VESZPRÉMI EGYETEM *(25*,.210(=
*$='$6È*78'20È1<,.$5
KESZTHELY Növényvédelmi Intézet Növénykórtani és Növényvirológiai Tanszék
Növénytermesztési és Kertészeti tudományok Doktori Iskola 'RNWRULLVNRODYH]HW
Dr. Horváth József az MTA rendes tagja TémaYH]HW
Dr. Gáborjányi Richard egyetemi tanár
PAPRIKA ENYHE TARKULÁS VÍRUS (PEPPER MILD MOTTLE VIRUS, PMMoV) IZOLÁTUMOK PATOLÓGIAI, SZEROLÓGIAI ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI JELLEMZÉSE
Készítette: KÁLMÁN DÓRA
Keszthely 2003
2
3
PAPRIKA ENYHE TARKULÁS VÍRUS (PEPPER MILD MOTTLE VIRUS, PMMoV) IZOLÁTUMOK PATOLÓGIAI, SZEROLÓGIAI ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI JELLEMZÉSE
Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Kálmán Dóra Készült a Veszprémi Egyetem Növénytermesztési és Kertészeti tudományok Doktori iskolája keretében 7pPDYH]HW
'U*iERUMiQ\L5LFKDUG
Elfogadásra javaslom (igen/nem)
…………………………….
A jelölt a doktori szigorlaton ……… % -ot ért el, Keszthely,
…...………………………… A Szigorlati Bizottság elnöke
Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: Dr. Kazinczi Gabriella
igen/nem ………..………………………
Bíráló neve: Dr. Takács András Péter
igen/nem
……………………………….. A jelölt az értekezés nyilvános vitáján ……. %-ot ért el Keszthely,
…….…………………………. A Bíráló Bizottság elnöke
$GRNWRUL 3K' RNOHYpOPLQ
VtWpVH«««««««««
...…………………………. Az EDT elnöke
4
TARTALOMJEGYZÉK
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE KIVONAT ABSTRACT ZUSAMMENFASSUNG 1.
BEVEZETÉS
8
2.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
2.1.
A paprika termesztése
2.2.
A paprikavírusok
2.3.
A Tobamovirus nemzetség
2.3.1.
A tobamovírusok evolúciója
2.3.2.
A tobamovírusok patotípusai
2.3.3.
A tobamovírusok csoportosítása
2.3.4.
$]
HJ\HV
SDSULNiW
IHUW
]
10
WREDPRYtUXVRN
UpV]OHWHVHEE
jellemzése 2.3.5.
A tobamovírusok nukleotid szekvenciája és replikációja
2.3.6.
A tobamovírusok terjedése
2.3.7.
$WREDPRYtUXVRNHOOHQLYpGHNH]pVOHKHW
2.3.7.1.
Biológiai módszerek a tobamovírusok elleni védekezésben
2.3.7.2.
Biotechnológiai módszerek a tobamovírusok elleni védekezésben
2.3.7.3.
Agrotechnikai eljárások a tobamovírusok elleni védekezésben
2.3.7.4.
A tobamovírusok elleni rezisztencianemesítés hazai eredményei
3.
ANYAG ÉS MÓDSZER
VpJHL
5
3.1.
Tesztnövény vizsgálatok
3.1.1.
Vizsgálati anyag
3.1.2.
Vizsgálati módszer
3.2.
Szerológiai és elektronmikroszkópos vizsgálatok
3.3.
Molekuláris virológiai vizsgálatok
3.3.1.
Össz-nukleinsav kivonás és tisztítás
3.3.2.
DNS másolat készítése reverz transzkripcióval
3.3.3.
Polimeráz láncreakció (PCR)
3.3.4.
Gélelektroforézis
3.3.5.
5HNRPELQiQVSOD]PLGRNHO
3.3.6.
A rekombináns plazmidok bejuttatása baktérium sejtekbe
3.3.7.
A rekombináns plazmidok felszaporítása
3.3.8.
A plazmidok tisztítása
3.3.9.
A nukleotid sorrend meghatározása
3.4.
A paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV) izolátumok összehasonlító vizsgálata
3.4.1. 3.4.2.
3.5.
4.
iOOtWiVD
Szekvencia analízis 5HVWULNFLyVHQ]LPDQDOt]LVpVNHYHUWIHUW
]pVHVNtVpUOHW
A paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV) növényen belüli terjedésének vizsgálata EREDMÉNYEK
4.1.
Tesztnövény vizsgálatok
4.2.
Szerológiai és elektronmikroszkópos vizsgálatok
4.3.
Molekuláris virológiai vizsgálatok
4.4.
A paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV) izolátumok összehasonlító vizsgálata
4.4.1.
Szekvencia analízis
6
4.4.2.
4.5.
Restrikciós enzim analízis ésNHYHUWIHUW
]pVHVNtVpUOHW
A paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV) növényen belüli terjedésének vizsgálata
5.
KÖVETKEZTETÉSEK, JAVASLATOK
6.
ÖSSZEFOGLALÁS
7.
ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK
8.
NEW RESULTS
9.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
10. IRODALOMJEGYZÉK AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN KÉSZÜLT KÖZLEMÉNYEK
7
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
A260/280 = abszorpciós spektrum minimum és maximum aránya AMV = Alfalfa mosaic virus, lucerna mozaik vírus Asn = asparagin, aszparagin BBWV = Broadbean wilt virus, lóbab hervadás vírus BMV = Brome mosaic virus, rozsnok mozaik vírus BpeMV = Bell pepper mottle virus, harang alakú paprika tarkulás vírus BTH = 1,2,3-benzotiadiazol-7-trikarboxi-S-metilészter cDNS = copy DNS, DNS másolat CGMMV = Cucumber green mottle mosaic virus, uborka zöld tarkulás mozaik vírus CMV = Cucumber mosaic virus, uborka mozaik vírus CP = coat protein, köpenyfehérje ELISA = Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, Enzimhez kötött Immunoszorbens Vizsgálat DAS-ELISA = Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immuno SorbeQW$VVD\.HWW
V$QWLWHVW6]HQGYLFV(Q]LPKH]
kötött Immunoszorbens Vizsgálat DYFV = Dulcamara yellow fleck virus, csucsor sárga foltosság vírus GS = gene silencing, „géncsendesítés” HeMV = Henbane mosaic virus, beléndek mozaik vírus HR = hypersensitive reaction, hiperszenzitív reakció INA = 2,6-dikloro-izonikotinsav ICTV = International Committee on Taxonomy of Viruses, Nemzetközi Vírus Taxonómiai Bizottság kD = kilodalton
8
Met = methionine, metionin MP = movement protein, mozgásfehérje nt = nukleotid ObPV = Obuda pepper virus, Óbuda paprika vírus ORF = open reading frame, nyitott leolvasási keret PaMMV = Paprika mild mottle virusI
V]HUSDSULNDHQ\KHWDUNXOiV
vírus PCR = polimerase chain reaction, polimeráz láncreakció PMMoV = Pepper mild mottle virus, paprika enyhe tarkulás vírus PPV = Plum pox virusV]LOYDKLPO
YtUXV
PVX = Potato virus X, burgonya X vírus PVY = Potato virus Y, burgonya Y vírus SA = salicylic acid, szalicilsav SoMV = Sowbane mosaic virus, Chenopodium mozaik vírus TAV = Tomato aspermy virus, paradicsom magtalanság vírus TEV = Tobacco etch virus, dohány karcolatos vírus TMGMV = Tobacco mild green mosaic virus, dohány enyhe zöld mozaik vírus TMV = Tobacco mosaic virus, dohány mozaik vírus ToMV = Tomato mosaic virus, paradicsom mozaik vírus tRNS = transzfer RNS TSWV = Tomato spotted wilt virus, paradicsom bronzfoltosság vírus
9
KIVONAT
Paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV) izolátumok patológiai, szerológiai és molekuláris biológiai jellemzése $
GLVV]HUWiFLy
D
SDSULNDWHUPHV]WpVEHQ
MHOHQW
V
NiURNDW
RNR]y
tobamovírusok, azon belül a hazai paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV) izolátumok részletes vizsgálatával foglalkozik. $V]HU] ND] pVN|]|WWJ\ WHUOHWHLU
O
V]iUPD]y
WHV]WQ|YpQ\HN
PLQWiNEDQ ]pVpYH
IHUW
MW|WW0DJ\DURUV]iJNO|QE|]
WDOiOW
l,
WREDPRYtUXVRN
DAS-ELISA
D]RQRVtWiViW
vizsgálatokkal,
elektronmikroszkópos eljárással és polimeráz láncreakcióval (PCR) végezték.
A
molekuláris
biológiai
vizsgálatok
során
univerzális
tobamovírus és vírus-specifikus primereket (TMV-U1, PMMoV, ObPV) terveztek
a
hazánkban
leggyakrabEDQ
HO
IRUGXOy
WREDPRYtUXVRN
azonosítására. A primereket saját és autentikus izolátumokkal tesztelték. A hazai PMMoV izolátumok köpenyfehérje gén szakaszának részletét klónozták és szekvenálták. Az így kapott szekvenciákat egybevetették az adatbankban található külföldi PMMoV izolátumok szekvenciáival, ennek alapján
filogenetikai
izolátumokat
törzsfát
szerkesztettek.
összehasonlították a
UHVWULNFLyV HQ]LP DQDOt]LV NHYHUW IHUW
spanyol
A
magyar
PMMoV
PMMoV izolátumokkal
]pVHV NtVpUOHW pV XQ WLVVXH SULQWLQJ
módszer segítségével. A munka során bizonyítást nyert a PMMoV P1,2 patotípusú L]ROiWXPiQDN KD]DL HO
IRUGXOiVD DPHO\HW PLQG SDWROyJLDL V]HUROyJLDL
elektronmikroszkópos,
mind
molekuláris
biológiai
módszerekkel
alátámasztottak. A hazai PMMoV izolátumok nagyfokú homológiát mutattak (95-100 %-RV
HJ\H] VpJ DPLQRVDY V]LQWHQ D NOI|OG|Q OHtUW
10 300R9 L]ROiWXPRNNDO $ ILORJHQHWLNDL W|U]VIiEDQ D I
FVRSRUWWyO
elkülönültek, legközelebb egyes koreai és japán izolátumokhoz álltak. A magyar és spanyol izolátumok összehasonlításakor a viselkedésükben hasonlóságokat és eltéréseket is megfigyeltek. $
IHOPpUpVHN
VRUiQ
D
V]HU] N
D
31,2
patotípusú tobamovírus
izolátumok elterjedését, ugyanakkor a P0 és P1 patotípusú izolátumok visszaszorulását figyelték meg. A disszertáció felhívja a figyelmet arra, hogy a rezisztens fajták alkalmazásával hazánkban is végbementek a WREDPRYtUXVRNUD MHOOHP] LG W
YiOWR]iVRN (V]HULQW D WREDPRYtUXVRN LG
U
O
-
UH iWW|ULN D UH]LV]WHQFLiW HJ\UH SDWRJpQHEE W|U]VHLN MHOHQQHN PHJ ÒJ\ QLN
D]
DODFVRQ
yabb
patogenitású
tobamovírus
izolátumokat
Magyarországon is sikerült visszaszorítani, ezek inkább házikertekben, HOKDQ\DJROW iOORPiQ\RNEDQ QHP UH]LV]WHQV IDMWiNDW WHUPHV]W
WHUOHWHNHQ
maradtak fenn. Ezzel párhuzamosan elterjedtek az agresszívebb, magasabb patogenitású törzsek. A PMMoV hazai jelenléte új járványtani kérdéseket YHW IHO PLYHO D YtUXV EHOV
PDJiWYLWHOOHO LV WHUMHG UiDGiVXO J\DNUDQ FVDN
QDJ\RQ J\HQJH WQHWHNHW RNR] D OHYHOHNHQ YDJ\ WQHWPHQWHV D IHUW
terméseken ugyanakkor nekrózis, GHIRUPiFLyILJ\HOKHW eladhatatlanná
teszi,
paprikatermesztésben.
és
így
nagyon
komoly
]pV $
PHJDPLDWHUPpVW
károkat
okoz
a
11
ABSTRACT
Pathological, serological and molecular biological characterization of Pepper mild mottle virus (PMMoV) isolates
The authors identified the tobamoviruses found in the samples collected from different parts of Hungary between 1999 and 2001, using host-plant tests, DAS-ELISA method, electrone microscope assay and polymerase chain reaction (PCR). Universal tobamovirus and virus-specific (TMV-U1, PMMoV, ObPV) primers were designed to detect the most important tobamoviruses in Hungary. A fragment of the CP gene of the Hungarian PMMoV isolate was cloned and sequenced. The sequence was compared to the sequences of other PMMoV isolates from the databank and a phylogenetic tree was created. A comparison was made between the Hungarian and the Spanish isolates adopting restriction enzyme analysis, mixed infections and tissue printing methods. The Hungarian isolates showed a great similarity to other PMMoV isolates (95-100 % similarity in amino acid level). In the phylogenetic tree they separated from the 3 main group and were closest to certain Japanese and Korean isolates. The results indicate the changes which can be observed in Hungary with the use of the resistant pepper varieties, as the tobamovirus isolates of P0 and P1 pathotypes are forced back, while those with higher pathogenicity (P1,2) come to the front. The presence of the PMMoV of P1,2 pathotype in Hungary raises new problems, as the virus can spread by internal seed-transmission as well, and often causes slight symptoms on the pepper leaves or no symptoms at all.
12
On the fruits occurs deformation and necrosis which makes the crop unmarketable causing great economic losses.
ZUSAMMENFASSUNG
Patologische, serologische und molekular biologische Charakteristik der Pepper mild mottle virus (PMMoV) Isolaten Die Autoren identifizierten die Tobamoviren die sie in den Proben aus verschiedenen Teilen von Ungarn zwischen 1999 und 2001 gesammelt haben mit Testpflanzen, DAS-ELISA Methode, Elektronmikroskopische Untersuchung und Polymerasenkettenreaktion. Um die Identifizierung von dem wichtigsten Tobamoviren in Ungarn haben sie universalische Tobamovirus und virus-spezifische (TMV-U1, ObPV, PMMoV) Primers geplant. Ein Abschnitt des Kapseleiweiß Gens des Ungarischen PMMoV Isolates wurde geklont und sequenziert. Die Sequenz wurde vergleicht mit der Sequenzen der anderen PMMoV Isolaten aus der Dateienbank und ein filogenetischer Baum wurde konstruirt. Es wurde zwischen den Ungarischen und Spanischen Isolaten ein Vergleich gemacht mit Restriktionenzym Analyse, gemischte Infekzionen und „tissue printing” Methode. Die Ungarischen Isolaten bezeigten große Ähnlichkeit zu anderen PMMoV Isolaten (95-100 % Ähnlichkeit auf der Ebene der Aminosäuren). In dem filogenetischen Baum separierten sie sich von den 3 wichtigsten Gruppen und standen am nächsten zu einigen Japanischen und Koreanischen Isolaten. Die Ergebnisse zeigen die Wandlungen welche in Ungarn beobachtet werden können, die im Zusammenhang sind mit dem Gebrauch des
13
widerstandsfähigen Paprikasorten stehen. Die Tobamovirus Isolaten mit P0 und P1 Pathotypus treten in Hintergrund während die Isolaten mit höcher Pathogenität kommen in den Vordengrund. Die Gegenwart des Isolaten PMMoV des P1,2 Pathotypus in Ungarn wirft auf neue Probleme, weil das Virus kann sich auch mit inneren Kornübertragung verbreiten und kann auf den Paprika blättern oft schwache oder garkeine Symptome herbeiführen. An den Früchten kann sich Deformation und Nekrosis entwickeln, was die Früchte unverkäuflich macht und damit große wirtschaftliche Schäden verursacht.
14
1. BEVEZETÉS
A Tobamovirus nemzetség tagjai a Nidovirales rend merev, pálcika alakú, kb. 300 nm hosszúságú, helikális szimmetriájú vírusai. A világ minden
részén
komoly
SDSULNDWHUPHV]WpVEHQMHOHQW
gazdasági
problémát
jelentenek
VNiURNDWRNR]QDNPLQGDV]DEDGI|OGLPLQGD
fólia alatt termesztett kultúrákban. Hazánkban az 1950-HV NH]G
G
HQ
V]iPRV
PDJ\DU
NXWDW
ó
foglalkozott
a
IRUGXOiVXNUyO MHOHQW
QHP]HWVpJJHO GH D PDJ\DURUV]iJL HO W|U]VHN HONO|QtWpVpU
a
pYHNW
O
Tobamovirus VpJNU
O pV D
O QHP NpV]OW iWIRJy GROJR]DW ÈOWDOiQRVDQ LVPHUW
MHOHQVpJKRJ\DWREDPRYtUXVRNLG
U
O LG
-
UHiWW|ULNDUH]LV]WHQFLiWpVHJ\UH
patogénebb törzseik jelennek meg. Az utóbbi két évtized is ezt igazolta: a korábban „egyeduralkodó” P0 patotípusú dohány mozaik vírus (Tobacco mosaic virus, TMV) U1 törzse szinte teljesen kiszorult, megjelent a P1,2 patotípusú paradicsom mozaik vírus (Tomato mosaic virus, ToMV) Ob törzs (amelyet újabban önálló vírusként tartanak nyílván Obuda pepper virus, ObPV néven), majd a P1,2 illetve P1,2,3 patotípusú paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV) izolátumok terjedtek el. A PMMoV különös veszélyessége abban rejlik, hogy csak gyenge tüneteket okoz a leveleken - tJ\ QHKH]HQ pV]UHYHKHW - pV EHOV
PDJiWYLWHOOHO LV
terjed. 0XQNiQN VRUiQ FpOXO W
]WN NL D KD]iQNEDQ SDSULNiQ HO
IRUGXOy
tobamovírus törzsek azonosítását és jellemzését. Ennek érdekében több pYHQ NHUHV]WO PLQWDJ\ *D]GDViJL MHOHQW
MWpVW IRO\WDWWXQN D] RUV]iJ NO|QE|] WHUOHWHLQ
VpJH pV ~MV]HU
VpJH PLDWW D IHOPpUpVHN VRUiQ OHtUW KD]DL
PMMoV izolátumokat különféle módszerekkel vizsgáltuk. Tesztnövénykísérletek, szerológiai vizsgálatok, elektronmikroszkópos eljárások és molekuláris biológiai módszerek segítségével kívántuk a magyar PMMoV
15 L]ROiWXPRNDW MHOOHPH]QL &pONLW
]pVHLQN N|]W V]HUHSHOW D KD]DL 300R9
izolátumok köpenyfehérje gén (coat protein, CP) részletének klónozása és szekvenálása. Vizsgálataink kiterjedtek a meghatározott szekvenciarészlet és a más országokban korábban leírt PMMoV izolátumok szekvenciájának összehasonlítására, valamint a filogenetikai rokonság megállapítására. A magyar izolátumokat részletesebben összehasonlítottuk a tulajdonságaikban közel álló spanyol izolátumokkal.
16
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
2.1.
A paprika termesztése
A világon több mint 1 millió hektáron termesztenek paprikát (Green és Kim 1991), ideértve a Capsicum nemzetség ERJ\yWHUPpV
SDSULNiLW
XJ\DQ~J\
PLQW
D
PH[LNyL IHNHWH FVtS
NDORFVDL
I
V
V]HUSDSULNiW
Magyarország a szabadföldi paprikatermesztés északi határa. Az étkezési paprika üzemi vetésterülete 4- H]HU KHNWiU H]HQNtYO MHOHQW
V D Ki]LNHUWL
terület. A termésátlag 123 mázsa/hektár, a termésmennyiség a házikerti WHUPHV]WpV QpONO NE H]HU WRQQD 0H] JD]GDViJL 6WDWLV]WLNDL eYN|Q\Y
2000).
2.2.
A paprikavírusok .|]LVPHUW KRJ\ D SDSULND EHWHJVpJHL N|]|WW D YtUXVRNQDN MHOHQW
szerep jut. Eddig több, mint 45 víUXVUyO tUWiN OH KRJ\ D SDSULNiW IHUW HEE
O
V
]L
-öt izoláltak természetes körülmények között (Horváth 1981, 1983,
1986a, 1986b, 1986c, Horváth és Beczner 1983, Green és Kim 1991, Green és Kalloo 1994, Edwardson és Christie 1997). Ezeket a vírusokat a tünetek DODSMiQ GLDJQRV]WL]iOQL OHKHWHWOHQ KLV]HQ HJ\ YtUXV NO|QE|] WQHWHNHW RNR]KDWLOOHWYHKDVRQOyWQHWHNLVV]iUPD]KDWQDNNO|QE|] NyURNR]yNWyO $ SDSULNDNXOW~UiN YtUXVIHUW
]|WWVpJH WiJ KDWiURN N|]|WW PR]RJKDW D
vegetáció alatt akár a 100 %-ot is elérheti (Benner és Kuhn 1985). Tóbiás et al.
DUUyO V]iPROWDN EH KRJ\ D SDSULND YtUXVIHUW
15-
N|]|WW LQJDGR]RWW D WHQ\pV]LG
megközelíthette.
Kajati
és
Kádár
]|WWVpJH NH]GHWEHQ
V]DN YpJpUH D
(1972)
felmérése
-ot is
alapján
a
17 YtUXVIHUW
]|WWV
ég a szentesi körzetben átlagosan 60,3%-os volt, de akadt
olyan adatfelvételi hely, ahol 95%-osnak bizonyult. $SDSULNiWIHUW
] YtUXVRNMHOHQW
YLOiJNO|QE|] UpV]HLQ
VpJHpVHO
IRUGXOiVLDUiQ\DHOWpU
D
Milbrath és Cook (1971) Hawaii-on 1970-71-ben,
a termesztett paprikák közt végeztek virológiai felmérést és gyakorinak találták a burgonya Y vírust (Potato virus Y, PVY), a TMV-t, de gyakran HO
IRUGXOW D GRKiQ\ NDUFRODWRV YtUXV
Tobacco etch virus, TEV) és a
paradicsom bronzfoltosság vírus (Tomato spotted wilt virus, TSWV) is. Makkouk és Gumpf (1974) szerint 1971-73-ban, Kaliforniában a PVY és a 7(9IRUGXOWDNHO
OHJJ\DNUDEEDQDSDSULNiQNLVHEEPpUWpNEHQDEXUJRQ\D
X vírus (Potato virus X, PVX), az uborka mozaik vírus (Cucumber mosaic virus, CMV), a TSWV és a TMV is jelen voltak. Egy másik felmérés szerint az Egyesült Államokban a paprika vírusbetegségei közül a TEV volt D GRPLQiQV H] D NyURNR]y (XUySiEDQ QHP IRUGXO HO QDJ\PpUWpNEHQ IHUW
]|WW D V]DEDGI|OG|Q
GH D &09 LV
Benner és Kuhn 1985). Conti és
Masenga (1977) adatai alapján Észak-Nyugat Olaszországban, fóliás termesztésben a TMV volt a legelterjedtebb, szabadföldön pedig a CMV. A lucerna mozaik vírus (Alfalfa mosaic virus, AMV) és a PVY inkább a konyhakertekben jelent meg. Az eddigi felmérések szerint Magyarországon leggyakrabban a TMV pV D &09 IRUGXOWDN HO
pV D OHJQDJ\REE WHUPpVYHV]WHVpJHW LV H]HN D
vírusok okozták (Kajati és Kádár 1972, Tóbiás és Molnár 1983). Gáborjányi et al. (1998a, 1998b) vizsgálatai alapján fólia alatt és üvegházban a ToMV, a CMV, a PVY, a TSWV bizonyultak a OHJMHOHQW
VHEEQHN
Zatykó (1982) a PVY és a paradicsom magtalanság
vírus (Tomato aspermy virus, TAV) veszélyességére is felhívta a figyelmet. Gáborjányi et al.
DGDWDL V]HULQW D V]DEDGI|OGL SDSULNiW IHUW
vírusok gyakorisága 1996-EDQ D N|YHWNH]
NpSSHQ DODNXOW D PLQWiN
]
%-
18
ában): CMV 77%, AMV 83%, TMV és ToMV 27%, PVY 44%, PVX 44%, beléndek mozaik vírus (Henbane mosaic virus, HeMV) 61%, Chenopodium mozaik vírus (Sowbane mosaic virus, SoMV) 27%. Egyes adatok szerint 0DJ\DURUV]iJRQ HO
IRUGXO PpJ D SDSULND ViUJD pUPR]DLN EHWHJVpJ SHSSHU
yellow vein mosaic disease), melynek rendszertani hovatartozása eddig PpJ QHP WLV]Wi]RWW GH IHOWHKHW
HQ YtUXVRV HUHGHW
Salamon et al. 1982,
Szürke és Salamon 1986, Gáborjányi et al. 1997). Hazánkban eddig összesen 13 paprikapatogén vírust izoláltak (1. táblázat), melyek között 4 tobamovírust is találunk. Salamon (1985) megemlíti a dohány enyhe zöld mozaik vírust (Tobacco mild green mosaic virus 70*09 LV PLQW 0DJ\DURUV]iJRQ HO
IR
rduló tobamovírust, erre
vonatkozólag azonban több adatot és újabb bizonyítékokat nem találtunk.
1. táblázat. A Magyarországon eddig leírt paprikapatogén vírusok (Gáborjányi et al. 1998a,b nyomán) Paprikapatogén vírusok
(OV
OHtUiV
Uborka mozaik vírus (Cucumber mosaic Szirmai 1941 virus, CMV) Lucerna mozaik vírus (Alfalfa mosaic Szirmai 1944 virus, AMV) Dohány mozaik vírus (Tobacco mosaic Szirmai 1950 virus, TMV) Burgonya X vírus (Potato virus X, Szirmai 1950 PVX) Burgonya Y vírus (Potato virus Y, PVY) Horváth 1967 Paradicsom magtalanság vírus (Tomato Beczner et al. 1979 aspermy virus, TAV)
19
Lóbab hervadás vírus (Broadbean wilt Salamon et al. 1980 virus, BBWV) Paradicsom
mozaik
vírus
(Tomato Horváth és Beczner 1973
mosaic virus, ToMV) Óbuda paprika vírus (Obuda pepper Csilléry és Ruskó 1980, Csilléry et al. virus, ObPV) Csucsor
1983
sárga
foltosság
vírus Salamon et al. 1987, Salamon és
(Dulcamara yellow fleck virus, DYFV)* Beczner 1987 Paradicsom
bronzfoltosság
vírus Gáborjányi et al. 1995ab
(Tomato spotted wilt virus, TSWV) Beléndek
mozaik
vírus
(Henbane Gáborjányi et al. 1997
mosaic virus, HeMV) Libatop mozaik vírus (Sowbean mosaic Gáborjányi et al. 1997 virus, SoMV) Paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper Tóbiás és Csilléry 1983, Salamon 1993, mild mottle virus, PMMoV)
Kiss 1996, Kálmán et al. 2000
* = az ICTV által hivatalosan nem jegyzett faj
Tóbiás et al. HOV
V]HULQW D 709 IHUW
]pVH N|YHWNH]WpEHQ D]
RV]WiO\~WHUPpVPHQQ\LVpJHFVDND]|VV]WHUPpV
al. (19
NtVpUOHWHL
DODSMiQ
D
709
WHUPpVPHQQ\LVpJHW OHJDOiEELV KD D IHUW
MHOHQW
-a volt. Feldman et
VHQ
]pV D NLOWHWpVW
FV|NNHQWHWWH
D
O V]iPtWRWW
napon belül bekövetkezett. A korai paprikák esetében kb. 80 %-os, a NpV
LHNQpO NE
-os termésveszteséget figyeltek meg. Általánosságban
HOPRQGKDWy KRJ\ PLQpO NRUDLEE IHQROyJLDL VWiGLXPEDQ pUL D IHUW
növényt,
annál
számolhatunk.
súlyosabb
kártétellel
illetve
]pV D
termésveszteséggel
20
2.3.
A Tobamovirus nemzetség
2.3.1. A tobamovírusok evolúciója
Az evolúcióval foglalkozó kutatók szerint a tobamovírusok kb. 120 PLOOLy pYHVHN PLNpQW ]iUYDWHUP JD]GiLN PHO\HNNHO IHOWHKHW HJ\WW IHMO
GWHN
Gibbs $ WREDPRYtUXVRN
VH
HQ
-600 millió éve
jelenhetett meg. Génszekvenciájuk és a génekben kódolt fehérje motívumok alapján a Tobra-, a Hordei- és a talaj-által közvetített gabona mozaik vírussal (Soil-borne wheat mosaic virus) állnak rokonságban, a köpenyfehérjéjük alapján a furovírusokkal is rokonok. Az RNS-polimeráz génjük alapján a tobamovírusok egy nagy csoportba, az alpha-like víruscsoportba tartoznak. Jelenleg a tobamovírusokat a replikációs stratégiájuk, genomfelépítésük, transzlációs mechanizmusuk, stb. alapján a Sindbisvírusokhoz hasonló növényvírusok „szupercsaládjába” sorolják. A 709 HUHGHWL KD]iMD IHOWHKHW
HQ YDODKRO 3HUX %ROtYLD %UD]tOLD WHUOHWpQ
volt (Gibbs 1999). $
WREDPRYtUXVRN
PHJYiOWR]KDW
KD
LJHQ
NO|QE|]
gazdanövényeken hoVV]~
LG
YiOWR]pNRQ\DN K
QpKiQ\
PpUVpNOHWHNHQ
YDJ\
Q NHUHV]WO WDUWMXN IHQQ
MHOOHP] MN NO|QE|]
NHW $ 709
L]ROiWXPRN YiOWR]pNRQ\DEEQDN EL]RQ\XOWDN NO|Q|VHQ D] 516 HOV
IHOH
mint a TMGMV izolátumok (Fraile et al. 1997). Az ausztrál TMV SRSXOiFLyEDQSpOGiXOD]LG
NVRUiQDQXNOHRWLGFVHUpNV]iPDQ|YHNHGHWWGH
inkább azoké, amelyek nem változtatták meg az aminosav sorrendet (Gibbs 1999). A dohány enyhe zöld mozaik vírus (Tobacco mild green mosaic virus 70*09 SRSXOiFLyN YLV]RQW PHJOHKHW
VHQ KDVRQOyDN HJ\PiVKR]
bár a kaliforniai és krétai populációk – PHO\HN
VLEEQHN W
QQHN
olyan változékonyak, mint az ausztrál és a spanyol populációk.
- kétszer
21
Fraile et al. (1997) közel 100 év tobamovírus izolátumait – köztük KHUEiULXPL
Q|YpQ\HNU
O
V]iUPD]yNDW
LV
- vizsgálták Ausztráliában.
Kezdetben Ausztráliában a TMGMV és a TMV is jelen volt - Nicotiana glauca-UyO PLQGNHWW
W L]ROiOWiN HO
WW
-, majd az utóbbi kiszorult, és
XWiQPiUFVDN70*09L]ROiWXPRNIRUGXOWDNHO
(QQHNRNDKRJ\D
TMV kevésbé volt versenyképes, mint a TMGMV, valamint kevert IHUW
]pVEHQ D 709 FVDN NE WL]HGQ\L PHQQ\LVpJEHQ IRUGXOW HO
D] HJ\HGL
IHUW
]pVKH] NpSHVW (] D] RND DQQDN LV KRJ\ D 709 V]LQWH WHOMHVHQ HOW
QW
Amerikából. Rekombinációkat is találtak a tobamovírusokon belül, pl. egy herbáriumon talált izolátum két szekvenciarészletét választották ki YpOHWOHQV]HU
3461-3769
HQ YL]VJiODWUD D] L]ROiWXP
nt-ig
TMGMV
-1250 nukleotidig (nt) TMV,
szekvenciájúnak
bizonyult.
A
TMV
„kihalásának” magyarázata a Muller-féle „záróretesz” (Muller’s rachet) vagy mutációs „beolvadás”: a populáció létszáma egy küszöbérték alá esik, melyben a deléciós mutációk eltávolítása rendkívül nehézzé válik (Lynch et al. 1993). A tobamovírusok evolúcióját és variabilitását vizsgálták azok a spanyol kutatók, akik 26 PMMoV-S izolátum RNS-ét hasonlították össze az RNAseT1 „ujjlenyomatuk” (fingerprint) alapján (Rodríguez-Cerezo et al. 1989). A kétdimenziós elektroforézis vizsgálat során az RNAse T1-el való emésztés után kapott oligonukleotidokat poliakrilamid gélben futtatták. Az izolátumokat bizonyos oligonukleotidok megléte vagy hiánya alapján 10 csoportba (haplotípus) sorolták. A vizsgálat eredményeit úgy összegezték, hogy a PMMoV-6$OPpULiEDQPHJOHKHW
VHQVWDELOSRSXOiFLyW
alkotott, de a változatosságot is fenntartotta. Egy uralkodó haplotípus volt, DPHO\E
O
N|]HOL
KHO\HWWHVtWHWWpN
URNRQ
D]W
$
YDU
iációk keletkeztek, amik azonban nem
PDJDV
VWDELOLWiV
D
PHJOHKHW
VHQ
N|W|WW
nukleotidsorrend következménye. A legnagyobb eltérést a II-es és X-es
22
haplotípus között találták. A haplotípusokon belül 2 alcsoportot különítettek el, az eOV
EHD],
-es és a II-es haplotípus; a másodikba a III-X-
es haplotípusok tartoztak. Leggyakoribbnak a VI-os haplotípus bizonyult, egy másik törzsfa viszont a IV-HV WtSXVW MHO|OWH PHJ N|]SRQWLNpQW PHO\E D W|EEL WtSXV NLIHMO
G|WW $] N|]W J\
-
MW|WW
D]WiQ IHOYiOWRWWDN D] ~MDEEDN (]HN V]HULQW WHNLQWKHW
mintákban az I-es és II-
DPLDUUDXWDOWKRJ\H]HN
HVKDSORWtSXVIRUGXOWHO
SpOGiXOD
O
VLEEWtSXVRNPHO\HNHW
VL WtSXVQDN UHOLNWXPQDN
-es PMMoV-S izolátum (P78/84).
2.3.2. A tobamovírusok patotípusai $ WREDPRYtUXVRN IHUW
]pVpYHO V]HPEHQ W|EE HOOHQiOOyViJRW EL]WRVtWy
rezisztenciagént azonosítottak. A paradicsomban a Tm-1 gén visszaszorította a ToMV replikációját (Motoyoshi és Oshima 1977), de a ToMV replikáz génjében bekövetkezett mutáció a Tm-1 gén által biztosított rezisztencia áttörését eredményezte (Meshi et al. 1988). A Tm-2 gén ugyancsak megvédte a növényt a YtUXVIHUW
]pVW
PHJV] QWHWKHW
O
Motoyoshi és Oshima 1975, 1977), de ez a rezisztencia is
YROWDN'PR]JiVIHKpUMpEHQLQGXNiOWPXWi
cióval (Meshi
et al. 1989). Ezek a megfigyelések arra utaltak, hogy a Tm-1 rezisztenciagén a vírusreplikáció, a Tm- D YtUXVPR]JiV V]LQWMpQ P
N|GLN
(Sanfaçon et al. 1993). Sokkal kevésbé ismerjük a Nicotiana glutinosa-ból származó N és a Nicotiana sylvestris-E
O V]iUPD]y
N’ UH]LV]WHQFLDJpQ P
N|GpVpW $ 709
CP-jében történt mutációk módosították az N’ gént tartalmazó növények hiperszenzitív reakcióját (Knorr és Dawson 1988, Saito et al. 1987, 1989). Az N gént tartalmazó dohányokban a
YiODV]
K
PpUVpNOHW IJJ
bizonyult. Az inokulált leveleken 25°& DODWW ORNiOLV Op]LyN IHMO
-
nek
GWHN PtJ
23
28°C felett a tünetek szisztemizálódtak (Samuel 1931). Az N gén P
N|GpVpQHNKiWWHUpWNLWHUMHGWHQNXWDWWiN1RKDV]iPRVDQWLYLUiOLVIHKpUMpW
azonosítottak (Loebenstein és Gera 1981, Spiegel et al. 1989, Edelbaum et al. 1990), egyik sem volt bizonyíthatóan összefüggésben az N gén aktivitásával. Eddig egyetlen tobamovírusról jelentették, hogy áttöri az N rezisztenciagént, ez a ToMV-Ob volt (Csilléry és Ruskó 1980, Csilléry et al. 1983). Az áttörés azonban nem minden esetben következett be, a K
PpUVpNOHWW
O IJJ|WW )HOWpWHOH]pVHN V]HULQW OHJDOiEE NpW UpV]E
O iOO D]
N
gén által biztosított védekezési mechanizmus: a vírus terjedésének visszaszorításából (ezt tudja áttörni a ToMV-Ob), és a nekrózis NLDODNXOiViEyODPLWEiUPHO\LNWREDPRYtUXVIHUW
zése aktivál (cf. Szilassy et
al. 1999). Az
egyes
paprikapatogén
tobamovírusok
megkülönböztetésének alapja a vad Capsicum
IDMRN IHUW
patológiai ]KHW
VpJH pV
ellenállóképessége. Az ellenállóképességet a Capsicum fajokban öt, azonos OyNXV]RQ OpY
GRPLQiQVDQ |U|NO
G
D IHUW
]pVW QHP WHOMHVHQ LQNRPSOHWW
módon) lokalizáló L gén (L+, L1, L2, L3, L4) biztosítja. Ezzel szemben a vírusnak 4 patotípusa létezik (P0, P1, P1,2, P1,2,3). A 2. táblázat azt mutatja be, hogy a paprika-vírus kapcsolat mikor inkompatibilis, és mikor kompatibilis. Abban az esetben, ha az L+ rezisztenciafokú paprikát EiUPHO\LN SDWRWtSXVVDO IHUW
]]N D] IRJpNRQ\ JD]GD
-parazita kapcsolatot
1
eredményez. Az L rezisztenciagén viszont rezisztenciát biztosít a P0 patotípussal szemben, az L2 a P0 és a P1 patotípussal szemben, stb.
2.
WiEOi]DW$NO|QE|]
UH]LV]WHQFLDIRN~SDSULNDIDMWiNpVD
SDWRWtSXV~WREDPRYtUXVRN kapcsolata (Rast 1979, 1988, Boukema et al. 1980, Tóbiás et al. 1982 és Boukema 1984 alapján)
NO|QE|]
24
Rezisztenciagén
Patotípus P0
P1
P1,2
P1,2,3
(TMV, ToMV,
(TMGMV,
(ObPV,
(PMMoV)
TMGMV)
PaMMV
PMMoV)
+
L
S
S
S
S
L1
R
S
S
S
2
L
R
R
S
S
L3
R
R
R
S
4
R
R
R
R
L
S = susceptibility (fogékonyság), R = resistance (rezisztencia)
De la Cruz et al. (1997) az L2 gén által biztosított rezisztencia mechanizmusát tanulmányozták. Ennek érdekében kimérákat készítettek az L2 gén által biztosított rezisztenciát UH]LV]WHQFLiWiWW|UQLQHPNpSHVI
iWW|U
300R9
-S (P1,2) és a
V]HUSDSULNDHQ\KHWDUNXOiVYtUXV
Paprika
mild mottle virus, PaMMV) (P1 JHQRPMiQDN IHOKDV]QiOiViYDO $] HOV hibrid (THG1) 5’ vége a PMMoV-6 JHQRPMiQDN HOV
UpV]pE
O ¶YpJH
pedig a PaMMV [30 kilodalton (kD) fehérjét kódoló rész C vége + CP + 3’nemkódoló
régió]
JHQRPMiQDN
PiVRGLN
IHOpE
O
V]iUPD]RWW
$
gazdanövényeken a hibrid a PMMoV-S-hez hasonló tüneteket okozott. Az L2
UH]LV]WHQFLDIRN~ ¶7DEDVFR¶ SDSULNiQ YLV]RQW D IHOV
QHP LQRNXOiOW
levelekben sem a hibrid, sem a PaMMV nem volt kimutatható (a PaMMVUH MHOOHP] KRJ\ QHP V]LV]WHPL]iOyGLN D] /
2
rezisztenciagént hordozó
SDSULNiEDQ 0LQGH]HN DUUD XWDOWDN KRJ\ D UH]LV]WHQFLipUW IHOHO
utolsó 1000 nukleotidban helyezkedett el. Ezt követ
V UpV] D]
HQ PHJDONRWWiN D
THG2 hibridet, amely kizárólag a CP-t tartalmazta a PaMMV-E
O pV D
THG1-hez hasonlóan viselkedett. Egy újabb hibridet készítettek (THG3), aminek CP génjében frameshift (kereteltolásos) mutációt indukáltak, hogy
25 HOG|QWKHW
OHJ\HQDUH]LV]WHQFLipUWIHOHO
VUpV]PDJiEDQD&3
-ben vagy az
RNS-ben található-e. Ez a nem a teljes CP-W WHUPHO KLSHUV]HQ]LWtY UHDNFLyW +5 D IHUW PDJD D &3 IHOHO
csonka
CP-W
KLEULG QHP LQGXNiOW
]|WW Q|YpQ\HNHQ (] D]W MHOHQWL KRJ\
V D +5 NLYiOWiVipUW QHP D] 516 $ 7+* NLPpU NyGROW
NpSHV
YROW
V]LV]WHPLNXVDQ
IHUW
]QL
a, mely D]
/
2
VpJpW
UH]LV]WHQFLDJpQW WDUWDOPD]y SDSULNiW pV H]]HO NL]iUWD DQQDN OHKHW
hogy az RNS molekula aktív szerepet játszana a HR indukálásában. A THG3 L2
UH]LV]WHQFLD iWW|U
WXODMGRQViJD D]W L
s bizonyítja, hogy a
rezisztenciához egy vírus által kódolt fehérje termelése szükséges. Az L2 UH]LV]WHQFLD
iWW|UpVH
QHP
HJ\
PiU
PHJOpY
Q|YpQ\L
YpGHNH]pVL
mechanizmus elnyomásának eredménye. Berzal-Herranz et al. (1995) szerint az L3 gén által biztosított rezisztencia gén-Gy]LV
IJJ
QHN W
QLN $ KHWHUR]LJyWD Q|YpQ\HNEHQ pV
bizonyos körülmények között – D KRPR]LJyWiNQiO WDSDV]WDOKDWy WQHWHNW HOWpU
HQ
- pUPHQWL pV DSLNiOLV QHNUy]LV IHMO
G|WW D 300R9 , IHUW
-
O
]pVpUH
Mint ismeretes, a P1,2 patotípusú PMMoV-S HR-t indukál az L3 rezisztenciagént tartalmazó paprikákon, míg a P1,2,3 patotípusú PMMoV-I áttörve ezt a rezisztenciát, szisztemikus tüneteket okoz. A PMMoV-S és a PMMoV-, NOyQRNEyO NO|QE|]
KLEULG YtUXVW NpV]tWHWWHN $] HOV
NOyQ
(THI-1) 5’ vége PMMoV-S, 3’ vége PMMoV-I szekvenciát tartalmazott. A NOyQQDOIHUW
]|WWSDSULNDQ|YpQ\HNHQV]LV]WHPLNXVWDUNXOiVMHOHQWPHJDPL
DUUD XWDOW KRJ\ D . JpQW iWW|UpVppUW IHOHO
O ¶ LUiQ\EDQ WDOiOKDWy D UH]LV]WHQFLD
V UpV] (]XWiQ RO\DQ NOyQRNDW NpV]tWHWWHN PHO
kisebb szakaszokat tartalmaztak a PMMoV-I-E
O
PHJiOODStWRWWiN KRJ\ D UH]LV]WHQFLD iWW|UpVppUW IHOHO
(]HN
yek egyre
VHJtWVpJpYHO
V UpV] D] XWROVy
nukleotidban helyezkedik el. A kérdéses régióban 6 különbség van a PMMoV-S és a PMMoV-I nukleotid sorrendjében, ez 2 aminosav különbségben jelentkezik. A 138. helyen található metionin (Met) –
26 DV]SDUDJLQ $VQ D] HJ\HWOHQ QHP NRQ]HUYDWtY FVHUH (] D NLHPHONHG MHOHQW UHG
VpJ
DPLQRVDY D &3 WpUV]HUNH]HWpW WHNLQWYH NLWHWW KHO\HQ HJ\ EpWD
Q DOID KpOL[KH] NDSFVROyGYD KHO\H]NHGLN HO (ONpS]HOKHW
KRJ\ H]
az aminosav közvetlen szerepet játszik a gazdanövény rezisztencia faktorával való kapcsolatban. Újabb klónok készítésével megállapították, hogy egyetlen aminosavcserével a PMMoV-I már nem tudta áttörni a rezisztenciát. Az L3 gén által biztosított rezisztencia áttöréséért, a HR NLDODNXOiVipUWD&3pVQHPD]516YROWIHOHO
V
Culver et al. a tobamovírusok CP-jében egy „elicitor régiót” azonosítottak (Culver és Dawson 1991, Culver et al. 1991). Az N gént tartalmazó
dohánynövénybe
aminosavváltozások
ebben
rezisztenciaválaszokat.
jutott az
Újabb
CP-MpEHQ
TMV
„elicitor
munkájukban
régió”-ban Culver
et
W|UWpQ
indukáltak al.
(1994)
kimutatták, hogy a jelenség magyarázata a TMV CP szerkezet IHOERPOiViEDQNHUHVHQG
H]W
a folyamatot képes felismerni a gazdanövény.
A Berzal-Herranz et al. (1995) által leírt aminosavcsere is ebben az „elicitor régió”-ban található. A PMMoV-I CP-jében tehát egyetlen aminosav cseréje is (Asn-0HW D KHO\HQ HOHJHQG indukiOiViKR] pV D YtUXVIHUW
]pV ORNDOL]iOiViKR] D
QHN EL]RQ\XOW D +5
Capsicum chinense (L3)
növényekben. Hasonló eredményre jutottak japán kutatók (Tsuda et al. DNLN SRQWPXWiFLyW WDUWDOPD]y PXWiQVRNDW iOOtWRWWDN HO KHO\HQOpY
DPLQRVDYFVHUpMHPHOOHWWHJ\PiVLNOHKHW
UH]LV]WHQFLD iWW|UpVpUH H] SHGLJ HJ\ NHWW DPLQRVDY KHO\HQ $] HOV
VpJHWLVIHOYi]ROWDND
V PXWiFLy D pV D]
YiOWR]DWUD WHUPpV]HWHV SpOGD D 300R9
L]ROiWXP PtJ D PiVRGLN OHKHW
-I
VpJ D 300R9
-Ij izolátum példájával
UH]LV]WHQFLiW iWW|U
3
bizonyítható. Mindkét izolátumot az L mutációnak tartják.
$
WHUPpV]HWHV
27
2.3.3. A tobamovírusok csoportosítása
A tobamovírusokat tekintélyes létszámuk miatt igen nehéz rendszerbe foglalni. Legelterjedtebbek a gazdanövénykör alapján felállított csoportosítások. Van Regenmortel
D
N|YHWNH]
NpSSHQ
FVRSRUWRVtWRWWD
D
tobamovírus törzseket: TMV-közönséges törzs ToMV törzsek ÒWLI
W|U]VHN
Hüvelyes törzsek Kabakos törzsek Orchidea törzsek U2 törzs Egyéb törzsek, melyek között az Argentínában izolált „pepper unusual strain” (Feldman és Oremianer 1972) is szerepelt. Tóbiás et al. (1982) több tobamovírus izolátumot megvizsgálva 3 FVRSRUWRW iOOtWRWWDN IHO $ V]HUROyJLDL pV D WHV]WQ|YpQ\YL]VJiODWRN HOWpU
csoportosítást eredményeztek. A Capsicum
WHV]WQ|YpQ\HNHQ
IHMO
G|WW
tünetek értékelése alapján az 1. csoportba a WU1, A1, FO izolátumok, a 2. csoportba a P14, SL izolátumok, a 3. csoportba a P8, P11, Ob izolátumok WDUWR]WDN$V]HUROyJLDLYL]VJiODWRNDODSMiQD]L]ROiWXPRNDN|YHWNH] NpSS
voltak csoportosíthatóak: 1. csoport: WU1 izolátum, 2/a. csoport: A1, FO izolátumok, 2/b. csoport: P14, SL, P8 izolátumok, 3. csoport: P11, Ob izolátumok. Feldman és Oremianer (1972) az alábbi rendszerbe foglalták a tobamovírusokat: Keresztesvirágú törzsek
28
Kabakos törzsek Hüvelyes törzsek Orchideafélék törzsei ÒWLI
W|U]VHN
Burgonyafélék törzsei Nicotiana glauca törzsek Paprika törzsek Burgonya törzsek Dohány törzsek Paradicsom törzsek Feldman és Oremianer (1972) felsorolták a listából kihagyott, egyéb TMV törzseket: batáta mozaik törzs (Elmer 1960, Still et al. 1960), kaktusz törzs (Sammons és Chessin 1961, Martin 1968), alma izolátumok (Kirpatrick és Lindner 1964, Gilmer és Wilks UpSD OLOD OHYHO Sharma V]
O
L]ROiWXPRN
VpJ YtUXV
Cappor és
Gilmer és Kelts 1965, 1968, Bercks 1967,
1968, Jankulova 1970), páfrány törzs (Faccioli 1966) Lychnis alba törzs (Chessin et al. 1967) Asparagus officinalis törzs (Faccioli és Paul 1967) Rhoeo discolor törzs (Thompson és Corbett 1970) Boerhaavia diffusa törzs (Khurana és Singh 1971), TMV törzsek t|OJ\U
O pV UR]VUyO
Yarwood és
Hecht-Poinar 1970, Nienhaus 1971), valamint lisztharmat konídiumokból kivont TMV törzsek (Yarwood 1971a, 1971b, Nienhaus 1971). Fukuda et al. (1980) szerint a tobamovírusok két nagy csoportba VRUROKDWyDN D] HOV IHUW
FVRSRUW WDJ
jai a kabakosokat vagy a hüvelyeseket
]LN D] LGH WDUWR]y YtUXVRNEDQ D] |VV]HpSOpVpUW IHOHO
V UpV] D &3
EHOOYDQ$PiVRGLNFVRSRUWEDWDUWR]yYtUXVRNQiOD]|VV]HpSOpVpUWIHOHO
rész a mozgásfehérjén (movement protein, MP) belül található.
-n V
29
2.3.4.
$]
HJ\HV
SDSULNiW
IHUW
]
WREDPRYtUXVRN
UpV]OHWHVHEE
jellemzése
A Tobamovirus nemzetség (ICTV kód 00.071.0.01) tagjai merev, pálcika alakú, helikális szimmetriájú virionok. Méretük kb. 300×15-18 nm, molekulatömegük 2×106, a köpenyfehérjéjük molekulatömege 17-18×103. Izoelektromos K
pontjuk
3,16-4,64
pH;
A260/280 arányuk
0,63-1,33;
-95 °C. A vírusok genomja pozitív, lineáris,
LQDNWLYiOiVL SRQWMXN
HJ\V]iO~ 516 $ QHP]HWVpJEH WDUWR]y YtUXVRN HU IHUW
]|WW VHMWHNEHQ ]iUYiQ\RNDW KR]QDN Op
VHQ LPPXQRJpQHN $
tre, melyek lehetnek kristályosak
(a citoplazmában), szabálytalan alakúak vagy amorf X-testek. A legtöbb faj gazdanövényköre korlátozott, vektor nélkül, mechanikailag vagy oltással terjednek.
(J\HGO D SDSULNiW QHP IHUW
] XERUND ]|OG IROWRVViJ PR]DLN
vírusról (Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV) ismert a rovarvektorral való terjedés. Egyes vírusfajok terjedésében fontos szerepe YDQ D PDJJDO W|UWpQ
YtUXViWYLWHOQHN $ WREDPRYtUXVRN D] HJpV] YLOiJRQ
elterjedtek. A nemzetségbe az ICTV nyilvántartása szerint 17 állandó és 2 feltételezett vírusfaj tartozik (a VIDE vírus adatbázis további 3 fajt is LGHVRURO $ QHP]HWVpJ |VV]HV WDJMD V]HUROyJLDLODJ NO|QE|] PpUWpNEHQ
rokon. A tobamovírusokat újabban a Nidovirales rendbe sorolják (Pringle 1998, Van Regenmortel et al. 2000). A nemzetség típustagja a dohány mozaik vírus (Tobacco mosaic virus, TMV, 00.071.0.01.001, génbank szekvencia: J02415, X68110, D63809, P0 patotípus), ami 5 % nukleinsavat és 95% fehérjét tartalmaz. A vírus szinonim nevei: TMV-U1, TMV típustörzs (TMV-type), TMV vulgáris törzs (TMV-vulgare), TMV közönséges törzs (TMV common strain). A TMV-W Államokban
és
HO
V]|U
Nicotiana tabacum-ról írták le, az Egyesült
Oroszországban
(Mayer
1886,
Iwanowski
1892).
30 0DJ\DURUV]iJUyO HO
V]|U
Linhart és Mezey jelentették (1890). A vírus
PHFKDQLNDLODJ pV PDJJDO iWYLKHW LJHQ NLWHUMHGW IHUW
GH SROOHQQHO QHP *D]GDQ|YpQ\N|UH
]L SO D SDSULNiW D SDUDGLFVRPRW D GRKiQ\W
al. 1978, Wetter et al. $709IHUW
Tóbiás et
]pVDSDSULNDOHYHOHLQHUHNN|]WL
mozaikfoltosságot, tarkulást, nekrotikus léziókat, levélhullást okozhat, HO
IRUGXO KRJ\ D OHYHOHN pV D WHUPpVHN NLVHEEHN D Q|YpQ\ J\HQJpEEHQ
IHMO
GLN
W|USO
eU]pNHQ\HEE
IDMWiNRQ
QHNURWLNXV
WHUPpVFVtNRVViJRW
szárnekrózist, és a virágok elsárgulását figyelhetjük meg. Világszerte elterjedt, több törzse ismert, így pl. a japán közönséges törzs (Japanese common strain); a maszkírozott M törzs (masked strain M); a TMV fehér mozaik törzs (TMV white mosaic strain), amelyet Johnson izolált 1928-ban Kentuckyban, és a sárga mozaik törzs (yellow mosaic strain, yellow mosaic type B), amit McKinney izolált 1929-ben a Kanári-szigeteken (McKinney 1929, Johnson 1930, Wetter 1984). $ I
V]HUSDSULND HQ\KH WDUNXOiV YtUXV
(Paprika mild mottle virus,
PaMMV, 00.071.0.01.006, X72586, patotípus P1) korábbi szinonim neve a TMV-3 YROW $ YtUXVW HO
V]|U +ROODQGLiEyO tUWiN OH
Capsicum annuum-
ról, melyen enyhe mozaikot okozott (Rast 1979). ValóV]tQ
OHJ PDJJDO LV
terjed, és elterjedt az eurázsiai régióban. A paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV, 00.071.0.01.007) korábbi szinonim nevei voltak: a dohány mozaik vírus látens törzse (latent strain of tobacco mosaic virus); a dohány mozaik vírus Samsun látens törzse (Samsun latent strain of tobacco mosaic virus); paprika mozaik vírus (pepper mosaic virus), P8-as izolátum, P14-es izolátum, SL-TMV (McKinney 1952, Greenleaf et al. 1964). Pares (1985) a Capsicum mozaik nevet javasolta a vírus elnevezésére, ez azonban nem NHUOWHOIRJDGiVUD(OV
NpQW
McKinney izolálta 1952-ben, Dél-Karolinában,
a TMV látens törzseként (McKinney 1952). McKinney
NpV
EE
31
megállapította, hogy a Samsun látens törzs rokona a TMV-U1-nek, de nem azonos vele. A rokonság bizonyítékait az alábbiakban határozta meg: 1. szerológiai rokonság; 2. az UV spektrum görbe hasonlósága; 3. morfológiai hasonlóság; 4. a TMV teljesen képes blokkolni a nekrotikus lokális léziók PHJMHOHQpVpW D OiWHQV W|U]]VHO W|UWpQ
alakú, kb. 312× QP D IHUW perces, 95°C-RQ
W|UWpQ
IHOOIHUW
]pV HV
etén. A vírus pálcika
]|WW Q|YpQ\ SUpVQHGYH
KHYtWpV
XWiQ
YHV]WL
HO
D
-8
higításban) 10
IHUW
] NpSHVVpJpW
(McKinney 1952, Wetter 1984). A paprikában a vírus számos zárványt formál a citoplazmában, amelyeket szöget bezáró
UpWHJHNE
O IHOpSO
csoportosulások alkotnak. A partikulumok ezen csoportok hosszanti tengelyére átlósan helyezkednek el. A vírus partikulumok sík rétegei a N|YHWNH] UpWHJJHO NE IRNRV V]|JEHQ V]HPEHIRUGXOWDN $ 709 8
törzsére jHOOHP]
-es
KH[DJRQiOLV NULVWiO\RN LV PHJMHOHQKHWQHN $ 300R9
PHFKDQLNDL ~WRQ N|QQ\HQ iWYLKHW
PDJJDO LV WHUMHG LVPHUW URYDUYHNWRUD
nincs. Különösen üvegházakban és fóliasátrakban okoz nagy gazdasági NiURNDW $ OHYpOHQ J\HQJH WQHWHN PR]DLN WDUNXOiV IHMO
dnek, vagy
tünetmentesek maradnak, a termésen klorotikus tarkulást, csökkent növekedést, ráncosodást, deformációt, esetenként nekrózist okoz. A Datura stramonium-on, a Nicotiana glutinosa-n, a Nicotiana plumbaginifolia-n és a Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc GRKiQ\RQ D 300R9 IHUW NLVHEE ORNiOLV Op]LyN IHMO IHUW
GQHN pV ODVVDEEDQ PLQW D 709 YDJ\ D 7R09
]pVQpO $ 300R9 QHP IHUW
YtUXV OHJIRQWRVDEE PHJ
Ausztráliában,
]pV HVHWpQ
]L D SDUDGLFVRPRW 9DOyV]tQ
U] MH (OWHUMHGW W|EEHN N|]W eV]DN
Ázsiában,
Dániában,
Izlandon,
OHJ D WDODM D
-Amerikában, Angliában,
Franciaországban, Görögországban, Olaszországban, Hollandiában és Spanyolországban (McKinney 1952, Greenleaf et al. 1964, Arteaga és Ortega 1981, Selassie et al. 1981, Nagai et al. 1981, Betti et al. 1982, Paludan 1982, Wetter et al. 1984, Pares 1985, Avgelis 1986, Tanzi et al.
32
1989, Lim et al. 1997, Tsuda et al. 1998). A vírus P1,2 vagy P1,2,3 patotípusú lehet. A
PMMoV
spanyol
izolátuma
(PMMoV-S,
00.071.0.01.007.00.001.001, M81413) általában P1,2 -es patotípusú (Arteaga és Ortega 1981), de beszámoltak P1,2,3 patotípusú izolátumok HO
IRUGXOiViUyO LV
Tenllado et al. 1997). A PMMoV-S-t 1980-ban írták le
Spanyolországban (Arteaga és Ortega 1981), fóliás termesztésben, ahova IHOWHKHW
OHJ IHUW
]|WW PDJJDO MXWRWW EH
982-85 között Spanyolország
GpONHOHWL UpV]pQ $OPpULiEDQ D 300R9 RNR]WD D OHJQDJ\REE IHUW SDSULNiEDQDIHUW
]|WWVpJHW
]pVW D
-100 %-ra becsülték (Alonso et al. 1989).
A dohány enyhe zöld mozaik vírus (Tobacco mild green mosaic virus, TMGMV, 00.071.0.01.011, M22483, patotípus P0 vagy P1) (Green és Kim 1991) szinonim nevei: zöld paradicsom atipikus mozaik vírus (greentomato atypical mosaic virus); a TMV gyenge törzse (mild strain of TMV); para-dohány mozaik vírus (para-tobacco mosaic virus); a TMV délkarolinai gyenge tarkulás törzse (TMV-South Carolina mild mottling strain); a TMV U2-es törzse (TMV strain U2); a TMV U5-ös törzse (TMV U5 törzs); paradicsom atipikus mozaikot és zöld tarkulást okozó törzs (tomato atypical mosaic green mottling strain) (Köhler és Panjan 1943, Johnson 1947, McKinney 1952, Siegel és Wildman 1954, Miller és Thornberry 1958, Knight et al. 1962, Wetter $ YtUXVW HOV McKinney írta le a Kanári-szigeteken (McKinney 1929). IRUGXOW HO
D] (J\HVOW ÈOODPRNEDQ p
NpQW
$ONDORPV]HU
HQ
s Olaszországban, Németországban
dohányon találták meg (Wetter et al. 1984). Az 1990-es években 7DLZDQEDQ LV L]ROiOWiN IHOWHKHW
HQ D] HJpV] YLOiJRQ HOWHUMHGW
Green és
Kim 1991). Általában nekrózist okoz a paprikákon. Bizonyos fajtákat szisztemikusan
is
fHUW
Magátvitellel nem terjed.
]
DPL
D
Q|YpQ\HN
SXV]WXOiViKR]
YH]HW
33
A paradicsom mozaik vírust (Tomato mosaic virus, ToMV, 00.071.0.01.013, X02144, P0 SDWRWtSXV HO Lycopersicon
esculentum-ról
írták
V]|U D] (J\HVOW ÈOODPRNEDQ
le
(Clinton
1909),
melyen
mR]DLNIROWRVViJRW pV WpOHQ OHYpONHVNHQ\HGpVW RNR]RWW +D]iQNEDQ HOV Horváth és Beczner V]iPROWDNEHPHJMHOHQpVpU WHUMHGKHW I
NpQW NOV
PDJiWYLWHOOHO 9DOyV]tQ
NpQW
O$YtUXVPDJJDOLV
OHJ D] HJpV] YLOiJRQ
elterjedt. Több törzse ismert, így pl. a paradicsom aukuba törzs (tomato aucuba strain), a paradicsom enációs tarkulás (tomato enation mottle) és a dahlemense törzs (dahlemense strain) (Hollings és Huttinga 1976). A ToMV a paprikán mozaikot, nekrotikus lokális léziókat, szárnekrózist, szisztemikus
levélnekrózist,
szisztemikus
klorózist,
Q|YpQ\SXV]WXOiVW RNR]KDW 1DJ\ JD]GDViJL MHOHQW
levélhullást,
VpJJHO EtU D] (J\HVOW
Államokban, Franciaországban és Olaszországban (Wetter et al. 1984). Csilléry et al. új tobamovírus törzset izoláltak paprikáról 1978-ban, Óbudán (Csilléry és Ruskó 1980, Csilléry et al. $ SDSULND IHOV
levelei sárgultak, vagy sárga foltosak voltak. A szerológiai és szimptomatológiai vizsgálatok alapján az új izolátumot a ToMV egy új törzseként (ToMV-Ob) azonosították. Az Ob s]LV]WHPLNXVDQIHUW UH]LV]WHQFLDJpQW WDUWDOPD]y SDSULNiNDW (] YROW D] HOV
]WHD]/
1
RO\DQ WREDPRYtUXV
mely áttörte az L1 rezisztenciagént. A vírus által okozott tünetek a Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc-n és a Nicotiana glutinosa-n a K
PpUVpNOHWW
OIJJ|
ttek: 18-20°C-RQQHNURWLNXVORNiOLVOp]LyIHMO
28°C-on illetve 30-32°C-RQ D] LQRNXOiOW OHYHOHNHQ ViUJD YDJ\ J\ IROWRNMHOHQWHNPHJQHNUy]LVQHPIHMO
G|WW U
V]HU
G|WW$V]LV]WHPLNXVOHYHOHNHQV|WpW
sárga mozaik volt látható. A vírus szekvenciáját Ikeda et al. (1993), valamint Padgett és Beachy (1993) határozták meg, és Obuda pepper virus (ObPV) néven az ICTV által bejegyzésre került (00.071.0.01.018, L11665, D13438, patotípus P1,2).
34
Akadnak olyan, a tobamovírusok közé besorolt vírusok, melyeket az ICTV hivatalos nyilvántartásában nem ismer el önálló vírusfajként. Ilyen például a harang alakú paprika tarkulás vírus (Bell pepper mottle
virus,
BpeMV)
melyet
Feldman
és
Oremianer
izolálták
Argentínában 1968-ban, harang alakú paprikáról (Capsicum annuum), mint egy addig ismeretlen TMV törzset (’TMV unusual strain’) (Feldman és Oremianer $ IHUW
]|WW HSLGHUPLV]EHQ H] D W|U]V QHP NpS]HWW ;
-
testeket, csak kevés hexagonális kristályt, és ritkán csoportos kristályokat. $ YtUXVQDN HJ\ WRMiVJ\P|OFV|W IHUW
]
törzsét (A1 törzs) Hollandiában
izolálták (Rast 1985). Salamon et al. (1987) a Solanum dulcamara-ról izoláltak egy vírust, amely a tobamovírus csoport addig ismeretlen tagjának bizonyult. A vírust csucsor sárga foltosság vírusnak nevezték el (Dulcamara yellow fleck virus, DYFV), majd 1993-ban Sanfaçon et al. Solanum dulcamara yellow fleck Ob-ra
nevezték
át.
A
természetes
flórában
végzett
vizsgálatok
megállapították, hogy a Solanum dulcamara közönséges, gazdájához nagymértékben adaptálódott vírusáról van szó, mely a Tisza magyarországi IHOV
HOOHQ
V]DNDV]iQ U]|WW
J\
MW|WW
YDJ\
RWW
IHUW
] G|WW
pV
YLUROyJLDLODJ
QHP
Solanum dulcamara növényekkel kerülhetett az ország más
területeire (Budakalász, Vácrátót). A vírus a paradicsomot szisztemikusan IHUW
]WH
DNiUF
sak a Solanum dulcamara-t. Az L1 rezisztenciafokú
paprikákon szisztemikus tüneteket okozott, melyek olyan súlyosak voltak, hogy gyakran a növény pusztulásához vezettek (Green és Kim 1991, Salamon és Kaszta 2000). A DYFV két mutánsát (LB és XII) egy korábban ToMV-Ob-YDO
MHO]HWW
L]ROiOWiN (J\ NpV
SDSULNiUyO
EEL PXQNiMiEDQ
V]iUPD]y
WREDPRYtUXV
NRPSOH[E
O
Salamon arról számolt be (Salamon
KRJ\ D '<)9 HJ\LN L]ROiWXPD ;0 YDOyV]tQ
OHJ N|]HO D]RQRV D
korábban ToMV-2E W|U]VNpQW PHJKDWiUR]RWW 2E MHO]pV
WR
bamovírussal,
35 PHO\ IHOWHKHW
HQ D '<)9
-Sd spontán mutánsa. Egy nemrég megjelent
munkájában pedig Salamon és Kaszta PiVV]HU]
NNHOHOOHQWpWEHQD
DYFV-t P1 patotípusúnak határozta meg, mivel az az L2 paprikákat ORNiOLVDQ IHUW
]WH 8J\DQLWW D '<)9
-nek
V]iPRV W|U]VpU
O V]iPROW EH pV
ide sorolta az Ob törzset is. Marthur et al. (1966) CPO törzs néven írták le a TMV egyik törzsét. (]DW|U]VFKLOLSDSULNiQIRUGXOWHO
,QGLiEDQJ\HQJHPR]DLNRWRNR]YD
Igwegbe D 709 OHYpOKXOOiVW HO PHJMHOHQpVpU
LGp] GHIROLDWL
on) törzsének
O V]iPROW EH DPHO\HW 1LJpULiEDQ L]ROiOWDN SDSULNiUyO
-
ben a paprikanövényeken komoly satnyulást, levél tarkulást, csökkent WHUPpVW pV WHUPpVN|W
GpVW ILJ\HOWHN PHJ 7RYiEEL YL]VJiODWRN V]HULQW
(Igwegbe és Ogungbade 1985) a szisztemikus tünetek a mozaiktól, WDUNXOiVWyODQ|YpQ\SXV]WXOiViLJWHUMHGWHNÈOWDOiEDQD]LG MREEDQ W~OpOWpN D IHUW
VHEEQ|YpQ\HN
]pVW PLQW D ILDWDODEEDN QDSSDO D IHUW
]pV XWiQ
nekrotikus lokális léziók jelentek meg, amit 3- QDSSDO D IHUW
]pV XWiQ
-
OHYpOKXOOiVN|YHWHWW$N|YHWNH] V]LV]WHPLNXVWQHWHNIRUGXOWDN PpJHO W~OpO
D
SDSULNiNRQ QHNURWLNXV IROWRN FV~FVV]iUDGiV pUQHNUy]LV FVtNRN
zöld érkivilágosodás, általános klorózis, érsárgulás, ráncok, érközti klorózis, levélnekrózis, levéldeformáció, rügybarnulás, koncentrikus QHNURWLNXV
IROWRN
VDWQ\XOiV
YLUiJHOU~JiV
ERV]RUNiQ\VHSU
V|GpV
terméshullás. 65 tesztelt paprikafajtából 8 rezisztensnek, 41 mérsékelten rezisztensnek, és 16 nagyon fogékonynak bizonyult (Igwegbe és Ogungbade 1985). Alexandre et al. (2000) Brazíliában TMV-p néven egy új WREDPRYtUXV W|U]VHW tUWDN OH PHO\ D SHW~QLiWIHUW
]WH(] D W|U]V DSHW~QLiQ
ViUJD PR]DLNRW RNR]RWW pV YHOH V]HPEHQ D YL]VJiOW WHV]WQ|YpQ\E
fogékonynak
bizonyult,
köztük
a
Solanaceae
család
tagjai.
O
Az
elektronmikroszkópos vizsgálatok során úgy tapasztalták, hogy a vírus
36
partikulumok 295-305 nm hosszúak, a virionok az epidermisz, a mezofillum és a parenchima sejtekben kristályréteget vagy tömeget, helyenként X-testeket alkottak. A partikulumok a mitokondriális mátrixban LVPHJMHOHQKHWWHNH]DYtUXVUDMHOOHP] HJ\HGLWXODMGRQViJ$709
-p és a
709 N|]W QDJ\REE PpUWpN
V]HUROyJLDL URNRQViJRW PXWDWWDN NL PLQW D
TMV-p és ToMV között (az SDI érték TMV-p és TMV közt 0,5; TMV-p és
ToMV
közt
1,0).
A
TMV-p
köpenyfehérjéjének
aminosav
szekvenciájában 4 különbséget találtak a TMV-hez viszonyítva (95%-os hasonlóság). A ToMV-vel 75,5%-os volt a hasonlóság. $
WiEOi]DW
D]
,&79
iOWDO
MHJ\]HWW
D
SDSULNiW
WREDPRYtUXVRN NO|QE|] WHV]WQ|YpQ\HNHQ RNR]RWW WQH
IHUW
]
teit foglalja össze
irodalmi adatok alapján.
3. táblázat. Paprikapatogén tobamovírusok által a gazdanövényeken okozott tünetek (Tóbiás et al. 1982, Tóbiás és Csilléry 1983, Csilléry és Ruskó 1980, Csilléry et al. 1983, Wetter et al. 1984, Avgelis 1986, Alonso et al. 1989, Green és Kim 1991 alapján) Vírusok Gazdanövény
TMV-U1
ToMV
ObPV
TMGMV
PMMoV
PaMMV
(D/H) -/N, Mo
*
l/s
*
-/Mo
-/Mo
NtL,
NtL, Ab/-
-/N, Mo L/Mo
-/Mo
-/Mo
-/Mo
Ab/NtL,
NtL, Ab/-
NtL, Ab/N
*
CLN, Ab/Mo NtL,Ab/-
Tabasco L C. chinense
Ab/NtL,
NtL, Ab/-
NtL, Ab/-
*
CLN, Ab/Mo NtL,Ab/-
Miscucho L3 Chenopodium
Ab/NtL/-
NtL/Mot
l/NtL/-
CL
CL
NtL/-
amaranticolor Chenopodium
CL NtL/-
CL/Mo NtL/-
CL
NtL/CL
NtL/-
quinoa
CL
CL/Mo
Capsicum annuum L+ C. annuum L1 C. frutescens 2
L/-
NtL/-
37
Cucumis sativus
0/0
0/0
*
*
0/0
*
Cucurbita pepo
0/0
0/0
*
*
0/0
*
Datura
NtL/-
NtL/-
L/-
NtL/-
NtL
*
stramonium Gomphrena
NtL/-
NtL/N
*
*
0/0
*
globosa Lycopersicon
-/Mo
-/Mo
l/Mo
0
0
*
esculentum Nicotiana
NtL/N
NtL/N
*
*
-/Mo
*
benthamiana N. clevelandii
NtL/N
NtL/N
*
-/Mo
-/Mo
*
-/Mo
-/Mo Vírusok
Gazdanövény
TMV-U1
ToMV
ObPV
TMGMV
PMMoV
PaMMV
N. glutinosa
NtL/-
(D/H) NtL/-
L/Mo
NtL/-
NtL
*
N.
NtL
NtL
*
*
NtL
*
plumbaginifolia N. rustica
CLN/Mo
NtL/-
L/Mo
*
NL/-
NL/-
NtL/-
NtL
NtL/-
N. sylvestris
-/MoD
NtL/-
-/MoDN NtL/-
N. tabacum cv.
-/MoD
-/Mo
(L)/Mo
-/Mo
l/s
0/0
Samsun N. tabacum cv.
NtL/-
NtL/-
-/MoD L/MoN
*
NtL
NtL/-
Xanthi-nc Ocimum
0/0
0/0
*
l/-
*
basilicum Petunia hybrida
CL -/Mo
CL NtL/-
NtL/-
CL NtL
0/0 Mo/s
NtL/-
Petunia
LCN/Mo LCN/Mo
*
-/MoD
*
LN/-/Mo
-/Mo
nyctagyniflora Phaseolus
D NtL/-
NtL/-
*
*
0/0
*
vulgaris Physalis
-/Mo
-/Mo
*
*
-/Mo
*
floridana Plantago major
0/0
*
LR/-
*
0/0
0/0
38
Solanum
NtL/N
*
NtL/-
*
-/(s)
(NtL)/-
melongena S. melongena
-/Mo
*
NtL/s
*
-/s
0/0
‘Claresse’ S. melongena
NtL/Mo
*
NtL/-
*
NtL/-
(NtL)/-
‘Dobrix’ S.
NtL,
*
NtL, Ab/-
*
NtL/-
-/Mo
pseudocapsicum S.
Ab/NtL/-
*
-/Mo
*
-/s
-/s
giganteum Vigna
0/0
0/0
*
0/0
*
*
unguiculata
"!$#&%' ( ) ( ' % ) *+ , .- #/ + 0 ( 21 * 3, 54 (#67( 0+ %71 8( + ( ( 0 09: , 54 ( ;#68( :<1 ) 9+ , 1 ) ( , >= #?+%) ( 0 <1 ) 3 , A@ #?(B +% ( C1 %+ D ) +*+ , #E F 7G ( 8 + 0 < HF % +% ( 1 8 + " I ) *+ , 1?,J#/ %) 2K 81 +( F +K ( , 5L #/) : G( 1 :F ) H ( ( 0 09: , M N#O 0% 0 0 (81 evélhullás), * = nincs adat
A számlálóban a lokális (klorotikus), D = deformation (deformáció), l = symptomless local infection (tünetmentes lokális , Nt = necrotic
TMV-U1 = Tobacco mosaic virus U1 (Dohány mozaik vírus U1-es törzse), ToMV (D/H) = Tomato mosaic virus D/H (Paradicsom mozaik vírus D/H törzse), ObPV = Obuda pepper virus (Óbuda paprika vírus), TMGMV = Tobacco mild green mosaic virus (Dohány enyhe zöld mozaik vírus), PMMoV = Pepper mild mottle virus (Paprika enyhe tarkulás vírus), PaMMV = Paprika mild mottle virus C. = Capsicum, N. = Nicotiana, S. = Solanum
1 P ) G G) QF 'J ) 9+ RS ) ,
2.3.5. A tobamovírusok nukleotid szekvenciája és replikációja
A tobamovírusok RNS-einek 5’ végén 7-metil guanozin sapkát (m7G5’ppp5’) találunk (Keith és Fraenkel-Conrat 1975). A 3’ végük tRNSV]HU
KLV]WLGLQW N|W
PiVRGODJRV V]HUNH]HW
$] 516 HOV
QXNOHRWLGMD
és a 3’ vég utolsó nukleotidjai fehérjét nem kódoló szakaszok (1. ábra). A TMV a legrégebben és legrészletesebben tanulmányozott víruskórokozó, teljes szekvenciája 1982 óta ismert (Goelet et al. 1982). Genomja 6395 nukleotidból áll. A PMMoV-S teljes nukleotidszekvenciáját 1990-es években közölték (Avila-Rincón et al. 1989, Alonso et al. 1991, García-Luque et al. 1990, 1993), a genom 6357 nukleotidból áll. Szekvenciaegyezése a ToMVvel 69,4 %-os, a TMV-U1-el 68,5%-os, a TMGMV-vel 64%-os. A
39
szekvenciaelemzések alapján elmondható, hogy a PMMoV egy csoportba tartozik a TMV-U1-el, a ToMV-vel és a TMGMV-vel, legközelebbi rokonságban a TMV-U1-el és a ToMV-vel áll.
TMV RNS 6395 nt UAG
5’ mGppGp
3’ tRNS
126 kD
I2-RNS 183 kD S-RNS 30 kD
17,6 kD
1. ábra. A Tobamovirus nemzetség típustagjának, a dohány mozaik vírusnak (Tobacco mosaic virus, TMV) JHQRPV]HUYH]
GpVH
nt = nukleotid, kD = kilodalton, UAG = gyenge stopkodon, tRNS = transzfer RNS, I2-RNS, S-RNS = szubgenomi RNS-ek
A Tobamovirus nemzetség tagjainak genomja 4 nyitott leolvasási keretet (open reading frame, ORF) tartalmaz, amelyek nem fednek át. Az RNS elején egy 69 nt hosszú vezérszekvencia található, melyet omega (Ω) szakasznak neveznek, és guanintól mentes. A 3’nem-kódoló régió 199 nt hosszú.
40 $]HOV
OHROYDViVLV]DNDV]
-3423-dik nukleotidig tart) egy 126 kD
QDJ\ViJ~ IHKpUMH V]LQWp]LVpW WHV]L OHKHW
Yp $ N' IHKpUMpEHQ
funkcionális domént találtak, konzervált motívumokkal. Az egyik domén OHKHW
IHOHO
V
D
PHWLOWUDQV]IHUi]
DNWLYLWiVpUW
PHO
y a sapka (cap)
formálódásához szükséges. A másik domén a helikáz domén, mely a QXNOHLQVDY ÄNLWHNHUpVpEHQ´ pV YDOyV]tQ
OHJ D UHNRPELQiFLyEDQ pV D
WUDQV]NULSFLyEDQLVV]HUHSHWMiWV]LN$]HOV
OHROYDViVLV]DNDV]WHJ\J\HQJH
amber stopkodon (UAG) követi, ami megengedi annak átolvasását YDOyV]tQ
OHJHJ\WLUR]LQEHV]~UyGiVDPLDWW pVD]RQNHUHV]WOHJ\N'
fehérje szintézisét eredményezi (a 183 kD fehérjét kódoló rész a 4908-ik nukleotidig
tart).
A
3421-4908-dik
nukleotidig
tartó
szakasz
a
legkonzerváltabb régió. A 183 kD fehérje karboxi-terminális végén található a polimeráz modul, melyben 4 domént azonosítottak. A 183 kD fehérjénél átírt szakasz, ami a harmadik leolvasási szakasznak felelne meg, elvileg egy önálló (54 kD) fehérje lehetne, ezt a fehérjét D]RQEDQDIHUW
]|WW
növényekben nem tudták kimutatni. Mind a 126, mind a 183 kD fehérje RNS-W
OIJJ $ EHOV
516
-polimeráz, tehát maga a replikáz enzim.
JpQHN WRYiEEL NLIHMH] GpVH V]XEJHQRPL 516
-ekhez kötött.
Az I2 szubgenomi RNS két ORF-et - ORF4 és ORF5 - is tartalmaz, melyek N|]O FVDN D] HOV
25) Q\LOYiQXOKDW PHJ (QQHN WHUPpNH D N'
nagyságú peptid, a mozgásfehérje (movement protein, MP). E peptidnek a SOD]PRGH]PD
PyGRVtWiViYDO
D
VHMWU
O
VHMWUH W|UWpQ
WHUMHGpVEHQ
YDQ
szerepe. A 30 kD fehérjét kódoló szakasz (4909-5682-dik nukleotidig) miként más tobamovírusoknál is - a legkevésbé konzervatív régióban van. A mozgásfehérjében azonosítottak egy domént, mely a nukleinsavhoz való N|W
GpVpUWIHOHO $ EHOV
OHROYDViVL V]DNDV] 25) WUDQV]OiFLyMD FV
ak egy újabb,
egycisztronos kis szubgenomi RNS (sRNS) révén valósul meg. Az ORF5 a
41
17,6 kD CP kódját foglalja magában. A 17,6 kD CP fehérjét kódoló rész az 5685-6158-GLN QXNOHRWLGLJ WDUW HO N|W
KHO\ pV QHP NRQ]HUYDW
WWH NO|QiOOy QW NRQ]HUYDWtY 516
ív (N, C, és központi régió) részeket is
tartalmaz. Mindkét szubgenomi RNS-W D IHUW
]|WW Q|YpQ\HNE
O L]ROiOWiN
N|]ON FVDN D] V516 PHWLOiOW $ U|YLG V516 J\RUV pV QDJ\W|PHJ N|SHQ\IHKpUMH
V]LQWp]LVpW
WHV]L
OHKHW
Yp
$
V]XEJHQRPL
516
-ek
szintézisének szabályozási mechanizmusa kevésbé ismert. A replikáció végén felszaporodó CP felismeri az RNS 3’ véghez közeli (5290-5527 nt közötti), speciális bázispárosodású szakaszait (felismerési régió), és PLQGNpW LUiQ\EDQ PHJNH]G W|UWpQ
GLN D N|SHQ\IHKpUMH
-alegységek nukleinsavval
|VV]HpSOpVH DVVHPEO\ pV D] ~M YLULRQRN NLDODNtWiVD $ UHDNFLy
vitro N|UOPpQ\HN N|]|WW LV YpJEHPHJ\ HJ\HV HVHWHNEHQ D N|W
in
KHO\HN D
rokon vírusok fehérjéit is felismerik. A vírusszintézis helye a citoplazma, ezen belül az endoplazmatikus retikulum speciális része (viroplazma). )HOPHUOWDQQDNDOHKHW
VpJHKRJ\DNORURSODV]WLV]RNLVDYtUXVELRV]LQWp]LV
KHO\HL OHQQpQHN 9DOyV]tQ YLULRQRN FVDN NpV
EE D]RQEDQ KRJ\ D YtUXV N|SHQ\IHKpUMH pV D
EE NHUOQHN D V]tQWHVWHNEH $ NpS] G|WW ~M YLULRQ
ok a
citoplazmában és a vakuolumokban halmozódnak fel igen nagy PHQQ\LVpJEHQpVJ\DNUDQKH[DJRQiOLVSDUDNULVWiO\RVIRUPiEDUHQGH] GQHN
(cf. Gáborjányi 1999). Ishikawa et al. (1988) a tobamovírusok RNS 3’ nemkódoló UpJLyMiQDN
MHOHQW
VpJpW
NXWDWWiN
NLPpU
át készítettek a TMV-L
SDUDGLFVRP W|U]V ¶QHPNyGROy UpJLyMiQDN KHO\HWWHVtWpVpYHO $] HOV
kiméra (OL1) a TMV-OM (közönséges törzs), a második (LG11) a CGMMV, a harmadik (LK31) a TMV tehénborsó törzs (TMV-Cc) 3' nemkódoló régióját tartalmazta. A TMV-L, TMV-OM és CGMMV 3’végének transzferRNS-V]HU
W516 V]HU
-
UpV]H KLV]WLGLQW NpSHV N|WQL
míg a TMV-Cc valint. A 4 tobamovírus 3’ nemkódoló régiója kb. 200
42
nukleotidból áll, egy tRNS-V]HU KiURP
HJ\PiVW
N|YHW
VWUXNW~UiW WDUWDOPD] D ¶ YpJpQpO pV
KXURNV]HU
U
észt a tRNS-V]HU
V]DNDV]WyO
közvetlenül 5’ irányban. A TMV-L-nek és a TMV-OM-nek közel azonos a tRNS-V]HU
UpV]N$&*009
-é is hasonló, bár néhány párosítatlan bázis
más pozícióban helyezkedik el. A TMV-Cc tRNS-V]HU
VWUXNW~UiMDYLV]RQW
eltér a TMV-L-pW l. A három kiméra képes volt replikálódni a TMV IHUW
]|WW Q|YpQ\HNEHQ pV SURWRSODV]WRNEDQ LV $] 2/ PXOWLSOLNiOyGiVD
KDVRQOy YROW D V]O
709
-L törzséhez, az LG11 és LK31 replikációja
D]RQEDQ FV|NNHQW PpUWpN
YROW ÒJ\ W
TMV-20pVD&*009V
QLN D 709
-L replikáz felismerte a
WD709
-Cc 3’struktúráját is, és így képes volt
a negatív szálú RNS szintézisét elindítani. Vagyis a vírus által kódolt replikáz komponensei és a 3’ nemkódoló régió közti kapcsolat nem volt olyan szigorúan kötött. Az RNS 3’ vége fontos szerepet játszhat a negatív szálú RNS szintézisének specifikus iniciációjában a pozitív szálú RNS vírusok replikációja során. Az eredmények arra utaltak, hogy a TMV-L-E
O
származó kimérák replikálódhatnak akkor is, ha a 3’nemkódoló régió más tobamovírusbyO V]iUPD]LN QRKD QpKiQ\ NLPpUD IHOKDOPR]yGiVD MHOHQW OHFV|NNHQW$]/*pV/.YtUXV516FV|NNHQWWHUPHO D
¶
WHUPLQiOLV
VWUXNW~UD
pV
D
YtUXV
UHSOLNi]
N|]WL
GpVHIHOWHKHW QHP
VHQ HQ
NLHOpJtW
kölcsönhatásból adódott. A kimérák csökkent replikálódása viszont egyéb WpQ\H] NQHN WXGKDWy
be (pl. a kiméra genomjának csökkent stabilitása). A
¶ WHUPLQiOLV VWUXNW~UD MHOHQW QXNOHRWLGV]HNYHQFLiNHU
VpJpW WiPDV]WMD DOi D] D WpQ\ LV KRJ\ D
VHQNRQ]HUYiOWDN$KiURPUpV]UHRV]WRWWYtUXVRN
közül a rozsnok mozaik vírus (Brome mosaic virus, BMV) és a CMV HVHWpEHQ D ¶ YpJE
O W|EE PLQW QW EHOHpUWYH D W516 V]HU
VWUXNW~UiW
is) közel azonos a genom osztott részeiben. A TMV–U1 3’ nemkódoló régiójából 204 nt megegyezik három független izolátum és törzs szekvenciájával. A tobamovírus RNS-ek 3’ terminális régiójának
43 MHOHQW
VpJpW EL]RQ\tWMD D] KRJ\ D 709 8 516 PHO\E
-
WHUPLQiOLV QW QHP IHUW DPHO\E
O KLiQ\]LN D ¶
] NpSHV KDVRQOyDQ D 709 / 516
O D KiURP HJ\PiVW N|YHW
KXURNV]HU
V]DNDV] KLiQ\]LN
-hez,
Ishikawa
et al. 1988).
2.3.6. A tobamovírusok terjedése A Tobamovirus
QHP]HWVpJ WDJMDL I
ROWiVVDO WHUMHGQHN D YHNWRURNNDO W|UWpQ SDSULNiW QHP IHUW MHOHQW
NpQW PHFKDQLNDL ~WRQ YDJ\
WHUMHGpV QHP LVPHUW NLYpWHOW D
] &*009 MHOHQW (J\HV YtUXVIDMRN HVHWpEHQ QDJ\
VpJHYDQDNOV
YDJ\EHOV
PDJiWYLWHOQHNLV
A tobamovírusok magátvitelét vizsgálva a kutatók megállapították, hogy a TMV a Capsicum frutescens (McKinney 1952) és a Capsicum annuum mag felületén is terjedhet (7RãLüHWDO 1980). A PMMoV-nél pedig DNOV
pVDEHOV
PDJiWYLWHOLVV]HUHSHWMiWV]LN
Tanzi et al. )HOWHKHW
HQ $PHULNiEyO (XUySiED LV PDJJDO
került át. Nagai V]HULQW D 300R9 IHUW 38%-RW LV HOpUKHWL 6]iPRV V]HU] WREDPRYtUXVVDO IHUW
Demski 1981, Nagai 1988,
]|WWVpJ D SDSULND PDJEDQ D
V]HULQW D SDSULNDPDJRN NOV
]|WW pV tJ\ DSUy VHEHNHQ NHUHV]WO IHUW
UpV]H
] GQHN D
magoncok (Szirmai 1950, Glaeser 1976, Molnár és Tóbiás 1979, Pares és Gunn 1989, Black et al. 1991, Mink 1993, Beczner et al. 1997). A pollenszemcsék is hordozhatnak tobamovírusokat a felületükön, és néha a citoplazmában is (Michon 1982, Hamilton és Valentine 1984). $WREDPRYtUXVRNHOOHQLYpGHNH]pVOHKHW
2.3.7.
$ YtUXVRN IHKpUMpE
Önálló
anyagcseréjük
VpJHL
O pV QXNOHLQVDYEyO IHOpSO
nincs,
a
REOLJiW VHMWSDUD]LWiN
gazdaszervezet
fehérje-
és
44
nukleinsavszintetizáló rendszerét parazitálják. A gazdasejttel szinte egy egységet alkotnak, így replikációjukat szelektíven meggátolni majdnem lehetetlen feladat. Ez az oka annak, hogy a vírusok esetében gyakorlati kémiai védeke]pVU
O QHP EHV]pOKHWQN $] HOOHQN W|UWpQ
ELROyJLDL WHUPpV]HWNE
YpGHNH]pV
O DGyGyDQ VRNNDO QHKH]HEE PLQW SO D EDNWpULXP
-,
vagy gombabetegségekkel szemben. Pedig a járványok fellépése, a UH]LV]WHQV IDMWiNDW LV PHJEHWHJtW
YDJ\ D Q|YpQ\YpG
V]HUHNNHO V]
emben
ellenálló új patotípusok, törzsek megjelenése állandó kihívást jelent a Q|YpQ\YpG
V]DNHPEHUHN
V]iPiUD
(OV
VRUEDQ
D
Q|YpQ\
JHQHWLNDL
adottságait próbálják megváltoztatni, javítani hagyományos (nemesítés) és új (biotechnológia) módszerekkel. A nemesítés még ma is számos tartalékot rejt. Az újabb módszerek segítségével (pl. protoplaszt fúzió) az HJ\PiVWyOWiYRODEEHV
IDMRNDWIDMWiNDWLVOHKHWNHUHV]WH]QL
A vírusok elleni védekezésben például a keresztvédettség és a szerzett rezisztencia jelenségét is próbálják felhasználni. gVV]HIRJODOYD D YtUXVRN HOOHQ D N|YHWNH] YpGHNH]pVL PyGRN M|KHWQHN
számításba: 1.
*HQHWLNDL
OHKHW
VpJHN
KDJ\RPiQ\RV
QHPHVtWpV
YDODPLQW
D
biotechnológiai és biológiai módszerek) 2. Agrotechnikai eljárások 3. Kémiai módszerek
2.3.7.1. Biológiai módszerek a tobamovírusok elleni védekezésben
A keresztvédettség jelenségének kihasználása
A biológiai védekezés egyik alapját a keresztvédettségi reakció felismerése képezi (McKinney 1929). A jelenség lényege, hogy egy korai
45 YtUXVIHUW
]pV PH
ly enyhe tüneteket okoz, védettséget indukál ugyanazon
YtUXV PiVLN W|U]VHLQHN NpV
EEL IHUW
]pVpYHO V]HPEHQ PHJJiWROYD D]
HJ\pENpQW V~O\RV WQHWHNNHO MiUy PiVRGLN IHUW
]pV NLDODNXOiViW $] LO\HQ
védettség (keresztvédettség, cross protection, indukált immunitás) annál HU
VHEE PLQpO N|]HOHEEL URNRQViJEDQ YDQ D NpW YtUXVW|U]V $ MHOHQVpJ
PDJ\DUi]DWiUD
D
N|YHWNH]
HONpS]HOpVHN
V]OHWWHN
D]
HOV
IHUW
]pV
nukleinsavai lefoglalják azokat a helyeket, ahol a replikáció végbemegy; a replikációhoz szükséges anyagok PiVRGLN IHUW
;a
HOIRJ\QDN D PiVRGLN IHUW
]pV QXNOHLQVDYiW D] HOV
IHUW
]pV LGHMpUH
]pV UHSOLNiFLyMD VRUiQOpWUHM|Y
QHP PHVVHQJHU 516 OHN|WL YDJ\ EHEXUNROyGLN D] HOV
YtUXV iOWDO WHUPHOW
köpenyfehérjével. A keresztvédettséget felhasználó módszerek lényege, hogy olyan PXWiQVRNDW iOOtWDQDN HO
DPHO\HN FVDN J\HQJH WQHWHNHW RNR]QDN D
WHUPHV]WHWW Q|YpQ\HNUH NRPRO\ YHV]pO\W QHP MHOHQWHQHN (]]HO IHUW NXOW~UiWPLQWHJ\ÄLPPXQL]iOMiN´D]WtJ\ NpV
esetén csak enyhe tünetek fHMO RO\DQ PXWiQVW iOOtWRWW HO IHUW
GQHN
EEDYtUXVÄYDOyGL´IHUW
YDJ\
D 7R09 VDOpWURPRV NH]HOpVpYHO PHO\ PHJ
WQHWHNHW
RNR]y
YtUXVW|U]VHNNHO
UL]WH
VRUEDQ YHJKi]L
SDUDGLFVRPNXOW~UiNQiO KDV]QiOWiN IHO D J\HQJtWHWW DWW
J\HQJH
]pVH
Rast (1972, 1975) kísérletei során
] NpSHVVpJpW GH FVDN HQ\KH WQHWHNHW RNR]RWW (OV
WHUPHV]WpV
]YH D
W|UWpQ
enuált),
YDNFLQiOiVL
módszert" vagy "premunitást". Hazánkban szintén folytattak kísérleteket gyenge tüneteket okozó ToMV törzzsel (M-II-16 törzs, Gáborjányi et al. 1980). Tanzi et al. (1986) salétromos kH]HOpVVHOPXWiQVW 0 iOOtWRWWDNHO egy P1,2,3
SDWRWtSXV~ 300R9 W|U]VE
O (] D] 0 PXWiQV V]LQWpQ 31,2,3
patotípusúnak bizonyult, de csak gyenge mozaikfoltosságot okozott a SDSULND IHOV
Fukami
OHYHOHLQ pV D WQHWHN KpW P~OYD YLVV]DIHMO
D IHUW
]|WW Q|YpQ\HNHW
GWHN
Nagai és
°C-on tartva egy attenuált
PMMoV izolátumot szelektált. Ez az izolátum csak nagyon gyenge
46 WQHWHNHW RNR]RWW D SDSULNDQ|YpQ\HNHQ $] DWWHQXiOW L]ROiWXPPDO IHUW
]|WW
fiatal magoncokat sikerült megvédeni a PMMoV súlyos károkat okozó izolátumaival szemben, de fogékonyak voltak a ToMV illetve a TMV-U1HVW|U]VIHUW
]pVpUH
cf. Wetter 1988).
Mindezen próbálkozások ellenére a gyengített vírustörzseket nem alkalmazzák elterjedten a termesztésben, mert felhasználásuk körülményes, fokozott figyelmet igényel, nem beszélve arról, hogy még a szakemberek is idegenkednek
a
vírusok
használatától,
mert
megtámadhatnak
és
elpusztíthatnak más, termesztett növényt, illetve rekombinációk révén új, virulensebb törzsek jöhetnek létre (Gáborjányi 1986). Az M-II-16 törzs például, bár a paradicsomon tüneteket nem okozott, elpusztította a hazai SDSULNDIDMWiN MHOHQW YpG
KDWiV K
V UpV]pW 8J\DQDNNRU D J\HQJtWHWW W|U]]VHO YpJ]HWW
pU]pNHQ\
Fraser és Loughlin H]pUW D Q\iUL LG
V]DNEDQ
alkalmazása eredménytelennek bizonyult, de megmaradt a veszélye annak, KRJ\ PiV NXOW~UiN SO SDSULND IHUW
] GMHQHN
Gáborjányi és Burgyán
1980, Gáborjányi et al. 1980, Burgyán és Gáborjányi 1984).
A szerzett rezisztencia jelenségének kihasználása
A keresztvédettséghez nagyon hasonló a szerzett rezisztencia jelensége. A szerzett rezisztencia olyan indukált ellenállóképesség, amelyet HJ\ HO
]HWHV ORNiOLV IHUW
]pV YiOW NL D] HOV
IHUW
lézió körüli szövetzónában (lokális szerzett IHUW
]pV KHO\pW
(Ross
O WiYRO HV
O V]iUPD]y ORNiOLV
UH]LV]WHQFLD YDJ\ D] HOV
WHUOHWHNHQ V]LV]WHPLNXV V]HU]HWW UH]LV]WHQFLD
DE $ JD]GDQ|YpQ\ D] HOV
WHUPHO DPHO\HN D] LG
]pVE
IHUW
EHQ PiVRGLN IHUW
]pV KDWiViUD RO\DQ DQ\DJRNDW
]pVW JiWROMiN (]W D MHOHQVpJHW LV
próbálták felhasználni a vírusok elleni védekezés során.
47
A szerzett rezisztencia kialakulásának okát vizsgálva természetes stressz szignálokat
feltételeztek és
mutattak ki,
amelyek
között
legismertebb a szalicilsav (SA) rezisztenciát indukáló hatása. A SA YtUXVOp]LyJiWOy
KDWiViUyO HO
acetilszalicilsavval
kezelte
UH]LV]WHQFLiUDHPOpNH]WHW
V]|U
a
White számolt be 1979-ben. White
dohányait,
és
szisztemikus
szerzett
YpGHWWVpJHWWXGRWWtJ\HOpUQL$NH]HOpV
FV|NNHQWHWWH D 709 IHUW
]pV KDWiViUD NLIHMO
-kal
G|WW ORNiOLV Op]LyN V]iPiW D
kontrollhoz képest (White 1979). Kiváló tulajdonságai ellenére a SA gyakorlati alkalmazása nehézségekbe ütközik, mert a növények a számukra feleslegesnek
ítélt
szalicilsavat
cukormolekulához
HOUDNWiUR]]iN H]pUW D V]DEDG 6$ PHQQ\LVpJH NOV Q|YHOKHW
kapcsolódva
DGDJROiVVDO QHKH]HQ
$ ELROyJLDLODJ KDWpNRQ\ NRQFHQWUiFLyMD SHGLJ RO\DQ QDJ\ KRJ\
az már közelít a növény számára toxikus koncentrációhoz. A felmerült problémák
áthidalására
indult
a
Ciba-*HLJ\
FpJ
PH]
JD]GDViJL
ELRWHFKQROyJLDL N|]SRQWMiEDQ LQWHQ]tY NXWDWiV D V]DOLFLOVDYDW KHO\HWWHVtW YHJ\OHWHN
LUiQW
(OV
NpQW
D
-dikloro-izonikotinsavat (INA) és
metilészterét fejlesztették ki. Ezt a vegyületet eredményesen használták üvegházi és szabadföldi kísérletekben egyaránt (Kessmann et al. 1994, Vernooij et al. GH PpUJH]
KDWiVVDO YROW D Q|YpQ\HNUH
Ryals et al.
$ N|YHWNH] YHJ
yület a BTH (1,2,3-benzotiadiazol-7-trikarboxi-S-
metilészter) volt, mely az INA-nál is hatékonyabb rezisztenciaindukálónak bizonyult (Friedrich et al. 1996). A BTH-t már eredményesen alkalmazták többek közt tobamovírusok ellen is (Rácz 1996, Fodor et al. 1997, Inbar et al. 1998). Újabb kísérletekben igazolást nyert a BTH vírusléziók nagyságát pV V]iPiW FV|NNHQW GH DIHUW
KDWiVD .
PtYHV HW DO
1998, Kálmán és Gáborjányi
]|WW Q|YpQ\HNEHQ V]LJQLILNiQVDQ QHP FV|NNHQWHWWH D YtUXV
koncentrációját (Kálmán és Gáborjányi 1998).
48
2.3.7.2.
Biotechnológiai
módszerek
a
tobamovírusok
elleni
védekezésben
A biotechnológiai eljárások során a növényi genomba új gén(eke)t MXWWDWQDN EH UH]LV]WHQV IDMWiN HO
iOOtWiVD FpOMiEyO $ EHMXWWDWiV W|UWpQKHW
szomatikus hibridizációval, vagy molekuláris genetikai módszerekkel WUDQV]IRUPiOiV NO|QE|] YHNWRURN DONDOPD]iViYDO
LQGLUHNW PyGV]HU
;
vagy direkt transzformáció, melynek során a DNS passzívan jut be, pl. génpuska segítségével). $ WUDQV]JpQLNXV Q|YpQ\HN HO
iOOtWiViYDO W|UWpQ
YtUXVRN HOOH
ni
védekezést a bevitt gének forrása alapján csoportosíthatjuk: a.
9tUXVHUHGHW
JpQHN
b.
1|YpQ\LHUHGHW
WHUPpV]HWHVYtUXVHOOHQiOOyViJJpQHN
c. Egyéb vírusellenállóság gének
A kórokozótól származtatott rezisztencia (OPpOHWLOHJ EiUPHO\ YtUXV HUHGHW YDODPLO\HQ V]LQW
V]HNYH
ncia alkalmas arra, hogy
HOOHQiOOyViJRW YiOWVRQ NL D WUDQV]JpQLNXV Q|YpQ\EHQ
(Lomonossoff 1995). A legtöbb kísérletet a CP gén, a replikáz gén, a MP gén, a szatellit RNS-ek és a defektív interferáló RNS-ek beépítésével végezték (Fauquet és Beachy 1992, Stiekema et al. 1993, Wassenegger 1998). A tobamovírusok elleni védekezésben eddig a CP génnel és a UHSOLNi]
JpQQHO
WUDQV]IRUPiOW
Q|YpQ\HNQpO
eredményeket elérni.
A köpenyfehérje génnel indukált vírusrezisztencia
VLNHUOW
MHOHQW
VHEE
49
E rezisztenciaforma felismerését a keresztvédettség felfedezése tette OHKHW
Yp
McKinney 1929). Egyes
kutatók feltételezték, hogy a
keresztvédettség során a második vírustörzzsel szembeni rezisztencia annak N|V]|QKHW
KRJ\
köpenyfehérjéje.
D
Az
VHMWHNEHQ
1980-as
Q|YpQ\HNHW iOOtWRWWDN HO
PiU
MHOHQ
években
YDQ
D]
HOV
Y
írustörzs
géntranszformációval
PHO\HN D YtUXV &3 JpQMpW PHJIHOHO
olyan
SURPRWHU
mögött hordozták, így a növények saját maguk termelték a vírus CP-jét. Beachy et al. (1985), valamint Powell et al. (1986) a TMV CP-jével dohánynövényeket transzformáltak. A felnevelt növények köpenyfehérjét WHUPHOWHNpVQDJ\IRN~UH]LV]WHQFLiWPXWDWWDND709IHUW 0D PiU W|EE PLQW V]i] LO\HQ PyGRQ HO
]pVpYHOV]HPEHQ
iOOtWRWW YtUXVUH]LV]WHQV
növény létezik, ezek ellenállóak az adott vírussal, és bizonyos mértékig a rokon vírusokkal szemben (Fauquet és Beachy 1992, Stiekema et al. 1993, Tepfer és Balázs 1997, Miller és Hemenway 1998, Wassenegger 1998). A PMMoV CP-jével transzformált növényeken például késleltetve, vagy HJ\iOWDOiQ QHP IHMO
GWHN WQHWHN D 300R9 IHUW
]pVpUH .pV
EE DODNXOWDN
ki a tünetek abban az esetben is, ha a TMV egyik közönséges törzsével IHUW
]WpN D Q|YpQ\HNHW
D] D]W N|YHW
Lim et al. 1997). Általában az F1 nemzedékben és
JHQHUiFLyNEDQ pUWpNHOLN D
rezisztenciát, ami vizuálisan is
PHJQ\LOYiQXO D]LQRNXOiOWOHYHOHNHQNHYHVHEEDIHUW
]pVLKHO\HNV]iPDpV
a szisztemikus tünetek is csökkennek, a vírus kisebb mennyiségben DNNXPXOiOyGLN D IHUW
]pV XWiQ $] LQRNXOXP NRQFHQWUiFLyMiQDN Q|YHOpVH
megszüntetheti a rezisztenciát, pl. a TMV esetében. A köpenyfehérje génnel indukált rezisztencia mechanizmusát kiterjedten kutatták (cf. Szilassy et al. 1999). A nem teljes köpenyfehérjék több esetben nem közvetítettek ellenállóságot, ami arra utalt, hogy esetleg magD
D IHKpUMH D IHOHO
V D] HOOHQiOOyViJpUW (]HNQHN D] DGDWRNQDN
ellentmondanak azok a kísérletek, melyek során a köpenyfehérje gén
50
antiszensz orientációban beültetve is védelmet nyújtott néhány esetben. Egy másik elképzelés szerint a köpenyfehérje által közvetített rezisztencia HVHWpQDIHUW
]|WWVHMWHNEHQDYLULRQRNV]pWYiOiVDJiWOyGLNDNL]iUyODJFVDN
nukleinsavat tartalmazó inokulum ezért töri át a rezisztenciát. Ezzel szemben a PVX RNS-pYHO
W|UWpQ
LQRNXOiOiV QHP V]QWHWWH PHJ D
transzgénikus növények rezisztenciáját. A rezisztencia mechanizmusát PDJ\DUi]yHONpS]HOpVHNN|]OOHJYDOyV]tQ
EEQHNDN|YHWNH]
NW
QQHN
1. A vírus nem tud megválni fehérjeburkától, vagy a transzgén által NyGROW
&3
EORNNROMD
melyekhez a vírus DIHUW 2. A CP-MpW WHUPHO IHUW
O
G|WW
D
Q|YpQ\L
]pVVRUiQN|W
PHJV]DEDGXOW
VHMWEHQ
~MUD
UHFHSWRURNDW
GLN
QXNOHLQVDY
N|SHQ\IHKpUMpYHO
PHJOpY
D
WUDQV]JpQLNXV
EHEXUNROyGLN
Q|YpQ\EHQ
H]iOWDO
QHP
WXG
]QL
3. A CP a vírus RNS replikációját befolyásolja. 4.
$ &3 D] 03 IHOKDOPR]yGiViUD pV P N|GpVpUH KDW t
gy befolyásolja a
rezisztenciát (Bendahmane et al. 2002).
A replikáz génnel indukált vírusrezisztencia
Golemboski et al. (1990) a TMV replikáz fehérjéjét expresszálták növényekben, aminek következtében a növények ellenállóak lettek a YtUXVIHUW
]pVVHO V]H
mben. A jelenség mechanizmusáról keveset tudunk,
W|EEHVHWEHQQLQFVNDSFVRODWDIHKpUMHNLIHMH] GpVHpVDUH]LV]WHQFLDN|]|WW $] tJ\ NLDODNtWRWW UH]LV]WHQFLD V] N YpGHWWVpJHW HUHGPpQ\H] FVXSiQ D
legközelebbi rokon vírustörzsek ellen hatékony. Tenllado et al. (1995) olyan klónt készítettek (P54-5), amely a PMMoV-S 54 kDa fehérjét kódoló régióját – vagyis a replikáz gén egy szakaszát - tartalmazta. A klónnal transzformált Nicotiana benthamiana
51
növények
közül hat, egymástól független vonalat vizsgáltak. A
transzgénikus
növényeket
PMMoV-S-VHO
UH]LV]WHQFLDYiODV]W WDSDV]WDOWDN $] HOV UH]LV]WHQFLD
YROW
H]HVHWEHQ
QHP
IHMO
IHUW
]YH
NpWIpOH
WtSXV~ HJ\ WHOMHV PDJDVIRN~ GWHN
WQHWHN
GH
NLVPpUWpN
replikációt meg lehetett figyelni. Csupán két vonal néhány egyede mutatta ezt a rezisztenciatípust. A második rezisztenciatípus késleltetett, indukált, de szintén magasfokú rezisztenciának bizonyult. Az ebbe a csoportba WDUWR]y Q|YpQ\HN NH]GHWEHQ IRJpNRQ\DN YROWDN GH NpV D
V]LV]WHPLNXV
IHUW
]pVE
O
$
Ä
kigyógyult”,
EE ÄNLJ\yJ\XOWDN´
tünetmentes
levelek
rezisztenseknek bizonyultak a PMMoV-S-nek és egy rokon vírusának (de nem a TMV-QHN PMMoV-, IHUW TMV-8 IHUW
IHUW
]pVpYHO V]HPEHQ $ WUDQV]IRUPiOW Q|YpQ\HN D
]pVpUH XJ\DQFVDN NpWIpOH YiODV]W DGWDN D 3D009 pV D
]pVpYHO V]HP
ben pedig fogékonynak bizonyultak. Mindkét
rezisztenciatípus hasonlított a replikáz-által közvetített rezisztenciára. A replikáz-iOWDO N|]YHWtWHWWUH]LV]WHQFLDMHOOHP]
MHKRJ\ D UH]LV]WHQFLiUD QHP
hat az inokulum dózisa; a homológ vagy közeli rokon vírusokra korlátozódik; nincs összefüggés a rezisztencia szintje és a transzgén NLIHMH] GpVpQHN V]LQWMH N|]|WW $] (/,6$ (P]\PH /LQNHG ,PPXQR
Sorbent Assay) vizsgálatok szerint a komplett rezisztenciájú növényeknél végig nagyon alacsony volt a CP szintje. A késleltetett rezisztenciatípust PXWDWy Q|YpQ\HNQpO HO IHUW
V]|U PDJDV YROW D &3 V]LQWMH PDMG QDSSDO D
]pV XWiQ GUDV]WLNXVDQ OHFV|NNHQW D] ~M WQHWPHQWHV OHYHOHNEHQ $]
RNS szintje hasonlóan alakult. A késleltetett rezisztenciájú növényt 35 QDSSDO D IHUW
]pV XWiQ ~MUD IHUW
]WpN 300R9
-S-VHO ~M WQHW QHP IHMO
és a CP szintje sem emelkedett. Ugyanakkor TMV-U1-HO kialakultak az U1-UH MHOOHP]
IHUW
G|WW ]YH
WQHWHN DPL DUUD XWDOW KRJ\ D NLDODNXOW
rezisztencia rendkívül vírus-specifikus. A késleltetett rezisztencia nem függött össze a növények fejlettségével, korával. Ehhez hasonló késleltetett
52
rezisztenciát – más kutatócsoportok - D V]LOYDKLPO
YtUXVQiO
Plum pox
virus, PPV) és a TEV-nél is megfigyeltek. Tenllado et al. (1996) tovább kutatva a replikáz által közvetített rezisztenciát egy olyan klónt készítettek (P54-7), amely nem a teljes 54 kDa gént tartalmazta. Ez a módosított, „csonka” gén egy kb. 18 kDa-os fehérjét kódolt. A teljes génnel transzformált növények közt akadt olyan, amely kezdetben fogékony vROW GH NpV
EE UH]LV]WHQVVp YiOW D FVRQND
JpQQHO WUDQV]IRUPiOWDN N|]W D]RQEDQ LO\HQ QHP IRUGXOW HO
$ KDW FVRQND
génnel transzformált vonal közül 4 nem mutatott rezisztenciát a PMMoV-S IHUW
]pVpYHO V]HPEHQ GH WQHWHNHW pV YtUXV &3 W PXWDWWDN NL D IHOV
-
szisztemikus levelekben. Két vonalból néhány egyed teljes rezisztenciát PXWDWRWW QHP IHMO
GWHN WQHWHN pV D] (/,6$ YL]VJiODW LV NHYpV &3
-t
mutatott ki, vagy egyáltalán nem mutatott. Ezen vonalakból azonban a legtöbb növény fogékony volt, de csak 3-5 nap múlva jelentek meg a tünetek (néhány egyed pedig egészen a 21. napig nem mutatott tüneteket). A 61-es vonal esetén, akár komplett, akár késleltetett rezisztenciát mutattak a növények, a CP felhalmozódása csökkent volt az inokulált levelekben a kontrollhoz képest. Protoplaszttal végzett tanulmányok alapján feltételezték, hogy az 54 kDa-os fehérje lehet az aktív molekula a replikáció által közvetített rezisztenciában, azonban kimutatni nem tudták a TMV-vel és a PMMoV-Sel transzformált növényekben. Nem volt összefüggés a transzkriptumok PHQQ\LVpJH pV D UH]LV]WHQFLD N|]W VHP D WHOMHV VHP D FVRQND JpQW NLIHMH] Q|YpQ\HNQpO
0LQGNpW
HVHWEHQ
XJ\DQRO\DQ
PpUHW
WUDQV]NULSWXPRN
jelenlétét mutatták ki, azonban a csonka gént tartalmazókban kisebb mértékben. A csonka
JpQQHO WUDQV]IRUPiOW Q|YpQ\HN D IHUW
QDSLJ PXWDWWiN D NpVOHOWHWHWW UH]LV]WHQFLiW $ IHMO
]pV XWiQ
G|WW V]LV]WHPLNXV WQHWHN
(mozaik, fodrosodás) eltértek a kontrollnál (a teljes, 54 kDa gént tartalmazó
53 WUDQV]IRUPiOW
Q|YpQ\HNQpO
IHMO
G|WW
WQHWHNW
O
Q|YHNHGpVJiWOiV $ YtUXV NRQFHQWUiFLyMD QDSSDO D IHUW QDSQiO PpUW pUWpNHW PXWDWWD +D QDSSDO D IHUW
H]pUWH]QHPOHKHWHWWIHOHO
tnyulás,
]pV XWiQ LV D
]pV XWiQ D PHJYiOWR]RWW
IHQRWtSXV~ Q|YpQ\ V]|YHWQHGYpYHO GRKiQ\RNDW IHUW MHOOHP] WQHWHNHW NDSWDN $]
VD
]WHN D 300R9
-S-re
4 kDa mRNS szintje végig nem változott,
V$300R9 ,IHUW
-
]pVpUHLVKDVRQOyHUHGPpQ\W
kaptak a csonka génnel transzformált növényekben, a PaMMV és TMVU1-HO
IHUW
]pVpUH SHGLJ IRJpNRQ\DN YROWDN $ 709
-U1-el inokulált
növények sem D NpVOHOWHWHWW WQHWIHMO
GpVW VHP D PHJYiOWR]RWW WQHWWtSXVW
nem mutatták. Az eredmények szerint a komplett rezisztencia – ami mind a teljes, mind a csonka génnel transzformált növényekben megvalósul magasfokú vírus-VSHFLILNXVViJRW
PXWDW
9DOyV]tQ QHN
W
QLN
KRJ\
D
komplett rezisztencia mindkét esetben (teljes és csonka gén) kizárólag vagy I
NpQW D WUDQV]JpQ 516 SURGXNWXPDL iOWDO N|]YHWtWHWW $ FVRQND JpQQHO
transzformált növények azonban sosem regenerálódtak úgy, mint a teljes génnel transzformáltak, amelyek kezdeti fogékonyság után „gyógyultak ki”. E növények megváltozott tünetegyüttest mutattak, ami csökkent patogenitással járt együtt. Tenllado és Díaz-Ruíz (1999) a transzgén dózisa és a transzgénikus növények által kifejezett rezisztencia típusa (Tenllado et al. 1995) közti kapcsolatot is vizsgálták. Kísérletekkel támasztották alá, hogy a teljes rezisztencia összefügg a transzgén homozigóta állapotával, noha nem mindegyik homozigóta növény mutatott teljes rezisztenciát. A transzgén homozigóta állapRWD WHKiW V]NVpJHV YROW GH QHP HOHJHQG
D 300R9
elleni rezisztencia biztosításához. A heterozigóták mindig késleltetett és VRKDVHP WHOMHV UH]LV]WHQFLiW PXWDWWDN ÒJ\ W
QLN NpW GRPLQiQV DOOpO
jelenléte szükséges a teljes rezisztencia megszilárdulásához, egy allél a NpVOHOWHWHWW UH]LV]WHQFLiKR] HOHJHQG
(] D]W MHOHQWL KRJ\ D JpQ
-dózis
54
faktorként játszik szerepet ebben a típusú rezisztenciában, vagyis minél több a transzgén alléljeinek száma, annál magasabb a megvalósuló rezisztencia foka. Ez a tulajdonság – hogy a gén-dózis faktorként játszik szerepet – nagyon emlékeztet a „géncsendesítés” (gene silencing, GS) által biztosított vírusrezisztenciára (Goodwin et al. 1996). 6]iPRV RO\DQ HVHW LVPHUW D] LURGDORPEDQ DPLNRU D JpQNLIHMH] GpV
blokkolt a transzgénikus növényekben (Jorgensen 1992, Flavell 1994, Baulcombe és English 1996, Wassenegger és Pélissier 1998). Néhány esetben a transzgén elnyomja azokat a transzgén-, és homológ gén szekvenciákat is, melyek már korábban jelen voltak a növényben. Ezt a jelenséget együttes elnyomásnak (co-supression) nevezik (Hart et al. 1992, Dorlhac de Borne et al. 1994, De Carvalho et al. (O
IRUGXO RO\DQ
HVHW LV DPLNRU *6 MHOHQLN PHJ D] HJ\HWOHQ WUDQV]JpQ OyNXVV]DO UHQGHONH]
növényben (Hobbs et al. 1993). A GS megvalósulhat transzkripciós szinten D JpQ NLIHMH] GpVpQHN EORNNROiVD UpYpQ
Matzke et al. 1994, Neuhuber et
al. 1994). Más vélemények szerint azonban az elnyomott gén átíródik, és a GS poszttranszkripcionálisan valósul meg az állandó mRNS szint csökkenés során (De Carvalho et al. 1992, Dehio és Schell 1994). Újabban egyes kutatók olyan RNS alapú mechanizmust feltételeztek, ami a transzkripcionális és poszttranszkripcionális GS-pUW LV IHOHO
V OHKHW
(Wassenegger és Pélissier 1998). A GS sokkal gyakrabban jelentkezik, ha a Q|YpQ\EHQ D WUDQV]JpQ W|EE SpOGiQ\D LV HO
IRUGXO YDJ\ D Q|YpQ\ D
transzgénre nézve homozigótává válik (De Carvalho et al. 1992, Hart et al. 1992, Dehio és Schell
1pKiQ\ HVHWEHQ D *6 |U|N|OKHW
QHN
bizonyult (Meyer et al. 1993, Guo et al. 1998), máskor a meiózisnál visszafordítható volt (De Carvalho et al. 1992, Dehio és Schell 1994, Dorlhac de Borne et al.
(J\HV V]HU]
N V]HULQW YtUXV 516
55 V]iOVSHFLILNXV WtSXV~ *6 IHOHO
V D 709
-U1 elleni, 54 K régió által
közvetített rezisztenciáért (Carr és Zaitlin 1991, Golemboski et al. 1993). Tenllado és Díaz-Ruíz (1999) kimutatták, hogy a PMMoV 54 kDa transzgén „csendesített” volt a 12-es vonal F2 homozigóta növényeiben, mind a komplett, mind a késleltetett rezisztencia esetén. Amíg a kezdeti fogékonyságot mutató transzgénikus növényekben a 54 kDa transzkriptum magas szinten halmozódott fel, addig a homozigóta, teljes rezisztenciájú növények nem detektálható szinten tartalmazták az 54 kDa mRNS-t, habár a transzgén pontosan átíródott. A transzgén transzkriptumának elnyomása SRV]WWUDQV]NULSFLRQiOLV
mindkét
IRO\DPDWRN
rezisztenciatípus
és
a
HUHGPpQ\H
transzgén
)HOWpWHOH]KHW
KRJ\
poszttranszkripcionális
csendesítése ugyanazon mechanizmus következménye, miként azt más V]HU] NLVHPOtWHWWpN
Baulcombe 1996, Goodwin et al. 1996, Wassenegger
és Pélissier 1998). Több elmélet látott napvilágot a poszttranszkripcionális GS PDJ\DUi]DWiUD HJ\HV V]HU] N V]HULQW D] DQWLV]HQV] 516 HOQ\RPKDWMD D FpO
gén felhalmozódását (Grierson et al. 1991, Marano és Baulcombe 1998); mások szerint kölcsönhatás és párosodás léphet fel a transzgén homológ kópiái között (Jorgensen 1992, Baulcombe és English 1996). Megint más NXWDWyN D ÄNLIHMH] GpVL NV]|EpUWpN´ PRGHOOHO PDJ\DUi]]iN D MHOHQVpJHW
(Dehio és Schell 1994). Ez a modell azon az elven alapszik, hogy a géndózis növelése a transzgénikus sejtekben a transzkripció arányát (így a transzkriptum mennyiségét) növeli egészen addig a küszöbértékig, ami a vírusrezisztencia kiváltásához szükséges. A PMMoV-S 54 kDa génjével transzformált, komplett rezisztenciájú Q|YpQ\HNEHQ D *6 PiU D IHUW
]pV HO
WW NLDODNXOW D Q|YpQ\HN LPPXQLVDN
YROWDN $ NpVOHOWHWHWW UH]LV]WHQFLiM~ Q|YpQ\HNEHQ D *6 FVDN D IHUW
]pV
56 VWDELOL]iOyGiVD XWiQ DNWLYiOyGRWW $ Q|YpQ\HN IHMO
GpVpYHO D WUDQV]JpQ
„csendesítése” is fokozódott (Dehio és Schell 1994). 9pGHNH]pVQ|YpQ\LHUHGHW
UH]LV]WHQFLDJpQHNEHpStWpVpYHO
A Nicotiana glutinosa-ból származó N gén a TMV-vel szemben biztosít rezisztenciát (Dinesh-Kumar et al. 1995). Ezt a gént bejuttatták Nicotiana tabacum cv. Xanthi dohányokba és paradicsom növényekbe is (Whitham et al. $] tJ\ HO W|EEVpJpQHN IHUW QHPIHMO
iOOtWRWW Q|YpQ\HNHQ D WREDPRYtUXVRN
]pVpUH ORNiOLV Op]LyN MHOHQWHN PHJ V]LV]WHPLNXV WQHWHN
GWHN
Egyéb rezisztenciagének
Egyéb rezisztenciagének növénybe juttatásával is több alkalommal VLNHUOW EL]RQ\RV PpUWpN
ribozimokat
kódoló
YpGHWWVpJHW HOpUQL ËJ\ SO NtVpUOHWHNHW IRO\WDWWDN
gének,
antitesteket
kódoló gének,
antiszensz
vírusszekvenciák, „öngyilkos gének”, riboszóma–inaktiváló fehérjék, YDODPLQW PDJDVDEE UHQG
növénykórokozó
állatok génjeinek transzformálásával. A nem
mikroorganizmusok génjeivel indukált rezisztencia
esetében a tobamovírusok elleni védekezésben is születtek eredmények. A Schizosaccharomyces pombae gombafajból klónozták a pac1 gént, mely a NHWW
sszálú RNS molekulát bontani képes RNázt kódolja. Ezt a gént
GRKiQ\Q|YpQ\HNEH MXWWDWYD D]RN UH]LV]WHQVVp YiOWDN D 7R09 IHUW
]pVpYHO
szemben (Iino et al. 1991, Watanabe et al. 1995). A jelenség elméleti KiWWHUH IHOWHKHW NHWW
VV]iO~
YDOyV]tQ
HQ D] KRJ\ D] HJ\V]iO~ 516 YtUXVRN U
UHSOLNiFLyV
LQWHUPHGLHUHN
OHJH]HNHWERQWMD
LV
eplikációja során
NHOHWNH]QHN
pV
D]
51i]
57
2.3.7.3. Agrotechnikai eljárások a tobamovírusok elleni védekezésben $ YpGHNH]pV OHKHW D
PHJHO
VpJHL J\DNRUODWL V]HPSRQWEyO FVDNQHP NL]iUyODJ
]
ésre (prevenció) korlátozódnak. A vírusbetegségek elleni
preventív védekezés célja a vírus és a gazdanövény találkozásának megakadályozása (infekciós profilaxis) és a gazdanövény vírusokkal szembeni fogékonyságának csökkentése (diszpozíciós profilaxis). Az
infekciós
profilaxis,
amely
a
vírus
WDOiONR]iViQDN PHJDNDGiO\R]iViUD WHUMHG NL V]iPRV I
és
gazdanövény
NpQW DJURWHFKQLNDL
HOMiUiVEyOiOO,GHWDUWR]LNDQ|YpQ\YpGHOPLKLJLpQpDYtUXVPHQWHVYHW
PDJ
biztosítása, a gyommentesen tartott állomány, a vetési és betakarítási LG
SR
nt optimális megválasztása, az izolálás, a szelekció, a termelési
IHJ\HOHP VWE $ YtUXVPHQWHV YHW IRNR]RWW MHOHQW
VpJ
%iU D EHOV
HUHGPpQ\WHOHQ D NOV
PDJ EL]WRVtWiVD D WREDPRYtUXVRNQiO
PDJiWYLWHOOHO WHUMHG
YtUXVRN HVHWpEHQ
PDJiWYLWHO HOOHQ KDWiVRV O
ehet a magok NaOH-os
vagy Na3PO4-as kezelése. A diszpozíciós profilaxishoz soroljuk a gazdanövény harmonikus víz- és tápanyagellátottságát, az optimális környezeti feltételek biztosítását, PLQGD]RNDW D WpQ\H] NHW DPLN HO
VHJtWLN KRJ\ D Q|YpQ\ D OHJMREE
fiziológiai állapotba kerülve ellenállóbb legyen a vírusokkal szemben.
2.3.7.4. A tobamovírusok elleni rezisztencianemesítés hazai eredményei
A vírusok elleni védekezésben különösen fontos, hogy kihasználjunk PLQGHQ RO\DQ OHKHW
VpJHW DPL D Q|YpQ\ JHQHWL
kai adottságából adódik. A
fogékony fajták termesztése kockázatos, a termésveszteségek gyakran arányosak
a
fogékonysággal.
A
rezisztens
fajták
termesztése
a
58
leggazdaságosabb, ahogy a növénynemesítés is a leggazdaságosabb és a környezet megóvása szempontjábyO D OHJPHJIHOHO
EE YpGHNH]pVL PyGV]HU
A vírus-ellenállóságra nemesítés hagyományos módszereinek alapját a keresztezés és a kiválogatás (szelekció) jelenti. A TMV és a PMMoV elleni rezisztencia egygénes, dominánsan |U|NO
GLN $] /
1
gén a Capsicum annuum-ból, az L2 gén a Capsicum
frutescens-E
O D] /
chacoense-E
O V]iUPD]LN $
(Csilléry
3
gén a Capsicum chinense-E
4
Capsicum IDMRN NHUHV]WH]KHW
$] |U|NOpVL DQ\DJ E
növénynemesítés
O D] /
számára
elvben
az
gén a Capsicum VpJH NRUOiWR]RWW
YtWpVpUH W|UHNY
egész
Capsicum
PRGHUQ
nemzetség
génkészlete felhasználható. A Capsicum annuum nagy változatossága HOOHQpUH D]RQEDQ DQ\DL V]O
Capsicum chacoense-YHO
NpQW FVDN HJ\HWOHQ YDGRQ pO
NHUHV]WH]KHW
IDMMDO D
N|QQ\HQ D UpV]EHQ WHUPHV]WHWW
Capsicum chinense-vel valamivel nehezebben, a Capsicum frutescens-sel és Capsicum baccatum-mal pedig csak nagyon nehezen. Reciprok irányban, tehát Capsicum annuum beporzóval a hibridek, bár viszonylag N|QQ\HQ OpWUHKR]KDWyDN D] HOV
a
YLVV]DNHUHV]WH]pVHNEHQ
PpUWpN
PHGG
ILJ\HOKHW
QHP]HGpNEHQ FV|NNHQW WHUPpNHQ\VpJ
SHGLJ
FLWRSOD]PiV
VpJ YDJ\ FVDN KtPPHGG
HUHGHW
NLVHEE
N PHJ D OHYpO]HWHQ D YLUiJRQ D WHUPpVHQ (]HN D WQHWHN D
YDJ\ |VV]HIpUKHWHWOHQVpJpU
-nagyobb
VpJ pV NO|QE|] WRU]XOiVRN
sejtmag és a fajidegen citoplazma öröklési anyagának eltéU HV
HN
Capsicum
V]HUNH]HWpU
O
O WDQ~VNRGQDN 8J\DQDNNRU SO D OHJWiYRODEE
cardenasii
bizonyítottan
nagyfokú
vírus-
(PVY)
rezisztenciája is áthozható a termesztett Capsicum annuum fajtáiba (Csilléry 1978). Az 1960-as évek végén a TMV-re még minden vizsgált étkezési fajta fogékony volt (Horváth 1969, Gáborjányi et al. 1997). Az 1970-HVpYHNW NH]G
G
HQ LQGXOW PHJ D I
V]HUSDSULNiN UH]LV]WHQFLiUD QHPHVtWpVH
O
Szirmai
59
1970) és az étkezési paprikákba az L1 rezisztenciagén beépítése (Zatykó et al. $709UH]LV]WHQVIDMWiNHOV
NpSYLVHO
L PHO\HNWDUWDOPD]WiND]
L1 gént) a D. Cecei, a Fehérözön, a Rezisztens Keszthelyi voltak. 1985-ben az államilag elismert magyar fajták 10%-a, 1995-ben 31%-a rendelkezett valamilyen fokú vírusrezisztenciával (Gáborjányi et al. E $] HOV
3
fajtát, mely az L gént tartalmazta, 1995-ben jelentették (Zatykó és Moór $] HOV iOOtWRWWD HO
KLEULGHW PHO\ D] /
4
gént tartalmazta, (H19-6F1) Csilléry
-ban a Capsicum chacoense, mint rezisztenciaforrás
felhasználásával. 1997-ben regisztrálták a Hímes F1 (L4-es) paprika fajtát (Sági és Salamon 1998).
60
3. ANYAG ÉS MÓDSZER 3.1. Tesztnövény vizsgálatok 3.1.1.
Vizsgálati anyag .tVpUOHWHNHW YpJH]WQN D EHJ\
MW|WW L]ROiWXPRN WHV]WQ|YpQ\HNHQ
okozott tüneteire vonatkR]yODJ$NtVpUOHWHNKH]NO|QE|] +
UH]LV]WHQFLDIRN~
4
(L -L ) paprikafajtákat (Rast 1979, 1988, Boukema et al. 1980, Tóbiás et al. 1982, Tóbiás és Maat 1982, Boukema YDODPLQWKiURPNO|QE|] GRKiQ\IDMWKDV]QiOWXQNDPHO\HNDN|YHWNH]
NYROWDN
Capsicum annuum: L+ (Albaregia, Synt. Cecei) L1 (D. Cecei, Fehérözön, Keszthelyi rezisztens) L2 (V-33/2) L3 (Bölény, Rapires, Hattyú) L4 (Hímes) Nicotiana rustica Nicotiana tabacum cv. Samsun Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc Az L+ és L4 rezisztenciafokú paprikákat csak néhány izolátum HVHWpEHQ HOOHQ
U]pVNpQW IHUW
]WN H]HN D SDSULNDIDMWiN XJ\DQLV D 300R9
izolátumok patotípusának meghatározásában szerepet nem játszanak. A paprikamagokat Dr. Zatykó Lajos (Zöldségtermesztési Kutató Intézet Rt., Budapest) és Dr. Kovács János (Veszprémi Egyetem Georgikon 0H] JD]GDViJWXGRPiQ\L .DU .HUWpV]HWL 7DQV]pN .HV]WKHO\ ERFViWRWWD
rendelkezésünkre.
61 $ YL]VJiODWRNDW D 0DJ\DURUV]iJ NO|QE|] WHUOHWHLU
2001
között,
fólia
SDSULNDPLQWiNNDO
alatti
YpJH]WN
és
szabadföldi
gVV]HVHQ
terPHV]WpVE PLQWiW
J\
O pV O
J\
MW|WW
MW|WWQN
izolátumokat Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc Q|YpQ\HNUH IHUW
$]
]WN pV D
továbbiakban csak azokat vizsgáltuk, melyek e tesztnövényen lokális léziót DGWDN
H]HNU
O
IHOWpWHOH]W
L]ROiWXPRN QHYpW D J\
tartalmazza.
Az
ük,
hogy
tobamovírust
tartalmaztak.
Az
MWpV N|UOPpQ\HLW pV D WQHWHNHW D WiEOi]DW
izolátumokat
Nicotiana
benthamiana
növényeken
szaporítottuk fel. 4. WiEOi]DW$] pVN|]WJ\ MW|WWpVDNicotiana tabacum cv. Xanthi-nc növényen lokális léziót adó izolátumok
Az izolátum neve
TCU V WHX Y+Z helye
TCU V WHX Y+Z
Tünet a
ideje
Tünet a
termésen
Fajta
levélen
KD-1
Jászfsztgyörgy
1999. okt.
N
Mo
Óriás F1
KD-2
Jászfsztgyörgy
1999. okt.
N
Mo
Titán
KD-4
Jászfsztgyörgy
1999. okt.
-
Mo
Titán
KD-7
Jászfényszaru
1999. okt.
N
Mo
Óriás F1
KD-8
Jászfényszaru
1999. okt.
-
Mo
Óriás F1
KD-9
Boldog
1999. okt.
N
Mo
Óriás F1
KD-10
Boldog
1999. okt.
N
Mo
HRF
KD-11
Pmonostor
1999. okt.
N
-
HRF
KD-12
Pmonostor
1999. okt.
N
-
Óriás F1
KD-13
Pmonostor
1999. okt.
-
N, Mo
Kárpátia
KD-14
Pmonostor
1999. okt.
N
D, Vc
Óriás F1
KD-15
Jászfényszaru
1999. okt.
N
D, Mo, Vn
Óriás F1
KD-16
Pmonostor
1999. okt.
-
Mo, Mot
KD-18
Pmonostor
1999. okt.
N
-
KD-47
Kiskunhalas
2000. szept.
-
Mo
2000. okt.
N
Mo, Vn
HRF
2000. okt.
N
Tn
HRF
2000. okt.
-
Mo, N
HRF
KD-61 KD-62 KD-63
[\] ^ _ ` a bc d] e [\] ^ _ ` a bc d] e [\] ^ _ ` a bc d] e
HRF Keceli *
62
KD-69
[\] ^ [\] ^ [\] ^ [\] ^ [\] ^
KD-71
Jászfsztgyörgy
2000. okt.
N
Mo
Óriás F1
KD-72
Jászfsztgyörgy
2000. okt.
N
Mo
Keceli
KD-73
Jászfsztgyörgy
2000. okt.
-
Mo, Ch, N, Vn
Keceli
KD-74
Jászfsztgyörgy
2000. okt.
N
-
Keceli
KD-75
Jászfsztgyörgy
2000. okt.
N
sMo
Keceli
KD-76
Jászfsztgyörgy
2000. okt.
N
-
KD-77
Jászfsztgyörgy
2000. okt.
-
Mo
KD-78
Jászfsztgyörgy
2000. okt.
N
Mo
KD-79
Jászberény
2000. okt.
-
Mo, N
Kárpátia
KD-80
Jászberény
2000. okt.
N
Mo
Kárpátia
KD-81
Jászberény
2000. okt.
N
-
Kárpátia
KD-82
Jászberény
2000. okt.
N, D
N, Mo
Kárpátia
KD-83
Jászfényszaru
2000. okt.
N
Mo
KD-84
Jászfényszaru
2000. okt.
-
Mo
KD-102
Szegvár
2000. okt.
-
Mo, Mot
KD-134
Jászfényszaru
2001. szept.
-
Ch, Fb
Danubia
KD-135
Jászfényszaru
2001. szept.
D
Mo
Danubia
KD-137
Jászfsztgyörgy
2001. szept.
N, D
Mo
Óriás F1
KD-139
Jászfsztgyörgy
2001. szept.
N, D
Mo, N
KD-140
Jászfsztgyörgy
2001. szept.
N
sMo
f"g+bg^ ` b+hiaj
KD-141
Jászfsztgyörgy
2001. szept.
N, D
sMo
Óriás F1
KD-143
Jászfsztgyörgy
2001. szept.
N
Ch
Bajnok
KD-64 KD-66 KD-67 KD-68
_` a bc d] e _` a bc d] e _` a bc d] e _` a bc d] e _` a bc d] e
2000. okt.
N
Mo, N
HRF
2000. okt.
-
Mo, R
Titán
2000. okt.
N
Mo
Titán
2000. okt.
D, N
Mo
Titán
2000. okt.
N
Mo
HRF
f"g+bg^ ` b+hiaj f"g+bg^ ` b+hiaj Keceli
f"g+bg^ ` b+hiaj Keceli b+hiaj *
Keceli
N = necrosis (nekrózis), Mo = mosaic (mozaikfoltosság), Mot = mottling (tarkulás), D = deformation (deformáció), Vc = vein clearing (érkivilágosodás), Vn = vein necrosis (érnekrózis), R = ringspot
k jl _ hHm n^ ] nh0h0dj opqsrutObr^ n _ nh0` h k c^ n _ v \` hophRtOhH^ ` j r] k j lgajgopwxaNtD] nyNag+b_ nh0` h k b+hz b+h agc_ v \` hop { |Nt flower (virágbarnulás), - = nincs tünet, * = nem ismert } d+h\+m h\]browning jl~jlOt } d+h\m g+^ h hH\+ga] jl~ _jlp;5n anh] n _At5 h\] e8n anh] n _p>[\] ^ _` a bcd] e8tC[\+ga] ^ _` a bcd] ep okt. = október, szept. = szeptember
3.1.2. Vizsgálati módszer
63
A steril földbe vetett magokból kelt növényeket – átlagos üvegházi körülmények között - cserepekbe ültettük. A dohányokat 4-6 leveles iOODSRWEDQ D SDSULNiNDW HJ\ NLIHMOHWW OHYpOSiUDV iOODSRWEDQ IHUW
izolátumonként 5-5 növényt. A Nicotiana benthamiana
]WN
Q|YpQ\HNU
O
származó mintákat 0,1 M Sörensen-féle foszfát pufferben (pH 7,0), dörzsmozsárban homogenáltuk (5-szörös hígításban), majd mechanikai PyGV]HUUHO LQRNXOiOWXN D OHYHOHNHW SDSULNiQiO D V]LNOHYHOHNHW pV D] HOV
kifejlett levélpárt, dohánynál az alsó 3-4 levelet). Az inokuláció során karborundum port (500 mesh) használtunk. A növényeket üvegházban (1825 °C; 160 mEm-2s-1 pótmegvilágítás naponta 8 órán keresztül; relatív SiUDWDUWDORP WDUWRWWXN $ IHMO
G|WW ORNiOLV pV V]LV]WHPLNXV WQHWHNHW
(kb. 4-5 nap illetve 3 hét elteltével) minden esetben feljegyeztük és értékeltük. A PMMoV a Nicotiana tabacum cv. Samsun növényeket OiWHQVHQ IHUW
]L H]pUW D IHOV
QHP LQRNXOiOW WQHWPHQWHV OHYHOHNE
szövetnedvvel Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc Q|YpQ\HNHW IHUW PDMGDIHMO
O Q\HUW ]WQN
G|WWWQHWHNHWpUWpNHOWN
3.2. Szerológiai és elektronmikroszkópos vizsgálatok $ EHJ\
MW|WW PLQWiN N|]O D]RNDW YL]VJiOWXN V]HUROyJLDL PyGV]HUUHO
amelyek a tesztnövény vizsgálatok során a Nicotiana tabacum cv. Xanthinc növényeken lokális léziót adtak. $ PHFKDQLNDL LQRNXOiFLyW N|YHW Q|YpQ\HNE
KpWHQ D
Nicotiana benthamiana
O Q\HUW V]|YHWQHGYHW PLQWDSXIIHUUHO
-szeresére hígítottuk
majd DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) módszerrel teszteltük (Clark és Adams 1977). A mintákat 3 tobamovírus poliklonális antiszérumával (Loewe Biochemica)HOOHQ DPHO\HNDN|YHWNH]
NYROWDN 7097R09300R9
UL]WN
64
A vizsgálatok során a Loewe Biochemica leírását követtük. A fotometrálást 405 nm-en, Labsystems Multiskan MS ELISA readerrel végeztük. Negatívnak azokat a mintákat tekintettük, amelyek extinkciós értékei nem haladták meg a negatív kontrollnál mért extinkciós érték kétszeresét. Az elektronmikroszkópos vizsgálat során negatív festéses módszerrel figyeltük meg a virionokat (Hitchborn és Hills (J\ EHJ\
MW|WW
–a
patológiai és szerológiai vizsgálatok során PMMoV-nak bizonyult izolátummal (KD- tüneteket
mutató
IHUW
]|WW
levelet
Nicotiana rustica
vizsgáltunk.
Egy
Q|YpQ\U
O V]iUPD]y
hártyázott,
szenezett
mintahordozó fémrácsra (gridre) desztillált vizet, majd uranil-acetát oldatot (2%-os) cseppentettünk. A frissen elvágott levelet – az un. Brandes-féle levélbemártásos módszert alkalmazva (Brandes 1964) - keresztülhúztuk egy tárgylemezre cseppentett vízcseppen, és az így nyert nedvbe érintettük a gridet, hogy a sejtnedv rátapadjon. A módszer során a virionokat tartalmazó nedvet nagy molekuODW|PHJ DPLN
HU
VHQ
HOHNWURQV]yUy
YROWXN
QHKp]IpPVyNNDO PHJIHVWHWWN
PLDWW
D
KiWWpUKiUW\iKR]
PLN|]EHQDYLULRQRNYLOiJRVDQNLUDM]ROyGWDNDV|WpWKiWWpUE
N|W
GWHN
O
3.3. Molekuláris virológiai vizsgálatok
A molekuláris virológiai vizsgálatok során olyan hazai izolátumokat választottunk, amelyek korábban a tesztnövény kísérletek és a DAS-ELISA vizsgálat során tobamovírusnak bizonyultak. Célunk volt, hogy a 0DJ\DURUV]iJRQ
HOWpU
LG
EHQ
pV
KHO\HQ
EHJ\
MW|WW
L]ROiWXPRNDW
molekuláris módszerekkel is azonosítsuk, illetve egy magyar izolátum köpenyfehérjerészletének nukleotid sorrendjét meghatározzuk, valamint a
65
más
országokban
leírt
PMMoV
izolátumok
szekvenciájával
összehasonlítsuk.
3.3.1. Össz-nukleinsav kivonás és tisztítás $NLYRQiVWMpJHQK L]ROiWXPPDO IHUW
származó
]|WW
W|WWN|UOPp
nyek között végeztük. Két – az adott
- Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc
levélkorongot
dörzsmozsárban,
teljes
Q|YpQ\U
nukleinsav
O
kivonó
pufferben feltártunk (White és Kaper 1989). Az extraktumot több OpSFV
EHQ IHQRO PDMG NOR
roform (1 térfogatnyi fenol + 1 térfogatnyi
kloroform) hozzáadásával tisztítottuk meg a gazdanövény sejtalkotóitól és IHKpUMpLW
O$]|VV]
PRViVW N|YHW
-nukleinsavat abszolút alkohollal vontuk ki. Az etanolos
HQ D QXNOHLQVDYDW YiNXXPV]iUtWyEDQ V]iUtWRWWXN
majd steril
desztillált vízben visszaoldottuk (White és Kaper 1989).
3.3.2. DNS másolat készítése reverz transzkripcióval
A tisztított és visszaoldott vírus RNS-hez 3’ indítószekvenciát (primert) adtunk, majd 65°C-on denaturáltuk. Ezután az oldathoz adtuk a reverz transzkriptáz enzimet (50 unit/reakció), annak pufferjét és a nukleotidokat, majd a reakcióelegyet 1 órára 42°C-ra tettük. Ily módon a vírus RNS-sel komplementer DNS másolatot (copy DNS, cDNS) hoztunk létre (Sambrook et al. 1989).
3.3.3. Polimeráz láncreakció (PCR)
A molekuláris biológiai vizsgálatokhoz olyan univerzális primerpárt WHUYH]WQN DPL D OHJW|EE SDSULNiW IHUW
] WREDPRYtUXVW IHOLVPHUL $
66
tobamovírusok szekvenciáját az EMBL/Genbank adatbázisából vettük (internetcím:
www.genome.ad.jp
$
0DJ\DURUV]iJRQ
HO
IRUGXOy
legfontosabb tobamovírusokat kiválogattuk az adatbankban található szekvenciák nagy száma miatt. Ezekben a szekvenciákban egy olyan UpV]OHWHW NHUHVWQN DPL KR]]iYHW
OHJ PHJHJ\H]LN OHJDOiEE D OHJIRQWRVDEE
tobamovírusok esetében, ide terveztük az univerzális primerpárt. Az 5’ végi XQLYHU]iOLV SULPHU D &3 JpQ HO
WW WDOiOKDWy GHJHQHUiOW YtUXVV]HQV] $ ¶
végi primer szintén degenerált, reverz komplementer, és a vírus 3’ nemkódoló régiójának végén található. A Magyarországon
HO
IRUGXOy
OHJIRQWRVDEE
WREDPRYtUXVRNUD
(TMV-U1, PMMoV, ObPV) specifikus primereket terveztünk. A primereket olyan szakaszra illesztettük, ahol az adott tobamovírus V]HNYHQFLiMD MHOHQW
VHQ HOWpU D W|EEL WREDPRYtUXVpWyO $] XQLYHU]iOLV ¶
végi primert használtuk a specifikus primerpárok 3’ végeként is. A ObPV SULPHU D &3 JpQ HO
WW PtJ D 709
-U1 és PMMoV specifikus primerek a
CP génen belül helyezkednek el. A specifikus primerek tervezésekor ügyeltünk arra, hogy a primerek által kiemelt szakaszok hossza jelenW különbözzön
VHQ
egymástól, így azok multiplex PCR vizsgálatokhoz
felhasználhatóak legyenek, vagyis a tobamovírusok azonosíthatóak legyenek a kapott PCR termék mérete alapján (2. ábra).
Univerzális primerpár: PMMoV esetében:
699 bp
TMV-U1 esetében:
709 bp
ObPV esetében:
782 bp
Specifikus primerek: PMMoV esetében:
613 bp
67
TMV-U1 esetében: 555 bp ObPV esetében:
899 bp
2. ábra. A primerek által felismert szakaszok hossza
A
nukleotidok
sorrendjének
HQ]LPDQDOt]LVQpO pV D NHYHUW IHUW
megállapításakor,
a
restrikciós
]pVHV NtVpUOHWQpO D 300R9 VSHFLILNXV
CP1 (vírusszensz) és CP2 (reverz komplementer) primereket használtuk (Tenllado et al. 1994). Az univerzális tobamovírus és vírus-specifikus primereket a 3. ábra mutatja. univerzális tobamovírus 5’ primer: 5’ - G(AT)CGC(GC)GA(GT)TC(GT)GATTCGT(AT)TTAAATATG – 3’
univerzális tobamovírus 3’ primer: 5’ – TGGGCC(GC)CTACC(GC)G(GC)GG – 3’
TMV-U1 primer: 5’ – GTCGTTCAAAGACAATTCAGTGAG – 3’
ObPV primer: 5’ – GGAGTTTCCAAACCTGTCGG – 3’
PMMoV primer: 5’ – CCATTAGAGTTACAAAAT(CT)TGTGTACTTC – 3’
CP1 primer: 5’ – CTGTGTACTTCGCGTTAGG – 3’
68
CP2 primer: 5’ – AATTCCTCAACATCGGGTCC – 3’
(a zárójelben tett bázisoknál a primer degenerált)
3. ábra. A PCR reakció során használt univerzális tobamovírus és vírus-specifikus primerek (Tenllado et al. 1994 és Kálmán et al. 2001 alapján) A PCR vizsgálat során a Fermentas cég termékeit használtuk. A reakció Perkin Elmer készülékben történt. A PCR reakcióelegy tartalmazta a cDNS-t, a felszaporítani kívánt szakasz kiemeléséhez szükséges 5’ és 3’ foszforilált indítószekvenciákat (primereket, 20 pM), a nukleotidkeveréket (10 mM), a MgCl2-ot (25 mM), puffert (10 ×
D PHJIHOHO
3&5 SXIIHU pV D K
XQLWUHDNFLy $ 3&5 FLNOXV HOV
VWDELO
N|UOPpQ\HNHW EL]WRVtWy
Taq polimeráz enzimet (2,5
OpSpVHNpQWD '16
-t denaturáltuk 94°C-on
15 másodpercig, ezt követte a primerek kapcsolódása a templáthoz (anellálás) 50°C-on (a CP1-CP2 primerek esetében 61°C-on) 30 másodpercig, majd a lánchosszabbítás 72°C-on 2 percig. A ciklust 40-szer ismételtük.
3.3.4. Gélelektroforézis
A kapott PCR termékeket agaróz gélben (1,2 %), gélelektroforézissel HOOHQ
UL]WN P$ iUDPHU
sségnél). Az elektroforézishez használt gél
fluoreszcens festéket, etídium-EURPLGRW V]NVpJHVViYRNDWDJpOE
WDUWDOPD]RWW
JPO
$
OV]LNpYHONLYiJWXNNLYRQyNLWVHJtWVpJpYHO %,2
-
69
RAD Prep-A-GeneTM DNA Purification Kit) tisztítottuk és desztillált vízben visszaoldottuk. 5HNRPELQiQVSOD]PLGRNHO
iOOtWiVD
Az így kapott DNS szakaszt (inzertet) pGEM-T plazmidvektorba (Promega) építettük T4 DNS ligáz enzim segítségével (Sambrook et al. 1989).
3.3.6. A rekombináns plazmidok bejuttatása baktérium sejtekbe
A
UHNRPELQiQV
SOD]PLGRW
K
VRNNDO
Escherichia coli DH5α
plazmidmentes kompetens baktériumsejtekbe juttattuk. A módszer lépéseit Sambrook et al. (1989) szerint végeztük. A rekombináns plazmid és a EDNWpULXPVHMWHNNHYHUpNpWHO
V]|UMpJUHPDMG
°C-RVYt]I
UG
EHpVLVPpW
jégre helyeztük. A baktérium szuszpenziót – ampicillin antibiotikumot tartalmazó - LB táptalajon egyenletesen eloszlattuk, és egy éjszakán át 37°C-on növesztettük. A táptalajon csak azok a baktériumok voltak képesek osztódni, amelyek hordozták az ampicillin rezisztenciagént. A OHPH]HQ
Q|Y
EDNWpULXP
pUWpNHOWN $ NpN V]tQ
NROyQLiNDW
~Q
³EOXH
-white” szelekcióval
EDNWpULXP NROyQLiN WDUWDOPD]WiN D SOD]PLGRW GH
ebben az esetben az inzert nem épült be. A fehér kolóniáknál egy, a plazmLGEDQ
OpY
HQ]LP
-JDODNWR]LGi]
P
N|GpVppUW
IHOHO
V
JpQ
NLIHMH] GpVH D] LQ]HUW EHpSOpVH PLDWW JiWROW YROW tJ\ D NpN V]tQ QHP
alakulhatott ki. Ezért a további munkához a fehér baktérium telepeket használtuk fel (Sambrook et al. 1989).
3.3.7. A rekombináns plazmidok felszaporítása
70
A kiválasztott fehér telepeket folyékony (ampicillint tartalmazó) LB táptalajba oltottuk (Sambrook et al. 1989). A baktériumokat egy éjszakán át 37°C-on, folyamatos rázatás mellett növesztettük. A baktériumok mellett a beépült
SOD]PLGRN LV IHOV]DSRURGWDN NOyQR]iV ,O\ PyGRQ HOHJHQG
PHQQ\LVpJ
'16
-t kaptunk a szekvencia analízishez.
3.3.8. A plazmidok tisztítása
A
baktériumkultúrát
centrifugáltuk,
így
különítve
el
a
baktériumsejteket a táptalajtól. A baktériumsejteket elpusztítottuk, a nemkívánatos sejttörmeléket és sejtalkotókat pedig eltávolítottuk. Végül a tisztított plazmidot abszolút alkohollal kivontuk, és szárítás után RNAse TE-ben HOOHQ
visszaoldottuk.
U]pVNpSSHQ
A
tisztított
rekombináns
plazmidot
EcoRI restrikciós endonukleázokkal emésztettük és
gélelektroforézissel vizsgáltuk.
3.3.9. A nukleotid sorrend meghatározása
A felszaporított és tisztított DNS szakasz nukleotid sorrendjét a madridi Centro de Investigaciones Biológicas-ban (Biológiai Kutatások Központja) található szekvenáló berendezéssel határozták meg. A kapott adatokat a „Wisconsin Genetics Computer (GCG) Package Version 9.1” számítógépes programcsomag segítségével értékeltük.
3.4. A paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV) izolátumok összehasonlító vizsgálata
71
3.4.1. Szekvencia analízis
A
Japánban,
Koreában,
Olaszországban,
Spanyolországban,
Brazíliában és Taiwanban leírt PMMoV izolátumok szekvenciáját az EMBL/Genbank adatbázisból vettük át (5. táblázat). A magyar és a külföldi izolátumok szekvenciáját a "Wisconsin Genetics Computer (GCG) Package Version 9.1" számítógépes programcsomag, valamint a BLASTN 2.2.4. program (Altschul et al. 1997) segítségével hasonlítottuk össze. Ezenfelül meghatároztuk
a
magyar
PMMoV
izolátumok
elhelyezkedését
a
tobamovírusok filogenetikai törzsfájában. A filogenetikai törzsfát a Treecon programmal készítettük. 5. táblázat. A szekvencia adatbankban található külföldi PMMoV izolátumok Az izolátum neve
Az izolátum száma
Az izolátum szekvenált része
a szekvencia adatbankban
Koreai izolátum, „P0”
AF103776
CP gén
Koreai izolátum, „P1”
AF103777
CP gén
Koreai izolátum, „P2”
AF103778
CP gén
Koreai izolátum, „P ”
AB084456
CP gén, MP gén
Olasz izolátum, „PMMoV-I”
X72587
CP gén + 3’nem-kódoló régió
Taiwani izolátum
M87827
CP gén
Spanyol izolátum, „PMMoV-S”
M81413
Teljes genom
Spanyol izolátum, „Ia”
AJ308228
Teljes genom
Japán izolátum, „PMMoV-J”
AB000709
Teljes genom
Japán izolátum, „PMMoV-Ge1”
AB062049
CP gén
Japán izolátum, „PMMoV-Ge4”
AB062050
CP gén
Japán izolátum, „PMMoV-Ge5”
AB062051
CP gén
72
Japán izolátum, „PMMoV-Oh”
AB062052
CP gén
Japán izolátum, „PMMoV-Tosa”
AB062053
CP gén
Japán izolátum, „PMMoV-Na”
AB062054
CP gén
Japán „C-1421”attenuált izolátum AB069853
Teljes genom
Brazil izolátum
CP gén
AF525080
5HVWULNFLyVHQ]LPDQDOt]LVpVNHYHUWIHUW
]pVHVNtVpUOHW
A restrikciós enzim analízishez a magyar PMMoV izolátumok mellett két spanyol PMMoV izolátumot használtunk (6. táblázat), melyeket a madridi Centro de InvestigaciyQHV %LROyJLFDV LQWp]HWE
O 'U -RVp
-Ramón
Díaz-Ruíz bocsátott rendelkezésünkre.
6. táblázat. A munkánk során használt spanyol PMMoV-S izolátumok (Rodrígue-Cerezo et al. 1989 alapján) $J\
Az izolátum neve
174 (P78/84)
MWpVKHO\H
Alméria, Spanyolország
$J\
MWpV
Az izolátum
ideje
gazdanövénye
1984
Capsicum annuum (Bellamy)
219 (P132/85)
Alméria, Spanyolország
1985
Capsicum annuum (Clovis)
Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc Q|YpQ\HNHW IHUW
]WQN D VSDQ\RO
(174-es, 219-es) PMMoV-S izolátummal, illetve három, általunk kiválasztott, magyar PMMoV izolátummal (KD-2, KD-63, KD-68). A IHUW
]|WW Q|YpQ\HNE
O
-8 db izolátumonként) 5 nap elteltével kivontuk a
nukleinsavat és a CP1-CP2 primerpárral PCR vizsgálatot végeztünk. A PCR termékeket TaqI restrikciós enzimmel emésztettük (65°C-on kb. 90
73
percig). Az emésztett termékeket 6%-os poliakrilamid gélben futtattuk, majd futtatás után a gélt etídium-bromiddal (0,05 µl/ml) festettük. .HYHUWIHUW
]pVHVNtVpUOHWHNHWYpJH]WQNDVSDQ\ROpVDPDJ\DU
izolátumokkal. L rezLV]WHQFLDIRN~SDSULNiNDW 'XOFH,WDOLDQR IHUW 1
]WQN
minden növényen a legalsó, kifejlett levélpárt. Egyes növényeket a 174-es és a 219-HVVSDQ\ROL]ROiWXPRNNDOIHUW és KD-63-as izolátumokkal. A 10 O
-t kevertünk össze (5
-2
JPONRQFHQWU
O HV
-
]WNPtJPiVRNDWDPDJ\DU.'
ációjú inokulumokból 5-5
O HVLOOHWYH
-
O.'
-2-HV
O
KD-63-as), és ezzel a keverékkel inokuláltuk a leveleket (kezelésenként 2-2 Q|YpQ\W .RQWUROONpQWPLQGHQHJ\HVL]ROiWXPPDONO|QLVIHUW
növényt (5 IHUW
OD]
adott inokulumból + 5
O1D
]WQN
-1
-foszfát oldat). Nyolc nappal a
]pVXWiQDQHPLQRNXOiOWV]LV]WHPLNXVIHUW
]pV
OHYHOHNE
OQXNOHLQVDY
kivonás után a CP1-CP2 primerpárral PCR vizsgálatot végeztünk. A PCR termékeket Taq I restrikciós enzimmel emésztettük és kapott fragmenteket 6 %-os poliakrilamid gélben futtattuk. Futtatás után a gélt etídium-bromidot
OPO WDUWDOPD]
ó oldatba tettük 5-10 percre, majd festés után az
eredményeket értékeltük.
3.5. A paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV) növényen belüli terjedésének vizsgálata
A PMMoV növényen belüli terjedésének vizsgálatához Nicotiana benthamiana
Q|YpQ\HNHW IHUW
]WQN D VSDQ\RO 300R9
-es, 219-es)
izolátumokkal, izolátumonként 8-8 növényt. Növényenként 2 levelet inokuláltunk, 15 –
O LQRNXOXPPDO
J
O $ IHUW
]pV XWiQ pV
6 nappal a leveleket leszedtük, és ún. "levéllenyomat" (tissue printing) PyGV]HUUHO YL]VJiOWXN QDS HOWHOWpYHO D IHUW
]|WW OHYHOHNHW QDS
74
elteltével a szisztemikus leveleket vizsgáltuk. A kontroll növényeknél a levelet az inokuláció után 5 órával teszteltük. $ IHUW
]|WW
Nicotiana benthamiana levelet dörzspapírra helyeztük, a
"szendvics" tetejére pedig 3MM (Whatman) papír került. Egy üvegbot VHJtWVpJpYHOKHQJHUJHWpVVHODOHYpOE
ONLSUpVHOW
ük a szövetnedvet. A levelet
egy új 3MM papírra helyeztük (színével lefelé), membránt fektettünk rá (nylon membrane, positively charged, Roche), és a tetejére is 3 MM papír került. A "szendvicset" vákuum gélszárítóba helyeztük, majd a membránt mostuk, szártWRWWXNpV89OiPSDDODWWIL[iOWXNDQXNOHLQVDYDW(]WN|YHW
HQ
a membránokat digoxigenin hibridizációs rendszerben (DIG hybridisation system, Boehringer-0DQQKHLP D PHJIHOHO
SUyEiYDO D 300R9
-S 54
kDa fehérjét kódoló gént tartalmazó, digoxigeninnel jelölt RNS szakasz) hibridizáltattuk. A kemilumineszcens azonosítás Anti-DIG-AP antiszérum pV &63' NHPLOXPLQHV]FHQV IRV]IDWi] V]XEV]WUiW PLQGNHWW 0DQQKHLP
WHUPpN
VHJtWVpJpYHO
W|UWpQW
$
KLEULGL]iFLyW
%RHKULQJHU N|YHW
HQ
-
D
membránra sötétben filmet helyeztünk és kb. 10 perc után a filmet HO
KtYWXN
75
4. EREDMÉNYEK 4.1. Tesztnövény vizsgálatok A tesztnövény vizsgálatok során kapott tüneteket a 7. táblázat tartalmazza. A vizsgált PMMoV izolátumok az L+, L1 és L2 rezisztenciagént tartalmazó paprikafajtákon loNiOLV WQHWHNHW QHP RNR]WDN $ IHOV
QHP
inokulált leveleken kb. 1-3 hét múlva mozaikfoltosság, tarkulás volt PHJILJ\HOKHW
YDJ\LVDSDSULNiNIRJpNRQ\DNYROWDNDYtUXVIHUW
]pVpUH$]
L3 és L4 rezisztenciagént tartalmazó fajták többsége ellenállónak bizonyult. $ IHUW
]pVW N|YHW
HQ ORNiOLV QHNUy]LVRN IHMO
GWHN DPHO\HW V]LNOHYpOKXOOiV
követett (hiperszenzitív reakció). Ezeken a paprikafajtákon az esetek W|EEVpJpEHQ D IHOV
OHYHOHN WQHWPHQWHVHN PDUDGWDN D IHUW
]pV QHP
szisztemizálódott. Néhány esetben azonban 2-3 hét elteltével levél-, szár-, csúcs-
YDJ\ pUQHNUy]LVW D]W N|YHW
HQ D Q|YpQ\ SXV]WXOiViW OHKHWHWW
megfigyelni. A Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc és a Nicotiana rustica növényeken minden esetben lokális léziókat észleltünk, szisztemikus tünetek nem HVHWpEHQDIHUW
IHMO
GWHN $
Nicotiana tabacum cv. Samsun növények
]pVWQHWPHQWHVYROWVHPORNiOLVVHPV]LV]WHPLNXVWQHWHN
nem jelentek meg. A Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc növényekre történt YLVV]DIHUW
]pV VRUiQ D]RQEDQ ORNiOLV Op]LyN IHMO
KRJ\ D] L]ROiWXPRN OiWHQVHQ IHUW
]WpN D
GWHN DP
i azt bizonyította,
Nicotiana tabacum cv. Samsun
növényeket. A tesztnövény kísérletek során kapott tüneteket mutatja a 4-10. ábra. A 4- iEUD QDSSDO D IHUW lokális tünetek láthaWyDN D IHUW IHUW
]pV XWiQ NpV]OW DPLNRU PpJ FVDN D
]pV QHP V]LV]WHPL]iOyGRWW $
-8. ábra a
]pV XWiQ KpWWHO NpV]OW DPLNRU PiU D V]LV]WHPLNXV WQHWHN LV
76 PHJILJ\HOKHW
HN $ iEUD D IHUW
-
]pVW N|YHW
ORNiOLVWQHWHNOiWKDWyDNV]LV]WHPLNXVWQHWDNpV
HQ QDSSDO NpV]OW D EELHNEHQVHPIHMO
4. ábra. A KD-7 PMMoV izolátum lokális tüneteket nem okozott az L1 rezisztenciafokú (Keszthelyi rezisztens) Capsicum annuum növényeken (fotó: Harsányi Anett)
G|WW
77
5. ábra. A KD-7 PMMoV izolátum lokális tüneteket nem okozott az L2 rezisztenciafokú (V33/2) Capsicum annuum növényeken (fotó: Harsányi Anett)
6. ábra. A KD-7 PMMoV izolátum lokális nekrózist, majd 3 V]LNOHYpOKXOOiVWLGp]HWWHO D]/ rezisztenciafokú (Hattyú) Capsicum annuum növényeken (fotó: Harsányi Anett)
78
7. ábra. A KD-141 PMMoVL]ROiWXPIHUW ]pVpWN|YHW HQNEKpW múlva szisztemikus mozaikfoltosságot figyeltünk meg az L2 rezisztenciafokú (V33/2) Capsicum annuum növényeken (fotó: Harsányi Anett)
8. ábra. A KD-300R9L]ROiWXPPDOIHUW ]|WW/3 rezisztenciafokú (Hattyú) Capsicum annuum növényeken érnekrózis, sziklevélhullás volt PHJILJ\HOKHW (fotó: Harsányi Anett)
79
9. ábra. A KD-300R9L]ROiWXPPDOIHUW ORNiOLVOp]LyNILJ\HOKHW
]|WW
Nicotiana rustica tesztnövényen
HNPHJ IRWy +DUViQ\L$QHWW
10. ábra. A KD-300R9L]ROiWXPPDOIHUW ]|WWNicotiana tabacum cv. Samsun növények tünetmentesek (balra), a Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc növényeken (jobbra) lokális léziókIHMO GWHN IRWy +DUViQ\L$QHWW
80
7. táblázat. A tobamovírus izolátumok által a tesztnövényeken okozott tünetek és az extinkciós értékek a PMMoV antiszérummal végzett DAS-ELISA vizsgálatok nyomán A
N. t. cv.
N. t. cv.
tobamovírus
Xanthi-
Samsun
izolátum
nc
N. rustica
C. a. L1
C. a. L2
C. a. L3
DAS-ELISA
*/**
ext. érték (a PMMoV
elnevezése
antiszérummal)
KD-1
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
1,233
•/•
KD-2
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,396
••/•
KD-4
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,338
•••/•
KD-7
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,535
•••/•
KD-8
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,149
•••/•
KD-9
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,450
••/•
KD-10
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,470
•••/•
KD-11
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,630
•/•
KD-12
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
1,535
••/•
KD-13
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/SN, N
2,567
••/•
KD-14
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/SN, N
0,708
••••/•
KD-15
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,836
••/•
KD-16
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
0,364
••/•
KD-18
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,196
••/•
KD-47
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/SN, N
2,053
•••/•
KD-61
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
1,217
•••/•
KD-62
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
0,892
••••/•
KD-63
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/SN, N
1,903
••••/•
KD-64
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/TN,
1,846
••••/•
VN KD-66
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
1,735
••••/•
KD-67
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/VN
1,567
•••/•
KD-68
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,247
••••/•
KD-69
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,059
••••/•
KD-71
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/N
2,452
••/•
KD-72
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/N
1,170
••/•
Az izolátum
N. t. cv.
N. t. cv.
N. rustica
C. a. L
1
C. a. L
2
C. a. L
3
DAS-ELISA
81
elnevezése
Xanthi-
Samsun
ext. érték
nc
(PMMoV antiszérummal)
KD-73
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
1,025
•/•
KD-74
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,027
•••/•
KD-75
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/SN, N
1,806
••/•
KD-76
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/SN, N
2,009
•••/•
KD-77
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
1,131
••/•
KD-78
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
1,858
••••/•
KD-79
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,157
•••/•
KD-80
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
1,682
•••/•
KD-81
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
0,707
••/•
KD-82
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,442
•••/•
KD-83
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,020
•••/•
KD-84
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,216
•••/•
KD-102
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
2,335
••/•
KD-134
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
0,968
•••/•
KD-135
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/N
0,818
•/•
KD-137
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
1,157
•••/••
KD-139
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/N
1,757
•••/•
KD-140
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/SN, N
0,728
•/•
KD-141
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/ SN
0,830
••/•
KD-143
L/-
-/s
L/-
-/Mo, Mot
-/Mo, Mot
L, Abs/-
1,308
••/•
N. kontroll
0,348
P. kontroll
3,500 N. t. = Nicotiana tabacum, N. = Nicotiana, C. a. = Capsicum annuum L = lesion (lézió), - = no symptoms (nincs tünet), Abs = abscission (levélhullás), Mot = mottling (tarkulás), Mo = mosaic (mozaik), SN = stem necrosis (szárnekrózis), N = necrosis (nekrózis), s = symptomless systemic infection (tünetmentes szisztemikus fert kontroll = pozitív kontroll, ext. érték = 405 nm-en mért extinkciós érték * = TMV antiszérummal mért extinkciós értékek • = 0,000 – 0,020 •• = 0,021 – 0,030 ••• = 0,031 – 0,040 •••• = 0,041 – 0,050 negatív kontroll = 0,034 pozitív kontroll = 3,133
++
x6 D 5R
** = ToMV antiszérummal mért extinkciós értékek • = 0,000 – 0,020
82 •• = 0,021 – 0,030 negatív kontroll = 0,017 pozitív kontroll = 3,260
4.2.
Szerológiai és elektronmikroszkópos vizsgálatok A szerológiai vizsgálatok - PHO\HNHW NO|QE|]
specifikus
antiszérumokkal
végeztünk
–
PHJHU
WREDPRYtUXVRNUD VtWHWWpN
D]W
D
feltételezésünket, hogy a minták tobamovírust tartalmaztak. A hazai PLQWiNEDQ
H
QHP]HWVpJE
O
D
300R9
IRUGXOW
eredményeit D WiEOi]DW XWROVy pV XWROVy HO
HO
$
YL]VJiODWRN
WWL RV]ORSD WDUWDOPD]]D $
pozitív minták meghaladták a negatív kontroll extinkciós értékének kétszeresét. Egy izolátum esetében (KD-16) a vizsgálat során pozitív szerológiai reakciót nem kaptunk. A DAS-ELISA vizsgálatokkal a mintákban TMV vagy ToMV jelenlétét kimutatni nem tudtuk. Az elektronmikroszkópos vizsgálatok során kb. 320 nm hosszúságú, QP V]pOHVVpJ
PHUHY SiOFLND DODN~ YLULRQRNDW ILJ\HOWQN PHJ
ábra). Megfigyeléseink megegyeztek az irodalmi adatokkal, melyek szerint a PMMoV-t 312×18 nm-es, merev, pálcika alakú virionok jellemzik.
83
11. ábra. Az elektronmikroszkóppal megfigyelt pálcika alakú virionok (a jobb alsó sarokban látható beosztás 100 nm-t jelöl, fotó: Dr. Bóka Károly)
4.3.
Molekuláris virológiai vizsgálatok
A PCR vizsgálat a DAS-ELISA módszernél megbízhatóbb HUHGPpQ\W DG (O WHUYH]HWW
V]|U D 3&5 SDUDPpWHUHLW RSWLPDOL]iOWXN pV D] iOWDOXQN
SULPHUHN
P
N|G
NpSHVVpJpW
WHV]WHOWN
7L]HQHJ\
RO\DQ
autentikus tobamovírus izolátummal teszteltük az univerzális primerpár P
N|G
NpSHVVpJpW DPHO\HN D] 07$ 1|YpQ\YpGHOPL .XWDWyLQWp]HWpE
LOODNHV]WKHO\L1|YpQ\YpGHOPL,QWp]HWE
O
OV]iUPD]WDN
Tíz kiválasztott, saját izolátumot (KD-2, 62, 63, 66, 68, 69, 72, 75, 79, 83) vizsgáltunk az univerzális és vírus-specifikus primerekkel. Valamennyi vizsgált izolátum tobamovírusnak, azon belül PMMoV-nek bizonyult. A 12. ábra egy ilyen PCR eredményét mutatja.
84
1018 bp 506 bp
MM
12.
NK
1
2
3
iEUD1pKiQ\VDMiWJ\
MWpV
4
5
6
7
8
PDJ\DU300R9L]ROiWXP3&5
vizsgálata PMMoV vírus-specifikus primerrel. MM = méretmarker, NK= negatív kontroll, 1 = KD- 66, 2 = KD-69, 3 = KD-72, 4 = KD-68, 5 = KD-63, 6 = KD-62, 7-8 = pozitív kontroll (a pozitív kontroll Dr. Almási Asztéria szívessége folytán) bp = bázispár
Univerzális és vírus-specifikus
primerekkel
történt
vizsgálat
eredményét mutatja a 13. ábra. A KD-2 izolátumot -amely korábban az ELISA és tesztnövény vizsgálatok alapján PMMoV-nek bizonyult- az univerzális és specifikus primerekkel teszteltük. Mindkét esetben kaptunk 3&5 WHUPpNHW DPL PHJHU
VtWHWWH NRUiEEL HUHGPpQ\HLQNHW KRJ\ D .'
-2
izolátum PMMoV-t tartalmazott. A PCR termékek méreteit zárójelben tüntettem fel. Természetesen, a KD-2 izolátumot a TMV-U1 és ObPV
1018 bp
85
primerekkel is teszteltük, de ezekben az esetekben - ahogy vártuk - nem kaptunk PCR terméket.
806 bp 506 bp
500 bp
MM
1
2
3
4
MM
13. ábra. A KD-2 izolátum PCR vizsgálata univerzális tobamovírus és a PMMoV specifikus primerekkel. MM = méretmarker, 1 = a KD-2 izolátum az univerzális tobamovírus primerrel (699 bp), 2-3 = a KD-2 izolátum a PMMoV-specifikus SULPHUUHO NpW NO|QE|]
3&5 YL]VJiODW HUHGPpQ\H ES
= egy autentikus TMV izolátum a TMV-U1 primerrel, kontrollként (555 bp) bp = bázispár
$'RPDV]pNU
O6]DW\PD]UyO1DJ\NRYiFVLEyO.DORFViUyOV]iUPD]y
mintákból tobamovírust kimutatni nem tudtunk, a tobamovírust tartalmazó minták a Jászságból, Kiskunhalasról és Szegvárról származtak. A jászsági mintákban mindhárom évben (1999, 2000, 2001) találtunk paprika enyhe WDUNXOiV YtUXVW $ J\
MWpV VRUiQ D 300R9
-t tartalmazó, pozitív minták
86
esetében általában a termésen nekrózist, deformációt, a levélen gyenge mozaikot, tarkulást, vagy tünetmentességet figyeltünk meg. A továbbiakban két magyar izolátumot választottunk ki (KD-63 és KD-68), amelyekkel PCR vizsgálatot végeztünk a CP1 – CP2 primereket használva. A PCR terméket klónoztuk, a rekombináns plazmidokat tisztítottuk, majd az izolátumokat szekvenáltattuk. A 14-17. ábra az izolátumok CP részletének nukleotid- és aminosav sorrendjét mutatja. 1
CTGTGTACTT CGGCGTTAGG TAATCAGTTT CAAACACAGC AGGCTAGAAC
51
TACGGTTCAA CAGCAGTTCT CTGATGTGTG GAAGACTATA CCGACCGCTA
101
CAGTTAGATT TCCTGCTACT GGTTTCAAAG TTTTCCGATA TAATGCCGTG
151
CTAGATTCTC TAGTGTCGGC ACTTCTCGGA GCCTTTGATA CTAGGAACAG
201
GATAATAGAA GTAGAAAATC CGCAAAATCC TACAACTGCC GAGACGCTTG
251
ATGCGACGAG GCGGGTAGAT GATGCGACGG TGGCCATTAG GGCCAGTATA
301
AGTAACCTCA TGAATGAGTT AGTTCGTGGC ACGGGAATGT ACAATCAAGC
351
TCTGTTCGAG AGCGCGAGTG GACTCACCTG GGCTACAACT CCTTAA
14. ábra. A KD-63 izolátum CP gén 396 bázis hosszúságú szakaszának nukleotid sorrendje A KD-63 és KD-68 izolátumok CP génjében található nukleotid eltérés YDVWDJJDOpVQDJ\REEEHW
PpUHWWHOV]HGHWW
1
CTGTGTACTT CGGCGTTAGG TAATCAGTTT CAAACACAGC AGGCTAGAAC
51
TACGGTTCAA CAGCAGTTCT CTGATGTGTG GAAGACTATA CCGACCGCTA
101
CAGTTAGATT TCCTGCTACT GGTTTCAAAG TTTTCCGATA TAATGCCGTG
151
CTAGATTCTC TAGTGTCGGC ACTTCTCGGA GCCTTTGATA CTAGGAATAG
201
GATAATAGAA GTAGAAAATC CGCAAAATCC TACAACTGCC GAGACGCTTG
251
ATGCGACGAG GCGGGTAGAT GATGCGACGG TGGCCATTAG GGCCAGTATA
301
AGTAACCTCA TGAATGAGTT AGTTCGTGGC ACGGGAATGT ACAATCAAGC
351
TCTGTTCGAG AGCGCGAGTG GACTCACCTG GGCTACAACT CCTTAA
87
15. ábra. A KD-68 izolátum CP gén 396 bázis hosszúságú szakaszának nukleotid sorrendje A KD-63 és KD-68 izolátumok CP génjében található nukleotid eltérés YDVWDJJDOpVQDJ\REEEHW
PpUHWWHOV]HGHWW
LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPATGFKVFR YNAVLDSLVSALLGAFDTRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDA TVAIRASISNLMNELVRGTGMYNQALFESASGLTWATTP
16. ábra. A KD-63 izolátum CP gén 396 bázis hosszúságú szakaszának aminosav sorrendje
LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPATGFKVFR YNAVLDSLVSALLGAFDTRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDA TVAIRASISNLMNELVRGTGMYNQALFESASGLTWATTP Az aminosavak rövidítései: A = alanin, R = arginin, N = aszparagin, D = aszparaginsav, C = cisztein, F = fenilalanin, G = glicin, Q = glutamin, E = glutaminsav, H = hisztidin, I = izoleucin, L = leucin, K = lizin, M = metionin, P = prolin, S = szerin, Y = tirozin, T = treonin, W = triptofán, V = valin
17. ábra. A KD-68 izolátum CP gén 396 bázis hosszúságú szakaszának aminosav sorrendje A 16-17. ábra alapján a két PMMoV izolátum köpenyfehérje génjének adott szakaszán aminosav eltérés nincs.
4.4.
A paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV) izolátumok összehasonlító vizsgálata
4.4.1.
Szekvencia analízis
88
A KD-63 és KD-68 izolátumok szekvenálása során kapott eredményeket
összehasonlítottuk
a
szekvencia
adatbankban
is
megtalálható, egyéb PMMoV izolátumok szekvenciájával nukleotid- és aminosav szinten (18-19. ábra). Nukleotid szinten a KD-63 és KD-68 izolátumok között egyetlen eltérést találtunk, a vizsgált szakasz 198. helyén (C-T). A magyar PMMoV izolátumokhoz leginkább a koreai P izolátum szekvenciája hasonlít, attól a KD-63 izolátum 3, a KD-68 izolátum 2 nukleotidban különbözik. A japán PMMoV-J, az attenuált C-1421, a PMMoV-Na és a brazil PMMoV szekvenciájától a KD-63 izolátum 4, a KD-68 izolátum 5 nukleotidban tér el. A spanyol PMMoV-S szekvenciájához képest az eltérés a KD-63 esetében 5, a KD-68 esetében 6 bázis. 6 bázis eltérést találunk a KD-63 és a taiwani PMMoV, illetve a KD-63 és a japán PMMoV-Oh között, a KD-68 esetében a különbség 7-7 nukleotid. A japán PMMoV-Ge1 és PMMoVGe4 izolátumok 7-7 bázisban különböznek a KD-63, 6-6 bázisban a KD-68 izolátumtól. Eggyel több különbséget találtunk a japán PMMoV-Ge5 izolátum esetében. A koreai P0 izolátumhoz képest 9 nukleotid az eltérés a KD-63, 10 nukleotid az eltérés a KD-68 esetében. 9 bázisnyi eltérést eredményez a KD-68 és a koreai P2, 10 bázisnyi eltérést eredményez a KD pV D NRUHDL 3 L]ROiWXPRN |VV]HKDVRQOtWiVD -HOHQW
VHEE D NO|QEVpJ D]
olasz PMMoV-I és a japán PMMoV-Tosa izolátumok szekvenciájához W|UWpQ
KDVRQOtWiVNRU
-21 eltérés a KD-68, 22-22 eltérés a KD-63
izolátum nukleotid sorrendjéhez képest. A legnagyobb eltérést a magyar PMMoV
izolátumok
és
a
spanyol
PMMoV-Ia
izolátumok
összehasonlításakor kaptuk: 22 eltérés a KD-68, 23 eltérés a KD-63 izolátum bázissorrendjéhez képest. A koreai P1 izolátum nem volt
89
eg\EHYHWKHW
PiV 300R9 L]ROiWXPRN V]HNYHQFLiMiYDO PLYHO D]RNNDO
homológiát nem mutatott. Aminosavsorrendben nem találtunk különbséget a két magyar PMMoV (KD-63 és KD-68) izolátum között. Szintén nincs eltérés a magyar izolátumok és a koreai P izolátum, a japán PMMoV-J izolátum, a japán PMMoV-Na izolátum, a japán C-1421 attenuált izolátum, a brazil izolátum és a spanyol PMMoV-S izolátum között. A magyar izolátumok 2 aminosavban térnek el az olasz PMMoV-I izolátumtól, valamint a japán PMMoV-Tosa, PMMoV-Oh, PMMoV-Ge4 és PMMoV-Ge1 izolátumtól. Eggyel több, 3 aminosav az eltérés a japán PMMoV-Ge5 izolátumtól. 4 aminosav a különbség a magyar izolátumok és a spanyol Ia izolátum, illetve a koreai P2 izolátum között. A magyar izolátumok legnagyobb eltérést a taiwani izolátumhoz (6 aminosav) illetve a koreai P0 izolátumhoz (7 aminosav) viszonyítva mutatnak. KD-63 KD-68 Koreai P PMMoV-J C1421 att. Brazil PMMoV-Na PMMoV-S PMMoV-Ge4 PMMoV-Ge1 Taiwani PMMoV-Oh PMMoV-Ge5 Koreai P2 Koreai P0 PMMoV-I PMMoV-Tosa Spanyol Ia
CTGTGTACTT CTGTGTACTT CTATGTACTT CTGTGTACTT CTGTGTACTT CTGTGTACTT CTGTGTACTT CTGTGTACTT CTATGTACTT CTATGTACTT CTGTGTACTT CTGTGTACTT CTATGTACTT CTATGTACTT CTATGTACTT TTGTGTACTT TTGTGTACTT TTGTGTACTT
CGGCGTTAGG CGGCGTTAGG CGGCGTTAGG CGGCGTTAGG CGGCGTTAGG CGGCGTTAGG CGGCGTTAGG CGGCGTTAGG CGGCGTTAGG CGGCGTTAGG CGGCGTTAGG CGGCGTTAGG CGGCGTTAGG CGGCGTTAGG CGGCGTTAGG CTGCGTTAGG CTGCGTTAGG CTGCGTTAGG
TAATCAGTTT TAATCAGTTT TAATCAGTTT CAATCAGTTT CAATCAGTTT CAATCAGTTT CAATCAGTTT CAATCAGTTT TAATCAGTTT TAATCAGTTT CAATCAGTTT CAATCAGTTT TAATCAGTTT TAATCAGTTT TAATCAGTTT TAATCAGTTT TAATCAGTTT TAATCAGTTT
CAAACACAGC CAAACACAGC CAAACACAGC CAAACACAAC CAAACACAAC CAAACACAAC CAAACACAAC CAAACACAAC CAAACACAGC CAAACACAGC CAAACACAAC CAAACACAAC CAAACACAGC CAAACACAGC CAAACACAGC CAAACACAAC CAAACACAAC CAAACACAAC
AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC AGGCTAGAAC
KD-63 KD-68 Koreai P PMMoV-J C1421 att. Brazil PMMoV-Na PMMoV-S PMMoV-Ge4 PMMoV-Ge1
TACGGTTCAA TACGGTTCAA TACGGTTCAA TACGGTTCAA TACGGTTCAA TACGGTTCAA TACGGTTCAA TACGGTTCAA TAAGGTTCAA TAAGGTTCAA
CAGCAGTTCT CAGCAGTTCT CAGCAGTTCT CAGCAGTTCT CAGCAGTTCT CAGCAGTTCT CAGCAGTTCT CAGCAGTTCT CAGCAGTTCT CAGCAGTTCT
CTGATGTGTG CTGATGTGTG CTGATGTGTG CTGATGTGTG CTGATGTGTG CTGATGTGTG CTGATGTGTG CTGATGTGTG CTGGTGTGTG CTGGTGTGTG
GAAGACTATA GAAGACTATA GAAGACCATA GAAGACTATT GAAGACTATT GAAGACTATT GAAGACTATT GAAGACTATT GAAGACTATA GAAGACTATA
CCGACCGCTA CCGACCGCTA CCGACCGCTA CCGACCGCTA CCGACCGCTA CCGACCGCTA CCGACCGCTA CCGACCGCTA CCGACCGCTA CCGACCGCTA
90
Taiwani PMMoV-Oh PMMoV-Ge5 Koreai P2 Koreai P0 PMMoV-I PMMoV-Tosa Spanyol Ia
TACGGTTCAA TACGGTTCAA TAAGGTTCAA TACGGTTCAA TACGGTTCAA TACTGTCCAA TACTGTCCAA TACTGTCCAA
CAGCAGTTCT CAGCAGTTCT CAGCAGTTCT CAGCAGTTCT CAGCAGTTCT CAGCAGTTCT CAGCAGTTCT CAGCAGTTCT
CTGATGTGTG CTGATGTGTG CTGGTGTGTG CTGATGTGTG CTGATGTGTG CTGACGTGTG CTGACGTGTG CTGACGTGTG
GAAGACTATT GAAGACTATT GAAGACTATA GAAGACCATA GAAGACCATA GAAGACTATA GAAGACTATA GAAGACTATT
CCGACCGCTA CCGACCGCTA CCGACCGCTA CCGACCGCTA CCGACCGCTA CCGACCGCTA CCGACCGCTA CCGACCGCTA
KD-63 KD-68 Koreai P PMMoV-J C1421 att. Brazil PMMoV-Na PMMoV-S PMMoV-Ge4 PMMoV-Ge1 Taiwani PMMoV-Oh PMMoV-Ge5 Koreai P2 Koreai P0 PMMoV-I PMMoV-Tosa Spanyol Ia
CAGTTAGATT CAGTTAGATT CAGTTAGATT CAGTTAGATT CAGTTAGATT CAGTTAGATT CAGTTAGATT CAGTTAGATT CAGTCAGATT CAGTCAGATT CAGTTAGATT CAGTTAGATT CAGTCAGATT CAGTTAGATT CAGTTAGATT CAGTTAGATT CAGTTAGATT CAATTAGATT
TCCTGCTACT TCCTGCTACT TCCTGCTACT TCCTGCTACT TCCTGCTACT TCCTGCTACT TCCTGCTACT TCCTGCTACT TCCTGCTACT TCCTGCTACT TCCTGCTACT TCCTACTACT TCCTGCTACT TCCTGCTACT TCCTGCTACT TCCTGCTACT TCCTGCTACT TCCTGCTACT
GGTTTCAAAG GGTTTCAAAG GGTTTCAAAG GGTTTCAAAG GGTTTCAAAG GGTTTCAAAG GGTTTCAAAG GGTTTCAAAG GGTTTCAAAG GGTTTCAAAG GGTTTCAAAG GGTTTCAAAG GGTTTCAAAG GGTTTCAAAC GGTTTCAAAG GGTTTCAAAG GGTTTCAAAG GGTTTCAAAG
TTTTCCGATA TTTTCCGATA TTTTCCGATA TTTTCCGATA TTTTCCGATA TTTTCCGATA TTTTCCGATA TTTTCCGATA TTTTTCGATA TTTTTCGATA TTTTCCGATA TTTTCCGATA TTTTTCGATA GTTTCCGATA TTTTTCGATA TTTTTCGATA TTTTTCGATA TTTTTCGATA
TAATGCCGTG TAATGCCGTG TAATGCCGTG TAATGCCGTG TAATGCCGTG TAATGCCGTG TAATGCCGTG TAATGCCGTG TAATGCCGTG TAATGCCGTG TAATGCCGTG TAATGCCGTG TAATCCCGTG TAATGCCGTG TAATGCCGTG CAATGCCGTG CAATGCCGTG TAATGCCGTG
KD-63 KD-68 Koreai P PMMoV-J C1421 att. Brazil PMMoV-Na PMMoV-S PMMoV-Ge4 PMMoV-Ge1 Taiwani PMMoV-Oh PMMoV-Ge5 Koreai P2 Koreai P0 PMMoV-I PMMoV-Tosa Spanyol Ia
CTAGATTCTC CTAGATTCTC CTAGATTCTC CTAGATTCTC CTAGATTCTC CTAGATTCTC CTAGATTCTC CTAGATTCTC CTAGATTCAC CTAGATTCAC CTAGATTCTC CTAGATTCTC CTAGATTCAC CTAGATTCTC CTAGATTCTC CTAGATTCTC CTAGATTCTC CTAGATTCTC
TAGTGTCGGC TAGTGTCGGC TAGTGTCGGC TAGTGTCGGC TAGTGTCGGC TAGTGTCGGC TAGTGTCGGC TAGTGTCGGC TAGTGTCGGC TAGTGTCGGC TAGTGTCGGC TAGTGGCGGC TAGTGTCGGC TAGTGTCGGC TAGTGTCGGC TAGTGTCGGC TAGTGTCGGC TAGTGTCGGC
ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA ACTTCTCGGA
GCCTTTGATA GCCTTTGATA GCCTTTGATA GCCTTTGATA GCCTTTGATA GCCTTTGATA GCCTTTGATA GCCTTTGATA GCCTTTGATA GCCTTTGATA GCCTTTGATA GCCTTTGATA GCCTTTGATA GCTTTTGATA GCCTTTGATA GCCTTTGATA GCCTTTGATA GCCTTTGATA
CTAGGAACAG CTAGGAATAG CTAGGAATAG CTAGGAACAG CTAGGAACAG CTAGGAACAG CTAGGAACAG CTAGGAACAG CTAGGAATAG CTAGGAATAG CTAGGAACAG CTAGGAACAG CTAGGAATAG CTAGGAATAG CTAGGAACAG CTAGGAATAG CTAGGAATAG CTAGGAATAG
KD-63 KD-68 Koreai P PMMoV-J C1421 att. Brazil PMMoV-Na PMMoV-S PMMoV-Ge4 PMMoV-Ge1 Taiwani PMMoV-Oh PMMoV-Ge5 Koreai P2
GATAATAGAA GATAATAGAA GATAATAGAA GATAATAGAA GATAATAGAA GATAATAGAA GATAATAGAA GATAATAGAA GATAATAGAA GATAATAGAA GATAATAGAA GATAATAGAA GATAATAGAA GATAATAGAA
GTAGAAAATC GTAGAAAATC GTAGAAAATC GTTGAAAATC GTTGAAAATC GTTGAAAATC GTTGAAAATC GTTGAAAATC GTAGAAAATC GTAGAAAATC GTTGAAAATC GTTGAAAATC GTAGAAAATC GTAGAAAATC
CGCAAAATCC CGCAAAATCC CGCAAAATCC CGCAAAATCC CGCAAAATCC CGCAAAATCC CGCAAAATCC CGCAAAATCC CGCAAAATCC CGCAAAATCC CGCAAAATCC CGCAAAATCC CGCAAAATCC CGCAAAATCC
TACAACTGCC TACAACTGCC TACAACTGCC TACAACTGCC TACAACTGCC TACAACTGCC TACAACTGCC TACAACTGCC TACAACTGCC TACAACTGCC TACAACTGCC TACAACTGCC TACAACTGCC TACAACTGCC
GAGACGCTTG GAGACGCTTG GAGACGCTTG GAGACGCTTG GAGACGCTTG GAGACGCTTG GAGACGCTTG GAGACGCTTG GAGACGCTTG GAGACGCTTG GAGACGCTTG GAGACGCTTG GAGACGCTTG GAGACGCTTG
91
Koreai P0 PMMoV-I PMMoV-Tosa Spanyol Ia
GATAATAGAA GATAATAGAA GATAATAGAA GATAATAGAA
GTAGAAAATC GTTGAAAATC GTTGAAAATC GTTGAAAATC
CGCAAAATCC CGCAAAATCC CGCAAAATCC CGCAAAATCC
TACAACTGCC TACTACTGCT TACTACTGCT TACTACTGCT
GAGACGCTTG GAGACGCTCG GAGACGCTCG GAGACGCTTG
KD-63 KD-68 Koreai P PMMoV-J C1421 att. Brazil PMMoV-Na PMMoV-S PMMoV-Ge4 PMMoV-Ge1 Taiwani PMMoV-Oh PMMoV-Ge5 Koreai P2 Koreai P0 PMMoV-I PMMoV-Tosa Spanyol Ia
ATGCGACGAG ATGCGACGAG ATGCGACGAG ATGCGACGAG ATGCGACGAG ATGCGACGAG ATGCGACGAG ATGCGACGAG ATGCGACGAG ATGCGACGAG ATGCGACAAG ATGCGACGAG ATGCGACGAG ATGCGACGAT ATGCGACGAA ATGCGACGAG ATGCGACGAG ATGCGACGAG
GCGGGTAGAT GCGGGTAGAT GCGGGTAGAT GCGGGTAGAT GCGGGTAGAT GCGGGTAGAT GCGGGTAGAT GCGGGTAGAC GCGGGTAGAT GCGGGTAGAT GCGGGTAGAT GCGGGTAGAT GCGGGTAGAT GCGGGTAGAT GCGGGTAGAT GCGAGTAGAT GCGAGTAGAT GCGAGTAGAT
GATGCGACGG GATGCGACGG GATGCGACGG GATGCGACGG GATGCGACGG GATGCGACGG GATGCGACGG GATGCGACGG GATGCGACGG GATGCGACGG GATGCGACGG GATGCGACGG GATGCGACGG GATGCGACGG GATGCGACGG GATGCTACGG GATGCTACGG GATGCTACGG
TGGCCATTAG TGGCCATTAG TGGCCATTAG TGGCCATTAG TGGCCATTAG TGGCCATTAG TGGCCATTAG TGGCCATTAG TGGCCATTAG TGGCCATTAG TGGCCATTAG TGGCCATTAG TGGCCATTAG TGGCCATTAG TGGCCATTAG TGGCTATTAG TGGCTATTAG TGGCTATTAG
GGCCAGTATA GGCCAGTATA GGCCAGTATA GGCCAGTATA GGCCAGTATA GGCCAGTATA GGCCAGTATA GGCCAGTATA GGCCAGTATA GGCCAGTATA GGCCAGTATA GGCCAGTATA GGCCAGTATA GGCCAGTATA GGCCAGTATA GGCCAGTATT GGCCAGTATT GGCCAGTATT
KD-63 KD-68 Koreai P PMMoV-J C1421 att. Brazil PMMoV-Na PMMoV-S PMMoV-Ge4 PMMoV-Ge1 Taiwani PMMoV-Oh PMMoV-Ge5 Koreai P2 Koreai P0 PMMoV-I PMMoV-Tosa Spanyol Ia
AGTAACCTCA AGTAACCTCA AGTAACCTCA AGTAACCTCA AGTAACCTCA AGTAACCTCA AGTAACCTCA AGTAACCTCA AGTAACCTCA AGTAACCTCA AGTAACCTCA AGTAACCTCA AGTAACCTCA AGTCCCATCA AGTAACCTCA AGTAACCTCA AGTAACCTCA AGTAACCTCA
TGAATGAGTT TGAATGAGTT TGAATGAGTT TGAATGAGTT TGAATGAGTT TGAATGAGTT TGAATGAGTT TGAATGAGTT TGAATGAGTT TGAATGAGTT TGAATGAGTT TGAATGAGTT TGAATGAGTT TGAATGAGTT TGAATGAGTT TGAATGAGTT TGAATGAGTT TGAATGAGTT
AGTTCGTGGC AGTTCGTGGC AGTTCGTGGC AGTTCGTGGC AGTTCGTGGC AGTTCGTGGC AGTTCGTGGC AGTTCGTGGC AGTTCGTGGC AGTTCGTGGC AGTTCGTGGC AGTTCGTGGC AGTTCGTGGC AGTTCGTGGC AATTCGTGGC AGTTCGTGGC AGTTCGTGGC AGCTCGAGGC
ACGGGAATGT ACGGGAATGT ACGGGAATGT ACGGGAATGT ACGGGAATGT ACGGGAATGT ACGGGAATGT ACGGGAATGT ACGGGAATGT ACGGGAATGT ACAGGAATGT ACGGGAATGT ACGGGAATGT ACGGGAATGT ACGGGAATGT ACGGGAAATT ACGGGAAATT ACGGGAAATT
ACAATCAAGC ACAATCAAGC ACAATCAAGC ACAATCAAGC ACAATCAAGC ACAATCAAGC ACAATCAAGC ACAATCAAGC ACAATCAAGC ACAATCAAGC ACAATCAAGC ACAATCAAGC ACAATCAAGC ACAATCAAGC ACAATCAAGC ACAATCAAGC ACAATCAAGC ACAATCAAGC
KD-63 KD-68 Koreai P PMMoV-J C1421 att. Brazil PMMoV-Na PMMoV-S PMMoV-Ge4 PMMoV-Ge1 Taiwani PMMoV-Oh PMMoV-Ge5 Koreai P2 Koreai P0 PMMoV-I PMMoV-Tosa Spanyol Ia
TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG TCTGTTCGAG
AGCGCGAGTG AGCGCGAGTG AGCGCGAGTG AGCGCGAGTG AGCGCGAGTG AGCGCGAGTG AGCGCGAGTG AGCGCGAGTG AGCGCGAGTG AGCGCGAGTG AGCGCGAGTG AGCGCGAGTG AGCGCGAGTG AGCGCGAGTG ATGGCGAGTG AGCGTGAGTG AGCGTGAGTG AGCGTGAGTG
GACTCACCTG GACTCACCTG GACTCACCTG GACTCACCTG GACTCACCTG GACTCACCTG GACTCACCTG GACTCACCTG GACTCACCTG GACTCACCTG GACTCACCTG GACTCACCTG GACTCACCTG GACTCACCTG GATTCACCTG GACTTACGTG GACTTACGTG GACTCACGTG
GGCTACAACT GGCTACAACT GGCTACAACT GGCTACAACT GGCTACAACT GGCTACAACT GGCTACAACT GGCTACAACT GGCTACAACT GGCTACAACT GGCTACAACT GGCTACAACT GGCTACAACT GGCTACAACT GGCTACAATT GGCTACAACT GGCTACAACT GGCTACAACT
CCTTAA CCTTAA CCTTAA CCTTAA CCTTAA CCTTAA CCTTAA CCTTAA CCTTAA CCTTAA CCTTAA CCTTAA CCTTAA CCTTAA CCTTAA CCTTAA CCTTAA CCTTAA
92
18. ábra. A magyar KD-63 és KD-68 PMMoV izolátumok nukleotid szekvenciájának összehasonlítása az adatbankban található, egyéb PMMoV izolátumok szekvenciájával a CP 396 bázis hosszúságú szakaszán A PMMoV izolátumok nukleotid sorrendjében található eltérések vastaggal szedettek. KD-63 KD-68 Koreai P PMMoV-J C1421 att. Brazil PMMoV-Na PMMoV-S PMMoV-Ge4 PMMoV-Ge1 Taiwani PMMoV-Oh PMMoV-Ge5 Koreai P2 Koreai P0 PMMoV-I PMMoV-Tosa Spanyol Ia
LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPATGFKVFRYNAVLDSLVSALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPATGFKVFRYNAVLDSLVSALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPATGFKVFRYNAVLDSLVSALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPATGFKVFRYNAVLDSLVSALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPATGFKVFRYNAVLDSLVSALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPATGFKVFRYNAVLDSLVSALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPATGFKVFRYNAVLDSLVSALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPATGFKVFRYNAVLDSLVSALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTKVQQQFSGVWKTIPTATVRFPATGFKVFRYNAVLDSLVSALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTKVQQQFSGVWKTIPTATVRFPATGFKVFRYNAVLDSLVSALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPATGFKVFRYNAVLDSLVSALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPTTGFKVFRYNAVLDSLVAALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTKVQQQFSGVWKTIPTATVRFPATGFKVFRYNPVLDSLVSALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPATGFKRFRYNAVLDSLVSALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPATGFKVFRYNAVLDSLVSALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPATGFKVFRYNAVLDSLVSALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPATGFKVFRYNAVLDSLVSALLGAFD LCTSALGNQFQTQQARTTVQQQFSDVWKTIPTATIRFPATGFKVFRYNAVLDSLVSALLGAFD
KD-63 KD-68 Koreai P PMMoV-J C1421 att. Brazil PMMoV-Na PMMoV-S PMMoV-Ge4 PMMoV-Ge1 Taiwani PMMoV-Oh PMMoV-Ge5 Koreai P2 Koreai P0 PMMoV-I PMMoV-Tosa Spanyol Ia
TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELVRGTGMYNQALFESASGLT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELVRGTGMYNQALFESASGLT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELVRGTGMYNQALFESASGLT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELVRGTGMYNQALFESASGLT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELVRGTGMYNQALFESASGLT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELVRGTGMYNQALFESASGLT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELVRGTGMYNQALFESASGLT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELVRGTGMYNQALFESASGLT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELVRGTGMYNQALFESASGLT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELVRGTGMYNQALFESASGLT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELVRGTGMYNQALFESASGLT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELVRGTGMYNQALFESASGLT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELVRGTGMYNQALFESASGLT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATMRVDDATVAIRASISPIMNELVRGTGMYNQALFESASGLT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATKRVDDATVAIRASISNLMNELIRGTGMYNQALFEMASGFT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELVRGTGNYNQALFESVSGLT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELVRGTGNYNQALFESVSGLT TRNRIIEVENPQNPTTAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELARGTGNYNQALFESVSGLT
KD-63 KD-68 Koreai P PMMoV-J C1421 att. Brazil PMMoV-Na PMMoV-S PMMoV-Ge4
WATTP WATTP WATTP WATTP WATTP WATTP WATTP WATTP WATTP
93
PMMoV-Ge Taiwani PMMoV-Oh PMMoV-Ge5 Koreai P2 Koreai P0 PMMoV-I PMMoV-Tosa Spanyol Ia
WATTP WATTP WATTP WATTP WATTP WATIPYT WATTP WATTP WATTP
19. ábra. A magyar KD-63 és KD-68 PMMoV izolátumok aminosav szekvenciájának összehasonlítása az adatbankban található, egyéb PMMoV izolátumok szekvenciájával a CP 396 bázis hosszúságú szakaszán A PMMoV izolátumok aminosav sorrendjében található eltérések vastaggal szedettek. A 16 adatbanki és a két saját izolátum 396 bázis hosszúságú szekvenciájának felhasználásával filogenetikai törzsfát készítettünk a Treecon program segítségével (20. ábra).
94
20. ábra. Magyar és külföldi PMMoV izolátumok filogenetikai törzsfája a köpenyfehérje gén 396 bázis hosszúságú szakaszának összehasonlítása alapján
u 8 ; + 88 +
H+ I A¡Jx¢NO ++ x¢I A¡J5£7O ++ £ I A¡J<
koreai P, SPANYIA = spanyol Ia
5HVWULNFLyVHQ]LPDQDOt]LVpVNHYHUWIHUW
4.4.2.
]pVHVNtVpUOHW
Elvégeztük három, általunk kiválasztott magyar PMMoV izolátum (KD-2, KD-63, KD-68) restrikciós hasítását TaqI enzimmel. A restrikciós mintázatok elemzését Tenllado et al. (1997) szerint végeztük. Eszerint a Taq
I
HQ]LPPHO
W|UWpQ
KDVtWiV
NpWIpOH
UHVWULNFLyV
PLQWi]DWRW
eredményezhet: az I típus a P1,2 patotípusú izolátumokra jHOOHP]
PtJ D ,,
típus a P1,2,3 patotípusúakra. Mindkét típuson belül 2 altípus létezik: az I1 altípusnál 2 fragment (356 bp, 40 bp), az I2 estében 3 fragment (220 bp, 135 bp, 40 bp), a II1 altípusnál 4 fragment (135 bp, 113 bp, 107 bp), a II2 esetében pedig 3 fragment (248 bp, 107 bp, 40 bp) keletkezik. 0LQGKiURPYL]VJiOWL]ROiWXPHVHWpEHQPHJHU
VtWpVWQ\HUWKRJ\D]RN
P1,2 patotípusúak, hiszen az I hasítási típusba tartoztak. A KD-2 izolátum I2 típusú mintázatot adott, ami a spanyol 219-es izolátumra jeOOHP]
$ .'
-
63 és KD-68 izolátum I1 típusú mintázatot adott, ami a spanyol 174-es L]ROiWXPUDMHOOHP] $NHYHUWIHUW
]pVHVNtVpUOHWHNHWDVSDQ\RO
-es és 219-es, valamint
a magyar KD-2 és KD-63 izolátumokkal folytattuk. A magyar izolátumok PCR termékeinek TaqI enzimmel történt hasítása után kapott fragmenteket mutatja a 21. ábra. A két spanyol izolátummal végzett kísérletnél a kevert IHUW
]pV
OHYHOHNEHQ FVDN D
-es izolátum mintázata volt kimutatható. A
magyar izolátumoknál azonban mindkét izolátum mintázatát kimutattuk, PLQGNpWL]ROiWXPMHOHQYROWDNHYHUWIHUW
]pV
OHYHOHNEHQ
95
267 bp
174 bp
102 bp
80 bp
1
21.
2
3
4
5
6
7
MM
iEUD$NpWPDJ\DU300R9L]ROiWXPPDOYpJ]HWWNHYHUWIHUW
]pVHV
kísérlet során kapott PCR termékek hasítása TaqI restrikciós endonukleázzal. MM = méretmarker, 1-2 = KD-2 izolátum, 3 = KD-63 izolátum, 4-6 = KD-2 + KD-63 izolátumok hasítási mintázata, 7 = nem emésztett PCR termék (KD-2) bp = bázispár
4.5. A paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV) növényen belüli terjedésének vizsgálata
96
A tissue printing vizsgálatok során kapott eredményeket a 22. ábra mutatja. Eszerint
D] L]ROiWXPRN WHUMHGpVpEHQ pUWpNHOKHW
NO|QEVpJHW H]]HO
a módszerrel nem tapasztaltunk. Mindkét izolátum esetében kaptunk „jelet” D] HUHN PHQWpQ LOOHWYH QDSSDO D IHW
]pV XWiQ GH QHP WXGWXN
bizonyítani, hogy a 219-es izolátum gyorsabban terjedt volna, mint a 174es.
22. ábra. A spanyol PMMoV izolátumok növényen belüli terjedésének
¤ ¥¦>§ vizsgálata ¤¨©2¥ª«¬A¦ ª®¯tissue ° ¨¬ ¦ ª± ¨Dprinting ² ³´ ¬ µ+¶«¬ °Jmódszerrel «µ·¸¹ ¬ º¨D³° ¬ ³° ¬J ¨¥ª »«µ·¸8¨¼½A¾¿ À½;ÁR¾Â§ «¥¨©ª°>Ã5Ä6Ä/ª Å ª » ¯ ° · ° 5 ¬ ° ³º¶+° ¼½ Æ"Ç<§D¯¥¥³´;° ³+¨²;± ² ³+° « ½ ³¸ ¦ ª »¯° ·° ¬5° ³º¶+° ¼ izolátumok, IL = inoculated leaf (in
97
5. KÖVETKEZTETÉSEK, JAVASLATOK
0XQNiQN
VRUiQ
SDSULNDPLQWiNEDQ
HO
D]
RUV]iJ
IRUGXOy
NO|QE|]
WHUOHWHLU
WREDPRYtUXVRNDW
O
EHJ\
D]RQRVtWRWWXN
MW|WW $
tesztnövényvizsgálatok eredményeit az irodalomban leírtakkal összevetve PHJiOODStWKDWy KRJ\ D PLQWiN YDOyV]tQ
OHJ 3DSULND HQ\KH WDUNXOiV YtUXVW
(Pepper mild mottle tobamovirus, PMMoV) tartalmaztak. Az irodalmi adatok szerint ugyanis ez a vírus a Nicotiana tabacum Xanthi-nc-n és a Nicotiana rustica-n lokális léziókat okoz, szisztemikus tünetek nem IHMO
GQHN $
IHUW
]L DKRJ\ H] HVHWQNEHQ LV W|UWpQW $ OiWHQV IHUW
Nicotiana tabacum cv. Samsun-t szisztemikusan látensen
tabacum cv. Xanthi-QF GRKiQ\RNUD W|UWpQW YLVV]DIHUW NO|QE|] UH]LV]WHQFLDIRN~ SDSULNDIDMWiN IHUW D]W LV HOG|QWLN KRJ\ D KD]iQNEDQ HO
]pVW D
Nicotiana
]pVVHO LJD
zoltuk. A
]pVHNRU NDSRWW HUHGPpQ\HN
IRUGXOy 300R9 L]ROiWXPRN D
kevésbé agresszív P1,2 patotípusba tartoztak, mivel az L3 rezisztenciagén által biztosított rezisztenciát nem tudták áttörni, ezeken a paprikákon KLSHUV]HQ]LWtY UHDNFLy YROW PHJILJ\HOKHW
$ 300R9 KD]DL MHOHQOpWpW
szerológiai, elektronmikroszkópos és molekuláris biológiai módszerekkel is alátámasztottuk. Eredményeink azt jelzik, hogy miként a világ számos országában – pl. Japánban, Spanyolországban, Olaszországban, Koreában, Brazíliában –, úgy Magyarországon is jelen van a Tobamovirus nemzetség ezen tagja. +D]iQNEDQ HGGLJ D YtUXV iOWDO RNR]RWW NiURNUyO WHUPpVYHV]WHVpJHNU
rendelkeztünk EHV]iPROWDN
adatokkal, D
300R9
de
más
JD]GDViJL
papriNDWHUPHV]W MHOHQW
VpJpU
O
O QHP
RUV]iJRNEyO
McKinney 1952,
Greenleaf et al. 1964, Arteaga és Ortega 1981). 1982-85 között Spanyolország délkeleti részén, Almériában a PMMoV okozta a
98 OHJQDJ\REE IHUW
]pVW D SDSULNiEDQ D IHUW
]|WWVp
get 20-100 %-ra becsülték
(Alonso et al. 1989). A vírus Koreában 20-50%-os termésveszteséget okozott a paprikakultúrákban (Lim et al. 1997). Hasonlóan nagy károkat okozott Olaszországban és Görögországban az 1980-as években (Avgelis 1986, Wetter 1984). A PMMoV hazai jelenléte új járványtani kérdéseket vet fel. A vírus a IHUW
]|WWQ|YpQ\PDJMiYDONOV
pVEHOV
PDJiWYLWHOOHOLVWHUMHGHOOHQWpWEHQ
a TMV-U1-el vagy a ToMV-YHO DKRO FVDN D NOV 300R9 IHOWHKHW
HQ $PHULNiEyO (XUySiED LV
V]HULQWD300R9IHUW
PDJiWYLWHO MHOOHP] $
így jutott át. Nagai (1988)
]|WWVpJDSDSULNDPDJEDQDNiUD
-ot is elérheti.
További vizsgálatokat végeztünk a vírus molekuláris jellemzésének érdekében. Ennek során elvégeztük a köpenyfehérje gén 396 bázis hosszúságú szakaszának szekvenálását két magyar PMMoV izolátum esetében. A két izolátum szekvenciájában nukleotidszinten egy különbséget találtunk, ami aminosav szinten különbséget nem okozott. Összehasonlítva a magyar izolátumok szekvenciáját az adatbankban található egyéb, külföldi izolátumok szekvenciájával, nukleotidszinten 94-99 %-os, aminosavszinten 95-100 %-os hasonlóságot tapasztaltunk. Az RNS YtUXVRNUDMHOOHP] DJHQRPYiOWR]pNRQ\ViJD1HPPHJOHS pYYHO NpV
KRJ\DNiU
-2
EE YDJ\ SiU V]i] NLORPpWHUUHO DUUpEE L]ROiOW YtUXVRN LV HOWpUQHN
HJ\PiVWyO
-HOOHP]
KRJ\
HOV
VRUEDQ
RO\DQ
PXWiFLyN
PDUDGQDN
életképesek, amelyek nem változtatják meg az aminosav sorrendet. Így IRUGXOKDWHO
KRJ\SODVSDQ\RO300R9
-S izolátum 5 nukleotidban tér el
a magyar KD-63 izolátumtól, aminosav sorrendjük azonban 100 %-ban megegyezik. Az ugyancsak spanyol Ia izolátum pedig a 23 nukleotidnyi különbség ellenére mindössze 4 aminosavnyi eltérést mutat a KD-63 L]ROiWXPPDO W|UWpQ
|VV]HKDVRQOtWiVNRU $ V]HNYHQFLDUpV]OHWHN DODSMiQ
szerkesztett filogenetikai törzsfa szerint a hazai izolátumok egyes japán és
99
koreai izolátumokhoz álltak legközelebb. Ennek esetleges magyarázata OHKHW KRJ\ D PDJ\DU YHW YHW
PDJRWD7iYRO
PDJ FpJHN J\DNUDQ WHUPHOWHWQHN SDSULND
-Keleten.
A restrikciós típusok vizsgálatánál a Tenllado et al. (1997) szerint kidolgozott módszert alkalmaztuk. Mind a három vizsgált magyar PMMoV izolátum az I-es restrikciós mintázatot adta, tehát P1,2 patotípusúnak bizonyult. Tenllado et al. (1997) vizsgálatai szerint ugyanis a P1,2 patotípusú izolátumok az I-es, a P1,2,3 patotípusú izolátumok a II-es restrikciós mintázatot mutatták. A magyar izolátumok közt mindkét restrikciós altípus (I1, I2)HO
IRUGXOW$UHVWULNFLyVDOWtSXVRNMHOHQW
VpJHQHP
ismert, az azonban köztudott, hogy akár egyetlen nukleotid megváltozása is a rezisztencia áttörését eredményezheti, így a restrikciós mintázatban kapott eltérések összefüggésben lehetnek az izolátumok agresszivitásával. $ NHYHUW IHUW
]pVHV NtVpUOHWHN VRUiQ D PDJ\DU L]ROiWXPRN QHP
mutatták a spanyol izolátumoknál tapasztalt sajátos „viselkedést”, a kevert IHUW
]pV
OHYHOHNEHQ
PLQGNpW
YL]VJiOW
PDJ\DU
L]ROiWXP
mintázata kimutatható volt. Ezek szeULQWDMHOHQVpJPHJOHKHW
UHVWULNFLyV
VHQHJ\HGLpV
nem függ a restrikciós mintázattól. A jelenség háttere, az egyedi viselkedés magyarázata nem ismert, és az un. „levéllenyomat” (tissue printing) módszerrel sem sikerült fényt deríteni rá. Ezzel a módszerrel a spanyol izolátumok terjedésében különbséget kimutatni nem tudtunk, bár attól függetlenül, hogy az izolátumok külön-külön hasonló sebességgel WHUMHGWHN
HO
IRUGXOKDW KRJ\
HJ\WWHV
IHUW
]pVQpO
D]
HJ\LN
L]ROiWXP
gyorsabban terjed, mint a másik. Eredményeinket összeJH]YH kiszorultak
volna
az
IHOYHW
alacsonyabb
GKHW
D
NpUGpV
patogenitású
KD]iQNEDQ
tobamovírusok?
Véleményünk szerint a jelenlegi felmérésben kapott adatok ellenére ezt nem lehet kijelenteni. Figyelembe kell venni, hogy az általunk vizsgált
100
paprikák nagy része tartalmazott valamilyen rezisztenciagént (pl. Óriás-L1, HRF-L1
8J\DQFVDN HOPRQGKDWy KRJ\ D J\
ILDWDOMyO NDUEDQWDUWRWW pV D WHQ\pV]LG
MWpVL KHO\HN W|EEVpJpEHQ
V]DN HOHMpQOpY
iOORPiQ\W WDOiOWXQN
Megállapítható ugyanakkor, hogy a rezisztens fajták használatával valóban visszaszorultak
a
kevésbé
agresszív
patotípusok.
Hazánkban
a
tobamovírusok elleni rezisztencianemesítés több évtizedes múltra tekint vissza. 1985-ben még csak a fajták 10%-a rendelkezett valamilyen tobamovírus elleni rezisztenciagéQQHO pYYHO NpV
EE SHGLJ PiU D IDMWiN
mintegy egyharmada. A közelmúltban (Gáborjányi et al. 1999) végzett vizsgálatok szerint pedig már csak a termesztett fajták ötöde nem rendelkezett valamiféle ellenállósággal. Gáborjányi et al. (1999) felmérése szeriQW
D
N|]WHUPHV]WpVEHQ
HO
IRUGXOy
IDMWiN
IHOH
WDUWDOPD]WD
D]
/
1
rezisztenciagént, 22%-uk pedig még ennél is magasabb fokú rezisztenciával W
QW NL $ QHPHVtW
N PXQNiMiQDN pV D UH]LV]WHQV IDMWiN KDV]QiODWiQDN
eredményeként tehát sikerült visszaszorítani a P0 patotípusú dohány-, és SDUDGLFVRP
PR]DLN
JRQGR]RWW
YDJ\
YtUXVRNDW GH
IRJpNRQ\
NHOO
HQ
iOORPiQ\RNEDQ
D
PLQGHQ EL]RQQ\DO D QHP
IDMWiNDW
WHUPHV]W
házikertekben még mindig jelen vannak. Erre utal egy pár éve végzett IHOPpUpV LV DPHO\ V]HULQW D EHJ\
MW|WW
minták 27 %-a tartalmazta e két
vírus valamelyikét (Gáborjányi et al. 1997). A jelek szerint tehát Magyarországon is lezajlottak azok a SDWRJHQLWiVEHOL YiOWR]iVRN PHO\HN D WREDPRYtUXVRNUD MHOOHP] HN +D
ugyanis huzamosabb ideig egy bizonyos rezisztenciagéQQHO
UHQGHONH]
paprikafajtát termesztünk, megfigyelhetjük azt a jelenséget, hogy a tobamovírus áttöri a rezisztenciát, vagyis egy agresszívebb, nagyobb patogenitású törzse jelenik meg. Betti et al. (1986, 1988) szerint Olaszországban az évek során egyre n|YHNY
WHUPpVYHV]WHVpJHN RND D
tobamovírusok virulenciájának fokozott növekedése volt. Ha egyetlen
101
TMV (P0
L]ROiWXPRW
HOOHQ
+
U]|WW
N|UOPpQ\HN
N|]|WW
W|EEV]|U|V
1
passzálással tartottak fenn L /L heterozigóta növényeken, kimutatható volt az L1 rezisztencia áttörése. Hasonlóképpen, magasabb patogenitású L]ROiWXPRNIHMO
GWHNKDDYtUXVW|U]VHWPDJDVDEEUH]LV]WHQFLDIRN~ /
1
vagy
2
L ) növényeken sorozatosan passzálták. Tehát a PMMoV P1,2 izolátuma a paprikanövényen ismételt passzálások során P1,2,3 patotípusúvá vált. A patogenitás
növekedése
GRKiQ\Q|YpQ\HNNHO
paprikán
V]HPEHQL
ugyanakkor
FV|NNHQW
együtt
PHJEHWHJtW
járt
NpSHVVpJJHO
a $
vírustörzs fokozatosan alkalmazkodva új gazdanövényéhez, elveszítette kapcsolatát az eredeti gazdanövényével, vagyis azt a képességét, hogy 6DPVXQ GRKiQ\W IHUW
]]|Q $] HJ\PiVW N|YHW
pYHNEHQ
-1983
között) izolált törzsek egyre több termésveszteséget és a paprikán egyre súlyosabb tüneteket okoztak. Betti et al. (1988) kísérleteik során úgy tapasztalták, hogy egy TMV-3 HOQHYH]pV izolátum néhány tesztnövényen DGRWWWQHWHV]HULQWHYRO~FLyViWPHQHWLiOODSRWQDNYROWWHNLQWKHW
patotípus között. Az izolátum szerológiai változása (TMV-P-E
D30
és P1
O 300R9
-
vel lett azonos) mellett a partikulum hossza 306-ról 286 nm-re változott. Betti et al. (1988) feltételezték, hogy a paprika törzseknek és a ToMV-nek N|]|V
VH
D
709
$
SDSULND
W|U]VHN
specializálódás a Capsicum IDMRNUD Q|YHNY
N|]|V
MHOOHP] MH
YROW
D
; a szerológiai
SDWRJHQLWiVVDO
elkülönülés a TMV és a ToMV típustól; homogén csoport alkotása; valamint a partikulum hosszának csökkenése, morfológiai átalakulások következtében, melyek relatív stabil állapotokon keresztül valósultak meg. +D]iQNEDQ D SDSULNiW pUW 709 IHUW
]pV HOV
OHtUiViWyO NH]GYH
(Szirmai 1950) több kutató foglalkozott a tobamovírusokkal. A 0DJ\DURUV]iJRQL]ROiOWWREDPRYtUXVRNKHWHURJHQLWiViUDHO
V]|U
al. KtYWiN IHO D ILJ\HOPHW NLPXWDWYD KRJ\ D IHUW
]|WW SDSULNiEyO
paradicsomból,
dohányból
és
Solanum
dulcamara-ból
Burgyán et
származó
102
izolátumok mind gazdanövénykörük, mind szerológiai tulajdonságaik alapján több csoportba oszthatók, és maguk a paprikáról származó L]ROiWXPRN LV W|EE |QiOOy WtSXVW NpSYLVHOQHN $] HOV
RO\DQ WREDPRYtUXVW
amely áttörte az L1 rezisztenciagént, 1982-ben izolálták ToMV-Ob néven (Csilléry és Ruskó 1980, Csilléry et al. 1983). Tóbiás és Csilléry (1983) egy ~M
709
SDSULND
W|U]V
PHJMHOHQpVpU
UH]LV]WHQFLDIRN~ SDSULNDIDMWiNDW IHUW
O
V]iPROWDN
EH
DPHO\
D]
/
1
]WH $ PLQWiNDW WHV]WQ|YpQ\HNHQ pV
szerológiai teszttel vizsgálták. Ezek alapján a
IHUW
]|WW PLQWiN SR]LWtY
reakciót adtak a TMV-SL (Samsun látens törzs) antiszérummal és az izolátumok legalább P1 patotípust képviseltek. További vizsgálatok azonban nem történtek annak a kérdésnek az eldöntésére, hogy az izolátumok P1 vagy magasabb patotípust képviseltek-e. Meg kell említeni, hogy Salamon egyik dolgozatában (1993) a PMMoV hazai izolálásáról és identifikálásáról számol be. A saját izolálású PMMoV-Nov-nak elnevezett izolátumról azonban nem közöl részletes leírást, így nem derül ki, hogy - a tesztnövény vizsgálatok mellett - milyen egyéb eredményekre alapozza azon feltételezését, hogy a PMMoV P1,2,3 patotípusú izolátumát találta meg Magyarországon. Véleményünk szerint érdemes lenne felülvizsgálni azt, hogy maga a vírus valóban jelen volt-e márpYHNNHOH]HO az
akkor
talált
izolátum
milyen
patotípust
UHQGHONH]pVQNUH iOOy DGDWRN DODSMiQ H] QHP G|QWKHW
WWLVpVD]WKRJ\
képviselt, HO
V]iPROW EH KRJ\ &VRQJUiG PHJ\pEHQ 300R9 IHUW
mert
a
Kiss (1996) arról
]WH D SDSULNiNDW D
kórokozót DAS-ELISA vizsgálatokkal azonosította. Gáborjányi et al. (1998a,b) felmérése alapján a
WREDPRYtUXVRN LVMHOHQW
V V]HUHSHWMiWV]RWWDN
a 1990-es években megfigyelt magyarországi paprikapusztulásban. A hazai viszonyok közt is bekövetkezett patogenitás emelkedésének oka azoknak a rezisztens fajtáknak a termesztése, amelyeknél a KLSHUV]HQ]LWLYLWiV QHP IHMO
GLN NL GH WHUHW DG D NyURNR]y DODFVRQ\DEE
103 V]LQW
UHSOLNiFLyMiQDN pV OHKHW
Yp WHV]L DQQDN IRNR]RWW DGDSWiOyGiViW $
SDSULNDSDWRJpQ YtUXVRN HVHWpEHQ H] D]pUW LV MHOHQW UH]LV]WHQFLDIRN HOpUpVH NYDQWLWDWtY |U|NO W|U]VHN LG
GpV
s, mert a magasabb L3
$ PDJDVDEE SDWRJHQLWiV~
YHO GRPLQiQVVi YiOKDWQDN HJ\ DGRWW SRSXOiFLyEDQ DPL HJ\HV
években - hazánkban is - súlyos járványok kiindulópontja lehet. 0XQNiQN VRUiQ HOV
NpQW MHOOH
meztük részletesen a hazai PMMoV
izolátumokat. Vizsgálataink hozzájárulnak a vírus ökológiájának és biológiájának OHKHW
VpJHW
jobb H
megismeréséhez.
NyURNR]y
WRYiEEL
Kísérleteink
megteremtik
WDQXOPiQ\R]iViKR]
a
HUHGPpQ\HLQN
felhasználhatóak a rezisztencia nemesítés során, a tobamovírusokkal V]HPEHQHOOHQiOOySDSULNDIDMWiNHO
iOOtWiVDNRU
104
6. ÖSSZEFOGLALÁS 0XQNiQN VRUiQ FpOXO W
]WN NL D KD]iQNEDQ SDSULNiQ HO
WREDPRYtUXVRN D]RQRVtWiViW *D]GDViJL MHOHQW
VpJH pV ~MV]HU
IRUGXOy
VpJH PLDWW
részletesen kívántuk jellemezni a hazai paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV) izolátumokat. pV N|]|WW PLQWHJ\ PLQWiW J\ SDSULNiUyO D] RUV]iJ NO|QE|] WHUOHWHLU
MW|WWQN WHUPHV]WHWW
O $ PLQWiNEDQ SDWROyJLDL
szerológiai, elektronmikroszkópos és molekuláris biológiai módszerekkel vizsgáltuk a tobamovírusok jelenlétét. $ EHJ\
MW|WW PLQWiN
-a tobamovírust, azon belül PMMoV-t
WDUWDOPD]RWW.O|QE|] UH]LV]WHQFLDIRN~SDSULNDIDMWiNIHUW
PMMoV szerológiai
izolátumok
P1,2 patotípusúnak
bizonyultak.
teszttel,
elektronmikroszkópos
eljárással
]pVpYHODKD]DL
DAS-ELISA és
OiQFUHDNFLy 3&5 PyGV]HUUHOLVLJD]ROWXND300R9KD]DLHO
polimeráz IRUGXOiViW
Univerzális tobamovírus és vírus-specifikus (TMV-U1, PMMoV, ObPV) primereket terveztünk a
KD]iQNEDQ
WREDPRYtUXVRN D]RQRVtWiViUD $ SULPHUHN P
HO
IRUGXOy
N|G
OHJIRQWRVDEE
NpSHVVpJpW VDMiW pV
autentikus izolátumok segítségével teszteltük. Két magyar PMMoV izolátum köpenyfehérje gén részletét klónoztuk és a nukleotid sorrendet meghatároztuk. A
V]HNYHQiOiV LV PHJHU
VtWHWWH D
PMMoV hazai jelenlétét. A két magyar izolátum szekvenciája egymással közel 100 %-os homológiát mutatott (1 nukleotid-, 0 aminosav eltérés). A kapott szekvenciákat tovább elemeztük, összehasonlítottuk az adatbankban található egyéb – spanyol, japán, koreai, brazil, taiwani és olasz - PMMoV szekvenciákkal. Nukleotid szinten a magyar izolátumok 94-99%-os, aminosav szinten 95-100 %-os hasonlóságot mutattak a külföldi PMMoV izolátumokkal.
105
A köpenyfehérje gén szakasz alapján filogenetikai törzsfát szerkesztettünk. A törzsfán a magyar izolátumok a három jyO HONO|QtWKHW
csoport egyikébe sem tartoztak, legközelebb egyes koreai és a japán izolátumokhoz álltak. A magyar PMMoV izolátumok restrikciós enzim analízisekor a Tenllado et al. (1997) által kidolgozott módszert alkalmaztuk. Ennek során a TaqI restrikciós endonukleázt használtuk, és az enzimmel történt hasítás után kapott mintázatot elemeztük. Mindhárom vizsgált hazai izolátum a P1,2 SDWRWtSXVUD MHOOHP] ,
-es hasítási típusba tartozott, azon belül a I1 altípusra
és az I2DOWtSXVUDMHOOHP] .HYHUWIHUW
PLQWi]DWLVHO
IRUGXOW
]pVHVNtVpUOHWHNHWYpJH]WQNDPDJ\DU .'
-63, KD-2) és
a spanyol (174, 219) izolátumokkal egyaránt. A spanyol izolátumokkal YpJ]HWW YL]VJiODWRN VRUiQ D NHYHUW IHUW
]pV
OHYHOHNEHQ FVDN D
-es
izolátum mintázatát tudtuk kimutatni, az mintegy „kiszorította” a 174-es izolátumot. Ezzel szemben a magyar izolátumokkal végzett kísérlet során a IHUW
]|WWOHYHOHNEHQPLQGNpWL]ROiWXPPLQWi]DWDNLPXWDWKDWyYROW
A jelenség magyarázata nem ismert. Úgy gondoltuk, hogy talán a 219-es izolátum gyoUVDEEDQ NpSHV WHUMHGQL D IHUW
]|WW OHYHOHNEHQ PLQW D
174-es. Hogy ezt megtudjuk, az izolátumok terjedését vizsgáltuk tissue printing módszerrel. Ezzel a módszerrel az izolátumok terjedésében nem tapasztaltunk lényeges különbséget, ezzel tehát nem magyarázhatjuk a megfigyeléseket. A felmérések során a P1,2 patotípusú tobamovírus izolátumok elterjedését, ugyanakkor a P0 és P1 patotípusú izolátumok visszaszorulását figyeltük meg. A PMMoV patogenitása magas (P1,2 vagy P1,2,3). Jelenléte a hazai paprikatermesztésben új járványtani kérdéseket vet fel, különös tekintettel DUUDKRJ\DNyURNR]yDIHUW
]|WWQ|YpQ\HNPDJMiYDOLVWHUMHG$
PHJIHOHO
]pVV]HPSRQWMiEyOLVIRQWRVLVPHUQL
IDMWDYiODV]WiVKR]pVDPHJHO
106
a vírus patológiai tulajdonságait. Az általunk végzett kísérletek hozzájárulnak a vírus biológiájának és ökológiájának jobb megismeréséhez.
107
7. ÚJ, TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK
1.
pV N|]|WW YtUXVIHUW SDSULNDPLQWiW J\ EHJ\
]pVUH XWDOy WQHWHNHW PXWDWy
MW|WWQN 0DJ\DURUV]iJ NO|QE|] WHUOHWHLU
MW|WW PLQWiNEyO YDJ\LV D PLQWiN
O $
-a a patológiai
vizsgálatok során lokális léziót adott a Nicotiana tabacum cv. XanthiQF
WHV]WQ|YpQ\HNHQ
6]LV]WHPLNXV
WQHWHN
QHP
IHMO
GWHN
DPL
tobamovírusok jelenlétére utalt. 2. Ez a 45 izolátum lokális tüneteket nem okozott a Nicotiana tabacum cv. Samsun tesztnövényeken. A ferW MHOH]YHKRJ\DIHUW
]pV OiWHQVHQ V]LV]WHPL]iOyGRWW
]pVHNHWQHPD709N|]|QVpJHVW|U]VHRNR]WD
Az izolátumok lokális tüneteket nem okoztak, de szisztemikus tarkulás, PR]DLNIROWRVViJRW
HO
LGp]WHN
D]
/
+
, L1 és L2 rezisztenciagént
tartalmazó paprikafajtákon.
/RNiOLVWQHWNpQWKLSHUV]HQ]LWtYUHDNFLyWpVV]LNOHYpOKXOOiVWLGp]WHNHO
a L3 és L4
UH]LV]WHQFLDIRN~ SDSULNiNRQ GH D IHOV
QHP LQRNXOiOW
levelek tünetmentesek maradtak. Néhány esetben az L3 paprikákon szisztemikus tünetként szár- pUQHNUy]LV IHMO
G|
tt, a növény elpusztult.
$ NO|QE|] UH]LV]WHQFLDIRN~ SDSULNDIDMWiN IHUW SDWRWtSXViQDNHO
]pVH D 300R9 31,2
IRUGXOiViWLJD]ROWD
3. A vizsgált 45 izolátumból 44 pozitív reakciót adott a DAS-ELISA vizsgálat során a PMMoV antiszérummal, és negatív reakciót adott a TMV és a ToMV antiszérummal.
Szerológiai módszerekkel igazoltuk a paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle virus, PMMoV) P1,2 patotípusú izolátumának HO
IRUGXOiViW0DJ\DURUV]iJRQ
4. Az elektronmikroszkópos vizsgálat során az irodalmi adatokkal meJHJ\H]
HQNE
×20 nm-es virionokat figyeltünk meg.
108
5. Univerzális tobamovírus és PMMoV, TMV-U1, ObPV vírus-specifikus primereket
terveztünk
YL]VJiODWWDOW|UWpQ
$
3&5
a
hazai
tobamovírus
izolátumok
PCR
D]RQRVtWiViUD
YL]VJiODWRNNDO
PHJHU
VtWHWWN
D
300R9
jelenlétét a
mintákban. 6.
(OYpJH]WN
NpW
iOWDOXQN
J\
MW|WW
L]ROiWXP
.'
-63,
KD-68)
köpenyfehérje gén 396 bázis hosszúságú szakaszának nukleotidsorrend meghatározását.
A két magyar izolátum (KD-63 és KD-68) egyetlen nukleotidban különbözött
egymástól
a
vizsgált
szakaszon,
az
aminosav
szekvenciájukban eltérés nem volt. 7. A kapott szekvenciákat összehasonlítottuk összesen 17, eddig leírt olasz, koreai, spanyol taiwani, brazil és japán PMMoV izolátum szekvenciájával, amelyek a szekvencia adatbankban megtalálhatók.
Nukleotid sorrendjüket tekintve a magyar izolátumok 94-99 %-os homológiát mutattak a külföldi izolátumokkal.
Aminosav sorrendjüket tekintve a magyar izolátumok 95-100 %-os homológiát mutattak a külföldi izolátumokkal.
8. A köpenyfehérje gén szakasz alapján készített filogenetikai törzsfában a magyar izolátumok a három csoporttól elkülönültek, legközelebb egyes japán és koreai izolátumok csoportjához álltak. 9. TaqI restrikciós endonukleázzal hasítottuk a PCR termékeket és a kapott mintázatokat értékeltük.
Mindhárom vizsgált magyar izolátum a P1,2SDWRWtSXVUDMHOOHP] mintázatot adta, köztük az I1 és az I2 DOWtSXVLVHO
10.
.HYHUWIHUW
IRUGXOW
]pVHVNtVpUOHWHNHWYpJH]WQNDPDJ\DUpVDVSDQ\RO
PMMoV izolátumokkal.
,
109
$NHYHUWIHUW
]pV
OHYHOHNEHQPLQGD.'
-2, mind a KD-63 izolátum
restrikciós mintázata kimutatható volt. Ezzel szemben a spanyol L]ROiWXPRNNDOW|UWpQWNtVpUOHWHVHWpEHQDNHYHUWIHUW
]pV
OHYHOHNEHQ
csak a 219-es izolátum restrikciós mintázatát tudtuk kimutatni, a 174esét nem. A „szövet-lenyomat” (tissue printing) vizsgálatok során a spanyol izolátumok növényen belüli terjedésének sebességében különbséget nem tapasztaltunk.
110
8. NEW RESULTS
1. 130 samples showing virus symptoms were collected between 1999 and 2001 from pepper plants in different parts of Hungary. 45 of these samples (35 %) gave local lesions on Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc plants, but caused no systemic symptoms, suggesting a tobamovirus infection.
The 45 isolates did not cause local symptoms on Nicotiana tabacum cv. Samsun host-plants, but latent systemic infection was observed, indicating that the infections were not caused by the TMV common strain.
2. The isolates gave no local lesions, but caused systemic mottling, mosaic on the pepper plants of L+, L1 and L2 resistance level.
As a local symptom, the isolates caused hypersensitive reaction and abscission on the pepper plants of L3 and L4 resistance level, but the upper, non-inoculated leaves remained symptomless. In some cases stem-, and vein-necrosis developed as a systemic symptom on the L3 pepper plants. Infection of the pepper plants with different resistance level proved the presence of the PMMoV isolate of P1,2 pathotype.
3. 44 out of the 45 isolates examined gave positive reaction with the PMMoV antiserum and gave negative reaction with the TMV and ToMV antisera during the DAS-ELISA serological tests.
The presence of the Pepper mild mottle virus (PMMoV) belonging to the P1,2 pathotype was supported by serological methods as well.
4. During the electron microscopic studies virions were observed with a size of 320×20 nm, similarly to the literary data.
111
5. Universal tobamovirus and PMMoV, TMV-U1 and ObPV virusspecific primers were designed for the identification of the Hungarian tobamovirus isolates by PCR.
The presence of the PMMoV in the samples was confirmed by the PCR method.
6. The nucleotide sequence of a 396 base long fragment of the CP gene was determined in the case of two Hungarian isolates (KD-63 and KD68).
The two Hungarian isolates (KD-63 and KD-68) differed in only one nucleotide, while their amino acid sequence corresponded to each other.
7. The sequences determined were compared to the sequences of totally 17, Italian, Korean, Spanish, Taiwanean, Brazil and Japanese PMMoV isolates found in the sequence database.
The Hungarian isolates showed a similarity of 94-99 % to the foreign isolates considering their nucleotide sequence.
The Hungarian isolates showed a similarity of 95-100 % to the foreign isolates considering their amino acid sequence.
8. In the phylogenetic tree based on the CP fragment the Hungarian isolates were separated from the three groups, they had more qualities in common with certain Japanese and Korean isolates, than with other ones. 9. The PCR products were restricted with TaqI restriction enzyme and the patterns were analysed.
The three Hungarian isolates examined gave a pattern ‘I’ when restricted with the restriction enzyme TaqI. Both the subtype I1. and I2 were found among the Hungarian isolates.
112
10. Mixed infections were carried out with the Hungarian and Spanish PMMoV isolates.
In the mixed-infected leaves both the restriction pattern of KD-2 and KD-63 could be detected. In contrast with that in the mixed-infections carried out with the Spanish isolates only the restriction pattern of the isolate 219 could be detected, the pattern of the isolate 174 could not. During the tissue printing examinations no difference was detected in the spread of the different isolates in plants.
113
9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton is szeretném megköszöQQLD7|NpOHWHV7pPDYH]HW
PQHN'U
Gáborjányi Richardnak, hogy egyetemi éveim óta tanít és mindenben WiPRJDW
YROW D] DNL IHONHOWHWWH EHQQHP D] pUGHNO
GpVW D YLUROyJLD
tudománya iránt, és annak alapjaira megtanított. Szeretném megköszönni a rengeteg segítséget Dr. Palkovics /iV]OyQDN DNL |Q]HWOHQO LG
W pV IiUDGViJRW QHP NtPpOYH WDQtWRWW 7
OH
tanultam a molekuláris biológia alapjait. Köszönöm Dr. Horváth József akadémikusnak, hogy az általa YH]HWHWW'RNWRULLVNROiEDQOHKHW
Vizsgálataim
VpJHWWHUHPWHWWDPXQNiPKR
legnagyobb
részét
az
.XWDWyLQWp]HWpEHQYpJH]WHP.|V]|Q|P'U.
MTA
z.
Növényvédelmi
PtYHV7DPiVQDND],QWp]HW
igazgatójának, hogy kísérleteimhez helyet és felszereltséget biztosított. $ PROHNXOiULV ELROyJLDL YL]VJiODWRNDW D J|G|OO
L 0H] JD]
dasági
Biotechnológiai Központban folytattam. Köszönöm Dr. Balázs Ervin DNDGpPLNXVQDNKRJ\HKKH]DPXQNiKR]OHKHW
VpJHWWHUHPWHWW
A távolból köszönöm Dr. Jose-Ramón Díaz-Ruíznak, Dr. Francisco Peralo Tenlladonak és Dr. Dionisio López Abellának, hogy Madridban IRJDGWDN pV OHKHW
Yp WHWWpN KRJ\ KyQDSRW D ODERUDWyULXPEDQ W|OWVHN ~M
módszereket tanuljak és az ott folyó kutatásokba bekapcsolódjam. Köszönöm az MTA Növényvédelmi Intézetében mindenkinek, HOV
VRUEDQD9LUROyJLDL&VRSRUWPXQNDWiUVDLQDNDJ|G|OO
Biotechnológiai
Központ
Virológiai
Csoportjának,
L0H] JD]GDViJL
a
keszthelyi
Növényvédelmi Intézet Virológiai Csoportjának, valamint a madridi Centro de
Investigaciones
munkámat segítették.
Biológicas-ban
megismert
kollegáimnak,
hogy
114
Köszönetemet fejezem ki Kassai Tamásnak és Tornyai Tibornak, a Szent István Egyetem oktatóinak, és mindenkinek, aki az izolátumok EHJ\
MWpVpEHQVHJtWHWW
Köszönöm
Dr.
Bóka
Károlynak
az
elektronmikroszkópos
vizsgálatokban nyújtott segítségét.
Végül, de nem utolsó sorban szeretném megköszönni V]OHLPQHN|FVpPQHNFVDOiGRPQDNEDUiWDLPQDNpVOHJI
NpSSHQ
Tibinek, hogy mindenben számíthattam, és számíthatok rájuk.
115
9. IRODALOMJEGYZÉK
Alexandre, M. A. V., Soares, R. M., Rivas, E. B., Duarte, L. M. L., Chagas, C. M., Saunal, H., Van Regenmortel, M. H. V., Richtzehain, L. J. (2000): Characterization of a strain of tobacco mosaic virus from Petunia. J. Phytopathology 148:601-607. Alonso, E., García Luque, I., Avila-Rincón, M. J., Wicke, B., Serra, M. T., Díaz-Ruíz, J. R. (1989): A tobamovirus causing heavy losses in protected pepper crops in Spain. J. Phytopathology 125:67-76. Alonso, E., García-Luque, I., De la Cruz, A., Wicke, B., Avila-Rincón, M. J., Serra, M. T., Castresana, C., Díaz-Ruíz, J. R. (1991): Nucleotide sequence of the genomic RNA of pepper mild mottle virus, a resistance-breaking tobamovirus in pepper. J. Gen. Virol. 72:2875-2884. Altschul, D., Stephen, F., Thomas, L., Madden, S., Alejandro, A., Schäffer, T., Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, D., Lipman, J. (1997): Gapped BLAST and PSI-BLAST: A new generation of protein database search programs. Nucleic Acid Research 25: 3389-3402. Arteaga, L. M., Ortega, G. R. (1981): Primeras observaciones de “cepas pimiento” del TMV en pimiento. Información Técnica Economica Agraria 42:27-32. Avgelis, A. D. (1986): A pepper strain of TMV who is new in Crete (Greece). Phytopath. Medit. 25:33-38. Avila-Rincón, M. J., Ferrero, M. L., Alonso, E., García-Luque, I., DíazRuíz, J. R. (1989): Nucleotide sequences of 5’ and 3’ non-coding
116
regions of pepper mild mottle virus strain S RNA. J. Gen. Virol. 70:3025-3031. Baulcombe, D. C. (1996): Mechanisms of pathogen-derived resistance to viruses in transgenic plants. The Plant Cell 8:1833-1844. Baulcombe, D. C., English, J. J. (1996): Ectopic pairing of homologous DNA and post-transcriptional gene silencing in transgenic plants. Curr. Opin. Biotechnol. 5:117-124. Beachy, N. R., Abel, P., Melvin, J. O., Barun, D., Fraley, R. T., Rogers, B. B., Horsch, R. B. (1985): Potential for applying genetic transformation to studies of viral pathogenesis and cross-protection. In: Zaitlin, M., Day, P., Hollander, A., Wilson, C. (eds): Biotechnology in Plant Science. Academic Press, Orlando, 1985, pp. 265-275. Beczner L., Salamon P., Molnár B., Vassányi R. (1979): Néhány cucumovirus hazai izolátumának szimptomatológiai és szerológiai jellemzése. Agrártudományi Közlemények 38:94. Beczner, L., Rochon, D. M., Hamilton, R. I. (1997): Characterization of an isolate of pepper mild mottle tobamovirus occuring in Canada. Canadian J. Plant Pathol. 19:83-88. Bendahmane, M., Szécsi, J., Chen, I., Howard Berg, R., Beachy, R. N. (2002): Characterization of mutant tobacco mosaic virus coat protein that interferes with virus cell-to-cell movement. PNAS 99:36453650. Benner, C. P., Kuhn, C. W. (1985): Identification and incidence of pepper viruses in Northeastern Georgia. Plant Disease 69:999-1001. Bercks, R. (1967): Vorkommen und Nachweis von Viren in Reben. Weinberg, Keller 14:151-162.
117
Bercks, R. (1968): Identifizierung von Viren in Reben-Blättern auf serologischem Wege. Weinberg, Keller 15:498-500. Berzal-Herranz, A., De la Cruz, A., Tenllado, F., Díaz-Ruíz, J. R., Lopez, L., Sanz, A. I., Vaquero, C., Serra, M. T., García-Luque, I. (1995): The Capsicum L3 gene-mediated resistance against the tobamoviruses is elicited by the coat protein. Virology 209:498-505. Betti, L., Tanzi, M., Rubbini, M., Canova, A. (1982): Ricerca sul TMV de peperone. I. Caratterizzazione di vari isolati del virus. Colture protette 12:29-38. Betti, L., Tanzi, M., Canova, A. (1986): Evolutionary changes in TMV pepper strains as a result of repeated host passages. Phytopath. Medit. 25:39-43. Betti, L., Tanzi, M., Canova, A. (1988): Pepper mosaic virus strains and their adaptation to the host. I. Biological and serological behaviour. Phytopath. Medit. 27:7-17. Black, L. L., Green, S. K., Hartman, G. L., Poulos, J. M. (1991): Pepper diseases: A field guide. AVRDC Publication No. 91347. 1-98. Boukema, I. W., Jansen, K., Hofman, K. (1980): Strains of TMV and genes for resistance. Eucarpia, IVth Meeting on Genetics and Breeding on Capsicum and Eggplant, Wageningen, The Netherlands, 1980. pp. 44-48. Boukema, I. W. (1984): Resistance to TMV in Capsicum chacoense Hunz. is governed by an allele of the L-locus. Capsicum Newsletter 3:4748. Brandes, J. (1964): Identifizierung von gestreckten pflanzenpathogenen Viren auf morfologischer Grundlage. Mitt. Biol. Bundanst. Ld-u. Forstw. 110:1-30.
118
Burgyán, J., Beczner, L., Gáborjányi, R. (1978): Relationship among some
tobamoviruses.
I.
Symptomatological
and
serological
comparison. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 13:75-85. Burgyán, J., Gáborjányi, R. (1984): Cross-protection and multiplication of mild and severe strains of TMV in tobacco plants. Phytopath. Z. 110:110-156. Cappor, S. P., Sharma, D. C. (1965): „Purple leaf” disease of beet. Indian Phytopath. 18:88-89. Carr, J. P., Zaitlin, M. (1991): Resistance in transgenic tobacco plants expressing a non-structural gene sequence of tobacco mosaic virus is a consequence of markedly reduced virus replication. Mol. PlantMicrobe Interact. 4:579-585. Chessin, M., Zaitlin, M., Solberg, R. A. (1967): A new strain of tobacco mosaic virus from Lychnis alba. Phytopathology 57:452-453. Clark, M. F., Adams, A. N. (1977): Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34:475-483. Clinton (1909): Rep. Conn. Agric. Exp. Stn. 1907-1908. pp. 854. Conti, M., Masenga, V. (1977): Identification and prevalence of pepper viruses in Northwest Italy. Phytopath. Z. 90:212-222. Culver, J. N., Dawson, W. O. (1991): Tobacco mosaic virus elicitor coat protein genes produce a hypersensitive phenotype in transgenic Nicotiana sylvestris plants. Mol. Plant-Microbe Interact. 4:458-463. Culver, J. N., Lindbeck, A. G. C., Dawson, W. O. (1991): Virus-host interactions: Induction of chlorotic and necrotic responses in plants by tobamoviruses. Ann. Rev. Phytopathol. 29:193-217.
119
Culver, J. N., Stubbs, G., Dawson, W. O. (1994): Structure-function relationship between tobacco mosaic virus coat protein and hypersensitivity in Nicotiana sylvestris. J. Mol. Biol. 242:130-138. Csilléry G. (1978):
$ NHUHV]WH]KHW
VpJ pV D QHPHVtWpV WDUWDOpNDL ,Q
=DW\Ny / HG 3DSULNDWHUPHV]WpV 0H] JD]GDViJL .LDGy %XGDSHVW
1979. pp. 289-290. Csilléry, G., Ruskó, J. (1980): The control of a new tobamovirus strain by linked to anthocyanin deficiency in pepper (Capsicum annuum). Eucarpia, Vth Meeting on Genetics and Breeding on Capsicum and Eggplant, Plovdiv, Bulgaria, 1980. pp. 40-43. Csilléry, G., Tóbiás, I., Ruskó, J. (1983): A new pepper strain of tomato mosaic virus. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 18:195-200. Csilléry G. (1985): A paprikafajoNNHUHV]WH]KHW
VpJH,Q 6RPRV$ HG $
paprika. Akadémiai Kiadó, Budapest, 1985. pp. 35-43. De Carvalho, F., Gheysen, G., Kushnir, S., Van Montagu, M., Inze, D., Castresana, C. (1992): Supression of β-1,3-glucanase transgene expression in homozygous plants. EMBO J. 11:2595-2602. De Carvalho, F., Frendo, P., Montagu, M. V., Cornelissen, M. (1995): Post-transcriptional cosupression of β-1,3-glucanase genes does not affect accumulation of transgene nuclear mRNA. Plant Cell 7:347358. Dehio, C., Schell, J. (1994): Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5538-5542. De la Cruz, A., Lopez, L., Tenllado, F., Díaz-Ruíz, J. R., Sanz, A. I., Vaquero, C., Serra, M. T., García-Luque, I. (1997): The coat protein is required for the elicitation of the Capsicum L2 gene-
120
mediated resistance against the tobamoviruses. Mol. Plant-Microbe Interact. 10:107-113. Demski, J. W. (1981): Tobacco mosaic virus is seedborne in pimiento pepper. Plant Disease 65:723-724. Dinesh-Kumar, S. P., Whitham, S., Choi, D., Hehl, R., Corr, C., Baker, B. (1995): Transposon tagging of tobacco mosaic virus resistance gene N: Its possible role in the TMV-N-mediated signal transduction pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4175-4180. Dorlhac de Borne, F., Vincentz, M., Chupeau, Y., Vaucheret, H. (1994): Co-supression of nitrate reductase host gene and transgenes in transgenic tobacco plants. Mol. Gen. Genet. 243:613-621. Edelbaum, O., Ilan, N., Grafi, G., Sher, N., Stram, Y., Novick, D., Tal, N., Sela, I., Rubenstein, M. (1990): Two antiviral proteins from tobacco: Purification and characterization by monoclonal antibodies to human β-interferon. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:588-592. Edwardson, J. R., Christie, R. G. (1997): Viruses infecting peppers and other Solanaceous crops. Univ. of Florida. Monograph 18-I and II. pp.766. Elmer, O. H. (1960): Etiology and characteristics of sweetpotato mosaic. Phytopathology 50:744-749. Faccioli, G. (1966): Identificazione di due virus isolati da Polypodium vulgare e Scolopendrium vulgare Sm. Atti Primo Congr. Unione Fitop. Medit., Bari-Napoli, 1966. pp. 562-568. Faccioli, G., Paul, H. L. (1967): Vergleichende Untersuchung von vier Isolaten des Tabakmosaik virus aus dem mediterranen Raum. Phytopath. Medit. 6:41-47. Fauquet, C., Beachy, R. N. (1992): Virus-engineered resistance: Concepts, efficacy, and stability. In: Thottappilly, G., Monti, L. M.,
121
Mohan Raj, D. R., Moore, A. W. (Eds.), Biotechnology: Enhancing Research on Tropical Crops in Africa. CTA/IITA Co-Publ., IITA Ibadan, pp. 273-286. Feldman, J. M., Gracia, O., Pontis, R. E., Boninsegna, J. (1969): Effect of tobacco mosaic virus on pepper yield. Plant Dis. Rep. 53:541-543. Feldman, J. M., Oremianer, S. (1972): An unusual strain of tobacco mosaic virus from pepper. Phytopath. Z. 75:250-267. Flavell, R. B. (1994): Inactivation of gene expression in plants as a consequence of specific sequence duplication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3490-3496. Fodor, J., Gullner*ÈGiP$/%DUQD%.
PtYHV7.LUiO\=
(1997): Local and systemic responses of antioxidants to tobacco mosaic virus infection and to salicylic acid in tobacco. Plant Physiol. 114:1443-1451. Fraile, A., Escriu, F., Aranda, M. A., Malpica, J. M., Gibbs, A. J., García-Arenal, F. (1997): A century of tobamovirus evolution in an Australian population of Nicotiana glauca. Journal of Virology 71:8316-8320. Fraser, R. S. S., Loughlin, S. A. R. (1982): Effects of temperature on the Tm-1 gene for resistance to tobacco mosaic virus. Plant Pathol. 20:109-117. Friedrich, L., Lawton, K., Ruess, W., Masner, P., Specker, N. et al. (1996): A benzothiadiazole derivative induces systemic acquired resistance in tobacco. Plant Journal 10:61-70. Fukuda, M., Okada, Y., Otsuki, Y., Takebe, I. (1980): The site of initiation of rod assembly on the RNA of a tomato and a cowpea strain of tobacco mosaic virus. Virology 101:493-502.
122
Gáborjányi R., Burgyán J. (1980): Biológiai védekezés gyengített vírustörzsekkel. A rezisztencia és a vírusszaporodás kapcsolata. Növényvédelem 19:241-249. Gáborjányi R., Molnár A., Burgyán J., Salla J. (1980): Biológiai védekezés gyengített vírustörzzsel: I. A keresztvédettségi reakció kialakulása és a vírusszaporodás kapcsolata. Kertgazdaság 12:63-70. Gáborjányi R. (1986): Biológiai védekezés a növényi vírusok ellen: (OPpOHWL OHKHW
VpJHN pV J\DNRUODWL HUHGPpQ\HN 1|YpQ\WHUPHOpV
35:561-568. Gáborjányi, R., Csilléry, G., Tóbiás, I., Jenser, G. (1995a): Tomato spotted wilt virus: A new threat for pepper production in Hungary. Eucarpia, IXth Meeting on Genetics and Breeding of Capsicum and Eggplant, Budapest, Hungary, 1995. pp. 159-160. Gáborjányi R., Vasdinyei R., Almási A., Csilléry G., Ekés M. (1995b): $ SDUDGLFVRPRW SDSULNiW pV GRKiQ\W IHUW
hazai
izolátumainak
tünettani
és
]
bronzfoltosság vírus
szerológiai
jellemzése.
Növényvédelem 31:533-540. Gáborjányi R., Pogány M., Horváth J. (1997): A vírusok szerepe a paprikapusztulásban. Növényvédelem 33:181-185. Gáborjányi, R., Horváth, J., Kovács, J., Kazinczi, G. (1998a): Role of viruses in pepper decline in Hungary. Eucarpia, Xth Meeting on Genetics and Breeding of Capsicum and Eggplant, Avignon, France, 1998. pp. 129-132. Gáborjányi, R., Horváth, J., Kovács, J., Kazinczi, G. (1998b): Role of virus- and phytoplasma infections in pepper decline in Hungary: an overview. Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 33:261-268. Gáborjányi R. (1999):
$
YtUXVJHQRP
V]HUYH]
GpVH
pV
D
YtUXVRN
replikációja. In: Horváth J. és Gáborjányi R. (eds): Növényvírusok és
123
virológLDL YL]VJiODWL PyGV]HUHN 0H]
JD]GD .LDGy %XGDSHVW
pp. 216-242. Gáborjányi
R.,
Almási
HOOHQiOOyNpSHVVpJH IHUW
A.,
Kálmán
NO|QE|]
D.
(1999):
SDWRJHQLWiV~
]pVpYHOV]HPEHQ.HUWJD]GDViJ
Paprikafajták WREDPRYtUXVRN
-14.
García-Luque, I., Serra, M. T., Alonso, E., Wicke, B., Ferrero, M. L., Díaz-Ruíz, J. R. (1990): Characterization of a Spanish strain of pepper mild mottle virus (PMMV-S) and its relationship to other tobamoviruses. J. Phytopathology 129:1-8. García-Luque, I., Ferrero, M. L., Rodríguez, J. M., Alonso, E., De la Cruz, A., Sanz, A. I., Vaquero, M. T., Serra, M. T., Díaz-Ruíz, J. R. (1993): The nucleotide sequence of the coat protein genes and 3’ non-coding regions of two resistance-breaking tobamoviruses in pepper shows that they are different viruses. Arch. Virol. 131:75-88. Gibbs, A. (1999): Evolution and origins of tobamoviruses. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 354:593-602. Gilmer, R. M., Kelts, L. J. (1965): Isolation of tobacco mosaic virus from grape foliage and roots. Phytopathology 55:1283. Gilmer, R. M., Wilks, J. M. (1967): Seed transmission of tobacco mosaic virus in apple and pear. Phytopathology 57:214-217. Gilmer, R. M., Kelts, L. J. (1968): Transmission of tobacco mosaic virus in grape seed. Phytopathology 58:277-278. Glaeser, G. (1976): Untersuchungen zur Frage der Samenübertragung von Paprikavirosen (Gurkenmozaikvirus und Tabakmosaik-virus). Land und Forstwirtsch. Forsch. Österreich, Bd. VII. Wien, 1976. pp. 111124.
124
Goelet, P., Lomonossoff, G. P., Butler, P. J. G., Akam, M. E., Gait, M. J., Karn, J. (1982): Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79:5818-5822. Golemboski, D. B., Lomonossoff, G. P., Zaitlin, M. (1990): Plants transformed with a tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant to the virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6311-315. Golemboski, D. B., Lomonossoff, G. P., Zaitlin, M. (1993): Plants transformed with a tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant to the virus. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87:6311-6315. Goodwin, J., Chapman, K., Swaney, S., Parks, T. D., Wernsman, E. A., Dougherty, W. G. (1996): Genetic and biochemical dissection of transgenic RNA-mediated virus resistance. Plant Cell 8:95-105. Green, S. K., Kim, J. S. (1991): Characteristics and control of viruses infecting peppers: A literature review. Technical Bulletin No 18. Asian Vegetable Research and Development Center. Taipei. 60. pp. Green, S. K., Kalloo, G. (1994): Leaf curl and yellowing viruses of pepper and tomato. An overview. Technical Bulletin No.21. Asian Vegetable Research and Development Center. Taipei. 51. pp. Greenleaf, W. H., Cook, A. A., Heyn, A. N. J. (1964): Resistance to tobacco mosaic virus in Capsicum, with reference to the Samsun latent strain. Phytopathology 54:1367-1372. Grierson, D., Fray, R. G., Hamilton, A. J., Smith, C. J. S., Watson, C. F. (1991): Does co-supression of sense genes in transgenic plants involve antisense RNA? Trends Biotechnol. 9:122-123. Guo, H. S., Cervera, M. T., García, J. A. (1998): Plum pox potyvirus resistance associated to transgene silencing that can be stabilized after different number of plant generations. Gene 206: 263-272.
125
Hamilton, R. I., Valentine, B. (1984): Infection of orchid pollen by Odontoglossum ringspot and Cymbidium mosaic viruses. Canadian J. Plant Pathol. 6:185-190. Hart, C. M., Fischer, B., Neuhaus J. M., Meins, F. (1992): Regulated inactivation of homologous gene expression in transgenic Nicotiana sylvestris plants containing a defense-related tobacco chitinase gene. Mol. Gen. Genet. 235:179-188. Hitchborn, J. H., Hills, G. J. (1965): The use of negative staining in the electron microscopic examination of plant viruses in crude extracts. Virology 27:528-540. Hobbs, S. L. A., Warkentin, T. D., Delong, C. M. O. (1993): Transgene copy number can be positively or negatively associated with transgene expression. Plant Mol. Biol. 21:17-26. Hollings, M., Huttinga, H. (1976): Tomato mosaic virus. CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses No. 156. Commonwealth Mycological Institute, Kew, England. p. 6. Horváth, J. (1967): Virulenzdifferenzen verschiedener Stämme und Isolate des Kartoffel-Y-Virus an Capsicum–Arten und Varietäten. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 1:333-352. Horváth J. (1969): Adatok a paprikafajták vírusokkal szembeni fogékonyságához és a paprikapatogén vírusok differenciálásához. Növénytermelés 18:79-88. Horváth J., Beczner L. (1973):
$
SDUDGLFVRP
SiIUiQ\OHYHO
VpJ
etiológiája. I. Uborka mozaik vírus és dohány mozaik vírus izolálása pVIHUW
]pVLNtVpUOHWHN1|Y
énytermelés 22:223-229.
Horváth J. (1981): Újabb adatok a növények vírusfogékonyságáról. 1. Solanaceae (Capsicum, Datura, Nicotiana, Petunia és Scopolia fajok). Bot. Közl. 68:181-185.
126
Horváth J. (1983): Újabb adatok a Capsicum-fajok vírusfogékonyságához és vírusrezisztenciájához. Növényvédelem 19:352. Horváth, J., Beczner, L. (1983): Viruses of vegetable plants in Hungary and some of their properties. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 18:237-254. Horváth, J. (1986a): Compatible and incompatible relations between Capsicum species and viruses. Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 21:35-49. Horváth, J. (1986b): Compatible and incompatible relations between Capsicum species and viruses. III. New incompatible host-virus relations (resistant and immune plants). Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 21:59-62. Horváth, J. (1986c): Compatible and incompatible relations between Capsicum species and viruses. III. New compatible host-virus relations (susceptible plants). Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 21:51-58. Igwegbe, E. C. K. (1983): Some properties of a tobacco mosaic virus strain isolated from pepper (Capsicum annuum) in Nigeria. Plant Disease 67:317-320. Igwegbe, E. C. K., Ogungbade, O. K. (1985): Evaluation of pepper cultivars under greenhouse conditions for resistance to a defoliation strain of tobacco mosaic virus. Plant Disease 69:899-900. Iino, Y, Sugimoto, A., Yamamoto, M. (1991): S. pmbe pac1+, whose overexpression inhibits sexual development, encodes a ribonuclease III-like Rnase. EMBO J. 10:221-226. Ikeda, R., Watanabe, E., Watanabe, Y., Okada, Y. (1993): Nucleotide sequence of tobamovirus Ob which can spread systemically in N gene tobacco. J. Gen. Virol. 74:1939-1944.
127
Inbar, M., Doostdar, H., Sonoda, R. M., Leibee, G. L., Mayer, R. T. (1998): Elicitors of plant defensive systems reduce insect densities and disease incidence. Journal of Chemical Ecology 24:135-149. Ishikawa, M., Meshi, T., Watanabe, Y., Okada, Y. (1988): Replication of chimeric tobacco mosaic viruses which carry heterologous combinations of replicase genes and 3’ non-coding regions. Virology 164:290-293. Iwanowski, D. (1892): Izv. Imp. Akad. Nauk. 35:67. Jankulova, M. (1970): Nachweis des Tabak-Mosaik-Virus an der Rebe in Bulgarien. Dokl. Akad. sel’-Khoz, Nauk Bolg. In: Rev. Plant Path. 50:843. Johnson, E. M. (1930): Virus diseases of tobacco in Kentucky. In: Ky. Agric. Exp. Stn. Bull. pp. 285-415. Johnson, J. (1947): Virus attenuation and the separation of strains by specific hosts. Phytopathology 37:822-837. Jorgensen, R. (1992): Silencing of plant genes by homologous transgenes. Agbiotechnol. News Info. 4:265-273. Kajati I., Kádár A. (1972): A szentesi paprikatermesztés problémáival kapcsolatban az 1972-es évben végzett vizsgálatok tapasztalatai. Növényvédelem 10:20-31. Kálmán D., Gáborjányi R. (1998): A szalicilsav és a BTH hatása a dohánynövények IHUW
dohány
mozaik
vírussal
szembeni
]pVIRJpNRQ\ViJiUDpVEHWHJVpJ
-ellenállóságára. Növényvédelem
34:593-600. Kálmán D., Kassai T., Tornyai T., Gáborjányi R. (2000): A paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle tobamovirus, PMMoV) új patotípusa Magyarországon. Növényvédelem 36:613-618.
128
Kálmán, D., Palkovics, L., Gáborjányi, R. (2001): Serological, pathological and molecular characterisation of Hungarian pepper mild mottle tobamovirus (PMMoV) isolates. Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 36:31-42. Keith, J., Fraenkel-Conrat, H. (1975): Tobacco mosaic virus RNA carries 5’-terminal triphosphorylated guanosine blocked by 5’-linked 7-methylguanosine. FEBS Letter 57:31-33. Kessmann, H., Staub, T., Hofmann, C., Maetzke, T., Herzog, J., Ward, E., Uknes, S., Ryals, J. (1994): Induction of systemic acquired disease resistance in plants by chemicals. Ann. Rev. Phytopathol. 32:439-454. Khurana, S. M. P., Singh (1971): A strain of tobacco mosaic virus inciting disease in Boerhaavia diffusa L. Phytopath. Z. 71:183-187. Kirpatrick, H. C., Lindner, R. C. (1964): Recovery of tobacco mosaic virus from apple. Plant Dis. Rep. 48:855-57. Kiss, F. E. (1996): Virus diseases of greenhouse pepper in South Hungary. International
Workshop
on
Biological
and
Integrated
Pest
0DQDJHPHQW LQ *UHHQKRXVH 3HSSHU +yGPH] YiViUKHO\ S
119. Knight, C. A., Silva, D. M., Dahl, D., Tsugita, A. (1962): Two distinctive strains of tobacco mosaic virus. Virology 16:236-243. Knorr, D. A., Dawson, W. O. (1988): A point mutation in the tobacco mosaic virus capsid protein gene induce hypersensitivity in Nicotiana sylvestris. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:170-174. Köhler, E., Panjan, M. (1943): Das Paramosaikvirus der Tabakpflanze. Ber. Dtsch. Bot. Ges. 61:175-180.
129 .
PtYHV 7 )RGRU - *XOOQHU * .LUiO\ =
The resistance
inducer "BTH" affects glutathione-related antioxidants in plants. VIII. Keszthelyi Növényvédelmi Fórum, Keszthely, 1998. p. 26. Lim, P. O., Ryu, J. S., Lee, H. J., Lee, U., Park, Y. S., Kwak, J. M., Choi, J. K., Nam, H. G. (1997): Resistance to tobamoviruses in transgenic tobacco plants expressing the coat protein gene of pepper mild mottle virus (Korean isolate). Mol. Cells 7:313-319. Linhart MH]
Gy.,
Mezey
Gy.
JD]GDViJL6]HPOH
(1890):
A
dohány
mozaikbetegsége.
-10.
Loebenstein, G., Gera, A. (1981): Inhibitor of virus replication released from tobacco mosaic virus infected protoplasts of a local lesionresponding tobacco cultivar. Virology 114: 132-139. Lomonossoff, G. P. (1995): Pathogen-derived resistance to plant viruses. Ann. Rev. Phytopathol. 33:323-343. Lynch, M. R., Burger, R., Butcher, D., Gabriel, W. (1993): The mutational meltdown in asexual populations. J. Hered. 84:339-344. Makkouk, K., Gumpf, K. (1974): Further identification of naturally occuring virus diseases of pepper in California. Plant Dis. Rep. 58:1002-1006. Marano, M. R., Baulcombe, D. (1998): Pathogen-derived resistance targeted against the negative strand RNA of tobacco mosaic virus: RNA strandspecific gene silencing? Plant J. 13:537-546. Marthur, S. B., Mishra, M. D., Tiwari, V. P. (1966): A new strain of tobacco mosaic virus affecting chilli pepper variety Puri Orange. Plant Dis. Rep. 50:619-622. Martin, E. B. (ed.) (1968): Plant virus names. Commonwealth Mycological Institute, Phytopath. Papers No. 9, Kew, Surrey, England. 204 pp.
130
Matzke, A. J. M., Neuhuber, F., Park, Y. D., Ambros, P. F., Matzke, M. A. (1994): Homology-dependent gene-silencing in transgenic plants: Epistatic silencing loci contain multiple copies of methylated transgenes. Mol. Gen. Genet. 244:219-229. Mayer, A. (1886): Über die Mosaikkrankheit des Tabaks. Landwirtsch. Vers. Sta. 32:451-467. McKinney, H. H. (1929): Mosaic diseases in Canary Islands, West Africa and Gibraltar. J. Agric. Res. 39:557-558. McKinney, H. H. (1952): Two strains of tobacco mosaic virus, one of which is seed-borne in an etch-immune pungent pepper. Plant Dis. Rep. 36:184-187. McKinney, H. H. (1968): Further study of the latent strain of the tobacco mosaic virus. Plant Dis. Rep. 52:919-922. Meshi, T., Motoyoshi, F., Adachi, A., Watanabe, Y., Takamatsu, N., Okada, Y. (1988): Two concomitant base substitutions in the putative replicase genes of tobacco mosaic virus confer the ability to overcome the effects of a tomato resistance gene. EMBO J. 7:15751581. Meshi, T., Motoyoshi, F., Maeda, T., Yoshiwoka, S., Watanabe, H., Okada, Y. (1989): Mutations in the tobacco mosaic virus 30-kD protein gene overcome Tm-2 resistance in tomato. Plant Cell 1:515522. Meyer, P. Heidmann, I., Niedenhof, Y. (1993): Differences in DNAmethylation are associated with a paramutation phenomenon in transgenic petunia. Plant J. 4:89-100. 0H]
JD]GDViJL 6WDWLV]WLNDL eYN|Q\Y
Statisztikai Hivatal, Budapest, 2001.
(szerk. Fenyvesi L). Központi
131
Michon, E. (1982): Virus, pollen, pollines. Rev. Cytol. Biol. Veget.-Bot. 5:31-40. Milbrath, G. M., Cook, A. A. (1971): Virus diseases of pepper (Capsicum sp.) in Hawaii. Plant Dis. Rep. 55:783-785. Miller, E. D., Hemenway, C. (1998): History of coat protein-mediated protection. In: Foster, G. D. and Taylor, S. C. (Eds), Plant Virology Protocols. From Virus Isolation to Transgenic Resistance. Humana Press, Totowa, New Jersey, pp. 25-38. Miller, P. M., Thornberry, H. H. (1958): A new viral disease of tomato and pepper. Phytopathology 48:665-670. Mink, G. J. (1993): Pollen and seed transmitted viruses and viroids. Ann. Rev. Phytopathol. 31:375-402. Molnár B., Tóbiás I. (1979): SDSULNDPDJYDNRQ9HW
$ YtUXViWYLWHO OHKHW
PDJJD]GiONRGiV
VpJpQHN YL]VJiODWD
-61.
Motoyoshi, F., Oshima, N. (1975): Infection with tobacco mosaic virus of leaf mesophyll protoplasts from susceptible and resistant lines of tomato. J. Gen. Virol. 29:81-91. Motoyoshi, F., Oshima, N. (1977): Expression of genetically controlled resistance to tobacco mosaic virus infection in tomato leaf mesophyll protoplasts. J. Gen. Virol. 34:499-506. Nagai, Y., Takeuchi, T., Tochihara, H. (1981): A new mosaic disease of sweet pepper caused by pepper strain of tobacco mosaic virus. Ann. Phytopath. Soc. Japan. 47:541-546. Nagai, Y., Fukami, M. (1986): Bulletin of the Faculty of Education. Chiba University, Chiba. III. Natural Sciences 27:153. Nagai, Y. (1988): Control of seed-borne tobacco mosaic on tomato and sweet pepper by chemical and physical treatments. Proceedings of
132
the 5th International Congress of Plant Pathology, Kyoto, Japan, 1988. p. 405. Neuhuber, F., Park, Y. D., Matzke, A. J. M. Matzke, M. A. (1994): Susceptibility of transgene loci to homology-dependent gene silencing. Mol. Gen. Genet. 244:230-241. Nienhaus, F. (1971): Tobacco mosaic virus strains extracted from conidia of powdery mildews. Virology 46:504-505. Padgett, H. S., Beachy, R. N. (1993): Analysis of tobacco mosaic virus strain capable of overcoming N gene-mediated resistance. Plant Cell 5:577-586. Paludan, N. (1982): Virus attack in Danish cultures of sweet pepper (Capsicum annuum L.) especially concerning tobacco mosaic virus. Acta Hort. 127:65-77. Pares, R. D. (1985): A tobamovirus infecting Capsicum in Australia. Ann. Appl. Biol. 106:469-474. Pares, R. D., Gunn, L. V. (1989): The role of non-vector soil transmission as a primary source of infection by pepper mild mottle and cucumber mosaic viruses in glasshouse-grown Capsicum in Australia. J. Phytopathology 126:353-360. Powell, P. A., Nelson, R. S., Hoffman, N., Rogers, S. G. (1986): Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene. Science 232:738-743. Pringle, C. R. (1998): The universal system of virus taxonomy of the International Committee on Virus Taxonomy (ICTV), including new proposals ratified since publication of the Sixth ICTV Report in 1995. Arch. Virol. 142:203-208. Rácz I. (1996): BION 50 WG növényaktivátor. Növényvédelem 32:644646.
133
Rast, A. Th. B. (1972): M-II 16, an artificial symptomless mutant of tobacco mosaic virus for seedling inoculation of tomato crops. Neth. J. Plant Pathol. 78:110-112. Rast, A. Th. B. (1975): Variability of tomato mosaic virus in relation to control of tomato mosaic in greenhouse tomato crops by resistance breeding and cross protection. Agric. Res. Rept. Wageningen 843:76. Rast, A. Th. B. (1979): Pepper strains of TMV in the Netherlands. Med. Fac. Landb. Wet. Rijksuvin. Gent 44:617-622. Rast, A. Th. B. (1985): An eggplant strain of tobacco mosaic. Med. Fac. Landb. Wet. Rijksuniv. Gent 50:1277-1280. Rast, A. Th. B (1988): Pepper tobamovirus and pathotypes used in resistance breeding. Capsicum Newsletter 7:22. Rodríguez-Cerezo, E., Moya, A., García-Arenal, F. (1989): Variability and evolution of the plant RNA virus pepper mild mottle virus. Journal of Virology 63:2198-2203. Ross, A. F. (1961a): Localized acquired resistance to plant virus infection in hypersensitive hosts. Virology 14:329-339. Ross, A. F. (1961b): Systemic acquired resistance induced by localized virus infections in plants. Virology 14:340-358. Ryals, J., Neuenschwander, U. H., Willits, M. G., Molina, A., Steiner, H. Y., Hunt, M. D. (1996): Systemic acquired resistance. Plant Cell 8:1809-1819. Saito, T., Meshi, T., Takamatsu, N., Okada, Y. (1987): Coat protein gene sequence of tobacco mosaic virus encodes a host response determinant. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6074-6077. Saito, T., Yamanaka, K., Watanabe, Y., Takamatsu, N., Meshi, T., Okada, Y. (1989): Mutational analysis of the coat protein gene of
134
tobacco mosaic virus in relation to hypersensitive response in tobacco plants with the N’ gene. Virology 173:11-20. Salamon, P., Molnár, A., Beczner, L. (1980): Virus diseases of Capsicum annuum increasing importance of some recently isolated viruses in Hungary. 8th Conf. Czechoslovak Plant Virologists, Bratislava, 1980. pp. 421-429. Salamon P., Szürke J., Dezséri M. (1982): Paprika sárga érmozaik SHSSHU \HOORZ YHLQ PRVDLF HJ\ LVPHUHWOHQ HUHGHW
~MDEE IHUW
]
betegség fellépése és terjedése Magyarországon. Növényvédelmi Tud. Napok, Budapest, 1982. p. 14. Salamon P. (1985): A paprika (Capsicum annuum) vírusbetegségei Magyarországon:
a
paprikavirózisok
szimptomatológiája
és
etiológiája. Növényvédelem 21:412. Salamon P., Beczner L. (1987): Dulcamara yellow fleck virus (DYFV): a tobamovirus csoport új, Solanum dulcamara populációkban elterjedt, Magyarországon endemikus tagja. Növényvédelmi Tud. Napok, Budapest, 1987. p. 83. Salamon, P., Beczner, L., Hamilton, R. I. (1987): Dulcamara yellow fleck virus (DYFV): a new member of the tobamovirus group isolated in Hungary. VIIth International Congress of Virology. Edmonton, National Res. Council, Ottawa, Canada, 1987. p. 329. Salamon P. (1993): Tobamovirus rezisztenciagének a
Capsicum
nemzetségben és a paprika rezisztencianemesítés hazai eredményei. In: Integrált termesztés a kertészetben 14, Budapest, 104-113. Salamon, P., Kaszta, M. (2000): Investigation on the transmission of some tobamoviruses by pollen and seed in pepper (Capsicum annuum L.). Int. J. Horticult. Sci. 6:127-131.
135
Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989): Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, Laboratory Press. Sammons, I. M., Chessin, M. (1961): Cactus virus in the United States. Nature 191:517-518. Samuel, G. (1931): Some experiments on inoculation methods with plant viruses and local lesions. Ann. Appl. Biol. 18:494-507. Sanfaçon, H., Cohen, J. V., Elder, M., Rochon, D. M., French, C. J. (1993): Characterization of Solanum dulcamara yellow fleck-Ob: a tobamovirus that overcomes the N resistance gene. Phytopathology 83:400-404. Sági Zs., Salamon P. (1998): Az L4 rezisztenciagén beépítése fehér étkezési paprika fajtatípusokba. Növénynemesítési Tud. Napok, Budapest, 1998. p. 117. Selassie, K. G., Dumas De Vaulx, R., Marchoux, G., Pochard, E., (1981): Le virus de la mosaique du tabac chez le piment. I. Apparition en France du Pathotype P1,2. Agronomie 1:853-858. Siegel, A., Wildman, S. G. (1954): Some natural relationships among strains of tobacco mosaic virus. Phytopathology 44:277-282. Spiegel, S., Gera, A., Salomon, R., Ahl, P., Harlap, S., Loebenstein, G. (1989): Recovery of an inhibitor of virus replication from the intercellular fluid of hypersensitive tobacco infected with tobacco mosaic
virus
and
from uninfected
induced-resistant
tissue.
Phytopathology 79:258-262. Stiekema, W. J., Visser, B., Florack, D. E. A. (1993): Is durable resistance against viruses and bacteria attainable via biotechnology? In: Jacobs, Th. and Parlevliet, J. E. (Eds), Durability of Disease Resistance. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht, pp. 71-81.
136
Still, W. H., Lal, S. B., Del Rosario, M. S. E. (1960): Additional evidence that sweet potato mosaic virus is a strain of tobacco mosaic virus. Phytopathology 50:709-711. Szilassy D., Kazinczi G., Horváth J. (1999): A vírus-ellenállóságra nemesítés biotechnológiai módszerei. In: Horváth J. és Gáborjányi R. HGV 1|YpQ\YtUXVRNpVYLUROyJLDLYL]VJiODWLPyGV]HUHN0H] JD]GD
Kiadó, Budapest, 1999, pp. 360-390. Szirmai J. (1941): $ I
V]HUSDSULND OHURPOiViW PHJLQGtWy ~MKLW
nevezett vírus-EHWHJVpJU
VpJQHN
O 1|YpQ\HJpV]VpJJ\L eYN|Q\Y
-
1939):109-133. Szirmai J. (1944): A paprika vírusbetegségei. Növényvédelem 1:51-55. Szirmai J. (1950): Vírusok és vírusbetegségek. In: Ubrizsy G (ed.): Növénykórtan. Akadémiai Kiadó, Budapest, 1952, pp. 193-232. Szirmai J. (1970):
$ I
V]HUSDSULND
Ä~MKLW
VpJ´ EHWHJVpJ
OHN]GpVH
rezisztencianemesítéssel. Növénytermelés 19:39-48. Szürke J., Salamon P. (1986): A paprika sárga érmozaik (pepper yellow vein mosaic) betegség elterjedése Magyarországon és kórokozójának átvitele a talajban. Növényvédelem 22:398. Tanzi, M., Betti, L., De Jager, C. P., Canova, A. (1986): Isolation of an attenuated virus mutant obtained from a TMV pepper strain after treatment with nitrous acid. Phytopath. Medit. 25:119-124. Tanzi, M., Betti, L., Canova, A. (1989): PepMV infection in pepper seeds. Biological characterization of some strains and their localisation in the seed. Phytopath. Medit. 28:204-209. Tanzi, M., Betti, L., Canova, A. (1990): PepMV transmission through the pepper seed: its involvement in the pathogenical behaviour. Phytopath. Medit. 29:122-123.
137
Tenllado, F., García-Luque, I., Serra, M. T., Díaz-Ruíz, J. R. (1994): Rapid detection and differentiation of tobamoviruses infecting Lresistant genotypes of pepper by RT-PCR and restriction analysis. Journal of Virological Methods 47:165-174. Tenllado, F., García-Luque, I., Serra, M. T., Díaz-Ruíz, J. R. (1995): Nicotiana benthamiana plants transformed with the 54-kDa region of the pepper mild mottle tobamovirus replicase gene exhibit two types of resistance responses against viral infection. Virology 211:170183. Tenllado, F., García-Luque, I., Serra, M. T., Díaz-Ruíz, J. R. (1996): Resistance to pepper mild mottle tobamovirus conferred by the 54kDa gene sequence in transgenic plants does not require expression of the wild-type 54-kDa protein. Virology 219:330-335. Tenllado, F., García-Luque, I., Serra M. T., Díaz-Ruíz, J. R. (1997): Pepper resistance-breaking tobamoviruses: can they co-exist in single pepper plants? European Journal of Plant Pathology 103:235243. Tenllado, F., Díaz-Ruíz, J. R. (1999): Complete resistance to pepper mild mottle tobamovirus mediated by viral replicase sequences partially depends on transgene homozygosity and is based on a gene silencing mechanism. Transgenic Research 8:83-93. Tepfer, M., Balázs, E. (1997): Virusresistant Transgenic Plants: Potential Ecological Impact. Springer Verlag, Berlin, 126 pp. Thompson, S., Corbett, M. K. (1970): A mosaic diseases of Rhoeo discolor caused by a strain of tobacco mosaic virus. Phytopathology 60:1018-1019.
138
Tóbiás I., Molnár B., Salamon P., Beczner L. (1978): A paprikapatogén YtUXVRN
IHUW
]pVpQHN
KDWiVD
QpKiQ\
pWNH]pVL
SDSULNDIDMWiUD
Kertgazdaság 10:51-59. Tóbiás I., Maat, D. Z. (1982): Néhány paprikáról izolált dohány mozaik vírus szerológiai tulajdonságainak összehasonlítása. Növényvédelmi Tud. Napok, Budapest, 1982. p. 23. Tóbiás, I., Rast, A. Th. B., Maat, D. Z. (1982): Tobamoviruses of pepper, eggplant and tobacco: comparative host reactions and serological relationships. Neth. J. Plant Pathol. 88:257-268. Tóbiás, I., Csilléry, G. (1983): Virus diseases of pepper in greenhouse and plastic tunnel in Hungary. Eucarpia, Vth Meeting on Genetics and Breeding on Capsicum and Eggplant, Plovdiv, Bulgaria, 1983. p. 45. Tóbiás I., Molnár B. (1983): $]pWNH]pVLSDSULNiQHO
IRUGXOyYtUXVWQHWHN
és víruskórokozók Magyarországon. Kertgazdaság 15:49-54. 7RãLü 0 âXWLü ' 3HãLü =
Transmission of tobacco mosaic
virus through pepper (Capsicum annuum L.) seed. Phytopath. Z. 97:10-13. Tsuda, S., Kirita, M., Watanabe, Y. (1998): Characterization of a pepper mild mottle tobamovirus strain capable of overcoming the L3 genemediated resistance, distinct from the resistance-breaking Italian isolate. Mol. Plant-Microbe Interact. 11:327-331. Van Regenmortel, M. H. V. (1981): Tobamoviruses. In: Kurstak, E. (ed), Handbook of Plant Virus Infections and Comparative Diagnosis. Elsevier/North-Holland, Publication Amsterdam. pp. 541-564. Van Regenmortel, M. H. V., Fauquet, C. M., Bishop, D. H. L, Carstens, E. B., Estes, M. K., Lemon, S. M., Maniloff, J., Mayo, M., McGeoch, D. J., Pringle, C. R., Wickner, R. B. (2000): Virus Taxonomy: The Classification and Nomenclature of Viruses. The
139
Seventh Report of the Internatinal Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego, 2000. 1167 pp. Vernooij, B., Friedrich, L., Morse, A., Reist, R., Kolditz-Jawhar, R., Ward, E., Uknes, S., Kessmann, H., Ryals, J. (1994): Salicylic acid is not the translocated signal responsible for inducing systemic acquired resistance but is required in signal transduction. Plant Cell 6:959-965. Wassenegger, M. (1998): Application of PCR to transgenic plants. In: Meltzer, S. J. (Ed), PCR in Bioanalysis. Humana Press, Totowa, New Jersey, pp. 153-164. Wassenegger, M., Pélissier, T. (1998): A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol. Biol. 37:349-362. Watanabe, Y., Ogawa, T., Takahashi, H., Ishida, I., Takeuchi, Y., Yamamoto, M., Okada, Y. (1995): Resistance against multiple part viruses in plants mediated by a double-stranded RNA specific ribonuclease. FEBS Letters 372:165-168. Wetter, C. (1984): Serological identification of four tobamoviruses infecting pepper. Plant Disease 68:597-599. Wetter, C., Conti, M., Altschuh, D., Tabillion, R., Van Regenmortel, M. H. V. (1984): Pepper mild mottle virus, a tobamovirus infecting pepper cultivars in Sicily. Phytopathology 74:405-410. Wetter, C. (1988): Pepper mild mottle virus. AAB Descriptions of Plant Viruses. No.330. White, R. F. (1979): Acetylsalicylic acid (Aspirin) induces resistance to tobacco mosaic virus in tobacco. Virology 99:410-412. White, J. L., Kaper, J. M. (1989): A simple method for detection of viral satellite RNAs in small plant tissue samples. Journal of Virological Methods 23:83-94.
140
Whitham, S., McCormick, S., Baker, B. (1996): The N gene of tobacco confers resistance to tobacco mosaic virus in transgenic tomato. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8776-8781. Yarwood, C. E., Hecht-Poinar, E. (1970): A virus resembling tobacco mosaic virus in oak. Phytopathology 60:1320. Yarwood, C. E. (1971a): Erysiphaceae transmit virus to Chenopodium. Plant Dis. Rep. 55:342-344. Yarwood, C. E. (1971b): Virus transmission by powdery mildews and rusts. Phytopathology 61:1325. Zatykó, L., Rajki, B., Horváth, S. (1979): Új, nagy term
NpSHVVpJ
vírusrezisztens paprika fajták termelése. Kertgazdaság 11:19-28. Zatykó L. (1982):3DSULNDWHUPHV]WpV0H]
JD]GDViJL.LDGy%XGDSHVW
pp.388. Zatykó, L., Moór, A. (1995): New results of breeding in Hungary. Eucarpia, IXth Meeting on Genetics and Breeding on Capsicum and Eggplant, Budapest, Hungary, 1995. pp. 1-4.
141
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN KÉSZÜLT KÖZLEMÉNYEK
Gáborjányi
R.,
Almási
HOOHQiOOyNpSHVVpJH HOWpU
A,
Kálmán
D.
(1999):
Paprikafajták
SDWRJHQLWiV~ WREDPRYtUXVRNNDO V]HPEHQ ,;
Keszthelyi Növényvédelmi Fórum, 1999 jan. 27-29, Keszthely. Abstr. 18. Gáborjányi
R.,
Almási
A.,
Kálmán
D.
(1999):
Paprikafajták
HOOHQiOOyNpSHVVpJH NO|QE|] SDWRJHQLWiV~ WREDPRYtUXVRN IHUW
]pVpYHO
szemben. Kertgazdaság 31:7-14. Kálmán D., Palkovics L., Gáborjányi R. (2000): A hazai paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle tobamovirus, PMMoV) izolátumok szerológiai, patológiai és molekuláris biológiai vizsgálata. V. Tiszántúli Növényvédelmi Fórum, 2000 szept. 7-8, Debrecen. Abstr. 58-59. Kálmán D., Kassai T., Tornyai T., Gáborjányi R. (2000): A paprika enyhe tarkulás vírus (Pepper mild mottle tobamovirus, PMMoV) új patotípusa Magyarországon. Növényvédelem 36:613-618. Kálmán, D., Palkovics, L., Gáborjányi, R. (2001): Characteristics a Hungarian Pepper mild mottle tobamovirus (PMMoV) isolate. Eucarpia, XIth Meeting on Genetics and Breeding of Capsicum and Eggplant, 2001, Antalya, Turkey. Abstr. 252-255. Kálmán, D., Palkovics, L., Gáborjányi, R. (2001): Serological, pathological and molecular characterisation of Hungarian Pepper mild mottle tobamovirus (PMMoV) isolates. Acta Phytopathol. Entomol. Hung. 36:31-42. Kálmán, D., Palkovics, L., Gáborjányi, R. (2001): Characterization of the CP gene and the 3’non-coding region of a Hungarian PMMoV isolate. Bioresources and viruses, 3rd Int. Conference, September 11-15, 2001, Kiev, Ukrajna. Abstr. 181.
142
Kálmán, D., Palkovics, L., Tenllado, P. F., Díaz-Ruíz, J. R., Gáborjányi, R. (2002): Characterisation of the Hungarian Pepper mild mottle tobamovirus (PMMoV) isolates. 54th Int. Symposium on Crop Protection. May 7, 2002, Ghent, Belgium. Abstr. 128. Tenllado, P. F., Atencio, F. A., González, P., Barajas, D., Kálmán, D., Peña, L. Díaz-Ruíz, J. R. (2002): Replicase-mediated transgenic resistance to tobamovirus infections. In: Brady, J. R. et al. (eds.): Recent Research Developments in Virology Vol. 4. Transworld Research Network. p. 81-90.
