DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI VESZPRÉMI EGYETEM GEORGIKON MEZŐGAZDASÁGTUDOMÁNYI KAR KESZTHELY
Doktori program: Szántóföldi növények tápanyagellátása és termesztése Doktori alprogram: A növények táplálkozását és a talajok termékenységét befolyásoló tényezők alapismerete Témavezetők: DR. DEBRECZENI BÉLÁNÉ MTA doktora
DR. OROSZ LÁSZLÓ MTA doktora
RIZS ÉS BÚZA NÖVÉNYEK EGYÜTTÉLÉSE NITROGÉNKÖTŐ BAKTÉRIUMOKKAL
Készítette:
DR. KÁRPÁTI ÉVA
KESZTHELY
2000
2
Bevezetés A gabonafélék egyik legfontosabb kémiai tápeleme, a termés mennyiségének és minőségének egyik fő meghatározója a nitrogén. Az intenzív gabonatermesztési technológiák nagy mennyiségű nitrogén műtrágya alkalmazását követelik meg. A nitrogén műtrágya költsége jelentősen befolyásolja a termelés gazdaságosságát. A nitrogén műtrágyázás a környezetet, élőhelyünket is óriási mértékben terheli. A nitrát felhalmozódás a talajvizekben, felszíni és ivóvizeinkben egyre komolyabb népegészségügyi problémát jelent. A tudomány még nem találta meg a nyitját, hogyan tudnánk a növények nitrogéntáplálását teljes egészében környezetbarát módon megvalósítani, de ha már a nitrogén műtrágyának
csak
egy
részét
ki
tudjuk
váltani
biológiai
nitrogéntáplálással, az már jelentős előrelépés lehet. A probléma egy ígéretes megoldása a biológiai nitrogénkötés felhasználása növények és mikroorganizmusok olyan együttélésében, amelyben a mikroorganizmus a levegő nitrogénjét köti meg, alakítja át ammóniává, és ezzel táplálja a növényt. Mintegy 20 éve, a kutatás egyre inkább a gabonafélék és fűfélék gyökérkörnyezetében, gyökerében természetes körülmények között is élő nitrogénkötő, növénynövekedést serkentő talajbaktériumokra terelődik, és belőlük oltóanyagok fejlesztésére irányul a munka. Ilyen baktériumok az Azospirillum fajok, melyek a gabona- és fűfélék gyökereinek felszínén élnek, egyesek a gyökérbelsőben, szárbelsőben is megtelepszenek. A trópusi vidékeken termesztett rizsben élő Herbaspirillum baktérium
3
endofita nitrogénkötő, a talajban nem, csak gazdanövénye belső szöveteiben él. Egyes EU országokban, gabonakultúrákban, az Azospirillum brasilense és az Azospirillum lipoferum egyedi és kevert oltóanyagait már évek óta nagy mennyiségben használják talajoltásra. Az Azospirillum és Herbaspirillum oltóanyagok hazai alkalmazása is ígéretes megoldás lehet arra, hogy ezeket, a hazai talajokban igen alacsony számban élő hasznos baktériumokat feldúsítsuk, és munkára fogjuk. Ehhez azonban körültekintően kell megbecsülnünk várható hatékonyságukat, és nemcsak a hazai éghajlati, időjárási és talajviszonyok mellett. Ismernünk kell a magyar gabonafajták hajlamát is, képesek-e velük hatékony nitrogénkötő asszociációban élni. Dolgozatomban a búza és rizs együttélését tanulmányozom Azospirillum és Herbaspirillum baktériumokkal. Hatékony
Azospirillum−búza
nitrogénkötő
asszociáció
létrehozásához és működtetéséhez alapvető, hogy megismerjük a növény és a baktérium között, az asszociáció kialakulása során lejátszódó biológiai eseményeket. Dolgozatom első részében ennek a jórészt még fekete doboznak egy szögletébe, az Azospirillum baktérium és a gyökérfelszín egy jelmolekulája, a gyökérlektin közötti molekuláris kölcsönhatásokba kapunk betekintést. A munka második részének témája három magyar rizs és egy magyar búzafajta jellemzése nitrogénkötő együttélésben Azospirillum és Herbaspirillum baktériumokkal.
4
Célkitűzés Munkám első részében az Azospirillum és búza együttélés kialakulásának egyik elemét, a búza gyökérfelszín és a baktérium sejtfelszín kölcsönhatását vizsgáljuk: − bemutatjuk a gyökérfelszínen expresszálódó gyökérlektin, a búzacsíra agglutinin (WGA) és a baktérium sejtfelszín közötti felismerési folyamatot; − leírjuk a lektin baktériumhoz kötődésének hatását a baktérium nitrogénkötésére; − vizsgáljuk a lektinkötődés kiváltotta jel kapcsolatát a nitrogénkötés szabályozási rendszerével a baktériumban; − és lektinkötő receptort keresünk baktérium sejtfelszínén. Munkám második részében: − nitrogénkötő asszociációt hozunk létre három magyar rizs- és egy magyar búzafajta, valamint az asszociatív Azospirillum brasilense és az endofita Herbaspirillum seropedicae nitrogénkötő, növénynövekedést serkentő baktériumok között; − jellemezzük a nitrogénkötő együttéléseket: − leírjuk a baktériumok megtelepedését a növényeken belül, és hatásukat a növények növekedésére, mint az asszociációnak a következményét; − leírjuk a fajták tűrőképességét, hajlamát a baktériumokkal való együttélésre, és fogékonyságukat az együttélés jótékony hatásának kihasználására; − bemutatunk egy rögzített sejtes oltóanyag előállítási technikát, mellyel a baktériumok immobilizált oltóanyagait állítottuk elő, és jellemezzük az oltóanyagok hatékonyságát.
5
Anyagok és Módszerek A molekuláris biológiai munkákhoz. Baktérium
törzsek,
plazmidok,
táptalajok
és
tenyésztési
körülmények. Az A. lipoferum SpBr17R a vad típusú törzs rifampinrezisztens mutánsa. A WGA-t nem kötő (WGA−) törzs SpBr17R::Tn2706 (Rifr, Cmr) transzpozon inszerciós mutáns. A pAB358 (nifH-lacZ), pAB576 (nifA-lacZ), pAB904 (glnBA-lacZ) és a pAB912 (glnA-lacZ) plazmidok az A. brasilense promoter-lacZ transzkripciós fúzióit, a pAB53 és pAB914 pedig az A. brasilense nifA és glnB génjeit hordozzák. Az A. lipoferum és Escherichia coli törzseket Luria-Bertani komplett táptalajon tenyésztettük 30°C-on, folyamatos levegőztetés mellett. Az A. lipoferum törzsek nitrogenáz enzim aktivitás vizsgálatát N-mentes minimál táptalajban végeztük. A molekuláris biológiai technikákat a "Molecular cloning: a laboratory manual" (1989) laboratóriumi kézikönyv szerint végeztük. Nitrogenáz enzim aktivitás mérés lektinek jelenlétében. A tenyészeteket 2 órán keresztül, 30°C-on, 99,5:0,5 (vol/vol) N2-O2 légkörben növesztettük, majd légmentesen 10 % (vol/vol) acetilén gázt adagoltunk hozzájuk. A lektineket az acetilén gáz hozzáadásával egyidőben adtuk a tenyészetekhez. A nitrogenáz enzim aktivitást acetilén redukciós eljárással határoztuk meg. Az A. brasilense nifH-lacZ, nifA-lacZ, glnBA-lacZ és glnA-lacZ fúziók bevitele A. lipoferum-ba és β-galaktozidáz vizsgálat lektin stimulus jelenlétében. A pAB358, pAB576, pAB904 és pAB912 plazmidokat konjugációval vittük be a vad típusú és a WGA− mutáns törzsekbe. A
6
transzkonjugánsokat minimál táptalajon szelektáltuk a megfelelő antibiotikumok jelenlétében. A nitrogenáz enzimet a fentiek szerint derepresszáltuk és a β-galaktozidáz aktivitást 4 órával a lektinek hozzáadása után mértük SDS-kloroform segítségével permeabilizált sejtekből. Differenciális lektinkötési vizsgálat. A baktériumok sejtfelszínén a lektinek megkötődését FITC-vel jelölt lektinekkel teszteltük. A lektinkötés
mértékét
az
525
nm
hullámhosszon
mért
átlagos
epifluoreszcenciával (E525/107 sejt/ml) számszerűsítettük. A WGA−Neu és a WGA−Glc lektineket úgy nyertük, hogy a WGA-t moláris fölöslegben
adott
N−acetil−D−neuraminsavval
vagy
N−acetil−D−glükózaminnal telítettük. WGA-t kötő komponensek kimutatása a sejtkapszulában. Három napos, minimál táptalajon növesztett sejtekről a kapszulát HEPES, Triton X−100 pufferben, 4 oC-on, 18 órán keresztül leoldottuk. A preparátumok fehérje
komponenseit
nátrium-dodecilszulfát-poliakrilamid
gél
elektroforézissel (SDS−PAGE) választottuk szét. A fehérjemintázatokat a gélekből nitrocellulóz membránra félszáraz blottolási technikával vittük át. A membránokat digoxigenin-jelölt WGA-val hívtuk elő. Növénykísérletekhez. Baktérium törzsek, növényfajták, táptalajok. Az A. brasilense és a H. seropedicae törzsek a vad típusú szülőtörzsek rifampin-rezisztens mutánsai. A növényoltási kísérletekben használt tesztnövények Karmina, Sandora és Ringola rizs fajták (Haltenyésztési Kutatóintézet, Szarvas),
7
valamint
Mv−23
búzafajta
(GATE
Tangazdaság).
A
baktériumtenyésztést minimál táptalajban, a nitrogenáz enzim aktivitás méréseket pedig nitrogénmentes minimál táptalajban végeztük. Folyadék és rögzített sejtes baktérium oltóanyagok készítése. A folyadék oltóanyag készítéséhez folyékony minimál táptalajt éjszakán át növesztett
baktériumtenyészettel
oltottunk
be.
A
tenyészeteket
folyamatos levegőztetés mellett, 16 órán át, 30°C-on növesztettük, majd folyékony nitrogénmentes minimál táptalajban mostuk és közvetlenül a növényoltásokhoz használtuk. A rögzített sejtes oltóanyag előállításához cellulózgyöngyöt tartalmazó folyékony minimál táptalajt a fentiek szerint oltottunk be. A tenyészeteket folyamatos levegőztetés mellett, 30°C-on 7 napon keresztül inkubáltuk. A tápközeget minden 48 órában cseréltük. A cellulózgyöngyöket friss folyékony minimál táptalajban reszuszpendáltuk (lombiktenyészet kísérletekhez), vagy nitrogénmentes folyékony minimál táptalajban való mosás után a növényoltásokhoz használtuk. Nitrogenáz
enzim
aktivitás
meghatározás. A
tenyészeteket
folyékony nitrogénmentes minimál táptalajban 2 óra nitrogenáz enzim derepressziónak
vetettük
alá
[30°C,
99,5:0,5
(vol/vol)
N2−O2
atmoszféra]. Majd a tenyészetekhez légmentesen 10 % (vol/vol) acetilén gázt adtunk. További 14 óra inkubáció után a nitrogenáz enzim aktivitást acetilén redukciós eljárással határoztuk meg. Növényoltási kísérletek tenyészedényben. 3 napos csíranövényeket mosott és hőkezelt homokba ültettünk (5 növény/edény), melyet megelőzően 5 ml folyékony vagy 5, 10, 20 és 30 gyöngynyi rögzített sejtes oltóanyaggal oltottunk be. A növényeket 20−25 °C hőmérsékletű
8
növényházban, napi 16 órás megvilágítás mellett, 28 napig neveltük. A rizs növényeket folyamatosan, a búza növényeket szükség szerint öntöztük. 28 nap eltelte után a gyökereket a szárakról levágtuk, mindkettőt légszárazra szárítottuk és mértük. Meghatároztuk a gyökér felszínén, a gyökér belső szöveteiben és a szárbelsőben, valamint a rizoszféra talajban megtelepedett baktériumok számát, valamint a baktériumok nitrogénkötését a gyökérben és a szárban.
Eredmények A búza és az Azospirillum közötti nitrogénkötő asszociáció létrejötte és működése egy sor kölcsönhatást igényel a növény és a baktérium
között.
Ebben
a
folyamatban
meghatározó
lépés
a
baktériumsejt és a gyökérfelszín közötti felismerés, ezen belül is a gyökérlektinek és a baktérium sejtfelszín szénhidrát alkotórészeinek kölcsönhatása. A lektinek közös jellemzője, hogy cukorcsoportokat, cukorláncok véghelyzetű tagjait képesek specifikusan felismerni, ezáltal glikozilált molekulákhoz, poliszacharidokhoz, glikoproteinekhez specifikusan és reverzibilisen kötődni. Így, a gyökérfelszínen expresszálódó lektinek szelektíven támogathatják a kolonizáló baktériumok megkötődését a gyökéren, mert különbséget képesek tenni a különböző baktérium fajok/törzsek sejtfelszíni cukormintázatai között, így ismerve fel a megfelelő baktérium partnert.
9
Munkám első részében a búza gyökérlektin, a búzacsíra agglutinin (WGA) és az Azospirillum lipoferum baktérium közötti kapcsolatot tanulmányoztuk, a baktérium lektinfelismerését és −kötését, és az ebből a kölcsönhatásból születő sejtválaszokat a baktériumban. Elsőként az A. lipoferum egy WGA-t nem kötő (WGA−) fenotípusú transzpozon inszerciós mutáns törzsét izoláltuk. A transzpozon inszerció kimutatásával lokalizáltuk a mutáns fenotípusért felelős hibás szakaszt a baktérium genom DNS-én. Felfedtük, hogy a WGA, a vad típusú sejtekhez kötődve, specifikusan fokozza azok nitrogénkötő kapacitását, valószínűleg, miután a lektin komplexet képez a megfelelő receptorral a sejtek felszínén. Amikor a lektin−baktérium kölcsönhatás gátolt, mint a WGA− mutánsban, a lektinkötésből eredő, és a nitrogénkötés szabályozási folyamatába belépő inger is hiányzik. Kimutattuk, hogy a WGA nitrogénkötést stimuláló hatása dózisfüggő, és hogy a lektin kötődése a sejtekhez nem befolyásolja a nitrogénkötés oxigénérzékenységét. Bemutattuk továbbá, hogy a WGA inger az asszociatív diazotrófokra, így az A. lipoferum és A. brasilense baktériumokra hat, míg a szabadonélő nitrogénkötőkre, az Azotobacter vinelandii és Klebsiella pneumoniae baktériumokra nem. Differenciális lektinkötési vizsgálattal felmértük, hogy a vad típusú és a WGA− sejtek felszínén milyen terminális cukorcsoportok találhatók, hiszen a lektinek ezeket ismerik föl és ezeken keresztül kötődnek a baktériumhoz. Következtetést vontunk le a mutáns sejtek felszínének cukormintázat hibájára. Azonosítottuk, hogy a cukorcsoportok közül
10
melyik cukor−lektin kapcsolat vesz részt a fokozott nitrogénkötés kiváltásában: a stimulációt a WGA-n kívül kizárólag csak olyan lektinekkel tudtuk elérni, amelyek, mint a WGA is, a sejtfelszín terminális N−acetil−D−glükózamin dimer végződésű cukorláncaihoz kötődnek. A továbbiakban vizsgáltuk, hogy a WGA-kötődés indukálta jel hogyan kapcsolódik a sejt nitrogénkötésének szabályozási rendszeréhez. A nitrogenáz enzim bioszintézise, azaz a nitrogenáz enzimet kódoló nif gének megnyilvánulása transzkripciós szintű szabályozás alatt áll. Így azt vizsgáltuk, hogy a lektin stimulus a nitrogénkötést szabályozó hatását vajon a nifH, nifA, glnB és glnA gének átíródásának módosítása révén fejti-e ki. A nifH gén a nitrogenáz enzimet kódoló struktúroperon, a nifHDK tagja. A nifA gén terméke, a NifA fehérje, aktív formában, a nifH gén expressziójának pozitív szabályozója. A glnB gén terméke, a PII fehérje a NifA fehérje aktivitásának szabályozásában vesz részt. A glnA gén pedig a glutamin szintetáz (GS) enzimet kódolja, ez az enzim készít a nitrogénkötési folyamat végtermékéből, az ammóniából glutamint, amely aztán a sejt további nitrogéntartalmú molekuláinak felépítéséhez szolgál forrásul. A fenti gének promotereinek a β-galaktozidáz enzim génjével, a lacZ génnel alkotott transzkripciós promoter fúzióit bevittük a baktériumba, és mértük a β-galaktozidáz aktivitást a sejtekben WGA és egyéb lektinek hatására, nitrogénkötési feltételek mellett. A WGA a nifHlacZ, nifA-lacZ és glnBA-lacZ fúziók expressziójában váltott ki növekedést, és ebből következően egy fokozott nitrogénkötést.
11
Ugyanezen gének expressziójának növekedését kiváltották mindazok a lektinek is, melyek a WGA-val azonos cukorkötő specifikusságúak és a nitrogénkötést is képesek voltak növelni. A
következő
lépésben
WGA−kötő
receptort
kerestünk
a
baktériumsejt felszínén. A lehetséges WGA−kötő komponenseket a sejtkapszulában, és annak is fehérje alkotóelemei között kerestük. A sejtekről kapszuláris anyagot oldottunk le és a preparátum fehérje komponenseit SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel szétválasztottuk, majd nitrocellulóz membránra vittük, a membránokat digoxigenin−jelölt WGA-val, enzim−immunodetekciós eljárással hívtuk elő. A vad típusú baktérium kapszula preparátumában a WGA egy fehérjéhez, egy 32 kDa polipeptidhez kötődött. A WGA-t nem kötő mutáns törzs kapszula preparátumának mintázatában a 32 kDa fehérje szintén jelen volt, de a WGA nem volt képes hozzákötődni. Továbbá, glikozilált fehérjék kimutatására alkalmas módszerrel kiderítettük, hogy a vad típusú kapszula preparátum 32 kDa molekulasúlyú WGA-kötő komponense glikolizált polipeptid. A WGA−immunodetekciós, a Schiff festési és a WGA−affinitás kromatográfiai kísérletek eredményei alapján feltételezzük, hogy a 32 kDa kapszulafehérje egy WGA−kötő receptor, vagy annak egy alkotóeleme lehet az A. lipoferum sejtfelszínén. Munkám második részében asszociatív szimbiózisokat alakítottunk ki három magyar rizs- és egy magyar búzafajta, valamint az A. brasilense asszociatív nitrogénkötő- és a H. seropedicae endofita nitrogénkötő
12
baktériumok között. Csíranövényeket oltottunk a baktériumok egyedi oltóanyagaival és vizsgáltuk az oltás hatását a növények növekedésére, az oltás után négy héttel. Összehasonlítottuk az egyes rizs fajták hajlamát a nitrogénkötő asszociációk elfogadására. Leírtuk a baktériumok megtelepedését és nitrogénkötő kapacitását a növényekben. Megmutattuk, hogy az A. brasilense kiváló partner nitrogénkötő együttélés kialakítására, mind a rizsben, mind a búzában. Az oltás jótékony hatása megnövekedett gyökértömegben és a laterális gyökerek számának gyarapodásában nyilvánult meg, amihez esetenként nagyobb szártömeg is párosult. nitrogéntáplálásának,
A jótékony hatás egyrészt a növény
másrészt
a
baktérium
által
termelt
és
a
gazdanövénynek továbbított hormon jellegű molekulák, elsősorban az indol-3-ecetsav
növekedést
serkentő
hatásának
köszönhető.
A
növényeknek a vizsgált, korai növekedési szakaszában a jótékony hatás nagyobb részben a hormonhatásnak köszönhető, bár a biológiai nitrogéntáplálás is már működhet. A különböző rizs fajtákkal kapott eredményeink azt hangsúlyozzák, hogy az oltás jótékony hatása nagymértékben függ a gazdanövény fajtájától. A Karmina és Sandora növények az oltásra jelentékeny gyökértömeg
gyarapodással
válaszoltak,
melyhez
a
Karmina
növényeknél szártömeg növekedés is párosult. A baktérium mindkét fajtában még a növények szárában is képes volt megtelepedni, azonban a szárkolonizáló kapacitása jelentősen különbözött a két fajtában.
13
Az Azospirillum baktériummal ellentétben, a két rizsfajta és a H. seropedicae nitrogénkötő asszociációja rapszodikus, nem mindig pozitív növényi választ váltott ki. Érdekes ez, hiszen korábbi közlemények ezt a baktériumot, mint a rizs természetes diazotróf endofitáját írják le. A Sandora növények megbízható szártömeg gyarapodással válaszoltak az oltásra, mialatt a baktériumok csak erősen korlátozott számban telepedtek meg a növény szárában. A Karmina növények H. seropedicae oltásakor jelentős gyökértömeg gyarapodást és mérsékelt szártömeg növekedést is kaptunk, amikor a baktérium kolonizációja visszafogott volt a növények szárában. Erőteljes szárkolonizáció azonban gyökértömeg csökkenést váltott ki. A Ringola fajtára egyértelműen káros volt mind az A. brasilense, mind a H. seropedicae oltása, ami a növények gyökértömeg csökkenésében nyilvánult meg. Míg az előbbi baktérium közel egyenletesen kolonizálta az egész növényt, az utóbbi korlátozott megtelepedése a szárbelsőben itt is megfigyelhető volt. Mind a Karmina és mind a Sandora fajtákban, a növényben élő A. brasilense és H. seropedicae baktériumok aktív nitrogénkötők voltak. A Karmina növényekben megtelepedett sejtek fajlagos nitrogénkötése meghaladta még az oltóanyagok in vitro, növény nélkül mért nitrogénkötését is. Az Mv−23 búzafajta a két nitrogénkötő baktériummal való együttélésre gyökeresen eltérő választ adott. A növények A. brasilense oltása megbízhatóan növelte a gyökértömeget, a szártömeg alakulását viszont nem befolyásolta. A baktérium növénybeni megoszlását nézve kitűnt, hogy döntően a gyökérbelső, és kisebb mértékben a szárbelső
14
kolonizációja ment végbe. A gyökérben mért fajlagos nitrogénkötés jóval magasabb volt az oltóanyag in vitro nitrogénkötési kapacitásánál. Ugyanakkor, a növény a H. seropedicae baktériummal való együttélésből kimondottan károsodott, amit jelentős gyökértömeg csökkenés mutatott. A baktérium az A. brasilense-hez hasonló kolonizációs mintázatot alakított ki a növényben. A növényoltásokhoz az oltóanyagok két formáját használtuk: folyadéktenyészeteket és rögzített sejtes kultúrákat. A rögzített sejtes forma segíti az oltóbaktérium túlélését és a védelmét a talajban, növelheti annak versenyképességét az őshonos mikroorganizmusokkal szemben a rizoszférában, valamint folyamatos sejtszolgáltatást biztosít a csírázó magok és csíranövények környékén. Továbbá, lehetővé teszi az oltóanyag időbeni, könnyű és pontos kivitelét a talajba. A rögzített sejtes oltóanyagokhoz az oltóbaktérium törzseket környezetbarát vivőanyagon, nagy
mikroporozitású,
preformált
cellulózgyöngyön
rögzítettük.
Jellemeztük a rögzített tenyészetek sejttermelő képességét és a sejtek nitrogénkötő kapacitását. A
cellulózgyöngyökből
sejtkoncentrációja,
nitrogénkötő
kirajzó
A.
kapacitása
brasilense és
populáció
növénykolonizáló
képessége felülmúlta a folyadék oltóanyagét, mind a rizs, mind a búza rizoszférájában. Ugyanakkor, a H. seropedicae esetében a rögzített sejtes oltóanyag hatékonysága nem haladta meg a folyadék oltóanyagét a baktérium
megtelepítésében,
sem
a
növényben,
sem
a
gyökérkörnyezetben, viszont előnyösen befolyásolta a gyöngyökből kirajzó baktérium populáció nitrogénkötő kapacitásának a megőrzését.
15
Új kutatási eredmények − Asszociatív szimbiózisokat alakítottunk ki három magyar rizs- és egy magyar búzafajta, valamint az Azospirillum brasilense és a Herbaspirillum seropedicae nitrogénkötő baktériumok között. − Az asszociatív nitrogénkötő A. brasilense kiváló jelölt hatékony nitrogénkötő asszociáció kialakítására mind a rizsben, mind a búzában. A baktérium a gyökér mellett a szárbelsőben is megtelepszik, és aktív nitrogénkötést végez. − Az endofita H. seropedicae csak a rizs növénnyel képes hatékony nitrogénkötő együttélésben élni, a búzával nem. Asszociációja azonban kétélű a rizs növényben is, akkor kiegyensúlyozott és hasznos, amikor a baktérium szétáradása a növénybelsőben, elsősorban a szárban, korlátozott. − Lényeges meghatározó az együttélésben a gazdanövény genotípusa: a Sandora rizsfajta mindkét baktériummal való együttélésből hasznot húz. A Karmina fajta A. brasilense-vel való együttműködése megbízhatóan előnyös. A H. seropedicae-vel együttélése bár lehet hasznos is, de alapvetően kiegyensúlyozatlan. A Ringola fajta károsodik mindkét nitrogénkötő baktérium megtelepedésétől. Az Mv−23 búzafajta kiválóan hasznosítja az A. brasilense asszociációt, míg a H. seropedicaevel való együttélésből kimondottan károsodik.
16
− A Karmina fajtában megtelepedett A. brasilense és H. seropedicae baktériumok, valamint az Mv−23 fajtában élő A. brasilense sejtek aktívabban kötik a nitrogént, mint növény nélkül, szabadon élve. − A növényoltásokhoz kifejlesztettük mindkét baktériumnak a rögzített sejtes oltóanyagait. A rögzített sejtes forma alkalmazása előnyösen
támogatta
a
baktériumok
túlélését
és
nitrogénkötő
képességének megőrzését talajban, valamint az A. brasilense esetében segítette a baktérium megtelepedését is mind a rizsben, mind a búzában.
A búza−Azospirillum együttélés kialakulásának tanulmányozása során megállapítottuk, hogy: − a búza gyökérlektin az A. lipoferum sejtekhez kötődve specifikusan növeli a baktérium nitrogénkötését; − a lektin a baktériumsejt felszínén egy 32 kDa glikozilált fehérjéhez kötődik, mely maga a lektinkötő receptor vagy annak egy komponense; − nitrogénkötés fokozás csak akkor jön létre, ha a lektin a receptorfehérje
N−acetil−D−glükózamin
végződésű
cukorláncaihoz
kapcsolódik; − a stimuláció mértékét befolyásolja a receptor és a lektin közötti kötési határfelületen kialakult cukorkapcsolatok száma; −
a lektinnek a receptorhoz kötődésével megszületett jel a
baktérium nitrogénkötésének szabályozási rendszeréhez továbbítódik, és
17
végső soron a nitrogénkötésért felelős enzim, a nitrogenáz fokozott bioszintézisét váltja ki; − a jeltovábbítás feltételezett útvonala, a lektin/receptor komplexről indulva, először felsőbb szabályozó elemeket (PII és NifA szabályozó fehérjék) céloz meg, majd végül a nitrogenáz enzimet kódoló struktúrgének
átírását
szabályozó
promoter
DNS
szakaszhoz
továbbítódik. Javaslatok Régi álmunk megvalósulása, hogy a növényekbe mikrobiális nitrogénkötési géneket ültessünk, és így tegyük képessé őket a levegőből való nitrogéntáplálkozásra, még mindig várat magára. Előbb vezethet célra a természetes növény−baktérium nitrogénkötő együttélések növénytermesztési gyakorlatban is alkalmazhatóvá tétele. NyugatEurópában gabonafélék oltására Azospirillum alapú oltóanyagokat már jó ideje használnak, a csírakori növekedés serkentésére, a betegségekkel szembeni ellenállás fokozására, a nitrogén műtrágyázás részleges helyettesítésére, a szárazságtűrés növelésére aszályos időszakokban. Eredményeink felhívják azonban a figyelmet arra, hogy ezen kereskedelmi oltóanyagok hazai alkalmazhatóságát körültekintően kell megítélni ahhoz, hogy azok kifizetődően alkalmazhatók legyenek hazai gabonafajták, hazai talaj- és időjárási körülmények között alkalmazva is. A hazai rizsfajtákkal végzett munkánkat tovább kell bővíteni hosszabb idejű, szabadföldi kisparcellás kísérletek irányába. Azonban a
18
jelenlegi eredmények alapján is megállapíthatjuk, hogy a Ringola fajta alkalmatlan bakteriális nitrogénkötő együttélés elfogadására. Javasoljuk viszont a Karmina és Sandora fajták Azospirillum és Herbaspirillum oltását. Célszerű a két baktérium kevert oltóanyagának hatékonyságát is jellemezni. A Karmina fajta különösen ígéretes, mert a növényben megtelepedett baktériumok igen intenzíven kötik a nitrogént, tehát feltehetőleg a fajta genetikai, fiziológiai háttere bőkezűen szolgálja a nitrogénkötő asszociáció működtetését. Oltóanyagaink nem minősülnek genetikailag módosított szervezeteknek (GMO), mert mesterségesen bevitt idegen genetikai információt nem hordoznak, tehát szabadföldi kipróbálásuk és későbbi lehetséges alkalmazásuk nem esik a GMO-ra vonatkozó szigorú szabályozás alá. A további kísérletek két ígéretes célpontja: az oltás hatásának összehasonlító elemzése öntözött és árasztott rizstermesztési technológiákban, másrészt annak felbecslése, hogy a biológiai nitrogéntáplálás milyen mértékben lesz képes a nitrogénműtrágya felhasználást helyettesíteni. Búza növénynél is javasolt fajtánkénti oltási vizsgálatokat végezni. Nem lesz meglepő, ha az endofita
Herbaspirillum baktérium nem
bizonyul megfelelő partnernek. A búza és rizs mellett, Azospirillum/Herbaspirillum/Acetobacter kevert tenyészetekkel pilótakísérleteket végeztünk már burgonya, cukorrépa és paradicsom oltására is. Azospirillum oltással vegetatív szaporítású dísznövények palántakori növekedését is tudtuk serkenteni. Egy másik perspektíva lehet a zöldségfélék biotermesztésében való alkalmazás, bár ilyen kísérleteket még nem végeztünk.
19
Az oltóanyag fejlesztés tárházát képezhetik a hazai talajokból és gabona kultúrákból izolálható Azospirillum és egyéb nitrogénkötő baktériumok.
Néhány
izolátummal
rendelkezünk
már,
de
ezek
nitrogénkötési kapacitása túl kicsi oltóanyagként való alkalmazásukhoz. A növényoltási kísérletekhez a cellulózgyöngy vivőanyagon rögzített
oltóanyagformát
javasoljuk.
Az
oltóanyag
túlélése
és
hatékonysága jobb, kezelése, kijuttatása könnyebb a folyadék kultúránál. Azonban a rögzített sejtes oltóanyag alkalmazása esetén is szükséges az évenkénti újraoltás. Fontos gyakorlati kérdés, hogy mely növényekkel alakítható ki Azospirillum asszociáció és a gazdanövénykör hogyan szélesíthető. Ezért ismernünk kell a baktérium gyökéren való megtelepedésének eseményeit, kritériumait, a gyökérfelszín és a baktérium közötti specifikus kommunikációt. Kimutattuk, hogy a búza gyökérlektin a baktériumsejt felszínén N−acetil−D−glükózamin csoportokhoz kötődik és ennek a kapcsolatnak a létrejötte serkenti a baktérium nitrogénkötését. Ez nem csupán egy molekuláris
struktúrbiológiai
kérdésre
adott
válasz.
Fehérjeadatbankokban fellelhető lektineket tanulmányozva azt találtuk, hogy számos gabonaféle és pázsitfűféle, valamint a burgonya és a paradicsom
eddig
N−acetil−D−glükózamin
ismert
lektinjei
cukrokat
ismernek
is föl.
valamennyien Irodalmi
adatok
mutatják, hogy a gabonaféléken és fűféléken kívül, az Azospirillum nemzetség a paradicsommal is hatékonyan él együtt. Vagyis a gyökérlektin és az Azospirillum sejt felszíne közötti specifikus
20
cukorkapcsolat a kompatibilis gazdanövénykör egy lényeges tényezője lehet. Ezért javasoljuk, hogy a gyökérfelszín és baktérium közötti kommunikációt és a lektin stimulálta nitrogénkötést a búzán kívül további gazdanövényekben is tárjuk föl. Specifikus lektineket termelő/túltermelő transzgénikus növények előállítására minden eszközünk megvan, de ez meggondolandó, mielőtt ezeknek a lektineknek az endogén funkciói nem tisztázottak megfelelően, és nemcsak a növényben, hanem az állatokban és az emberben is, hiszen élelmiszernövényekről van szó. Továbblépésként javasolhatjuk annak a kérdésnek a feltárását is, hogy a baktérium nitrogénkötése lektin ingerrel milyen mértékig fokozható. Ehhez meg kell ismerni a receptorgén megnyilvánulásának szabályozását, a lektin/receptor komplexről induló jel természetét, a nitrogénkötés
szabályozási
rendszeréhez
irányuló
jelátvitel
mechanizmusát. Továbbá, alapvető probléma a fokozott nitrogénkötés energiaellátása a baktériumban. Alapkutatási
szempontból,
a
dolgozatban
bemutatott
növény−baktérium kölcsönhatás-együttes modellként szolgálhat további eukarióta−prokarióta
kommunikációs
rendszerek
megértéséhez.
A
modell sarkköve, hogy a sejtfelszínek között áramló információk leolvasásában, megértésében a sejtfelszínek cukormintázatai vesznek részt, rajtuk keresztül továbbítódik a kommunikációs jel a sejtbe, a megfelelő célpontokhoz. A modell, a nitrogénkötő együttéléseken túl, segítheti a patogén baktérium és növényi sejt közötti kapcsolat tökéletesebb megértését is. Baktérium és állati sejt, baktérium és emberi
21
sejt közötti, sejtfelületi cukorkapcsolatok révén folyó "párbeszédnek" a fejlődésbiológiai vonatkozásai, az embrionális differenciálódásban betöltött szerepe szintén napjainkban kezd ismertté válni.
Lektorált közlemények Rethati, B., Dallmann, K., Simon, K. I., Balint, A., Szajani, B., Orosz, L. and Karpati, E. (2000) Characterization of Hungarian rice cultivars in nitrogen fixing associations with bacteria. Cereal Res. Comm. 28(12):9-16. Karpati, E., Kiss, P., Fendrik, I., de Zamaroczy, M., Orosz, L. (1999) Interaction of Azospirillum lipoferum with wheat germ agglutinin stimulates nitrogen fixation. J. Bacteriol., 181(13):3949-3955. Karpati, E., Kiss, P., Marini, F., Buglioni, S., Afsharian, M., Del Gallo, M., Fendrik, I. (1995) Molecular study of the interaction of Azospirillum lipoferum with wheat germ agglutinin. In: Azospirillum VI and Related Microorganisms, Fendrik, I., Del Gallo, M., Vanderleyden, J., de Zamaroczy, M. (eds) NATO ASI Series, Volume 37, Springer-Verlag, p. 213-221. Karpati, E., Ponyi, T., Sik, T. (1989) Host specific chemotaxis of Rhizobium meliloti induced by alfalfa. Bulletin Univ. Agricult. Sci. Gödöllő, p. 15-19. Karpati, E., Vörös, G., Orosz, L. (1997) Interaction of chitooligosaccharide-backboned residues of Azospirillum lipoferum with wheat root. In: Biological nitrogen fixation for the 21th century, Elmerich, C., Kondorosi, A., Newton, W. E. (eds) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London p.135. Karpati, E., Kiss, P., Afsharian, M., Del Gallo, M., Fendrik, I. (1995) Wheat germ agglutinin receptor of Azospirillum lipoferum: separation and function. In: Nitrogen Fixation: fundamentals and applications, Tikhonovich, I., Provorov, N., Romanov, V., Newton, W. (eds) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London, p. 342-343.
22
Előadások Kárpáti, É., Rétháti, B., Mikuska, Zs., Orosz, L. (1999) Molekuláris kommunikáció növény és baktérium között nitrogénkötő asszociációban. IV. Magyar Genetikai Kongresszus, Siófok, p. 108109. Kárpáti, É., Kiss, P., Orosz, L. (1998) A gyökérlektin és a baktérium receptor illeszkedése génműködést szabályoz. Magyar Biokémiai Egyesület 3. Munkaértekezlet, Sárospatak, p. 141. Kárpáti, É., Vörös, G., Orosz, L. (1996) A növényi lektinek és az Azospirillum közötti molekuláris kölcsönhatások. Magyar Biokémiai Egyesület I. Munkaértekezlet, Seregélyes, p. 110. Kárpáti, É., Kiss, P., Afsharian, M., Del Gallo, M., Fendrik, I. (1994) Az Azospirillum nitrogénkötő talajbaktérium lektin receptora. III. Genetikai Kongresszus, Debrecen, p. 91. Karpati, E., Marini, F., Buglioni, S., Manelli, S., Altieri, F., Fendrik, I., Del Gallo, M. (1994) Molecular study on binding of wheat germ agglutinin by Azospirillum lipoferum. NATO Advanced Research Workshop on Azospirillum and Related Microorganisms, Sarvar, Hungary, p.4. Manelli, S., Buglioni, S., Karpati, E., Del Gallo, M. (1993) Analisi della cinetica di legame tra lectine vegetali e il batterio azotofissatore Azospirillum. XII. Symposium of Italian Society of General Microbiology and Microbial Biotechnologies, SIMGBM, Camerino, p. 11-13. Poszterek Rétháti, B., Dallmann, K., Orosz, L., Kárpáti, É. (2000) A gazdanövény genetikai hátterének szerepe az Azospirillum asszociáció eltűrésében. Magyar Biokémiai Egyesület 5. Munkaértekezlet, Sopron, p. 146. Venkei, Zs., Orosz, L., Kárpáti, É. (2000) Az Azospirillum lipoferum kölcsönhatása gazdanövénye lektinjével, a búzacsíra agglutininnel. Magyar Biokémiai Egyesület 5. Munkaértekezlet, Sopron, p. 151. Oravecz, A., Orosz, L., Kárpáti, É. (2000) Transzpozont hordozó vektor fejlesztése Photorhabdus luminescens rovarpatogén baktérium mutagenezisére. Magyar Biokémiai Egyesület 5. Munkaértekezlet, Sopron, p. 144.
23
Rétháti, B., Kárpáti, É., Preininger, É., Orosz, L., Gyurján, I. (1999) gfp (green fluorescent protein) riporter gén konstrukciók bevitele és működtetése Azotobacter vinalandii nitrogénkötő baktériumban. IV. Magyar Genetikai Kongresszus, Siófok, p. 209-210. Karpati, E., Vörös, G., Orosz, L. (1997) Azospirillum lipoferum specifically communicates with root lectin of wheat. 8th European Congress on Biotechnology, Budapest, p. 152. Afsharian, M., Karpati, E. (1995) Nitrogen fixing bacteria from rhizosphere of Iranian and Hungarian gramineous plants. In: Nitrogen Fixation: fundamentals and applications, Tikhonovich, I., Provorov, N., Romanov, V., Newton, W. (eds) Kluver Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London, p. 749. Buglioni, S., Karpati, E., Marini, F., Fendrik, I., Del Gallo, M. (1994) Study of WGA-lectin binding receptors of Azospirillum spp. Convegno Congiuto ABCD-AGI- SIBBM-SIMGBM, Montesilvano, Italy. Karpati, E., Olasz, F., Marini, F., Del Gallo, M., Werner, A. (1993) A new transposon for improved mutagenesis of Azospirillum. XII. Symposium of Italian Society of General Microbiology and Microbial Biotechnologies, SIMGBM, Camerino. Karpati, E., Olasz, F., Marini, F., Del Gallo, M., Werner, A. (1993) A new transposon for improved mutagenesis of plant growth promoting rhizobacteria. Congress on Agricultural and Environmental Biotechnology: Biodiagosis, biocontrol, bioprocesses, Torino, p. 5355.
