A növekedési faktorok szerepe egyes kutyabetegségek gyógyításában
VII. Praxismenedzsment konferencia és állatorvosi asszisztens továbbképzés Budapest, 2013. november 23. Gyetvai Béla – Kun Csaba
Témafelvetés • Rövid áttekintés a növekedési faktorokról • A Humanofort®-ról • Preklinikai kísérletek (oxidatív stressz, hámsejt regenerálódás, gyomor nyálkahártya védelme a peptikus fekélyképzőkkel szemben in vitro és patkányban) • Akut, szubakut toxicitási vizsgálatok • Klinikai mozgásszervi és szőrnövekedési vizsgálatok eredményei
Növekedési faktorok Szuper-család
Jellegzetes családtag
Receptor-típus
Citokin családok
CSF, EPO, CNTF, LIF, IL 1-22, TNF-család
Sok féle…….
EGF
EGF, Neuregulin , TGF-α
Trk
FGF
FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, ….. FGF-15
Trk
NGF
NGF
Trk, p75
PDGF
PDGF, VEGF
Trk
TGF
TGFb-1/-4,-5(X) TGFb -2,TGFb -3
Ser/Tyr kinázok
Insulin
IGF-1,2
Aminosav összetétel Minta megnevezése, azonosítója Humanofort átlag
Aminosav megnevezése Aszparaginsav Treonin Szerin Glutaminsav Prolin Glicin Cisztin Alanin Valin Metionin Izoleucin Leucin Tirozin Fenilalanin Hisztidin Lizin Arginin Aminosav összesen
Aminosav tartalom (%) 0,82 0,42 0,49 1,10 0,23 0,41 0,13 0,49 0,41 0,18 0,36 0,68 0,32 0,40 0,50 0,62 0,20 7,76
Zsírsav összetétel Minta megnevezése, azonosítója
Humanofort átlag
Zsírsav megnevezése Kapronsav C6:0 Mirisztinsav C14:0 Palmitinsav C16:0 Palmitolajsav C16:1 Margarinsav C17:0 C10-Heptadecénsav C17:1 Sztearinsav C18:0 Olajsav C18:1n9c Linolsav C18:2n6c Arachinsav C20:0
Zsírsav tartalom (mg/kg) 49 66 3901 451 20 44 1003 4948 313 25
Gadolajsav C20:1 Eikozapenténsav C20:5n3c Behénsav C22:0 Zsírtartalom (g/kg) Omega 3 zsírsavak összesen Omega 6 zsírsavak összesen
17 97 42 10,98 97 313
Humanofort®-ról röviden • Humanofort® = standardizált csirkeembrió-kivonat, (standardized extract of chicken embryo, SECO) • Toxikológiai profil (akut és krónikus toxicitás) Nem toxikus. • Mutagenitás vizsgálatok ( micronuclei teszt, citogenikus vizsgálat, Ames-teszt) Nem mutagén. • Onkogenicitás és onkostimuláns hatás vizsgálata Nem onkogén, egyes esetekben tumorcsökkenés volt megfigyelhető patkánykísérletekben.
Humanofort®-ról röviden Preklinikai tanulmányok • SECO hatása növényi szövetekre: gibberellin-indukálta enzimek (pl. aamilázok) fokozása. • SECO és SECO-ból izolált peptidek fokozzák a humán fibroblasztok antioxidáns kapacitását • Humanofort® fokozza a 3H-timidin beépülését a humán fibroblaszt sejtekbe • SECO-ból izolált peptidek citoprotektív és citostimuláns aktivitása • Bulk Humanofort® (SECO + keményítő) és SECO fokozza a szteroidhormonok metabolitjainak vizelettel ürítését • SECO hepatoprotektív és antioxidáns hatása toxikus hepatitisben • Bulk Humanofort® pozitívan hatott a kísérleti állatok élettartamára
Humanofort®-ról röviden Néhány klinikai tanulmány (humán vizsgálatok) • Treatment with Humanofort® in sexual disfunctionality of psychogenic nature (Zbranca, Vulpoi, Alexandrescu - Jassy, Romania. • Effect of treatment with Humanofort® on neurosis (Predescu, Giurgiuca – Gh. Marinescu Hospital, Romania) • Clinical research of Humanofort® effects on ageing (Suloc, Dobre, Olinescu – Nat. Inst. of Geriatrics, Romania) • Oxidativ stress decrease and clinical improvement on elderly treated with Humanofort® (Groin, Oiliness, Inst. of Oncology, Timisoara) • Oxidativ stress decrease in old patient treated with drugs containing embryo peptides (Mohasco, Oiliness, Ounce – Lab. Hyppocrate)
Preklinikai kísérletek I. A HUMANOFORT® HATÁSA CITOKIN GÉNEXPRESSZIÓVAL KIVÁLTOTT OXIDATÍV STRESSZRE IPEC-J2 SEJTEKNÉL JERZSELE BT. ÉS SZENT ISTVÁN EGYETEM
MEZŐGAZDASÁG-ÉS KÖRNYEZETTUDOMÁNYI KAR 2010
A HUMANOFORT® HATÁSA CITOKIN GÉNEXPRESSZIÓVAL KIVÁLTOTT OXIDATÍV STRESSZRE IPEC-J2 SEJTEKNÉL HF oxidatív stresszre mutatott előnyös hatását vizsgáló kísérleti elrendezés Plate 1-3
1500 μl plain medium (control) 1500 μl plain medium (control) 1300 μl plain medium 200 μl 0.1% Humanofort/PBS (CHumanofort final=0.013% ) 1300 μl plain medium 200 μl 0.1% Humanofort/PBS (CHumanofort final=0.013% )
1150 μl plain medium 150 μl 10 mM H2O2 200 μl 0.01% Humanofort/PBS ( H2O2 + 0.0013%Humanofort) 1150 μl plain medium 150 μl 10 mM H2O2 200 μl 0.01% Humanofort/PBS ( H2O2 + 0.0013%Humanofort)
1350 μl plain medium 150 μl 10 mM H2O2 (1mM H2O2) 1350 μl plain medium 150 μl 10 mM H2O2 (1mM H2O2)
1300 μl plain medium 200 μl PBS 1300 μl plain medium 200 μl PBS
1150 μl plain medium 150 μl 10 mM H2O2 200 μl 0.1% Humanofort/PBS ( H2O2 + 0.013%Humanofort) 1150 μl plain medium 150 μl 10 mM H2O2 200 μl 0.1% Humanofort/PBS ( H2O2 + 0.013%Humanofort)
1150 μl plain medium 150 μl 10 mM H2O2 200 μl PBS
1300 μl plain medium 200 μl 0.01% Humanofort (CHumanofort final=0.0013% ) 1300 μl plain medium 200 μl 0.01% Humanofort (CHumanofort final=0.0013% )
1150 μl plain medium 150 μl 10 mM H2O2 200 μl PBS
A HUMANOFORT® HATÁSA CITOKIN GÉNEXPRESSZIÓVAL KIVÁLTOTT OXIDATÍV STRESSZRE IPEC-J2 SEJTEKNÉL 1 % Humanofort filtrátum/szuszpenzió hatása 1 mM hidrogén-peroxidra 1 órás inkubációt követően szobahómérsékleten. Mindkét 1% Humanofort filtrátum és szuszpenzió szignifikánsan csökkentette a minta peroxid-tartalmát.
H2O2 concentration (mM)
Interaction of Humanofort and 1 mM H2O2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
0h 1h
Control
Filtrate
Suspension
A HUMANOFORT® HATÁSA CITOKIN GÉNEXPRESSZIÓVAL KIVÁLTOTT OXIDATÍV STRESSZRE IPEC-J2 SEJTEKNÉL Peroxid-indukált oxidatív stressz hatékonyan gátolható 0.01% HF-tal az IL-8 és TNF-α citokin termelési profilra vonatkozóan (csillagok=szignifikáns különbségek) 12,0 11,0 10,0
Relative gene expression
9,0 8,0 7,0
IL-6 IL-8
6,0
TNF-a 5,0
*
4,0 3,0
*
*
2,0 1,0 0,0 1 mM H2O2+200 PBS
1 mM H2O2+1%HF 1 mM H2O2+0,5% HF
1 mM H2O2+0,1%HF
1 mM H2O2+0,05%HF
1 mM H2O2+0,01%HF
1mM H2O2+0,001%HF
1mM H2O2+0,0001%HF
A HUMANOFORT® HATÁSA CITOKIN GÉNEXPRESSZIÓVAL KIVÁLTOTT OXIDATÍV STRESSZRE IPEC-J2 SEJTEKNÉL
Következtetések Megállapítható, hogy a HF gyulladásgátló és antioxidáns hatású alacsonyabb koncentrációk mellett (0,1 - 0,001%), miközben prooxidáns hatású magasabb koncentrációkban (1%). Ezeknél nagyobb koncentrációknál azonban közvetlen - feltehetően kémiai – hidrogén-peroxid inaktiválás bizonyulhat jótékony hatásúnak.
Preklinikai kísérletek II. A HUMANOFORT® HATÁSA KUTYA BŐRBIOPTÁTUMBÓL SZÁRMAZÓ ELSŐDLEGES EPITELIÁLIS SEJTEKEN ÉS FIBROBLASZT KULTÚRÁKON JERZSELE BT. ÉS SZENT ISTVÁN EGYETEM
MEZŐGAZDASÁG-ÉS KÖRNYEZETTUDOMÁNYI KAR 2010
A HUMANOFORT® HATÁSA KUTYA BŐRBIOPTÁTUMBÓL SZÁRMAZÓ ELSŐDLEGES EPITELIÁLIS SEJTEKEN ÉS FIBROBLASZT KULTÚRÁKON
A HUMANOFORT® HATÁSA KUTYA BŐRBIOPTÁTUMBÓL SZÁRMAZÓ ELSŐDLEGES EPITELIÁLIS SEJTEKEN ÉS FIBROBLASZT KULTÚRÁKON
Giemsa stained 18 day-old primary epithelial and fibroblast cell culture of dog skin (6-well plate, macroscopic picture). Upper wells treated with 0.01% Humanofort®. Lower wells are non-treated controls.
* A significant difference (*P < 0.05) was noted for Humanofort® treatment compared with their controls. Student two-sample t-test was used for statistical analysis
A HUMANOFORT® HATÁSA KUTYA BŐRBIOPTÁTUMBÓL SZÁRMAZÓ ELSŐDLEGES EPITELIÁLIS SEJTEKEN ÉS FIBROBLASZT KULTÚRÁKON Kolóniák száma a kontroll és a Humanofort® -tal kezelt sejtkultúrákban Kezelés
Kontroll csoport
0.01% Humanofort®-tal kezelt csoport
Kolóniák száma
2±0.8
9.3±2.5*
Szignifikáns különbség (*P < 0.05) állapítható meg Humanofort® kezelésnél a kontrolllhoz képest. Student kétmintás t-teszt alkalmazása a statisztikai elemzéshez.
A HUMANOFORT® HATÁSA KUTYA BŐRBIOPTÁTUMBÓL SZÁRMAZÓ ELSŐDLEGES EPITELIÁLIS SEJTEKEN ÉS FIBROBLASZT KULTÚRÁKON EREDMÉNYEK
•
(1) Humanofort® 0.01% koncentrációja fokozza az epitel és fibroblaszt-szerű sejtek növekedését a kutya bőréből nyert elsődleges sejtkultúrákban.
•
(2) Humanofort® jelenlétében nagyszámú rétegzett epiteliális sejtkolónia alakul ki.
•
(3) Ez a hatás azt jelzi, hogy a Humanofort® hozzáadásával a kutya bőrének reepitelizációja stimulálható.
•
(4) Tapasztalatunk szerint a Humanofort® stimuláló hatása – részben- a növekedési faktor receptorok (EGFR) aktiválásának fokozásával vagy az epiteliális növekedési faktor expresszió regulációjával magyarázható.
Preklinikai kísérletek III. A HUMANOFORT® HATÁSA AZ ACETIL-SZALICILSAVVAL KEZELT GASZTROINTESZTINÁLIS SEJTEKRE JERZSELE BT. ÉS SZENT ISTVÁN EGYETEM
MEZŐGAZDASÁG-ÉS KÖRNYEZETTUDOMÁNYI KAR 2010
A HUMANOFORT® HATÁSA ACETIL-SZALICILSAVVAL KEZELT GASZTROINTESZTINÁLIS SEJTEKRE
Tanulmány célja • (1) A tanulmány célja az acetil-szalicilsav hatásának vizsgálata sejtkultúrákra • (2) Humanofort® hatásának vizsgálata acetilszalicilsavval kezelt IEC-18 patkány bélsejtvonalon.
A HUMANOFORT® HATÁSA ACETIL-SZALICILSAVVAL KEZELT GASZTROINTESZTINÁLIS SEJTEKRE Fluoreszcens mikroszkópos kép DAPI-val jelzett IEC-18 sejtmagok 7.4 mmol/l ASA-val kezelt mintákban . Fragmentált sejtmagok apoptosist jeleznek.
A HUMANOFORT® HATÁSA ACETIL-SZALICILSAVVAL KEZELT GASZTROINTESZTINÁLIS SEJTEKRE Fluoreszcens mikroszkópos kép DAPI-val jelzett IEC-18 sejtmagok 7.4 mmol/l ASA-val és 0,01% Humanofort® -tal kezelt mintákban . Nincsenek fragmentált sejtmagok.
A HUMANOFORT® HATÁSA ACETIL-SZALICILSAVVAL KEZELT GASZTROINTESZTINÁLIS SEJTEKRE EREDMÉNYEK
•
(1) Humanofort® magas koncentrációban (0.1%) csökkenti a a patkány intesztinális epiteliális sejtek proliferációs képességét acetil-szalicilsav jelenlétében. Ez a magas koncentráció gátolja a patkány ileális epitelsejt regenerációját.
•
(2) Humanofort® alacsonyabb koncentrációban (0.01%) szignifikánsan növeli a patkány intesztinális epiteliális sejtek proliferációs rátáját acetil-szalicilsav jelenlétében. Szignifikánsan magasabb száma figyelhető meg az osztódó sejteknek, ha ezt a HF –koncentrációt adják az IEC-18 sejtvonalhoz.
•
(3) Mindez azt jelzi, hogy a Humanofort® hatása acetil-szalicilsavval kezelt gasztrointesztinális sejtekre erősen dózisfüggő.
HUMANOFORT® AKUT ORÁLIS TOXICITÁS TESZT EREDMÉNYE • Humanofort® akut orális toxicitás teszt kivitelezése OECD 423 „Guideline for Acut Oral Toxicity – Acut Toxic Class Method” alapján (Study Code: HF-012011, SZIE, GYMT) • A Humanofort® tesztanyag toxikus anyagnak nem minősíthető és GHS Category 5 –be sorolható.
HUMANOFORT® 28 NAPOS ISMÉTELT ADAGGAL VÉGZETT ORÁLIS TOXICITÁS TESZT EREDMÉNYE
• Humanofort® teszt kivitelezése OECD 407 „Guideline for Repeated Dose 28-day Oral Toxicity Study in Rodents” alapján (Study Code: HF-02-2011, SZIE, GYMT) • A Humanofort® tesztanyag nem bizonyult toxikusnak 28 napos adagolást követően sem egereknél.
Klinikai kísérletek I. HUMANOFORT® HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA MESTERSÉGESEN INDUKÁLT GYOMORFEKÉLY MEGELŐZÉSÉRE PATKÁNYOKBAN 21 NAPOS ORÁLIS KEZELÉSSEL KÓRSZÖVETTANI KIÉRTÉKELÉSSEL SZENT ISTVÁN EGYETEM MEZŐGAZDASÁG-ÉS KÖRNYEZETTUDOMÁNYI KAR
ÉS ORSZÁGOS KÖRNYEZETEGÉSZSÉGÜGYI INTÉZET 2011
HUMANOFORT® HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA MESTERSÉGESEN INDUKÁLT GYOMORFEKÉLY MEGELŐZÉSÉRE PATKÁNYOKBAN 21 NAPOS ORÁLIS KEZELÉSSEL KÓRSZÖVETTANI KIÉRTÉKELÉSSEL
• Humanofort® stressz-ellenes hatásának vizsgálata patkányokban, a modell prednizolonnal mesterségesen indukált gyomorfekély gyakoriságának elemzésén alapult. Exterminálás és kórboncolás vizsgálat 22. napján. • Kezelt állatoknál elhullás nem volt, 21 napos adagolásnál kóros tünetek nem jelentkeztek. • Kísérleti anyagnak nem volt hatása a kísérleti állatok testtömegére. • Statisztikai elemzéssel megállapítható volt, hogy a Humanofort® 1 mg/ttkg dózisban 21 napig orálisan adagolva patkányokban a pozitív kontroll és a csak vivőszerrel kezelt egyedekhez képest SZIGNIFIKÁNS MÉRTÉKBEN CSÖKKENTETTE A MESTERSÉGESEN INDUKÁLT GYOMORFEKÉLY ELŐFORDULÁSÁNAK GYAKORISÁGÁT.
Klinikai kísérletek II. HUMANOFORT HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA CÉLÁLLATFAJON (KUTYA) A KONZERVATÍV KEZELÉST IGÉNYLŐ, FÁJDALOMMAL JÁRÓ MOZGÁSZAVAROK TÜNETEIRE (AHESST DOG TM1) ÉS A SZŐRNÖVEKEDÉSRE (AHESST DOG TO1) Vizsgálati helyek és vizsgálatvezetők:
Talpas Állategészségügyi Kft. Dr. Papp Antal 1116 Mesterházi u. 4. PRIMAVET Állatkórház Kft. Dr. Kendik Zsolt 1152 Budapest, Rákos út 60.
Vezér Állategészségügyi Centrum Kft. Dr. Dancsházi Tibor 4032 Debrecen, Szikes u. 6. Netvet Kft. Dr. Nagy Elek 4034 Debrecen, Holló L. u.24.
HUMANOFORT HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA CÉLÁLLATFAJON (KUTYA) A KONZERVATÍV KEZELÉST IGÉNYLŐ, FÁJDALOMMAL JÁRÓ MOZGÁSZAVAROK TÜNETEIRE ÉS A SZŐRNÖVEKEDÉSRE • ANYAG ÉS MÓDSZER A vizsgálatokat 4, egymástól független vizsgáló helyen végeztük, 12-12 állat bevonásával. Az állatok az egyes vizsgálati helyeken felváltva kaptak a hatóanyagot tartalmazó és a placebo készítményből a kezelés időtartamára elegendő mennyiséget, melyet a vizsgáló állatorvos vakon osztott ki (6 állat placebot, 6 állat hatóanyagot tartalmazót, vizsgálati helyenként).
HUMANOFORT HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA CÉLÁLLATFAJON (KUTYA) A KONZERVATÍV KEZELÉST IGÉNYLŐ, FÁJDALOMMAL JÁRÓ MOZGÁSZAVAROK TÜNETEIRE ÉS A SZŐRNÖVEKEDÉSRE • ANYAG ÉS MÓDSZER A TM1 vizsgálatban az állatok mozgásának ill. a mozgásszervi tüneteknek a változását egy pontozásos adatlap segítségével vettük fel, a TO1 vizsgálatban a szőr hosszát mm-ben vettük fel. A TM1 vizsgálat során a 0. napon mért pontértéket a 42. napon mérttel hasonlítottuk össze, a TO1 vizsgálat során a 14. napon és a 30. napon mm-ben mért szőrhosszakat hasonlítottuk össze.
HUMANOFORT HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA CÉLÁLLATFAJON (KUTYA) A KONZERVATÍV KEZELÉST IGÉNYLŐ, FÁJDALOMMAL JÁRÓ MOZGÁSZAVAROK TÜNETEIRE ÉS A SZŐRNÖVEKEDÉSRE • EREDMÉNYEK AHESST DOG TM1 A vizsgálat során azt találtuk, hogy a hatóanyagot tartalmazó készítménnyel történt kezelés szignifikánsan eredményesebb volt, a kezelés során a mozgásszervi tünetek súlyosságát jelző pontértékek átlagosan 6,09 ponttal csökkentek a hatóanyagot tartalmazó készítmény etetése során, szemben az átlagosan 2,00 pontos csökkenéssel a placebo készítmény etetése során.
HUMANOFORT HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA CÉLÁLLATFAJON (KUTYA) A KONZERVATÍV KEZELÉST IGÉNYLŐ, FÁJDALOMMAL JÁRÓ MOZGÁSZAVAROK TÜNETEIRE ÉS A SZŐRNÖVEKEDÉSRE • EREDMÉNYEK AHESST DOG TO1 A vizsgálat során azt találtuk, hogy a hatóanyagot tartalmazó készítmény adagolása mellett a szőrnövekedés szignifikánsan nagyobbnak bizonyult a placebo adagolása mellett mért értékeknél. Az ártalmatlanságra irányuló vizsgálatok egy esetben sem mutattak releváns eltérést, mely a készítmény adagolására lett volna visszavezethető.
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!
