prof. Ing. Karel Melzoch, CSc., Ústav kvasné chemie a bioinženýrství, VŠCHT Praha

Diplomové práce absolventů studijního oboru „Kvasná chemie a bioinženýrství“, obhájené na Fakultě potravinářské a biochemické technologie VŠCHT Praha v akademickém roce 2007/08 prof. Ing. Karel Melzoch, CSc., Ústav kvasné chemie a bioinženýrství, VŠCHT Praha

1

Zaměření Sladařství a pivovarství: Martin Baszczyňski: Stanovení stáří buněčné populace pomocí průtokové cytometrie (doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Pivovarské kvasinky Saccharomyces cerevisiae mají limitovanou replikativní délkuživota. Mohou během svého života prodělat pouze omezený počet dělení (10- 30 dělení). Během stárnutí prodělají řadu morfologických a fyziologických změn. Buňka roste, postupně se snižuje životaschopnost, buněčný povrch se zvrásňuje, prodlužuje se generační doba, zvyšuje se počet jizev a snižuje se metabolická aktivita. Poté vstoupí do nereplikativního stavu nazývaného fáze „senescence“. Následuje smrt a autolýza. Zestárlé kvasinky vykazují odlišné flokulační charakteristiky a schopnosti fermentace. Předpokládá se, že vlastnosti spodně kvasících kmenů začínají degenerovat po desátém znovunasazení. Otázka stárnutí kvasinek je velmi důležitá u procesů kontinuální fermentace, se zvýšeným rizikem stárnutí imobilizovaných buněk, zvláště pokud je kvasinka imobilizována delší dobu (až několik měsíců). Jak ovlivňuje stárnutí imobilizovaných kvasinek v průběhu kontinuální kultivace kvalitu produktu je zatím nejasné. Z tohoto důvodu je studium vlivu stárnutí kvasinek na životaschopnost a fermentační kapacitu důležité. Existuje mnoho metod na stanovení stáří buněk. Avšak tradiční metody založené na kultivačních technikách neumožňují sledování fyziologických změn v závislosti na čase. Proto byla vyvinuta rychlá metoda stanovení replikativního stáří kvasinek založená na fluorescenčním barvení jizev selektované populace buněk a následném měření průměrné intenzity fluorescence těchto buněk průtokovou cytometrií. Jako vhodná korelace se ukázala kalibrační křivka, kde jednotlivým bodům křivky odpovídala průměrná intenzita fluorescence buněčné populace s různým průměrným počtem jizev. Tato metoda byla použita na určení stárnutí biomasy v kontinuálním air-lift reaktoru a k určení replikativního stáří v různých zónách sedimentu v nádobě s kónickým dnem. Determination of cell population age by flow cytometry The brewing yeast Saccharomyces cerevisiae has a limited replicative lifespan. Brewing yeast are capable of a finite number of divisions (10-30 divisions). During their replicative lifespan they are undergoing characteristic morphological and physiological changes. Yeast display an array of changes during their aging including decrease of viability, increase in size, cell surface wrinkling, increase of generation time, increasing bud scar number and decreased metabolic activity. Subsequently they are entering a non-replicative state termed senescence, leading to death and autolysis. The aged brewing yeasts show changed flocculation characteristics and fermentation performance. It is believed that the performance of lager strain begins to degenerate after 10 serial repitchings. The question of yeast aging is particularly important in continuous fermentation processes with elevated risk of immobilized yeast ageing particularly when considering that immobilized cells are spending in a continuous reactor long periods of time (several months). There is little known on the impact of senescence and aging of immobilized yeast in continuous fermentation on product quality. Therefore the study of impact the yeast cell aging on the viability and the fermentation performance is very important. There are many methods of cell age and viability assessment; however, traditional culturebased techniques do not provide real-time information on microbial physiology. Hence, an expeditious method of yeast age estimation was developed based on selective bud scar 2

staining and subsequent fluorescence intensity measurement by flow cytometry. The calibration curve resulting from cytometric determination of average bud scar fluorescence intensities of cell populations with different average bud scar numbers showed a good correlation. The combination of flow cytometry with bud scar staining resulted in a method of rapid cell age estimation. This method was applied to determine the ageing of immobilized cells in continuous gas-lift reactor and furthermore to determine the age distribution of yeast across the sediment on the bottom of laboratory-scale cylindroconical vessels. Marie Cíchová: Vliv taninů na obsah a složení polyfenolů bílých vín (Ing. Jaromír Fiala, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Rostlinné látky fenolové povahy se ve víně vyskytují ve velmi nízkých koncentracích, proto je nutné tyto látky před samotným stanovením zakoncentrovat. Vhodnou metodou pro izolaci, purifikaci a zakoncentrování fenolových látek ze složité matrice je extrakce na pevné fázi (SPE). Nejdůležitějšími skupinami fenolických látek jsou fenolické kyseliny, flavonoidy, flavanoly, anthokyany a třísloviny. Tyto látky slouží jako redukční činidla a podobně jako vitamin E a C či karotenoidy ochraňují lidské tkáně před oxidačním stresem, který může být doprovodným jevem mnoha onemocnění jako např. rakoviny, koronárních a zánětlivých onemocnění. Tato práce se zabývá stanovením celkových a jednotlivých polyfenolických látek ve víně, jejich obsahem a změnami jejich obsahu po přídavku taninů ve dvou různých koncentracích. Vína byla před i po přídavku taninů podrobena senzorické analýze a byl sestaven chuťový profil vlivu taninů na senzorické vlastnosti. Přídavek taninu do vína může výrazně ovlivnit chuť i vůni vína, jak pozitivně tak i negativně. Výsledky získané v práci jsou použitelné pro optimalizaci přídavku taninů do vín révy vinné v koncentraci, která nejlépe ovlivňuje senzorickou kvalitu vína. Pro volbu vhodného taninu je nutné přihlédnout k tomu, že každá vinařská oblast a víno v ní vyrobené, má rozdílné podmínky pro zrání hroznů a jiné technologické postupy při výrobě vína. Influence of tannins to content and structure polyphenols in white wines Plant substances of phenolic character occur in wine in very low concentrations, it is therefore necessary to graduate these substances before their assessment. An appropriate method for the isolation, purification, and graduation of phenolic substances from a complex matrix is solid phase extraction (SPE). The most important groups of phenolic substances are phenolic acids, flavonoids, flavanols, anthocyans, and tannins. These substances serve as reductants and, in a manner analogous to vitamin E and C or carotenoids, protect human tissue from oxidizing stress, which can be incidental to many diseases, such as cancer, coronary or inflammatory diseases. This work is concerned with the assessment of aggregate and individual polyphenolic substances in wine, their content and changes of their content after the addition of tannins in two different concentrations. Wines were subjected to a sensory analysis both before and after the addition of tannins, and a taste profile of the impact of tannins on sensory properties was compiled. The addition of tannin into wine can influence significantly the taste as well as the aroma of wine, both in positive and negative terms. The results obtained in this work are suitable for the optimisation of tannin additions into grape wines in a concentration which has the best impact on the sensory quality of wine. However, one must take into account that each wine 3

region and the wine produced in it have different conditions for ripening of grapes and different technological procedures for wine production. Tereza Ehlová: Tvorba karbonylových sloučenin a jejich aduktů s oxidem siřičitým během výroby (doc. Ing. Pavel Dostálek, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Diplomová práce se zabývá studiem tvorby aduktů karbonylových sloučenin s oxidem siřičitým v modelovém systému, aplikací poznatků z modelové studie v analýze karbonylových sloučenin metodou SPME–GC/MS a sledováním tvorby aduktů během hlavního kvašení a dokvašování piva. V experimentální části je použita metoda průtokové chronopotenciometrie pro stanovení oxidu siřičitého a metoda SPME-GC/MS pro kvantifikaci vybraných karbonylových sloučenin. Pomocí metody průtokové chronopotenciometrie byla popsána závislost tvorby aduktů karbonylových sloučenin s oxidem siřičitým na pH, teplotě, koncentraci reaktantů a struktuře karbonylových sloučenin v modelovém systému, jehož základ tvořil acetátový pufr. Sledováním rozpadu aduktů v pivu při teplotě 50 °C bylo zjištěno, že při zakoncentrování karbonylových sloučenin během SPME zaniká část aduktů přítomných v pivu a na vláknu se derivatizují nejen volné karbonylové sloučeniny, ale i ty, které pocházejí z rozpadlých aduktů a jsou za běžných podmínek senzoricky neaktivní. Z hlediska tvorby aduktů během výroby piva je významná fáze dokvašování, kdy se na karbonylové sloučeniny váže až 50 % z celkového množství oxidu siřičitého, který byl vytvořen během hlavního kvašení. Formation of carbonyl compounds and their sulphur dioxide aducts during beer brewing The diploma thesis deals with studying of the adduct formation from carbonyl compounds and sulphur dioxide in a model system, the application of knowledge from the model study in analyses of carbonyl compounds with the SPME-GC/MS method and monitoring the formation of adducts during the main fermentation and lagering. In the experimental part, the flow-through chronopotentiometry was used for determination of sulphur dioxide and the SPME-GC/MS for quantification of selected carbonyl compounds. The dependence of formation of adducts on pH, temperature, concentration of reactants and structure of carbonyl compounds in the model system, which was based on acetic buffer, has been characterized by the method of flow-through chronopotentiometry. By monitoring the degradation of adducts in beer at 50 °C it has been found out that the isolation of carbonyl compounds by SPME leads to destruction of part of adducts contained in beer. Not only free carbonyl compounds but also the ones, that come from degraded adducts and are sensory inactive under normal conditions, are derivatizated on the fibre. In terms of the formation of adducts, the phase of lagering is important, because up to fifty per cent of total amount of sulfur dioxide, which was created during the main fermentation, is bound to carbonyl compounds during this process. Michaela Linhová: Faktory ovlivňující cytometrické stanovení buněčné viability u kvasinky Pichia pastoris (Ing. Barbora Branská, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha)

4

Cílem této práce bylo analyzovat faktory ovlivňující značení fluorescenčními sondami s následnou detekcí průtokovou cytometrií s ohledem na stanovení buněčné viability a později i dalších parametrů fyziologického stavu kvasinky Pichia pastoris. K tomuto studiu byly uskutečněny kultivace na třepaných baňkách a pro srovnání sloužily vzorky odebírané z kontinuální kultivace. V kultivacích byl použit rekombinantní kmen Mut+ kvasinky P. pastoris, který po indukci methanolem produkuje extracelulárně trypsinogen, dále kmen geneticky modifikovaný pro intracelulární produkci β-galaktosidasy a geneticky neupravovaný kmen. V diplomové práci byly sledovány změny počtu značených mikroorganismů v populaci P. pastoris v závislosti na rozdílných postupech značení fluorescenčními sondami (propidium jodid, ethidium bromid, sytox green, fluorescein diacetát, karboxyfluorescein diacetát, dihydroethidium, dichlorodihydrofluorescein diacetát, 3,3´-diethyloxakarbokyanin jodid, Rhodamin 123, bis-oxonol) a operacích s buňkami. Byly testovány: vliv reakčního prostředí (fosfátového pufru, HBS pufru, H2O a BMGY média), různých teplotních podmínek (10 minut při 0°C, 10 minut při 25°C, 10 minut při 0°C s následujícími 10 minutami při 25 °C, 10 minut při 25 °C s následujícími 10 minutami při 0°C, 10 minut při 40°C) a přídavku depolarizačních (CCCP, azid sodný) a permeabilizačních (triton, ethanol) činidel. Na základě provedených experimentů bylo zjištěno, že vliv reakčního prostředí na značení byl zanedbatelný, z teplotních režimů byl zaznamenán největší posun intenzity fluorescence při 40°C a důsledky depolarizace a permeabilizace buněk byly vnímány různými sondami odlišně. Vybrané metody poté byly aplikovány na sledování fyziologických změn při kultivaci na třepaných baňkách a kontinuálních kultivacích ve fermentoru v uspořádání chemostat, kde byly porovnávány různé kultivační substráty a kmeny Pichia pastoris. Předpokládaný negativní vliv methanolu jako zdroje uhlíku a energie na produkci ROS se nepotvrdil pro žádný zkoumaný kmen P. pastoris, ale byl zjištěn negativní vliv akumulace nespotřebovaného methanolu v médiu na fyziologický stav kvasinky. Jako referenční test ke stanovení viability pomocí průtokové cytometrie byly použity klasické metody určování životaschopnosti buněk: barvení methylenovou modří a kultivační stanovení. Bylo zjištěno, že barvení methylenovou modří dobře koreluje s výsledky získanými průtokovou cytometrií, naopak u kultivačního stanovení docházelo k výraznému podhodnocení způsobenému nejspíše přítomností vícebuněčných struktur. Factors influencing the use of flow citometry determination of the viability in Pichia pastoris populations The aim of this work was to analyse factors influencing staining of cells with fluorescent dyes employing flow cytometry detection. The attention was paid mainly to assessment of cell viability and particular parameters of the physiological state of the yeast Pichia pastoris. To this purpose cultivation in shaking flasks were proceeded and samples for comparison were taken from continuous cultivations. Two recombinant P. pastoris Mut+strains (for extracellular trypsinogen production and strain for intracellular production of β-galactosidase) and one wild strain were used in cultivations. Changes of the number of stained cells in Pichia pastoris population were measured in dependence on various procedures of labeling by fluorescent dyes (propidium iodide, ethidium bromide, sytox green, fluorescein diacetate, carboxyfluorescein diacetate, dihydroethidium, dichlordihydrofluorescein diacetate, 3,3´-diethyloxacarbocyanine iodide, Rhodamin 123, bis-oxonol) and operations with cells. Influence of reaction conditions, namely the buffers (phosphate buffer, HBS buffer, water and BMGY medium), various temperature incubation profiles (for 10 min at 0°C, for 10 min at 25°C, for 10 min at 0°C followed by 10 min at 25 °C , for 10 min at 25 °C followed by 10 min at 0°C, for 10 min at 5

40°C) and additions of depolarizing (CCCP, podium azide) and permeabilizing (triton, ethanol) reagens were tested. In conclusion, the effect of reaction conditions for labeling was shown to be inconsiderable. Various temperature incubations profiles displayed the biggest fluorescence intensity shift at 40°C and the effect of various reagents additions was different for different dyes. Finally, suitable methods were chosen and used for the determination of physiological changes of three P. pastoris strains grown in shaking flasks or in the bioreactor in a chemostat culture on various substrates. The supposed negative effect of methanol as a source of carbon and energy on intracellular ROS accumulation was not confirmed, but it was found out that the acumulation of residual concentration of methanol in medium had a negative effect on a physiological state of the yeast. The classical methods for assessment of cell viability as methylene blue labeling and platecount method were used as reference tests to assessment of viability by flow cytometry. It was found out that methylene blue labeling well correlated with data obtained using flow cytometry. On the contrary, strongly underestimated results were observed by using platecount method, this was probably caused by cluster formation. Pavel Novák: Kontinuální kvašení nealkoholického piva (doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) V současné době se pro výrobu nealkoholického piva využívají dva odlišné postupy. První je založen na šetrném odstranění alkoholu z hotového piva a druhý na omezené tvorbě ethanolu úpravou technologického postupu. Tato diplomová práce se zabývá alternativním způsobem výroby nealkoholického piva v kontinuálně pracujícím, průtočném reaktoru. K experimentu byl použit gas-lift reaktor s vnitřní cirkulací o pracovním objemu 2,9 litrů a imobilizovaným biofilmem kvasinek na upraveném mlátě. Teplota fermentace byla 8 °C a zřeďovací rychlost okolo 0,28 h-1. Cílem práce bylo sledování obsahu senzoricky aktivních látek nealkoholického piva v závislosti na intenzitě aerace a následná senzorická analýza těchto piv. Hodnoty průtoku vzduchu byly zvoleny 0 a 200 ml.min-1. Před vlastním experimentem bylo nutné určit jednu z provozních charakteristik daného reaktoru a to množství těkavých látek vystripovaných do pracovního plynu. Za pracovních podmínek nebyl úbytek u většiny sledovaných těkavých látek procesem stripování vyšší než 20 % původní koncentrace. Vliv aerace na rychlost odbourávání aldehydů nebyl prokázán. Nezávisle na aeraci poklesl jejich obsah kvašením na přibližně 10 % z původní koncentrace. Tvorba vyšších alkoholů také nezávisela na intenzitě aerace a jejich obsah v obou vzorcích byl srovnatelný s komerčně vyráběnými nealkoholickými pivy. U esterů byl potvrzen trend jejich klesající tvorby s vyšším přísunem kyslíku. V pivu připraveném při nulové aerací se obsah esterů blížil hodnotám obsahů v komerčně vyráběných nealkoholických pivech, což mělo také pozitivní vliv na poměr A/E. Senzorická analýza nízkoalkoholických piv z kontinuálního systému nepotvrdila výsledky instrumentální analýzy. Nízkoalkoholické pivo vyrobené v aerovaném systému předčilo jedno z komerčně vyráběných nealkoholických piv. Bohužel pivo připravené v neaerovaném kontinuálním systému propadlo a umístilo se na posledním (pátém) místě. Lze se domnívat, že příčina byla v nekvalitní vstupní surovině (práškový mladinový koncentrát). Continuous fermentation of alcohol-free beer

6

Nowadays, two different strategies of alcohol-free beer production are used. The first is based on the alcohol removal from beer of conventional strenght, while the second method is based on restricted ethanol formation achievable by modified technology. This diploma thesis deals with the continous fermentation of alcohol-free beer with immobilized yeast. An internal loop gas-lift reactor with working volume of 2,9 l was used throughout the experiments together with a biocatalyst consisting of yeast biofilm on pre-treated spent grains. The continous fermentation was carried out at 8 °C and at a dilution rate around 0,28 h-1. The purpose of this diploma thesis was to study the formation and conversion of the most improtant flavour compounds depending on the aeration intensity. The applied flow rates of air were 0 and 200 ml.min-1. Prior to fermentation experiment it was necessary to deremine one of the operating characteristics of the continuous reactor namely the stripping of beer volatile compounds by driving gas. Under operating conditions, the losses of selected volatile compounds by stripping were maximum 20 % of their original concentration. The influence of oxygen on the wort aldehyde reduction was not confirmed. Independently on aeration, the total aldehyde content decreased to 10 % of its initial content. The production of higher alcohols was also independent on aeration and their concentration in continuously produced alcohol-free beer was comparable with commercial samples. Concernig esters, the inhibition of their production by oxygen has been confirmed as expected. The total volume of esters in continuously fermented alcohol-free beer (no aeration) was fully comparable with conventionally fermented alcohol-free beers. The ester content also positively influenced the higher alcohols to esters ratio (A/E). The sensorial analysis of contiuous low-alcohol beers did not confirm the results from instrumental analysis. The continuously fermented low-alcohol beer (aeration 200 ml.min-1) was evaluated better than one of the conventionally fermented non-alcoholic beer. On the other hand, continuously fermented low-alcohol beer (no aeration) was the worst of all samples. The surprising result can be most probably ascribed to the inferior quality of the raw material (dried wort). Zdeněk Prokop: Sledování a charakterizace fyziologických změn v pivovarských kvasinkách (Ing. Jaromír Fiala, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Cílem této diplomové práce bylo studium změn obsahu intracelulárních látek a vlastností buněčné stěny během propagace a obsahu intracelulárních látek, vlastností buněčné stěny a obsahově významných látek v mladině v průběhu hlavního kvašení. Zkoumány byly tři provozní kmeny spodních pivovarských kvasinek, které prošly dvěma odlišnými způsoby uchovávání. První populace kvasinek byly uchovávány klasickým způsobem na sladinovém agaru v lednici při teplotě 4 °C po dobu jednoho roku s pravidelným přeočkováváním každé tři měsíce a druhé populace byly uchovávány s přídavkem ochranné látky v elektrickém mrazícím zařízení při teplotě -70 °C po dobu jednoho roku. Ve stejný moment byla zahájena propagace i hlavní kvašení u všech sledovaných populací a byly pozorovány odlišnosti v parametrech – nárůst biomasy, hydrofobita, sedimentační schopnosti, rH, úbytek extraktu, využití sacharidů a aminokyselin, tvorba vicinálních diketonů, relativní velikost a granularita buněk a obsah intracelulárních látek v buňkách kvasinek. Získané výsledky ukázaly, že kvasinky uchovávané způsobem klasickým i novějším za použití teploty -70 °C se od sebe významněji neliší a zachovávají si vitalitu a viabilitu na velmi podobné úrovni.

7

Monitoring of brewing trast physiological changes The aim of this diploma thesis was to study of changes of content of intracellular components and characterization of cell wall during propagation and to study of content of intracellular components, characterization of cell wall and significant substances content during main fermentation. The main purpose of investigation was held on three strains of bottom brewing yeast, which underwent two different techniques of storage. First populations of yeast were preserved by classical way on a slope with malt extract agar in a refrigerator at 4 °C for 1 year with regular moving to fresh slope every 3 month and second population were cryopreserved at -70 °C for 1 year. At the same time the propagation and also main fermentation was started with all monitored population and it was observed diversity parameters like – biomass, hydrophobity, sedimentation abilities, rH, decrease of extract, utilization of sugars and amino acids, production of vicinal diketones, relative size and granularity distribution and content of intracellular components in yeast cells. Obtained results have showed, that yeast stored by classical method and cryopreserved yeast have not differed significantly and they have remained its own vitality and viability at the similar level. Michal Rouč: Optimalizace ATP bioluminiscenčních metod v provozních podmínkách (Ing. Jaromír Fiala, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Pro vysokou kvalitu vyráběného piva je nezbytná účinná mikrobiologická kontrola v pivovarech. Kromě tradičních, většinou pracných a časově náročných metod, se v poslední době prosazují nové, moderní metody, které poskytují okamžité informace o znečištění. Jednou z nich je metoda ATP bioluminiscence, která nachází stále více využití v českých pivovarech. Tato diplomová práce je zaměřena na možnosti využití ATP bioluminiscence ke kontrole mikrobiologické čistoty a její optimalizaci v pivovarské praxi. Byly testovány možnosti využití této metody ke kontrole povrchů, kontrole mikrobiologické čistoty hotového piva, kontrole oplachových vod a možnosti využití v kvasničném hospodářství. Nejvíce se ATP bioluminiscence osvědčila při kontrole povrchů a hotového piva. Vzhledem k velkému počtu rozdílných luminometrů komerčně dostupných na trhu, je tato práce zaměřena pouze na bioluminometr SystemSURE II od společnosti Hygiena. Optimalization of ATP bioluminescence methods under industrial conditions For high quality of produced beer an effective microbiological inspection in breweries is necessary. Besides of traditional methods which take a lot of time, effort and diligence, new modern methods providing immediate information about pollution have progressed at present. One of them is the Method of ATP bioluminescence which has been used in Czech breweries more and more. This thesis has been intended for ATP bioluminescence using to inspect the microbiological cleanness and its optimization in brewer general practice. There were tested possibilities of using of these methods to inspect surfaces, microbiological cleanness of beer and its using in yeast production. The Method of ATP bioluminescence has reached the best results in inspection of surfaces and pasteurized beer.

8

Because of great number of different luminemeters commercially accessible on market, is this thesis aimed on luminemeter SystemSURE II by Hygiena company. Alena Rýparová: Tvorba degradačních produktů iso-α-hořkých kyselin (Ing. Marcel Karabín, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Cílem předložené diplomové práce na téma „Tvorba degradačních produktů iso-α-hořkých kyselin“ bylo zjistit vliv reakčních podmínek na rozklad standardu iso-α-hořkých kyselin za vzniku jejich degradačních produktů a dále sledovat vliv podmínek skladování na obsah isoα-hořkých kyselin, na celkové množství oxidu siřičitého v pivu a na změny antioxidačního potenciálu piva. Byly analyzovány dicyklohexylaminové standardy iso-α-hořkých kyselin, jejichž rozklad byl sledován při pokojové teplotě na světle a bez přístupu světla, při teplotě 35°C bez přístupu světla bez přídavku a s přídavkem antioxidantu. Dále byly testovány vzorky hotového piva z jedné šarže, které byly skladovány při pokojové teplotě na světle a ve tmě a při teplotě 30°C ve tmě po dobu pěti měsíců. Nejvýznamnější vliv na rozklad standardu iso-α-hořkých kyselin má zvýšená teplota. Přídavkem antioxidantu se rozklad iso-α-hořkých kyselin zpomalí. Rozkladem standardu isoα-hořkých kyselin vznikají jejich degradační produkty, jejichž možné struktury byly navrženy pomocí metody HPLC-NMR. Závislost mezi rozkladem iso-α-hořkých kyselin a mezi vznikem jejich degradačních produktů je lineární. Naměřené výsledky potvrdily, že při nevhodném skladování hotového piva zvláště při zvýšené teplotě, dochází k úbytku obsahu iso-α-hořkých kyselin. V hotovém pivu byl zjištěn výraznější pokles obsahu trans- isomerů iso-α-hořkých kyselin než jejich cis- isomerů. Během skladování piva dochází také k výrazným ztrátám oxidu siřičitého a antioxidačního potenciálu piva. Změny sledovaných analytických veličin byly nejvýraznější u vzorků uložených při 30°C. Nebyl zaznamenán rozdíl v rychlosti úbytku sledovaných analytických veličin během skladování piva při pokojové teplotě na světle a při pokojové teplotě bez přístupu světla. Formation of degradation products of iso-α-bitter acids The goal of this diploma work on the topic „Formation of degradation products of iso-α-bitter acids“ was finding the influence of reactive conditions on the degradation of iso-α-bitter acids standard and on the formation of their degradation products. The influence of storage conditions on the content of iso-α-bitter acids and on the content of total sulphure dioxide and on the changes of antioxidative potential in beer was the second target of this work. Dicyclohexylamine standards of iso-α-bitter acids were analyzed, their degradation was observed at room temperature in the light and in the dark, and at temperature 35°C in the dark condition without and with addition of an antioxidant. Further samples of beer from one batch, which were stored at room temperature in the light and in the dark and at 30°C in the dark, were tested during five months period. The most significant influence on the degradation of the standard of iso-α-bitter acids has high temperature. The degradation of iso-α-bitter acids is slower when an antioxidant is added. New degradation products are formed by the degradation of iso-α-bitter acids. Their structure was predicted by a methode HPLC-NMR. Relationship between degradation of iso-α-bitter acids and between formation of their degradation products is linear.

9

The measured results proved that during improper storage of beer especially at higher temperatutures, the content of iso-α-bitter acids decreases. The degradation of trans- isomers of iso-α-bitter acids was more significant than degradation of their cis- isomers. Principal losses of sulphure dioxide and antioxidative potential were observed during storage of beer, as well. The changes of monitoring analytical values were the most significant for the samples stored at 30°C. There wasn´t detected a difference in analytical values between the samples stored at room temperature in the light and between the samples stored at room temperature in the dark. Eliška Václavíková: Enzymové biosenzory pro fermentační procesy (doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Cílem této diplomové práce bylo zvýšit stabilitu alkoholoxidasy (AOX) imobilizací na tyto nosiče: sepabeads EC-EP403 s epoxidovými skupinami, sepabeads EC-HA403 s hemamethylenaminovými skupinami, nanočástice SSG-59 obsahující epoxydové skupiny a nanočástice o průměru 35nm a 68,5nm, které obsahovaly pouze –OH skupiny. Povrch těchto nanočástic byl modifikován pomocí dvou činidel 3-aminopropyltrimethoxysilanu (APTS) a 3-(2-aminoethylamino)propyltrimethoxysilanu (AEAPS). K imobilizaci enzymu byly využívány dva postupy dle Matea a dle Lopez-Gallegy. Rozdíl v jednotlivých postupech je v množství použitého enzymu, inkubačních časech, v množství použitého glycinu a v postupu dle Lopez-Gallegy se na promytí částic využívá 0,025M fosfátový pufr místo destilované vody. U všech částic s imobilizovaným enzymem byla proměřena tepelná stabilita při zahřívání na 40°C. V další části experimentální práce byly z částic, které vykazovaly aktivitu po 24 hodinách zahřívání připravené čočky s citlivými vrstvami a byla proměřena jejich odezva na přídavky ethanolu pomocí senzoru MATIONES, který monitoruje intenzitu fluorescence rutheniového komplexu v ORMOCER®u s imobilizovaným enzymem. Intensita fluorescence komplexu je zhášena kyslíkem, který využívá enzym pro oxidaci detekované látky. Na závěr mé práce byla připravena čočka s citlivou vrstvou ze sepabeads s imobilizovanou glukosaoxidasou (GOX) a byl proměřen vliv teploty na odezvu signálu po přídavku glukosy. Enzymatic biosensors for fermentation processes The aim of my Diploma Thesis was to increase stability of alcoholoxidase (AOX) via immobilization. Five different supports were examined: sepabeads EC-EP403 with epoxy groups, sepabeads EC-HA403 with hehamethylenamin groups, nanoparticles SSG-59 containing epoxy groups and silica nanoparticles 35nm and 68,5nm diameter with –OH groups. The surface of silica nanoparticles was modified with 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTS) and 3-(2-aminoethylamino)trimethoxysilane (AEAPS). The experimental work started with immobilization AOX by adsorption and chemical bonding to the supports. Two procedures of immobilization were applied; the first developed by Mateo and the second is according to Lopez-Gallego. They differ in amount of enzyme, incubation times, the amount of glycine and washing with phosphate buffer or with distilled water. The thermal stability at 40°C of the supports with immobilized enzyme was measured. The supports with enzyme AOX were used in the preparation of sensitive layers on lenses and their responses to ethanol using MATIONES optical biosensor were determined. The principle of the MATIONES biosensor is based on monitoring the fluorescence intensity of 10

the ruthenium complex co-immobilized with the enzyme AOX in the ORMOCER® matrix. The fluorescence intensity of the ruthenium complex is quenched by oxygen, which is competitively consumed by the enzyme during the oxidation of the measured compound. At the end of experimental work sensitive layers with enzyme glucosaoxidase (GOX) in sepabeads were prepared and the influences of temperature on lifetime responses to addition of glucose were measured. Josef Zvoník: Stanovení polyfenolů v pivu a pivovarských surovinách (doc. Ing. Pavel Dostálek, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Tato práce se zabývala vývojem obsahu fenolových látek, zejména flavan-3-olů v průběhu sladování a výroby piva. Pro kvantifikaci těchto látek byla použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie s detekcí diodovým polem i s detekcí hmotnostní. V průběhu sladování byl potvrzen spíše pokles všech flavan-3-olů s výjimkou katechinglukosidu. Tato látka v průběhu sladování vzniká a to zřejmě během namáčení a klíčení. Obsah fenolových kyselin zůstává na stejné úrovni nebo se zvyšuje, jelikož se uvolňují ze svých vázaných forem. Bilance látek v průběhu výroby piva je velmi obtížná. U velmi různorodých várek byl však zjištěn pokles obsahu flavan-3-olů, zejména polymerovaných. Obsah fenolových kyselin zůstává na stejné úrovni nebo mírně klesá. Výsledky práce naznačují, že stabilizační prostředek na bázi polyamidu dokáže stabilizovat s větší účinností, než stabilizátor s polyvinylpolypyrrolidonem i přesto, že odstraňuje menší množství polyfenolů. Antioxidační kapacita je nejvyšší u mladiny, kde se k fenolovým sloučeninám sladu přidají vysoce antioxidačně účinné látky z chmele. V průběhu další výroby piva antioxidační kapacita spíše klesá. Extrakční postup použitý na vzorky v této práci výrazněji neovlivňuje antioxidační vlastnosti a tedy zřejmě ani profil fenolových látek. Determination of polyphenols in beer and brewing raw materiále This work studied changes of the content of polyphenols especially flavan-3-ols during malting and brewing technology. High performance liquid chromatography with diode array detector and MS detector were used for quantification of polyphenols. During malting process was confirmed decrease of all flavan-3-ols content with the exception of catechin-glucoside. This substance is created during malting process probably during steeping or sprouting. The content of fenolic acids remains on the same level or increases, due to their changes from bounded to available form. It is very hard to prepare the balance-sheet of phenolics during the brewing technology. There was found decrease of flavan-3-ols content, especially polymerized ones. Content of phenolic acids is almost on the same level during brewing process. The results of this work indicate that polyamid stabilizing agent can stabilize beer with a higher effectivity than PVPP stabilizing agent although it remove a lower amount of polyphenols. An anioxidant capability is the highest for wort, because highly antioxidant effective substances from hop are added to wort during wort boiling. An antioxidant capability rather decreases during next brewing operations. The method of extraction used in this work has no important influence on antioxidant properities and on a profile of polyphenols between an original sample of intermediate products of beer production and their extracts.

11

Zaměření Kvasná chemie a technologie: Václav Černý: Aerobní termofilní stabilizace odpadních kalů z čistírny průmyslových a zemědělských odpadů (prof. Ing. Mojmír Rychtera, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Tato diplomová práce se zabývá použitím aerobních termofilních mikroorganismů v čistírenské praxi. Tato technologie ve srovnání s konvenčně používaným procesem anaerobní digesce přináší některé výhody, které se v ekonomice procesu projevují nižšími investičními náklady, ale také nevýhody promítnutými do nákladů provozních. Průběh kultivací byl hodnocen z analýz CHSK-media, CHSK-supernatantu, sušiny odvodněného kalu, celkového dusíku v supernatantu a vybraných chemických individuí na kapalinovém chromatografu. Vlastní experimenty byly zaměřeny na degradaci kukuřičných lihovarských výpalků bez pevné fáze a s pevnou fází, jako modelového media vznikajícího průmyslovým zpracováním zemědělských komodit. Výsledkem je rychlost degradace, která je závislá na velikosti vneseného znečištění. Čištění probíhalo do hodnoty CHSK cca 10 kgO2 . m-3. V další části této práce bylo prováděno přítokování odpadního kalu získaného z komunální čistírny odpadních vod. Výsledek však nedokázal, ale ani nevyvrátil argumenty uváděné v literatuře vyzdvihující výhody aerobní termofilní stabilizace. Aerobic thermophilic stabilization of waste sludges from waste water treatment plants, industrial and agricultural wastes This diploma work is engaged in application of aerobic thermophilic microorganisms in waste water treatment. This technology brings certain advantages in comparison with conventionally used process of anaerobic digestion, especially of lower investment costs. On the other hand, operating costs are higher. The course of cultivations was evaluated by analyses of COD in media and supernatant, dry substance of dewatered sludge, nitrogen content in supernatant and analyses of selected chemical substances by HPLC. The experiments as such were focused in degradation of corn distillery stillage without and with solid phase, as exemplary media coming from an industrial treatment of agriculture commodities. The result is rate of degradation which depends on initial concentration of pollution. Usual final value of COD was 10 kgO2 . m-3 approx. Next part of this thesis describes treatment of waste sludge from municipal waste water treatment plant. However, the results neither proved nor disproved arguments featured in literature, underlining benefits of aerobic thermophilic stabilization of waste water treatment sludge. Petr Fribert: Využití bakterií Zymomonas mobilis pro produkci ethanolu z obilných zápar (prof. Ing. Karel Melzoch, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Zymomonas mobilis je gramnegativní bakterie, která se vyznačuje vysokým teoretickým výtěžkem etanolu během fermentace a toleruje koncentraci ethanolu v médiu až 160 g/l. Vysoká výtěžnost a produktivita ethanolu pozorovaná u Zymomonas mobilis jsou důsledkem její unikátní fyziologie. Zymomonas mobilis k produkci ethanolu nepoužívá enzymy glykolýzy, ale Entner-Doudoroffovy dráhy.

12

Ačkoli je Zymomonas mobilis výborným producentem ethanolu, není vhodná pro konverzi biomasy, protože zkvašuje pouze glukosu, fruktosu a sacharosu. Tyto překážky mohou být vyřešeny genetickými modifikacemi vedoucími k rozšíření spektra substrátů, které je Zymomonas mobilis schopna fermentovat. Tato práce se zabývá fermentačními testy sbírkových kmenů Zymomonas mobilis na širokém spektru substrátů za rozdílných podmínek. Obilné zápary byly připraveny enzymovou hydrolýzou pšeničného šrotu. Nejlepších výsledků bylo dosaženo při použití metody zcukření využívající enzymové preparáty SPEZYME XTRA, DISTILLASE L-400 a OPTIMASH BG. Při kultivaci Zymomonas mobilis na obilné zápaře za anaerobních podmínek bylo dosaženo výtěžku ethanolu 0,39 g/g sušiny obilí. Konečná koncentrace ethanolu po anaerobní fermentaci v bioreaktoru Biostat B činila 56,7 g/l, což odpovídalo 96 % teoretické výtěžnosti ethanolu. Use of Bakteria Zymomanas mobilis for ethanol production from grain mashes Zymomonas mobilis is a gram-negative bacterium which has a high theoretical yield of ethanol during fermentation and which can tolerate ethanol concentration up to 160 g/l. The high yields and the high productivity of ethanol is a consequence of unique physiology of Zymomonas mobilis. For the production of ethanol it uses enzymes of Entner-Doudoroff pathway instead of enzymes of glycolysis. Although Zymomonas mobilis is a great producer of ethanol it is not suitable for conversion of biomass, because it ferments only glucose, fructose, and sucrose. These problems can be solved by genetic modifications leading to extension of the spectrum of substrates which can be fermented. This work is focused on fermentation tests of various strains of Zymomonas mobilis on a wide spectrum of substrates under different conditions. Wheat mash was prepared by enzyme hydrolysis of weatflour. The best results were obtained using saccharification method using enzyme preparations SPEZYME XTRA, DISTILLASE L-400 a OPTIMASH BG. During the cultivation on wheat mash the ethanol yield 0,39 g/g dry matter of grain was achieved. The final concentration of ethanol after anaerobic fermentation in bioreactor Biostat B was 56,7 g/l which is 96 % of theoretical ethanol yield. Josef Havránek: Modelling of Microbial Degradation Processes (prof. Ing. Jan Páca, DrSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Biotrickling filtration is a new, alternative way of treating the air polluted with volatile organic compounds (VOCs). The biotrickling filter consists of a porous packing material on which the microrganisms grow. The polluted gas passes through the carrier material countercurrently to the mobile liquid phase, which ensures a good nutrient supply to the micro organisms. Finally, the pollutant is transferred to cells where the biodegradation takes place. The microorganisms break down the pollutant into harmless products. The aim of this research project was to create both steady and unsteady state mathematical models for the data obtained in a biotrickling filter treating styrene and acetone. Ottengraf´s model was used to describe steady state data. This model presumes that kinetics can be first-order, zero-order with reaction rate limitation, and zero-order with diffusion rate limitation. This model is relatively simple and gives a good prediction of steady state. Several approaches were used to determine the model fitting. Most suitable model was chosen on the basis of comparing R2 (coefficient of determination) values of trend lines and also comparing the consistency of kinetic parameter values (K0, K0´, K1´) measured by the coefficients of variation. 13

An empirical first order plus dead-time model was used together with a more fundamental approach to describe the unsteady state. Secondly, an absorption model was created. Following model assumes that the process in the biotrickling filter is influenced by the degree of mixing in the bottom part of the column. Both plug flow and model of well mixed vessel were assumed in the reservoir for the circulation liquid. Modelování mikrobních degradačních procesů Filtrace pomocí biotrickling filtrů je poměrně novou, alternativní metodou čištění odpadních plynů znečištěných zejména těkavými organickými látkami (volatile organic compounds – VOCs). Biotrickling filtr se skládá z náplně, na které roste buněčná populace. Znečištěný vzduch prochází skrz biotrickling filtr souproudně nebo protiproudně vzhledem k toku kapalné fáze, která zajišťuje přísun nutrietů buněčné populaci v biotrickling filtru. Polutant je nejdříve absorbován v kapalné fázi a posléze transportován do buněk, kde dochází k jeho konečné přeměně na méně škodlivé produkty, většinou oxid uhličitý a vodu. Cílem této diplomové práce bylo vyvinout matematický model popisující chovaní biotrickling filtru v ustáleném a neustáleném stavu na základě dat naměřených při současném odstraňovaní styrenu a acetonu. K popisu ustáleného stavu byl využit model navržený Ottengrafem. Tento model předpokládá, že kinetika může být nultého řádu s difúzní limitaci, nultého řádu s reakční limitací nebo prvního řádu. Bylo voleno několik postupů, jak ověřit vhodnost tohoto modelu. Nejvhodnější model byl zvolen na základě porovnání hodnot R2 spojnicí trendu a na základě porovnání konsistence kinetických parametrů (K0, K0´, K1´) stanovované na základě směrodatné odchylky. K popisu neustáleného stavu bylo vyvinuto hned několik modelů. Nejdříve byl použit empirický model prvního řádu, následovaný absorpčním modelem. Dále byl vyvinut model předpokládající separátní řešení pro část kolony, která slouží jako rezervoár pro cirkulační kapalinu. V nádobě pro cirkulační kapalinu byl nejdříve předpokládán pístový tok, později se přešlo k modelu ideálně míchané nádoby. Jan Marek: Využití různých substrátů při expresi proteinů kvasinkou Pichia pastoris (Dr. Ing. Leona Paulová, ÚKCHB VŠCHT Praha) Cílem této práce bylo zmapovat růst geneticky modifikovaného kmene kvasinky Pichia pastoris Mut+ a kinetiku tvorby produktu, kterým je vepřový trypsinogen na různých substrátech. Exprese heterologního genu je vložena pod kontrolu AOX promotoru a indukována v přítomnosti methanolu. Při kontinuálních kultivacích v uspořádání chemostatu byly proměřovány ustálené stavy a tranzientní stavy na různých jednoduchých a směsných substrátech. Růstové charakteristiky byly zjišťovány na substrátech, které obsahovaly jako zdroj uhlíku a energie methanol, glycerol, glukosu, sorbitol a nebo jejich směs s methanolem v poměru obsahu uhlíku ve směsi 1:1. Byly určeny maximální růstové rychlosti produkčního kmene na jednoduchých substrátech, sorbitolu (0,03 h-1), methanolu (0,11 h-1), glukose (0,20 h-1), glycerolu (0,25 h1) a směsných substrátech glycerolu s methanolem (0,20 h-1) a glukosy a methanolu (0,26 h1) pomocí vyplavovacích experimentů. Při růstu kultury na glukosovém či glycerolovém médiu nebyla detekována tvorba produktu, neboť tyto substráty působí represivně na AOX promotor. Naproti tomu při růstu na sorbitolu byla zaznamenána exprese nízké hladiny produktu i bez přítomnosti methanolu. Na směsných substrátech, které obsahovaly glukosu, glycerol nebo sorbitol v kombinaci s methanolem byla 14

v tranzientních stavech po indukci methanolem sledována kinetika tvorby trypsinogenu. Tvorba produktu byla zaznamenána vždy bezprostředně po indukci methanolem, v žádném případě nebyla zaznamenána jakákoli lag fáze v tvorbě produktu. V průběhu kontinuálních kultivací se s výjimkou růstu na směsném substrátu sorbitol/methanol nepodařilo dosáhnout ustáleného stavu vzhledem k tvorbě produktu. Koncentrace produktu dosáhla vždy maximální hodnoty mezi 4. až 8. hodinou od indukce a následně měla klesající trend. Nejlepších výsledků bylo dosaženo na směsném substrátu, kdy zdrojem uhlíku a energie byl sorbitol, společně s methanolem v poměru uhlíků 1:1. Při zřeďovací rychlosti 0,03 h-1 bylo po 7 hodinách od indukce dosaženo maximální koncentrace trypsinogenu 203 mg.l-1. V tomto případě bylo dosaženo ustálení tvorby produktu na průměrné koncentraci 170 mg.l-1. Pichia pastoris – use of different substrates for protein expression The aim of this thesis was to make a screening of growth and production parameters of recombinant yeast Pichia pastoris Mut+ strain grown in continuous chemostat culture on different substrates or their mixtures with methanol. The Pichia pastoris host strain contained the synthetic gene encoding extracellular production of porcine trypsinogen upon induction with methanol The transient and steady states of chemostat cultures of host strain grown on mineral media containing different carbon sources such as methanol, glycerol, glucose, sorbitol or their mixtures with methanol were measured. The following maximum specific growth rates of host strain on different carbon sources were determined in wash-out experiments: 0.03 h-1 for growth on sorbitol, 0.11 h-1 for methanol, 0.20 h-1 for glucose, 0.25 h-1 for glycerol, 0.20 h-1 for mixture of glycerol and methanol (carbon ratio 1:1) and 0.26 h-1 for mixture of glucose and methanol (carbon ratio 1:1). In case of cultivations on the media containing glucose or glycerol as a sole carbon source, the production of trypsinogen was not observed due to repressive effect of those substrates on AOX promotor. On the other hand, low concentration of trypsinogen was identified in case of cultivation on sorbitol as the sole substrate even if methanol was not present in the medium. Kinetics of trypsinogen production upon the methanol induction was also studied. In all cases the zymogen formation was observed immediately after induction. Unfortunatelly, the steady product formation rate was not achieved except the growth on mixed substrate containing sorbitol and methanol. By growth on methanol or its mixtures with glucose or glycerol, the maximum product concentration was achieved between 4-8 hours after the induction, then the production rate declined. The best results were achieved by cultivation of the host stratin on the mixed substrate containing sorbitol and methanol (carbon ratio 1:1) at dilution rate 0.03 h1. Maximum yield 203 mg.l-1 of trypsinogen was achieved seven hours after induction and steady level 170 mg.l-1 of product was then obtained. Zlata Palkovičová: Screening kmenů pro fermentační produkci rozpouštědel (Dr. Ing. Petra Patáková, ÚKCHB VŠCHT Praha) Tato diplomová práce byla zaměřena na screening kultivačních podmínek pro vybrané 4 kmeny klostrídií tvořících rozpouštědla: C. saccharoperbutylacetonicum DSM 14923 (značený jako C3), C. pasteurianum NRRL B-598 (C7), C. beijerinckii NRRL B-466 (C8) a C. beijerinckii NRRL B-592 (C9). Nejprve byla proměřena pro všechny kmeny růstová křivka na TYA médiu, při teplotě 37oC. Poté byly zjišťovány vlivy různých kultivačních podmínek na tvorbu rozpouštědel. Jednalo se o testování vlivu počátečního pH, kultivační teploty, počáteční koncentrace glukosy a 15

přídavku octanu amonného v koncentraci 6 g/l. Vliv počátečního pH ve zkoumaném rozsahu nebyl velký, zato vliv teploty se ukázal jako zásadní. Při zvýšení obsahu glukosy došlo ke zvýšení tvorby rozpouštědel, ale zbytková koncentrace glukosy byla vysoká. I po přídavku octanu amonného došlo k vyšší produkci rozpouštědel, zároveň se však i ve vyšší míře tvořila kyselina máselná. Dále byla provedena kultivace ve dvou stupních, kdy se druhý stupeň zaočkoval kulturou v exponenciální fázi do TYA média s vyšší koncentrací glukosy. Tím se docílily i nejvyšší výsledné koncentrace butanolu. Jako další testované médium bylo zkoušeno GYE médium, a to ve dvou modifikacích. Při kultivaci na GYE médiu s vyšší koncentrací živin se dosáhlo výsledků porovnatelných s úspěšnějšími jednostupňovými kultivacemi. Nakonec byla provedena izolace DNA kmenů C2, C3, C5 a C9 pomocí komerčního kitu UltraClean™ Microbial DNA Isolation Kit. Pro ověření úspěšnosti izolace byla poté provedena vizualizace produktů izolace pomocí elektroforézy. V Mikrobiologickém ústavu AV pak byla provedena typizace těchto čtyř kmenů na základě srovnání částí sekvence DNA, kódující 16S rRNA, s Evropskou databází ribosomální RNA. Screening of clostridial strains for fermentative solvents production This diploma thesis was aimed at screening of cultivation conditions of 4 strains of solvent producing Clostridia: C. saccharoperbutylacetonicum DSM 14923 (C3), C. pasteurianum NRRL B-598 (C7), C. beijerinckii NRRL B-466 (C8) a C. beijerinckii NRRL B-592 (C9). At first, growth curve of all 4 strains cultivated on TYA medium, 37oC, were measured. Then influence of cultivation temperature, value of pH at the beginning of cultivation, the concentration of glucose and addition of ammonium acetate in concentation of 6 g/l were followed. The influence of pH in tested range was not significant, but the influence of temperature was proved to be essential. The higher concentration of glucose improved the production of butanol, but the residual concentration of glucose remained high. Addition of ammonium acetate also improved production of butanol, but also high concentrations of butyric acid were obtained. Furthermore two stage cultivation was tested, when the second stage was inoculated by culture in exponential phase of growth obtained by cultivation in first stage. By this way, higher final concentration of butanol was obtained. Other tested medium was GYE medium in two modifications. When cultivated in the medium with higher glucose concentration, higher final concentrations of butanol, comparable with similar one-stage cultivations in TYA medium, were obtained. Finally, DNAs of strains C2, C3, C5 and C9 were isolated with commercial kit UltraClean™ Microbial DNA Isolation Kit. To prove the isolation had been succesful, DNA was visualized on electrophoresis gel. These 4 strains were typed based on comparison of parts of DNA sequences coding 16S rRNA with European database of ribosomal RNA. This last task was performed in the Institute of Microbiology of Academy of Sciences of the Czech Republic. Jiří Teplý: Využití zemědělských surovin a odpadů pro fermentační produkci rozpouštědel (Dr. Ing. Petra Patáková, ÚKCHB VŠCHT Praha) Tato diplomová práce se zabývá využitím zemědělských surovin a odpadů pro fermentační produkci rozpouštědel. Tvorba těchto rozpouštědel byla sledována u čtyř bakterií z rodu Clostridium, jmenovitě u C. saccharoperbutylacetonicum DSM 14923, C. beijerinckii DSM 6422, C. beijerinckii CCM 6218 a C. beijerinckii NRRL B-466. Kultivace probíhala vsádkově 16

v nemíchaných nádobách, 50 ml Erlenmeyerových baňkách nebo 10 ml skleněných zkumavkách, které byly opatřeny vatovou zátkou. Tyto nádoby byly pak v anaerobní nádobě při 37°C kultivovány v termostatu. Během kultivace bylo vyzkoušeno deset druhů médií, dvě obsahující melasu, dvě média z brambor, jedno z kukuřice, dvě s lihovarskými výpalky a tři s glycerolem. Obsah organických rozpouštědel v médiu – acetonu, etanolu a butanolu, stejně jako obsah organických kyselin – kyseliny octové a máselné – obsah některých zdrojů uhlíku (glukosa a glycerol) byl stanoven pomocí HPLC analýzy. Koncentrace sacharosy u médií, které obsahovaly melasu, byla stanovena metodou podle Schoorla. Obsah škrobu v médiích z brambor a kukuřice byl stanoven pomocí enzymatické sady MEGAZYME AMYLOSE/AMYLOPECTIN. Biomasa získaná po kultivaci byla stanovena vážkově. Médium, které poskytovalo nejvyšší koncentraci butanolu, bylo kukuřičné médium, zaočkované prostřednictvím buněčné bakteriální kultury. Na tomto médiu kmen C. beijerinckii CCM 6218 dosáhl koncentrace 9,44 g.dm-3 butanolu. Nejvyšší podíl butanolu z celkového množství organických rozpouštědel byl dosažen také s použitím kmene C. beijerinckii CCM 6218, který byl kultivován na melasovém médiu typu A ve skleněných zkumavkách. Podíl butanolu činil 75 % všech rozpouštědel. Zmiňovaný kmen C. beijerinckii CCM 6218 rovněž dosahoval nejvyšších koncentrací butanolu u většiny použitých médií. Utilization of agricultural raw materials and wastes for fermentative production of solvents This diploma thesis is dealing with the utilization of agricultural raw materials and wastes for fermentative production of solvents. Production of these solvent has been followed at four bacteria of the genus Clostridium, namely at C. saccharoperbutylacetonicum DSM 14923, C. beijerinckii DSM 6422, C. beijerinckii CCM 6218 and C. beijerinckii NRRL B-466. Batch cultivations have been taken place in nonmixed vessels, 50 mL Erlenmeyer´s flasks or 10 mL glass test tubes, which have been closed by cotton pluggs. These vessels have been cultivated in an anaerobic jar at 37°C in thermostat. During cultivation, ten different media: two containing molasses, two media of potatoes, one of maize, two with distiller´s maize slops and three with glycerol were tested. Contents of organic solvents in medium – acetone, ethyl alcohol and butyl alcohol, as well as contents of organic acids – acetic and butyric acids – contents of some sources of carbon (glucose and glycerol) have been determined by HPLC analyses. Concentrations of saccharose in media, which contained molasses, have been determined by the method according to Schoorl. Contents of starch in media with potatoes and maize have been analyzed by the enzymatic kit MEGAZYME AMYLOSE/AMYLOPECTIN. Biomass gained after cultivation has been determined gravimetricly. Maize medium inoculated by growing bacterial culture has provided the highest concentration of butyl alcohol. The strain C. beijerincki CCM 6218 has attained concentration 9,44 g.dm-3 butyl alcohol on this media. The highest ratio of butyl alcohol from all amount of organic solvents has been achieved also with the strain C. beijerinckii CCM 6218 that has been cultivated in molasses medium of type A in glass test tubes. Portion of butyl alcohol was 75 % of all solvents. The mentioned strain C. beijerinckii CCM 6218 also has reached the highest concentrations of butyl alcohol at most of used media.

17

Martin Valeš: Charakterizace lihovarských výpalků, jejich předúprava a následné biotechnologické zpracování (prof. Ing. Mojmír Rychtera, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Tato diplomová práce se zabývá analýzou lihovarských výpalků, vlivem použitých surovin a technologického postupu přípravy na jejich složení, možnosti předúpravy a následného biotechnologického zpracování upravených i neupravených výpalků pomocí anaerobní digesce. Jako hlavní parametry charakterizace řídkých výpalků byly zvoleny: CHSK, obsah sušiny a popelu, koncentrace minerálních látek a koncentrace glukózy, etanolu, glycerolu, kyseliny mléčné, jantarové a octové. V pevných fázích výpalků byl analyzován obsah sušiny, popelu, bílkovin a celulózy. Analyzované výpalky byly použity jako média pro anaerobní digesci. Bylo provedeno celkem pět experimentů, jedna semikontinuální kultivace, tři „batch“ kultivace a jedna „batch“ kultivace s úpravou pH během procesu. Pro všechny experimenty byla použita směsná termofilní anaerobní bakteriální populace ve formě aktivovaného kalu z termofilní čistírny odpadních vod. Semikontinuální kultivace měla informovat o chování používané mikrobní populace na daném médiu. V „batch“ kultivacích byly jako médium použity upravené i neupravené výpalky. Poslední kultivace s úpravou hodnot pH měla informovat o vlivu hodnot pH na rychlost a celkovou produktivitu procesu. Jako metody předúpravy výpalků byly použity separace a enzymová a kyselá hydrolýza pevných fází výpalků. Nejlepších výsledků na upravených materiálech bylo dosaženo při použití přídavku enzymově upravené pevné fáze k řídkým výpalkům. Největšího snížení organické zátěže výpalků a nejvyšší produkce bioplynu bylo dosaženo při kultivaci s úpravou hodnot pH. Characterization of distillery stillage, its pretreatment and subsequent biotechnological processing This thesis is focused on analysis of distillery stillage, influence of used raw materials and technological process of preparation on its composition, possibility of its pretreatment and subsequental processing of modified and raw stillage using anaerobic digestion. This characteristics of thin stillage were monitored: COD (chemical oxygen demand), solid and ash content, the concentration of minerals and the concentration of glucose, ethanol, glycerol, lactic acid, succinic acid and acetic acid. In solid phasis, there were monitored: the content of solids, ashes, proteins and celulose. Analyzed stillages were used as mediums for anaerobic digestion. We tested this five experiments: one semi-continuos cultivation, three „batch“ cultivations and one „batch“ cultivation with a regulation of pH values. It was used mixed thermofilic anaerobic bacterial population descending from activated sludge from thermofilic waste water treatment plant for all experiments. Semi-continuos cultivation informed us about the behavior of our microbial population on the medium used. There were used not only raw stillage, but also modified stillage as the medium for all „batch“ cultivation. The last cultivation with the regulation of pH values informed us about the influence of pH values on the process rate and overall productivity. There were used separation and enzymatic and acid hydrolysis as the methods of the stillage pretreatment. The best results were achieved by using an addition of enzymatic hydrolyzed solid phase into the thin stillage. Best values of organic load reduction and producted biogas were achived in the cultivation with a regulation of pH values.

18

Zaměření Aplikovaná biologie a bioinženýrství: Jana Látalová: Celulolytické mikroorganismy: komparativní studie individuálních taxonů (prof. RNDr. Vladimír Jirků, DrSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Celulosu lze posuzovat jako netoxický, ale i těžko odstranitelný polutant. Mikrobní degradace celulosy je často diskutována, ale vždy konfrontována s úspěšnou přirozenou biodegradací přírodní biomasy a neúspěchy ve zvládání biologické likvidace celulosových odpadů produkovaných člověkem. Výzkum minulých deseti let prokázal, že vhodné celulolytické mikroorganismy jsou povrchově vybaveny strukturami, které soustřeďují vazné i katalytické komponenty a slouží jako nosič celulolytické aktivity, vhodně kontaktující celulosový substrát, jestliže je tento kontaktován buněčným povrchem. Proto by vývoj v zavedení účinnější biologické solubilizace odpadní pevné celulosy mohl být spojen s přímou kolonizací povrchu těchto materiálů populací celulolytického mikroorganismu vhodných vlastností, tedy s vývojem celulolytického biofilmu. V tomto kontextu je cílem předložené experimentální práce charakterizovat 4 taxonomicky vzdálené kmeny se záměrem předběžného výběru taxonu, který by mohl být použit ve vývoji výše zmíněné technologie. Jednotlivé kmeny byly popsány z hlediska schopnosti utilizovat různé typy celulosy jako jediný zdroj C, schopnosti mimobuněčného uvolňování celulolytických enzymů, a to pod vlivem změn kultivační teploty, pH prostředí a nutričního profilu. Kromě uvedeného vznikla a byla ověřena metoda monitorování kolonizace pevné celulosy. Cellulolytic microorganisms: comparative study of individual taxons Celulose as a solid pollutant is considered in view of its lack of toxicity on the one hand and its recalcitrant nature on the other. The microbial degradation of cellulosics is frequently discussed, and the contrast between its success in handling natural cellulosic wastes versus its failure to cope with man – made refuse is described. The research carried out in the past decade has demonstrated that cellulolytic organisms are mostly provided with cell surface multienzyme conglomerates, which are capable of solubilizing solid cellulosic substrates. These complexes include cellulose binding and enzymatic components and serve as a substrate-targeting carrier, efficiently delivering hydrolytic component to the cellulose, if this solid substrate is physically contacted by cell surface. Therefore, a progress in establishing more efficient arrangement for technological solubilization of solid cellulosic wastes could be achieved using cellulolytic biofilms, formed by direct colonization of these wastes by cell populations of cellulolytic strains of adequate properties. In this context, the aim of presented experimental work was to characterize four taxonomically not related strains to select these ones that could be engaged in above biofilmbased technology development. The capacity of respective strains to utilize different cellulosic substrates as well as to manifest cellulolytic activity, under the effect of changes in temperature, pH and nutrition profile, is described. Moreover, a method enabling to monitor solid cellulose colonization was developed and preliminary verified. Hana Pavlíčková: Biodegradace fenolových sloučenin v biofirmu erythropolis (prof. Ing. Alena Čejková, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)

19

Rhodococcus

V této diplomové práci byla sledována degradace fenolu (katecholu) jako zástupce polutantů aromatického charakteru pomocí dvou kmenů bakterie Rhodococcus: adaptovaný Rhodococcus erythropolis CCM 2595ad a modifikovaný kmen Rhodococcus erythropolis CCM 2595 pSRK 21phe, s posílenou aktivitou enzymů metabolické dráhy utilizující fenol. Degradace fenolu probíhala v biofilmových reaktorech a pro srovnání také suspenzní populací v reaktoru a třepaných baňkách. Lepší schopnosti degradace jednoznačně vykazuje biofilm, který degraduje fenol o použité počáteční koncentraci 0,7 g/l o řád rychleji než suspenzní buňky, čímž se výrazně krátí čas potřebný k jeho úplné degradaci. Jelikož hydrofobita buněčného povrchu ovlivňuje adhezivní vlastnosti buněk k nosiči, byla dalším sledovaným parametrem hydrofobita buněčných obalů a její změny v průběhu kultivačního procesu. Z důvodu, že je tato povrchová vlastnost určena složením buněčných obalů, byla také hledána souvislost mezi změnou použitého substrátu, jeho koncentrace, a variabilitou složení hlavních komponent buněčných obalů (mastných kyselin a polysacharidů). Biodegradation of phenolic compounds in Rhodococcus erythropolis biofilm In this diploma thesis a degradation of phenol (catechol) by two different strains of Rhodococcus (by an adapted strain Rhodococcus erythropolis CCM 259ad and by a modified strain Rhodococcus erythropolis CCM 2595 pSRK 21 phe with higher enzyme activity of the metabolic pathway for utilization of phenol) was studied. The degradation took place in biofilm reactors. For comparison, degradation by planktonic population in a reactor and shaken flasks was investigated, too. Better degradation abilities unequivocally has the biofilm, which degraded phenol (initial concentration 0,7 g/l) with a one order higher degradation rate. This significantly reduced time which was necessary for the complete degradation of phenol. Because the hydrophobicity of cell surface has an influence on adhesive properties of cells, the second studied parameter was the hydrophobicity of cell surface and changes of the hydrophobicity during the cultivation. The hydrophobicity is determined by composition of cell surface, that is why a connection of a change of used substrate and its concentration to a variability of composition of main components of cell surface (fatty acids and polysaccharides) was studied. Martina Rejlová: Ovlivnění fyziologického stavu Saccharomyces cerevisiae modifikací obalových vrstev buňky (doc. Ing. Jan Masák, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) V souvislosti s genetickou modifikací obalových vrstev buňky dochází v určité míře k ovlivnění fyziologického stavu daného mikroorganismu. Cílem předkládané diplomové práce bylo popsat a zhodnotit vliv povrchové expozice vazebných domén pro těžké kovy na schopnost růstu a charakter obalových vrstev kvasinky Saccharomyces cerevisiae W303. Byly studovány tři geneticky modifikované kmeny Saccharomyces cerevisiae W303. Cestou genových manipulací byl u dvou kmenů modifikován buněčný povrch s cílem zvýšit schopnost sorpce těžkých kovů. Modifikace u kmenu nesoucího plazmid s označením p416-αS spočívala v povrchové expozici glykoproteinu α-aglutininu, zatímco kmen nesoucí plazmid s označením p1αS-PC2 nesl na svém povrchu α-aglutinin se zakotveným oligopeptidem. Třetí kmen byl použit jako kontrolní. Růst rekombinantních kmenů se téměř nelišil. Z hlediska utilizovaného C-zdroje bylo na mannose dosaženo vyššího výtěžnostního koeficientu v porovnání s glukosou a fruktosou. U všech kmenů byl pozorován rozdíl v hydrofobitě buněčného povrchu v závislosti na růstové fázi. V rané stacionární fázi růstu byla zaznamenána vyšší hydrofobita obalových struktur než 20

v exponenciální fázi růstu. Při porovnání s mateřským kmenem vedla povrchová expozice glykoproteinu α-aglutininu k vzrůstu hydrofobity obalových vrstev buňky. Za přítomnosti oligopeptidu navázaného na α-aglutininu nebyl zjištěn významný rozdíl v hydrofobitě buněk oproti kmenu kontrolnímu. Nižší koncentrace dusíku v médiu se neprojevila změnou hydrofobity povrchu buněk jednotlivých kmenů. Stanovení podílu mannosy v buněčných stěnách neprokázalo významný rozdíl mezi rekombinantními kmeny. Influence of modification of cell surface layers on physiological state of Saccharomyces cerevisiae In connection with genetic modification of cell envelope layers the physiological state of the microorganism is affected to a certain extent. The aim of this master thesis is to describe and evaluate the influence of surface display of anchoring domains for heavy metals on the ability of growth and character of Saccharomyces cerevisiae W303 cell envelope layers. Three genetically modificated strains of Saccharomyces cerevisiae W303 were studied. The cell surfaces of two of these strains were genetically modified to increase the ability of heavy metals sorption. The modification of the strain carrying plasmid p416-αS consisted in the surface display of the glycoprotein α-agglutinin, while strain carrying plasmid p1αS-PC2 carried at the surface α-agglutinin with anchored oligopeptide. The third strain was used for check. The growth of recombinated strains was almost the same. According utilized carbon source, higher yield coefficient was reached on mannose compared with glucose and fructose. The difference in cell surface hydrophobicity in dependence on the growth phase was observed in all strains. In the early stationary phase there was noticed higher hydrophobicity of envelope structure than in the exponential growth phase. In comparison with a mother strain the surface glycoprotein α-agglutinin display conduced to the cell surface layer hydrophobicity increase. In comparison with the control strain there wasn’t found a important difference in the cell hydrophobicity when the oligopeptide bound to α-agglutinin was present. Lower nitrogen concentration didn’t change the cell surface hydrophobicity of the individual strains. The determination of mannose ratio in cell walls didn’t prove a significant difference between recombinant strains. Kateřina Sedmíková: Biofiltrace směsi styrenu a acetonu (prof. Ing. Jan Páca, DrSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Byla studována degradace par styrenu a acetonu v bioreaktorech typu biofiltru a biotrickling filtru. Nejprve byly měřeny a vyhodnoceny degradační rychlosti a účinnosti jednotlivých polutantů a jejich směsí za podmínek ustáleného stavu v obou typech reaktorů. Tyto výsledky umožnily určit, jakým způsobem ovlivňuje biodegradabilita a rozpustnost ve vodě jednotlivých sloučenin provozní charakteristiky reaktorů. Biotrickling filtr dosáhl ve srovnání s biofiltrem o mnoho vyšší degradační rychlosti a účinnosti při velkém zatížení směsí s převažujícím podílem acetonu. Druhá část byla zaměřena na dynamické odezvy obou systémů při skokových přetíženích a/nebo na odlehčení po těchto zátěžích. Jak vyplynulo z pokusů, průlom polutantů na výstupu z lože byl větší stejně tak jako doba potřebná k návratu byla delší v případě současného zvýšení vstupní koncentrace a průtoku vzduchu.

21

Biofiltration of styrene and acetone mixture Biofiltration of styrene and acetone vapors was performed using a biofilter and a trickle bed reactor. First, the degradation rate and efficiency of the individual pollutants and their mixtures under steady state conditions was measured and evaluated in both the reactor systems. From this followed, how the biodegradability and the water solubility of the individual compounds affected performance characteristics of the reactor. A comparison of both the reactor types revealed that the biotrickling filter was able to achieve much higher degradation rate and efficiency at high loading rates for vapor mixtures with prevailing acetone content. The second part was focused on dynamic responses to the step-wise overloading and/or the loading release in both the reactor types. The resultes proved that the pollutant breakthrough was higher as well as the recovery time was longer in case of a combined step change of the inlet concentration and the air flow rate. Hana Šímová: Odstranění benzínových par v biofiltru (prof. Ing. Jan Páca, DrSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Práce se zabývala analýzou biofiltrace benzínových par v podmínkách ustálených stavů. Bylo zjištěno, že při vyšších hodnotách zátěže reaktoru lze dosáhnout podstatně vyšších hodnot degradační účinnosti při vyšších vstupních koncentracích par a delších dobách kontaktu mezi polutantem a biokatalyzátorem. Prokázalo se, že mikroorganismy preferenčně degradovaly aromatické uhlovodíky. Zrychlení degradace alifatických uhlovodíků se projevilo až po degradaci 90 % aromatických uhlovodíků. Dále bylo studováno dynamické chování bioreaktoru při krátkodobých přetíženích systému, přetíženích následovaných přerušením přívodu polutantu a po přerušení provozu. Ani krátkodobé přetížení, ani přerušení přívodu polutantu neměly výrazně negativní vliv na degradační účinnost reaktoru. Po víkendovém přerušení provozu došlo k obnovení původní degradační aktivity až po 24 h. Aby se zabránilo periodickému skokovému vzrůstu výstupní koncentrace polutantu při periodickém zatěžování, byl před biofiltr zařazen adsorbér naplněný granulovaným aktivním uhlím. Tento kombinovaný systém účinně zabránil přílišnému zvýšení výstupní koncentrace, která již nepřesahovala standardní limity. Gasoline vapor removal in a biofilter Gasoline vapor biofiltration under steady state conditions was studied. The results revealed that much higher values of the removal efficiency at higher loading rates can be archived using higher vapor concentrations in the inlet air and a longer contact time of pollutant with the biocatalyst. Microorganisms preferentially degraded aromatic hydrocarbons. After a removal of 90 % of aromatics from the gas phase, aliphatic hydrocarbons started to be efficiently degraded, too. The second part of the work was focused on dynamic responses of the bioreactor to short-term overloading tests, overloading tests with following non-loading periods, and idle periods. Both the overloading and non-loading periods did not have any negative impact on the degradation rate and efficiency. The idle period lasting over weekend resulted in about 24 h recovery of the biocatalyst to the original activity. To eliminate the periodical step-wise pollutant breakthrough, an adsorber filled with granular activated carbon was included in front of the biofilter. This combined system eliminated the vapor breakthrough efficiently and the outlet concentration of residual compounds had not exceeded the standard limits anymore. 22

Martin Vojtíšek: Biologická degradace nitrovaných sloučenin (prof. Ing. Jan Páca, DrSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) V této práci byla testována schopnost směsné populace izolované ze znečištěné půdy a potoka areálu Explosia Pardubice a.s. degradovat nitroglycerin a ethylenglykoldinitrát. Experimenty probíhaly jako vsádkové submersní procesy. Zkoumanými faktory ovlivňující biodegradaci nitroglycerinu byly zejména vliv teploty, vliv vstupní koncentrace polutantu a vliv přídavku kosubstrátu. Byla též provedena izolace jednotlivých čistých kmenů ze směsné populace, a ověření jejich degradačních schopností v submersních procesech. Pouze jediný kmen dokázal zcela degradovat GTN. Směsná populace byla schopná odbourávat nitroglycerin, přičemž vyšší teplota měla pozitivní vliv na rychlost degradace, stejně jako vyšší vstupní koncentrace nitroglycerinu. Ethylenglykoldinitrát tato směsná populace odbourávat schopna nebyla. Biological degradation of nitrated compounds The ability of mixed culture to degrade nitroglycerin and ethylene glycol dinitrate was tested in this study. Microbial culture was isolated from contaminated soil and waste water of an explosive manufacturing plant, Explosia Pardubice a.s. The effect of temperature, initial substrate concentration and co-substrate addition on the degradation of GTN was tested in aerobic batch experiments. An isolation of the pure strains was accomplished, and their ability to degrade nitroglycerin was also tested. Just one strain was able to degrade nitroglycerin totally. With the mixed culture, complete degradation of nitroglycerin was observed. Temperature had a positive effect on the degradation rate, as well as the increasing initial concentration. Ethylene glycol dinitrate was not biodegradable by our mixed microbial culture. Hana Tománková: Identification of Antibody Fragments with Aktivity Against Prion Aggregation Using Yeast Model (prof. Ing. Karel Melzoch, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) MilleGen is a biotechnological company, based in Labege, near Toulouse (France). The company is focused on directed molecular evolution and engaged in the engineering of human therapeutic antibodies. Recently, its scientists have developed a new screening platform allowing the discovery of recombinant antibody against targets which are implicated in some diseases development. One of the applied methods was designed in collaboration with the Amyloid and Cell Division Cycle Laboratory (ACCL) of CNRS (Roscoff, France). This work is based on selecting of human recombinant antibodies recognising specifically the neurodegenerative diseases-related target. In ACCL, a rapid yeast-based two-step assay was developed to screen for “anti-prion” drugs. The applied method associates the phenotype (red)/(white) to the soluble or aggregated form of prionic protein Sup35. This approach has already allowed to M. Blondel´s team in Roscoff to identify several compounds that are effective against aggregation of budding yeast [PSI+] prion. Interestingly, their compounds have been shown to be also active in promoting mammalian prion clearance. The similar screening approach is thus used, on MilleGen’s platform from VH and scFv antibody fragment library, to identify novel prion aggregation inhibitors. In MilleGen´s platform, the method was primarily applied to screen the VH antibody fragment library which permitted isolation of some VH fragments promoting, seemingly, [PSI+] prion clearance. Presently, the aim of the strategy is to screen the MilleGen’s scFv 23

antibody fragment library to isolate candidates with anti-aggregating activity. Thus, the scFv fragment library with a diversity of 106 was cloned in the yeast screening plasmid and its first part was screened. Simultaneously, a second colorimetric system of detection, enabling to test the isolated candidates for their activity against aggregation, was developed. The isolation of recombinant antibody scFv fragments against aggregation of prion proteins in a yeast model would make it possible to find recombinant antibodies active against mammals’ prion aggregation. Such approach may provide development of many tools needed for diagnostic, research and therapy of prion disease and largely of neurological diseases. It will also make it possible to find antibodies having the capacity to be active, stable and soluble in an intracellular environment. Využití kvasinkového modelu k identifikaci fragmentů protilátek s aktivitou proti agresi proteinů prionového typu MilleGen je biotechnologická společnost se specializací na vývoj lidských protilátek různých terapeutických aplikací. V posledních letech se tato společnost zaměřila na výzkum a vývoj tzv.„screeningové platformy”, která má za úkol navržení metod umožňujících objevení rekombinantních protilátek interagujících s biomolekulami způsobujícími rozvoj řady onemocnění. Jedna z používaných metod byla vyvinuta ve spolupráci se státní laboratoří ACCL (the Amyloid and Cell Division Cycle Laboratory), která sídlí v západofrancouzském městě Roscoff. Tato metoda je založena na selekci rekombinantních lidských protilátek se schopností specificky rozpoznat biomolekuly, jejichž výskyt byl pozorován u neurodegenerativních onemocnění. V ACCL byla již dříve vyvinuta rychlá dvoukroková metoda využívající kvasinkový systém k selekci chemických molekul s anti-prionovou aktivitou. Tato metoda asociuje fenotyp (červená)/(bílá) k rozpustné či agregované formě kvasinkové bílkoviny Sup35 prionového typu. U sloučenin, které byly díky své aktivitě proti shlukování (agregaci) kvasinkových [PSI+] prionů tímto postupem identifikovány, byla prokázána také schopnost působení proti agregaci prionů u savčích systémů. Podobnou metodu tedy použili i v MilleGen k selekci nových inhibitorů prionové agregace testováním tzv. „bank fragmentů rekombinantních protilátek“ typu VH a scFv. Pomocí výšše uvedené metody byla v rámci screeningové platformy společnosti MilleGen prověřena nejprve banka obsahující VH fragmenty. Bylo izolováno několik fragmentů, které se chovají jako inhibitory prionové agregace. Proto jsou zde v současné době stejným způsobem prověřovány i banky s scFv fragmenty. Jedna z nich o diverzitě 106 byla klonována do plasmidu zajišťujícího expresi fragmentů v kvasince. Její první část pak byla testována pro svou anti-prionovou aktivitu pomocí specifického kmene. Zároveň byl vyvinut i druhý kolorimetrický systém, který umožní ověření požadované aktivity izolovaných fragmentů. Selekce rekombinantních protilátek typu scFv proti agregaci prionů pomocí kvasinkového modelu představuje slibnou metodu pro identifikaci protilátek aktivních i v savčích systémech. Tento přístup nabízí potenciál pro identifikaci molekul s aplikacemi jak v diagnostice, tak ve výzkumu či při terapiích, navíc i na úrovni širšího spektra neurodegenerativních onemocnění. Představuje také nezanedbatelnou perspektivu pro izolaci protilátek, které by vykazovaly aktivitu, stabilitu a dostatečnou rozpustnost i v intracelulárním prostoru.

24

Na závěr bych chtěl popřát všem absolvenům úspěšný start jejich profesní kariéry, hodně štěstí a spokojenosti v osobním životě a byl bych rád, kdyby na svoji Alma Mater nezapomněli a udržovali s ní kontakty i v budoucnosti.

25