Diplomové práce absolventů studijního oboru „Biotechnologie a Biotechnologie léčiv“, obhájené na Fakultě potravinářské a biochemické technologie VŠCHT Praha v akademickém roce 2008/2009 prof. Ing. Karel Melzoch, CSc., Ústav kvasné chemie a bioinženýrství, VŠCHT Praha Anotace diplomových prací Diploma theses anotations Petr Bednář: Stanovení vitality pivovarských kvasinek pomocí intracelulární změny NAD(P)H (doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Vitalita pivovarských kvasinek zásadním způsobem ovlivňuje délku kvašení, tvorbu vedlejších produktů kvašení a schopnost redukce nežádoucích senzoricky aktivních látek. Tím se vitalita významnou měrou podílí na kvalitě hotového produktu. V této práci je presentována nová metoda pro stanovení vitality pivovarských kvasinek založená na měření intenzity fluorescence intracelulárního NAD(P)H během přechodu suspenze kvasinek z anaerobiózy do aerobiózy. Tato metoda je citlivá pro buňky o vysoké viabilitě, při počtu méně než 10 % mrtvých buněk. V této práci je testován nový fluorimetr, specializovaný pro měření intenzity fluorescence NAD(P)H, jehož konstrukce je velmi jednoduchá a tudíž relativně levná. Výsledky jsou porovnávány s víceúčelovým fluorescenčním spektrometrem, na kterém byly prováděny předchozí pokusy. I přes podstatné zjednodušení poskytuje nový fluorimetr srovnatelné výsledky s původním fluorescenčním spektrometrem. Zároveň byl testován zjednodušený postup měření, využívající H2O2 pro navození aerobních podmínek, pro lepší aplikaci do provozního měřítka. Aplikace této metody do provozních podmínek by měla být jednoduchá a levná. Determination of brewing yeast vitality by means of intracellular NAD(P)H Vitality of brewing yeast fundamentally influences the duration of fermentation, the formation of fermentation by-products and the ability of brewing yeast to reduce undesirable flavour compounds. That is the reason, why yeast vitality significantly influences the quality of final product. This work presents a new method for determination of brewing yeast vitality, based on on-line measurement of fluorescence intensity of intracellular NAD(P)H during anaerobic – aerobic shift of yeast suspension. This method is sensitive for high viability yeast with less than 10 % dead cells. In this work a new and simplified fluorimeter was tested, which is specialised for fluorescece intensity measurement of NAD(P)H. Results obtained from this new fluorimeter are compared with a multifuncional 2-D fluorescence spectrometer used in previous work. Despite of its simplified construction the new fluorimeter provides results comparable with the previously used advanced fluorescence spectrometer. At the same time testing of a simplified measurement procedure adjusted to industrial conditions, using H2O2 to induce aerobic conditions, was carried out. Aplication of this method to brewing process should be as simple and cheap as possible. Michael Bražina: Fyziologická aktivita Saccharomyces cerevisiae v průběhu kvašení mladin s zvýšeným obsahem mykotoxinů (Ing. Jaromír Fiala, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Cílem každého výrobce piva je vyrábět produkt, jehož senzorický vjem a složení se v dlouhodobém horizontu nemění. Toho může být dosaženo jen důslednou kontrolou procesu 1
kvašení. Zásadní vliv na průběh kvašení má fyziologický stav kvasnic nasazovaných do provozního kvašení. Hlavním cílem této práce bylo zjistit vliv mykotoxinu deoxynivalenol na fyziologický stav pivovarských kvasinek. Sledován byl především jeho vliv na viabilitu a na obsah glykogenu, trehalosy, DNA a bílkovin v kvasinkách. Nosnou metodou této práce byla průtoková cytometrie. Pro stanovení viability bylo použito barvení methylenovou modří s následným počítáním buněk v Bürkerově komůrce. Bylo zjištěno, že zvýšený obsah deoxynivalenolu v mladině neměl vliv na viabilitu kvasnic. Dále bylo pozorováno, že jeho přítomnost v mladině ovlivňovala u některých kmenů kvasinek obsah glykogenu, trehalosy, DNA a bílkovin v buňce. Vliv na obsah glykogenu byl pozorován především v exponenciální fázi růstu. Obsah trehalosy byl ovlivněn především na konci kvašení, tudíž lze předpokládat, že deoxynivalenol působí jako stresový faktor v konečné fázi kvašení, kdy docházejí zkvasitelné zdroje energie. Fysiological activity of Saccharomyces cerevisiae during fermentation of wort with higher contents of mycotoxins The ultimate goal of every brewer is the formation of a consistent final product. This can only be achieved if the fermentation stage of the brewing process is precisely controlled. Status of yeast used under industrial conditions has significant effect on the course of fermentation. The main objective of this work was to determine the impact of the mycotoxin deoxynivalenol on the physiological state of the brewer’s yeast. Focus was put on the observation of its impact on the viability and the content of glycogen, trehalose, DNA and proteins in yeast. The main method used in this work was flow cytometry. Methylene blue staining followed by counting cells in Bürker chamber was used to determine the yeast viability. It was found out the increased content of deoxynivalenol in worth had no influence on the yeast viability. It was observed its present in worth influenced the content of glycogen, trehalose, DNA and proteins of certain strains of yeast. The influence on the glycogen content is evident mainly in the exponential phase of growth. The content of the trehalose was influenced by deoxynivalenol mainly at the end of fermentation, therefore it can be assumed that deoxynivalenol acts as a stress factor at the end of fermentation when the lack of energy is approaching. Tomáš Bryzgal: Vliv podmínek kvašení na obsah mykotoxinů (Ing. Jaromír Fiala, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Mykotoxiny jsou sekundární metabolity některých rodů plísní, především rodů Fusarium, Aspergillus, Penicillium a Alternaria. Je prokázán jejich častý výskyt v obilovinách. Z nich se přes zpracovatelské technologie mohou mykotoxiny dostat až do konečných produktů, které jsou součástí lidské diety. Jedním z mnoha těchto produktů je i pivo. Mykotoxiny DON a DON-3-G jsou mykotoxiny nejčastěji se vyskytující v pivovarství. Tato práce je zaměřena na posuzování vlivu podmínek kvašení na jejich obsah. Byl sledován vliv teploty hlavního kvašení a použitého kmene pivovarských kvasinek. Při posuzování vlivu teploty hlavního kvašení byly porovnávány čtyři teploty (7,5 °C, 9 °C, 15 °C a 20 °C). Jen při teplotě 9 °C došlo k významnějšímu poklesu koncentrace sledovaných mykotoxinů. Vliv použitého kmene kvasinek byl sledován u dvou pracovních kmenů Saccharomyces pastorianus a kvasinek Saccharomycodes ludwigii. Ukázalo se, že vliv použitého kmene kvasinek nebyl nikterak výrazný a u všech kvasných pokusů došlo pouze k poklesu koncentrace DON-3-G. Mezi porovnávanými kmeny kvasinek však nebyly výrazné rozdíly. 2
Influence of fermentation conditions on content of mycotoxins Mycotoxins are secondary metabolites of some genera of fungi, especially Fusarium, Aspergillus, Penicillium and Alternaria. It demonstrated the frequent occurrence in cereals. Mycotoxins can get over processing technologies into the final products, which are part of human diet. One of many of these products is beer. Mycotoxins DON and DON-3-G are the most commonly occurring mycotoxins in brewing. This thesis is aimed at assessing the influence of fermentation conditions on their content. It was observed influence of temperature of fermentation and the strain of brewer's yeast. For analysis of the influence of the temperature of fermentation four temperatures (7,5 °C, 9 °C, 15 °C and 20 °C) were compared. Significant decrease in the concentration of mycotoxins was monitored only at the temperature of 9 ° C. Influence of the strain of yeast was investigated in two strains of trast, Saccharomyces pastorianus and Saccharomycodes ludwigii. It appeared that the impact of the strain of yeast was not significant and it caused only a decrease of the concentration of DON-3-G in all fermentation experiments. Between compared yeast strains were not any significant differences. Ales Čamra: Charakteristika biodegradérů polycyklických aromatických uhlovodíků (prof. RNDr. Vladimír Jirků, DrSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) se v dnešní době řadí mezi závažné polutanty životního prostředí. Tato práce je základní charakteristikou mikroorganismů izolovaných ze zemin dlouhodobě kontaminovaných polycyklickými aromatickými uhlovodíky (PAU). Cílem je izolace a charakterizace vhodných mikroorganismů pro případné pozdější uplatnění v bioremediačních technologiích. Byla studována schopnost růstové utilizace modelových PAU jako jediného zdroje uhlíku a energie, a to v závislosti na teplotě, pH a koncentraci zdroje dusíku a fosforu v kultivačním médiu. Dále byl sledován vliv povrchově aktivních látek . Získané výsledky potvrzují, že v dlouhodobě kontaminovaných oblastech je přítomná mikroflóra schopna rozšířit svůj metabolický potenciál vzhledem k PAU, a zásadně tak přispět k jejich dekontaminaci. Charakteristics of polycyclic aromatic hydrocarbons - degrading strains Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) are at present pollutants of great concern widespread in the environment. This work is a basic characteristics of mikrobial isolates obtained from PAH long – term contaminated soils with emphasis on their further application in bioremediation technologies. Microbial utilization of model PAH as a single carbon and energy source under different physiochemical conditions was studied. Obtained results confirm that mikroflora present at such long – term contaminated ecosystems is able to enhance its metabolic potencial and biodegrade PAH. Mikrobial biodegradation is one of the main processes in PAH decontamination. Alžběta Davidová: Studium katalytických vlastností nitrilas z vláknitých hub rodů Penicillium a Fusarium (prof. Ing. Alena Čejková, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Kmen Fusarium solani IMI 196840 kultivovaný ve dvou krocích (nárůst mycelia v kultivačním mediu bohatém na živiny, následná indukce nitrilasové aktivity 3
2-kyanopyridinem jako induktorem v mediu), produkoval 1150 U nitrilasy/l kultury. Kmen Penicillium multicolor CCF 2244 kultivovaný stejným způsobem produkoval 132,5 U nitrilasové aktivity/l kultury. Při jednokrokové kultivaci v modifikovaném kultivačním mediu podle Czapka-Doxe s 2-kyanopyridinem jako induktorem nitrilasové aktivity produkoval tento kmen 61 U/l kultury. Nitrilasová aktivita se lišila v teplotním optimu, které je pro F. solani 45°C a pro P. multicolor 35 - 45°C. V případě obou enzymů se jedná o aromatické nitrilasy s vysokou substrátovou specifitou pro benzonitril. V případě F. solani byla prokázána substrátová specifita i pro 2-tolunitril, 3-tolunitril, 4-tolunitril, 2-chlorbenzonitril, 3-chlorbenzonitril, 4-chlorbenzonitril, 3-hydroxybenzonitril a 2-methyl-4butenenitril. Study of catalytic properties of nitrilases from filamentous fungi of genera Penicillium and Fusarium Fusarium solani IMI 196840 was grown in two-stage culture (in the first stage the fungal biomass was produced, in the second stage the activity was induced by 2-cyanopyridine) and its nitrilase activity was 1150 U/l culture. Penicillium multicolor CCF 2244 was cultured in the same way to give 132.5 U/l culture. In one-stage culture in the modified Czapek-Dox medium with 2-cyanopyridine as inductor activity produced 61 U/l culture. Both enzymes are aromatic nitrilases with high substrate specificity for benzonitrile. For F. solani nitrilase a broad substrate specificity for 2- tolunitrile, 3-tolunitrile, 4-tolunitrile, 2-chlorobenzonitrile, 3chlorobenzonitrile, 4-chlorobenzonitrile, 3-hydroxybenzonitrile and 2 methyl-4butenenitrile was demonstrated. Jana Fořtová: Optimalizace podmínek fermentace butanolu (prof. Ing. Karel Melzoch, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Diplomová práce je zaměřena na optimalizaci fermentačního média pro anaerobní bakterie rodu Clostridium, které se využívají pro produkci butanolu. Většina kultivací byla prováděna s kmenem Clostridium pasteurianum NRRL B-598. K optimalizaci média sloužily vsádkové kultivace v baňkách prováděné za striktně anaerobních podmínek s glukosou o koncentraci 60 a 80 g.l-1, se zdroji organického dusíku a živin v podobě kvasničného autolyzátu, tryptonu a syrovátkového proteinu, zdroji anorganického dusíku (chlorid amonný, fosforečnan amonný a octan amonný) a dalšími komponentami. Byl rovněž sledován efekt přídavku butanolu do média na začátku kultivace. Přítokované kultivace byly prováděny v bioreaktoru za použítí médií o různé koncentraci glukosy. Ta byla přítokována podle aktuální koncentrace glukosy tak, aby se zamezilo jak limitaci tak inhibici substrátem. Slibným se ukázalo využití syrovátkového proteinu, který by mohl být vhodným a cenově zajímavým zdrojem živin. Bylo dosaženo koncentrace butanolu až 8,5 g.l-1. Náhrada chloridu amonného jiným zdrojem anorganického dusíku se neosvědčila. Při všech přítokovaných kultivacích v bioreaktoru bylo dosaženo koncentrace butanolu kolem 8 g.l-1 a to bez ohledu na průběh kultivace. Butanol fermentation – bioprocess optimisation The diploma thesis deals with optimization of a fermentation medium for anaerobic bacteria of genus Clostridium, which are applied to butanol production. The majority of the cultivations was performed using a strain Clostridium pasteurianum NRRL B-598. The optimization of the medium was carried out in batch cultivations under strictly anaerobic conditions. The medium contained glucose at concentration of 60 and 80 g.l-1, a source of organic nitrogen and nutrients as a yeast autolysate, tryptone and whey protein, a source 4
of inorganic nitrogen (ammonium chloride, ammonium phosphate and ammonium acetate) and other components. The effect of butanol addition into the medium at the beginning of cultivation was studied. Fed-batch cultivations were performed in a bioreactor using a medium with various concentrations of glucose. The medium was added with respect to the actual glucose concentration in order to avoid limitation as well as inhibition by the substrate. Whey protein showed to be a promising source of nutrients. The concentration of butanol was up to 8,5 g.l-1. Substitution of ammonium chloride by another inorganic source of nitrogen was not effective. Concentration of 8 g.l-1 was attained during all fed-batch cultivations in the bioreactor regardless of cultivation conditions. Radek Halama: Mikrobní degradace benzínových par (prof. Ing. Jan Páca, DrSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Práce se zabývala biofiltrací par benzínu v ustálených stavech. Byla potvrzena preferenční degradace aromatických složek benzínu před alifatickými. Ty byly degradovány převážně až po odbourání 90 % aromatických složek. Ani při vysokých koncentracích polutantu (10 g.m-3) nebyl pozorován významný negativní vliv na mikrobiální populaci. Dále bylo studováno dynamické chování biofiltru během skokových změn vstupní koncentrace. Po krátkodobém přetížení (8 h) nebo přerušení provozu (až 70 h) docházelo k obnovení původní degradační účinnosti již během jednoho dne. Vhodnou konfigurací reaktoru se podařilo podstatně snížit kolísání zátěže biofiltru a udržet výstupní koncentraci pod normovaným limitem. Microbial degradation of gasoline vapor The study was focused on gasoline vapor biofiltration at constant and varied loading rates. A degradation of aliphatic and aromatic components was evaluated separately. The results revealed that aromatic hydrocarbons were removed prior to aliphatic ones. Dynamic properties of the reactor were tested using step-wise overloading conditions. Using a suitable reactor configuration, variations of the loading rate were smoothed and the pollutant concentration in the outlet could be maintained below the standard limit value. Jana Hlousková: Mitochondrie v procesu státnutí kvasinek (doc. Ing. Jan Masák, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Dlouhodobá kultivace buněk způsobila snížení respirace isolovaných mitochondrií. Ukázalo se, že čím je vyšší endogenní respirace mitochondrií, tím je nižší jejich spřažená respirační kapacita po přidání substrátu. Reakce na přídavek odpřahovače oxidativní fosforylace je naopak vysoce individuální a závisí jak na kmenech, ze kterých jsou mitochondrie izolovány, tak na délce kultivace buněk. Dále byl zjišťován efekt permeabilizace isolovaných mitochondrií mrazem. Mitochondrie chronologicky mladých buněk reagují zvýšením respiraci, zatímco u mitochondrií chronologicky starých buněk permeabilizace vede ke snížení respirace.V poslední části byla měřena respirace mitochondrií v závislosti na jejich replikativním stáří. Mitochondrie replikativně mladých buněk mají o 95% vyšší respirační aktivitu, než mitochondrie replikativně starých buněk. Permeabilizace mrazem vede k navýšení endogenní respirace jak u mitochondrií replikativně mladých, tak i replikativně starých buněk. Mitochondria during the yeast aging
5
Results confirm that the long-term cultivation leads to the decrease in respiration of isolated mitochondria. In addition, it is shown that the bigger the endogenous respiration, the lower is the coupled respiration capacity after substrate treatment. The answer to the addition of uncoupler is highly individual and depends on the strain, which mitochondria were isolated from, and on the period of cell cultivation. The effect of freeze permeabilization on isolated mitochondria has been investigated. The chronologically young cell mitochondria react by respiration increase, while permeabilization of chronologically old cell mitochondria leads to the respiration decrease. In the last part, the dependence of mitochondrion respiration on replicative age of source cells was measured. The respiration of replicatively young cell mitochondria is 95% higher than the respiration of replicatively old cell mitochondria. The freeze permeabilization leads to the respiration increase of both, replicative young cell and replicative old cell mitochondria. Michaela Holá: Antimikrobiální účinky oxidu titaničitého (prof. Dr. Ing. Martina Macková, ÚBM VŠCHT Praha) Práce je zaměřena na studium antimikrobiálního účinku oxidu titaničitého aplikovaného v kombinaci s UV zářením. Prokázalo se, že nejvyššího inhibičního efektu při použití kombinace oxidu titaničitého za současného ozařování UV světlem bylo dosaženo u bakteriálních kultur Citrobacter freundii (gramnegativní bakterie) a Staphylococcus aureus (grampozitivní bakterie), naopak nejnižší inhibice růstu bylo dosaženo u grampozitivní bakteriální kultury Enterococcus faecalis. U samotného UV záření bylo dosaženo nejvyššího inhibičního účinku u gramnegativních bakteriálních kultur Citrobacter freundii a Pseudomonas aeruginosa. Naopak poměrně nízkých inhibičních účinků při ozařování vzorků UV světlem, bylo dosaženo u grampozitivních bakteriálních kultur Bacillus subtilis a Enterococcus faecalis. Působení samotného TiO2 mělo největší vliv na gramnegativní bakterie Citrobacter freundii a Pseudomonas aeruginosa, naopak nejméně byly ovlivněny Escherichia coli (gramnegativní bakterie) a Staphylococcus aureus (grampozitivní bakterie). Antimicrobial effect of titanium oxide This study gives a view of bacterial strains, potential pathogens with the intent to study antimicrobial effect of titanium dioxide used in combination with UV irradiation on viability of the cells. Results indicate, that the highest inhibition effect was observed when titanium oxide was combined with UV light. This treatment led to the highest inhibition effect to cultures of Citrobacter freundii (gramnegative bacteria) and Staphylococcus aureus (grampositive bacteria). On the other hand the lowest inhibition of growth was determined for grampositive bacteria Enterococcus faecalis. However when influence of UV light was examined alone it could be concluded that the highest inhibition effect was determined for gramnegative cultures of Citrobacter freundii and Pseudomonas aeruginosa. The lowest effect was examined for cultures of Bacillus subtilis and Enterococcus faecalis. When TiO2 was used alone the highest influence was observed for Citrobacter freundii and Pseudomonas aeruginosa. However, almost no inhibition of growth was determined for Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Kitipong Jaisamut: Physico-chemical and biochemical treatment of lignocellulosic materiále for fermentation purposes (prof. Ing. Mojmír Rychtera, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha)
6
Objective of this diploma thesis was to test one of many lignocellulosic waste materials – corn stover – using simple chemical and biochemical methods for further application in production of biofuels. Corn stover was at first characterized with respect to chemical composition and then treated both with weak acids and with hydroxides under relatively mild conditions. Reducing sugars (from 5 till 9 g/l) were contained only in liquid phase after acid treatment. Washed solid phase from each hydrolysis treated with commercial enzymes of enzyme manufacturers Novozymes A/S (Novozymes Biomass Kits) and Genencore International B.V. (AcceleraseTM 1000). Enzymatic hydrolysis demonstrated better results on prehydrolyzed material with alkaline pretratment. However end product inhibition slowed down the process of hydrolysis and therefore SSF (simultaneous saccharification and fermentation) method was suggested to improve the process in combination with fermentation. SSF process (acetonebutanol-ethanol fermentation with the strain C. pasteurianum NRRL B-598) realized on the solid phase obtained from alkaline hydrolysis with the use of enzymes Novozymes Biomass Kits at 37 oC manifested relatively good results; from 100 kg dry corn stover we could get 7 kg solvents containing mainly butanol (5kg). Fyzikálně-chemická a biologická úprava lignocelulosových materiálů pro fermentační účely Cílem této diplomové práce bylo testovat jeden z mnoha lignocelulosových odpadů – kukuřičnou slámu – s použitím jednoduchých chemických a biochemických metod pro další aplikaci pro produkci biopaliv. Kukuřičná sláma byla nejprve charakterizována z hlediska obsahu hlavních složek a potom podrobena jak hydrolýze slabými kyselinami tak i hydroxidy za relativně mírných podmínek. Redukující látky v obsahu 5 až 9 g/l obsahovala pouze kapalná fáze po kyselé hydrolýze. Promytý materiál z každé hydrolýzy byl podroben enzymové hydrolýze s použitím enzymů od výrobců Novozymes A/S (Novozymes Biomass Kits) a Genencore International B.V. (AcceleraseTM 1000). Enzymová hydrolýza vykázala lepší výsledky na pevném materiálu z alkalické hydrolýzy. Avšak inhibice konečným produktem zpomalila proces a proto byla použita metoda SSF (paralelní zcukření a fermentace) ke zlepšení procesu a k dosažení lepších výsledků. SSF proces (aceton–butanoletanolová fermentace s kmenem C.pasteurianum NRRL B-598) realizovaný na pevném fázi získané po alkalické hydrolýze s použitím enzymů Novozymes Biomass Kits při teplotě 37 oC poskytl relativně dobré výsledky; ze 100 kg kukuřičného odpadu by bylo možno získat 7 kg rozpouštědel obsahujících až 5 kg butanolu. Tadeáš Jakubec: Gangliosidy u cholestázy indukované ethinyl estradiolem po aktivaci a inhibici hemosygenasy-1 (prof. Ing. Tomáš Ruml, CSc., ÚBM VŠCHT Praha) Práce navazuje na publikaci Majera a spol.1, v níž bylo popsáno, že u intrahepatální cholestázy indukované u potkanů kmene Wistar 17-α-ethinyl estradiolem dochází ke zvýšení gangliosidu GD1a a velmi výraznému nárůstu gangliosidů b-větve: GD3, GD1b a GT1b, které jsou u kontrolních potkanů Wistar minoritní. V této diplomové práci byl u obou skupin, cholestatické i kontrolní, sledován vliv hemoxygenasy-1 na složení jaterních gangliosidů ve vzorcích z potkanů kmene Wistar Oběma skupinám byl podáván aktivátor hemoxygenasy-1, hemin, nebo inhibitor hemoxygenasy-1, tj. Sn-mesoporfyrin. Z uvedených skupin byly isolovány gangliosidy z jater. Jejich koncentrace a jejich zastoupení bylo sledováno z denzitometrického proměření chromatogramů. Z výsledků se ukázalo, že při aktivované hemoxygenase-1 proti inhibované dochází u kontrolních zvířat dochází k signifikantnímu nárůstu gangliosidů a-větve biosyntézy (GD1a) i 7
b-větve (GT1b). Tento nárůst je možné přičíst pozitivnímu hepatoprotekčnímu účinku hemoxygenasy-1 na biosyntézu gangliosidů. Tato chromatografická studie upozornila na možnou souvislost aktivace HO-1 s nárůstem koncentrace některých gangliosidů, který je pravděpodobně způsoben stimulací jejich biosyntézy. K důkazu této stimulace je třeba dalších studií: sledování mRNA příslušných glykosyltranferas, případně sledování jejich enzymatické aktivity. Gangliosides at ethinylestradiol induced cholestasis after activation or inhibition of heme oxygenase-1 This diploma thesis is a continuation of the work published by Majer et al1, demonstrating a dramatic increase of b-series gangliosides in liver of Wistar rats in intrahepatal cholestasis induced by 17-α-ethinylestradiol. An increase of GD1a ganglioside and very high increase of b-series gangliosides GD3, GD1b and GT1b was shown in cholestatic samples were compared with control ones. In this diploma thesis the effect of hemoxygenase-1 on the composition of rat gangliosides in both, cholestatic and control group, was studied. An activator of hemoxygenase-1 –hemin- or inhibitor of hemoxygenase-1 -Sn-mesoporphyrine- were applied to both cholestatic and control animals. Liver gangliosides were isolated from these groups and separated by TLC chromatography and quantified by densitometry. Results showed significant increase of both a-series ganglioside GD1a and b-series ganglioside GT1b and GD1b in group of cholestatic as well as in normal animals at activated hemoxygenase-1 when compared with that at inhibited hemoxygenase-1. This effect might be caused by hepatotoprotective effect of heme oxygenase 1 on ganglioside biosynthesis. This chromatographic study draws the attention to the possibility of stimulation of biosynthesis of some gangliosides by activation of heme oxygenase-1. Further studies of mRNA of selected glycosyltrasferases or determination of their enzymatic activity are necessary for confirmation of this observation. Lukáš Jelínek: Využití stanovení obsahu jednotlivých polyfenolů pro určení odrůdy chmele (Ing. Marcel Karabín, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Hlavním cílem této práce bylo navrhnutí postupu identifikace chmelových odrůd na základě specifických identifikačních znaků, získaných stanovením obsahu a relativního zastoupení 19 jednoduchých polyfenolových sloučenin u 22 tuzemských a zahraničních odrůd. Na zakladě těchto stanovení byla nalezena řada specifických markerů, pomocí kterých byl navržen postup, umožňující pro daný soubor vzorků jednoznačnou identifikaci 17 z 22 sledovaných odrůd, přičemž byla pomocí metod shlukové analýzy potvrzena odlišnost Žateckého poloraného červeňáku a dalších tuzemských odrůd. V další části práce byl sledován vliv vybraných parametrů (granulační postup, místo pěstování) na tyto polyfenolové znaky. Nebyl prokázán jednoznačný trend ve změnách obsahů polyfenolů v průběhu granulačního procesu, na druhou stranu však byly zjištěny významné rozdíly v profilu polyfenolových sloučenin v závislosti na pěstitelské oblasti. The use of determination of individual polyphenol content for hop variety identification The main goal of this diploma thesis was to propose identification of different hop cultivars on the basis of special markers. Twenty two hop varieties origin from Czech Republic and abroad were tested for content (relative content) of nineteen individual polyphenols.
8
Several markers were identified as varietal specific. Seventeen (from twenty two) hop varieties were distinguished by using these markers. Unique polyphenolic composition was confirmed for Saaz and other Czech hop varieties by using of cluster analysis. In the second part of this work we studied an influence of some parameters (granulation process and growing location) on the polyphenolic markers. There was not confirmed any clear trend in the changes of polyphenols content during granulation process. On the other hand significant differences were founded for polyphenolic profile in dependence of growing region. Petr Kaluža: Purifikace monoklonálních protilátek pro stanovení prolaminů ječmene a jejich aplikace (doc. Ing. Pavel Dostálek, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Prolaminy jsou bílkovinná frakce obilovin (rodu Triticeae) rozpustné ve zředěných roztocích ethanolu. Tyto proteiny jsou charakteristické vysokým obsahem prolinu a glutaminu. Proto bývají prekurzory vzniku zákalů v pivu. Je známa také alergenita prolaminů vůči osobám postiženým celiakií. Avšak role piva jako potencionálního alergenu nebyla dosud dostatečně prokázána. Panel monoklonálních protilátek získaný imunizací myší proti prolaminům obilovin byl purifikován, rozdělen a testován. Po charakterizaci těchto protilátek byly některé vybrány a testovány ELISA systémem v nepřímém kompetitivním uspořádání. Byly určeny detekční limity monoklonálních protilátek a jedna protilátka byla vybrána pro následující analýzy, zvláště pro stanovení jejích křížových reakcí s prolaminovými frakcemi různých cereálií a vzorkem piva. Kvůli komplexnosti a množství interferujících sloučenin byly prolaminy charakterizovány pomocí jednorozměrné i dvourozměrné elektroforesy. Tyto elektroforetické postupy byly optimalizovány pro stanovení prolaminové frakce proteinů obilovin. Purification of monoclonal antibodies for determination of barley prolamines and their application Prolamines are usually considered to be ethanol-soluble proteins of specific cereals (Triticeae family). These proteins are typical of high content of proline and glutamine, therefore they are precursors of haze forming mechanism. Prolamins are also well-known for causing some allergic reactions. The role of beer as a potential allergen has not been completely evaluated yet. Panel of monoclonal antibodies (MAbs) raised against hordeins was purified, separated and tested. After characterization of these antibodies, some of them were selected and tested in an imunochemical analytical system of indirect competitive ELISA. Detection limits of MAbs were collected and one MAb was used for consequent analysis, especially for determination of its crossreactivity with various cereal proteins and a sample of beer. Prolamins were characterized by 1D and 2D electrophoresis because of the problematic complexity of the sample and high content of interfering compounds. These methods were optimized for the needs of prolamin analysis. Kristýna Klímová: Biotechnologický potenciál bakterie Rhodococcus sp. (doc. Ing. Jan Masák, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Cílem této diplomové práce bylo posoudit degradační aktivity biotechnologicky významného bakteriálního rodu Rhodococcus vůči vybraným aromatickým polutantům, zejména fenolu a jemu příbuzným látkám. Na základě dostupných souborů experimentálních dat byly vzájemně 9
porovnávány vlastnosti několika kmenů modelového organismu, Hlavním pozornost byla věnována porovnání růstových charakteristik a degradace fenolu sledovanými kmeny v suspenzní populaci a biofilmu na pozadí vnějších vlivů kultivace. Dále byl zkoumán rozsah potencionálních substrátů v podobě derivátů fenolových sloučenin, zejména utilizace chlorfenolů a chlorbenzoových kyselin, mimo jiné také odolnost vůči těkavým alifatickým chlorethylenům. Bylo potvrzeno, že jednoznačně vyšší rychlosti spotřeby substrátu a tedy kratšího času potřebného pro degradační proces buňky dosahují ve své imobilizované podobě, biofilmu. Dále se potvrdil vliv povahy utilizovaného substrátu na poměr v zastoupení monomerních složek i biopolymerů v EPS a míru nasycenosti řetězců mastných a mykolových kyselin. Biotechnological potential of bakteria Rhodococcus sp. The goal of this diploma thesis was to consider degradation aktivity of biotechnologically important bacterial genus Rhodococcus against selected aromatic pollutant, especially phenol and its related compounds. Based on accessible experimental data were mutually confronted characteristics of some strains of model organism. Main attention was paid to comparison of growth characteristics and degradation of phenol by planctonic growth populations and biofilms on background of different environmental conditions. Utilization of substituted phenols, other monoaromatic compounds as well as chloroethylenes as potential substrats was examined. The higher biodegradation rate of phenolic compounds in biofilm was confirmed. Specific influence of utilized substrates on the cell surface composition (biopolymers in EPS degree of fatty acids and mycolis acids saturation) was confirmed, too. Jan Kotlík: Biodegradace proudících směsí par hydrofobních a hydrofilních látek (prof. Ing. Jan Páca, DrSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Práce se zabývala studiem procesu biodegradace směsí par v různých typech reaktorů a porovnáním jejich účinností. Byly použity tyto typy reaktorů: biofiltr, biotrickling filtr, biotrickling filtr a biofiltr v sériovém zapojení a probublávaný submersní reaktor. Degradovanými polutanty byly páry styrenu a acetonu. U všech typů reaktorů byly vyhodnoceny provozní parametry, tzn. rychlost a účinnost degradace. Probublávaný reaktor i sériové zapojení biotrickling filtru a biofiltru vykazovaly vysokou účinnost odbourávání acetonu a styrenu ze znečištěného vzduchu při vysokých rychlostech zatěžování. Stabilita provozu probublávaného reaktoru byla nižší než u náplňových typů. Biodegradation of flowing vapor mixtures of hydrophobic and hydrophilic compounds A biodegradation of vapor mixtures was studied in different types of reactors. The following reactor types were applied: biofilter, biotrickling filter, a series of biotrickling filter and biofilter, and bubble column reactor. Vapors of styrene and acetone mixtures were degraded by immobilized and/or free microbial cells. Performance parameters, i.e. the degradation rate and efficiency were evaluated in each reactor system. The series of biotrickling filter and biofilter and the bubble column reactor figured out high removal efficiency of both the pollutants at high loading rates. However, the operation stability was higher with the packed bed reactors with immobilized cells. Ipek Kücükturan: Physiology and metabolism of genetically engineered Pichia pastoris yeast grown on different substrates and their mixtures (Dr. Ing. Leona Paulová, ÚKCHB VŠCHT Praha) 10
Influence of cultivation conditions (mainly type of substrate) and overproduction of recombinant protein on a physiology of Pichia pastoris Mut+strain cultivated in chemostat cultures at dilution rate 0.03 h-1 was studied using flow cytometry together with fluorescent staining of selected cellular functions (membrane integrity – staining with propidium iodide (PI) and membrane polarization – staining with bis-(1,3,dibarbituric acid) trimethyl oxonol (BOX)). Product expression was not achieved during the growth of host strain on single glucose and glycerol due to their repressive effect on AOX promoter; on the other hand, low trypsinogen production (43 ± 1.6 mg.L-1) was observed in cultures grown on sole sorbitol even when methanol was not present. In cultures cultivated on mixed substrates containing methanol plus other substrate (glycerol, glucose or sorbitol), trypsinogen formation was initiated shortly after the induction and reached the steady values exceeding 100 mgL-1. Viability of cell culture was improved by using mixed feeding strategy (~3% cells with compromised membrane and ~10% of depolarized cells) compared to growth on sole methanol (~8% of cells stained with PI and ~20% cells stained with BOX). Fyziologie a metabolismus rekombinantní kvasinky Pichia pastoris při růstu na jednoduchých nebo směsných substrátech Vliv kultivačních podmínek (zejména typu substrátu) a nadprodukce rekombinantního proteinu na fyziologický stav rekombinantní kvasinky Pichia pastoris fenotypu Mut+ při kontinuálních kultivacích při nízké zřeďovací rychlosti (0.03 h-1) byl sledován pomocí průtokové cytometrie ve spojení s barvením vybranými fluorescenčními sondami (propidium iodid (PI) – sledování integrity cytoplasmatické membrány a bis-(1,3,dibarbituric acid) trimethyl oxonol (BOX) – sledování polarizace cytoplasmatické membrány). Zatímco při kultivacích na glycerolu nebo glukose nebyl rekombinantní protein exprimován z důvodu represivního charakteru těchto substrátů, při kultivacích na sorbitolu byla zaznamenána produkce trypsinogenu (43 ± 1.6 mg.L-1) i tehdy, kdy nebyl přítomen methanol, který působí jako inductor exprese. Při kultivacích na směsném substrátu, který obsahoval kromě methanolu glycerol, glukosu nebo sorbitol, byla produkce trypsinogenu zaznamenána krátce po indukci a dosahovala ustálených hodnot převyšujících 100 mgl-1. Použití směsných substrátů mělo pozitivní vliv na viabilitu buněčné populace (~3% buněk s porušenou cytoplasmatickou membránou a ~ 10% depolarizovaných buněk) v porovnání s kultivacemi na samotném methanolu (~8% buněk obarvených PI and 21% značených BOX). Klára Michálková: α-N-Acetylgalactosaminidasa z Aspergillus niger: příprava enzymu, purifikace a použití (doc. Ing. Jan Masák, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Tato práce je zaměřena na fungální α-N-acetylgalaktosaminidasu z kmene Aspergillus niger CCIM K2, její produkci, purifikaci a použití v syntéze biologicky aktivních přírodních látek. Extracelulárně produkovaná α-N-acetylgalaktosaminidasa byla purifikovaná metodami ionexové chromatografie na silném katexu (Fractogel EMD SO3-), gelové filtrace (Superdex 20010/30GL) a chromatofokusace (Mono P 5/200). Purifikovaný enzym byl dále použit ke glykosylaci volných aminokyselin (Ser a Thr) a chráněných aminokyselin (Boc-Ser a Boc-Thr) za účelem syntézy biologicky a imunologicky aktivního Tn antigenu (GalNAc-α-O-Ser/Thr) a jeho Boc derivátů. Glykosylace chráněných aminokyselin byla úspěšná. V reakčních směsích chráněných aminokyselin byly nalezeny glykosylované chráněné aminokyseliny a také glykosylované volné aminokyseliny. Tyto produkty byly izolovány a charakterizovány dvěma metodami hmotnostní spektrometrie (MALDI-TOF, ESI). Tn antigenní látky GalNAc-α-O-Ser a GalNAc-α-O-Thr a jejich deriváty 11
GalNAc-α-O-Boc-Ser a GalNAc-α-O-Boc-Thr byly potvrzeny. Molární výtěžky glykosylace se pohybovaly mezi 3,1 a 7,9 %, což je srovnatelný výsledek s dříve publikovanými enzymovými syntézami Tn antigenu. α-N-Acetylgalactosaminidase from Aspergillus niger: production, purification and using of the enzyme This work is focused on fungal α-N-acetylgalactosaminidase from Aspergillus niger CCIM K2, its production, purification and its use in synthesis of biologically active compounds. Extracellularly produced α-N-acetylgalactosaminidase was purified using the methods of ionexchange chromatography on a strong cation exchanger (Fractogel EMD SO3-), gel filtration (Superdex 20010/30GL) and chromatofocusing (Mono P 5/200). The purified enzyme was further used for glycosylation of free amino acids (Ser and Thr) and protected amino acids (Boc-Ser and Boc-Thr) in order to synthesise biologically and immunologically active Tn antigen (GalNAc-α-O-Ser/Thr) and its Boc derivates. Glycosylation of protected amino acid was successful. In reaction mixtures of protected amino acids, glycosylated protected amino acids as well as glycosylated free amino acids were detected. The products were isolated and characterised by two methods of mass spectrometry (MALDI-TOF, ESI). Tn antigens, GalNAc-α-O-Ser and GalNAc-α-O-Thr, and their derivates, GalNAc-α-O-Boc-Ser and GalNAc-α-O-Boc-Thr, have been confirmed. Molar yields of the products were between 3.1 and 7.9%, which is comparable to the enzymatic synthesis of Tn antigen published before. Jan Petříček: Vliv kyslíku na analytické parametry révových vín (Ing. Jaromír Fiala, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Víno je složeno z mnoha chemických látek. Mezi nejvýznamnější složky ve víně patří polyfenoly. Jejich množství a charakter je ovlivněn zpracováním hroznů a samotnou odrůdou. Během zrání a stárnutí vína dochází ke značným změnám s ohledem na složení polyfenolů, které ovlivňují chuť a barvu vína. Významné jsou také jejich antioxidační vlastnosti, které v průběhu výroby víno chrání před negativním vlivem kyslíku. Měření sledovalo vliv odkalovací technologie na koncentraci polyfenolů ve víně. Dále byl sledován rozdíl koncentrace polyfenolů mezi vínem v tanku na sklepě a vínem v láhvi, které během výroby přijalo určité množství kyslíku. Stanovení obsahu celkových polyfenolů bylo provedeno spektrofotometrickou metodou s Folin-Ciocalteuovým činidlem. Pro lepší stanovení jednotlivých polyfenolů bylo použito SPE k jejich zakoncentrování. Dále byly jednotlivé polyfenoly kvantifikovány metodou HPLC s DAD detekcí. Hodnoty rozpuštěného kyslíku byly stanoveny pomocí měřiče kyslíku a teploty TYP MKT 44A. Z naměřených výsledků vyplývá, že při změně odkalení ze sedimentace na flotaci koncentrace polyfenolů dosahuje vyšších hodnot. Získané složení polyfenolů se dále vyvíjí poklesem hodnot během výroby a zrání vína díky příjmu kyslíku. Influence of oxygen to analytical parameters of grape wines Wine is a complex of many different chemical substances. Phenols are one of the most important ingrediences. The quantity and character phenols can be controlled during the selection of the grapes. Maturation and aging of wine leads to its significant changes witch can be observed in the change of the composition of phenols. This affects the taste and the color of wine. Antioxidant properties are also very important which protects wine against the negative influence of oxygen.
12
Monitoring of phenols was carried out under different circumstances. It was also important to monitor differences between wine in the vessel (the cellar) and wine in the bottle, from which was taken away some oxygen during period of the production. Determination of total phenols was carried out under the use of the spectrophotometric method with Folin-Ciocalteuov agent. For better results of individual phenols was used SPE. In addition, individual phenols were quantified by HPLC with DAD detection. Values of dissolved oxygen are determined by measuring oxygen and temperature MKT TYPE 44A. From the measured results show that clariffication of flotation have higher values phenols than sedimentation. The composition of polyphenols are evolving decrease in their values during production and aging of wine due to oxygen intake. Lucie Piecková: Genetická a fyziologická charakterizace solventogenních bakterií rodu Clostridium (Dr. Ing. Petra Patáková, ÚKCHB VŠCHT Praha) Cílem této práce bylo porovnání vlastností a příbuznosti 11 kmenů rodu Clostridium schopných produkce rozpouštědel, zahrnujících druhy C. acetobutylicum, C. saccharoperbutylacetonium, C. saccharobutylicum, C. beijerinckii, C. pasteurianum a C. tetanomorphum. Srovnání fenotypových vlastností probíhalo především prostřednictvím biochemických testů. Zjišťována byla schopnost fermentovat osm druhů sacharidů (laktosu, sacharosu, celobiosu, arabinosy, galaktosu, manosu, xylosu a glukosu) v bezcukerném TYA mediu s přídavkem diagnostického disku napuštěného roztokem příslušného cukru. Dále byla testována přítomnost katalasy, utilizace škrobu, hydrolýza kaseinu, ztekucení želatiny a tvorba slizových pouzder. Ke zjištění příbuznosti byla využita srovnávací sekvenční analýza části genu kódujícího 16S rRNA. Sekvenace byla provedena od pozice 359 do 1521, číslováno podle E. coli. Po porovnání získaných sekvencí s dvěma mezinárodními databázemi byla zjištěna 100 % shoda v daných sekvencích u pěti kmenů. Kvůli značné míře příbuznosti 16S rRNA sekvencí se tak přikročilo k analýze úseků tzv. mezerníku jehož geny leží mezi úseky kódujícími 16S a 23S rRNA. Tento postup však bude třeba ještě optimalizovat. Genetic and physiological characterization of genus Clostridium solventogenic bakteria The aim of this diploma thesis was to compare properties and to find relatedness of 11 strains of solventogenic clostridia comprising species C. acetobutylicum, C. beijerinckii C. saccharoperbutylacetonium, C. saccharobutylicum, C. pasteurianum and C. tetanomorphum Biochemical tests determined main phenotypic characteristics of the strains. To assign ability to ferment eight different kinds of saccharides (lactose, saccharose, cellobiose, arabinose, galactose, mannose and glucose), TYA medium without saccharidic source with added carbohydrates differentiation discs was used. Further starch and casein hydrolyses, presence of catalase, gelatin liquefying and capsule formation were tested. To determine phylogenetic relations among tested species and strains, 16S rRNA gene sequence analysis was used; DNA from position 359 to 1521 (E. coli numbering) was sequenced and the gained sequences were compared with two international databases. The gene sequence of five strains was 100 % identical, therefore 16S-23S rRNA spacer region was examined in similar way. However, this procedure needs further optimization. Pavlína Pohludková: Izolace butanolu z medií po ABE, fermentaci, integrované systémy (prof. Ing. Karel Melzoch, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Aceton butanol ethanolová (ABE) fermentace rodu Clostridium se v současné době dostává do popředí díky možnosti využití butanolu jako alternativního paliva. 13
Mezi největší problémy ABE fermentace patří inhibice růstu a množení buněk vznikajícími rozpouštědly, která významně snižuje jejich finální koncentraci a celkovou produktivitu systému. Jako řešení se nabízí využití in situ separace vznikajících rozpouštědel v průběhu fermentace v integrovaných systémech. V této diplomové práci byly k separaci rozpouštědel z modelových směsí a reálných médií po fermentaci používány metody stripování plynem a extrakce do organických rozpouštědel. Cílem práce bylo vyvinout optimální metodu těchto separačních technik, kterou by bylo možné použít v integraci s ABE fermentací. V případě metody stripování plynem byla jako optimální zvolena metoda s recyklem plynu s rychlostí průtoku plynu 1,5 VVM a dobou stripování minimálně 24 h. V případě extrakce rozpouštědel je optimálním extrakčním činidlem oleylalkohol s výtěžností extrakce butanolu 85 %. Butanol isolation from broth after ABE fermentation, integrated systems The acetone butanol ethanol (ABE) fermentation process by Clostridium is of interest for production of fuels from renewable resources. Unfortunately, economical production of butanol by fermentation is hampered by end-product inhibition and uneconomical product recovery. One of the most critical problems in ABE fermentation is solvent toxicity which results in low final solvent concentration (usually less than 20 g/l) and productivity. To solve these problems, in situ recovery systems (integrated systems) have been employed. In this diploma thesis, liquid-liquid extraction and gas stripping have been used for solvent separation from model solutions and fermented medias. The aim of this work was to develop an optimal method of extraction and gas stripping which could be integrated with ABE fermentation. In case of the first method, gas stripping, the optimal method has following parameters: system with gas recycle, gas flow rate 1,5 VVM and a period longer than 24 h. In case of extraction, oleyl alcohol has been chosen as an optimal extractant because of its yield of butanol which amounts 85 %. Miriam Polová: Studium enzymů vybraných mikroorganismů štěpících fenolové sloučeniny (doc. Ing. Jan Masák, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Mezi časté polutanty životního prostředí patří fenol a jeho deriváty. Jednou z možností jeho odstranění je aplikace bioremediačních technologií za využití bakterie Rhodococcus erythropolis. Tato bakterie je schopna utilizovat fenol jako jediný zdroj uhlíku a energie. V předložené diplomové práci byla zkoumána změna aktivity fenolhydroxylasy, klíčového enzymu degradační dráhy fenolu, u bakterie Rhodococcus erythropolis CCM 2595 v závislosti na kultivačních podmínkách a fázi růstu. Aktivita fenolhydroxylasy byla zkoumána v exponenciální a stacionární fázi růstu na třech různých substrátech: fenolu, glukose a sukcinátu. Dále byl hledán vztah mezi kultivačními podmínkami a zastoupením intracelulárních proteinů u této bakterie a byly podniknuty první kroky v izolaci a purifikaci fenolhydroxylasy. Bližší poznání vlastností čistého enzymu je jednou z cest ke zvýšení efektivity degradačního procesu. The study of phenol degrading enzymes in selected microorganisms Phenol and its derivatives belongs to frequent environmental pollutants. One of the possibilities to remove it is the application of bioremediation technologies using the 14
Rhodococcus erythropolis strain. This bacteria is able to grow on phenol as a sole carbon and energy source. In this diploma thesis the changes in activity of phenol hydroxylase, which is an important enzyme in the phenol degradation pathway, depending on cultivation conditions and phase of growth was studied. The activity was determined in cells grown on three different carbon sources (phenol, glucose and succinate) in the exponential and stationary phase. The relation between cultivation conditions and occurence of intracellular proteins was investigated and first steps of izolation and purification of phenolhydroxylase were undertaken. Closer recognition of pure enzyme characteristics is one of ways to increase the degradation processes. Dagmar Pospíšilová: Rod Rhodococcus a možnosti jeho využití v remediacích (prof. Ing. Alena Čejková, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) V této diplomové práci byly studovány dva kmeny bakterie rodu Rhodococcus (modifikovaný a adaptovaný Rhodococcus erythropolis) a efekt teploty na jejich růst a schopnost degradovat fenol. Hydrofobita buněčného povrchu má vliv na adhezivní vlastnosti buněk. Dalším úkolem bylo sledovat vliv změny teploty na hydrofobitu daných kmenů. Zajímavou charakteristikou povrchu buněk je zeta potenciál používaný jako doplňková informace k hydrofobitě. Zeta potenciál umožňuje určit hodnotu izoelektrického bodu bakterií, která poskytuje informace o složení bakteriálního povrchu, určujícího faktoru povrchových vlastností buněk. Byl také sledován vztah mezi hydrofobitou, isoelektrickým bodem a adhezí na hydrofobní a hydrofilní materiál. V této diplomové práci bylo zjištěno, že změny teploty výrazně ovlivňují růst buněk. Pokles teploty způsobuje snížení rychlosti růstu, pomalejší degradaci a také snížení hydrofobitu povrchu buněk. Pokles teploty má vliv také na zvýšení obsahu nenasycených mastných kyselin. Izoelektrický bod bakterií se nachází mezi 1,5-2,5. Tato hodnota může vypovídat o přítomnosti záporně nabitých funkčních skupin na buněčném povrchu, které mohou ovlivňovat adhezi. The genus Rhodococcus possibility of application in bioremediation technologies In this diploma thesis were studied two strains of Rhodococcus (a modified and adapted strain Rhodococcus erythropolis) and effect of temperature on their growth and abilities to degrade phenol. The hydrophobicity of cell surface has an influence on adhesive properties of cells. The other aim of this work was to study the effect of temperature change on hydrophobicity of given strains. Interesting characteristic of cell surface is a zeta potential used as complementary information to hydrophobicity. The zeta potential enables to estimate an isoelectric point of bacterial cells, which provides information of cell surface composition, determining factor of cell surface properties. The relationship between hydrophobicity, isoelectric point and adhesion to hydrophobic and hydrophilic material was studied too. In this diploma thesis was found that temperature changes have a notable effect on growth. The decrease of temperature implicate growth rate decrease, lower degradation and caused a decrease of cell surface hydrophobicity, too. The decrease of temperature induced an increase in unsatured fatty acids content. The isoelectric point of bacteria was found in a range between 1,5 and 2,5. This values indicate a presence of anionic functional group in cell surface, which could affect adhesion. Michal Šneberger: Zjišťování autenticity odrůd chmele podle obsahu chmelových silic a pryskyřic (Ing. Marcel Karabín, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) 15
Cílem diplomové práce bylo identifikovat vybrané tuzemské a zahraniční chmelové odrůdy na základě obsahu chmelových pryskyřic a silic a zjistit, zda na základě analýzy iso-α-hořkých kyselin ve vzorcích odebraných během výroby piva lze určit použitou chmelovou odrůdu. Na základě stanovení obsahů a relativního zastoupení jednotlivých chmelových silic a pryskyřic ve vzorcích chmele 7 tuzemských a 13 zahraničních odrůd byla určena řada významných identifikačních znaků charakteristických pro jednotlivé odrůdy. Dále byl zkoumán možný vliv vybraných parametrů (granulace, místo pěstování) na obsah chmelových pryskyřic a silic. Rozdíly v obsazích a zastoupení chmelových silic a pryskyřic mezi hlávkovými a granulovanými chmely téže odrůdy byly velmi nízké. Naproti tomu byly zjištěny dílčí rozdíly vyplývající z rozdílných pěstebních lokalit. Na základě získaných dat byla navržena metoda identifikace odrůd, která umožňuje v daném spektru vzorků identifikovat 15 z 20 stanovovaných odrůd. Determination of autenticity of hop varieties based on hop oils and resins content The goal of this diploma thesis was to identify chosen domestic and foreign hop varieties on the basis of a content of hop resins and hop oils and to find out, whether it is possible to determine used hop variety based on the iso-α-bitter acids analysis in samples obtained during the beer production. A number of significant identification signs characteristic for individual varieties was assigned based on the determination of contents and abundance of hop oils and resins in samples of 7 domestic and 13 foreign hop varieties. Further a possible impact of chosen parameters (granulation, silvicultural place) on the content of hop resins and hop oils was examined. Differences in the contents of hop resins and hop oils between hop cones and hop pellets of the same variety were very low. On the other hand there were ascertained partial differences sequent upon different silvicultural localities. A method of identification of hop varieties was designed based on the gained data. This method allows identifying 15 out of 20 analysed varieties. used for its production. Aneta Sajdová: Použití genových manipulací pro studium procesů stárnutí u kvasinek (prof. Ing. Alena Čejková, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) V této diplomové práci jsou popsány dvě cesty vedoucí k přípravě nových kvasinkových kmenů ∆ fob1 RAS2val19 a ∆ fob1 RAS2+, se kterými měl být proveden soubor analys využívaných pro popis procesů stárnutí a apoptosy. K tomuto účelu byly k dispozici dva výchozí plasmidy – pCB6 a pCB3. Při práci s plasmidem pCB6 byl využit antibiotický selekční znak – gen kanamycinové resistence. Při práci s pCB3 byl využit auxotrofní selekční znak – URA3 gen. Plasmid pCB3 sloužil jako výchozí složka k získání konstruktu nesoucího fragment FOB1 genu jehož ORF sekvence byla nahrazena URA3 genem. V diplomové práci bylo použito několik typů paralelních metodik, jejichž výsledky byly porovnávány. Získané poznatky vedly k upřesnění jednotlivých metodik a doplnění informací, např. při práci s genem kanamycinové resistence je nutno pro kvasinky použít antibiotikum Geneticin; metodiku transformace lithium-acetátovým způsobem je nutno rozšířit o postkultivaci kvasinek. Základní otázka projektu – jestli a jak delece FOB1 genu ovlivní přítomnost ERC v mladých buňkách kmene nebyla zodpovězena, protože požadované kmeny se nepodařilo získat. The use of gene manipulation in the study of yeast aging
16
Two ways leading to the new yeast strains ∆ fob1 RAS2val19 a ∆ fob1 RAS2+ obtainment have been described in this diploma thesis. These yeast strains should have been used for analysing the process of aging and apoptosis. Two plasmids were applied for this purpose – pCB6 and pCB3. While operating with pCB6 the antibiotic resistance marker – the kanamycin resistance gene was used. When tampered with pCB3 the auxotrophic marker – URA3 gene was used. The plasmid pCB3 was the basic component necessary for the vector construction carrying fragment with FOB1 gene ORF deletion and substitution with URA3 gene. Several types of paralel protocols were applied and results have been compared. Findings obtained in experiments led to corrections in particular protocols and information complementations. For example while using the kanamycin resistance gene for yeast selection, the Geneticin must be used; and the lithium – acetate transformation technic must be extended by yeast postcultivation. The basic project question, whether and how does the FOB1 deletion influences the ERCs presence in young cells wasn´t answered. The yeast strains were not obtained. Jan Skalický: Oxidativní stres a apoptóza u kvasinky Pichia pastoris (Ing. Barbora Branská, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Cílem této diplomové práce bylo ověření a optimalizace metodik detekce reaktivních kyslíkových částic (ROS) a sledování apoptózy u kvasinky Pichia pastoris s využitím selektivního fluorescenčního značení a následné mikroskopické a cytometrické analýzy. První část práce byla zaměřena na nalezení podmínek oxidativního stresu a zavedení metodik detekce ROS pomocí vybraných fluorescenčních sond (2´,7´-dichlorodihydrofluorescein diacetátu, dihydroethidia a dihydrorhodaminu 123). Oxidativní stres byl u buněk vyvoláván přídavkem různých koncentrací peroxidu vodíku. Nejprve byly nalezeny podmínky účinně vyvolávající oxidativní stres bez usmrcení buněk (0,1 mol.l-1 H2O2 působící na buňky v exponenciální fázi růstu po dobu 1 hodiny), které byly následně použity k proměření závislosti fluorescenční odezvy na čase inkubace a koncentraci přidaných sond. Na základě získaných dat byl stanoven interval značení na 15 minut a koncentrace přidaného barviva 10 μg.ml-1 pro všechny testované fluorescenční sondy. Ve druhé části byla sledována akumulace ROS v průběhu kultivací na různých uhlíkatých substrátech; konkrétně glukose, glycerolu a methanolu. Zatímco v exponenciální fázi růstu byly na jednotlivých substrátech naměřené rozdíly v intracelulární koncentraci reaktivních kyslíkových částic nevýznamné, ve stacionární fázi růstu bylo možné pozorovat zvýšení fluorescenční odezvy zejména u buněk rostoucích na methanolu. Třetí část práce byla věnována detekci apoptózy, kdy byly apoptické buňky značeny annexinem V-FITC na základě externalizace fosfatidylserinu na vnější stranu cytoplazmatické membrány, zatímco nekrotické buňky s porušenými membránami byly značeny propidium jodidem. Ke zpřístupnění cytoplazmatické membrány musely být nejprve připraveny protoplasty enzymatickým odstraněním buněčné stěny pomocí lytikasy. Optimalizace množství lytikasy a doby jejího působení byla provedena na základě spektrofotometrické a mikroskopické kontroly. V závěru byly zavedené metodiky využity ke sledování akumulace ROS a jejich vlivu na indukci apoptózy v průběhu vsádkových kultivací, přičemž byl potvrzen vliv stárnutí populace na akumulaci ROS a indukci apoptózy. Akumulaci ROS bylo možné sledovat od 2 týdne kultivace, první buňky značené annexinem V-FITC byly pozorovány u 3 týdny staré kultury. Oxidative stress and apoptosis in yeast Pichia pastoris 17
The aim of this diploma thesis was to verify and optimise methods used for detection of reactive oxygen species (ROS) and their accumulation in intracellular space of the yeast Pichia pastoris using selective fluorescent probes and subsequent flow cytometry analysis. Furthermore apoptosis in this yeast induced by the oxidative stress was also monitored. The first part of this work was focused on finding conditions causing oxidative stress and on the implementation of methods used for detection of ROS by fluorescent staining. As fluorescent probes 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, hydroethidine and dihydrorhodamine 123 were applied. Oxidative stress was induced by the addition of hydrogen peroxide therefore conditions effectively initiating oxidative stress without cell death had to be firstly found. Optimal conditions triggering oxidative stress seemed to be the concentration 0,1 mol.l-1 H2O2 applied on cells for a period of 1 hour. On the basis of these findings the optimization of staining conditions for each probe was made (10 μg.ml-1 for 15 min). In the second part the accumulation of ROS during cultivations on various carbon substrates was monitored when glucose, glycerol or methanol were used as the only source of carbon and energy. While in exponential phase of growth insignificant differences in intracellular concentration of ROS on individual substrates were measured, in stationary phase of growth the increasing fluorescent response was detected; especially in culture growing on methanol. The third part of work was dedicated to detection of apoptosis induced by oxidative stress. Apoptic cells were identified by annexin V-FITC staining on grounds of the exposure of phosphatidylserine to the outer leaflet of the plasma membrane while dead and damaged cells were signalised by propidium iodide. To access the plasma membrane for annexin V-FITC cell wall was firstly removed by the enzyme lyticase. Optimization of protoplasts preparation was made on the grounds of spectrophotometric and microscopic control. In conclusion the established methods for monitoring of accumulation of ROS in P. pastoris were applied. Moreover the influence of ROS on induction of apoptosis in batch cultivations was assessed whereas the influence of aging in yeast on accumulation of ROS and induction of apoptosis was confirmed. Since the second week of cultivation the accumulation of ROS was detected while first cells stained by annexin V-FITC in the third week of cultivation were observed. Radka Špačková: Biologická degradace nitrátesterů (Ing. Martin Halecký, Ph.D., ÚKCHB VŠCHT Praha) Zaměřením této práce je popis biodegradace nitrátesterů glycerol trinitrátu (GTN) a etylenglykol dinitrátu (EGDN). První část je zaměřena na metodiku analýzy nitrátesterů, která se ukázala být zásadním problémem při popisu degradačních vlastností GTN. V této kapitole se pojednává o problematické rozpustnosti GTN, o interakcích GTN s některými plastovými a jinými materiály a následky těchto jevů na průběh kvantitativní analýzy GTN i EGDN. Výsledkem je vypracování metodiky analýzy těchto nitrátesterů. Druhá část se zabývá biodegradačními testy GTN a EGDN, kdy byla použita směsná mikrobiální populace pocházející z odpadní vody a půdy areálu společnosti Explosia a.s. Byly popsány hlavní aspekty ovlivňující průběh degradace v submersní kultivaci, jako vliv vstupní koncentrace nitrátesterů, pH a vliv různých kosubstrátů. Biodegradace GTN byla popsána i pro případ, kdy GTN sloužil jako jediný zdroj energie, uhlíku, a dusíku. U EGDN bylo zjištěno, že není využíván jako primární substrát a byla studována biodegradace EGDN za přídavku glycerolu nebo pyruvátu. Biofiltrace GTN byla studována také v náplňovém reaktoru v batch nebo kontinuálním uspořádání.
18
Biological degradation nitrátesterů The ame of this study is basic characterization of biodegradation of nitrate esters: glycerol trinitrate (GTN) and ethylene glykol dinitrate (EGDN). The first part is focused on nitrate esters analysis methodology, which has shown to be a fundamental problem of description of degradation properties GTN. The problematic solubility of GTN, interactions of some plastic and other materials with GTN and consequences of this facts to quantitative analysis GTN and EGDN are treated in this chapter. The result of this study is an exact description of nitrate esters analysis methodology. The second part deals with GTN and EGDN biodegradation tests, where mixed microbial population was used. This population comes from waste-water and soil of Explosia a.s. company district. Main aspects influencing biodegradation in submerged cultivation (entrance concentrations of nitrate esters, pH, influence of cosubstrates) were described. Apart from EGDN, GTN can be used as the only source of energy, carbon and nitrogen. Biodegradation of GTN was studied in loading reactor in batch or continual arrangement too. Diep Tran Khac: Application of polyamide sorbents for improvement of beer colloidal stability (doc. Ing. Pavel Dostálek, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Insoluble polyamides were first used by Harriss and Ricketts in the late 1950s for beer stabilisation. These investigators showed that Nylon 66 effectively removes anthocyanidins from beer. However, practical use of nylons as a colloidal stability treatment agent has essentially been eliminated, because they cost too much. Therefore in 1960s nylon was replaced by cheaper PVPP. PVPP, which is an insoluble crosslinked form of PVP, represents the most frequently used stabiliser for removal of polyphenols nowadays. In 1980s the research of polyamides for brewing application was done at the Institute of Chemical Technology Prague, where several polyamide sorbents with excellent sorption activity were developed. Nowadays a new polyamide (PA) sorbent was developed. This sorbent is kieselguhr covered by a thin layer of poly-6-caprolactame. The sorbent is prepared by in solution polymerisation in the presence of kieselguhr. PVPP and PA were compared due to their sorption capacity for polyphenols in beer. Sorption capacity was also measured in model solutions (catechin in acetate buffer) and industrial scale. There was no principal difference in sorption capacity between PVPP and PA. However combination effect of PA and silicagel gave better colloidal stability than combination effect of PVPP and silicagel. Stabilized beers had longer real shelf-life while antioxidant power was preserved. Použití polyamidových sorbentů pro zvýšení koloidní stability piva Nerozpustné polyamidy byly poprvé použity Harrissem a Ricketsem pro stabilizaci piva koncem 50. let. Tito výzkumníci ukázali, že Nylon 66 efektivně odstraňuje anthokyanidiny z piva. Z důvodu vysoké ceny přestaly být nylony pro stabilizaci piva používány. V 60.letech byl nylon nahražen levnějším PVPP. PVPP, který je nerozpustná zesítěná forma PVP, představuje nejčastěji používaný stabilizační prostředek současnosti. V 80. letech byl proveden výzkum aplikace polyamidů v pivovarství na VŠCHT Praha, při kterém bylo vyvinuto několik polyamidových sorbentů s vynikajícími sorpčními schopnosti. V současné době byl vyvinut nový polyamidový sorbent. Tento sorbent je křemelina pokrytá tenkou vrstvičkou poly-6-kaprolaktamu. Tento sorbent je připraven polymerací v roztoku v přitomnosti křemeliny. PVPP a PA byly porovnány z hlediska jejich sorpční kapacity pro polyfenoly piva. Sorpční kapacita byla také měřena v modelových roztocích (katechin v octanovém pufru) a v průmyslovém měřítku. Není podstatný rozdíl v sorpční kapacitě PVPP a 19
PA. Nicméně při současném použití PA a silikagelu získáme pivo koloidně stabilnější než při použití PVPP a silikagelu. Stabilizovaná piva měla delší dobu reálné koloidní stability, zatímco jejich antioxidační kapacita byla lépe více zachována. Martin Valeš: Charakterizace lihovarských výpalků, jejich předúprava a následné biotechnologické zpracování (prof. Ing. Mojmír Rychtera, CSc., ÚKCHB VŠCHT Praha) Tato diplomová práce se zabývá analýzou lihovarských výpalků, vlivem použitých surovin a technologického postupu přípravy na jejich složení, možnosti předúpravy a následného biotechnologického zpracování upravených i neupravených výpalků pomocí anaerobní digesce. Jako hlavní parametry charakterizace řídkých výpalků byly zvoleny: CHSK, obsah sušiny a popelu, koncentrace minerálních látek a koncentrace glukózy, etanolu, glycerolu, kyseliny mléčné, jantarové a octové. V pevných fázích výpalků byl analyzován obsah sušiny, popelu, bílkovin a celulózy. Analyzované výpalky byly rozděleny na pevný a tekutý podíl. Pevný podíl byl upraven pomocí enzymové nebo kyselé hydrolýzy a oba spojené podíly byly použity pro anaerobní digesci. Bylo provedeno celkem pět experimentů, jedna semikontinuální kultivace a čtyři vsádkové kultivace (jedna z nich s úpravou pH během procesu). Pro všechny experimenty byla použita směsná termofilní anaerobní bakteriální populace ve formě aktivovaného kalu z termofilní čistírny odpadních vod. Nejlepších výsledků na upravených materiálech bylo dosaženo při použití přídavku enzymově upravené pevné fáze k řídkým výpalkům. Největšího snížení organické zátěže výpalků a nejvyšší produkce bioplynu bylo dosaženo při kultivaci s úpravou hodnot pH. Characterization of distillery stillage, its pretreatment and subsequent biotechnological processing This thesis is focused on analysis of distillery stillage, influence of used raw materials and technological process of preparation on its composition, possibilities of its pretreatment and subsequential processing of modified and raw stillage using anaerobic digestion. These characteristics of thin stillage were monitored: COD (chemical oxygen demand), solid and ash content, the concentration of minerals and the concentration of glucose, ethanol, glycerol, lactic acid, succinic acid and acetic acid. In solid phasis, there were monitored: the content of solids, ashes, proteins and celulose. Analyzed stillage was separated and the sediment was treated by either enzymatic or acid hydrolysis prior the use of stillage as a medium for anaerobic digestion. Five experiments were performed: one semi-continuous cultivation and four batch cultivations (one of them with pH control). For all experiments mixed thermofilic anaerobic bacterial population originating from activated sludge from thermofilic waste water treatment plant was used. The best results were achieved when enzymatically hydrolyzed solid phase was added into the thin stillage. The best values of organic load reduction and produced biogas were achieved in the cultivation with pH control.
20
