vitamin C p.a. (E. Merck) - Asam asetat glasial p.a. (E. Merck)

ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

BAB III ALAT, BAHAN DAN METODE PENELITIAN

1. Bahan-bahan yang Digunakan

.

- Asam askorbat/vitamin C p.a. (E. Merck) - Kolesterol p.a. (E. Merck) - Asam asetat glasial p.a. (E. Merck) - Asetat anhidrida p.a. (E. Merck) - Asam sulfat pekat p.a. (Riedel de Haen) - Natrium sulfat anhidrat p.a. (Ferak) - Heparin (Leo) - Mangan klorida tetrahidrat p.a. (E. Merck) 2. Alat-alat yang Digunakan - Spectrofotometer Hitachi dual wavelength

double beam

type 557 - Fisher melting point apparatus - Tabung pemusing - Labu ukur - Pipet volume - Mikropipet - Timbangan analitik Sartorius-Werke GMBH Type 2472 3.Cara Kerja 3.1. Analisis

Kualitatif terhadap Vitamin C

3.1.1. Pemeriksaan Organoleptis Meliputi

pemeriksaan warna, bentuk, bau dan

rasa.

27

SKRIPSI

PENGARUH PEMBERIAN VITAMIN C ...

JEMY TANDRA


28

3.1.2. Reaksi Warna - Larutan dalam air

mereduksi perak nitrat

dengan

segera dalam keadaan dingin, menghasilkan endapan hitam [28]. - 2 ml dari suatu larutan

2,0%

ditambah 2 ml air,

0,1 g natrium bikarbonat dan kurang lebih 0,02

g

ferro sulfat, kocok dan biarkan, dihasilkan warna deep-violet

(lembayung

tua), yang

hilang

pada

penambahan 5 ml asam sulfat encer [28]. - Larutan dalam air diberi 1 tetes larutan nitroprussid

dan

encer,

pada

maka

3

tetes

natrium

penambahan

natrium

hidroksida

hidrogen

klorida

encer tetes demi tetes terjadi warna biru [293 - Dalam

keadaan dingin, mereduksi

dengan

terbentuk

endapan

merah

larutan Fehling coklat

sampai

jingga kuning [29], - Larutan dalam

air

diberi

1

tetes larutan biru

metilen, maka lama-lama warna akan menjadi

pucat

bila diletakkan di tempat yang terang [29]. 3.1.3. Pemeriksaan Titik Lebur Kurang lebih 1 mg serbuk vitamin C dalam

pipa kapiler berdinding gelas

panjang

8

ujungnya ujung pipa

SKRIPSI

tipis

cm dan diameter 1 mm, yang tertutup.

pipa

Bahan didorong

kapiler yang terbuka,

yang tertutup diketuk-ketukkan


dimasukkan dengan

salah

masuk

satu

melalui

kemudian

ujung

sampai

bahan

JEMY TANDRA


29

mencapai

ujungnya. Pipa kapiler ini dipasang

pada

tempatnya, kemudian penangas air, dipanaskan perlahan-lahan. Ketika temperatur sekitar 15°C di titik leburnya, atur nyala api sehingga meningkat

dengan

kecepatan

1-2°C

bawah

temperatur per

menit.

Temperatur saat bahan mulai melebur sampai

melebur

sempurna disebut jarak titik lebur. Titik

lebur vitamin C adalah

190°C,

diikuti

dekomposisi [13, 14]. 3.2. Hewan Percobaan 3.2.1. Rancangan Percobaan heirirt percobun (tin o U

dipuasikia s e lm

I2-H jii

•

(files kolesterol to tii din kolesterol H#L

Grnp pertata

Keloipok I

(Ip. I I . 1

SKRIPSI

Grup kedua

Keloipok 11

(lp . 11.2

(lp . I I . 3

(elotpok I I I

(Ip. IV.l


Keloipok IV

Kip. IV.2

Kip. IV.3

JEMY TANDRA


30

Keterangan : Kelompok

I

: makanan dasar

Kelompok II.l : makanan dasar + vitamin C dosis 1 Kelompok II.2 : makanan dasar + vitamin C dosis 2 Kelompok II.3 : makanan dasar + vitamin C dosis 3 Kelompok

III : makanan dasar + kolesterol 3% 1 ml

Kelompok IV.1 : makanan dasar + kolesterol 3%

1 ml

+ vitamin C dosis 1 Kelompok IV.2 : makanan dasar + kolesterol 3%

1 ml

+ vitamin C dosis 2 Kelompok IV.3 : makanan dasar + kolesterol 3%

1 ml

+ vitamin C dosis 3 Dalam penelitian ini digunakan 40 ekor (Cavia Jl.

porcellus) yang diperoleh dari

Raya

Selecta No. 37,

Batu,

marmot

Peternakan,

dengan

kriteria

sebagai berikut : - berjenis kelamin jantan - berumur 2-3 bulan - bobot badan 250-400 gram - berada dalam keadaan normal dan sehat Pada dibagi

awal percobaan, 40 ekor marmot

tersebut

menjadi 8 kelompok (masing-masing

kelompok

5 ekor marmot) sebagai berikut : I.

Kontrol

normal : hewan

pecobaan

diberi

makanan dasar (kangkung, ubi dan jagung). II.

SKRIPSI

Dengan pemberian makanan dasar dan


vita-

JEMY TANDRA


31

min C, yang dikelompokkan atas : 11.1. Diberi makanan dasar dan vitamin

C

dosis 1. 11.2. Diberi makanan dasar dan vitamin

C

dosis 2. 11.3. Diberi makanan dasar dan vitamin

C

dosis 3. III. Dengan pemberian makanan dasar dan sterol 3% IV.

kole

1 ml.

Dengan pemberian makanan dasar, rol 3% dan vitamin C, yang

koleste

dikelompokkan

atas : IV.1. Diberi makanan dasar, kolesterol 3% 1 ml dan vitamin C dosis 1. IV.2. Diberi makanan dasar, kolesterol 3% 1 ml dan vitamin C dosis 2. IV.3. Diberi makanan dasar, kolesterol 3% 1 ml dan vitamin C dosis 3. Kolesterol dengan Vitamin

0.5% C

diberikan

dalam

bentuk

akasia

sebagai

bahan

diberikan

dalam

bentuk

suspensi

pensuspensi. larutan

yang

selalu dibuat baru. Masing-masing bulan secara

sesuai per

marmot diperlakukan selama

dengan oral.

Pada

dilakukan pengambilan

SKRIPSI

kelompok awal

dengan

pemberian

sebelum

penelitian

sampel darah


se-

dengan

terle-

JEMY TANDRA


32

bih

dahulu

marmot dipuasakan

selama

12-14

jam.

Pada akhir penelitian juga diambil sampel darah. 3.2.2. Pemilihan Dosis Dosis bahan penelitian yang digunakan merupakan dosis untuk

manusia yang dikonversikan pada

bina-

tang percobaan. Nilai konversi dosis manusia terha dap marmot 400 g adalah 0,031 [31]. Pada penelitian ini digunakan dosis 500 mg, 1 g dan 1,5 g. Dosis setara 500 mg = (500 mg x 0,031) : 400 g = 0,039 mg/g BB marmot Dengan cara yang sama, untuk dosis yang setara dengan 1 g dan 1,5 g diperoleh 0,078 mg/g BB marmot dan

0,116 mg/g BB marmot.

4. Uji Validasi 4.1. Kelurusan

Kelurusan didapatkan dari perhitungan

persamaan

garis regresi. n. Zxy - (2x) (Zy) r = ------------------------------^n.Zx2 - (Zx)a ) (n.2y2~ (SyT2 )' di mana :

r = koefisien korelasi x = kadar zat dalam larutan y = serapan yang terbaca

Persamaan garis : Y = bX + a di mana : a = Y - bx

SKRIPSI


JEMY TANDRA


33

n.Sxy - Zx.Zy b = -------------n.Zx2 - (Zx)2 4.2. Sensitivitas [27]

Untuk analisis instrumental harga LOD ditentukan dengan

cara menganalisa sejumlah sampel

blanko

dan

menghitung simpangan baku dari hasil yang didapatkan. Simpangan

baku

ini dikalikan dengan

suatu

faktor,

biasanya 2 atau 3, menghasilkan perkiraan dari LOD. Untuk

penentuan harga LOQ, simpangan

baku

ini

dikalikan dengan 10. 4.3. Presisi

Harga dingan

s

presisi dengan

didapatkan x

atau

berdasarkan

dengan

prosen

perbankoefisien

variasi. s % KV = — — x

. 100

/Z(x-x )2 s

= n-1

Keterangan : x = kadar sampel x = kadar sampel rata-rata n = jumlah sampel s = simpangan baku

SKRIPSI


JEMY TANDRA


34

4.4. Akurasi

Akurasi

metode

ini

dinyatakan

dalam

prosen

perolehan kembali (% Recovery) dengan persamaan :

% Recovery =

dimana :

-------CA + CB

. 100

= kadar sampel mula-mula Cg = kadar larutan baku yang ditambahkan Cjr = kadar sampel setelah penambahan larutan baku

5. Pembuatan Kurva Baku

Pada dan

penelitian ini diperlukan larutan baku induk

beberapa

larutan baku kerja. Larutan

baku

induk

dibuat dengan kadar 5000,0 ppm dengan pembuatan sebagai berikut : - Ditimbang dengan seksama 250,0 mg kolesterol dimasukk.an

ke

dengan

dalam asam

labu ukur 50

ml,

kemudian

asetat glasial sampai garis

ditambah tanda

dan

dikocok sampai homogen. - Larutan baku kerja

dibuat

dari pengenceran

larutan

baku induk, sehingga didapatkan beberapa maeam yaitu 1500.0

200,0 ppm; 400,0 ppm; 500,0 ppm:

kadar

1000,0

ppm; 2000,0 ppm; 2500,0 ppm; 3000,0

ppm

ppm; dan

4000.0 ppm.

SKRIPSI


JEMY TANDRA


35

5.1. Pemilihan Panjang Gelombang Maksimum Pada pemilihan panjang gelombang maksimum gunakan dua macam larutan baku kerja.

meng

Pelaksanaannya

sebagai berikut : - Dipipet dalam

0,2 ml tabung

larutan baku kerja reaksi yang

berisi

dimasukkan pereaksi

ke

warna

Liebermann-Burchard yang sebelumnya tabung direndam dalam

air es, kemudian dikocok sampai homogen

dibiarkan 30 menit dalam

pada suhu kamar, dimasukkan

kuvet dan dibaca serapannya, dicari

gelombang

dan

maksimum dengan

alat

ke

panjang

spektrofotometer.

Sebagai titik nol -digunakan blanko aquadest

ditam-

bah pereaksi warna Liebermann-Burchard yang

selan-

jutnya diperlakukan sama dengan larutan baku

kerja

kolesterol. 5.2. Pembuatan Kurva Baku Kurva kolesterol 200,0 ppm;

baku dalam

dibuat

dari

larutan

asam asetat glasial

baku

kerja

dengan

kadar

ppm; 400.0 ppm; 500,0 ppm; 1000,0 ppm; 2500,0 ppm; 3000,0 ppm; 4000,0 ppm

dan

ppm. Masing-masing larutan baku kerja tersebut

1500,0 5000,0 dire-

aksikan seperti pada (5.1) dan dibaca serapannya pada panjang

gelombang maksimum yang didapat dari

perco-

baaan (5.1). Dari data akan diperoleh persamaan garis regresi.

Sebagai titik nol digunakan larutan

blanko

dengan menggunakan aquadest ditambah pereaksi.

SKRIPSI


JEMY TANDRA


36

Liebermann

Burchard, yang

selanjutnya

diperlakukan

sama dengan larutan baku kerja kolesterol. 6. Pengambilan Sampel Darah Sebelum dilakukan pengambilan sampel darah, marmot yang akan diambil darahnya dipuasakan selama 12-14 sebelumnya.

Masing-masing

marmot

yang

akan

jam

diambil

darahnya secara intrakardial dianestesi dengan inhalasi eter (Aether anaestheticus) dengan painya

diperkirakan terca-

irama pernapasan yang teratur.

ditelentangkan

marmot

depan,

kemudian

diraba

bagian jantung yang memberikan denyut

terkuat.

Dengan

menggunakan

sebanyak

3

dengan posisi dada di

Setelah

spuit

disposable

darah

diambil

m l , kemudian darah dipindahkan

ke

tabung pemusing tanpa antikoagulan. Darah yang pul

dibiarkan

selama

30 menit pada

suhu

dalam terkum-

kamar

dan

kemudian dipusingkan selama 20 menit, sehingga serumnya terpisah.

Serum yang telah terpisah ini dimasukkan

daiam botol yang tertutup rapat, selanjutnya

ke

dilakukan

penentuan kadar [33]. 7. Penentuan Kadar 7-1. Penentuan Kadar Kolesterol Total Serum Kadar kolesterol total serum ditentukan metode

Huang

dan

kawan-kawan

pereaksi Liebermann-Burchard.

SKRIPSI

dengan

menurut

menggunakan

Metode ini menggunakan


JEMY TANDRA


37

satu

pereaksi warna yang dibuat dengan cara

sebagai

berikut : Ke dalam bejana yang direndam dalam air es, masukkan asam asetat glasial p.a., asetat drida

anhi

p.a., asam sulfat pekat p.a. dengan

bandingan 3:6:1, dicampur sampai homogen. dian

di

Kemu

ditambahkan ke dalamnya 2% Natrium

anhidrat

p.a.,

kemudian

per-

sulfat

dikocok

sampai

homogen. Penentuan kadar kolesterol total serum dilakukan dengan cara sebagai berikut : Ke

dalam tabung-tabung reaksi yang berisi 5

ml

pereaksi Liebermann-Burchard (sebelumnya

tabung

direndam dalam air es), dimasukkan dengan

hati-

hati

masing-masing 0,2 ml serum. Untuk

blanko

digunakan

aquadest

Liebermann-Burchard. tercampur pada

suhu

ditambah

Campuran

Serapan

pereaksi

dikocok

merata, kemudian dibiarkan kamar.

larutan

dari

sampai 30

menit

masing-masing

larutan tersebut dibaca dalam waktu tidak 10

menit pada panjang gelombang

lebih

maksimum

yang

terpilih, dengan menggunakan alat spektrofotometer [23]. Perhitungan

:

Untuk menghitung kadar kolesterol total, diguna kan

SKRIPSI

persamaan garis regresi yang diperoleh dari


JEMY TANDRA


38

percobaan (5.2). Catatan : Sebelum maka

mengalami

perlakuan,

dilakukan dulu penentuan kadar

kolesterol

total

hewan

dan

percobaan

kolesterol HDL

serum

sebagai

pem-

banding, 7.2. Penentuan Kadar Kolesterol HDL Serum

Untuk

penentuan

kadar

kolesterol

HDL

serum,

terlebih dahulu dilakukan teknik pengendapan selektif menggunakan

pereaksi

heparin

dan

Mangan

klorida.

Pengendapan

selektif ini berdasarkan sifat

lipopro

tein, yaitu kemampuannya untuk bereaksi dengan kation bervalensi proses

dua (Mn^+ ) dan polianion (heparin).

ini

lipoprotein-lipoprotein

dalam

serum akan diendapkan, kecuali

serum

yang

mengandung

HDL

ini

Pada

yang

terdapat

HDL,

kemudian

ditentukan

kadar

penentuan kadar kolesterol HDL ini,

serum

digunakan adalah serum yang diambil dari

hewan

kolesterol HDL-nya . Pada yang

percobaan yang telah dipuasakan sebelumnya selama 12 14

jam. Pelaksanaan penentuan kadar

kolesterol

HDL

serum adalah sebagai berikut : Sebanyak pemusing,

1 ml serum dimasukkan ke dalam kemudian

ditambahkan

tabung

berturut-turut

larutan heparin 5000 unit/ml sebanyak 40 nl, dan larutan

SKRIPSI

Mangan

klorida 16,4


gram/dl

sebanyak

JEMY TANDRA


39

50

nl. Campuran dikocok sampai homogen dan

diamkan menit,

30

menit pada suhu kamar.

Setelah

larutan disentrifugasi selama 20

di30

menit,

kemudian supernatannya dipisahkan. Bila supernatan

masih kelihatan keruh

kurang

sempurna,

berarti

maka harus

pengendapan

direaksikan

sampai pengendapan sempurna. Supernatan 0,2

ml dimasukkan ke dalam tabung

berisi 5 ml pereaksi warna yang

lagi

dipipet

reaksi

yang

Liebermann-Burchard,

sebelumnya tabung direndam dulu dalam

air

es. Selanjutnya kadar kolesterol HDL

ditentukan

sama

kolesterol

seperti

pada penentuan

kadar

total serum [23]. 8. Analisis data

Setelah didapatkan data hasil percobaan, dilakukan uji

statistik yaitu uji anakova

(analisis

kovarian),

dengan a = 0,05 [34, 35, 36].

SKRIPSI


JEMY TANDRA


40

I X

II Y

IV

III

X

X

Y

Y

X

Y

X 11 Y 11 X 12 Y 12 X 13 Y 13 X 14 Y 14 X21 Y21 X22 Y22 X23 Y23 X24 Y24 X31 Y31 X32 Y32 X33 Y33 X34 Y34 X41 Y41 X42 Y42 X43 Y43 X44 Y44 X51 Y51 X52 Y52 X53 Y53 X54 Y54 Total 2X Rata^

X

ZY

ZX

2Y

2X

ZY

SX

2Y

Y

X

Y

X

Y

X

Y

I, II, III, IV = kelompok X = kadar

kolesterol total

atau

kolesterol

HDL

atau

kolesterol

HDL

sebelum perlakuan Y = kadar

kolesterol total

* setelah perlakuan i = kolom 1, 2, ..., t j = baris 1. 2, ..., n

SKRIPSI


JEMY TANDRA


41

Tabel Anakova Pro CRD Sumber

Dikoreksi

JK db

variasi

2xx

Zxy

2yy

t-1

Txx

Txy

Tyy

N-t

Exx

Exy

Eyy

JKS

db

RJK

Antar kelompok Dalam SE

N-t-1

St +E

N-2

ST+E~

t-1

kelompok Jumlah

Sxx

N-l

Sxy

Syy

SE

SE db

ST+E“SE t-1

( St +E - Sg )/(t-1) F hitung Anava = -----------------SE/(N-t-l) db :

= t-1 V2 = N-t-1

E2xy/Exx F hitung regresi = ---------Sg/(N—t—1) db : v1 = 1 V2 = N-t-1 Keterangan : db = derajat bebas JK = Jumlah kuadrat JKS = Jumlah kuadrat sisa RJK = Rata-rata jumlah kuadrat

SKRIPSI


JEMY TANDRA


42

Sxx = koreksi jumlah total kuadrat dari X t n (2 2 X±i )2 t n i=l j= l = 2 . 2 X*i d ----------------i=l j=l t 2 n i=l Sxy = koreksi jumlah total hasil dari X dan Y t

n

t

n

, (i=l * j-1 * XU >(i=l * j=l * Yid } t n = 2 2 Xij Yi j ---------------------------i=l j=l t 2 n i=l Syy = koreksi jumlah total kuadrat dari Y t (2

n 2

Yi j )2

t n i=l j=l = 2 2 Y - i j -----------------i=l j=l t 2n i=l Txx = perlakuan jumlah kuadrat dari X t ! i= l

n j=1 n

SKRIPSI

t n <2 Z Xij i=l j= l t 2n i=l


JEMY TANDRA


43

Txy = perlakuan jumlah hasil dari X dan Y t n n 2 { Z Xi(j )( 2 Yid ) i=l j=l j=l

t n t n (2 Z Xid )( Z Z i=l j=l i=l j=i

n

t Z n i=l

Tyy = perlakuan jumlah kuadrat dari Y t n Z ( Z Yi(j >■ i=l j=l

t n ( Z Z Yij )» i-1 j~l

n

t Z n i=l

Exx = Sxx - Txx Exy = Sxy - Txy Eyy - Syy - Tyy E2xy Sj? = E y y ----~ Exx

^T+E “ ' Jika

F hitung

mengetahui atau

S* xy — --Sxx

tidak.

>

F tabel (ada perbedaan),

apakah perbedaan yang terjadi itu dilakukan uji HSD

(Honestly

untuk

bermakna

Significant

Difference). /RJiT HSD “ q a,k,N - k.\

SKRIPSI

n


JEMY TANDRA


44

Jika

beda mean > HSD, berarti ada beda yang

ber-

makna dan jika beda mean < HSD, berarti tidak ada

beda

yang bermakna.

SKRIPSI


JEMY TANDRA

vitamin C p.a. (E. Merck) - Asam asetat glasial p.a. (E. Merck)

Recommend Documents