Váţení studenti, Praha, červen Prof. Ing. Karel Voříšek, CSc

KATEDRA MIKROBIOLOGIE, VÝŢIVY A DIETETIKY FAKULTA AGROBIOLOGIE, POTRAVINOVÝCH A PŘÍRODNÍCH ZDROJŮ ČZU V PRAZE

ZEMĚDĚLSKÁ MIKROBIOLOGIE (sylaby přednášek)

PROF. ING. KAREL VOŘÍŠEK, CSC.

PRAHA, ŘÍJEN 2008

Váţení studenti, s odvoláním na ţádosti studentů rozhodl jsem se vydat sylaby přednášek, které jsou upraveným materiálem, pouţívaným při zpětné projekci během přednášek předmětu „Zemědělská mikrobiologie“, „Mikrobiologie I“ a částečně v dalších předmětech KMVD. Vaše poznámky a náměty k vylepšení této pomůcky budou uvítány ([email protected]). Velmi důrazně bych však chtěl upozornit, ţe se nejedná o komplexní oponovaný studijní materiál, protoţe v řadě případů jsou uvedena jen hesla bez jakéhokoliv komentáře a vysvětlení (velmi viditelné je to např. v kapitolách I a II). Také chybí celá řada obrázků, schemat a dalších doprovodných materiálů, na některé je dokonce v textu odkazováno, ale nejsou jeho součástí – je tím myšleno viz přednášky. Zvládnutí pouze těchto sylabů by proto zřejmě nemuselo stačit k dobrým výsledkům u zkoušky – předpokládá se, ţe si je studenti budou doplňovat při přednáškách případně z doporučené literatury. Věřím však, ţe tato studijní pomůcka Vám studium tak zajímavého a pro lidskou populaci uţitečného předmětu usnadní.

Praha, červen 2008

Prof. Ing. Karel Voříšek, CSc.

1

I. ÚVOD - PŘEHLED OKRUHŮ: Obecná mikrobiologie (historie, bakterie, houby, viry) Bakteriální buňka Metabolismus Výţiva a rozmnoţování Genetika Koloběhy biogenních prvků (látek) N–C–P-S Mikrobiologie půdy Mikrobiologie vody Mikrobiologie krmiv Mikroorganismy a ţivočichové Doporučená literatura: Růţek, Voříšek: Vybrané kapitoly z pedobiologie a mikrobiologie, PowerPrint 2003 Klaban: Svět mikrobů, Gaudeamus, 2001 (1999) Klaban: Ilustrovaný mikrobiologický slovník. Galen 2005 Leitgeb: Mikrobiologie, MON 1988 (1983)(skriptum) Marendiak a kol.: Polnohospodarska mikrobiologia, Priroda 1988 Káš: Zemědělská mikrobiologie, SZN 1983 Rozšiřující: Kaprálek: Fyziologie bakterií, SPN 1986 Rozsypal a kol.: Obecná bakteriologie, SPN 1989 Brady, Weil: The nature and properties of soils, Prentice Hall 1999 Atlas: Principles of microbiology, WCB 1997 Paul, Clark: Soil microbiology and biochemistry, AP 1996 Paul: Soil mikrobiology, ecology and biochemistry, AP 2007 Tománková a kol.: Potravinářská mikrobiologie, PowerPrint 2006

2

I.1 Vymezení pojmů Mikrobiologie (mikro = drobný, bios = ţivý, logos = věda) Objekty mikrobiologie: Priony – specifické bílkoviny, způsobující např. BSE Viry – podbuněčné organismy Bakterie – typické prokaryotické organismy Houby – eukaryotické organismy vláknité či holokarpické I.2. Základní historické údaje Fracastorius (1546) A. van Leeuwenhoek (1632-1723) 1674, 24.4.1676 Objevitel mikroskopu, popsal bakterie L. Pasteur (1822-1895) Fermentace, techniky, hnití, nemoci, vakcinace-imunisace R. Koch (1843-1910) Izolace bakterií v čisté kultuře, nemoci, 4 postuláty definující příčinný vztah mezi patogenním mikroorganismem a chorobou I.3. Zemědělská mikrobiologie, „půdní“ mikrobiologie Kostyčev, Ivanovskij, Vinogradskij, Popov, Omelianskij, Mečnikov

3

II. MIKROBY V TEORII VZNIKU ŢIVOTA Samoplození Biogenese

Monomorfismus x pleomorfismus Pasteur – odmítnutí samoplození Ţivý systém = vysoce uspořádaný soubor látek (nukleové kyseliny, bílkoviny, tuky, glycidy), stabilní, strukturní, výměna látek, růst, rozmnoţování, vývoj Etapy evoluce (viz schema)

SYSTEMA NATURAE 2000 (kalsifikace)

BIOTA -

„viry“ (zahrnují např. viry, viroidy, priony)

-

Bakterie (prokaryotická buňka)

-

Archaea (prokaryotická buňka)

-

Eucaryota (eukaryotická buňka) Protozoa Chromista Houby Rostliny Ţivočichové

4

III. MORFOLOGIE BAKTERIÍ 1. 2. 3. 4. 5.

6.

Základní údaje Koky Tyčinky Vláknité bakterie Stavba bakteriální buňky 5.1. Bičík 5.2. Fimbrie (pily), glykokalyx 5.3. Pouzdro, kapsula, slizový obal 5.4. Buněčná stěna 5.5. Cytoplasmová membrána 5.6. Cytoplasma 5.7. Ribosomy 5.8. Nukleoid 5.9. Plasmidy 5.10. Mesozom 5.11. Inkluse 5.12. Spora, sporulace Základy systematiky bakterií

III.1. Základní údaje Prokaryotická buňka: úplná samostatnost buňky nepřítomnost jádra (chybí jaderná membrána, haploidní – 1 chromosom) nepřítomnost buněčných organel odlišná stavba ribosomů příjem ţivin celým povrchem peptidoglykan v buněčné stěně anaerobiosa schopnost vázat N2 velikost v mikrometrech: (0,2) – 0,4-10 velký aktivní povrch k objemu 1 g Escherichia coli = 1012 buněk = povrch 3 m2 Tvar: kulovitý (koky) válcovitý (tyčinky) vláknitý (aktinomycety a příbuz.) (řada přechodných)

5

III.2. Koky Kulovité, jednotlivě nebo ve shlucích ø 1 µm 0,8 – 1,2 (3) µm diplokoky streptokoky tetrády sarcina stafylokoky

Diplococcus Streptococcus Micrococcus Sarcina Staphylococcus Micrococcus

III.3. Tyčinky Válcovitý tvar, morfologicky rozmanité 0,2-1,2 x (0,4) 1-10 µm 0,8-1 x 3-5µm často bičíky, jejich umístění (počet) = důleţitá charakteristika Sporulující („bacily“) spóra = odolný klidový útvar plektridium klostridium Rody: Bacillus (aerobní) Clostridium (anaerobní) Sporolactobacillus Nesporulující -

rovné (bakterium)

Pseudomonas Lactobacillus Escherichia

-

vibrio

Vibrio

-

spirila

Spirillum

-

spirochéta

Leptospira

III.4. Vláknité a příbuzné „vláknité“ bakterie buňky v dlouhých řetízkách často s povrchovou vrstvou – sirné b. aktinomycety dlouhá větvená jednobuněčná vlákna ø cca 1 µm, délka i desítky mikrometrů substrátové a vzdušné mycelium tvorba konidií (vzdušné mycelium) = nepohlavní rozmnoţovací částice typické půdní organismy, výroba antibiotik, některé jsou patogenní (alergenní) Rody: Streptomyces, Nocardia, Actinomyces

6

plejomorfní tyčinky nepravidelný tvar, často větvené Rody: Rhizobium (fixace N2) Mycobacterium (půdní, TBC) Propionibacterium (sýry, vitaminy) Eubacterium (trávicí trakt) III.5. Stavba bakteriální buňky Vnější struktury – postradatelné Bičík (Flagellum) Fimbrie, pily, glykokalyx Pouzdro, kapsula, slizový obal Buněčná stěna Vnitřní struktury – nepostradatelné (většina) Cytoplasmová membrána Cytoplasma Ribosomy Nukleoid (Plasmidy) Mesozom (Inkluse) (Spora) III.5.1. Bičík (Flagellum) Pouze u některých bakterií Orgán pohybu Ukotven v cyt. membráně basálním tělískem Sloţen z bílk. vláken – flagelin ø cca 20 nm, délka aţ 15-20 µm Antigenní vlastnosti („F“)

7

Umístění a mnoţství druhově specifické: 1. MONOTRICHA

Vibrio cholerae

jeden bičík na jednom pólu 2. LOFOTRICHA

Pseudomonas sp.

svazek bičíků na jednom pólu 3. AMFITRICHA

Spirillum volutans

na kaţdém pólu jeden nebo i více bičíků 4. PERITRICHA

Escherichia coli, Bacillus sp., Clostridium sp.,Proteus vulgaris

povrch buňky pokryt bičíky

III.5.2. Fimbrie, pily, glykokalyx Povrchové vláknité struktury Fimbrie Aţ 1000, ø 3-10 nm, délka aţ 1 – aţ několik µm Bílkovinné vlákno Funkce: uchycení k povrchům Pily Podobné fimbriím, 1-10 na buňku Silnější (9-10 nm) Bílkovinné vlákno Funkce: F-pily podmínkou konjugace Receptor pro uchycení některých virů Glykokalyx Polysacharidová vlákna Funkce:

adherence na povrchy vymezení prostoru pro exoenzymy

III.5.3. Pouzdro (kapsula), slizový obal, S-vrstva Povrchové ochranné struktury Pouzdro (kapsula) Polysacharidy + další komponenty Výrazně strukturní, vazba na buněč. stěnu Výrazně zvyšuje odolnost (vnější podmínky, fagocytosa…) Antigenní vlastnosti = „K“ antigen 8

Slizový obal Hlavně polysacharidy „Nestrukturní“, bez vazby na bun. stěnu S-vrstva Krystalická protein. vrstva (i archaebakterie) Ochranná funkce III.5.4. Buněčná stěna Přítomna u většiny bakterií (ne Mycoplasma, některé archaebakterie), je ale postradatelná Peptidoglykan je typický komponent bakteriální buněčné stěny N-acetylmuramová kys. + N-acetylglukosamin (spojené můstky, vytváří „síťovinu“) Dále D-aminokyseliny – např. DAP Není u eukaryotů a archaebakterií Tloušťka velmi variabilní (cca 10 – 80 nm) Výrazný rozdíl v obsahu mezi G+ a G- bakteriemi Funkce: Ochranná (osmotický tlak, chemické látky, aj.) Určuje tvar buňky Antigenní vlastnosti („O antigen“) Regulace přijmu ţivin  Buněčná stěna G+ bakterií – (obarví se fialově) Velmi silná, 20 – 80 nm, Ø cca 40 nm) Relativně jednoduchá stavba, v podstatě jednovrstevná, z cca 90% peptidoglykan Často „protkána“ kyselinou teichoovou (rezervoár P) Rody: Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces  Buněčná stěna G- bakterií – (obarví se červeně) Tenká, cca 10 nm Obvykle trojvrstevná:

9

Vnější membrána, „dvojvrstevná“, 7-8 nm; vysoký podíl lipidů: tvořená fosfolipidy, proteiny, lipopolysacharidy, lipoproteiny, poriny (průchod ţivin) Periplasmatický prostor – gel, tloušťka variabilní, významný prostor pro metabolické reakce Peptidoglykanová vrstva velmi tenká, cca 1 nm Rody: Acetobacter, Azotobacter, Escherichia, Pseudomonas, Rhizobium, Salmonella III.5.5. Cytoplasmová membrána Nepostradatelná struktura bakteriální buňky Hlavní komponent = fosfolipidy tvořené fosfátovou skupinou a mastnými kyselinami spojeno glycerolem Významný podíl proteinů rozloţený v matrixu membrány Fosfát(-) je hydrofilní (obvyklá orientace vně buňky) Mastné kyseliny (NEPOLÁRNÍ) jsou hydrofóbní Působí dvojvrstevným dojmem – ale fluidní struktura Tloušťka:

5-10 nm

Funkce: Osmotická bariera Selektivní bariera (semipermeabilita) Transport ţivin Metabolismus (respirace; fotosynthesa; synthesa tuků a buněčné stěny) Přítomnost receptorů Chemotaxe

III.5.6. Cytoplasma Vyplňuje vnitřní prostor buňky Prostor pro vnitřní struktury Významná v metabolismu buňky Sloţení (= cytosol): voda, bílkoviny Protoplast = cytoplasma + cytopl. membrána

10

III.5.7. Ribozomy Počet: obvykle 10000 (i více), souvisí s úrovní metabolické aktivity buňky Velikost: 70S (eukaryota 80S) Rozměry: cca 15 x 20 nm Stavba: 2 zákl. subjednotky 50S a 30S; 50S = 23S rRNA + 5S rRNA + bílkoviny 30S = 16S rRNA + bílkoviny Sloţení: cca 60% RNA + 40% bílkoviny (v ribozomech cca 80% buněčné RNA, zbytek jako mRNA a tRNA) Funkce: synthesa bílkovin

III.5.8. Nukleoid Synonyma: chromatin, chromatinové tělísko, aj. Tvořen dvouvlákennou DNA v kruhu Jediný chromosom u většiny bakterií, délka aţ 1,4 mm Bez jaderné membrány Obsahuje 99 – 100 % buněčné DNA V oblasti nukleoidu se nachází i bílkoviny a stopy RNA (transkripce) Funkce: kóduje dědičnost (cca 3500 genů)

III.5.9. Plasmidy Postradatelná součást buňky, zvyšuje genetickou variabilitu Tvořeny kruhovou dvouvlákennou DNA (extrachromosomální DNA) Počet: 0 – cca 100 Samostatný replikon – replikace nezávislá na dělení buňky resp. na replikaci chromosomální DNA „Curing“ = ztráta plasmidů při dělení Typy plasmidů:

Kompatibilní x nekompatibilní F-plasmidy = konjugativní R-plasmidy = kódují rezistenci (antibiotika, toxiny…) Temperovaný = dočasná součást chromosomu Metabolické plasmidy Plasmidy virulence Plasmidy – kód pro bakteriociny

11

Funkce - shrnutí: 

dodatková genetická informace (obvykle < 30 genů)



významný nástroj genových manipulací

III.5.10 Mesozom = intracelulární membranoidní struktura Derivát (vychlípenina) cytopl. membrány Funkce: nejasná – metabolismus, dělení buňky aţ názor, ţe se jedná o artefakt

III.5.11. Inkluse Granule = uloţení sloučenin uvnitř buňky, některé s membránou Např:

zásobní materiál (polyhydroxybutyrát) polyfosfáty (volutin) metabolity (granule S)

III.5.12. Spora (sporulace) = odolný klidový útvar vznikající uvnitř (endospóra) některých bakterií, Bacillus, Clostridium, (Sporolactobacillus, Sporosarcina) Ţivotné i po 500 letech (i tisíce?) Umístění: centrální aţ terminální Neslouţí k rozmnoţování, z 1 buňky 1 spora Vysoká odolnost: teplo, UV záření, sucho, barviva, chemikálie… „Ţivotní cyklus“ sporulujících bakterií: vegetativní b., sporulace, spora, klíčení, vegetativní b. Sporulace cca 10 hod v 7 fázích Spora (odlišnosti od vegetativní buňky): Stavba – více „obalů“: exosporium, plášť spory, kortex (peptidoglykan), stěna spóry, cytoplasm. membrána Chemismus – sníţený obsah volné vody, vysoký obsah kys. dipikolinové Sníţený metabolismus („nulový“) Nepřijímá ţiviny z vnějšku Redukce ribozomů

12

III.6. Systematika a identifikace bakterií Základní taxonomická jednotka - druh = soubor buněk charakterizovaných stejnými morfologickými, kultivačními, biochemickými a dalšími vlastnostmi Podmínka při určování – čistá kultura, získáme nejlépe rozmnoţením 1 buňky Morfologické vlastnosti: Tvar buněk, seskupení, barvitelnost dle Grama (G+, G-), velikost (?), bičíky, tvorba spor… Tvar, barva a okraj kolonií; charakter růstu v tekutém prostředí Kultivační (fyziologické) vlastnosti: (obvykle optimum a rozmezí) Teplota, pH, vztah k O2, tolerance k chemikáliím (např. NaCl, ţlučové soli) Biochemické (metabolické) vlastnosti: Zdroje ţivin – C, N…. Enzymy - katalasa, hydrolasy Metabolity (primární, sekundární). Energetický metabolismus Další vlastnosti: DNA charakteristiky: % G+C v DNA, sloţení DNA (hybridizace, PCR) Serologické vlastnosti

Systematika: Obdobná dalším organismům Druh – Rod – Čeleď – Řád – Oddělení - Říše niţší jednotky neţ druh: poddruh, morfovar, biovar, patovar, serovar… Základní název binární (vţdy jen jeden !?) Lactobacillus plantarum Escherichia coli Pseudomonas fluorescens Enterococcus faecium (pův. Streptococcus faecium)

13

Systémy bakterií Celá řada přístupů Fylogenetický systém „Morfologický systém“ – původně zaloţen hlavně na morfologii, postupně převládly další charakteristiky Bergeyś Manual of Systematic Bacteriology, respektuje poznatky z fylogenese bakterií, podrobný taxonomický popis Bergeyś Manual of Determinative Bacteriology, „klíč“ pro určování; zde bakterie rozděleny do 35 skupin – morfologie, Gram, vztah k O2; např. 5.sk.– fakultat. anaerobní G- tyčinky 19.sk.–rovné nesporulující G+ tyčinky Numerická taxonomie Zaloţena na sdruţování bakterií podle společných vlastností s vyuţitím statistických metod, tvorba klastrů a dendrogramů Taxonomie zaloţená na porovnávání shodnosti vlastností izolované bakterie s ideokmeny rRNA taxonomie – RNA evolučně nejkonzervativnější součást buňky = „biologické hodiny“, nejvíce se přibliţuje fylogenetické taxonomii

14

IV. MORFOLOGIE VIRŮ 1.

Základní údaje

2.

Reprodukce

3.

Systematika

IV.1. Základní údaje Virus – původně označován jako jed, později patogenní mikroorganismus 1892 Ivanovskij objevil virus mozaikové choroby tabáku Podbuněčný (acelulární) organismus Intracelulární obligátní parazit téměř bez vlastního enzymového vybavení, plně závislý na hostitelské buňce Velikost: 30 – 300 nm (elektronový mikroskop) Virion: základní jednotka

Stavba: Centrálně nukleová kyselina – DNA nebo RNA (= genetický kód, dědičnost) Na obvodu proteinová kapsida sloţená z jednotlivých kapsomér. Prostorové uspořádání typické – spirálovitý (helikální) a poly-edrální (mnohostěn – 16, 24, 32…) Virový plášť (pouze u některých) – vnější lipidový obal

IV.2. Reprodukce Vţdy v hostitelské buňce Základní fáze: Přichycení na receptor hostitele Penetrace = průnik do hostitelské buňky (virion tím zaniká) Dále dvě moţnosti Lytický cyklus okamţité vyuţití metabolismu hostitelské buňky a reprodukce virionů: synthesa nukleových kyselin, synthesa proteinů, kompletace virionů, lýze buňky Lyzogenní cyklus – virion se stává na omezenou dobu součástí chromosomu hostitelské buňky = temperovaný virion: mnoţení buňky, dceřiné buňky obsahují temperovaný virion, vydělení virionu, dále pokračuje lytický cyklus 15

IV.3. Systematika virů Zaloţena na morfologických a dalších charakteristikách virionu Stavba virionu – holý, s pláštěm Stavba kapsidy Typ nukleové kyseliny – DNA, RNA Uspořádání NK – jednovlákenná, dvojvlákenná, přímá, kruhová (DNA) Hostitelská buňka Ţivočišná b. Rostlinná b. Mikrobní b.: bakteriofág aktinofág mykofág

16

V. HOUBY 1. Základní charakteristika 2. Systematika hub 3. Význam hub (kvasinky a mikromycety) V.1. Základní charakteristika Typické eukaryotní organismy – plnohodnotné jádro Mono-, di- a polykaryotické Haploidní kromě zygoty Buněčná stěna často chitin (občas celulosa) Tvar: holokarpický, myceliární (vlaknitý), častá tvorba rozmnoţovacích orgánů Vláknité houby: mycelium, stélky, hyfy Velikost: jednotky aţ stovky mikrometrů Jedno- a vícebuněčné, bez buněčných přep. Převáţně aerobní (anaerobní bachorové h.) Nefotosyntetizující Heterotrofní Chemoorganotrofní Saccharomyces

Holo 1 B

1J

Penicillium

Myc

VB

1J

Mucor

Myc

BP

VJ

Boletus

Myc

VB

2 J (1 J)

Rozmnoţování hub - Vegetativní: fragmenty mycelia, pučení - Nepohlavní částice (spory): oidie, chlamydospóry, sporangiospóry (Zygomycota), konidie (Deuteromycota resp. Ascomycota) - Pohlavní: pohlavní orgány –

antheridium (samčí), oogonium (samičí); tvorba pohlavních spor (bez meoisy) askospory basidiospory;

17

pohlavní spory vytvoří mycelium; fúzí pohl. mycelií vzniká dikaryotické mycelium; následně fúze jader a redukční dělení

V.2. Systematika hub Podobně jako u bakterií ve vývoji Znaky: uspořádání buněk, rozmnoţování, tvar rozmnoţovacích částic Hlavní třídy:  (Oomycetes) Přeřazeny do Protista, resp. Chromalveolata Nedělené mycelium, diploidní, zoospóry Buněčná stěna - celulosa Saprofytické, parasitické Rod: Perenospora, Pythium, Phytophtora infestans Chytridiomycota Asexuální zoospóry, jednoduchá buňka aţ mycelium Saprofytické, parasitické Často ve vodě, na organických zbytcích Rod: Synchytrium  Zygomycota Mycelium mnohojaderné bez přepáţek Rozmnoţování: nepohlavní – sporangiospory pohlavní – zygospory Převáţně saprofytní, rozklad jednoduchých glycidů Některé parazitické Rod: Mucor, Rhizopus  Ascomycota Velmi rozsáhlá skupina Mycelium jednak vláknité bohatě větvené, mnohobuněčné, jednak holokarpické Pohlavní askospory vznikají v asku (vřecku); sdruţeny do plodniček. Kleistothecium – Perithecium - Apothecium Saprofytické, parasitické Rod: Saccharomyces (dříve Endomycetes), Chaetomium, Xylaria, Erysiphe (parazitická)  (Deuteromycota) – umělá skupina Synonyma: Fungi imperfecti, houby nedokonalé Nyní hlavně Ascomycota (Basidiomycota) 18

Houby s „neznámým“ pohlavním rozmnoţováním Typická tvorba nepohlavních rozmnoţovacích částic – konidie; konidiofor, fialida Většina saprofytických, půdních; spory rovněţ ve vzduchu Rod: Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Trichoderma, Alternaria  Basidiomycota „Houby vyšší“, relativně sloţitý ţivotní cyklus: - Produkce haploidních basidiosor (obvykle 4) na basidiu - Spóry jednojaderné haploidní  mycelium - Fúze dvou mycelií  dikaryotické mycelium, jeho růst - Fúze jader (=zygota), meiosa, další dělení - Vznik basidie a basidiospor Rod: Agaricus, Boletus, Amanita Význam hub 

Půda = hlavní rezervoár Mineralizace Humifikace Půdotvorné procesy Detoxikace xenobiotik Koloběhy biogenních prvků



Voda a vzduch Většinou nepříznivé pro jejich růst Zdroj šíření a kontaminace (spory)



Krmiva, potraviny (často neţádoucí) Zhoršení organoleptických vlastností Rozklad ţivin Produkce metabolitů Produkce mykotoxinů Kancerogenní účinky Součást „kulturní“ mikroflóry



Původci chorob – mykózy



Průmyslové vyuţití Alkoholy Organické kyseliny Enzymy Antibiotika Detoxikace Potravinářství

19

VI. PRVKOVÉ A LÁTKOVÉ SLOŢENÍ 1.

Prvkové sloţení

2.

Látkové sloţení 2.1.

Voda

2.2.

Sušina 2.2.1. N-látky 2.2.2. Polysacharidy 2.2.3. Tuky 2.2.4. Vitaminy 2.2.5. Enzymy

VI. 1. Prvkové sloţení (v sušině) V mikrobních buňkách obdobné prvky s jinými organismy průměr C

40-63%

50

N

2-15%

8

H

7-8%

8

O

20-44%

30 Celkem C+N+H+O = 96%

P

3-5%

3

S

1%

1 Celkem P+S = 3,5% Celkem C+N+H+O+P+S = 99,5%

K,Mg,Ca,Na…

0,4%

Fe,Cu,Mn, Co, F, J..

0,1%

Celkem = 99,9%

Kaprálek uvádí: C

N

H

O

P

S

50

15

8

20

3

1

20

= 97%

VI.2. Látkové sloţení Voda – sušina

VI.2.1. Voda Obsah 73 – 90%

ø 80%

Voda vázaná = důleţitá součást struktury buňky, odebrání = poškození aţ zánik, cca 20% Voda volná = voda postradatelná, moţno šetrně odstranit (lyofilizace), cca 60% VI.2.2 Sušina 10 – 27 % Dusíkaté látky Velmi variabilní – s jednoduchostí stavby zastoupení roste Obsah v sušině: Viry

81 – 100%

Bakterie

50 – 94%

Kvasinky

31 – 63%

Plísně, Mikromycety

14 – 44%

N- látky - významná sloţka: Bílkoviny (aminokyseliny) – stavební a metabolická funkce DNA – genetický kód RNA – syntesa bílkovin

Escherichia coli: Bílkoviny

60%

DNA

3%

RNA

16%

Polysacharidy

3%

Lipidy

15%

Celkem

97%

Ostatní

3%

Celkem

100%

21

VI.2.3. Enzymy = biokatalysátory Sniţují aktivační energii Pracují za normálního tlaku V reakci se nespotřebovávají E+S

E-S

E-P

E+P

Velmi účinné (1 molekula E za 1sec. zpracuje aţ 50000 molekul substrátu) Specifické Bílkovina

jednoduchá sloţitá (bílk. + nebílk. část = kofaktor)

Holoenzym = koenzym + apoenzym Koenzym = snadno oddělitelný kofaktor Mikroorganismy (bakterie, houby) = hlavní zdroj průmyslových enzymů Rozdělení enzymů Podle místa působení Exoenzymy – vylučovány vně buňky Endoenzymy – působí uvnitř buňky Podle přítomnosti v buňce Konstitutivní – přítomny trvale Adaptivní – indukovány substrátem Třídy enzymů (6) - podle typu reakce Oxidoreduktasy – oxidačně redukční reakce A-H + B  A + B-H (+E) Ethanol + NAD  Acetaldehyd + NADH Př.: dehydrogenasy, oxygenasy, katalasa Transferasy – přenos skupin -NH2, -CH3… A-NH2 + B  A + B-NH2 Př.: aminotransferasy (transaminasy), hexosokinasy Hydrolasy – hydrolytické štěpení molekul (zvláště glykosidická v., peptidická v.,…) X-Y + H2O  X-H + Y-OH Glukosa 6-P + H2O  Glukosa + MAP Př.: proteasy, glykosidasy, lipasy 22

Lyasy – nehydrolytické štěpení vazeb (C-C, C-O, C-N…) Často odštěpují (vnášejí) malé molekuly: H2O, CO2, NH3… Př.: dekarboxylasy, deaminasy… Isomerasy – vnitromolekulové přesuny = přeměny isomerů Přeměna L-forem na D-formy (i opačně) Ligasy – vznik energeticky náročných vazeb za současného rozkladu energeticky bohatých sloučenin (např. ATP) Př.: syntetasy, polynukleotidsyntetasa (= DNA ligasa)….

23

VII. VÝŢIVA MIKROORGANISMŮ 1.

Ţiviny

2.

Transport ţivin

3.

Způsoby výţivy a zisku energie VII.1. Ţiviny Funkce ţivin: zdroj stavebních látek zdroj energie (chemotrofové) (ţiviny musí vstoupit do buňky) Vyhraněné poţadavky C – N – P – S – O – H , přijímány jako součást sloučenin nebo jako ionty makromolekuly tráveny vně buňky Uhlík Základ všech organických sloučenin Cca 50% ze sušiny buňky -

Organický Lépe vyuţívány: -CH2OH, =CHOH, =COH (sacharidy, alkoholy…), zvláště mono- a disacharidy, polysacharidy jen některé mikroorganismy Hůře vyuţit redukovaný: -CH3, =CH2 Vůbec ne –COOH Značná variabilita – významné v identifikaci bakterií

-

Anorganický – CO2, = autotrofní Pro asimilaci nutné značné mnoţství energie

Dusík Nezbytný: aminokyseliny, bílkoviny, nukleové kyseliny….. -

Organický nejvhodnější aminokyseliny (bílkoviny po hydrolyse) – přímo pro synthesy či jako donor –NH2

-

Anorganický NH4+: často preferovaný iont snadný průnik do buňky synthesa aminokyselin NO3-: méně frekventovaný zdroj N (nutná redukce) v anaerobních podmínkách zdroj kyslíku 24

N2:

omezeně vyuţitelný zdroj N typické u diazotrofů nitrogenasa nutná redukce:

N2 HN=NH H2N-NH2 2 NH3 2 NH4+

následuje synthesa aminokyselin: (kys. glutamová či asparagová) značná spotřeba energie Rody: Clostridium, Azotobacter, Rhizobium Fosfor Nezbytný pro výstavbu sloučenin (nukleotidy, fosfolipidy, DNA, RNA), energetiku (ATP)… -

minerální – tyto formy preferovány H2PO4- > HPO42- > PO43-

-

organický – před vyuţitím obvykle mineralizace (fosfatasy)

Síra Nezbytná součást některých aminokyselin (cystin, cystein, metionin), vitaminů, hormonů -

minerální – často preferovaná forma SO42organická forma – (obvykle -S-S-, -SH) aminokyseliny (cystin, cystein, metionin)

Ostatní biogenní prvky Převáţně jako ionty K+, Na+, Ca2+, Cl-, I-……

25

VII.2. Transport ţivin Průchod buněčnou stěnou a cytoplasmovou membránou Pasivní transport (difuse) Pohyb ve směru koncentračního spádu Rychlost = koncentrační gradient + permeabilita membrány Energeticky nenáročný Malé molekuly voda, některé ionty Zprostředkovaná difuse Pohyb ve směru koncentračního spádu Podstatně rychlejší Zabezpečena specifickými proteiny (permeasy): uchycení – přenos - uvolnění Energeticky nenáročná Silně rozvinuta u eukaryotů Prokaryota - glycerol Aktivní transport Pohyb proti koncentračnímu spádu Nutný přísun energie (ATP, gradient iontů) Zabezpečen specifickými proteiny (permeasami): uchycení – přenos – uvolnění Např.: sacharidy, aminokyseliny… Translokace skupin Fosfoenolpyruvát/fosfotransferásový systém (PEP/PTS systém) Typický pro eukaryota Spojen s přeměnou přenášeného substrátu Př.: přenos glycidů glukosa (vně)  glukosa-6P (uvnitř) VII.3 Způsoby výţivy a zisku energie C

- Autotrofní Zdroj uhlíku = CO2 Nezávislé na organické hmotě Komplexní enzymový aparát Vývojově starší 26

-

Heterotrofní Vyţadují organicky vázaný C Vyţadují (často) růst. faktory Mezerovitý enzymový aparát Saprofyté – parazité – (symbiosa) – mutualismus

-

Mixotrofní Kombinované vyuţití CO2 a organického uhlíku

Donor H+ (e-) Litotrofní – donor anorganická l. Organotrofní – donor organická l.

Zdroj energie Fototrofní - záření, slunce Chemotrofní – energie chemických vazeb Příklady: Fotolitotrofní

E – světlo

Cyanobakterie

autotrofové

H+/e- - anorg

Purpurové b.

C – CO2 Fotoorganotrofní

E – světlo

Purpurové nesirné b.

heterotrofové

H+/e- - org

Zelené nesirné b.

C – org (CO2) Chemolitotrofní

E – anorg

Nitrifikační

autotrofové

H+/e- - anorg

S-oxidující

C – CO2

Ţelezité Vodíkové

Chemoorganotrofní E – org heterotrofové

Houby

H+/e- - org

Mléčné b.

C – org

Amonifikační Celulolytické aj.

27

VIII. METABOLISMUS CHEMOTROFŮ 1.

Dvě stránky metabolismu

2.

ATP, NAD, NADP

3.

Katabolický = energetický metabolismus 3.1. Fermentace 3.2. Respirace 3.3. Katabolismus dalších látek 3.4. Vztah ke O2

4.

Anabolický metabolismus = biosynthesy

5.

Regulace metabolismu

VIII.1. Dvě stránky metabolismu Vzájemně neoddělitelné + prolínající se 1)

KATABOLISMUS

Převaha rozkladných procesů Produkce meziproduktů (= ţiviny) Hlavní varianty: fermentace, respirace !! Zisk energie pro zabezpečení funkcí: Biosynthesy Pohyb Příjem ţivin Teplo Bioluminiscence Elektrický potenciál Entalpie = energie uvolněná v reakci Volná entalpie – energie vyuţitelná Entropie – energie „ztrátová“

2)

ANABOLISMUS = BIOSYNTHESY

Spotřeba energie + přijatých ţivin + meziproduktů z katabolismu Výstup = synthesa látek Náhrada opotřebovaných látek Růst buněk Rozmnoţování buněk

28

Významnou spojkou obou stránek metabolismu jsou přeměny ATP Katabolismus

ADP + Panorg +E

ATP

Anabolismus

Reakce:

exergonické – samovolný průběh endergonické – energii dodávat

VIII.2. ATP, NADP, NAD ATP =Adenosintrifosfát – universální přenašeč energie E - uloţena v energeticky bohatých vazbách Adenosin

ribosa

P

1)

P

2)

P

2)

1)

esterová vazba

2)

anhydridová vazba (energet. bohatá)

ADP + Panorg +E

ATP

2 hlavní varianty vzniku ATP substrátová fosforylace (např. glykolysa) oxidativní fosforylace (redukce NADH2) Další př. energeticky bohatých sloučenin: acetyl-KoA, cytosinfosfát… NAD, NADP = nikotinamidadenindinukleotid (fosfát) universální přenašeč H mezi redox systémy

AH2 + NAD+

A + NADH + H+

B + NADH + H+

BH2 + NAD+ + E

O2

často

H2O

29

VIII.3. Katabolický metabolismus Př.: Chemoorganotrofové

Sloţitá C -látka (celulosa) hydrolysa glukosa glykol ysa, E -D, H-P pyruvát

fermentace

respirace

ethanolová

úplná aerobní

mléčná

neúplná aerobní

máselná

anaerobní

propionová

anorg. látek

acetonbuthanolová (viz koloběh uhlíku)

30

GLYKOLYSA

etapy

glukosa ATP ADP glukosa 6-P

fruktosa 6-P

fosforylace

ATP ADP fruktosa 1,6-diP

glyceraldehyd 3-P

vznik 2 trios

fosfodihydroxyaceton 4ADP

4ATP

pyruvát

vznik pyruvátu a energie

Energetický zisk („čistý“) glykolysy = 2 ATP

31

ENTNER-DOUDOROFFOVA DRÁHA

glukosa ATP

ADP

glukosa 6-P fosfoglukonová kyselina fosfoglyceraldehyd + pyruvát 2ADP

2ATP

pyruvát HEXOSO(PENTOSO)FOSFÁTOVÁ DRÁHA glukosa ATP

ADP

glukosa 6-P fosfoglukonová kyselina CO2 pentosofosfát

fosfoglyceraldehyd + ethanol 2ADP pyruvát

C6

C5 + C1 (CO2)

C5

C3 (pyruvát) + C2 (ethanol)

C6

C3 + C2 + C1

32

2ATP

VIII.3.1. Fermentace Donor i akceptor H+/e: organická látka Typická pro anaerobní podmínky Název podle koncových produktů - ethanolová - ethanol + CO2 - mléčná – kyselina mléčná (+ případně další kyseliny+alkohol+CO2) - máselná – kyselina máselná + další kys. + alkoholy + CO2 - propionová – kyselina propionová + CO2 - acetonbuthanolová – aceton + buthanol + další

VIII.3.2. Respirace Donor H+/e organická i anorganická látka Akceptor H+/e anorganická látka (často O2) -

Úplná aerobní respirace (akceptor O2) Součástí Krebsův cyklus a dýchací řetězec Energeticky nejvydatnější – aţ 38 ATP

pyruvát CO2, NADH+H+

dekarboxylace

acetylkoenzym A + oxaloctová vstup do Krebsova cyklu kyselina citronová kyselina oxaloctová + 2CO2 + 3(NADH+H+)+…. dýchací řetězec cytochromoxidasový nepřímý

O2

H2O C6H12O6 + 6O2 -

6CO2 + 6H2O +38ATP

neuplná aerobní respirace akceptor O2 org. C-látka + O2

jednodušší org.C-látka + H2O + (CO2) + E

Př.: octové a citronové kvašení (podle Pasteura nepravá kvašení)

33

-

anaerobní respirace akceptorem O ze sloučenin NO3- + H+

NO2- + H2O + E

denitrifikace NO3- + H+

N2 + H2O + E

desulfurikace SO42- + H+

S2- + H2O + E

- Respirace anorganických látek (často spojována s anaerobní respirací) akceptorem H+/e- anorganická látka (ne kyslík) Fe3+

Fe2+

S0 + H2 H2 + CO2 H+ + NO3-

H2S CH4 + H2O NH4+ + H2O

VIII.3.3. Katabolismus dalších látek - lipidy zdroj energie podobně jako sacharidy Hydrolysa – vznik glycerolu a mastných kyselin Glycerol fosforylován  glykolysa Mastné k. – β oxidace , acetyl-KoA, Krebsův cyklus - bílkoviny Hydrolysa – proteasy (polypeptidy aţ aminokyseliny) – zuţitkování v anabolismu Deaminace (transaminace) C-skelet  pyruvát, acetyl-KoA a dále fermentace či respirace

34

VIII.3.4. Vztah ke kyslíku Významný znak při identifikaci Aerob Vyţaduje přítomnost O2 jako akceptoru H+/eEnergetická dráha = aerobní respirace Př.: Bacillus, Penicillium Obligátní anaerob O2 nevyţaduje či „toxický“ Energetická dráha = fermentace, anaerobní respirace Př.: Clostridium, Bacteroides, Paracoccus, Desulfovibrio Fakultativní anaerob Můţe ţít jak v přítomnosti tak v nepřítomnosti O2 2 varianty: 1)

nemění metabolismus, energetická dráha = fermentace např.: mléčné bakterie

2) mění metabolismus; +O2 aerobní respirace, - O2 fermentace Př.: Saccharomyces Mikroaerofilní Vyţadují niţší parciální tlak O2 neţ v atmosféře

35

VIII.4. Anabolismus Přijaté ţiviny, meziprodukty katabolismu + energie zuţitkovány pro synthesu: 1)

náhrada opotřebovaných

2)

nové látky pro rozmnoţování a růst

anorg. molekuly

CO2,NH3,H2O,PO43-…

monomery

nukleotidy,AK,cukry…

makromolekuly

NK,proteiny,polysacharidy

supramolekulární útvary

membrány….

buněčné struktury

nukleoid,ribosomy,bičíky

buňka Asimilace N2 = postupná redukce (synthesa aminokyselin) N2 aţ na 2NH4+

(viz kap. VII.1. - ţiviny

Synthesa aminokyselin o aminace (vyuţití NH4+) ketokyselin frekventované AK: glutamová, asparagová o transaminace; AK v nadbytku donorem -NH2 ketokyselina akceptorem Synthesa bílkovin Místem synthesy ribosomy = translace Účast m-RNA, t-RNA, r-RNA Fáze: iniciace – elongace - terminace 36

Asimilace CO2 Kalvinův cyklus, zpětná glykolysa Energeticky velmi náročné Synthesa glycidů zpětná glykolysa, dodat energii (ATP) Synthesa DNA, RNA Předchází synthesa nukleotidů Synthesa DNA = replikace, vlákno DNA matricí Synthesa RNA = transkripce, matricí úsek vlákna DNA

VIII.5. Regulace metabolismu Zaloţena především na regulaci enzymů Koncentrace substrátu Výrazný vliv nízkých koncentrací Rovnice Michaelis-Mentenové s V=

vmax

Ks + s kde Ks je koncentrace s pro 0,5 vmax

Kompetitivní inhibice Inhibitor „soutěţí“ se substrátem o aktivní místo enzymu Vliv vnějších fyzikálně-chemických faktorů Nejrychlejší reakce při optimální úrovni: pH, teplota…. Extrémní hodnoty vedou např. k denaturaci Mnoţství enzymů Regulováno především úrovní ribosomální synthesy Kompartmentace Distribuce enzymů, substrátu a metabolitů v buňce – vazba na určité bun. struktury Allosterická regulace Inhibice či stimulace na základě ovlivnění prostorového uspořádání enzymu Efektor se váţe na regulační část enzymu a tím mění konformaci místa určeného pro substrát 37

Zpětná vazba (feedback efekt) = inhibice enzymové reakce konečným produktem

E1

E2

E3

E4

E5

S

M1

M2

M3

M4

P

Pasteurův efekt O2 regulace metabolismu u některých fakultativních anaerobů (Saccharomyces) +O2 aerobní respirace -O2 fermentace Kyslíkový efekt O2 reguluje metabolismus u některých anaerobů +O2 blokuje metabolismus či dokonce toxický Vliv kvality substrátu Uplatnění konstitutivních či adaptivních enzymů Sigma faktor Iniciace synthesy (transkripce) m-RNA jako matrice pro synthesu enzymu v ribosomech

38

IX. RŮST A MNOŢENÍ BAKTERIÍ 1.

Ţivotní cyklus

2.

Růst buňky

3.

Mnoţení v populaci 3.1. Vsádková kultivace 3.2. Kontinuální kultivace 3.3. Další varianty

4.

Kultivace smíšených kultur

XI.1. Ţivotní cyklus = uspořádaná sekvence jednotlivých biochemických a morfologických událostí od vzniku buňky do jejího rozdělení

A

B

C

A

E

F

D

E

F

Doba mezi dvěma děleními buňky = generační doba Hlavní součásti: Synthesa buněčného materiálu Replikace DNA Vlastní rozdělení buňky Doba pro replikaci nemusí být totoţná s generační dobou IX.2. Růst buňky - růst individuální buňky, tj- nárůst objemu, zvětšování velikosti, tím, ţe stavební látky se ukládají v „růstových zónách“ - růst bakteriální populace („růstová křivka bakterií“) = nárůst počtu buněk v mnoţící se populaci;charakterizována dobou zdvojení („T“) populace

IX.3.1. Vsádková kultivace = statická kultivace = batch culture Do mnoţící se populace se nezasahuje, prostředí je modifikováno pouze přítomnými buňkami; uzavřený systém Grafické vyjádření – semilogaritmicky (osa y = log počtu buněk, osa x = čas)

39

Hlavní fáze: (1) Lag fáze Buňky se přizpůsobují – synthesa enzymů Buňky se nemnoţí (moţný pokles počtu) – synthesa nových komponentů Délka – stáří buněk, sloţení prostředí, vnější faktory (2) Fáze fyziologického mládí Adaptace dokončena, začíná dělení Kultura velmi citlivá na vnější vlivy (3) Exponenciální (logaritmická) fáze Intenzivní mnoţení – nejkratší doba zdvojení Buňky nedorůstají maximální velikosti Rychlost růstu konstantní („přímka“) Intenzivní spotřeba ţivin Maximální produkce primárních metabolitů (CO2, kyseliny, alkoholy...) (4) Stacionární fáze Počet ţivých buněk je konstantní Počet umírajících = počtu vzniklých Důvod: dosaţení „M“ koncentrace spotřebovány ţiviny nahromadění metabolitů Doba zdvojení = 0 Intenzivní produkce sekundárních metabolitů (5) Fáze odumírání Počet buněk se sniţuje (logaritmicky) Doba zdvojení < 0 (záporná) Matematické charakteristiky Délka lagu Generační doba Doba zdvojení (T) Počet buněk (N) Počet dělení (generací)

0

1

2

4

n

Počet buněk

1

2

4

8

2n

Obecná rovnice (pro exponen. fázi): Nt = N0 * 2n

kde

Nt je počet buněk v čase t N0 je počet buněk v čase t0

40

n je počet generací

n = t/T

T je doba zdvojení N = N0 * 2t/T (důleţitá rovnice pro výpočet T) Specifická růstová rychlost (μ) = přírůstek počtu buněk (biomasy…) za časovou jednotku vztaţený k počátečnímu mnoţství buněk (biomasy…) μ = (dN/dt)/N0 μ = μMAX*S/(Ks + S) Ks je saturační konstanta ţiviny S Růstový výtěţek (Y) = mnoţství biomasy na mnoţství spotřebované ţiviny (S)

Y = dN/dS příklady vyuţití: etanol, antibiotika, jogurt…. IX.3.2. Kontinuální kultivace Otevřený systém – regulace vybraných parametrů z vnějšku: Mnoţství ţivin Mnoţství metabolitů Mnoţství buněk Buňky udrţujeme v logaritmické fázi Dva hlavní systémy Chemostat Regulace – chemické parametry Sterilní medium je doplňováno a kultivační medium s buňkami odstraňováno (konstantní rychlost) Rychlost výměny určována spotřebou limitující ţiviny a dobou zdvojení

Turbidostat Regulace – udrţení stanoveného počtu buněk v populaci Rychlost doplňování je variabilní Ţiviny obvykle v nadbytku

41

Výhody kontinuální kultivace: vyšší vyuţití biofermentoru Nevýhody: horší vyuţití ţivin Příklady: kyselina octová, čištění odpadních vod, trávicí trakt IX.3.3. Další varianty kultivace Submersní - růst v celém profilu prostředí Povrchová – růst na povrchu substrátu Diauxie (polyauxie) – sloţená růstová křivka, dáno postupným vyuţíváním ţivin Synchronizovaná – většina buněk ve stejné části ţivotního cyklu (např. po chladovém šoku = zabránění dělení, ale růst neomezen) Homogenní – charakteristika ve všech částech fermentoru shodná Heterogenní – koncentrace ţivin + buněk + metabolitů ve fermentoru rozdílná Kultivace s imobilizovanými buňkami (enzymy) – buňky uchyceny na nosiči (nejsou v mediu) IX.4. Kultivace smíšených kultur (dříve uvedená pravidla platí pro monokulturu) – ve směsných podstatně sloţitější Symbiosa – vzájemný vztah 2 organismů: mutualismus – pro oba výhodné komensalismus – výhodné pro jednoho partnera, druhý není ovlivněn parasitismus – jeden z partnerů zvýhodněn, druhý poškozován antagonismus (amensalismus) – jeden z partnerů poškozován, druhý neovlivněn kompetice – oba partneři poškozováni; např. soutěţení o ţiviny a prostor; (competitive exclusion) syntrofismus – vzájemná „spolupráce“ při produkci růstových faktorů, výměně ţivin apod. predace – jeden organismus slouţí jako „kořist“ druhému

Interakce: organismus mutualismus syntrofismus komensalismus parasitismus antagonismus kompetice

A + + + + 42

B + + 0 0 -

X. PROMĚNLIVOST BAKTERIÍ 1.

Fenotypové změny

2.

Genotypové změny

3.

Přenos genů 3.1. Konjugace 3.2. Transdukce 3.3. Transformace 3.4. Extrachromosomální přenos

4.

Restrinkce, oprava DNA

5.

Genové manipulace Historicky – názor o úplné plejomorfii Později monomorfismus Relativně velká proměnlivost bakterií: -

reakce na vnější podmínky

-

rychlost mnoţení

-

haploidní chromosom

Obecné genetické zákony platí i pro bakterie Nyní bakterie významný objekt genetiky Geny: chromosomální X extrachromozomální (hlavně plasmidové) Změny - zasahující genotyp – jsou dědičné (změna v DNA) - zasahující fenotyp (= umoţnění fenotypové realizace vlastnosti) X.1. Fenotypové změny Mají dočasný ráz Reakce na vnější podmínky Zasahují celý soubor (většinu buněk), např.: adaptivní enzymy – indukce enzymu substrátem velikost buňky přítomnost bičíků disociace kolonií změny morfologie kolonií spojené i se změnami některých vlastností

43

S – hlenovité – toxičtější, odolnější R – drsné - (méně virulentní i niţší toxicita (u streptokoků 6 fází) X.2. Genotypové změny – mutace Změny v uspořádání nukleotidů v DNA Delece – zařazení - přesmyk… 1 či více párů Mutace: spontánní X indukované Mutageny zvyšují frekvenci mutací – chemomutageny (bromouracil…), radiační mutace (UV a γ záření) Projev mutací vzhledem k haploiditě bakterií okamţitý (není recesivita) Letální mutace znamenají okamţitou smrt buňky

Mutace: -

jsou dědičné (při replikaci informace přechází do dceřiných buněk)

-

jsou diskontinuální (nárazovité)

-

jsou řídké, zasahují malý počet jedinců, pravděpodobnost 1:106-109

-

jsou specifické – zasahují určitý determinovaný znak

-

jsou nezávislé

-

mohou být spontánní (není známa příčina)

X.3. Přenos genů U vyšších organismů – sexuální procesy (zygota nositelem vlastností obou rodičů U bakterií sexuální procesy nejsou Alternativou „parasexuální“ procesy Pro většinu hub jsou sexuální procesy důleţitou součástí ţivotního cyklu

X.3.1. Konjugace = předání informace z donora akceptorovi Podmínky: rozdílnost buněk (přítomnost F plasmidu), sex-pily Etapy: (1) sex-pily vytvoří kanálek (2) F plasmid se „otevře“ (DNA není jiţ kruhovitá) (3) jedno vlákno koncem 5´vstupuje do akceptora (můţe být přerušeno) (4) replikace – vznik 2. vlákna

44

Hfr konjugace: Plasmid je součástí chromosomu a při přestupu můţe přenést i část chromosomální informace

X.3.2. Transdukce Přenos genetické informace zabezpečen vektorem V přírodních podmínkách hlavní vektor virus, který „omylem“ během své replikace přijal DNA hostitele Další vektory: plasmidy, kosmidy (umělé), aj. Přenášena jen malá část DNA Pravděpodobnost: 1:106-108 Tři typy příjmu: - rekombinantní = fragment DNA se váţe na chromosom - abortivní – DNA nevstupuje do chromosomu - plasmidový

X.3.3. Transformace = buňka recipienta přijímá volnou DNA z vnějšího prostředí a zabudovává ji do chromosomu Pravděpodobnost menší – DNA relativně velká a můţe být v buňce rozloţena endonukleasami Vstup moţný pro malý fragment (2000-5000 nukleotidových párů) X.3.4. Extrachromosomální přenos genů = přenos zabezpečený plasmidy zvláště R Plasmid = dodatečná genetická informace Autoreplikační jednotka nezávislá na replikaci chromosomální DNA Výrazné zvýšení genetické variability Při dělení buňky variabilita přechodu plasmidů do dceřinných buněk; moţná i ztráta (curing)

X.4. Oprava DNA, restrinkce = schopnost buňky opravit změněnou (poškozenou) DNA = podpora homeostase poškozený nukleotid (např. guanin metylací, či thymin zdvojením) je rozpoznán a změna je enzymaticky odstraněna bakterie mají regulační systém pro opravy = SOS regulon 45

X.5. Genové manipulace = řízená a cílená změna genomu Převáţně zaloţeno na transdukci Fáze genových manipulací: Získání genu (1) rozštěpení genomu donora restrinkčními endonukleasami (restrinktasami) (2) prostřednictvím mRNA – slouţí jako matrice pro synthesu DNA reversní transkriptasou (3) synthesa genu podle jeho mapy (DNA synthetiser) (4) nákup genu výběr vhodného vektoru nejčastěji R plasmid, nutná přítomnost vhodných markerů (resistence na antibiotika), mapa plasmidu (znalost míst, kde je DNA plasmidu „otevřena“ restrinktasami konstrukce rekombinantního plasmidu otevření plasmidu restrinktasou vloţení genu ligasou výsledek: směs rekombinantních a původních plasmidů konstrukce rekombinantní buňky plasmidy vstupují do buněk akceptora výsledek: směs 3 typů buněk (původní + s nezměněným plasmidem + s rekombinantním plastidem) výběr rekombinantní buňky zaloţen na vyuţití markerů klonování rekombinantní buňky namnoţení se sledováním stability nové vlastnosti vytvoření podmínek pro expresi genu optimalizace prostředí a vnějších podmínek pro fenotypové uplatnění genu

46

XI. VLIV VNĚJŠÍCH FAKTORŮ 1.

Úvod

2.

Fyzikální faktory

3.

Chemické faktory

XI.1. Úvod Rozvoj mikroorganismů Rozhodující úroveň: minimum – optimum – maximum Omezení mikroorganismů - cidní (fungicidní, baktericidní) = usmrcení (např. koagulací bílkovin) - statický (bakteriostatický) = reverzibilní zabránění rozmnoţování = blokace synthesy bílkovin - lytický (bakteriolytický) = rozpad buňky XI.2. Fyzikální faktory Teplota - psychrofilové –

růst při 0°C, optimum cca 15°C nad 20 (25)°C nerostou

- mesofilové -

obvykle ne pod 10°C optimum 20 - 40°C (typické teploty 25, 30, 37°C)

- termofilové

optimum 45 - 70°C

- hypertermofilové

růst při 70 - 90°C (1.sk.) 80 - 90°C (2.sk.) (výjimečně i výše)

Vysoká teplota má často mikrobicidní vliv (vyuţito pro sterilaci), niţší teplota spíše vliv mikrobistatický (vyuţito při skladování potravin) pH - alkalofilové – optimum při pH > 8 - neutrofilové – optimum při pH 6-7 (8) (většina mikroorganismů) - acidofilové – optimum při pH < 6 (5) (např. thiobacily i pod 1)

47

- acidorezistentní – optimum kolem pH 7,0 - ale přeţívají i v kyselé oblasti (plísně např. i pod 3,5) Voda (vodní aktivita) Voda - nezbytná jako stavební součást a pro příjem ţivin Vodní aktivita – aw - (dostupnost vody) – rozhoduje o tom, zda prostředí bude kolonizováno; Rozsah 0 – 1, běţná media 0,95; pod 0,6 mikroorganismy nerostou Osmotický tlak Souvisí s koncentrací iontů: izotonické – hypotonické – hypertonické prostředí Hydrostatický tlak Mikroorganismy relativně necitlivé Záření (ionizující a UV) Ovlivňuje (poškozuje) DNA, zpočátku mutagenní charakter později mikrobicidní Ionizující – tvorba volných radikálů UV – tvorba dimérů thyminu Oxidačně redukční potenciál – „EH“ Měří se v mV Aerobové vyţadují + Anaerobové vyţadují – (obvykle < -40 mV, častěji -200 mV aţ -400 mV – methanogenní) XI.3. Chemické faktory Chemické látky prostředí

- slouţí jako ţiviny - negativní vliv

MIC = minimální inhibiční koncentrace (objektivní měřítko účinnosti) Stanovení inhibiční zóny („antibiotický test“) (A) Dělení podle cíle působení: Antiseptika – usmrtí či inhibují růst mikroorganismů, netoxické pro ţivé tkáně Desinfekce – usmrtí mikroorganismy v neţivém prostředí – cílené především na patogeny; pokud všechny = sterilace (B) Dělení podle místa působení In vitro – vně ţivých organismů

48

In vivo – uvnitř ţivých organismů = chemoterapeutika (synthetické, antibiotika) (C) Dělení podle mechanismu účinku: Denaturace bílkovin Ireverzibilní zásah způsobující koagulaci bílkovin Etylalkohol – účinný při koncentraci cca 60-85% Kyseliny a zásady – změna pH; (anorganické i organické kyseliny) Blokáda a oxidace –SH a –NH2 skupin = tím poškození aminokyselin Příklady: Hg – výplachy, moření obilí (-SH) Ag – desinfekce vody Cu – proti řasám, houbám Oxidační látky – sloučeniny Cl, Br, I, KMnO4, kyslík (H2O2, O3), ethylenoxid Alkylační – formaldehyd Fenol Působení na buněčné membrány = poškození celistvosti; interakce mezi proteiny a lipidy, poškození lipidů Detergenty – látky s afinitou k povrchům Nejúčinnější kationtové odvozené od NH4+, (vodíky nahrazeny organickými radikály) = „kvarterní amonné soli“ - ajatin Ovlivnění biosynthes = látky, které blokují normální metabolismus např. podobné substrátu, koenzymu… (D) Dělení podle chemických charakteristik kyseliny, zásady, těţké kovy, oxidační látky, detergenty, alkoholy….

49

XII. PŘEMĚNY C-LÁTEK 1. Úvod 2. Fermentace 2.1. Etanolové kvašení 2.2. Mléčné kvašení 2.3. Máselné kvašení 2.4. Propionové kvašení 2.5. Acetonbutanolové kvašení 3. Respirace 3.1. Úplná aerobní respirace 3.2. Neúplná aerobní respirace 3.3. Přeměny sloţitých C-látek 3.4. Rozklad škrobu 3.5. Rozklad celulosy 3.6. Rozklad pektinových látek 3.7. Rozklad hemicelulos 3.8. Rozklad ligninu XII.1. Úvod Organismy = producenti – konzumenti - reducenti Funkce mikroorganismů v koloběhu biogenních prvků je nezastupitelná = jsou hlavními reducenty Ve vzduchu cca 0,035% CO2, tj. 700.109 t Roční spotřeba rostlin cca 20.109 t – při „nedoplňování“ zásob na 35 let Zdroje: vulkanický CO2 spalování fosilních paliv mineralizace organických látek (85 - 97% mikroorganismy, z toho 85% půda a 12% voda)

XII.2. Fermentace Navazuje na glykolysu Donorem H+/e- organická látka Anaerobní proces Energeticky méně výhodná oproti respiracím 50

XII.2.1. Etanolové kvašení CH3COCOOH  CH3COH + CO2 (dekarboxylace pyruvátu) CH3COH + H+  CH3CH2OH

(redukce acetaldehydu)

C6H12O6  2CH3CH2OH + 2CO2 Podmínky: Anaerobní, mezofilní Jednoduché cukry (mono-, disacharidy) Sloţité cukry (škrob) aţ po hydrolyse Zdroj N – NH4+, případně organický Dostatek P Původci: kvasinky (Saccharomyces) a některé bakterie (Zymomonas) Význam: Produkce ethanolu (alkohol. nápoje, průmyslová surovina) Pekařství (Biomasa = zdroj vitamínů a bílkovin) XII.2.2. Mléčné kvašení CH3COCOOH + H+  CH3CHOHCOOH Homofermentativní (HM) = C6H12O6  2CH3CHOHCOOH (< 90%) Heterofermentativní (HR) = C6H12O6  CH3CHOHCOOH+CH3COOH + CH3CH2OH + CH2OHCHOHCH2OH + CO2 Poţadavky: Anaerobní (mikroaerofilní), ale vţdy fermentace (chybí cytochromy) Mezofilní (termofilní) Acidorezistentní Náročné na prostředí Zdroj C – mono- a disacharidy Zdroj N – organické N-látky Vyţadují růstové látky – vitaminy Původci (= bakterie mléčného kvašení - BMK): Lactococcus: HM; mléko, sýry Lc. lactis, Lc. cremoris 51

Streptococcus: HM; jogurt Sc. salivarius ssp. thermophilus Enterococcus: HM; trávicí trakt, indikátor fekálního znečištění, siláţování, probiotika E. faecium, E. faecalis Pediococcus: HM; mléko Leuconostoc: HR; mléko, produkce polysacharidů Lactobacillus: HM i HR Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus (HM), jogurt Lb. acidophilus (HM), mléko, pochva, trávicí trakt, probiotika Lb. plantarum (HM) rostliny, siláţ Lb. fermentum, Lb. brevis (HR), siláţ, kyselé zelí

[Bifidobacterium (?BMK; „HR“; vysoký podíl kyseliny octové – 60%); trávicí trakt, probiotika, mléčné výrobky B. bifidum, B. animalis, B. longum nepatří mezi bakterie mléčného kvašení] Význam (viz rovněţ výše): Mléko a mléčné výrobky Ţivočichové: trávicí trakt (!+), nepatogenní Konzervace: siláţ, zelenina, „domorodé produkty“ Probiotika Výroba kyseliny mléčné XII.2.3. Máselné kvašení Široká škála produktů: kyselina máselná + k. octová + další org. kyseliny (valerová, isovalerová, isomáselná) + (aceton) + alkoholy (buthanol) + plyny (CO2, H2) 4 C6H12O6  3CH3CH2CH2COOH + CH3COOH + 8CO2 + 8H2 2CH3COCOOH  CH3CH2CH2COOH + 2CO2 pyruvát  acetyl-CoA + CO2 + H2 butyrát + acetát + buthanol + aceton + isopropanol

52

Poţadavky: Anaerobní (bez cytochromů), mezofilní Zdroj C – široké spektrum C-látek (monosacharidy aţ polysacharidy, pektiny, aj.) Zdroj N – organický N, NH4+, i N2 Původci: Clostridium: G+ anaerobní sporulující tyčinka, bohatý enzymový aparát Cl. pasteurianum, Cl. butyricum, Cl. felsineum, Cl. cellobioparum, Cl. thermocellum….. Význam: (široké spektrum aktivit r. Clostridium) Typická půdní bakterie – nejdůleţitější fermentace v půdě Organická hnojiva (hnůj, kompost) Rozklad sloţitých C-látek anaerobně Anaerobní fixace N2 Anaerobní rozklad bílkovin Patogenní, producent toxinů Cl. perfringens, Cl. botulinum, Cl. tetani Trávicí trakt – rozklad sloţitých C-látek Čištění odpadních vod Průmyslová produkce kyseliny máselné

XII.2.4. Propionové kvašení hexosa  pyruvát  propionát + acetát + CO2 + H2O laktát  pyruvát  propionát + acetát + CO2 + H2O Původce: Propionibacterium Poţadavky: Jednoduché C-látky Organické N-látky Aerotolerantní 53

Význam:

Trávicí trakt zvláště bachor Kůţe ţivočichů Výroba sýru – ementál („oka“, aroma) Produkce vitamínů (B12) Protiplísňový preparát

XII.2.5. Acetonbuthanolové kvašení = modifikované máselné kvašení, kyselina máselná je redukována H+ na butanol dominantní produkty: aceton, buthanol, (kyselina máselná - málo) Původce: Clostridium acetobutylicum Význam: fermentační produkce acetonu a buthanolu

XII.3. Respirace V koloběhu C významná především aerobní respirace, kde akceptor H+ je O2 Úplná aerobní respirace = úplná mineralizace širokého spektra C-látek (mono-, di-, polysacharidy, tuky, „uhlíkaté skelety“ org. sloučenin, aj.) (hydrolysa – glykolysa – redukce pyruvátu – Krebsův cyklus – dýchací řetězec) Produkty: CO2, H2O (ATP) Významný zdroj CO2 v ţivotním prostředí Neúplná aerobní respirace (nepravá kvašení) = neúplná mineralizace, zůstávají organické C-látky - Octové kvašení CH3CH2OH+O2  CH3COOH + H2O Původce: Acetobacter kaţení vína výroba octa (ocetnice –imobilizované buňky, kontinuální kultivace) - Citronové kvašení glycidy  kyselina citronová Původce: Aspergillus niger Význam: potravinářství – limonády, dţemy

54

XII.4. Rozklad sloţitých C-látek Významný vliv poměru C:N – optimum 25:1 XII.4.1. Rozklad celulosy Nejvýznamnější rostlinný polysacharid rozloţitelný pouze mikroorganismy Celulosa  aktivní celulosa  celobiosa  glukosa  pyruvát (dále odlišné) celulasy: C1 a Cx (glukanasy) Tři hlavní varianty: Aerobní rozklad v půdě = úplná aerobní respirace s typickými produkty - CO2, H2O Původci: Cytophaga, Sporocytophaga, Cellulomonas, Trichoderma aj. Anaerobní rozklad v půdě = máselné kvašení s typickými produkty Původci: Clostridium thermocellum Anaerobní v trávicím traktu = modifikované máselné kvašení Dominantní metabolit = kyselina octová Další metabolity: organické kyseliny (máselná…), CO2, H2, alkoholy Typické pro bachor a tlusté střevo Původci: Fibrobacter, Butyrivibrio, Bacteroides, Clostridium cellobioparum Cl. thermocellum Bachor – vedle bakterií se rozkladu celulosy účastní ještě houby (celulosa bez bakterií /hub/ nerozloţitelná) XII.4.2. Rozklad škrobu Snadno rozloţitelný Začíná hydrolysou (α- a β-amylasy): amylopektin + amylosa; amylopektin + amylosa  glukosa amylopektin  maltosa + dextriny ; amylosa  maltosa

55

Aerobní rozklad = typická úplná aerobní respirace Produkty: CO2, H2O Původci: bakterie – Bacillus; houby – Aspergillus Význam: -

typický půdní proces

-

výroba lepidel

-

produkce amylolytických enzymů (slad, sladidla)

Anaerobní rozklad = typické máselné kvašení (kys. máselná, další org. kyseliny, buthanol, CO2, H2) Původci: Clostridium (Cl. pasteurianum, Cl. butyricum) Význam: -

typický půdní proces

-

přeměny škrobu v trávicím traktu

XII.4.3. Rozklad pektinových látek Pektin = polygalakturonidy Mezibuněčné prostory rostlinných buněk Začíná hydrolysou – pektinolytické enzymy (pektinasy) Meziprodukty = kyselina galakturonová, galaktosa, xylosa, arabinosa Aerobní rozklad pektinových látek = úplná aerobní respirace všech meziproduktů hydrolysy Produkty: CO2, H2O Původci: Bacillus, Mucor Význam: -

půdní proces

-

rosení lnu

-

(produkce pektinolytických enzymů – potravinářství)

Anaerobní rozklad pektinových látek Meziprodukty hydrolysy (s výjimkou kyseliny galakturonové) podléhají máselnému kvašení Produkty: kys. galakturonová, org. kyseliny (máselná, octová, a další), alkoholy (buthanol), CO2, H2 56

Původci: Clostridium Význam: - půdní proces - trávicí trakt - máčení lnu (Cl. pectinovorum)

XII.4.4. Rozklad hemicelulos Komplexní - polymery hexos, pentos, (uronové kyseliny); xylosy a manosy „Čisté“ – relativně snadno rozloţitelné Aerobně = aerobní respirace Anaerobně = máselné kvašení

XII.4.5. Rozklad ligninu Komplexní C-látka, obsahuje aromatická jádra (fenyl + propanyl) Doprovází celulosu a hemicelulosu Zahájen hydrolysou Prioritní aerobní rozklad houbami (basidiomycota, částečně askomycota) Phanerochaete, Pleurotus, později Aspergillus a Trichoderma Doprovodně – aktinomycety (Streptomyces, Nocardia) Dále i bakterie - Pseudomonas Produkty: CO2 + H2O Význam: -

půdní proces

-

trávicí trakt - termiti

57

XIII. PŘEMĚNY N-LÁTEK

1.

Úvod

2.

Amonifikace

3.

Nitrifikace

4.

Denitrifikace

5.

Fixace N2

6.

Imobilizace

XIII.1. Úvod N-látky – klíčová součást všech ţivých systémů Funkce: stavební – nositel genetické informace – metabolická – (zásobní látky)……. Zásoba biogenního N omezená – nutná „recyklace“ N v různém oxidačním stupni: N3- aţ N5+

XIII.2. Amonifikace = hlavní mineralizační reakce v koloběhu N hlavní místo = půda; (další voda) org. N látky  NH4+, NH3 (aminokyseliny), proteiny, nukleové kyseliny, močovina, kyselina močová, chitin, peptidoglykan….. aerobní i anaerobní (psychrofilní) – mesofilní – (termofilní) „pravé“ bakterie, aktinomycéty, mikromycéty Významný vliv poměru C:N: Optimum cca

25:1

= vyváţený zdroj C + N +energie

< 25:1

rozklad rychlý, nadbytek N, únik NH3

> 25:1

(např. sláma 80:1), rozklad zpomalen, odčerpávání N z jiných zdrojů = imobilizace

Vyuţití NH4+, NH3: -

synthesa aminokyselin (anabolismus)

-

nitrifikace (zisk energie)

-

(příjem rostlinami)

-

volatisace 58

-

vyplavení (povrchové a spodní vody)

-

fyzikálně-chemická vazba na půdní komplexy (jílové minerály, organická hmota)

-

vazba na půdní částice

Amonifikace bílkovin Hydrolysa peptidické vazby – proteinasy proteiny  poly- oligo- di- peptidy  aminokyseliny Dále deaminace: NH4+, NH3, ketokyselina o Aerobní rozklad bílkovin = výraznější mineralizace Produkty: CO2, NH4+, NH3 Původci: aerobové a fakultativní anaerobové Bacillus, Pseudomonas, Proteus o Anaerobní rozklad bílkovin Produkty: CO2, NH4+, NH3, skatol, indol, merkaptany, H2S…. Původci: Clostridium Amonifikace močoviny CO(NH2)2  CO2 + NH3 Původci: urobakterie; Micrococcus ureae, Planosarcina ureae Typický proces pro stájové prostředí Trávicí trakt (bachor!)

XIII.3. Nitrifikace = oxidace redukovaných forem N aerobní proces Autotrofní nitrifikace NH4+  NH2OH  NO2-  NO3Zdroj C = CO2 (Calvinův cyklus) Typický půdní proces: neutrální reakce, aerace Indikátor půdní úrodnosti Původci: aerobní chemoautotrofové

59

o Nitritace NH4+ + O2  NO2- + 2H++H2O + E Původci: Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosolobus… o Nitratace NO2- + O2  NO3- + E Původci: Nitrobacter, Nitrococcus… Heterotrofní nitrifikace NH4+  NO2-  NO3RNH2  NO2-  NO3Zdroj C = organická C-látka Typický proces zvláště v kyselých půdách, méně výkonná neţ autotrofní Původci: houby (Aspergillus), aktinomycety (Streptomyces), bakterie (Arthrobacter)

Význam nitrifikace: -

zdroj energie pro nitrifikační bakterie

-

ţivina pro rostliny (hlavní zdroj N je NO3-)

-

substrát pro denitrifikaci

-

neţádoucí proces v chlévském hnoji

-

nitráty silně pohyblivé, neakumulují se

-

při nadbytku ztráty vyplavením = moţnost vzniku nitrosoaminů (karcinogen) = ztráta ţiviny = zhoršená kvalita vody  povrchové vody – eutrofizace  spodní vody – zvýšený obsah NO3- neumoţňuje jejich vyuţití jako pitné vody (methaemoglobinemie)

XIII.4. Denitrifikace = redukce oxidovaných forem N = anaerobní respirace (zdroj energie) Typický anaerobní půdní proces

60

Disimilativní denitrifikace NO3- + H+  N2 + H2O + E (NO3-  NO2-  NO  N2O  N2) Původci: široké spektrum anaerobů a fakultativních anaerobů Pseudomonas, Paracoccus, Propionibacterium, Thiobacillus… Půda (org.hnojiva) - ztrátový proces Voda - můţe být pozitivní, likvidace NO3- odstraňování NO3- z pitné vody - odstraňování NO3- při čištění odpadních vod Asimilativní denitrifikace NO3- + H+  NH4+ + H2O + E (NO3-  NO2-  NH2OH  NH3) Půda – proces při nadbytku NO3- spíše pozitivní - menší pravděpodobnost ztrát Poznámky: (1) NO3- + H+  NO2- + H2O + E velmi běţná redukce (nitrátreduktasa) (2) NO3- + H+  N2 + H2O + O2 + E O2 – vyuţit pro aerobní respiraci organických sloučenin (3) NO3- + H2O + S  N2 + SO42- + H+ + E sirné bakterie (redukce nitrátů spojená s oxidací S)

XIII.5. Fixace N2 Objevena 1882 – diazotrofní bakterie = redukce N2  NH4+ (N = N  HN=NH  H2N-NH2  2 NH3  2 NH4+  aminokyseliny /glutamová, asparagová/) N2+8e-+16ATP+10H+  2NH3+H2+16ADP+16Pi Nitrogenasa (nif gen) – přenos H+ na N2 v anaerobních podmínkách Hup+ gen - synthesa hydrogenasy zlepšuje hospodaření s H (nevzniká H2) Energeticky náročné – ATP (dostatek P) Fixace intenzivní především při nedostupnosti jiných zdrojů N Význam: návrat N z atmosféry do koloběhu biogenních prvků – v přírodních ekosystémech hlavní forma 61

320.1012 g/rok

Celkový input N do půdy: z toho je:

fixace

175.1012 g/rok

hnojiva

85.1012 g/rok

Rozdělení diazotrofních bakterií: -

volně ţijící v půdě: Azotobacter, Clostridium, Azotomonas….

-

asociativní: Azospirillum ….

-

symbiotické: Frankia, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Rhizobium….

Diazotrofní bakterie zahrnují řadu skupin: organotrofní, fototrofní, cyanobakterie.. Vztah diazotrofů k O2: všechny varianty; aerobové aţ anaerobové

Azotobacter Plejomorfní (diplokoky, tyčinky) aerobní mesofilní bakterie Náročný na podmínky prostředí: Neutrální půdní reakce (Ca2+) Vysoký obsah organických látek (zdroj E jednodušší C-látky) Strukturní půdy (humus, vzduch) Dobrá zásoba biogenních prvků (P, Ca, K…) Fixace při nedostatku jiných zdrojů N Výskyt jen v kvalitních půdách (vyuţíván jako indikátor) Úroveň fixace 15-20 mg N/1g glukosy

Clostridium Anaerobní sporulující mesofilní tyčinka (1 x 1,5-8 μm) Menší náročnost na podmínky prostředí: Výskyt i při mírně kyselé reakci Méně aktivní ve fixaci N2 Zdroj C a E široké spektrum org. C-látek (E – máselné kvašení) Úroveň fixace 10-12 mg N/1g glukosy Výskyt ve většině půd

Rhizobium Symbiotická fixace N Aerobní nesporulující plejomorfní tyčinka V kořenech jako bakteroidy (aţ T, Y – tvary) 62

Symbiosa s kořeny rostlin (Fabaceae) – pro fixaci obligatorní (volně v půdě a v lab. podmínkách nefixuje) – zde vytváří hlízky (hlízkové bakterie) Specifita – věrnost hostitelské rostlině Pro fixaci nezbytná anaerobiosa – leghaemoglobin (vazba O2) Mutualistický vztah : rostlina poskytuje glycidy, bakterie N-sloučeniny Zvýšená zásoba půdního N omezuje fixaci Nejvýkonnější diazotrofové: (30) 50 – 200 (800) kg/ha; Ø 140 kg/ha Účelná inokulace semen před výsevem - preparát Rizobin (ČR) Průběh fixace: Geneticky podmíněno – geny: nod, nif, fix - rozpoznání kořene a adherence - narušení kutikuly a průnik - pohyb kořenovým systémem (infekční vlákno) - tvorba hlízky - vznik bakteroidů a zahájení fixace - intenzivní fixace - stárnutí bakteroidů, zánik, lýza Důleţité vlastnosti rhizobií: specifita – invazivita – virulence – efektivita – přeţívání v půdě

XIII.6. Imobilizace = převod minerálních forem N do organických látek v ţivých buňkách; projevuje se nárůstem biomasy (počet, velikost) Silně souvisí s poměrem C:N (viz dříve) Při širokém poměru nestačí N v rozkládané látce – odčerpáván N z půdní zásoby (roztoku) Význam: - nejedná se o ztrátu (jiná forma) - moţná konkurence s rostlinami (negativní) - stabilizace N v období vegetačního klidu (Stabilizace N v půdě = humifikace)

63

XIV. PŘEMĚNY P-LÁTEK 1.

Úvod

2.

Mineralizace

3.

Imobilizace

4.

Solubilizace

5.

Redukce PO43-

XIV.1. Úvod P – důleţitá součást buněčných látek – nukleové kyseliny, enzymy, hormony Speciální funkce v energeticky bohatých sloučeninách (ADP, ATP….)

XIV.2 Mineralizace P-org. sloučeniny  P-anorg. látky Fosfatasy (alkalické, kyselé) Zdroje: ATP – NK – fosfolipidy (fosfoproteiny) – fytáty Produkty: H2PO4-, HPO42-, PO43Význam: - nezastupitelná součást koloběhu biogenních prvků - zdroj ţivin pro mikroorganismy a rostliny

XIV.3. Imobilizace = převod anorg. P do buněk ţivých (mikro)organismů anorg. P-sloučeniny  org. P-látky Nutný přísun energie Nejběţnější: ADP + Pi + E  ATP Vznik NK….. Určující poměr C:P: > 100 : 1 podpora imobilizace Význam: -

konkurence mikroorganismů s rostlinami

-

sníţení pravděpodobnosti ztrát např. vyplavením

-

nezbytný proces při nárůstu biomasy

64

XIV.4. Solubilizace = zpřístupnění P organismům z málo rozpustných minerálních forem /AlPO4, Ca3(PO4)2,…../ Vázáno na tvorbu kyselin při metabolismu mikroorganismů – minerální (H2CO3), organických (octová) PO43-  HPO42-  H2PO4Význam: -

doplňkový zdroj ţivin pro mikroorganismy a rostliny

XIV.5 Redukce PO43= zdroj kyslíku v anaerobních podmínkách (anaerobní respirace) – tím zisk energie

65

XV. PŘEMĚNY S-LÁTEK 1. Úvod 2. Mineralizace 3. Imobilizace 4. Sulfurikace 5. Desulfurikace

XV.1. Úvod Základní biogenní prvek – součást aminokyselin (methionin, cystin, cystein), enzymy, hormony…. Funkce stavební, metabolická (enzymy), energetická (přeměny S-látek zdrojem E) Mikroorganismy – příjem anorganické (SO42-) i organické (aminokyseliny) formy S Zdroje: organická hmota – minerály – atmosféra

XV.2. Mineralizace org S-látky  anorg. S-látky (SO42-, H2S) aerobně (SO42-), anaerobně (H2S) řada mikroorganismů – není specializace Význam: -

zpřístupnění S pro organismy

-

nezastupitelná součást koloběhu S

XV.3. Imobilizace anorg. S-látky (SO42-)  org S-látky (např. sirné aminokyseliny) zabudování S do ţivých (mikro)organismů nutný přísun energie poměr C:S > 400:1 výrazně podporuje imobilizaci Význam: -

stabilizace S v prostředí

-

moţná konkurence s rostlinami (v půdě)

66

XV.4. Sulfurikace oxidace redukovanějších sloučenin S H2S  S  S2O32-  SO42Aerobní proces Nejčastěji H2S (S2-) + O2  SO42- + E S0 + O2  SO42- + E Původci: sirné bakterie – Thiobacillus Význam: -

zpřístupnění S organismům

-

okyselení půd

-

podíl na zvětrávání mateční horniny

XV.5. Desulfurikace redukce oxidovanějších forem S SO42-  S  H2S Anaerobní proces = anaerobní respirace, zdroj energie Donorem H+ často organická látka R-CH2OH+SO42-  R-COOH+H2O+S2- +E

Př.:

SO42- + H+  S0 + H2O + E S0 + H+  H2S + E SO42- + H+  H2S + H2O + E Původci: sirné bakterie – Desulfovibrio… Význam: -

ztráta ţivin

-

redukce toxicity Fe2+ a Mn2+ v „anaerobních“ půdách

67

XVI. MIKROBIOLOGIE PŮDY 1.

Úvod

2.

Hlavní skupiny mikrorganismů

3.

Vztahy mezi půdními mikroorganismy a rostlinami

4.

Funkce půdních mikroorganismů 4.1. Vznik půdy 4.2. Koloběh C-látek 4.3. Koloběh N-látek 4.4. Koloběh S-látek 4.5. Koloběh P-látek 4.6. Mineralizace 4.7. Imobilizace 4.8. Humifikace, humus 4.9. Samočištění 4.10. Detoxikace xenobiotik 4.11. Únava půdy 4.12. Produkce fytoalexinů

5.

Moţnosti ovlivnění

XVI.1. Úvod Půda: -

hlavní rezervoár mikroorganismů

-

= „ţivý organismus“ - hlavní místo biotransformace biogenních prvků

Sloţky půdy: -

minerální podíl – cca 45% (skelet - písek - prach - jíl)

-

organické látky – obvykle 1-3%, občas 8%, výjimečně více (organogenní aţ 80%); z toho organismy <1%, častěji <0,3%

-

póry – 50% (optimální - voda 2/3, vzduch 1/3)

68

P Ů D N Í O R G A N I C K Á H M O T A

P R I M Á R N Í

E D A F O N M R T V Ý

O R G.

E. O H

H M O T A

V

H U M U S

P Ř E M. H U M U S

Ţivá sloţka půdy Mikroorganismy Ţivočiši Ţivé části rostlin Právě odumřelý edafon (rozpoznatelný původ) Snadno rozloţitelná V Ø široký poměr C:N Organická hmota v transformacích Uţší poměr C:N (= výsledek mineralizace)

Stabilizovaná OH Uţší poměr C:N Dlouhý poločas rozkladu

Výsledný celkový poměr C:N v půdě: 10-12:1

XVI.1. Hlavní skupiny půdních mikroorganismů - základní dělení - podle výţivy - podle získávání energie - fyziologické skupiny - systematicky

69

základní dělení Bakterie (pravé, aktinomycety) – houby POČET A HMOTNOST PROKARYOTNÍCH A EUKARYOTNÍCH PŮDNÍCH ORGANISMŮ

Vývojová linie

Skupina

Počet jedinců .g-1

Hmotnost t.ha-1

PROKARYOTÉ

Bakterie

< 109

0,450 – 4,500

Aktinomycety

< 108

0,450 – 4,500 0,900 – 9,000

CELKEM EUKARYOTÉ

Houby (Mycota)

< 106

1,120 – 11,200

Řasy (Algae)

< 105

0,056 – 0,560

Prvoci (Protozoa)

< 105

0,017 – 0,170

Hlísti (Nematoda)

< 105

0,011 – 0,110

Ţíţaly (Lumbricidae)

-

0,110 – 1,100

-

0,017 – 0,170

Ostatní bezobratlí a obratlovci

1,331 – 13,310

CELKEM

(Brady, 1990) Půdní bakterie

109. g-1

2,5 t.ha-1

Půdní aktinomycety

108. g-1

2,0 t.ha-1

Půdní mikromycety

105. g-1

5,0 t.ha-1

9,5 t.ha-1 (Kubát, 1992)

podle výţivy -

autotrofní: zdrojem C je CO2

-

heterotrofní: zdrojem C je org. látka

-

saprofytické: vyuţívají odumřelou organickou hmotu

-

zymogenní: vyuţívají odumřelou rostlinnou hmotu

-

oligotrofní: ţijí při nízkých koncentracích ţivin

-

eutrofní (kopiotrofní): vyţadují prostředí bohaté ţivinami

-

autochtonní: typické pro dané prostředí, vyskytují se pravidelně, mnoţí se

-

alochtonní: mikroorganismy do prostředí zavlečené, kontaminující

70

podle získávání energie -

fototrofní: zdroj E světelné záření (fotolitotrofní, fotoorganotrofní)

-

chemotrofní: zdroj E energie chemických vazeb (chemolitotrofní, chemoorganotroní)

fyziologické skupiny - koloběh C: celulolytické, amylolytické, máselné… - koloběh N: amonifikační, nitrifikační, denitrifikační, diazotrofní… - koloběh S: sulfurikační, desulfurikační, (sirné)… - koloběh P: fosfáty solubilizující… systematicky (rody) -

kokovité: Staphylococcus, Micrococcus...

-

tyčinky sporulující: Bacillus, Clostridium

-

tyčinky nesporulující (řada plejomorfních): Arthrobacter, Mycobacterium, Nitrosomonas, Nitrobacter, Pseudomonas, Rhizobium…

-

aktinomycety: Streptomyces, Nocardia…

-

houby: Mucor, Rhizopus; Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Trichoderma…

XVI.3. Vztahy mezi mikroorganismy a rostlinami Všechny varianty: od mutualismu po parasitismus Spermosféra = mikroflora povrchu semen Můţe být antagonistou patogenních mikroorganismů Můţe ohroţovat klíční rostlinku (zvláště houby) Vyuţití chitinolytických mikroorganismů (Pseudomonas) pro regulaci = biologické moření Epifytní mikroflora = mikroflora nadzemních částí rostlin U zdravé rostliny často antagonista neţádoucích mikroorganismů U poškozené se můţe podílet na neţádoucích procesech Z hlediska krmivářského sloţení nepříznivé Hnilobné bakterie (aţ 90%) – dominantní rod Pseudomonas

71

Mikromycety – zastoupení do 10%, negativní – rozklad ţivin a produkce mykotoxinů (Mucor, Rhizopus; Aspergillus, Fusarium, Penicillium…) Sporulující tyčinky – zastoupení aţ 10%, negativní - rozklad ţivin, produkce kyseliny máselné (Bacillus, Clostridium) Bakterie mléčného kvašení – obvykle do 1(3)% - pozitivní, významné pro siláţování (Lactobacillus, Lactococcus)

Rhizosfera = mikroflora povrchu kořenů a přiléhající půdy (< 1mm) Ovlivněna kořenovými exudáty Ovlivňuje výţivu rostlin Můţe mít podíl na únavě půdy Odlišné sloţení – dominantní nesporulující tyčinky Odlišný počet (rhizosférní efekt = R/S), poměr výrazně > 1 (obvykle 10-100 /1000/x)

Mykorhiza = mutualistické (symbiotické) souţití mycelia hub a kořenů rostlin, pro některé rostliny aţ obligatorní Různá úroveň vzájemného vztahu: peritrofní mykorhiza – ektotrofní mykorhiza – endotrofní mykorhiza VAM = vesikulo-arbuskulární mykorhiza, průnik vláken hub do buněk kořenu rostliny Význam: R - Zvětšení povrchu kořenů R - Zlepšený příjem vody a ţivin R – Zvýšení mineralizace v blízkosti kořenů (  dostupnost ţivin) R – Zlepšená dostupnost P H – Zlepšené zásobování glycidy XVI.4. Funkce půdních mikroorganismů XVI.4.1. Vznik půdy Půda = přírodně historický útvar; vzniká působením půdotvorných činitelů na mateční horninu Půdotvorní činitelé: fyzikální, chemické, biologické (hlavně mikroorganismy) 72

Organismy ovlivňují: - zvětrávání hornin – vznik kyselin (org. i anorg.) - synthesu organických látek zvláště humusu - rozklad org. látek - tvorbu struktury (agregace) - mísení org. a min. látek (hlavně makroedafon)

1

XVI.4.2. Koloběh C-látek (viz poznámka pod čarou) Úplná aerobní respirace Máselné kvašení XVI.4.3. Koloběh N-látek Amonifikace Nitrifikace Denitrifikace Fixace N2 Imobilizace XVI.4.4 Koloběh S-látek Mineralizace Imobilizace Sulfurikace Desulfurikace XVI.4.5. Koloběh P-látek Mineralizace Imobilizace Solubilizace fosfátů XVI.4.6. Mineralizace úloha mikroorganismu nazastupitelná C -

1

Úplná aerobní respirace

Kapitoly XVI.4.2. aţ XVI.4.6. – podrobnosti viz předchozí kapitoly

73

= org. C-látky  CO2 + H2O + E = úplná mineralizace Máselné kvašení

-

= org. C-látky  CO2 + H2 + org. kyseliny (máselná..) + alkoholy = neúplná mineralizace typická pro anaerobní podmínky, vysoký podíl organických látek N Amonifikace = přeměna org.N látek  NH4+ Aerobní i anaerobní proces P Org. P-látky  minerální (H2PO4-, HPO42-, PO43-) Aerobní i anaerobní proces S Org. S-látky  minerální (H2S, SO42-) Aerobní i anaerobní proces Priming efekt (objeven při studiu mineralizace) = urychlení mineralizace obtíţně mineralizovatelné látky v přítomnosti snadno mineralizovatelné (po jejím přídavku) Produkce CO2

Snadno

Obtíţně

Směs

= priming efekt

_____________________________________ ___________

Význam: rozklad sloţitých látek detoxikace

74

XVI.4.7. Imobilizace = příjem látek ţivými (mikro)organismy z půdního roztoku a jejich zabudování do buněk Výsledek = nárůst biomasy (počet buněk či jejich hmotnost) Při nadbytku ţiviny v půdě jednoznačně pozitivní Při nedostatku konkurence s rostlinami Výrazně ovlivněna ve vazbě na obsah C-látek: optimální poměry: C:N

25 (30) : 1

C:P

100 : 1

C:S

400 : 1

Širší poměr znamená výraznější imobilizaci

XVI.4.8. Humifikace = proces transformace primární organické hmoty na humus Humus = stabilní organická hmota s uţším poměrem C:N a s dlouhým poločasem mineralizace (proto nemůţe slouţit jako aktuální významný zdroj ţivin) Základní podmínky:

přísun organické hmoty vnější podmínky přítomnost aktivních mikroorganismů

přísun organické hmoty (OH) Organická hmota i zároveň zdroj meziproduktů (M) a zdrojem E pro synthesy Hlavní zdroje OH- především rostliny: -

-

kořenové exudáty (1300-1600 kg/ha), poločas rozkladu 1-3 dny, zdroj E+ odumřelé kořínky za vegetace (1000-1300 kg/ha), poločas rozkladu 1-3 týdny, zdroj E+, M± odumřelé rostliny /posklizňové zbytky/ (3500-4000 kg/ha), poločas rozkladu 6-40 měsíců, zdroj E+, M+ organická hnojiva (dávka variabilní), poločas rozkladu: močůvka 3-5 dnů, kejda 3-6 týdnů,hnůj 3-6 měsíců, kompost 10-40 měsíců; zdroj E i M odumřelý edafon – velmi variabilní (např. při 5t bakterií + 5t hub/ha to můţe být cca 21t/ha), poločas rozkladu – dny

75

VÝZNAMNÝ VLIV CHEMICKÉHO SLOŢENÍ: Mineralizace

Zdroj energie

Zdroj meziprod.

Rychlá

Dobrý

Málo

Pomalá

Špatný

Hodně

Glycidy Proteiny Hemicelul. Celulosa Tuky Vosky Lignin (humus)

3 fáze přeměny organických látek: 1) transformace vodorozpustných látek (značná část mineralizována  Energie) 2) transformace nerozpustných látek (vznik fenol-proteinových komplexů) 3) „zrání“ převáţně fyzikálně-chemické reakce: kondenzace, polymerace, tím stabilizace Vnější podmínky -

Teplota Optimální mesofilní podmínky Niţší teplota zpomaluje proces Vyšší teplota urychluje humifikaci, ale vyšší mineralizace, vzniká kvalitní humus v menším mnoţství Vyšší teplota přispívá k hygienizaci (likvidace patogénů) sniţuje klíčivost semen

-

pH Optimální kolem 7,0 Niţší zpomaluje humifikaci, zvýšený rozvoj mikromycet, méně kvalitní humus Velmi vysoké pH přispívá k hygienizaci (vápnění např. kalů, ztráty NH3) 76

-

Aerace Vysoká aerace podporuje mineralizaci, vzniká méně ale kvalitního humusu, proces rychlejší – dostatek energie Nedostatečná aerace neposkytuje dostatek energie, více meziproduktů, proces pomalejší, méně kvalitní humus ve větším mnoţství Doporučení – kombinace aerobních a anaerobních podmínek s dominancí aerobních (překopávání kompostu)

-

Vlhkost Nutný faktor pro příjem ţivin V protikladu s aerací (zaplnění pórů vodou) Optimum – 60% max. vodní kapacity V kompostu cca 65 rel. %

-

Další faktory Klimat, erose, půdotvorný substrát…

Přítomnost aktivních mikroorganismů Nejsou specializované mikroorganismy Nutná komplexní aktivní mikroflora Zabezpečují řadu katabolických a anabolických procesů Výsledek – humus = stabilní komplexní organická hmota Stadia procesu:

1. bakterio-plísňové 2. aktinomycetové

HUMUS Stabilní organická hmota s dlouhým poločasem rozpadu Sloţení – pestrá chemická struktura, popis zaloţen na sráţení a rozpouštění v alkaliích a kyselinách Komponenty humusu: Fulvokyseliny Huminové kyseliny Huminy Hymatomelanové kyseliny kapitoly XVI.4.9 – XVI.4.12 viz pouze prednášky 77

XVII. MIKROBIOLOGIE VODY 1.

Úvod

2.

Mikrobiologie pitné vody

3.

Mikrobiologie povrchových vod

4.

Mikrobiologie odpadních vod 4.1. Charakteristika odpadních vod 4.2. Čištění odpadních vod

XVI.1. Úvod Výskyt mikroorganismů silně variabilní

(0-109 v 1 ml)

Výskyt je určen zdrojem kontaminace a zároveň je určen mnoţstvím ţivin, hlavně organických látek Ţivá sloţka = plankton (megalo – aţ nanoplankton) Autochtonní x alochtonní mikroorganismy Zákon o vodách – č. 254/2001Sb.

XVI.2. Mikrobiologie pitné vody Optimum – počet mikroorganismů 0 či blízký, většinou malé mnoţství přítomno Normy: -

Zákon 258/2000Sb. o ochraně veřejného zdraví

-

Vyhláška MZ ČR 252/2004Sb. platná od 1.5.2004 (nahrazuje vyhlášku 376/2000Sb.); /navazuje na Směrnici Rady EU 98/83/EC/; vychází z 258/2000Sb., 274/2001Sb., 274/2003Sb.

-

Vyhláška (§4) určuje rozsah a četnost odběrů

-

ČSN ISO 5667-3, 5667-5, 5667-14 upravují odběr a manipulaci se vzorkem

Definice pitné vody: nově není Definice z neplatné ČSN: Voda zdravotně nezávadná, která při trvalém poţívání nevyvolává onemocnění nebo poruchy….

78

Pojmy z vyhlášky: -

Hygienický limit – hodnota stanovená v přílohách vyhlášky, musí být dodrţen v místech odběru; u balené v místě stáčení a po dobu minimální trvanlivosti (výjimka KTJ/ml stanovené při 22°C – 500KTJ a 36°C – 100KTJ)

-

Zásobovaná oblast – území ve kterém je lokalizována rozvodná síť, voda je dodávána jedním provozovatelem

-

Individuální zdroj pitné vody, zpravidla slouţí k zásobování podle §3 odst.2 písm. a) zákona (např. studna)

-

Výdejní automat – uměle instalovaná nádrţ, do které se voda dováţí nebo přivádí z vhodného zdroje (nejedná se o automaty na balenou vodu)

-

Balená pitná voda – 292/1997Sb., 241/1998Sb., 465/2000Sb.

-

Mezní hodnota (MH) - její překročení obvykle nepředstavuje akutní zdravotní riziko; (voda ztrácí kvalitu v daném ukazateli - konzumace nemusí být vyloučena, nutná opatření)

-

Nejvyšší mezní hodnota (NMH) – hodnota zdravotně závaţného ukazatele jakosti; při jejím překročení je vyuţití vody jako pitné vyloučeno

-

Doporučená hodnota = optimální koncentrace dané látky (pouze Ca, Ca+Mg)

-

Při překročení limitů se neprodleně provede opakovaný rozbor pro potvrzení výsledků; přijmou se rovněţ nápravná opatření

Mikrobiologické parametry pitné vody: -

Escherichia coli (EC), indikátor čerstvého fekálního znečištění, vzhledem k niţší citlivosti na vnější vlivy neţ patogenní mikroorg. hlavní indikátor

-

koliformní bakterie (KB), indikátor celkového fekálního znečištění

-

enterokoky (EK), indikátor fekálního znečištění, (metabolicky BMK)

-

Pseudomonas aeruginosa (PA) – potenciální patogen

-

počty kolonií při 36°C (K36), zdrojem výkaly, půda, rostliny, prach…

-

počty kolonií při 22°C (K22), zdrojem půda, rostliny, prach…

-

Clostridium perfringens (CP) – potenciální patogen, stanovuje se při úpravě vody z povrchové (MH: 0/100ml)

-

další biologické ukazatele: mikroskopický obraz: počet organismů, abioseston, ţivé organismy

-

dále řada parametrů (52) fyzikálních a chemických

-

(patogenní mikroorganismy se běţně nesledují)

79

Potenciálně přenosné patogenní mikroorg. ve vodě: Campylobacter, E.coli, Salmonella, Shigella, Vibrio, Yersinia, Pseudomonas, Aeromonas, viry, prvoci

HODNOTY PRO PITNOU VODU (KTJ) skupina NMH

EC

KB***) MH

Pitná v.

BV

0/100ml

0/250ml

0/100ml

0/100ml

ENT

NMH

0/100ml

0/250ml

PA

NMH

-

0/250ml

K36

MH

100/1ml**)

-

K36

NMH

-

20/1ml

K22

MH

200/1ml

-

500/1ml**) K22

NMH

CP*)

MH

-

500/1ml

0/100ml

-

*) pouze u pitných vod upravených z povrchových **) pro náhradní zásobování, vodu dodávanou dopravními prostředky a malé nedezinfikované zdroje do 5 m3/den ***) minimálně u 95% rozborů Metody mikrobiologických stanovení: -

EC - ČSN EN ISO 9308-1

-

KB - ČSN EN ISO 9308-1

-

ENT - ČSN EN ISO 7899-2

-

PE - ČSN EN 12780

-

K22, K36 - ČSN EN ISO 6222

-

CP – zákon 252/2004Sb.

Opatření při překročení mezních hodnot bakterií – desinfekce: Ag, Cu, Cl (plynný, Savo, chloramin), O3, UV a γ záření Dále ve vyhlášce limitní hodnoty -

pro teplou vodu

-

pro teplou vodu z individuálního zdroje pro účely osobní hygieny 80

XVII.3. Mikroflóra povrchových vod Mikroorganismy pravidelně přítomny ve variabilním mnoţství Měřítkem znečištění saprobita:

mnoţství organických látek mnoţství bakterií obsah O2 charakter procesů

Stupně saprobity: -

polysaprobní – vysoce znečištěné vody mnoţství org.látek – vysoké mnoţství bakterií – vysoké (cca 108/ml) obsah O2 – nízký (blízký 0) charakter procesů – anaerobní (redukční) vyšší organismy téměř nepřítomny

-

α-mesosaprobní – znečištěné vody mnoţství org.látek – střední mnoţství bakterií – vysoké (cca 106/ml) obsah O2 – nízký charakter procesů – silně anaerobní přítomny nenáročné organismy

-

β-mesosaprobní – mírně znečištěné voda mnoţství org.látek – malé mnoţství bakterií – vysoké (cca 104/ml) obsah O2 – dobrý charakter procesů – značně aerobní vyhovuje značnému mnoţství ţivočichů

-

oligosaprobní- čistá voda mnoţství org.látek –blízké 0 mnoţství bakterií – nízké (< 103/ml) obsah O2 – plná nasycenost charakter procesů – silně aerobní vyhovuje i náročným ţivočichům

Jakost povrchových vod definuje ČSN 75 7221 (říjen 1998): Cca 46 kriterií; mezné hodnoty fyzikální, chemické, biologické 81

Norma vymezuje 5 tříd jakosti: I.

neznečištěná voda

II.

mírně znečištěná voda

III.

znečištěná voda

IV.

silně znečištěná voda

V.

velmi silně znečištěná voda

Biologické parametry: Termotolerantní koliformní bakterie Enterokoky Saprobní index makrozoobentosu Chlorofyl Kontrola jakosti – ČSN 75 7220 XVII.4. Odpadní vody

XVII.4.1. Charakteristika Vody polysaprobní, silně kontaminované, vysoký obsah organických látek – nesmí do vodotečí, nutno ošetřit – vyčistit (speciální reţim pro vody s toxickými látkami) XVII.4.2. Čištění komunálních odpadních vod Základem fyzikální a mikrobiální procesy Členění: – mechanický stupeň - biologický stupeň

- aerobní - anaerobní

Mechanický stupeň -

česla – zachycení hrubých nečistot (skládka spalování)

-

lapák písku – odstranění písku (skládka)

-

I. sedimentace Povrch – plovoucí nečistoty (skládka, spálení) Usazenina = surový kal  anaerobní stupeň Střed = mechanicky vyčištěná voda  aerobní stupeň

Biologický aerobní stupeň Princip: dodat maximum vzduchu (O2) a tím podpořit mineralizaci, imobilisaci, aerobní respiraci, amonifikaci, nitrifikaci…. 82

Technické varianty: akumulační rybníky závlahová pole aerobní ţlaby biofiltry (aerofiltry, rychlofiltry) aktivační ţlaby Aktivace – nejúčinnější varianta Princip: mechanicky vyčištěná voda + aktivovaný kal + vzduch (O2) Výsledek: vyčištěná voda + minerální metabolity + aktivovaný kal II. sedimentace: odděluje aktivovaný kal od vody (  vodoteč) Aktivovaný kal: část recyklována (pro další aktivaci); přebytečný akt.kal  anaer.stupeň Na aktivaci také můţe navazovat denitrifikační stupeň, kde v anaerobních podmínkách je NO3- (vzniklý při nitrifikaci) denitrifikován na N2 + H2O Biologický anaerobní stupeň Princip: zabránit přístupu O2 a tím podpořit máselné kvašení, acidogenesi, acetogenesi, metanogenesi… Surový kal a přebytečný aktivovaný kal ve vyhnívacích nádrţích (I a II), zde anaerobní mikrobiální procesy Výsledek: -

anaerobně stabilizovaný kal, odvodnit a pouţít pro kompostování, aplikaci do půdy, skládkování

-

bioplyn – směs CH4, CO2 a stop dalších plynů  spalování – tepelná a elektrická energie

83

XVIII. MIKROBIOLOGIE KRMIV 1.

Úvod

2.

Mikroflóra objemných krmiv

3.

Mikroflóra sena

4.

Mikroflóra jadrných krmiv, krmných směsí

5.

Mikrobiologie siláţe XVIII.1. Úvod Mikroorganismy často neţádoucí – podíl na destrukci ţivin (zvláště při zhoršení skladovacích podmínek) – produkce neţádoucích metabolitů Výjimky: – mléčné bakterie v siláţi a senáţi –

mikroorganismy (zvláště kvasinky) jako zdroj vitamínů a bílkovin

– probiotika – ţivý krmný mikrobní doplněk k optimalizaci mikroflory trávicího traktu

XVIII.2. Mikroflóra objemných krmiv = mikroflora zelených částí rostlin = epifytní mikroflóra V průměru nepříznivé sloţení Obvyklý počet 105 – 108/g (podrobnosti viz kapitola XVI.3)

XVIII.3. Mikroflóra sena Sníţení obsahu vody (na 12-16%) vede k omezení mikrobiálních aktivit a změně Sloţení mikroflóry: Mikroflóra vychází z epifitní: - sníţení počtu (při optimálním sušení) - přechod bakterií v anabiosu - preference klidových stádií (spóry, konidie) - typičtí představitelé – mikromycety, Bacillus

84

Přísun vody vede ke stimulaci mikrobních procesů Samozahřívání - termogenese termogenese = výsledek fyziologických a mikrobiálních procesů při nepřiměřeném obsahu vody (i lokálně) Hlavním zdrojem tepla mikroorganismy - 5-10% substrátu = zdroj ţivin - 95-90% substrátu pro produkci tepla - (v půdě 20-40% ţiviny, 80-60% mineralizace – energie) Fáze: fyziologická mikrobiologická (mesofilové, termofilové) chemická, suchá destilace  samovznícení XVIII.4. Mikroflóra jadrných krmiv Základ - epifytní mikroflora Zvýšený výskyt vţdy negativní ČSN 46 70 11 „Metody zkoušení nezávadnosti krmiv“ ČSN 46 70 06 „Mikrobiologické zkoušení krmiv Není norma stanovující konkrétní parametry Hlavní kriteria kvality: -

bez patogenních mikroorganismů (např. Salmonella)

-

bez mikromycet – producentů toxinů

Naše výsledky: -

-

celkový počet bakterií do 103/g

výborné

do 105/g

vyhovující

počet mikromycet do 103/g

dobré

do 104/g

průměrné

nad 105/g

plesnivějící (plesnivé)

Hlavní skupiny mikroorganismů: - bakterie:

Bacillus Pseudomonas Escherichia! Salmonella ! 85

- mikromycety

Aspergillus! Penicillium Mucor Alternaria Fusarium!

Polská norma vymezuje počty: Proteolytické b. Amonifikační b. Saprofytické houby Toxiny produkující mikromycety XVIII.5. Mikrobiologie siláţe = konzervovaná objemná (zelená) píce činností mléčných bakterií 3 základní podmínky: (1) anaerobní uloţení siláţované hmoty (velikost řezanky, rychlost naskladnění, vytěsnění vzduchu, uzavření….) (2) cukerné minimum (Zubrilin) = dostatek zkvasitelných cukrů, aby pH pokleslo na cca 4,2 (odvislé od sušiny) (3) přítomnost bakterií mléčného kvašení Fáze siláţování (1) fáze smíšené mikroflory (do 7 dnů) – rozvoj všech epifytních bakterií, spotřebován O2, rozvoj anaerobů, počátek produkce org.kyselin (2) fáze bakterií mléčného kvašení – anaerobiosa umoţňuje rozvoj BMK; zpočátku hlavně kokovité (podfáze mléčných koků - Lactococcus) – rychle se mnoţí ale méně odolné vůči pH; nahrazeny tyčinkami (podfáze ml.tyčinek – Lactobacillus); při nízkém pH odumírání i tyčinek (3) technologická zralost (cca po 8 týdnech) – mikrobní procesy ustávají, píce je konzervována a získává dlouhodobou skladovatelnost Hlavní mikroorganismy siláţe (1) Bakterie mléčného kvašení (BMK) jediná pozitivní skupina v siláţi; fermentuje glycidy na kyselinu mléčnou; homofermentativní (preferovány) i heterofermentetivní.; hlavní: Lactococcus (lactis), Lactobacillus (plantarum) 86

(2) Mikromycety (plísně) Negativní – konkurenti BMK, rozklad ţivin, produkce toxinů; Acidorezistentní, regulace anaerobiosou; Aspergillus, Penicillium (3) Bakterie máselného kvašení Konkurenti BMK, produkce kys.máselné, tím zhoršení organoleptických vlastností; Anaerobní, regulace – nízké pH: < 4,9 (4,5); Clostridium (4) Hnilobné bakterie Dominantní v epifytní mikroflóře, rozklad proteinů, vznik neţádoucích metabolitů (NH4+); Aerobní aţ anaerobní, regulace: nízké pH; Pseudomonas, Escherichia (5) Kvasinky Konkurenti BMK (cukry fermentují na etanol + CO2); V malém mnoţství nevadí; Fakultativní anaerobové; Regulace – dlouhá generační doba; Saccharomyces Regulace procesů v siláţi (1)

Anaerobiosa = nezastupitelná podmínka

(2)

Očkování BMK – nutný ale dostatek glycidů Polyvalentní x monovalentní preparáty Enterococcus faecium (Lactisil); Lactobacillus

(3)

Doplnění dalších mikroorganismů Především jako zdroj hydrolas Bacillus, Aspergillus…

(4)

Kombinované přípravky Obsahují enzymovou sloţku (hydrolysa polysacharidů – např. amylasy) + BMK

(5)

Doplnění glycidů Melasa - dříve nejpouţívanější přísada Kombinace snadno a obtíţně siláţovatelných rostlin

(6)

Sníţení pH (nyní výjimečně) Přídavek organických či anorganických kyselin nahradí určitý nedostatek glycidů; (kys. mravenčí, H2SO4….)

87

(7)

Regulace neţádoucích mikrobů (nyní výjimečně) Soli organických kyselin, formaldehyd Antibiotika (v současnosti jiţ zakázána) – ČR dříve pouţívala pouze 2: bacitracin, chlortetracyklin

88

XIX. MIKROBIOLOGIE ŢIVOČICHŮ 1. Úvod 2. Mikrobiologie trávicího traktu (TT) 2.1.

Hlavní skupiny mikroorganismů TT

2.2.

Ekologie mikroorganismů TT

2.3.

Bachor

2.4.

Význam mikroorganismů TT

2.5.

Moţnosti ovlivnění mikroflóry TT

3. Patogenní mikroorganismy a imunita 3.1.

Patogenita

XIX.1. Úvod Kaţdý ţivočich část ţivota v bezmikrobním stavu (děloha, vejce…) Kontaminace v době porodu (líhnutí) Rozdělení ţivočichů: Gnotobiot = mikrobiologicky definovatelný -

bezmikrobní (germ-free, GF) – izolován od vnějšího prostředí, vše sterilní

-

mono-, di-, poly-biot = kontaminovaný definovanými mikroorganismy

Konvenční ţivočich = mikrobiologicky nedefinovatelný SPF (specific pathogen free) = prostý definovaných patogenních mikroorganismů -

nejčastěji odvozen od gnotobiotů

-

odvozen od konvenčních ţivočichů

XIX.2. Mikroflora trávicího traktu TT zpočátku sterilní – kontaminace: porodní cesty, skořápka, vzduch, potrava… XIX.2.1. Hlavní skupiny mikroorganismů TT Autochtonní Dominantní anaerobní mikroorganismy, podstatně méně fakultativních anaerobů Anaerobní bakterie Především sacharolytické (škrob, celulosa), pektinolytické - Bacteroides, Butyrivibrio, Clostridium, Fibrobacter, Peptococcus, Prevotella… Bakterie mléčného kvašení

89

Výrazně pozitivní skupina: antagonisté neţádoucích mikroorganismů a procesů Hlavní představitelé: - Lactobacillus (homo- i hetero-fermentativní), L. acidophilus, L. reuteri, L. salivarius - Enterococcus (homofermentativní) - Bifidobacterium (60% octová, 40% mléčná), dominantní u kojených mláďat, B. bifidum, B. animalis, B. longum, aj.

Enterobakterie G- bakterie, původně povaţovány za hlavní, ve skutečnosti několik %; -

Escherichia kdysi chápána jako nejdůleţitější rod zvláště v kaudální části, od patogena aţ mutualista, rozlišení antigeny (K – kapsulární, O – somatický, H - flagelární); synthesa vitaminů X, průjmy (smrt)

-

Dále Klebsiella, Enterobacter

Alochtonní (1) kontaminující (např. patogenní) – pak i velký počet (2) přítomny pravidelně (např. kvasinky), ale pak malý počet, často <106/g XIX.2.2. Ekologie mikroorganismů TT Od ţaludku (ţlaznatého) počet mikroorganismů kaudálně roste; aţ 1011-1012/g, tvoří aţ 30% chymu Ústní dutina Osídlení četné (i 1011/g) Diversita velká Mikroflóra spíše neţádoucí (např. způsobuje kazivost zubů) Vole Mikroflóra bohatá (108/g) Hlavně BMK Konzervace potravy Ţaludek Mikrobně chudý (často < 106) Regulace přijatých mikroorganismů

90

Tenké střevo Hlavně enzymy hostitele V dudodenu počet malý, dále kaudálním směrem roste Tlusté střevo, výkaly Hlavní místo výskytu u monogastrů Počet běţně 1011/g Intenzivní mikrobní metabolismus Problematické vyuţití produktů XIX.2.3. Bachor Populaci tvoří: bakterie, houby, protozoa Hlavní procesy: fermentace a synthesy Mikroflóra (bakterie) Bakterie nepostradatelné, jsou schopny nahradit ostatní sloţky Počet 1011 aţ téměř 1012 v 1 ml Celulolytické (modifikované máselné kvašení s vysokým podílem kyseliny octové) Amylolytické – štěpí škrob Proteolytické – štěpí bílkoviny Významní představitelé: Bacteroides, Butyvibrio, Clostridium, Fibrobacter, Methanobacterium, Peptostrptococcus, Prevotella, Ruminococcus, Selenomonas, Streptococcus Mykoflóra (anaerobní houby) Rozklad sloţitých C-látek (celulosy) Významní představitelé: Neocallimastix, Piromonas Mikrofauna (protozoa) Hlavní funkce = synthesa bílkovin (kvalitní ţivočišné) Částečně i přeměny glycidů Popsáno cca 50 druhů, u jedince do 10 Celkový počet 103-106/ml Významní představitelé: Entodinium, Diplodinium, Epidinium, Ophryoscolex, Isotricha XIX.2.4. Význam mikroorganismů TT Přeměny potravy (+, -) – vyuţití mikrobních enzymů (hlavně hydrolasy) Synthesa - aminokyselin, bílkovin, vitamínů (+)

91

Obranné reakce (+) -

Konstitutivní = vrozené, výhodné; vznik během fylogenese, např. řasinkový epitel, schopnost synthetizovat globuliny, fagocytosa Stejné u konvenčních a GF

-

Adaptivní = mikroflora nezbytná k vyvolání, např. mnoţství sérových globulinů U konvenčních vyvinuté dobře proti GF

-

Extrakorporální = mikroflora nezbytná k jejich manifestaci, antagonismus autochtonních k alochtonním; Kompetice o ţiviny a prostor; Competitive exclusion (Nurmi koncept); Vyuţití v probioticích U GF chybí

Negativní funkce -

intestinální autointoxikace

-

kompetice o ţiviny

-

indukce karcinogenese

-

zhoršení chorob

-

zubní kazy

-

bacilonosičství

Rozdělení ţivočichů podle významu MTT (modely): -

Kooperační (přeţvýkavci) Mikroflóra nepostradatelná = zdroj enzymů Zabezpečení důleţitých funkcí: rozklad potravy, synthesa aminokyselin a vitaminů Hlavní místo rozvoje - bachor

-

Kompetitivní (masoţravci) Sloţení potravy + mikrobů + ţivočicha je obdobné – konkurence o ţiviny V ţaludku „sterilace“, dále působí hlavně enzymy ţivočicha Mikroorganismy aţ v kaudálních částech – zde i synthesy

-

kooperačně-kompetitivní (všeţravci) I zde redukce v ţaludku a větší rozvoj v tlustém střevě, které je delší, často výrazné slepé střevo Přínos mikrobů jen průměrný Koprofagie (prase, morče, králík, aj.) zlepšuje vyuţití látek z výkalů 92

XIX.2.5. Moţnosti ovlivnění mikroflory TT Potrava Při mírných a postupných změnách sloţení potravy je ovlivnění nevýrazné „Chemická“ aditiva -

Antibiotika (v minulosti velmi frekventovaná – bacitracin, chlortetracyklin, monensin), nyní silně regulována (pouze definovaná, ne jako růstové stimulátory) – ovlivnění metabolismu, regulace patogenů (sub- a terapeutické dávky)

Probiotika Ţivý potravní mikrobní doplněk s cílem optimalizovat mikroflóru TT Příklady:Lactobacillus (L. acidophilus), Enterococcus (E. faecium), Bifidobacterium (B. bifidum, B. animalit, B. longum) Význam:

-

redukce patogenů

-

omezení karcinogenese

Prebiotika Potravní doplněk s komponenty nevyuţitelnými makroorganismem (např. inulin, oligosacharidy), které stimulují rozvoj pozitivní mikroflory Synbiotika = kombinace probiotika + prebiotika „Functional food“ Potraviny obsahující doplňky zvyšující jejich uţitnou hodnotu s malým přímým nutričním významem XIX.3. Patogenní mikroorganismy a imunita

XIX.3.1. Patogenita Schopnost vyvolat onemocnění podmíněno 3 vlastnostmi: invazivita: schopnost překonat obranné bariery virulence: schopnost ţít a rozmnoţovat se v organismu hostitele toxicita: schopnost produkovat exo- nebo endo-toxiny

93

Exotoxin

Endotoxin

Difuse z buňky

Vazba na buňku

Bílkovina

Lipid, sacharid..

Štěpen proteasami

Neštěpen

Silně toxický

Méně toxický

Silný antigen

Slabý antigen

Termolabilní

Termostabilní

Selektivní

Neselektivní

Denaturace formaldehydem

Ne

(vznik anatoxinu)

Patogenita- stanovení: -

ED 50 (Efective Dosis)= dávka antigenu při níţ onemocní (příznaky) 50% populace

-

LD 50 (Lethal Dosis) = dávka antigenu při níţ zemře 50% populace

Imunita – schopnost organismu bránit se průniku a rozmnoţování patogena Imunizace – cílené vyvolání obranných reakcí Imunita vrozená – podmíněna geneticky (druhová, rasová…) Imunita získaná = adaptivní (vzniká během ţivota) -

aktivní - synthesa imunoglobulinů hostitelem jako reakce na antigen (očkování, prodělání choroby)

-

pasivní – přijetí hotových protilátek (při vývoji v děloze, mlezivo, séra, imunoglobuliny)

94

XX. MIKROBIOLOGIE MLÉKA 1.

Fáze rozvoje mikroorganismů

2.

Vyuţití mikroorganismů (kultury)

XX.1. Fáze rozvoje mikroorganismů Mléko je obsahem bílkovin a glycidů vhodné prostředí pro mikroorganismy. Fáze baktericidní podmínkou nízký počáteční počet mikroorganismů a rychlé ochlazení (< 6°C, pak počet v této fázi klesá a mléko je dále skladovatelné) Fáze smíšené mikroflory rozvoj všech přítomných bakterií; spotřeba O2 a přechod do anaerobiosy; preference rozvoje BMK Fáze BMK intenzivní rozvoj BMK (Lactococcus, Lactobacillus) pokles pH a výrazné omezení ostatních mikroorganismů později pokles BMK a po jistou dobu stabilita Fáze kvasinek pozvolný rozvoj kvasinek, které odbourávají kyselinu mléčnou – tím vzestup pH Fáze hnilobných bakterií sníţení kyselosti umoţní rozvoj hnilobných bakterií – proteolysa, peptonisace – tím totální rozklad dokončen XX.2. Vyuţití mikroorganismů (kultury) Zpracování mléka je často zaloţeno na vyuţití různých kultur mikroorganismů. Kysané mléčné výrobky (viz rovněţ cvičení) -

smetanová: Lactococcus lactis jogurtová: Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, Sc. salivarius ssp. thermophilus acidofilová: Lb. acidophilus kefírová: Kluyveromyces + Candida + Torulopsis (kvasinky); homoi heterofermentativní BMK, Lactobacillus, Lactococcus

Sýrařské kultury Směsné kultury BMK a dalších; např. mazové bakterie, proteolytické b., propionové b., Penicillium, aj.

95