UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie Academiejaar 2011-2012
VASTE FASE EXTRACTIE VAN ETHYL GLUCURONIDE VOOR DE DETECTIE IN DE HAARMATRIX Astrid Beuckelaers Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Dr. Apr. C. Stove Commissarissen
Prof. Dr. Apr. W. Lambert Dr. Apr. S. Wille
AUTEURSRECHT
De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.
Gent, juni 2012
Promotor
Auteur
Dr. Apr. C. Stove
Astrid Beuckelaers
SAMENVATTING De huidige methode die in België gehanteerd wordt om een periode van alcoholonthouding te controleren is de bepaling van carbohydrate deficient transferrin (CDT). CDT, als biomerker voor ethanol, is echter niet optimaal. Het kan aanleiding geven tot vals positieve en vals negatieve resultaten. In het kader van een onderzoeksproject op het Nationaal Instituut voor Criminalistiek en Criminologie, wordt een nieuwe UPLC-MS/MS methode ontwikkeld om ethyl glucuronide, een alternatieve merker voor ethanol, te kwantificeren in haar. Een bepaling van EtG in de haarmatrix biedt de mogelijkheid om de alcoholconsumptie van de afgelopen maanden na te gaan, afhankelijk van de haarlengte. Het staal waar EtG zich in bevindt, wordt voor de start van de analyse onderworpen aan o.a. een vaste fase extractie. Een vaste extractie wordt uitgevoerd SPE-kolommen. Tijdens dit onderzoek zullen verschillende SPE-kolommen met elkaar worden vergeleken. Het besluit van dit onderzoek is dat zowel de Clean Screen als de Bond Elut SAX de meest geschikte vaste fase extractiekolommen zijn. De Clean Screen omwille van zijn hoge recovery, de Bond Elut SAX omwille van het beperkte matrixeffect. Verdere experimenten zijn noodzakelijk om een definitieve keuze te maken. De resultaten van dit onderzoek vormen een basis voor verdere ontwikkeling van de vaste fase extractie en de analysemethodes voor de bepaling van ethyl glucuronide. Verder uitvoerig onderzoek is vereist zodat alle staalvoorbereidende stappen (bv. decontaminatie, extractie) kunnen geoptimaliseerd worden om uiteindelijk tot een geschikte staalvoorbereiding van EtG te komen.
Ik wens iedereen te bedanken die mij geholpen heeft deze masterproef te realiseren. Graag wil ik het Nationaal Instituut voor Criminologie en Criminalistiek bedanken voor de unieke kans die mij werd geboden om de wereld van de forensische wetenschappen te ontdekken. Dank je wel N. Kummer, voor de samenwerking en de begeleiding gedurende het hele onderzoek. Bedankt Dr. C. Stove, voor het nalezen en corrigeren van mijn masterproef. Daarnaast bedank ik ook de hele vakgroep Drugs en Toxicologie van het NICC en in het bijzonder Karen Smet, Sarah Wille en Nele Samyn, voor de zeer aangename samenwerking en het antwoord op vele vragen.
INHOUDSOPGAVE INHOUDSOPGAVE LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN 1. INLEIDING ....................................................................................................................... 1 2. LITERATUURSTUDIE ................................................................................................... 2 2.1. ALCOHOL EN ALCOHOL IN HET VERKEER ........................................................... 2 2.2. VERSCHILLENDE ALCOHOLMERKERS: OVERZICHT ......................................... 3 2.3. INDIRECTE MERKERS ................................................................................................. 3 2.3.1. Transaminases ...................................................................................................... 3 2.3.2. Gamma-glutamyl transferase (GGT) ................................................................. 4 2.3.3. Serotonine metabolieten ...................................................................................... 4 2.3.4. Gemiddelde corpusculair volume (MCV) .......................................................... 4 2.3.5. Koolhydraat-deficiënt transferrine (CDT) ........................................................ 4 2.3.6. Combinatie GGT-CDT ........................................................................................ 6 2.3.7. Andere indirecte merkers.................................................................................... 6 2.4. DIRECTE MERKERS ..................................................................................................... 6 2.4.1. Ethanol .................................................................................................................. 7 2.4.2. Fosfatidylethanol (PEth) ..................................................................................... 7 2.4.3. Fatty acid ethyl esters (FAEE) ............................................................................ 7 2.4.4. Ethyl glucuronide (EtG) ...................................................................................... 7 2.4.5. Ethyl sulfaat (EtS) ............................................................................................... 8 2.5. ETHYL GLUCURONIDE ............................................................................................... 8 2.6. HAARANALYSE .......................................................................................................... 10 2.6.1. Incorporatiemechanismen van lichaamsvreemde stoffen in haar ................. 10 2.6.2. Algemene procedure .......................................................................................... 11 2.6.3. Voor – en nadelen............................................................................................... 12 2.7. VASTE FASE EXTRACTIE ......................................................................................... 13 2.7.1. Werking .............................................................................................................. 13 2.7.2. Interactie mechanismen..................................................................................... 14 2.7.3. Doelstellingen...................................................................................................... 16 2.8. ANALYSE ..................................................................................................................... 17 2.8.1. Gas chromatografie ........................................................................................... 17
2.8.2. Vloeistofchromatografie .................................................................................... 17 3. OBJECTIEVEN .............................................................................................................. 18 4. MATERIALEN EN METHODEN ................................................................................ 19 4.1. VOORBEREIDING HAARSTALEN ........................................................................... 19 4.1.1. Materialen ........................................................................................................... 19 4.1.2. Methoden ............................................................................................................ 19 4.2. VASTE FASE EXTRACTIE ......................................................................................... 20 4.2.1. Materialen ........................................................................................................... 20 4.2.2. Methoden ............................................................................................................ 25 4.2.3. Berekeningen ...................................................................................................... 27 4.3. ANALYSE ..................................................................................................................... 29 4.3.1. Materialen ........................................................................................................... 29 4.3.2. Methoden ............................................................................................................ 29 4.4. OPTIMALISATIE SPE.................................................................................................. 32 4.4.1. Materialen ........................................................................................................... 32 4.4.2. Methoden ............................................................................................................ 32 4.5. BEPALEN MATRIXEFFECT EN RECOVERY: CLEAN SCREEN EN BOND ELUT SAX ............................................................................................................................... 33 4.5.1. Materialen ........................................................................................................... 33 4.5.2. Methoden ............................................................................................................ 33 5. RESULTATEN EN DISCUSSIE ................................................................................... 35 5.1. RESULTATEN PRIMAIRE TESTEN VASTE FASE EXTRACTIE .......................... 35 5.1.1. Verlies in de laad– en wasstap .......................................................................... 35 5.1.2. Oasis MAX en Clean Screen ............................................................................. 38 5.1.3. Sterke anionuitwisselaars .................................................................................. 39 5.2. OVERZICHT MATRIXEFFECT KOLOMMEN ......................................................... 40 5.3. OPTIMALISATIE VASTE FASE EXTRACTIE.......................................................... 41 5.3.1. Oasis MAX .......................................................................................................... 41 5.3.2. Bond Elut SAX ................................................................................................... 43 5.3.3. Isolute SAX, Isolute PE-AX en Clean Screen .................................................. 45 5.4. MATRIXEFFECT EN RECOVERY ............................................................................. 47 5.4.1. Clean Screen ....................................................................................................... 47 5.4.2. Bond Elut SAX ................................................................................................... 48
6. CONCLUSIE ................................................................................................................... 51 6.1. ELIMINATIE OP BASIS VAN DE LAAD – EN WASSTAP ..................................... 51 6.2. VERMINDEREN VAN HET MATRIXEFFECT ......................................................... 51 6.3. BOND ELUT SAX ........................................................................................................ 51 7. LITERATUURLIJST ..................................................................................................... 53
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN 5-HIAA
5-hydroxy-indol azijnzuur
5-HTOL
5-hydroxytryptophol
ACN
Acetonitril
ALT
Alanine transaminase
AST
Aspartaat transaminase
Beta-HEX
Beta-hexosaminidase
BIVV
Belgisch Instituut Voor de Verkeersveiligheid
CDT
Carbohydrate deficient transferrin
EI
Electrospray ionization
EtG
Ethyl glucuronide
EtS
Ethyl sulfaat
eV
Elektronvolt
FAEE
Fatty acid ethyl esters
GC
Gas Chromatography
GGT
Gamma-glutamyl transferase
H2 O
Water
HAA
Hemoglobin-associated acetaldehyde
HCl
Zoutzuur
HILIC
Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography
IS
Interne Standaard
LC
Liquid Chromatography
MCV
Mean corpuscular volume
MeOH
Methanol
mg
Milligram
min
Minuten
mL
Milliliter
mM
Millimolair
mmHg
Millimeter kwik
MS
Massaspectrometer
MS/MS
Tandem massaspectrometrie
NCI
Negative Chemical Ionization
NH3
Ammoniak
NH4OH
Ammonium hydroxide
PEth
Fosfatidylethanol
pg
Picogram
Rpm
Revolutions per minute
SAX
Strong anion exchange
sec
Seconden
SIJ
Sialic-acid index of Apo J
SoHT
Society of Hair Testing
SPE
Solid Phase Extraction
Tf
Transferrine
TFA
Trifluoroazijnzuur
UPLC
Ultra Performance Liquid Chromatography
UV
Ultraviolet
V
Voltage
1.
INLEIDING
Bij een overtreding van de wet is de rechter in staat om een rijbewijs gedurende een bepaalde periode in te trekken. De rechter kan het terugkrijgen van het ingetrokken rijbewijs associëren met het slagen voor bepaalde herstelonderzoeken. De onderzoeken houden psychologische en/of medische testen in. Bij aanwijzingen van alcoholverslaving kan ook een alcoholvrije periode worden opgelegd [1, 2]. De huidige methode die in België gehanteerd wordt om een periode van alcoholonthouding te controleren is de bepaling van carbohydrate deficient transferrin (CDT). Het is een diagnostische merker om alcoholgebruik te detecteren. Het nadeel van CDT als merker is de beperkte specificiteit en gevoeligheid, wat aanleiding kan geven tot vals positieve en vals negatieve resultaten. Er kan besloten worden dat de resultaten van de CDT-waarden geen uitsluitsel kunnen geven i.v.m. de controle op chronisch alcoholgebruik [3, 4]. In samenwerking met het Belgisch Instituut Voor de Verkeersveiligheid (BIVV) worden verschillende nieuwe analytische methodes op punt gesteld om andere, directe, biomerkers van alcohol te bepalen. In deze thesis wordt er dieper ingegaan op de directe biomerker ethyl glucuronide (EtG). EtG is een directe merker van ethanol aangezien het uitsluitend na alcoholconsumptie in ons lichaam voorkomt. Het is een metaboliet van ethanol die in urine, bloed en haar kan worden gedetecteerd. Het beperkte detectievenster van EtG in urine en bloed vormt een probleem. Een EtG bepaling in de haarmatrix biedt hiervoor de oplossing. Dankzij een haarbepaling kan de alcoholconsumptie van de afgelopen maanden worden gedetecteerd. Dit is wel afhankelijk van de haarlengte [5, 6]. In het kader van een onderzoeksproject op het Nationaal Instituut voor Criminalistiek en Criminologie, wordt een nieuwe UPLC-MS/MS methode ontwikkeld om ethyl glucuronide te kwantificeren in haar. Voor de start van de analyse van EtG wordt de haarmatrix onderworpen aan staalvoorbereidende stappen. Een Solid phase extraction (SPE) of vaste fase extractie is een belangrijke stap bij de staalvoorbereiding. Het voornaamste doel van een vaste fase extractie is de isolatie van de gewenste componenten. In dit onderzoek is dit nl. EtG. Een vaste fase extractie biedt de mogelijkheid om interfererende substanties, die eveneens geëxtraheerd worden uit de haarmatrix, uit het staal te verwijderen. Een vaste fase extractie wordt uitgevoerd met een SPE-kolom [7]. Tijdens dit onderzoek zullen verschillende SPEkolommen met elkaar worden vergeleken.
1
2.
LITERATUURSTUDIE
2.1. ALCOHOL EN ALCOHOL IN HET VERKEER Drinken en rijden met een voertuig gaan niet samen. Het effect van ethanol (alcohol) op de rijvaardigheid werd grondig bestudeerd. Bij 0,5 promille (0,5 ‰) of 0.5 gram ethanol per liter bloed ondervindt de meerderheid van de bevolking effecten die de rijvaardigheid in het gedrang brengen. Vanaf deze waarde wordt de waakzaamheid van de bestuurder verstoord. Daarenboven worden de psychomotorische vaardigheden en de visuele scherpte negatief beïnvloed. De kans dat je als bestuurder van een voertuig betrokken raakt in een fataal ongeluk is tot tien keer groter vanaf 0,5 promille, in vergelijking met een volledig nuchtere chauffeur [8]. Vanaf een bloedalcoholconcentratie van 0,5 promille is een persoon in België strafbaar volgens de wet; dit wordt arbitrair gelijkgesteld met 0,22 mg alcohol per liter uitgeademde lucht. Wanneer die limiet overschreden wordt, kan de rechter een geldboete opleggen. In bepaalde gevallen kan de rechter het rijbewijs intrekken en kan er zelfs een gevangenisstraf worden opgelegd. Bij het intrekken van het rijbewijs moet deze persoon op het einde van die periode opnieuw zijn rijvaardigheid bewijzen. Dit gebeurt aan de hand van één of meerdere testen die mogelijk door de rechter opgedragen worden: een theoretisch examen, een praktisch examen, psychologische testen of medische testen [9]. Naast die testen kan de rechter ook een alcoholvrije periode (abstinentie) van minstens 6 maanden opleggen wanneer iemand aan een alcoholverslaving leidt [2]. Om te controleren of een persoon geen alcohol gedronken heeft, in die periode van 6 maanden, wordt een bloedanalyse uitgevoerd. In België wordt bij de analyse het percentage koolhydraat-deficiënt transferrine (CDT%) in het serum gemeten. Een hoeveelheid ethanol wordt niet bij iedere persoon weerspiegeld in dezelfde ethanolconcentraties in het bloed [10]. Het is afhankelijk van een aantal parameters, o.a. geslacht, BMI, ras en een alcoholafhankelijkheid. In de lever wordt ± 95% van de ethanol, die in ons lichaam wordt opgenomen, geoxideerd. In het oxidatieproces wordt ethanol via acetaldehyde omgezet tot azijnzuur (zie figuur 2.1.). Het overige deel wordt grotendeels gemetaboliseerd in de longen (1,6-6%), de huid (0,5%) en de nieren (0,5-2%) [11]. Een klein percentage (2-10%) komt onveranderd in zweet, urine en uitgeademde lucht terecht. [10] Slechts
een
zeer
klein
gedeelte
wordt
gemetaboliseerd
tot
vetzuur
ethylesters,
ethylglucuronide, ethylsulfaat en fosfatidylethanol [12].
2
2.2. VERSCHILLENDE ALCOHOLMERKERS: OVERZICHT Om ethanol te detecteren zijn er zowel directe als indirecte biomerkers die een beeld kunnen geven van het voorbije alcoholgebruik. Figuur 2.1. geeft een overzicht weer van de belangrijkste biomerkers. Om correcte resultaten te bekomen moeten de analyses met de meest gevoelige en meest specifieke merkers gebeuren. Om deze redenen werd gekozen om EtG te hanteren als merker van ethanol [13]. Na%orgaan%of% weefsel%schade:% Indirecte)merkers) % Alcohol%dehydrogenase%(ADH)%
Oxida8ef:% ADH%
Aldehyde%dehydrogenase%(ALDH)%%
CH3CHO% acetaldehyde%
CH3COOH% azijnzuur% ALDH%
Niet
Figuur 2.1. Metabolisme ethanol en overzicht directe en indirecte merkers [10, 14]. ALT: alanine aminotransaminase, AST: aspartaat aminotransaminase, MCV: mean corpuscular volume en GGT: gamma-glutamyl transferase 2.3. INDIRECTE MERKERS Indirecte merkers zijn niet rechtstreeks gecorreleerd met een ethanolinname. Ze geven slechts een indicatie van het alcoholgebruik. Door het gebrek aan correlatie tussen beiden kunnen de merkers aanleiding geven tot vals positieve en vals negatieve resultaten. Dit betekent dat de specificiteit en gevoeligheid van de merkers niet optimaal is. Hierna volgt een overzicht van de belangrijkste indirecte merkers [4]. 2.3.1. Transaminases De stijging van alanine aminotransaminase (ALT) en aspartaat aminotransaminase (AST) is gebaseerd op het feit dat bij chronisch alcoholgebruik de lever schade oploopt. Dit wordt gereflecteerd in een stijging van deze enzymen in het serum [15]. De transaminases hebben een beperkte specificiteit, aangezien de serumwaarden ook kunnen stijgen bij andere aandoeningen: een myocard infarct, een trauma aan de skeletspieren of een leverziekte. De waarden van AST en ALT stijgen niet bij één hoge alcoholinname [6, 16].
3
2.3.2. Gamma-glutamyl transferase (GGT) GGT is een glycoproteïne enzym. De serumwaarde van het leverenzym stijgt bij alcoholgebruik doordat er een beschadiging aan de lever optreedt. GGT is als biomerker gevoeliger dan de transaminases. Desondanks is de specificiteit niet optimaal, aangezien de bloedwaarden ook kunnen stijgen bij o.a. geneesmiddelengebruik of een hepatobiliaire ziekte [17, 18]. 2.3.3. Serotonine metabolieten In
urine
kunnen
twee
metabolieten
van
serotonine
teruggevonden
worden:
5-
hydroxytryptophol (5-HTOL) en 5-hydroxy-indol azijnzuur (5-HIAA). 5-HTOL komt in normale omstandigheden voor in urine, maar bij alcoholgebruik stijgt het 5-HTOL-level tot 20u na inname. Het berekenen van de ratio van 5-HTOL op 5-HIAA is een specifieke, maar indirecte merker [6, 17, 18]. 2.3.4. Gemiddelde corpusculair volume (MCV) MCV staat voor mean corpuscular volume of gemiddeld celvolume van een rode bloedcel. De morfologie van de rode bloedcel wordt beïnvloed door alcohol en zijn metabolieten. Bij chronisch alcoholgebruikers stijgt het volume van de rode bloedcellen. Aangezien rode bloedcellen een levensduur van 120 dagen hebben, levert dit tot 3 maanden na het laatste alcoholgebruik een bewijs dat een persoon gedronken heeft. Het nadeel van deze indirecte merker is echter de specificiteit, aangezien MCV ook stijgt bij verschillende andere aandoeningen [17]. 2.3.5. Koolhydraat-deficiënt transferrine (CDT) Vooraleer men in België een ingetrokken rijbewijs terugkrijgt, wordt het CDT% gemeten in het serum om de opgelegde alcoholvrije periode te controleren. Een CDT%-bepaling kan zowel een alcoholvrije periode als chronisch alcoholgebruik detecteren [3, 4]. Transferrine is een glycoproteïne die zorgt voor het ijzertransport in de bloedbaan. Transferrine is opgebouwd uit een polypeptideketen verbonden met twee koolhydraatketens. Deze dragen een wisselend aantal eindstandige siaalzuurgroepen, wat resulteert in verschillende isovormen. Figuur 2.2. geeft de chemische structuur van siaalzuur weer. In het lichaam bevinden zich verschillende isovormen van transferrine (Tf): pentasialo-Tf, tetrasialo-Tf, trisialo-Tf, disialo-Tf, monosialo en asialo-Tf. De verschillende isovormen worden weergegeven in figuur 2.3. [19].
4
Figuur 2.2. Structuur siaalzuur [20]. Eindstandige*siaalzuur* Koolhydraatketen* Polypep6deketen*
Figuur 2.3. De verschillende isovormen van transferrine [21]. De benaming CDT (carbohydrate deficient transferrin) staat voor de som van drie verschillende isovormen van transferrine: disialo-, monosialo- en asialo-Tf. Onderzoek heeft aangetoond dat voornamelijk disialo– en asialo-Tf gecorreleerd zijn met chronisch alcoholgebruik [22]. In sommige studies wordt ook trisialo-Tf in rekening gebracht [23]. Bij chronisch alcoholgebruik, gedefinieerd als meer dan 60 g ethanol per dag nuttigen en dit gedurende een lange periode, neemt CDT toe. De stijging wordt veroorzaakt doordat de eindstandige siaalzuurgroepen verwijderd worden bij de langdurige blootstelling aan ethanol [17, 24]. CDT% wordt berekend door de verhouding te bepalen van de hoeveelheid CDT op de totale hoeveelheid transferrine [16, 25]. CDT bezit in vergelijking met alle andere indirecte merkers een relatief goede specificiteit en gevoeligheid. Een gestegen waarde levert het bewijs dat een persoon de afgelopen 2 weken alcoholische dranken heeft ingenomen. Toch zijn zowel de gevoeligheid als de specificiteit van CDT als merker niet optimaal. Zwangerschap en bepaalde leverziekten doet het CDT% stijgen ondanks een alcoholvrije periode. Dit kan zorgen voor een lagere specificiteit en leidt tot valse positieve resultaten [4, 15, 25]. Verder is het mogelijk dat het CDT% in het serum niet stijgt bij een kortstondige hoge alcoholinname. Het is eveneens mogelijk dat de CDTlevels niet stijgen, ondanks chronisch alcoholgebruik. Deze vaststellingen zorgen ervoor dat de gevoeligheid niet altijd optimaal is [4].
5
Het meten van de CDT% is niet altijd feilloos. De resultaten moeten zorgvuldig geïnterpreteerd worden aangezien er een kans bestaat op vals positieve en vals negatieve resultaten. De uitkomst van analytische testen moet steeds vergeleken worden met de medische en psychologische testen die worden uitgevoerd. De CDT%-waarden kunnen afhankelijk van deze testen bevestigd of ontkracht worden [3]. 2.3.6. Combinatie GGT-CDT De combinatie van GGT-CDT resulteert in meer gevoelige resultaten dan bij het gebruik van één indirecte biomerker en dit zonder daarbij aan specificiteit te verliezen. De verhouding GGT-CDT in het serum blijft hetzelfde ongeacht de aan– of afwezigheid van een leverpathologie. Bij andere indirecte merkers kunnen de serumwaarden stijgen bij een leveraandoening, wat de interpretatie van de resultaten bemoeilijkt [13, 15]. 2.3.7. Andere indirecte merkers Naast bovenstaande merkers zijn er nog een aantal andere indirecte merkers die minder frequent gebruikt worden: o.a. acetaldehyde, hemoglobine geassocieerd acetaldehyde (HAA), totaal serum siaalzuur (TSA), siaalzuur index van Apo J (SIJ) en serum beta-hexosaminidase (Beta-HEX) [17]. 2.4. DIRECTE MERKERS Geen enkele indirecte merker kan een definitief bewijs van chronische alcoholinname leveren. Directe merkers kunnen dit wel aangezien ze enkel ontstaan in de aanwezigheid van ethanol. Bijgevolg zijn de directe merkers, in tegenstelling tot de indirecte, meer gevoelig en specifiek [24]. Tabel 2.1. geeft een overzicht van de directe merkers en hun detectievenster. Tabel 2.1. Overzicht directe merkers en hun detectievenster. biomerker Ethanol
PEth FAEE EtS EtG
Matrix Urine Bloed uitgeademde lucht Bloed Bloed Haar Bloed Urine Bloed Urine Haar
detectievenster 18-24 u 10-12u 4-6u 4 weken 99u maanden 4-8 uur 30 u 4-8 uur 1u - 5 dagen Maanden
Referentie [6]
[12] [26] [16] [26]
6
2.4.1. Ethanol Ethanol kan gedetecteerd worden in urine, bloed of uitgeademde lucht. Het nadeel is echter zijn beperkte detectievenster. In urine is het mogelijk om ethanol op te sporen tot 18-24u, in bloed tot 10-12u en in de uitgeademde lucht tot 4-6u na inname. Tenzij voor recent alcoholgebruik te detecteren wordt ethanol zelf
niet gebruikt als merker voor
alcoholconsumptie vanwege zijn vluchtigheid en de mogelijkheid op contaminatie [6, 18, 27]. 2.4.2. Fosfatidylethanol (PEth) PEth is een glycerofosfolipide dat enkel na inname van ethanol gevormd wordt en heeft daardoor een specificiteit van 100%. Bovendien bezit de merker een gevoeligheid tussen 94 en 100% [12]. 2.4.3. Fatty acid ethyl esters (FAEE) Ethanol ondergaat tijdens zijn metabolisatie een esterificatie waardoor FAEE gevormd worden. FAEE zijn een groep van meer dan 20 verschillende ethyl esters van vrije vetzuren. Ze ontstaan in het bloed en komen voornamelijk via talg in het haar terecht. Volgens een consensus van de Society of Hair Testing kan chronische alcoholconsumptie worden aangetoond door de bepaling van 4 verschillende FAEE in haar. Door de detectie in haar biedt de bepaling van FAEE de mogelijkheid om het alcoholgebruik van de afgelopen maanden te controleren. Dit is echter afhankelijk van de haarlengte [16, 27, 28]. Abstinentie kan niet gecontroleerd worden met behulp van FAEE, aangezien er zelfs bij geheelonthouders steeds een kleine hoeveelheid aan FAEE in het haar wordt teruggevonden. Dit kan aanleiding geven tot vals positieve resultaten. Een eerste verklaring is de endogene aanwezigheid van FAEE in het haar. Een andere oorzaak is het gebruik van haarlotions op basis van ethanol die ervoor zorgen dat er FAEE in het haar worden teruggevonden ondanks abstinentie. Het is echter wel zo dat FAEE een betere gevoeligheid en specificiteit t.o.v. alle indirecte merkers bezitten [6, 26]. 2.4.4. Ethyl glucuronide (EtG) Het onderzoek van deze thesis gaat voornamelijk over ethyl glucuronide in haar. In een volgend hoofdstuk worden de eigenschappen van EtG uitgebreider besproken.
7
2.4.5. Ethyl sulfaat (EtS) EtS is een niet-oxidatieve metaboliet van ethanol die wordt aangemaakt door sulfatatie via sulfotransferasen. EtS kan teruggevonden worden in urine. Het nadeel van de detectie in urine is het beperkte detectievenster: het kan slechts tot 30 uur na alcoholinname waargenomen worden. [16] Er bestaat ook een kans op vals positieve resultaten, aangezien ethanol bevattende mondspoelmiddelen een stijging van EtS in urine kunnen veroorzaken. [6] 2.5. ETHYL GLUCURONIDE Zoals reeds eerder werd vermeld, is ethylglucuronide een alternatieve directe biomerker voor ethanol. Tijdens de metabolisatie van ethanol wordt 0,02-0,06 % omgezet in EtG door de conjugatie van glucuronzuur en ethanol. Na inname van ethanol kan EtG worden teruggevonden in bloed tot 8u en 1u tot 5 dagen in urine. Ook in haar is ethyl glucuronide op te sporen [5, 6, 16, 28, 29]. EtG is een polaire molecule met een moleculair gewicht van 222,19 g/mol en een pKa van 3,21. De chemische structuur van EtG bevat een carboxylgroep en wordt weergegeven in Figuur 2.4. Het mechanisme voor de incorporatie in haar is nog niet volledig gekend, maar de hypothese wordt gesteld dat door de hydrofiliciteit van de molecule dit voornamelijk via zweet plaatsvindt [28, 30, 31].
Figuur 2.4. Structuur EtG [31].
8
Volgens een consensus van de Society of Hair Testing wordt er vanaf een concentratie ≥ 30 pg EtG /mg haar gesproken van chronisch alcoholgebruik. Dit komt overeen met gedurende enkele maanden dagelijks meer dan 60 g alcohol innemen. De meting gebeurt met stukjes haar van 0-3 en 0-6 cm [27]. EtG heeft als biomerker een grotere gevoeligheid dan CDT en andere indirecte merkers [32]. Nochtans is deze nog steeds niet optimaal: er kunnen zowel vals positieve als vals negatieve resultaten voorkomen. Zo wordt soms, na inname van ethanol, toch geen EtG teruggevonden in het hoofdhaar. Wanneer EtG niet wordt teruggevonden in haar, is dit bijgevolg geen bewijs van abstinentie [4]. Haarlotions die ethanol bevatten kunnen ook de resultaten beïnvloeden [33, 34]. Er zijn echter studies die dit tegenspreken [35, 36]. Aangezien EtG enkel ontstaat bij de inname van ethanol levert de aanwezigheid van EtG in haar bijgevolg wel een bewijs van alcoholinname. Er kan geconcludeerd worden dat indien een persoon positief test voor EtG, abstinentie kan worden uitgesloten [4]. Er worden slechts zeer kleine hoeveelheden EtG teruggevonden in haar (pg/mg). Dit zorgt ervoor dat er nood is aan een zeer gevoelige detectiemethode [37]. Het voordeel van EtG als biomerker is dat deze niet beïnvloed wordt door geslacht, leeftijd, ziekte, bepaalde geneesmiddelen en haarkleur [38]. EtG in haar is een goede indicator voor alcoholgebruik aangezien het in haar stabiel blijft gedurende drie maanden en het de mogelijkheid biedt om een profiel op te stellen van de alcoholconsumptie van de afgelopen maanden. Een analyse door middel van andere directe of indirecte merkers kan gebruikt worden om de bekomen resultaten te bevestigen of ontkrachten [39, 40].
9
2.6. HAARANALYSE 2.6.1. Incorporatiemechanismen van lichaamsvreemde stoffen in haar Haar groeit vanuit een haarfollikel die zich onder het huidoppervlak bevindt. De groei van haar is een cyclisch proces met een groei-, rust- en uitvalfase. De groeisnelheid van hoofdhaar bedraagt 0,6-1,4 cm per maand. De capillairen die de follikel omgeven zorgen voor de toevoer van de nodige voedingsstoffen. Ook lichaamsvreemde stoffen, zoals metabolieten van alcohol, kunnen in het haar worden opgenomen. Er wordt verondersteld dat de incorporatie tot stand komt door vier mechanismen die weergeven worden in figuur 2.5.
3.# 3.#
4.#
2.#
1.## Figuur 2.5. Incorporatie mechanismen in haar [41]. 1. Via passieve diffusie komen de substanties vanuit de capillairen in de groeiende cellen van het haarfollikel. 2. Via omliggende compartimenten die zich diep in de huid bevinden incorporeren de stoffen in het haar. 3. Vanuit het zweet dat afkomstig is van de omliggende zweetklieren komen substanties via diffusie in het haar terecht. Ook via talg dat vanuit de talgklieren gesecreteerd wordt in de haarfollikel komen de substanties door diffusie in het haar terecht. 4. Uit de omgeving kunnen stoffen op het oppervlak van de huid terecht komen en zo het haar binnendringen. Het vermogen van substanties om opgenomen te worden in haar, is geassocieerd met de chemische structuur ervan. De lipofiliciteit en de basiciteit van de substanties zijn hierbij van belang als ook de hoeveelheid melanine in haar [41, 42].
10
2.6.2. Algemene procedure De haaranalyses worden uitgevoerd volgens bepaalde richtlijnen. Het grootste deel van de laboratoria werkt volgens richtlijnen die opgesteld zijn door de Society of Hair Testing (SoHT) [43]. Naast het testen van hoofdhaar, is het eveneens mogelijk om de aanwezigheid EtG te bepalen in o.a. schaam-, borst-, oksel- en andere lichaamsharen [44]. 2.6.2.1. Verzamelen haarstaal en opslag Het
verzamelen
van
de
haarstalen
wordt
bij
voorkeur
uitgevoerd
door
een
laboratoriummedewerker. Verschillende belangrijke zaken dienen genoteerd te worden bij de staalafname: de lengte van het haar, de haarkleur, aantal centimeter haar dat achterblijft op het hoofd, voorafgaande cosmetische haarbehandelingen, de datum en de plaats op het hoofd. Het staal wordt zo dicht mogelijk tegen de hoofdhuid afgenomen en hierbij wordt aangegeven welke zijde van het staal zich aan de hoofdhuid bevond. Bij voorkeur wordt het staal afgenomen op de plaats die de vertex posterior heet. Haarstalen worden het best bewaard in een papieren enveloppe bij kamertemperatuur, in een droge en donkere kamer. 2.6.2.2. Segmentatie Vermits haar zo’n 1 cm per maand groeit kan er een tijdsprofiel op basis van de geconsumeerde substanties worden opgesteld. Om een goed profiel te kunnen weergeven wordt het haar in stukken van 1 centimeter gesegmenteerd. 2.6.2.3. Decontaminatie en het verknippen van haar of pulveriseren Decontaminatie van het haar is noodzakelijk aangezien substanties uit de omgeving op het haar kunnen blijven kleven. Deze externe contaminatie kan leiden tot vals positieve resultaten. Dit kan veroorzaakt worden door o.a. resten van haarproducten, talg, stof of andere substanties uit de lucht. Na de decontaminatie worden de haren per segment geknipt of verpulverd. 2.6.2.4. Extractie van substanties uit haarmatrix De componenten die zich in de haarmatrix bevinden dienen te worden geëxtraheerd. De keuze van het extractiesolvent is afhankelijk van de structuur van de stoffen die geanalyseerd worden.
11
2.6.2.5. Opzuiveren van extract en analyse Voorafgaand aan de analyse worden de extracten gezuiverd om de interfererende substanties, die na de extractie nog in het staal aanwezig kunnen zijn, te verwijderen. De verschillende procedures die gebruikt worden zijn: vaste fase (micro-) extractie of vloeistof-vloeistof extractie. De analyse gebeurt door een gepaste techniek, vaak LC-MS of GC-MS [41, 42, 45]. 2.6.3. Voor – en nadelen 2.6.3.1. Voordelen •
Het voordeel van een haaranalyse t.o.v. bloed- of urineanalyses is het lange detectievenster. De samenstelling van het haar geeft een profiel weer van het alcoholgebruik van de afgelopen maanden, afhankelijk van de haarlengte.
•
Niet-invasieve staalafname (in vergelijking met een bloed staalafname).
2.6.3.2. Nadelen •
Een haarlengte die 6 cm overschrijdt, is niet meer bruikbaar voor analyse aangezien de concentratie van de substanties afneemt naarmate het haar verder groeit. Een haarlengte die kleiner is dan 3 cm moet bij de resultaten van een EtG bepaling in haar met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd [37, 39, 41].
•
Water, wind en UV-stralen (bv. van de zon) kunnen het haar beschadigen en dit heeft gevolgen voor de concentraties van de substanties in het haar [41, 42].
•
De hydrofiliciteit van EtG kan ertoe leiden dat, bij het meervoudig wassen van het haar met shampoo, de molecule verwijderd wordt uit het haar [28, 46].
•
De pigmentatie van het haar wordt veroorzaakt door melanine en bepaalt onze haarkleur. Melanine kan een invloed hebben op de concentratie van de stoffen die in het haar terecht komen. Bij EtG is dit niet het geval [47].
•
Cosmetische behandelingen zoals kleuren of bleachen kunnen EtG uit het haar verwijderen. Dit kan leiden tot vals negatieve resultaten [46].
•
Recent alcoholgebruik kan niet gedetecteerd worden aangezien de metabolieten van alcohol pas na een week opgenomen worden in het haar [5].
12
2.7. VASTE FASE EXTRACTIE Vooraleer een haarstaal geanalyseerd wordt, vinden er staalvoorbereidingen plaats, met als belangrijkste stap een solid phase extraction (SPE) of een vaste fase extractie. 2.7.1. Werking De geldende principes van een vloeistofchromatografie zijn eveneens bij een vaste fase extractie van toepassing. De extractie van een analiet vindt plaats door een interactie die ontstaat tussen een vaste (sorbent) en een vloeibare fase. De vaste fase is het sorbent waaruit de kolom is opgebouwd. De vloeibare fase wordt op de kolom gebracht, vloeit erdoorheen en verlaat uiteindelijk de kolom. Een vaste fase extractie gebeurt in 4 opeenvolgende stappen: conditioneren, laden van het staal op de kolom, wegwassen van ongewenste substanties en De afbeelding kan niet worden weergegeven. Mogelijk is er
onvoldoende geheugen beschikbaar om het de proces afbeelding te elueren van de analiet [48-50]. Figuur 2.7. verduidelijkt dat verder in het hoofdstuk
wordt verklaard.
Vaste&fase&extrac+e&& Interfererende&componenten& Analiet&(EtG)& soli& solidphasea2eelding.jpg&
Condi+oneren&
Laden&staal&
Wassen&
Elueren&
Figuur 2.7. De verschillende stappen van een vaste fase extractie [51]. Een vaste fase extractie begint met het conditioneren. Het conditioneren is noodzakelijk voor het sorbent van de kolom. Bij het conditioneren worden er verschillende oplossingen doorheen de kolom gestuurd. Het eerste solvent zal voor de activatie van het sorbent zorgen zodat het nadien een interactie kan aangaan met de analiet. Vervolgens wordt een tweede solvent op de kolom gebracht die het eerste verwijderd. Het tweede solvent zorgt ervoor dat de kolom voorbereid wordt op het laden van het staal [48, 52]. Na conditionering van de kolom wordt het staal op de kolom gebracht. Bepaalde componenten die aanwezig zijn in het staal kunnen reversibele interacties aangaan met de functionele groepen op het oppervlak van het sorbent. De interactie zorgt ervoor dat de relevante analieten uit het staal op de kolom worden weerhouden (retentie).
13
De overige substanties in het staal, die geen interactie met het sorptiemateriaal van de kolom vertonen, vloeien doorheen de kolom. Dit maakt het mogelijk om specifieke componenten uit het staal te extraheren. Daarna vindt de wasstap plaats met als doel zoveel mogelijk interfererende substanties (interferenties) van de kolom te elimineren en de analiet op de kolom te weerhouden. De laatste stap is de elutie. Een geschikt solvent verbreekt de interacties tussen de overgebleven componenten en de functionele groepen van de kolom waardoor de componenten de kolom verlaten. Dit proces heet elueren. De opeenvolging van de verschillende stappen maakt het mogelijk om een specifieke substantie (analiet) af te zonderen of te extraheren uit een bepaalde matrix [48, 53]. Om een goede vaste fase extractiemethode te bekomen moet er rekening gehouden worden met de eigenschappen van de analiet, het sorbent en de matrix. Daarenboven moet de elutie compatibel zijn met de gebruikte analysemethode [53]. 2.7.2. Interactie mechanismen Er zijn verschillende interacties mogelijk tussen de analiet en de functionele groepen op het oppervlak van het sorbent. De functionele groepen zijn covalent gebonden op een sorbent of pakkingsmateriaal, dat opgebouwd is uit silica of polymeren. Ongebonden silica bevat silanolgroepen die als functionele groep hydroxylgroepen bezitten. Silica kan gemodificeerd worden door op de silanolgroepen liganden te plaatsen. De modificatie is niet volledig en de vrije silanolfuncties veroorzaken secundaire polaire en ionische interacties. Silica is stabiel bij pH van 2 tot 7,5. Een sorbent bestaande uit polymeren is stabiel bij alle pH-waarden (0 t.e.m. 14) en wekt geen secundaire ionische interacties op [48, 53]. Er zijn vier types sorbenten die elk verschillende interacties veroorzaken: 2.7.2.1. Normale fase sorbent Polaire functionele groepen op het sorbent reageren met polaire gedeelten van componenten uit het staal. Er zijn verschillende functionele groepen die aanleiding geven tot hydrofiele of polaire interacties vb. amines, hydroxylgroepen en carbonylgroepen [48].
14
2.7.2.2. Omgekeerde fase sorbent Een kolom die gepakt is met silica kan gemodificeerd worden door hydrofobe groepen op de silanolgroepen te plaatsen, op die manier wordt een omgekeerde fase sorbent gevormd. De componenten die het best geëxtraheerd worden door de hydrofobe interacties zijn apolaire moleculen. Deze interacties komen tot stand door ‘dispersie’ of Van der Waals krachten. De krachten treden ook op bij een kolom waarvan het pakkingsmateriaal opgebouwd is uit polymeren [53]. 2.7.2.3. Ionenuitwisselingssorbent Een ionische interactie is een elektrostatische aantrekking die plaatsvindt wanneer 2 geladen deeltjes, zowel van het sorbent als van een molecule uit het staal, met elkaar interageren. Een positieve lading interageert met een negatieve lading en omgekeerd. Er zijn twee soorten ionische interacties: kationische en anionische interacties (zie Figuur 8.2. ).
Figuur 2.8. Interacties van geladen analiet met anion – en kationuitwisselingssorbenten [54]. Een anionische interactie grijpt aan tussen een negatieve lading van de analiet en een tegenovergestelde positieve lading van het sorbent. Bij een kationische interactie gebeurt het omgekeerde. Componenten met een ioniseerbare groep worden het beste geëxtraheerd met een ionenuitwisselingssorbent. Er zijn twee soorten ionuitwisselingsreacties: een zwakke en een sterke ionenuitwisselingsreactie. Sterke ionenuitwisselingssorbenten zijn steeds geladen, ongeacht de pH. De lading van een zwakke ionenuitwisselaar is afhankelijk van de pH.
15
Om de extractie goed te laten verlopen is de pH in de verschillende stappen (laden, wassen, elueren) van belang. Bij de laadstap is het van belang dat zowel de functionele groepen op het pakkingsmateriaal als die van de analiet geladen zijn. Een zure molecule (EtG) is bij een pH van 2 eenheden boven de pKa voor 99% geladen, bij een pH van 2 eenheden onder de pKa is ze voor 99% ongeladen. Afhankelijk van het feit of een sorbent een zwak of sterk ionenuitwisselingssorbent is, verliest ofwel het sorbent ofwel de analiet zijn lading en elueert de analiet. Naast de pH spelen ook de selectiviteit van de tegenionen en de ionensterkte van het solvent een rol bij elutie van de analiet [48, 53]. 2.7.2.4. Gemengde retentiemodus Sorbenten met een gemengde retentiemodus bezitten verschillende soorten functionele groepen die in staat zijn om meerdere reacties te combineren. 2.7.3. Doelstellingen De eerste doelstelling is het isoleren van de analiet. Een vaste fase extractie wordt gebruikt om enkel de analiet in het eluaat over te houden. Ten tweede wordt de analiet aangeconcentreerd. De concentratie van EtG in het haarstaal is zeer laag (pg/mg), wat de bepaling bemoeilijkt. Na de extractie bevindt de analiet zich in een kleiner volume, waardoor de concentratie toeneemt. Dit leidt tot een grotere respons van EtG bij de detectie, hetgeen resulteert in een hogere gevoeligheid van de meetmethode [7]. Ten derde worden ongewenste of interfererende componenten uit het staal verwijderd, waardoor de selectiviteit van de methode verbetert. De interferenties zorgen bij de analyse voor het zogenaamde matrixeffect. Het matrixeffect kan bij de analyse leiden tot een ionsuppressie of een ionversterking [7, 49].
16
2.8. ANALYSE Voor de analyse van EtG in haar worden zowel vloeistofchromatografie (LC) als gaschromatografie (GC) gebruikt, beide gekoppeld aan een (tandem) massaspectrometer [27]. 2.8.1. Gas chromatografie Het grote nadeel van GC is de derivatisatiestap. De derivatisatiestap is noodzakelijk om van EtG een vluchtige molecule te maken, pas daarna kan EtG geanalyseerd worden door middel van gaschromatografie. Een voorwaarde om gaschromatografie toe te passen is dat de moleculen niet thermolabiel zijn [55]. De detectie vindt plaats met een massaspectrometer (MS). Jurado et al. (2004) [11] omschreef een methode voor de bepaling van EtG in haar. Hierbij werd gebruik gemaakt van de elektrospray ionisatie (EI), nl. GC-EI-MS, om EtG in haar te detecteren. Bij Yegles et al. (2004) [56] werd een andere ionisatietechniek aangewend: een methode met GC-MS in de negatieve chemische ionisatie mode (NCI). Ook andere bronnen beschreven een dergelijke methode [28, 57]. Voor de detectie kunnen ook twee gekoppelde massaspectrometers met de gaschromatograaf worden verbonden: GC-MS/MS. De tandem massaspectrometer verhoogt de gevoeligheid en selectiviteit. In de literaruur wordt een validatie van een GC-NCI-MS/MS methode beschreven [29, 31, 32]. Daarnaast beschreven Lees et al. (2012) [5] een GC-EI-MS/MS methode om EtG te bepalen in haar. 2.8.2. Vloeistofchromatografie Vloeistofchromatografie (LC) is een snelle en zeer efficiënte methode om EtG te bepalen. Het nadeel van deze techniek is de ionsuppressie of ionversterking, veroorzaakt door het matrixeffect, die bij de detectie het signaal doet dalen (suppressie) of doet verhogen (versterking) [58]. In de literatuur wordt een LC-ESI-MS/MS methode omschreven [30, 37, 59-61]. De kolom die voor de analyses gebruikt werd is een omgekeerd fase kolom. De kolom werd voor het eerst gehanteerd bij Janda et al. (2002). Om de ionisatie in de massaspectrometer te verbeteren pasten 2 studies [60, 61] een post-kolom additie toe met acetonitril. Kintz et al. (2008) [62] en Tarcomnicu et al. (2010) [63] maakten gebruik van hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) om EtG in haar te bepalen. De detectie werd uitgevoerd door een MS. Vervolgens valideerde Kronstrand et al. (2011) [64] een ultra performance liquid chromatography (UPLC) methode voor de bepaling van EtG in haar.
17
3.
OBJECTIEVEN
Een bepaling van EtG in de haarmatrix biedt de mogelijkheid om de alcoholconsumptie van de afgelopen maanden na te gaan, afhankelijk van de haarlengte. Met behulp van de directe merker EtG kan via een haarbepaling chronisch alcoholgebruik worden vastgesteld. Tot op heden wordt er naar een geschikte methode gezocht om een abstinentie en een beperkte alcoholinname te kunnen onderscheiden. Om beiden te differentiëren is het noodzakelijk om zeer lage concentraties aan EtG te detecteren. Het matrixeffect speelt hierbij een belangrijke rol, aangezien de matrix kan leiden tot een lagere gevoeligheid. Een voldoende hoge gevoeligheid is essentieel om deze lage concentraties te kwantificeren. Gedurende de staalvoorbereiding worden de haren vermalen en door middel van water wordt EtG uit de haren geëxtraheerd. Nadien wordt het extract opgezuiverd met behulp van vaste fase extractie (SPE). Aangezien haar een complexe matrix is waar allerlei substanties zich in bevinden, is de vaste fase extractie een enorm belangrijke stap bij de staalvoorbereiding. SPE wordt toegepast om de gewenste component (EtG) te isoleren van de overige interferenties die zich in het staal bevinden. De interferenties zijn afkomstig van de biologische matrix en zorgen voor het matrixeffect. Door deze zoveel mogelijk te verwijderen wordt het matrixeffect geminimaliseerd of eventueel geëlimineerd. In dit onderzoek wordt de vaste fase extractie geoptimaliseerd. De reden hiervoor is dat co-eluerende interferenties de ionisatie van de analiet beïnvloeden en deze kunnen het signaal verlagen (ionsuppression) of verhogen (ionenhancement). Het uiteindelijke doel van dit onderzoek is een geschikte SPE-kolom te selecteren die het mogelijk maakt het matrixeffect te minimaliseren, zodat lage concentraties EtG (pg/mg) kunnen worden gedetecteerd. Tijdens dit onderzoek zullen verschillende SPE-kolommen met elkaar worden vergeleken. Er werden negen SPE-kolommen geselecteerd op basis van een mogelijk goede retentie modus voor EtG. Aan blanco-stalen, zonder EtG, zal een gekende hoeveelheid EtG worden toegevoegd. Bij elke extractie wordt het staal, dat we laden op de kolom, opgevangen. Ook de wasstap en de elutiestap worden opgevangen. Elke stap van de extractie zal met een UPLCMS/MS methode geanalyseerd worden en de verschillende hoeveelheden EtG worden vergeleken. Na het vergelijken van de verschillende SPE-kolommen zal voor de meest geschikte SPE-kolom de recovery en het matrixeffect worden nagegaan.
18
4.
MATERIALEN EN METHODEN
4.1. VOORBEREIDING HAARSTALEN 4.1.1. Materialen Gebruikte toestellen: •
Weegschaal (Sartorius Mechatronics Belgium N.V., Vilvoorde, België)
•
Vermaler (Precellys 24, Bertin Technologies, Montigny-Le-Bretonneux, France)
•
Thermomixer ( Eppendorf Thermomixer comfort, Eppendorf, Hamburg, Duitsland)
•
Centrifuge (Centrifuge 5417 R, Eppendorf, Hamburg, Duitsland)
•
Buisjes (Precellys 24 (2 mL), Bertin Technologies; Montigny, Frankrijk)
•
Finnpipetten (Fischer Scientific, Aalst, België)
Gebruikte reagentia: •
Water (H2O) (Biosolve Chimie, Dieuze, Frankrijk)
•
EtG oplossing (LGC Promochem, Molsheim, België): 5 µg EtG / mL MeOH
•
Mierenzuur/H2O (0,1/99,9) (v/v) (Biosolve Chimie, Dieuze, Frankrijk)
4.1.2. Methoden Decontaminatie van de haren met H2O en aceton werd uitgevoerd voorafgaand aan de start van dit onderzoek. Vervolgens starten de experimenten met het verknippen van de haren in segmenten van ± 1 cm. Nadien wordt er 6 keer ± 30 mg van een blanco haarstaal afgewogen en met een pincet in een buisje gestopt. Het blancostaal bevat geen EtG en is afkomstig van vrijwilligers, kinderen of volwassen die geheelonthouders zijn. Verder worden de haren in de buisjes vermalen met een Precellys 24 pulverisator. Het toestel maakt 6200 omwentelingen per minuut (rpm) in 3 cyclussen van 90 seconden. De wachttijd tussen twee opeenvolgende cycli bedraagt 5 seconden. Aan elk buisje wordt 1410 µL H2O toegevoegd. Hierna wordt 60 µL van een EtG werkoplossing met concentratie 250 ng/mL in de buisjes gepipetteerd. Het totale volume in elk buisje bedraagt 1470 µL. Om de substanties volledig uit het haar te extraheren worden de buisjes 2 uur geschud in de thermomixer bij 40°C, 900 rpm. Door middel van H20 worden de substanties uit de haren geëxtraheerd aangezien uit onderzoek blijkt dat dit een goede manier is om substanties uit de haren te extraheren [11]. Daaropvolgend worden de buisjes 10 minuten gecentrifugeerd bij 4°C, 14 000 rpm.
19
4.2. VASTE FASE EXTRACTIE 4.2.1. Materialen Gebruikte toestellen: •
High recovery vials (Waters Corp., Milford, USA)
•
LCMS Certified vials (Waters Corp., Milford, USA)
•
Vacuum Vac Master (IST Biotage, Uppsala, Zweden)
•
Evaporator Vapotherm (Euro-scientific, Lint, België)
•
IKA® VORTEX Genius 3 (IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Duitsland)
•
Glazen pasteurpipetten (VWR International BVBA, Leuven, België)
•
Finnpipetten (Fischer Scientific, Aalst, België)
Gebruikte reagentia: •
Methanol (Biosolve Chimie, Dieuze, Frankrijk)
•
H2O (Biosolve Chimie, Dieuze, Frankrijk)
•
Acetonitril (Biosolve Chimie, Dieuze, Frankrijk)
•
Ammonium acetaat (Biosolve, Valkenswaard, Nederland)
•
n-hexaan (Merck chemicals, Overijse, België)
•
Ammoniak (32%) (Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland)
•
Mierenzuur (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland)
•
EtG-D5 oplossing (LGC Promochem, Molsheim, België): 70 ng EtG-D5/mL MeOH
Gebruikte vaste fase extractie kolommen: De verschillende kolommen werden geselecteerd op basis van een (theoretisch) goede retentie modus voor de analiet. Voor het pakkingsmateriaal van de kolom werden zowel silica als polymeren geselecteerd, beide met een gemengde of enkelvoudige retentiemodus. Aangezien EtG een molecule is met ioniseerbare groepen werd voornamelijk gekozen voor sterke anionuitwisseling. Ook de zwakke anionuitwisseling werd als retentiemodus uitgekozen. Dit biedt de mogelijkheid om de vergelijking te maken met de sterke anionuitwisseling. Verder werd er ook gekozen voor SPE-kolommen met polaire interacties aangezien EtG ook hydrofiele eigenschappen heeft. De extractieprotocollen die gehanteerd worden zijn afkomstig van specificaties van de fabrikant of van al eerder gebruikte protocollen in de literatuur. De protocollen die gebruikt worden voor dit onderzoek bevinden zich in de tabellen 4.1. en 4.2.
20
Naast het protocol worden ook het pakkingsmateriaal, de functionele groepen en de interacties weergegeven in de tabel. POLYMERISCH ANIONUITWISSELINGSSORBENT 1. Oasis MAX (60 mg, 3cc) (Waters Corp., Milford, USA) 2. Strata-X-AW (100 mg, 3 mL) ( Phenomenex, Utrecht, Nederland) SORBENT MET GEMENGDE RETENTIEMODUS 1. Screen-A (100 mg, 1 mL) (Phenomenex, Utrecht, Nederland) 2. Bond Elut NH2 (50 mg, 1 mL) (Agilent Technologies, Diegem, België) CLEAN SCREEN (200 mg, 3 mL) (United Chemicals Technologies, Bristol, Verenigd Koninkrijk) STERKE ANIONUITWISSELINGSSORBENTEN Dit zijn sorbenten waarop functionele groepen gebonden zijn die steeds positief geladen zijn, ongeacht de pH van het solvent. Bij een sterke anionuitwisseling is het pakkingsmateriaal van de kolom steeds positief geladen. De positieve lading trekt negatief geladen deeltjes aan en deze worden door de elektrostatische aantrekking op de kolom weerhouden. Gebaseerd op dit mechanisme leiden de negatief geladen groepen van EtG (bv. een zure carboxylgroep) tot het weerhouden van de analiet op de kolom. Onderstaande SPE-kolommen zijn opgebouwd uit silica en bezitten een quaternaire amine als functionele groep. Het silicamateriaal wekt secundaire hydrofiele interacties op. Verder maken de quaternaire amines de sterke anionuitwisseling mogelijk. De pKa van deze functionele groepen is groter dan 14 [48, 49]. 1. Bond Elut SAX (100 mg, 3mL) (Agilent Technologies, Diegem, België) In het oorspronkelijk protocol werd de wasstap uitgevoerd met 1 mL ACN. Voorafgaand aan de definitieve testen werd een vaste fase extractie uitgevoerd om te controleren of 1 mL MeOH een sterkere was opleverde. Dit bleek echter niet het geval. Het standaardprotocol met 1 mL ACN wordt niet veranderd.
21
2. Strata-SAX (100 mg, 3 mL) (Phenomenex, Utrecht, Nederland) 3. Isolute PE-AX (100 mL, 3 mL) (Sopachem, Eke, België) 4. Isolute SAX (100 mL, 3 mL) (Sopachem, Eke, België) Er is niet veel verschil tussen Isolute SAX en Isolute PE-AX, enkel hun tegenion is verschillend. Isolute SAX heeft als tegenion een chloride, Isolute PE-AX een acetaat. Het acetaation wordt makkelijker van de kolom verdreven dan een chloride ion. Hoe sterker het tegenion gebonden is aan de quaternaire aminegroep, hoe moeilijker het is voor de componenten uit het staal om het tegenion te verdringen. Voor beide kolommen wordt hetzelfde protocol gehanteerd om de vaste fase extractie uit te voeren. Bij de conditioneringsstap wordt er gekozen voor MeOH i.p.v. ACN, aangezien er in de literatuur meestal methanol gehanteerd wordt om te conditioneren. MeOH/mierenzuur (98/2) (v/v) wordt verkozen als solvent om te elueren [48, 65].
22
Tabel 4.1. Overzicht pakkingsmateriaal, functionele groepen, interacties en protocollen van polymerisch anionuitwisselingssorbenten, sorbenten met een gemende retentiemodus en Clean Screen. SPE-kolom
Oasis MAX
Strata-X-AW
Screen-A
Bond Elut NH2
Clean Screen
pKa ± 9
Pakkingsmateriaal Functionele groepen
polymeren quaternair amine
polymeren
silica
(1) diaminogroep (2) aromatische ring
(1) C8-keten (2) quaternair amine
silica aminopropyl (pKa = 9,8)
silica
Interacties
sterke anionuitwisseling
(1) zwakke anionuitwisseling
(1) hydrofoob
(1) hydrofiel
(1) hydrofoob
(1) hydrofiel
(2) sterke anionuitwisseling
(2) zwakke anionuitwisseling
(2) anionuitwisseling
1 mL MeOH 1 mL H2O
2 mL MeOH/MZA (99/1) (v/v) 2 mL H2O/MZA (99/1) (v/v) (pH = 2)
(1) co-polymeren (2) anionuitwisseling
(2) hydrofoob Conditioneren 2 mL MeOH 2 mL H2O
1 mL MeOH 1 mL H2O
2 mL MeOH 2 mL buffer B
1 mL ACN Laden Wassen
1,5 mL staal (pH = ±5) 1,5 mL staal (pH = ±5) 1 mL H2O/NH4OH (95/5) (v/v) (pH = 11,3) 2 mL bufferB 1 mL MeOH
Drogen bij 5 mmHg Elueren Referentie
1,5 mL staal (pH = ±5) 1,2mL AAbuffer*/MeOH (50/50) (v/v)
1,5 mL staal (pH = ±5) 2 mL H2O (pH = ±5)
2 mL MeOH
2 min vacuüm 2 min vacuüm 2 min vacuüm 1 mL MeOH/MZA (98/2) (v/v) 2 mL MeOH/NH4OH (95/5) (v/v) 1,2 mL MeOH/MZA (85/15) (v/v) catalogus Phenomenex, [67] en [29] en [66] [68] catalogus Phenomenex, [69] en [70]
A: MZ: mierenzuur, B: buffer: ammonium acetaat buffer / pH 6-7
1,5 mL staal (pH = ±5) 1 mL n-hexaan
23
15 min vacuüm 10 min vacuüm 1 mL H2O/NH3 (32%) (90/10) 3 mL MeOH/MZA (99/1) (v/v) (v/v) [56], [71] en [49]
[72]
Tabel 4.2. Overzicht pakkingsmateriaal, functionele groepen, interacties en protocollen van de sterke anionuitwisselingssorbenten. SPE-kolom
Bond Elut SAX
Pakkingsmateriaal silica Functionele groepen quaternair amine Interacties sterke anionuitwisseling 2 mL MeOH Conditioneren 2 mL H2O Laden 1,5 mL staal (pH = ±5) Wassen 1 mL H2O (pH = ±5) 1 mL ACN Drogen bij 5 mmHg 2 min vacuüm 1 mL ACN/H2O/MZA Elueren (95/4/1) (v/v/v) Referentie
[73] en [71]
Strata SAX
silica quaternair amine sterke anionuitwisseling 2 mL MeOH 2 mL bufferB 1,5 mL staal (pH = ±5) 1,2 mL bufferB/MeOH (50/50) (v/v) 2 mL MeOH 2 min vacuüm 1,2 mL MeOH/MZA (85/15) (v/v) catalogus Phenomenex, [69] en [74]
Isolute PE-AX
silica quaternair amine sterke anionuitwisseling 1 mL MeOH 1 mL H2O 1,5 mL staal (pH = ±5) 1 mL H2O/MeOH (50/50) (v/v)
silica quaternair amine sterke anionuitwisseling 2 mL MeOH 2 mL H2O 1,5 mL staal (pH = ±5) 2 mL H2O/MeOH (50/50) (v/v)
2 min vacuüm 1 mL MeOH/MZA (98/2) (v/v) catalogus Biotage, [75], [76] en [65]
15 min vacuüm 2 mL MeOH/MZA (98/2) (v/v)
A: MZ: mierenzuur , B: buffer: ammonium acetaat buffer / pH 6-7
Isolute SAX
24
catalogus Biotage, [75], [77] en [65]
4.2.2. Methoden De SPE experimenten worden telkens uitgevoerd met zes kolommen per type. De vaste fase extractie start met het conditioneren van de kolom. De kolom mag tussen de conditioneringsstappen door niet droog komen te staan. Na de conditionering wordt elke oplossing die de kolom doorloopt, opgevangen in verschillende soorten vials, afhankelijk van het volume. 30 µL interne standaard (IS) of EtG-D5 oplossing wordt in de vials gepipetteerd vooraleer de verschillende oplossingen erin worden opgevangen. Tabel 4.3. verduidelijkt de procedures die worden toegepast bij de verschillende SPE-stappen. De laadstap (staal) wordt gerecupereerd in een LCMS vial. Het totale volume in de vial bedraagt 1,5 mL: 1470 µL vanuit het buisje + 30 µL IS. De laadstap hoeft niet te worden drooggedampt. Doordat het een waterige oplossing is, kan deze meteen geïnjecteerd worden in de UPLC-MS/MS. Na de laadstap volgen één of meerdere wasstappen. Daaropvolgend wordt de kolom gedroogd bij een bepaalde druk die vooropgesteld wordt door het protocol. Vervolgens vindt de elutie plaats. De was- en elutiestappen worden gecollecteerd in high recovery vials. Afhankelijk van het volume wordt de eerste mL opgevangen in één vial en de tweede mL in een andere. De evaporatie gebeurt onder stikstof bij een temperatuur van 35 °C. De volgende wasstappen werden drooggedampt: MeOH, MeOH/ammonium acetaat buffer, MeOH/H2O, ACN en n-hexaan. De elutiestappen die werden drooggedampt zijn: MeOH/mierenzuur,
MeOH/NH4OH,
ACN/H2O/mierenzuur
en
H2O/NH3.
Na
het
droogdampen vindt de reconstitutie plaats. 100 µL van de mobiele fase, mierenzuur/H2O (0,1/99,9) (v/v), wordt aan de vials toegevoegd. Hiertoe wordt 100 µL van de mobiele fase, mierenzuur/H2O (0,1/99,9) (v/v) aan de vials toegevoegd (dit is de startconditie van de UPLC-analyse). Nadien worden alle vials gevortext en geanalyseerd met behulp van UPLCMS/MS. Tabel 4.3. Weergave van de verschillende SPE-stappen en hun procedures. Conditioneren variabel (zie protocol)
Laden 1470 µL staal
Wassen variabel (zie protocol)
Elueren variabel (zie protocol)
+
+
+
30 µL
30 µL
30 µL
Totaal volume
-
1500 µL
Droogdampen
-
-
Reconstitutie (100 µL)
-
-
variabel afhankelijk van wassolvent enkel na droogdampen
variabel afhankelijk van elutiesolvent enkel na droogdampen
Oplossing op de kolom gebracht Opgevangen in vial IS
25
Om nadien de recovery en het matrixeffect te berekenen worden er referentieoplossingen aangemaakt. Behalve voor de conditionering worden voor elke stap van de vaste fase extractie zes referentieoplossingen bereid. Voor het eluaat worden de referentieoplossingen bereid door 30 µL IS in high recovery vials te pipetteren en nadien droog te dampen. Vervolgens wordt 60 µL van de oorspronkelijke EtG werkoplossing (zie 4.1. voorbereiding haarstalen) en 40 µL mierenzuur/H2O (0,1/99,9) (v/v) in de vials gepipetteerd. Het totale volume bedraagt 100 µL. Dit is hetzelfde volume dat wordt verkregen bij de reconstitutie na de vaste fase extractie en dient als referentie voor de elutie. Ook voor de laad– en wasstap worden er zes referentieoplossingen bereid. Voor de laadstap wordt opnieuw 60 µL EtG werkoplossing, 30 µL IS en 1410 µL H2O in een LCMS vial overgebracht. De referentie voor de wasstap wordt bereid door 60 µL EtG werkoplossing en 940 µL H2O (1 mL) en 960 µL H2O (1,02 mL) in een vial te pipetteren. De referentieoplossingen worden niet onderworpen aan een vaste fase extractie. Na de aanmaak worden ze gevortext en geanalyseerd met UPLC-MS/MS. In tabel 4.4. worden bovenstaande stappen verduidelijkt. In de referentieoplossingen bevindt zich dezelfde hoeveelheid EtG zonder de aanwezigheid van een matrix. Deze oplossingen zijn de referenties die gebruikt worden bij de berekening van de verkregen resultaten. Tabel 4.4. Aanmaak van de referentieoplossingen.
EtG werkoplossing Mierenzuur/H2O (0,1/99,9) (v/v) IS (30 µL) H 20 Totaal volume
Laadstap 60 µL
Wasstap 60 µL
-
-
30 µL
30 µL
1410 µL 1500 µL
940 µL (1 mL) 960 µL (1,2 mL) 1 mL of 1,2 mL
Elutiestap 60 µL 40 µL 30 µL (vooraf drooggedampt)
100 µL
26
4.2.3. Berekeningen De hoeveelheid aan EtG (%) in elke stap wordt berekend door de verhouding te nemen van de respons van die stap op de respons van de referentie voor diezelfde stap (zie 4.2. Vaste fase extractie). Bij het berekenen van de respons wordt het gemiddelde genomen van de 6 verkregen waarden. De berekening van de wasstap is complexer omdat deze soms wel en soms niet geëvaporeerd wordt. Wanneer de wasoplossing na het droogdampen wordt gereconstitueerd in 100 µL wordt de berekening uitgevoerd door de verhouding te nemen van de respons van de wasstap op de respons van de referentiewaarde voor de elutie (100µL). Indien de wasoplossing niet wordt drooggedampt wordt de wasstap vergeleken met de referentie voor de was. In beide vials wordt 1 mL teruggevonden, zo kunnen deze vergeleken worden. De bepaling van EtG in het eluaat maakt het mogelijk de recovery te bepalen. De recovery wordt bepaald door de verhouding te nemen van de respons van het eluaat op de respons van de referentie. Bij deze experimenten wordt de IS na de extractie in elke vial toegevoegd. Eveneens wordt bij de berekening gerekend met de responsen i.p.v. de oppervlakten waardoor de IS compenseert voor het matrixeffect. Bovenstaande berekeningen worden verderop verduidelijkt, waar voor de verschillende SPE-stappen telkens het EtG (%) wordt berekend. De interne standaard (IS) EtG-D5 wordt toegevoegd aan de vials voordat de verschillende extractiestappen erin worden opgevangen. In normale omstandigheden wordt deze voor de extractie aaan het staal gevoegd, om op die manier te compenseren voor de verliezen van de analiet tijdens de extractie. Daarnaast wordt de IS ook gebruikt om een schatting te maken van het matrixeffect, aangezien er wordt verondersteld dat de IS en de analiet hetzelfde reageren. De schatting van het matrixeffect wordt berekend door het bepalen van de verhouding van de oppervlakte van de IS in het eluaat op de oppervlakte in zijn referentie.
27
𝑙𝑎𝑑𝑒𝑛 =
𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑠 𝑙𝑎𝑑𝑒𝑛 𝑠𝑡𝑎𝑎𝑙 ∗ 100 𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑠 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑡𝑖𝑒 𝑙𝑎𝑑𝑒𝑛
Droogdampen (100µL): 𝑤𝑎𝑠 =
𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑠 𝑤𝑎𝑠 ∗ 100 𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑠 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑡𝑖𝑒 𝑒𝑙𝑢𝑡𝑖𝑒
Niet droogdampen (1 mL): 𝑤𝑎𝑠 =
𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑠 𝑤𝑎𝑠 ∗ 100 𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑝𝑜𝑛𝑠 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑡𝑖𝑒 𝑤𝑎𝑠
𝑒𝑙𝑢𝑡𝑖𝑒 =
𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑠 𝑒𝑙𝑢𝑡𝑖𝑒 ∗ 100 𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑠 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑡𝑖𝑒 𝑒𝑙𝑢𝑡𝑖𝑒
𝑚𝑎𝑡𝑟𝑖𝑥𝑒𝑓𝑓𝑒𝑐𝑡 =
𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑜𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝐼𝑆 𝑒𝑙𝑢𝑡𝑖𝑒 ∗ 100 𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑜𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝐼𝑆 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑡𝑖𝑒 𝑒𝑙𝑢𝑡𝑖𝑒
28
4.3. ANALYSE 4.3.1. Materialen Gebruikte toestellen: •
UPLC-kolom: Acquity UPLC HSS T3, 2.1 x 100 mm, 1.8 µm (Waters Corp., Milford, USA)
•
Tandem massaspectrometer: Xevo TQ MS (Waters Corp., Milford, USA)
Gebruikte reagentia: •
Acetonitril (Biosolve, Valkenswaard, Nederland)
•
mierenzuur/H2O (0,1/99,9) (v/v) (Biosolve Chimie, Dieuze, Frankrijk)
4.3.2. Methoden UPLC-MS/MS condities: Kolom: Acquity UPLC High Strength Silica (HSS) T3 Column, 2.1 x 100 mm, 1.8 µm Mobiele fase: A: mierenzuur/MeOH (0,1/99,9) (v/v) B: Acetonitril Temperatuur kolom: 60°C
Injectievolume: 5 µL
Stroomsnelheid: 400 µL/min Alle oplossingen van de laadstap, wasstap en elutiestap worden onderworpen aan een UPLCMS/MS. Gradiëntelutie wordt toegepast, de verandering van de mobiele fase in functie van de tijd wordt weergegeven in Tabel 4.4. De totale looptijd bedraagt 3 minuten, waarbij de mobiele fase met een debiet van 400 µL/min doorheen de kolom wordt gestuurd. EtG wordt gedetecteerd door middel van een UPLC-ESI-MS/MS met ESI in negatieve MRM modus. Er wordt een post-kolom additie toegepast met isopropanol. De post-kolom additie wordt toegevoegd aangezien uit eerdere experimenten dit het meest geschikte solvent bleek. Een post-kolom additie wordt toegepast om de ionsuppressie te verminderen en zo het signaal van de analiet te verbeteren [78]. De data worden verzameld met MassLynx software. De resultaten worden verwerkt door middel van Microsoft Excel 2010.
29
Tabel 4.4. Gradiënt UPLC-MS/MS Tijd (min) 0,0 2,0 2,1 2,5 2,6 3,0
Debiet (mL/min) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
Mobiele fase A (%) 99 88 0 0 99 99
Mobiele fase B (%) 1 12 100 100 1 1
Tabel 4.5. Parameters MS Scan Type MS2 scan Ion Modus ESStart massa 50 Einde massa 250 Scan tijd (sec) 0,05 Interscan tijd (sec) xA Start tijd (min) 0 Stop tijd (min) 3 Cone voltage (V) 30 A: automatisch ingesteld door het programma IntelliStart. Tabel 4.6. MS parameters Capillary (kV) Cone (V) Extractor (V) Source Temperatuur (°C) Desolvation Temperature (°C) Cone Gas Flow (L/Hr) Desolvation Gas Flow (L/Hr) Collision Gas Flow (mL/Min)
1 18 3 150 650 40 900 0,35
30
De detectie gebeurde in multiple reaction monitoring (MRM) modus waarbij de parameters worden gehanteerd die weergegeven worden in Tabel 4.7. Het eerste product ion van EtG wordt gebruikt om EtG te kwantificeren. Het tweede dient ter identificatie. Tabel 4.7. MRM condities EtG en EtG-D5 Molecule EtG EtG EtG-D5
Precursor ion 220,96 220,96 225,97
Product ion 74,95 84,96 84,9
Dwell (s) 0,11 0,11 0,19
Collision (eV) 22 24 30
31
4.4. OPTIMALISATIE SPE 4.4.1. Materialen Gebruikte toestellen: zie 4.2. Vaste fase extractie Gebruikte reagentia: •
Oasis MAX: nieuwe wasstappen: 1. H2O/NH3 (95/5) (v/v) 2. MeOH/NH3 (98/2) (v/v), ACN/NH3 (95/5) (v/v) of n-hexaan.
•
Isolute PE-AX: nieuwe wasstap: 1. H2O 2. MeOH of ACN.
•
Isolute SAX: nieuwe wasstap: 1. H2O 2. MeOH of ACN.
•
Clean Screen: nieuwe wasstap: 1. H2O 2. MeOH of ACN.
•
Bond Elut SAX: nieuwe elutiesolventen: -HCl/ACN/H2O (0.26/84/16) (v/v/v) -HCl/MeOH/H2O (0.26/84/16) (v/v/v) -15% mierenzuur in ACN/H2O (95/4) (v/v) -1,5% mierenzuur in ACN/H2O (95/4) (v/v) -2% mierenzuur in ACN/H2O (95/4) (v/v) -3% mierenzuur in ACN/H2O (95/4) (v/v) -4 % mierenzuur in ACN/H2O (95/4) (v/v) -6 % mierenzuur in ACN/H2O (95/4) (v/v) -0,1% TFA in ACN/H2O (95/4) (v/v)
• Trifluoroazijnzuur (TFA) (Biocompare, San Francisco, USA) 4.4.2. Methoden De vaste fase extracties met de nieuwe was– en elutiesolventen worden op dezelfde manier uitgevoerd als de eerder beschreven methode bij 4.2. Vaste fase extractie. Ditmaal wordt 3 keer dezelfde extractie uitgevoerd met het nieuwe solvent.
32
4.5. BEPALEN MATRIXEFFECT EN RECOVERY: CLEAN SCREEN EN BOND ELUT SAX 4.5.1. Materialen Gebruikte toestellen en reagentia: zie 4.2. Vaste fase extractie 4.5.2. Methoden Er worden 3 soorten oplossingen bereid. Vooraf wordt een EtG werkoplossing bereid met een intermediaire concentratie van 100 pg/mg haar. De experimenten van de recovery en het matrixeffect kunnen samen worden uitgevoerd. Van elke onderstaande oplossing worden er 6 exemplaren aangemaakt. ANALIET NA EXTRACTIE (A) De stalen met intermediaire concentratie van de analiet worden op die manier bereid dat de reële matrix zo goed mogelijk wordt benaderd. De experimenten worden uitgevoerd zoals bij 4.2. Vaste fase extractie, met het verschil dat nu enkel 1470 µL H2O in de buisjes wordt gebracht. Het eluaat, waarin de IS zich bevindt, wordt drooggedampt. Nadien wordt er 60 µL EtG werkoplossing en 40 µL mierenzuur/H2O (0,1/99,9) (v/v) in de vials gepipetteerd. Zowel de analiet (100%) als de interne standaard (100%) worden na de extractie aan het blanco extract toegevoegd. ANALIET VOOR EXTRACTIE (B) De stalen worden bereid waarbij de analiet met een intermediaire concentratie zich in dezelfde matrix als de reële stalen bevindt. De stalen worden behandeld zoals bij 4.2. Vaste fase extractie. De analiet wordt voor de extractie toegevoegd, de interne standaard wordt pas na de extractie toegevoegd (100%). ANALIET IN REFERENTIEOPLOSSING (C) De referentieoplossingen worden bereid door 6 maal exact dezelfde hoeveelheid EtG werkoplossing te nemen die voordien gebruikt werd bij oplossingen (A) en (B). Deze referentieoplossingen worden aangemaakt om de hoeveelheid EtG te verifiëren die verkregen wordt zonder extractie (100%) en zonder de aanwezigheid van de matrix.
33
Voor de vaste fase extractie van Clean Screen wordt het standaardprotocol gehanteerd dat eerder beschreven werd in 4.2. Vaste fase extractie. Voor de Bond Elut SAX werd eveneens het standaardprotocol gehanteerd, enkel de elutieoplossing werd veranderd. Er werd gebruik gemaakt van 2% mierenzuur in ACN/H2O (95/4) (v/v). De berekeningen voor het matrixeffect en de recovery worden in onderstaande formules weergegeven. Zowel het absolute als het relatieve matrixeffect (%) worden bepaald. Het absolute matrixeffect is een weergave van het matrixeffect op de analiet. Een percentage van 100% geeft de afwezigheid van een matrixeffect aan. Een waarde kleiner dan 100% geeft ionsupressie weer, een hogere waarde duidt ionversterking aan. Ook de relatieve standaarddeviatie (RSD%) wordt bij het matrixeffect vermeld, dit om de standaarddeviatie van de resultaten uit te drukken. De onderstaande berekening voor het absoluut matrixeffect wordt 6 keer uitgevoerd. Tenslotte wordt het gemiddelde genomen. Bij het relatief matrixeffect (%) wordt dit gecompenseerd door de interne standaard. De berekening wordt in onderstaande formule weergegeven. Hiervan wordt het gemiddelde berekend en dit is het uiteindelijke relatieve matrixeffect. Idealiter zou dit 100% moeten zijn. Dit is zo indien de IS en de analiet hetzelfde reageren. Wanneer de waarde geen 100% is zal één van beide meer ionsuppressie of ionversterking ondervinden. Eveneens wordt het RSD% erbij vermeld. De recovery (%) duidt de fractie van EtG aan die overblijft na de extractie van het oorspronkelijk staal (100%) [30, 79]. 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑢𝑡 𝑚𝑎𝑡𝑟𝑖𝑥𝑒𝑓𝑓𝑒𝑐𝑡 % =
𝑜𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑒𝑡 (𝐴) ∗ 100 𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑜𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑒𝑡 (𝐶)
𝑜𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑒𝑡 (𝐴) 𝑜𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝐼𝑆 (𝐴) 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑒𝑓 𝑚𝑎𝑡𝑟𝑖𝑥𝑒𝑓𝑓𝑒𝑐𝑡 % = ∗ 100 𝑜𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑒𝑡 (𝐶) 𝑜𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝐼𝑆 (𝐶) 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 % =
𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑝𝑜𝑛𝑠 (𝐵) ∗ 100 𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑝𝑜𝑛𝑠 (𝐶)
34
5.
RESULTATEN EN DISCUSSIE
Door middel van chromatografie met een HSS T3 kolom en tandem massaspectrometrie worden de verschillende stappen van de vaste fase extractie geanalyseerd. Op die manier wordt een schatting verkregen van de hoeveelheid EtG die in elke stap terechtkomt. EtG is een polaire molecule met ioniseerbare groepen en er wordt verondersteld dat de molecule voornamelijk dankzij de ioniseerbare groepen wordt weerhouden op de kolom. In onderstaande resultaten worden de hoeveelheden EtG in elke stap en het matrixeffect weergegeven. Hierbij dient rekening te worden gehouden met het feit dat deze waarden slechts schattingen zijn. 5.1. RESULTATEN PRIMAIRE TESTEN VASTE FASE EXTRACTIE 5.1.1. Verlies in de laad– en wasstap De extractie van EtG uit de haarmatrix gebeurt met water. In de literatuur wordt beschreven dat door middel van water zoveel mogelijk EtG wordt geëxtraheerd. Er wordt besloten om het extractiesolvent niet te wijzigen. Een eerste selectie van de kolommen wordt gemaakt op basis van het verlies aan EtG in de laadstap. Grafiek 5.1. geeft de SPE-kolommen weer waarbij EtG verloren gaat in de laadstap en grote hoeveelheden worden teruggevonden in de wasstap. Met deze SPE-kolommen worden geen verdere experimenten uitgevoerd omwille van het verlies in zowel de laad– als de wasstap. Grafiek 5.1. Resultaten van SPE-kolommen die EtG verliezen in de laad – en wasstap. (n=6) Verlies bij laad- en wasstap 100
EtG (%)
80
1
60 40
42
76
17
2
7 15
Elutie
58
Laden
Was
20 0
Strata X-AW
Screen A
Bond Elut NH2
SPE-kolommen
35
Strata-X-AW De pH van het staal dat op de kolom wordt gebracht is ± 5. Bij deze pH zijn de zwakke anionuitwisselingsgroepen van de Strata-X-AW geladen. Toch gaat er ± 17% verloren in de laadstap. Dit kan verklaard worden doordat de pH geen 2 volledige eenheden boven de pKa van EtG (3,21) ligt. Hierdoor is EtG niet volledig geladen en gaat er een deel verloren in de laadstap. Er wordt ± 42% teruggevonden in de beide wasstappen: ± 41% door te wassen met 25 mM ammoniumacetaat buffer/H2O (pH= 6-7) en ± 1% door te wassen met MeOH. In theorie kan dit verschijnsel verklaard worden aan de hand van drie parameters: de pH, de ionensterkte en de selectiviteit van de tegenionen van de wasoplossing. Bij zwakke anionuitwisselaars wijzigt de lading van de functionele groepen van het sorbent afhankelijk van de pH. De pKa van het sorbent bedraagt ± 9. De pH van de buffer is 6 à 7 waardoor de functionele groepen van het sorbent en van de analiet geladen blijven. De functionele groepen verliezen hun lading niet, wat ertoe leidt dat de pH van de wasoplossing waarschijnlijk geen aanleiding geeft tot een vroegtijdige elutie. De aanwezige ionen in de wasoplossing kunnen de componenten, die op de kolom weerhouden worden, verdringen van hun bindingsplaats. Het mechanisme wordt veroorzaakt door een hoge ionensterkte of een hoge selectiviteit van de tegenionen [48]. In het eluaat wordt de analiet nauwelijks (± 0%) teruggevonden. De oorspronkelijke elutieoplossing is het mengsel MeOH/NH4OH (95/5) (v/v). Een mengsel bestaande uit mierenzuur/MeOH zou een mogelijk nieuw elutiesolvent kunnen zijn. Verdere experimenten zijn nodig om de stelling te verifiëren. Toch wordt de Strata-X-AW in dit onderzoek niet verder geoptimaliseerd vanwege het verlies van EtG in de laad- en wasstap. Een schatting van het matrixeffect geeft een waarde van ± 120 % (RSD % = 1) weer.
36
Screen-A Er gaat nagenoeg geen EtG (± 2%) verloren bij de laadstap. ±76 % van de analiet wordt bij het wassen niet langer weerhouden op de kolom en wordt geëlueerd met de wasoplossingen : 25 mM ammoniumacetaat buffer/MeOH (50/50) (v/v) en MeOH. Opnieuw kunnen de drie parameters die eerder vermeld werden bij Strata-X-AW, een aanleiding geven tot het vroegtijdig verlaten van de analiet van de kolom. Bij het gebruik van de ammoniumacetaat buffer komt ± 71 % EtG in de was terecht. Aangezien Screen-A een sterke anionuitwisselaar is en de pH van de buffer 6-7 bedraagt, wordt het verlies waarschijnlijk grotendeels teweeg gebracht door een hoge ionensterkte of een hoge selectiviteit van de tegenionen in de wasoplossing. Ook in dit geval werd quasi geen EtG (± 1%) aangetroffen in het eluaat. Het matrixeffect wordt geschat op ± 67% (RSD % = 13), geassocieerd met een ionsuppressie van ± 33 %. Bond Elut NH2 Gedurende de laadstap wordt ± 58 % van de analiet niet weerhouden op de kolom. Dit verschijnsel kan worden verklaard door de conditionering van de kolom. De laatste stap van de conditionering bereidt het pakkingsmateriaal voor op het laden van het staal. Overeenkomstig met de gevolgde procedure voor de Bond Elut NH2 is dit ACN. De polaire functionele groepen op de kolom vertonen weinig affiniteit voor het organisch solvent ACN. Als reactie hierop verkleinen de polaire functionele groepen het contactoppervlak waardoor de groepen minder beschikbaar zijn. De daaropvolgende interactie kan niet maximaal plaatsvinden [52]. De aminegroep die zorgt voor de zwakke anioninteractie, is ook verantwoordelijk voor een polaire interactie. Waarschijnlijk komt zo een deel van de analiet in de laadstap terecht. ± 15% EtG wordt met n-hexaan in de wasstap meegenomen en ± 7% komt uiteindelijk in de elutie terecht. n-hexaan wordt gehanteerd als wasstap om alle apolaire moleculen die gebonden zijn van de kolom te verwijderen. Het matrixeffect bij het gebruik van deze kolom heeft een waarde van ± 87% (RSD% = 7). Verdere experimenten dienen uitgevoerd te worden om te bevestigen dat het conditioneren met ACN het verlies bij het laden veroorzaakt. Het wijzigen van de solventen bij het conditioneren zou mogelijk een verbetering van de vaste fase extractie opleveren. Voor de elutie moet er vooral rekening worden gehouden met de pH. Met deze SPE-kolommen (Screen-A, Strata-X-AW, Bond Elut NH2) worden geen verdere experimenten uitgevoerd omwille van de verliezen in de laad– en de wasstap.
37
5.1.2. Oasis MAX en Clean Screen Grafiek 5.2. Vaste fase extractie van Oasis MAX en Clean Screen. (n=6) Vaste fase extractie Oasis MAX en Clean Screen Matrixeffect 120 100 80 60 40 20 0
70
62
Laden
Was
Elutie
106
61
17 EtG (%)
Matrixeffect Oasis MAX
EtG (%)
Matrixeffect (%) Clean Screen
Oasis MAX Met een vaste fase extractie met Oasis MAX wordt een recovery bereikt van ± 70%. Ondanks de hydrofobe interacties die opgewekt worden door de polymeren zijn het vermoedelijk de anioninteracties die voornamelijk ervoor zorgen dat EtG op de kolom weerhouden blijft [29]. Bij de Oasis MAX gaat niets verloren in de laadstap. Er wordt ± 17% van de analiet teruggevonden in de was met H2O/NH4OH en MeOH. Het verlies tijdens het wassen kan mogelijks verklaard worden door de ionensterkte van de oplossing H2O/NH4OH waardoor de ionen in staat zijn om de analiet van de kolom te verdrijven. De wasstap met H2O/NH4OH werd drooggedampt in de vials. Nadien werd een witte neerslag in de vials waargenomen. Verder kan uit grafiek 5.2. worden afgeleid dat de Oasis MAX geen optimale recovery bezit. Daarnaast wordt er ± 62% (RSD% = 10) matrixeffect waargenomen, wat geassocieerd wordt met een ionsuppressie van ± 38%. De vaste fase extractie van Oasis MAX wordt geoptimaliseerd om zoveel mogelijk interferenties te verwijderen. Dit heeft als doel het matrixeffect te verlagen. Clean Screen Een vaste fase extractie met Clean Screen resulteerde in een recovery van ± 106%. Het matrixeffect bedroeg ± 61% (RSD% = 13), wat geassocieerd wordt met een ionsuppressie van ± 39%. Verdere experimenten zullen worden uitgevoerd om het matrixeffect te verkleinen. Belangrijk om te vermelden is de relatief hoge kostprijs van de kolom.
38
5.1.3. Sterke anionuitwisselaars Alle sterke anionuitwisselaars bezitten een quaternair amine als functionele groep. Die zit gebonden aan het oppervlak van silica. Uit onderstaande grafiek 5.3. wordt afgeleid er onderling zeer grote verschillen zijn, ondanks gelijkaardige principes voor de verschillende sterke anionuitwisselaars. Grafiek 5.3. EtG% in elke stap en het matrixeffect voor alle sterke anionuitwisselaars. (n=6) 120 Matrixeffect
Laden
Was
100
Elutie 105
100
80 60
111
40
64 46
84 31
20 16
0
33
EtG (%) Matrixeffect EtG (%) Matrixeffect EtG (%) Matrixeffect EtG (%) Matrixeffect (%) (%) (%) (%) Isolute SAX
Isolute PE-AX
Strata SAX
Bond Elut SAX
Isolute SAX en PE-AX resulteren in een matrixeffect van ± 46% (RSD% = 10) (SAX) en ± 64% (RSD% = 9) (PE-AX). Beide kolommen hebben een zeer goede recovery, nl. ± 111% (SAX) en ± 85% (PE-AX). Het onderscheid tussen beide kolommen is het verschil in het tegenion van de functionele groepen. Isolute SAX heeft een chloride als tegenion, Isolute PEAX bevat een acetaat als tegenion [65]. Bij de Strata SAX wordt er in de laadstap geen EtG aangetroffen. Er wordt ± 16% in de wasstap gerecupereerd door middel van ammoniumacetaat buffer/MeOH (50/50) (v/v) met een pH 6-7. Het verlies in de wasstap kan eventueel verklaard worden door de selectiviteit van de tegenionen of de ionensterkte van de wasoplossing [48]. Er wordt ± 31% in het eluaat teruggevonden. Het matrixeffect van de Strata SAX is echter zeer klein, de waarde bedraagt ± 105% (RSD% = 5).
39
Tenslotte bedraagt de recovery ± 33% voor de Bond Elut SAX. Het grote voordeel van deze kolom is dat er nagenoeg geen matrixeffect (± 100%) (RSD% = 3) aanwezig is. Het matrixeffect van Isolute SAX en PE-AX geeft weer dat er veel interferenties co-elueren met de analiet. Er werd besloten om de wasoplossingen te optimaliseren zodat de interferenties efficiënter worden verwijderd in de wasstap zonder dat daarbij minder EtG geëlueerd wordt. Dit heeft als doel het matrixeffect te verkleinen. Bij de Bond Elut SAX wordt er geen matrixeffect waargenomen. Uit de experimenten blijkt dat de wasstap voldoende geschikt is, aangezien alle interferenties tijdens de wasstap verwijderd worden. Er wordt besloten om de elutiestap aan te passen om een betere recovery te verkrijgen. Bij een sterke anionuitwisseling zijn de functionele groepen op de kolom steeds geladen. Om EtG te laten elueren, is het noodzakelijk dat de analiet zijn lading verliest. EtG heeft een pKa van 3,21. De functionele groepen van EtG zijn voor 99% ongeladen bij een pH die 2 eenheden lager ligt dan de pKa. In dit geval 1,21. De Bond Elut SAX heeft echter silica als pakkingsmateriaal, wat enkel stabiel is bij een pH van 2 tot 7,5. Voor de optimalisatie wordt een compromis tussen beiden gesloten door een elutiesolvent aan te maken met een pH ± 2,3 [48, 49]. 5.2. OVERZICHT MATRIXEFFECT KOLOMMEN Grafiek 5.4. geeft de matrixeffecten weer van alle geteste SPE-kolommen. De Isolute SAX geeft het meest aanleiding tot ionsuppressie en bezit het grootste matrixeffect (46%). Clean Screen, Oasis MAX, Isolute PE-AX en Screen-A veroorzaken ongeveer allemaal hetzelfde matrixeffect (± 64%). Van deze vier kolommen bezit de Clean Screen het grootste matrixeffect (± 61%) maar wel de hoogste recovery (± 106%). De enige SPE-kolom zonder matrixeffect is de Bond Elut SAX, met als nadeel een lage recovery van ± 33%. Voor de Strata-X-AW wordt een ionversterking vastgesteld. Dit is niet significant en valt gewoon onder de meetonzekerheid.
40
Grafiek 5.4. Matrixeffect (%) van EtG-D5 van alle SPE-kolommen. De gemiddelde waarde wordt vermeld. De foutenbalken geven het RSD% weer. (n=6) Matrixeffect EtD-D5(%) 140
Matrixeffect (%)
120 120
100 100
80
87
60 40
105
61
62
Clean Screen
Oasis MAX
64
67
46
20 0 Isolute SAX
Isolute Screen-A Bond Elut Bond Elut PE-AX NH2 SAX SPE-kolommen
Strata SAX
Strata XAW
5.3. OPTIMALISATIE VASTE FASE EXTRACTIE 5.3.1. Oasis MAX In de oorspronkelijke wasstap werden 1 mL H2O/NH4OH (95/5) en 1 mL MeOH gebruikt om de kolom te wassen. Ondanks het feit dat 11% EtG in de eerste was werd teruggevonden, werd er besloten om de eerste wasstap te behouden om zoveel mogelijk polaire interferenties te verwijderen. De volgende wasstap met 1 mL methanol werd vervangen door MeOH/NH3 (98/2) (v/v), ACN/NH3 (95/5) (v/v) en n-hexaan. De wasstap met MeOH/NH3 (98/2) (v/v) werd voordien al toegepast bij de methode volgens Pragst et al. (2008) [28]. Aan MeOH of ACN wordt ammoniak toegevoegd zodat de oplossing voldoende basisch zou zijn. n-Hexaan werd al eerder gebruikt bij een LC-MS/MS methode in de literatuur [30].
41
Uit grafiek 5.5. kan worden afgeleid dat de aanpassingen geen verbetering opleverden voor het matrixeffect. MeOH/NH3 en ACN/NH3 zorgen voor een gelijkaardig matrixeffect, nl. ± 40%. Het verlies in de wasstap en de recuperatie van EtG in de elutiestap zijn te vergelijken met het oorspronkelijk protocol. Met het gebruik van n-hexaan als wasstap is de recovery ± 107%, waarbij een hogere ionsuppressie wordt waargenomen (matrixeffect ± 23%). Er kan besloten worden dat er geen verbetering optreedt door het gebruik van de nieuwe wasstappen. Oasis MAX is een kolom die opgebouwd is uit polymeren. Hierdoor is de kolom stabiel bij een pH range van 0 tot 14. Aangezien de kolom stabiel blijft bij een groot pH gebied is het mogelijk om het oorspronkelijke protocol te optimaliseren door een meer zure oplossing te hanteren voor de elutie [49, 80]. Grafiek 5.5. Optimalisatie wasstap Oasis MAX. (n=3) Optimalisatie wasstap Oasis MAX Matrixeffect
Laden
Was
Elutie
120 100 80
43
MeOH (primaire test) MeOH (optimalisatie MeOH/NH3 (98/2) test)
40
ACN/NH3 (98/2)
23 Matrixeffect (%)
11 EtG (%)
EtG (%)
15 Matrixeffect (%)
EtG (%)
28
24
17
72
Matrixeffect (%)
45
Matrixeffect (%)
0
107
55
59
EtG (%)
20
62
Matrixeffect (%)
40
70
EtG (%)
60
n-hexaan
42
5.3.2. Bond Elut SAX Bij de primaire testen met de Bond Elut SAX wordt er slechts ± 33% van EtG in het eluaat teruggevonden. De elutieoplossing in het oorspronkelijk protocol is ACN/H2O/mierenzuur (95/4/1) (v/v/v). Het initieel protocol geeft aanleiding tot de afwezigheid van een matrixeffect.
Uit grafiek 5.6. blijkt dat het eluaat geen EtG bevat bij een gebruik van HCl in een mengsel van ACN met H2O en in een mengsel van MeOH met H2O. Er is eveneens geen matrixeffect aanwezig. 0,1% TFA in ACN/H2O (95/5) (v/v) zorgt ervoor dat slechts ± 13% finaal elueert. Wanneer mierenzuur wordt toegevoegd aan het elutiesolvent kan er geconcludeerd worden dat bij een stijging van het percentage mierenzuur, m.a.w. bij een dalende pH, meer EtG in het eluaat gerecupereerd wordt. Het gevolg hiervan is echter dat er naast de analiet ook meer interferenties in het eluaat terechtkomen, wat tot een toenemend matrixeffect leidt. Wanneer de pH onder 2 daalt, kan de silica degenereren. Dit kan eveneens aanleiding geven tot de verhoogde ionsuppressie. Voor kolommen met een ionuitwisselingsinteractie leiden 3 parameters tot de elutie van de analiet: de pH, de ionensterkte en de selectiviteit van de tegenionen van het solvent. Hierbij speelt vooral de pH een belangrijke rol [48]. Een lage recovery vormt op zich geen probleem, zolang deze reproduceerbaar is en de gevoeligheid van de methode gewaarborgd wordt. Het matrixeffect is bij voorkeur zo klein mogelijk, aangezien deze factor veel minder reproduceerbaar is en dus niet bij elke analyse hetzelfde zal zijn.
Na de optimalisatie werd besloten dat 2% mierenzuur in ACN/H2O (95/4) (v/v) een goede elutieoplossing zou zijn, deze oplossing biedt een recovery van ± 68%. Daarnaast wordt er een ionsuppressie waargenomen van ±21%.
43
Grafiek 5.6. Optimalisatie elutie Bond Elut SAX. (n=3) Optimalisatie elutie Bond Elut SAX 100 100
99
98
90
90
94
90 85
80
79
78
70
71
60 50
68
63
59
56
78
61
40 30
33
20 10
13
HCl/ACN/H2O pH 2
HCl/MeOH/H2O pH 2
0,1% TFA in ACN/H2O
Matrixeffect (%)
EtG (%)
Matrixeffect (%)
EtG (%)
Matrixeffect (%)
EtG (%)
Matrixeffect (%)
EtG (%)
Matrixeffect (%)
EtG (%)
Matrixeffect (%)
EtG (%)
Matrixeffect (%)
EtG (%)
Matrixeffect (%)
EtG (%)
Matrixeffect (%)
EtG (%)
Matrixeffect (%)
EtG (%)
0
15% mierenzuur in 6% mierenzuur in 4% mierenzuur in 3% mierenzuur in 2% mierenzuur in 1,5% mierenzuur 1% mierenzuur in ACN/H2O ACN/H2O ACN/H2O ACN/H2O ACN/H2O in ACN/H2O ACN/H2O
44
5.3.3. Isolute SAX, Isolute PE-AX en Clean Screen Een vaste fase extractie met Isolute SAX, Isolute PE-AX en Clean Screen wordt gekenmerkt door een hoge recovery, maar is gekoppeld aan een aanzienlijk matrixeffect. Aangezien er veel interfererende stoffen in het uiteindelijke eluaat terechtkomen, wordt geprobeerd om de wasstap te optimaliseren. In grafiek 5.7. en 5.8. worden de resultaten van de optimalisatie van de wasstap bij Isolute SAX, Isolute PE-AX en Clean Screen weergegeven. Uit de twee grafieken blijkt dat er nagenoeg geen verandering optreedt voor zowel de geschatte recovery als het matrixeffect. Uit grafiek 5.7. kan worden besloten dat de wasstap met 1 mL H2O gevolgd door 1 mL MeOH steeds het kleinste matrixeffect oplevert. Grafiek 5.7. Matrixeffect (%) EtG-D5. De gemiddelde waarde wordt vermeld. De
Matrixeffect (%)
foutenbalken geven het RSD% weer. (n=3)
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Matrixeffect (%) EtG-D5
67 58
100% MeOH
100% ACN
56
protocol
Isolute PE-AX
67
64
100% MeOH
45
46
100% ACN
protocol
Isolute SAX Verschillende wasstappen
100% MeOH
60
61
100% ACN
protocol
Clean Screen
45
Grafiek 5.8. EtG (%) in eluaat bij de optimalisatie van de wasstap. De gemiddelde waarde wordt vermeld. De foutenbalken geven het RSD% weer. (n=3) Recovery bij optimalisatie
EtG (%) in eluaat
140 120 100 80
103
97
90
107
111 90
84
60
102
106
100% ACN
protocol
40 20 0 100% MeOH
100% ACN
protocol
Isolute PE-AX
100% MeOH
100% ACN
protocol
Isolute SAX verschillende wasstappen
100% MeOH
Clean Screen
46
5.4. MATRIXEFFECT EN RECOVERY De experimenten voor het matrixeffect en de recovery worden gelijktijdig uitgevoerd. Voor het matrixeffect wordt zowel het absoluut als relatief matrixeffect uitgerekend. Het matrixeffect speelt een belangrijke rol in dit onderzoek, aangezien de ionsuppressie die geassocieerd is aan de matrix, leidt tot een lagere gevoeligheid. EtG is slechts in lage concentraties aanwezig in haar. Een voldoende hoge gevoeligheid is noodzakelijk om deze lage concentraties te kwantificeren [81]. 5.4.1. Clean Screen Tabel 5.1. Absoluut en relatief matrixeffect van Clean Screen met vermelding van RSD%. Absoluut matrixeffect (%)
RSD %
Relatief matrixeffect (%)
RSD %
73
5
128
11
Het absoluut matrixeffect bedraagt 73% (RSD% = 5), hetgeen inhoudt dat de ionsuppressie voor EtG 27% is. Het relatief matrixeffect wordt berekend door de IS mee in rekening te brengen. Wanneer de ionsuppressie voor de IS en de analiet dezelfde is, bedraagt het relatief matrixeffect 100%. Het relatief matrixeffect bedraagt 128% in onze experimenten. Dit wil zeggen dat de interne standaard meer ionsuppressie ondervindt dan de analiet zelf. Hierop werd het absoluut matrixeffect op de IS berekend. Voor de IS bedraagt de ionsuppressie 42%, voor EtG is dat slechts 27%. De recovery van de Clean Screen bedraagt 83%.
47
5.4.2. Bond Elut SAX Tabel 5.2. Absoluut en relatief matrixeffect van Bond Elut SAX met vermelding van RSD%. Absoluut matrixeffect (%) 81
RSD % 4
Relatief matrixeffect (%) 125
RSD % 10
Opnieuw wordt bij de Bond Elut SAX een verschillende waarde voor het absoluut en relatief matrixeffect verkregen. Het absoluut matrixeffect bedraagt 81% (RSD% = 4) waardoor de ionsuppressie voor de analiet 19% is. Het relatief matrixeffect heeft een waarde van 125%. Uit deze waarden kan worden afgeleid dat de interne standaard meer ionsuppressie ondervindt dan de analiet EtG. Hierop werd het absoluut matrixeffect op de IS berekend. Voor de IS bedraagt de ionsuppressie 35%, voor EtG is dat slechts 17%. De recovery hiervan bedraagt 69%. In normale omstandigheden reageert de IS op dezelfde manier als de analiet aangezien de twee componenten nagenoeg identiek zijn qua chemische structuur. Op die manier zou de ionsuppressie op de IS even groot moeten zijn, waardoor de IS compenseert voor het matrixeffect. In figuur 5.1. wordt het verschil tussen beide weergeven in een chromatogram. De figuur geeft weer dat de analiet en de interne standaard niet op dezelfde manier reageren. De pieken in de grafiek overlappen niet, omdat de retentietijd van beide verschillend is, hetgeen kan leiden tot een verschillend matrixeffect. Een verklaring voor dit fenomeen kan gevonden worden in het feit dat er zich een deuterium i.p.v. een waterstof in de chemische structuur bevindt. Hierdoor wijzigt de lipofiliciteit en bijgevolg ook de retentietijd van de IS op de omgekeerde fase kolom. Deze wijziging kan problematisch zijn wanneer de piek van een interfererende matrix component ongeveer dezelfde retentietijd heeft als de IS en de analiet. Doordat beiden een verschillende retentietijd bezitten, kunnen ze beiden anders beïnvloed worden door de matrix. De verklaring voor dit probleem wordt aangehaald door Van Eeckhaut et al. (2009) en andere studies [78, 79].
48
Een verschillend matrixeffect tussen de IS en de analiet hoeft daarom niet voor problemen te zorgen bij de analyse. Wanneer deze verschillen consequent hetzelfde zijn, kan dit in rekening worden gebracht. Verdere experimenten moeten uitwijzen of het verschil in ionsuppressie tussen beiden steeds hetzelfde is bij iedere matrix. Bijkomend onderzoek met allerlei matrices (verschillende haarkleur, leeftijd, ras en geslacht) is noodzakelijk om na te gaan of de IS steeds eenzelfde grotere ionsuppressie ondervindt bij het gebruik van de Clean Screen en de Bond Elut SAX. Indien niet, kan geopteerd worden om een andere IS te gebruiken, vb.
13
C
gelabelde interne standaard [78]. Matrixeffecten zijn aanvaardbaar zolang de gevoeligheid voldoende hoog blijft en het effect reproduceerbaar is bij verschillende soorten haarstalen. Bijkomend onderzoek moet worden verricht om na te gaan of verschillende haarmatrices hetzelfde matrixeffect teweeg brengen [81]. Matrixeffecten kunnen ook verholpen worden door over te schakelen op een andere ionisatiebron, van ESI naar APCI. Dit zou het matrixeffect kunnen verminderen, al heeft APCI een lagere gevoeligheid dan ESI [78, 81].
49
1,32%
1,33%
EtG:%220,957%>%84,956% EtG:%220,957%>%74,946% EtG0D5:%225,968%>%84,897%
Figuur 5.1. Chromatogram waar bij de vaste fase extractie gebruik gemaakt werd van de Clean Screen. Op dit chromatogram is te zien dat de pieken van de analiet en de piek van de IS niet overlappen.
50
6.
CONCLUSIE
6.1. ELIMINATIE OP BASIS VAN DE LAAD – EN WASSTAP Er werd besloten om de in de literatuur beschreven extractiestap van EtG uit hoofdhaar te behouden. De analiet werd geëxtraheerd met behulp van water. Bijgevolg bestaat de laadstap steeds uit een waterig extract. Wanneer uit de primaire testen bleek dat een kolom EtG verliest in de ladingstap werd deze geëlimineerd. Bond Elut NH2 en Strata-X-AW werden op basis van dit criterium niet verder onderzocht. Met de Screen-A werden geen verdere experimenten uitgevoerd aangezien er een grote hoeveelheid van de analiet tijdens de wasstap van de kolom werd verdreven. 6.2. VERMINDEREN VAN HET MATRIXEFFECT Diverse wasstappen werden uitgetest ter verbetering maar het oorspronkelijk protocol bleek nog steeds het meest geschikt. Optimalisatie van de recovery dient te gebeuren in verdere experimenten om te controleren of een elutiesolvent met een pH ±1 een betere recovery oplevert. Isolute SAX en Isolute PE-AX hadden beiden een recovery van > 80%. De wasstap werd van beide geoptimaliseerd, maar dit bleek nagenoeg geen invloed te hebben op zowel het matrixeffect als de recovery. De SPE-kolom Clean Screen zou in de toekomst als SPEkolom kunnen gebruikt worden voor de vast fase extractie van ethyl glucuronide. Het nadeel van deze kolom is echter de hoge kostprijs. 6.3. BOND ELUT SAX Bond Elut SAX bleek bij de primaire testen de meest geschikte kolom aangezien er geen matrixeffect waar te nemen was. Er werd gezocht naar een meer geschikt elutiesolvent om te trachten de recovery te verhogen tot meer dan 33%. Uit de optimalisatie kan geconcludeerd worden dat wanneer het percentage aan mierenzuur opgedreven wordt, en de pH daalt, er meer analiet in het eluaat gerecupereerd wordt. Hierbij wordt echter ook een belangrijker matrixeffect waargenomen. De elutieoplossing 2% mierenzuur in ACN/H2O (95/4) (v/v) biedt hiervoor een oplossing aangezien bij het gebruik van deze oplossing een lage ionsuppressie (21%) en een voldoende hoge (± 70%) recovery wordt waargenomen.
51
Het besluit van dit onderzoek is dat zowel de Clean Screen als de Bond Elut SAX de meest geschikte vaste fase extractiekolommen zijn. De Clean Screen omwille van zijn hoge recovery, de Bond Elut SAX omwille van het beperkte matrixeffect. Verdere experimenten zijn noodzakelijk om een definitieve keuze te maken. De resultaten van dit onderzoek vormen een basis voor verdere ontwikkeling van de vaste fase extractie en de analysemethodes voor de bepaling van ethyl glucuronide. Verder uitvoerig onderzoek is vereist zodat alle staalvoorbereidende stappen (bv. decontaminatie, extractie) kunnen geoptimaliseerd worden om uiteindelijk tot een geschikte staalvoorbereiding van EtG te komen.
52
7.
LITERATUURLIJST
[1] http://www.bivv.be/?menu=herstelonderzoeken, in. [2] Koninklijk besluit betreffende het rijbewijs in, 30/04/1998 [3] T.M. Maenhout, G. Baten, M.L. De Buyzere, J.R. Delanghe, Carbohydrate Deficient Transferrin in a Driver's License Regranting Program, Alcohol Alcohol, (2012). [4] B. Liniger, A. Nguyen, A. Friedrich-‐Koch, M. Yegles, Abstinence monitoring of suspected drinking drivers: ethyl glucuronide in hair versus CDT, Traffic injury prevention, 11 (2010) 123-‐ 126. [5] R. Lees, R. Kingston, T.M. Williams, G. Henderson, A. Lingford-‐Hughes, M. Hickman, Comparison of Ethyl Glucuronide in Hair with Self-‐Reported Alcohol Consumption, Alcohol Alcohol, (2012). [6] N.E. Walsham, R.A. Sherwood, Ethyl glucuronide, Annals of clinical biochemistry, 49 (2012) 110-‐117. [7] R.M. Smith, Before the injection-‐-‐modern methods of sample preparation for separation techniques, Journal of chromatography. A, 1000 (2003) 3-‐27. [8] J.C. Fell, R.B. Voas, The effectiveness of reducing illegal blood alcohol concentration (BAC) limits for driving: evidence for lowering the limit to .05 BAC, Journal of safety research, 37 (2006) 233-‐243. [9] Wet betreffende de politie over het wegverkeer, in, KB, 16/03/1968. [10] A.W. Jones, Evidence-‐based survey of the elimination rates of ethanol from blood with applications in forensic casework, Forensic science international, 200 (2010) 1-‐20. [11] C. Jurado, T. Soriano, M.P. Gimenez, M. Menendez, Diagnosis of chronic alcohol consumption. Hair analysis for ethyl-‐glucuronide, Forensic science international, 145 (2004) 161-‐166. [12] A. Isaksson, L. Walther, T. Hansson, A. Andersson, C. Alling, Phosphatidylethanol in blood (B-‐PEth): a marker for alcohol use and abuse, Drug testing and analysis, 3 (2011) 195-‐200. [13] J. Hietala, H. Koivisto, P. Anttila, O. Niemela, Comparison of the combined marker GGT-‐CDT and the conventional laboratory markers of alcohol abuse in heavy drinkers, moderate drinkers and abstainers, Alcohol Alcohol, 41 (2006) 528-‐533. [14] http://www.wardelab.com/19-3.html, in. [15] G. Hoiseth, L. Morini, A. Polettini, A. Christophersen, J. Morland, Ethyl glucuronide in hair compared with traditional alcohol biomarkers-‐-‐a pilot study of heavy drinkers referred to an alcohol detoxification unit, Alcoholism, clinical and experimental research, 33 (2009) 812-‐816. [16] X. Joya, B. Friguls, S. Ortigosa, E. Papaseit, S.E. Martinez, A. Manich, O. Garcia-‐Algar, R. Pacifici, O. Vall, S. Pichini, Determination of maternal-‐fetal biomarkers of prenatal exposure to ethanol: A review, Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, (2012). [17] S.K. Das, L. Dhanya, D.M. Vasudevan, Biomarkers of alcoholism: an updated review, Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation, 68 (2008) 81-‐92. [18] O. Niemela, Biomarkers in alcoholism, Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry, 377 (2007) 39-‐49. [19] K. Golka, A. Wiese, Carbohydrate-‐deficient transferrin (CDT)-‐-‐a biomarker for long-‐term alcohol consumption, Journal of toxicology and environmental health. Part B, Critical reviews, 7 (2004) 319-‐337. [20] http://www.crscientific.com/article-5-min-stain-CrO3.html, in. [21] http://www.clinchem.org/content/47/7/1225.full?ck=nck. [22] J.P. Bergstrom, A. Helander, Clinical characteristics of carbohydrate-‐deficient transferrin (%disialotransferrin) measured by HPLC: sensitivity, specificity, gender effects, and relationship with other alcohol biomarkers, Alcohol Alcohol, 43 (2008) 436-‐441. [23] F. Bortolotti, G. De Paoli, F. Tagliaro, Carbohydrate-‐deficient transferrin (CDT) as a marker of alcohol abuse: a critical review of the literature 2001-‐2005, Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences, 841 (2006) 96-‐109.
53
[24] P.R. Marques, Levels and types of alcohol biomarkers in DUI and clinic samples for estimating workplace alcohol problems, Drug testing and analysis, 4 (2012) 76-‐82. [25] V. Bianchi, A. Ivaldi, A. Raspagni, C. Arfini, M. Vidali, Use of carbohydrate-‐deficient transferrin (CDT) and a combination of GGT and CDT (GGT-‐CDT) to assess heavy alcohol consumption in traffic medicine, Alcohol Alcohol, 45 (2010) 247-‐251. [26] F. Pragst, M. Rothe, B. Moench, M. Hastedt, S. Herre, D. Simmert, Combined use of fatty acid ethyl esters and ethyl glucuronide in hair for diagnosis of alcohol abuse: interpretation and advantages, Forensic science international, 196 (2010) 101-‐110. [27] P. Kintz, Consensus of the Society of Hair Testing on hair testing for chronic excessive alcohol consumption 2011, Forensic science international, 218 (2012) 2. [28] F. Pragst, M. Yegles, Determination of fatty acid ethyl esters (FAEE) and ethyl glucuronide (EtG) in hair: a promising way for retrospective detection of alcohol abuse during pregnancy?, Therapeutic drug monitoring, 30 (2008) 255-‐263. [29] H. Kharbouche, F. Sporkert, S. Troxler, M. Augsburger, P. Mangin, C. Staub, Development and validation of a gas chromatography-‐negative chemical ionization tandem mass spectrometry method for the determination of ethyl glucuronide in hair and its application to forensic toxicology, Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences, 877 (2009) 2337-‐2343. [30] P. Cabarcos, H.M. Hassan, M.J. Tabernero, K.S. Scott, Analysis of ethyl glucuronide in hair samples by liquid chromatography-‐electrospray ionization-‐tandem mass spectrometry (LC-‐ESI-‐ MS/MS), Journal of applied toxicology : JAT, (2012). [31] R. Agius, T. Nadulski, H.G. Kahl, J. Schrader, B. Dufaux, M. Yegles, F. Pragst, Validation of a headspace solid-‐phase microextraction-‐GC-‐MS/MS for the determination of ethyl glucuronide in hair according to forensic guidelines, Forensic science international, 196 (2010) 3-‐9. [32] H. Kharbouche, M. Faouzi, N. Sanchez, J.B. Daeppen, M. Augsburger, P. Mangin, C. Staub, F. Sporkert, Diagnostic performance of ethyl glucuronide in hair for the investigation of alcohol drinking behavior: a comparison with traditional biomarkers, International journal of legal medicine, 126 (2012) 243-‐250. [33] F. Pragst, Interpretation problems in a forensic case of abstinence determination using alcohol markers in hair, Forensic science international, 217 (2012) e4-‐7. [34] F. Sporkert, H. Kharbouche, M.P. Augsburger, C. Klemm, M.R. Baumgartner, Positive EtG findings in hair as a result of a cosmetic treatment, Forensic science international, 218 (2012) 97-‐100. [35] S. Suesse, F. Pragst, T. Mieczkowski, C.M. Selavka, A. Elian, H. Sachs, M. Hastedt, M. Rothe, J. Campbell, Practical experiences in application of hair fatty acid ethyl esters and ethyl glucuronide for detection of chronic alcohol abuse in forensic cases, Forensic science international, 218 (2012) 82-‐91. [36] L. Martins Ferreira, T. Binz, M. Yegles, The influence of ethanol containing cosmetics on ethyl glucuronide concentration in hair, Forensic science international, 218 (2012) 123-‐125. [37] M.E. Albermann, F. Musshoff, B. Madea, A fully validated high-‐performance liquid chromatography-‐tandem mass spectrometry method for the determination of ethyl glucuronide in hair for the proof of strict alcohol abstinence, Analytical and bioanalytical chemistry, 396 (2010) 2441-‐2447. [38] L. Morini, C. Varango, C. Filippi, C. Rusca, P. Danesino, F. Cheli, M. Fusini, G. Iannello, A. Groppi, Chronic excessive alcohol consumption diagnosis: comparison between traditional biomarkers and ethyl glucuronide in hair, a study on a real population, Therapeutic drug monitoring, 33 (2011) 654-‐657. [39] R. Agius, L.M. Ferreira, M. Yegles, Can ethyl glucuronide in hair be determined only in 3cm hair strands?, Forensic science international, 218 (2012) 3-‐9. [40] V. Pirro, V. Valente, P. Oliveri, A. De Bernardis, A. Salomone, M. Vincenti, Chemometric evaluation of nine alcohol biomarkers in a large population of clinically-‐classified subjects: pre-‐ eminence of ethyl glucuronide concentration in hair for confirmatory classification, Analytical and bioanalytical chemistry, 401 (2011) 2153-‐2164.
54
[41] F. Pragst, M.A. Balikova, State of the art in hair analysis for detection of drug and alcohol abuse, Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry, 370 (2006) 17-‐49. [42] M. Balikova, Hair analysis for drugs of abuse. Plausibility of interpretation, Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czechoslovakia, 149 (2005) 199-‐207. [43] G. Cooper, M. Moeller, R. Kronstrand, Current status of accreditation for drug testing in hair, Forensic science international, 176 (2008) 9-‐12. [44] I. Kerekes, M. Yegles, U. Grimm, R. Wennig, Ethyl glucuronide determination: head hair versus non-‐head hair, Alcohol Alcohol, 44 (2009) 62-‐66. [45] G.A. Cooper, R. Kronstrand, P. Kintz, Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair, Forensic science international, 218 (2012) 20-‐24. [46] L. Morini, A. Zucchella, A. Polettini, L. Politi, A. Groppi, Effect of bleaching on ethyl glucuronide in hair: an in vitro experiment, Forensic science international, 198 (2010) 23-‐27. [47] B.M. Appenzeller, M. Schuman, M. Yegles, R. Wennig, Ethyl glucuronide concentration in hair is not influenced by pigmentation, Alcohol Alcohol, 42 (2007) 326-‐327. [48] K.C.V.H. N. SIMPSON, Sorbent Extraction Technology Handbook Varian Sample Preparation Products, Harbor City, 1993. [49] S.M. Wille, W.E. Lambert, Recent developments in extraction procedures relevant to analytical toxicology, Analytical and bioanalytical chemistry, 388 (2007) 1381-‐1391. [50] P.L. Kole, G. Venkatesh, J. Kotecha, R. Sheshala, Recent advances in sample preparation techniques for effective bioanalytical methods, Biomedical chromatography : BMC, 25 (2011) 199-‐217. [51] http://www.abacus-lab.com/analitycal-chemistry/extraction/solid-phase-extraction(spe).aspx, in. [52] N.J.K. Simpson, Solid-‐Phase Extraction Principles, Techniques, and Applications, 528. [53] V. Walker, G.A. Mills, Solid-‐phase extraction in clinical biochemistry, Annals of clinical biochemistry, 39 (2002) 464-‐477. [54] http://www.waters.com/waters/nav.htm?cid=10083845, in. [55] M. Wood, M. Laloup, N. Samyn, M. del Mar Ramirez Fernandez, E.A. de Bruijn, R.A. Maes, G. De Boeck, Recent applications of liquid chromatography-‐mass spectrometry in forensic science, Journal of chromatography. A, 1130 (2006) 3-‐15. [56] M. Yegles, A. Labarthe, V. Auwarter, S. Hartwig, H. Vater, R. Wennig, F. Pragst, Comparison of ethyl glucuronide and fatty acid ethyl ester concentrations in hair of alcoholics, social drinkers and teetotallers, Forensic science international, 145 (2004) 167-‐173. [57] A. Alt, I. Janda, S. Seidl, F.M. Wurst, Determination of ethyl glucuronide in hair samples, Alcohol Alcohol, 35 (2000) 313-‐314. [58] F. Gosetti, E. Mazzucco, D. Zampieri, M.C. Gennaro, Signal suppression/enhancement in high-‐performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, Journal of chromatography. A, 1217 (2010) 3929-‐3937. [59] I. Janda, W. Weinmann, T. Kuehnle, M. Lahode, A. Alt, Determination of ethyl glucuronide in human hair by SPE and LC-‐MS/MS, Forensic science international, 128 (2002) 59-‐65. [60] L. Morini, L. Politi, A. Groppi, C. Stramesi, A. Polettini, Determination of ethyl glucuronide in hair samples by liquid chromatography/electrospray tandem mass spectrometry, Journal of mass spectrometry : JMS, 41 (2006) 34-‐42. [61] F. Lamoureux, J.M. Gaulier, F.L. Sauvage, M. Mercerolle, C. Vallejo, G. Lachatre, Determination of ethyl-‐glucuronide in hair for heavy drinking detection using liquid chromatography-‐tandem mass spectrometry following solid-‐phase extraction, Analytical and bioanalytical chemistry, 394 (2009) 1895-‐1901. [62] P. Kintz, M. Villain, E. Vallet, M. Etter, G. Salquebre, V. Cirimele, Ethyl glucuronide: unusual distribution between head hair and pubic hair, Forensic science international, 176 (2008) 87-‐90. [63] I. Tarcomnicu, A.L. van Nuijs, K. Aerts, M. De Doncker, A. Covaci, H. Neels, Ethyl glucuronide determination in meconium and hair by hydrophilic interaction liquid chromatography-‐tandem mass spectrometry, Forensic science international, 196 (2010) 121-‐127.
55
[64] R. Kronstrand, L. Brinkhagen, F.H. Nystrom, Ethyl glucuronide in human hair after daily consumption of 16 or 32 g of ethanol for 3 months, Forensic science international, 215 (2012) 51-‐55. [65]
http://www.sopachem.com/fileadmin/pdf/ac/ist/Tech_Note_Be/3259_1762_tn103rev1_1__1_ .4_isolute_sax-pe-ax_aqueous_samples.pdf, in. [66] http://www.waters.com/waters/nav.htm?cid=513209, in. [67] https://phenomenex.blob.core.windows.net/documents/b50e7828-‐7b9b-‐431f-‐9490-‐ fd9e4498a660.pdf, in. [68] https://phenomenex.blob.core.windows.net/documents/663ce763-‐838d-‐44cc-‐8ba8-‐ 12e406c314df.pdf, in. [69] https://phenomenex.blob.core.windows.net/documents/deecfb8a-‐44d8-‐40fb-‐9250-‐ 1ed10ad38236.pdf. [70] http://www.phenomenex.com/Products/SPDetail/Strata/Screen-A, in. [71] http://www.chem.agilent.com/Library/brochures/5990-6042EN.pdf, in. [72] http://www.sepaxtech.com.cn/appl_spe/Ethylglucuronide_and_Ethyl_Sulfate_hair_LCMSMS.pdf, in. [73] Y. Zheng, A. Helander, Solid-‐phase extraction procedure for ethyl glucuronide in urine, Journal of analytical toxicology, 32 (2008) 778-‐781. [74] http://www.phenomenex.com/Products/SPDetail/Strata/SAX, in. [75] http://www.teknolab.no/pdf/Biotage_2010_analytical_sample_prep_catalog.pdf, in. [76] http://www.biotage.com/DynPage.aspx?id=112931, in. [77] http://www.biotage.com/DynPage.aspx?id=112915, in. [78] A. Van Eeckhaut, K. Lanckmans, S. Sarre, I. Smolders, Y. Michotte, Validation of bioanalytical LC-‐MS/MS assays: evaluation of matrix effects, Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences, 877 (2009) 2198-‐2207. [79] S. Wille, F. Peters, V. Di Fazio, N. Samyn, Practical aspects concerning validation and quality control for forensic and clinical bioanalytical quantitative methods, Accreditation and Quality Assurance: Journal for Quality, Comparability and Reliability in Chemical Measurement, 16 (2011) 279-‐292. [80] http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000370, in. [81] F.T. Peters, Recent advances of liquid chromatography-‐(tandem) mass spectrometry in clinical and forensic toxicology, Clinical biochemistry, 44 (2011) 54-‐65.
56
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
INTERNATIONALISATION AT HOME
Astrid Beuckelaers
Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Academiejaar 2011-2012
57
1. Improving adherence: from research to policy to practice (Prof. Nick Barber) In deze lezing werd een onderzoek besproken waar naar een correct geneesmiddelengebruik gestreefd wordt. Dit is één van de taken is van de huidige apotheker. In de studie werden de redenen voor een slechte therapietrouw bij patiënten onderzocht. Door navraag te doen bij patiënten waren de oorzaken o.a. de volgende: angst voor de bijwerkingen en onwetendheid over de motivatie van de inname van de medicatie. Het doel van het onderzoek is, aan de hand van enkele eenvoudige vragen die gesteld worden aan patiënten, meer inzicht te verkrijgen over de oorzaken van de slechte therapietrouw. Deze verworven inzichten leiden ertoe dat in de toekomst, samen met de patiënt, een oplossing kan gezocht worden voor de verbetering van de therapietrouw.
2. Access to quality medicines in resources limited setting: the role and challenges of a humanitarian pharmacist (Dr. Raffaella Ravinetto and Dr. Benedetta Schiavetti) In de tweede lezing wordt er toegelicht dat in bepaalde derde wereld landen geen essentiële geneesmiddelen beschikbaar hebben voor de lokale bevolking. In tegenstelling tot de Westerse landen is de toegang tot geneesmiddelen er beperkt. Dit heeft vele oorzaken: gebrekkige
distributiekanalen,
de
armoede
en
onvoldoende
uitgebouwde
gezondheidsinfrastructuur. Ook de kwaliteit van de geneesmiddelen wordt niet steeds gegarandeerd: een verminderde werkzaamheid van de actieve component of de houdbaarheidsdatum die nagenoeg verstreken is. Intussen is de kwaliteit en de distributie van medicijnen sterk verbeterd, al zijn er nog vele werkpunten. De kwaliteit van de geneesmiddelen kan in de toekomst nog verbeteren. De farmaceutische industrie zou meer kunnen investeren in medicijnen voor tropische ziekten o.a. de slaapziekte, tuberculose en pediatrische HIV. Verder maken de enorme kosten van research and development (R&D) het vrijwel uitsluitend mogelijk voor de grote, kapitaalkrachtige bedrijven om nieuwe geneesmiddelen te ontwikkelen. Er is eveneens nood aan de bouw van noodzakelijke medische infrastructuur, voornamelijk om de distributie van de geneesmiddelen vlotter te laten verlopen.
58
3. Computational chemistry in drug discovery: can we improve productivity and reduce attrition? (Dr. Alexander Alex)
De ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddelen is een zeer complex proces. Bovendien is die procedure duur en tijdrovend. Tijdens deze presentatie werd de nadruk gelegd op het feit dat geneesmiddelenonderzoek meer productief zou moeten zijn. Een oplossing voor dit probleem wordt geboden door het concept ‘computationeel design’. Computationeel design biedt de mogelijkheid om de tijdspanne, waarin een potentiële bruikbare verbinding wordt gegenereerd en geoptimaliseerd, in te korten. Dit gebeurt aan de hand van virtuele screeningsmethoden, deze versnellen de procedure. De screeningsmethoden baseren zich op de chemische structuur van een target of die van een ligand. Het concept ‘computationeel design’ zal in de toekomst nog aan belang winnen bij de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. 4. Applications of antibodies in the analysis of drugs, disease markers, bacteria and toxins (Prof. Richard O’Kennedy)
De aanmaak van de antilichamen gebeurt met behulp van recombinante DNA-technieken. In zijn presentatie beklemtoonde Prof. O’Kennedy het nut van het gebruik van antilichamen in de huidige geneeskunde. De antilichamen hebben een zeer belangrijke functie: ze zijn in staat om biomerkers van bepaalde ziektes op te sporen. Alsook bepaalde geneesmiddelen of bacteriën. 5. Evalutatie
Het concept om de studenten te laten deelnemen aan lezingen van internationale wetenschappelijke gastsprekers is zeer positief. Toch zijn niet alle lezingen even interessant en nuttig geweest.
59
