vítězslava Březiny, CSc. na Nových Hradech, 6.7.2016 Poznámky vedoucí projektu na Letní škole Šárky Beranové ze dne 19.6.2015-21.7.2015, 13.2.2016 Příbalový leták buněk L929/ECCAC, 5.12.2015 http://www.pheculturecollections.org.uk/products/celllines/generalcell/detail.jsp?refId=85011425&collection=ec acc_gc 5.12.2015 http://ghr.nlm.nih.gov/glossary=fibroblast 5.12.2015 http://www.worthington-biochem.com/try/ 5.12.2015 http://ekolist.cz/cz/zpravodajstvi/zpravy/chemie-ochrani-fasady-proti-plisni-ale-ohrozuje-zivot-vrekach 13.2.2016 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/monolinuron 13.2.2016 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Terbutryn#section=Top 13.2.2016 http://kurim.cz/filemanager/files/file.php?file=185677 6.2.2016 http://www.coleman.cz/ImgGalery/Img6/Soubory-Ke-Stazeni/03_Bezpecnostni-Listy/110_03017.pdf 13.2.2016 http://www.chemnet.com/cas/cz/886-50-0/terbutryn.html 13.2.2016 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/f2442?lang=en®ion=CZ 5.12.2015 http://www.aktin.cz/clanek/3230-aminokyseliny-l-glutamin 5.12.2015 http://www.stefajir.cz/?q=gentamicin 5.12.2015 http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.rec8247 31.1.2016 http://digilib.k.utb.cz/bitstream/handle/10563/16277/ond%C5%99%C3%AD%C5%A1ek_2011_ bp.pdf?sequence=1 7.2.2016 Obrázky: Letní škola Nové Hrady +http://www.nikoninstruments.com/cz_CZ/Products/Live-Cell-Screening-Systems/BioStationIM-Q/Overview-Key-Features 5.2.2016 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/monolinuron#section=Top 13.3.2016 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Terbutryn#section=Top 13.3.2016

29

6 Přílohy:

Obrázek 1 - Dilatované buňky L929

Obrázek 2 - NUNC miska s médiem

Obrázek 3 - Pasážování ve flow-boxu

Obrázek 4 - Versen Trypsin

Obrázek 5 - monolinuron strukturní vzorec19

Obrázek 6 - Algo universal

19

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/monolinuron#section=Top 13.3.2016

Obrázek 7 - terbutryn strukturní vzorec20

Obrázek 8 – Terbutryn

20

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Terbutryn#section=Top 13.3.2016

Obrázek 9 - PBS roztok v Erlenmeyerově baňce

Obrázek 10 - Žádané pH PBS roztoku

Obrázek 11 - Bürkerova komůrka

Obrázek 12 - Časosběrná sestava OLYMPUS

Obrázek 13 - Časosběrná sestava BIOSTATION21

21

http://www.nikoninstruments.com/cz_CZ/Products/Live-Cell-Screening-Systems/BioStation-IM-Q/Overview-KeyFeatures 5.2.2016

Obrázek 14- Vliv terbutrynu na buňky

Vliv vybraných pesticidů na živočišné buňky L929 in vitro

Recommend Documents