1
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta
Využití genové terapie pro léčbu virových onemocnění Bakalářská práce
Use gene therapy to treat viral diseases Bachelor thesis
Vedoucí práce:
Vypracoval: Brno
2
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma: Využití genové terapie pro léčbu virových onemocnění, vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana AF MZLU v Brně.
Dne …………………………. Podpis ……………………….
3
PODĚKOVÁNÍ Touto cestou bych velmi ráda poděkovala vedoucímu práce Ing. Liboru Stehlíkovi za odborné vedení, nespočet cenných rad, vstřícnost, ochotu při zpracování a čas, který si na mne byl ochoten udělat. Dále bych ráda poděkovala rodině za podporu a zázemí během studia, partnerovi za trpělivost a pohodu během vypracovávání práce a přátelům za shovívavost a veškerou pomoc, kterou mi při práci poskytli.
Jméno studenta:
4
Kristýna Veverková
Název bakalářské práce: Využití genové terapie pro léčbu virových onemocnění
ABSTRAKT: Tato bakalářská práce se zabývá inovační hypotézou s ohledem na nahlédnutí do genové terapie virových onemocnění, s rozšířeným rozborem a aplikací hypotézy na viru prasečí chřipky. Cílem práce je vyhledávat literaturu a její následné zpracování s vytyčením podstatných informací k zadanému tématu. Dále se práce skládá z detailního zaměření se na virus prasečí chřipky, jeho popisu, systematického zařazení a nejen aplikace, ale i jeho přizpůsobení se genové terapii pro léčbu tohoto virového onemocnění, a obdobného zaměření na T-lymfocyty. Výsledkem práce je inovační námět pro geneticky modifikovaný virus, který je v určitém mezistupni mezi virem prasečí chřipky a buňkou pro imunitní odpověď organismu prasete. Dále řádné zamyšlení a rozbor jednotlivých možností výsledků, u takto modifikovaného viru prasečí chřipky.
Klíčová slova : T-lymfocyty Modifikovaný virus Imunita Prasečí chřipka
5 Name of student: Kristýna Veverková
The title of work: Use gene therapy to treat viral diseases
Abstrakt: This work deals with innovative hypothesis with regard to access to the gene therapy of viral diseases, with an extended analysis and application of hypotheses on the swine flu virus. The goal of this work is to search the literature and its subsequent treatment with essential information to the specified topic. Furthermore, the work consists of a detailed focus on the swine flu virus, its description, and the systematic inclusion of not only applications but also its adaptation to gene therapy for treatment of viral diseases, and in the
same
way
focus
on
T-lymphocytes.
The result of this work is an innovative idea for a genetically modified virus, which is in some intermediate state between the swine flu virus and the cell immune response to pig body. Furthermore, proper consideration and analysis of various options for the results of this
modified
Key words : T-lymphocytes The modified virus Immunity Swine Flu
virus
of
swine
flu.
6
1 OBSAH
1 OBSAH ..................................................................................................................................................... 6 2 ÚVOD A CÍL ............................................................................................................................................. 7 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED ................................................................................................................................. 8 3.1 VIRY ...................................................................................................................................................... 8 3.2 VIRION .................................................................................................................................................. 8 4 PRŮBĚH VIROVÉ INFEKCE......................................................................................................................... 9 5.1 CHŘIPKA.............................................................................................................................................. 10 5.2 ORTOMYXOVIRY ................................................................................................................................. 11 6 PRASEČÍ CHŘIPKA................................................................................................................................... 13 6.1 VÝVOJ ................................................................................................................................................. 13 6.2 PRŮBĚH A PŘÍZNAKY NEMOCI U PRASAT: ........................................................................................... 14 6.3 GENETIKA PRASEČÍ CHŘIPKY: .............................................................................................................. 15 6.4 STRATEGIE VIRU PRASEČÍ CHŘIPKY ..................................................................................................... 16 7 EXPRESE GENŮ....................................................................................................................................... 16 8 ANTIGENNÍ ZVRAT U CHŘIPKY................................................................................................................ 18 9 PRINCIP GENETICKÉHO INŽENÝRSTVÍ ..................................................................................................... 20 10 IMUNITA .............................................................................................................................................. 21 10.1 SPECIFICKÁ IMUNITA......................................................................................................................... 21 10.2 KLONÁLNÍ SELEKCE............................................................................................................................ 23 10.3 EFEKTOVÉ BUŇKY :............................................................................................................................ 24 10.4 RECEPTORY B – LYMFOCYTŮ ............................................................................................................. 25 10.5 T BUŇKY : .......................................................................................................................................... 25 11 MATERIÁL, METODIKA: ........................................................................................................................ 27 12 VÝSLEDKY, DISKUSE.............................................................................................................................. 28 14 ZÁVĚR ................................................................................................................................................. 30 13 POUŽITÁ LITERATURA : ........................................................................................................................ 31
7
2 ÚVOD A CÍL Na počátku mého literárního přehledu se chci věnovat přiblížení pojmu virus, jako takový, dále jeho vlastnosti, klasifikace, princip množení a průběh napadení hostitele. V další části chci více představit chřipkové viry všeobecně, několik informací o větších oblastech jejich působení v historii a následné detailní zaměření se na virus prasečí chřipky H1N1. A, vzhledem k jeho působení na prasečí organismus, rozeberu i imunologickou odpověď se zaměřením na T-lymfocyty, které bude více objasněno v metodice a postupu při genové modifikaci viru. V metodice se budu věnovat vlastnímu inovačnímu námětu, jakým způsobem chci modifikovat a čím vším virus H1N1 tak, aby vznikl jedinečný virus na rozhraní viru RNA a imunologické buňky prasete. Tento nový virus bude i mým výsledkem a to z toho hlediska, že právě on bude i mým lékem na dané virové onemocnění, které se v dobách nedávných zasloužilo o nákazu pandemickou. Takže ve výsledcích užším způsobem rozeberu vlastnosti a předpoklady pro nový virus a jeho funkci v napadeném organismu. V diskusi budu svoji hypotézu konfrontovat s výsledky obdobných prací jiných autorů. A závěrem shrnu výsledky mojí práce s případným podnětem pro genové terapie virových onemocnění. Tato bakalářská práce má na základní úrovni shrnout dosavadní poznatky a informace o molekulárních mechanismech viru H1N1 a T-lymfocytů, s vyvrcholením prostřednictvím námětu na konkrétní vhodnou modifikaci viru H1N1.
8
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1 Viry Viry jsou nukleoproteinové částice, které řadíme díky jejich strukturním a organizačním schopnostem do skupiny hraniční mezi živé a neživé nebuněčné organismy. S živými organismy viry pojí to, že obsahují genetický kód pro vlastní replikaci. S neživými organismy je spojuje to, že postrádají aparát pro syntézu bílkovin a metabolický aparát. Jejich charakteristickou vlastností je schopnost vniknout do hostitelské buňky, tam se reprodukovat, dle jejího translačního systému, a tím se nechávají hostitelskou buňkou replikovat. Vzhledem k této strategii viry považujeme za nitrobuněčné parazity. Svým vnikem do organismu, ať rostlinného nebo živočišného, způsobují obrovské množství rozmanitých virových onemocnění. Jako ukazatel, který organismus se jednotlivé viry chystají napadnout, nám může sloužit jejich rozpoložení nukleové kyseliny. Díky němu, můžeme viry rozdělovat na RNA-viry, mezi které řadíme většinu rostlinných virů a DNAviry, které reprezentují viry živočišné. Jak už pojem „většina“ v předešlém naznačuje, ne všechny RNA-viry inklinují k napadání buněk rostlinných, ale jejich část také způsobuje mnohá virová onemocnění živočichům. Mezi taková onemocnění patří například chřipková onemocnění, vzteklina, AIDS a jiné. Je i vědecky prokázáno, že mnohé virové infekce lze řadit i mezi rizikové faktory pro vznik a rozvoj maligního bujení tkáně u živočichů. Lze tedy všeobecně říci, že ať už viry jako takové nebo i onemocnění, která způsobují, vyvolávají zájem mnoha oborů. Řadíme sem virologické výzkumy humánního a veterinárního lékařství, rostlinolékařství, imunologii, farmakologii, zoohygienu, ekologii a zemědělství. Virus prochází základním životním cyklem. Začíná při klidové formě mimo hostitelskou buňku v neživém prostředí – virion. Infikuje hostitelskou buňku a rozmnožuje se v ní. A opět jako virion, několikrát zmnožen, je po rozpadu buňky hostitelské uvolňován do prostředí. (JELÍNEK, ZICHÁČEK, 2005)
3.2 Virion Je to částice viru, schopná infikovat buňku a množit se v ní. Velikost virionů je 20 až 300nm. Uvnitř virionu se nachází nukleová kyselina ( ve formě DNA nebo RNA ).
9 Nukleová kyselina zde představuje funkci genoforu, nosiče genů, a u převážné většiny představuje celý genom viru. Ten může být buď ve struktuře lineární nebo cirkulární. U DNA virů převládá výskyt dvou komplementárních vláken, zatímco u RNA virů jediným vláken s positivní nebo negativní polaritou. V případě positivní polarity se zde jedná o informační RNA, kterou lze přímo překládat na ribozomech hostitelské buňky do příslušných polypeptidů. Pokud je přítomna negativní polarita, je pak RNA přepisována do informační podoby za pomoci RNA-polymerázy, která je součástí virionu. Vyskytují se i viry, které neobsahují genom souvislý, ale je nahrazen separátními segmenty. Okolo nukleové kyseliny je bílkovinný obal, který je obvykle značen jako kapsid. Skládá se z makromolekul bílkovin tzv. kapsomer. Struktura kapsidu je geometricky pravidelná. Některé viriony mají uvnitř kapsidu kromě nukleové kyseliny ještě jeden nebo několik enzymů, potřebných k zahájení své reprodukce uvnitř hostitelské buňky. Některé viriony mají okolo kapsidu ještě membránový obal, tvořený bílkovinami a fosfolipidy. Virové bílkoviny jsou vždy specifické a udělují viru antigenitu.(JELÍNEK, ZICHÁČEK, 2005)
4 Průběh virové infekce V počátku dochází k přilnutí viru na povrch buňky, což je specifický proces. Aby se virus mohl přichytit, musí mít hostitelská buňka na svém povrchu specifické receptory. Je to takzvaně buňka citlivá na daný virus. U viru je nositelem specifity, neboli antigenity, membránový obal a u virů bez obalu kapsid. Některé viry, převážně rostlinné, pronikají do buňky i nespecificky, cestou mechanickou. Kromě citlivosti k viru rozlišujeme ještě permitivitu buňky, což je schopnost buňky uskutečnit genetický program nukleové kyseliny viru po té, kdy vnikla do buňky. (JELÍNEK, ZICHÁČEK, 2005) Po vniknutí viru do buňky, buď vzniká jen nukleová kyselina, u bakteriofágů, nebo celý virus. V tomto případě je jeho membránový obal a kapsid rozložen hydrolytickými enzymy buňky. Podle genetických informací obsažených v nukleové kyselině viru se v hostitelské buňce začnou syntetizovat enzymy, z nichž jeden způsobí přímo rozpad chromozomu hostitelské buňky. Virová nukleová kyselina se replikuje. Okolo každé z nich se vytvoří ochranný kapsid. Hostitelská buňka praskne a viriony se uvolní do prostředí. (JELÍNEK, ZICHÁČEK, 2005) Nukleové kyseliny virů se někdy včleňují do chromozomu hostitelské buňky a stanou se její součástí. Tento virový chromozom je předáván dceřiným buňkám jako provirus. Za
10 určitých podmínek, může provirus udělit hostitelské buňce nové vlastnosti. Většinou se tato buňka stává buňkou nádorovou. (JELÍNEK, ZICHÁČEK, 2005)
5 Klasifikace virů Viry spadají do Říše Nebuněční (Subcellulata), taxonomicky jsou dále členěni do čeledí, rodů a jednotlivých druhů rodu. Viry v jedné čeledi mají simultánní typ nukleové kyseliny, uspořádání virionu a strategii replikace. Dle virového genomu rozdělujeme viry na DNA a RNA viry. Jako samostatnou skupinu rozeznáváme viry s RNA genomem schopné reverzní transkripce do DNA a integrace do hostitelského genomu. Nejčastěji se pak využívá Baltimorská klasifikace, která dělí živočišné viry do šesti tříd : • Třída I – viry s dvouvláknovou DNA, kdy mRNA je tvořena asymetrickou transkripcí • Třída II – viry s jednovláknovou DNA a stejnou polaritou jako výsledná mRNA • Třída III – viry s dvouvláknovou RNA, kdy mRNA je tvořena asymetrickou transkripcí • Třída IV – viry s jednovláknovou RNA, kdy vytvořená mRNA je identická s genomem • Třída V – viry s jednovláknovou RNA, kdy vytvořená mRNA je komplementární s genomem • Třída VI – retroviry s jednovláknovou RNA, ale v jejich rozmnožovacím cyklu je i stadium DNA Vzhledem k neustálým objevům nových virů, je taxonomická klasifikace virů poměrně živý proces. Proto přibližně jednou ročně vydává Mezinárodní komise pro klasifikaci virů (ICTV) taxonomický seznam známých virů.
5.1 CHŘIPKA Spousta lidí si klade otázku odkud se chřipka vlastně každý rok bere. Odpověď na tuto otázku zodpověděl tým vědců z University of Cambridge. Zdrojem každoročních chřipkových epidemií jsou země jihovýchodní a východní Asie. Vědcům se také podařilo zjistit, cestu po které nově vzniklý virus putuje. Chřipkové viry zrozené v jižní či jihovýchodní Asii doputují během šesti až devíti měsíců do Austrálie, Evropy či
11 Severní Ameriky. Za dalších pár měsíců se chřipka přestěhuje na jihoamerický kontinent. Do své asijské domoviny se už virus nikdy nevrátí. Do Evropy a Severní Ameriky virus obvykle přicestuje na palubách letadel. Jižní Amerika získává chřipku až importem z Evropy a Severní Ameriky. K místu zrodu nového typu chřipky předurčuje jižní a jihovýchodní Asii pestré spektrum klimatických podmínek na poměrně malém území. Vědci
také zjistili že rychlost šíření viru
neovlivňuje vzdálenost ale klimatické podmínky (PETR J., 2008). Rezervoárem viru influenzy A je vodní ptactvo, především divoké kachny. Virus způsobuje v tomto ptactvu bezpříznakové infekce, množí se v jejich střevech, je obsažen v jejich fekáliích a ve vodě znečištěné těmito fekáliemi (ROZSYPAL,2005)
5.2 Ortomyxoviry Kmeny viru chřipky se klasifikují do tří rodů čeledi Orthomyxoviridae. Tyto viry jsou charakteristické svojí sférickou nebo vláknitou strukturou o průměru 80 – 120nm. RNA se v této čeledi vyskytuje v helikoidální kapsidě. Nukleokapsida je obalena lipoproteinovou dvojvrstvou, která je zde z předešlé hostitelské buňky. Dále jsou pak charakteristické gp výběžky, které jsou zakotvené do proteinu M. Vyskytují se zde dva druhy povrchových antigenů chřipky – hemaglutinin a neuramidáza. Slabou stránkou těchto virů, je jejich citlivost na éter a tuková rozpouštědla.
Influenzavirus A způsobuje chřipku u člověka a onemocnění dýchacích cest u koní, ptáků a prasat. Influenzavirus B se vyskytuje jen u lidí, způsobuje chřipku. Influenzavirus C se vyskytuje jen u lidí a způsobuje chřipku v dětských kolektivech. Všechny kmeny viru rodu A mají společný nukleokapsidový antigen S, liší se původem, ekologii a hlavně typem antigenu H a N. Virus influenzy A (virus chřipky) patří mezi viry obalené, viriony jsou zhruba kulovitého tvaru. Genom tvoří osm segmentů negativní RNA. Jedním z produktů těchto segmentů jsou proteiny PB1, PB2 a PA tvoří komplex, který se vyznačuje aktivitou RNA-dependentní RNA-polymerázy čili RNA-replikázy. Dalším produktem segmentů je hemaglutinin HA membránový protein a hlavní povrchový antigen viru. Tímto proteinem se viriony viru chřipky vážou na hostitelskou buňku. Protein způsobuje fúzi viru s hostitelskou buňkou (ROZSYPAL,2005) Aktivní hemaglutinin je trimer tří proteinů vázající se na receptory, které jsou ukončeny kyselinou N-acetylneuraminovou (sialovou). Jsou to receptory málo specifické, a proto může virus infikovat buňky různého typu. Hemaglutinin jako takový zajišťuje vazbu viru
12 na receptory kyseliny sialové. Umožňuje vstup viru do buňky endocytózou a způsobuje fůzi virového obalu a endosomální membrány. Aby byla navozena fůze, musí být nejdříve hemaglutinin proteolyticky rozštěpen. Jeho dalším významným úkolem je jistým způsobem neutralizovat imunitní odpověď, jeho změny ve struktuře mají za následek vyhnutí se imunitní odpovědi. Místa hemaglutininu na které se vážou protilátky, podléhají častým mutacím, což je zdrojem nových antigenních subtypů chřipky. Je také zdrojem genetické variability tohoto viru a vzniku chřipkových pandemií vznikající průměrně po deseti letech. Neuramidináza je vedle hemaglutininu další důležitý antigen viru. Z receptoru odštěpuje kyselinu sialovou. Tato jeho aktivita se uplatňuje při uvolňování viru z buňky, kdy tím, že odštěpuje kyselinu sialovou z receptoru, umožňuje vytvořeným virionům uniknout před interakcí s receptory v membráně. Nukleoprotein je stavební 12psidový protein. Proteiny M1 a M2 tvoří obal pod lipidovou dvojvrstvou. Proteiny NS1 a NS2 se uplatňují při replikaci viru. Geny kódující neuramidázu a hemaglutinin mají vysokou mutační rychlost, takže není divu , že existuje čtrnáct subtypů hemaglutinin označovaných jako H1-H14 a devět subtypů N1-N9 neuramidázy (viz tabulka níže). Příslušnost k určitému suptypu je jedna z hlavních charakteristik kmenu chřipky (ROZSYPAL,2005)
Tabulka 1 ( Přehled jednotlivých jedinců pro subtyp hemaglutinů ) Subtyp Hemaglutininu
Člověk
Prase
H1
ano
ano
H2
ano
H3
ano
H4 H5
Kůň
Ptactvo ano ano
ano
ano
ano ano
ano
ano
13 H6
ano
H7
ano
ano
H8
ano ano
H9
ano
ano
ano
H10
ano
H11
ano
H12
ano
H13
ano
H14
ano
H15
ano
H16
ano
Subtypy Neuraminidasy
ČLOVĚK
N1
ano
N2
ano
N3
PRASE
KŮŇ
PTACTVO
ano
ano ano
ano
ano
N4
ano
N5
ano
N6
ano
N7
ano
ano
N8
ano
ano
N9
ano
6 Prasečí chřipka
6.1 Vývoj Tento virový patogen je u domácích prasat poměrně rozšířený, napadá dýchací trakt zvířat. Většinou se jedná o Influenzavirus A subtyp H1N1 (poprvé byl izolován v roce
14 1930), z dalších prasečích virů to mohou být subtypy H1N2, H3N1 nebo H3N2. Prasata mohou být nakažena i typickými ptačími chřipkovými viry A i některými lidskými chřipkovými viry. Opačným směrem tj. přenos prasečího viru na člověka se obvykle neděje. Někdy však viry překonají mezidruhovou bariéru a mohou vyvolat onemocnění v lidské populaci. Symptomy takového onemocnění bývají velmi podobné běžné sezónní chřipce. Některé infekce probíhají bez závažnějších příznaků a proto ani nebývají mnohdy rozeznány. Jiné mohou mít až fatální následky (PETR J., 2008) Na konci roku 2008 se objevil nový typ viru H1N1. První zprávy o přenosu na člověka pochází z poloviny března loňského roku, z oblasti Mexico City, kde se objevily případy pneumonie vyvolané právě tímto virem. K překonání mezidruhové bariéry Influenzaviru A subtypů H1N1 však nedošlo v historii lidstva poprvé. Například v roce 1988 v americkém státě Wisconsin, došlo k několikanásobné nákaze lidí prasečí chřipkou (viru H1N1). To potvrzují i studie amerických vědců.Tým vědců z atlantského Center for Disease Control and Prevention, analyzovali vzorky krve pacientů, odebrané během čtyřletého období (rok 2005-2009). Plná třetina lidí nad šedesát let měla v krvi protilátky, které reagují s virem „mexické“ chřipky. U dětí se tyto protilátky nenašli, stejně tak u skupiny osob 18-60 let věku se tyto protilátky nacházeli jen vzácně. Vysvětlením je skutečnost, že lidé starší šedesáti let se v minulosti s tímto virem již střetli.
6.2 Průběh a příznaky nemoci u prasat: Jedná se o akutní virové onemocnění dýchacího aparátu. Vůbec poprvé bylo objeveno v roce 1918 Koenem. Problematiku nákazy, imunitní reakce, způsobů přenosu a přežívání viru následně popsal Shop.
Tato nákaza se šíří hned několika cestami, jako jsou
kupříkladu : přímým kontaktem (ze zvířete na zvíře), aerogenně, lavinovitě a to zejména v období snížené přirozené imunity a to pod tlakem teplotního stresu ( obzvláště v přechodných ročních období ) a v porodních cyklech. Průběh je ve většině případech akutní, doba trvání je v rozsahu 4 – 6 dnů s morbiditou téměř 100% a mortalitou pohybující se okolo 3%. Tento virus má tendence k respirativnímu tropismu. Replikace viru probíhá v čichové sliznici, tonzilách, tracheji, bronchomízní uzliny a plicích. (ROZSYPAL,2005) Nejtypičtějším znakem onemocnění je charakteristický psí posed nebo nemocný kus leží s roztaženými předními končetinami opírajíc se o hrudní kost. Co se dalších příznaků týče,
15 běžně se zde vyskytuje neochota k pohybu, nechutenství, apatičnost, výtoky z očí a rypáku, namáhavé dýchaní, horečka a samic poruchy reprodukce a aborty.
6.3 Genetika prasečí chřipky: Genom viru chřipky je rozdělen do osmi segmentů negativní RNA. Některé segmenty obsahují více genů, které se překrývají.
1.segment RNA
PB1 757
Součást transkriptázového komplexu. Katalysuje adici nukleotidu.
2.segment RNA
PA 716
Součást transkriptázového komplexu.
3.segment RNA
PB2 759
Součást transkriptázového komplexu. Endonukleasa. Rozeznává cap hostitelských mRNAs
4.segment RNA
HA 566
Hemaglutinin, velký povrchový glykoprotein. Vazba prostřednictvím kys. křemičité, za nízkého pH fúze.
5.segment RNA
NP 498
Nukleokapsidový protein. Interakces mRNA segmenty. Účastní se spuštění syntézy templář a syntézy virionových RNA.
6.segment RNA
NA 454
Povrchový glykoprotein. Neuraminidasa.
7.segment RNA
M1 252
Matricový protein uvnitř lipidové dvojvrstvý virionu.
M2 97
Aktivita iontového kanálu.
NS1 230
Nestrukturální protein, inhibuje export poly(A)dmRNA
NS2 121
Zprostředkovává export ribonukleoproteinů z jádra buňky
8.segment RNA
Je-li hostitelská buňka infikována dvěma chřipkovými viry, které se navzájem geneticky liší, mohou přeskupením segmentům vzniknout 256 kombinací, které se proti rodičovským liší. Dále vir obsahuje polymerázy, nukleoprotein, matrixový protein a nestrukturální proteiny. Nukleoprotein má na starosti řízení replikace virové RNA v komplexu s PB2, PB1 a PA. Dále matricové proteiny řídí jednak transport virových ribonukleoproteinových komplexů do jádra a z jádra. A napomáhá zrání ribonukleoproteinového komplexu v plasmatické membráně během vlastní výstavby virionů. A pak fungují také jako iontový kanál, skrze který vstupují H+ do virionu, dojde tedy k disociaci matrixového proteinu nebo nukleoproteinu, což následně umožní ribonukleoproteinovému komplexu dostat se do jádra. Tím moduluje pH Golgiho aparátu a umožňuj molekulám Hematoglutininu, které jsou na kyselé prostředí citlivé, prostoupit buněčným povrchem neporušeně. Nestrukturální
16 proteiny mohou být buďto zapojené v jaderném exportu virových ribonukleoproteinovém komplexu nebo mohou vázat a oddělovat RNA a zabraňují buněčné apoptóze. Do každého virionu se musí dostat všech osm segmentů, ale může být vyměněn třetí segment za třetí segment nesoucí mutantní alelu určitého genu. Přeskupování segmentů je zdrojem vzniku nových kmenů virů chřipky, způsobující epidemie chřipky.
6.4 Strategie viru prasečí chřipky Vir prasečí chřipky a hostitelská buňka mají mezi sebou velmi specifický vztah. Infekčnost je omezena na jediný druh hostitele. V tomto případě je to podtrženo silnou vnímavostí T-lymfocytů prasete na vir prasečí chřipky. Tato vnímavost k virové infekci je dána přítomností vhodných receptorů na buněčném povrchu, které umožňují adsorpci a penetraci virionu do cytoplazmy. K samotnému množení viru v hostitelské buňce však dojde jen tehdy, pokud je buňka metabolicky vybavena k realizaci úplného replikačního cyklu. Celá strategie se skládá z několika stádií rozebraných níže. Počátečním krokem vlastní interakce viru s buňkou je adsorpce virionu na povrch buňky. Adsorpce do hostitelské buňky probíhá pomocí hemaglutininu a to skrze dva druhy receptorů a to jednak glykoproteinovými nebo gangliosidovými s kyselinou sialovou. Kyselina sialová je tedy nezbytnou složkou vnějších buněčných receptorů. V přírodě lze naleznout více než 40 derivátů této kyseliny. Dva hlavní druhy, které podmiňují molekulární mechanismus rozpoznávání receptoru chřipkovými viry, jsou 5-Nglykolylneuraminová kyselina a 5-N-acetylneuraminová kyselina. Tyto dva druhy se liší funkční skupinou na uhlíku C5. Po navázání chřipkového viru následuje endocytóza kdy při nízkém pH se v endosomu pak uvolní nukleokapsid, ze kterého putuje virální DNA do jádra hostitelské buňky a zde ji přepisuje. ( Obr.2.)
7 Exprese genů Segmentovaná negativní RNA, kterou byla buňka infikována, přepíše RNA-dependentíRNA-polymerazou do pozitivní RNA, která působí jako mRNA, dále do pozitivní RNA, která působí jako matrice pro replikaci do negativní RNA. Tento děj se označuje jako první transkripce. Molekula RNA-dependentí-RNA-polymerázy je obsažen ve virioneh, takže
17 tato transkripce může proběhnout nezávisle na hostitelské buňce, která ostatně tento enzym nemá. Pozitivní RNA ve funkci mRNA , obvykle obsahuje jeden gen. Proteiny vznikle překladem mRNA z první transkripce se využije k replikaci pozitivní RNA do negativní a ke druhé transkripci, kterou opět vzniká mRNA překládaná do všech kódovaných proteinů. Molekulární mechanismy měnící genetickou informaci Genetická informace se mění mutacemi, rekombinacemi a transpozicemi. Všechny uvedené typy změn jsou dědičné. Mutace se vyskytují ve všech genech a setkáváme se s nimi u všech živých organismů. Jsou to dědičné změny genotypu jejíchž podstatou jsou substituce, delece nebo inzerce. Jsou zdrojem nové genetické variability, která umožňuje adaptaci organizmů na změny životního prostředí (SNUSTAD D.P.,SIMMONS M.J., 2009).Nukleotidová substituce probíhá dvěma způsoby, transicí a trasverzí. Při transici se vyměňuje purinový nukleotid za purinový nukleotid případně pyrimidový nukleotid za pyrimidový nukleotid. Při transverzi je výměna purinového nukleotidu za pyramidový nukleotid a naopak. Ve strukturních genech může vést substituce ke změně smyslu kodonu, nebo ke vzniku terminačního kodonu. Delece je ztráta jednoho nebo více nukleotidů s nukleotidové sekvence. Inzerce je naopak vložení
jednoho nebo více
nukleotidů s nukleotidové sekvence (ROZSYPAL,2005) Mutace dělíme na spontánní a indukované. Jako spontánní mutace označujeme ty, které vznikají bez zjevných vnějších příčin. Indukované mutace jsou pak takové mutace, které vznikají v organizmech po působení fyzikálních a chemických látek s mutagenním účinkem tj. navozujících změny v DNA nebo RNA (SNUSTAD D.P.,SIMMONS M.J., 2009). Geny se mutacemi mění na různé mutantní formy, které je nutno rozlišovat od jejich výchozích forem před mutacemi. Alela příslušného genu převládající v přírodní populaci se nazývá standardní. Standardní alela obvykle kóduje funkční polypeptid nebo se přepisuje do funkční RNA. Od ní se odvozuje mutantní alela. Lze rovněž rozlišit mutace které se odrazí na fenotypu a ty které se na fenotypu neprojeví tzv. tiché mutace. Mutace které se odráží na fenotypu organizmu, jsou způsobené mutační alelou, která je funkční jen částečně nebo vůbec. Tichá mutace spočívá ve změně kodonu, která se neprojevuje ve funkci polypeptidového řetězce. Jejich základem může být buď změna kodonu pro určitou aminokyselinu v jiný kodon stejného smyslu. Tuto změnu nazýváme nukleotidové synonymní mutace. Nebo substituce nukleotidu, při které dochází ke změně smyslu kodonu neprojevující se ve funkci kódovaného polypeptového řetězce (ROZSYPAL,2005).
18 Mutace je reverzibilní proces. Rozlišujeme několik typů reverzí. Pravá reverze spočívá v úplné obnově mutované nukleotidové sekvence na původní. Při této reverzi se mutantní genotyp úplně vrací ke standardnímu. Tento jev je charakteristický pro tzv. bodové mutace. Jako bodové označujeme mutace spočívající v substituci jednoho nukleotidu nebo jednoho nukleotidového páru. Operační reverze spočívá ve zpětné mutaci, kterou se v mutantní alele strukturního genu kodon, změněný původní mutací, změní v kodon, který je synonymní s původním kodonem, a obnovuje proto funkci polypeptidového řetězce kódovaného touto alelou. Při operační reverzní se obnovuje genetická informace ve standartní alele jinou formou jejího zápisu. Pseudoreverze spočívá ve zpětné mutaci, kterou se v mutantní alele kodon změněný původní mutací změní v kodon, který obnovuje funkci polypeptidového řetězce kódovaného touto alelou, přestože má jiný smysl než původní kodon. Určité místo polypeptidového řetězce může být obsazeno různými aminokyselinami, aniž se mění jeho biologická funkce. Proto na tomto místě některé aminokyseliny při reverzi navozují buď částečně nebo úplně biologickou funkci polypeptidu, což vede k částečnému , nebo úplnému návratu mutantního fenotypu na standardní (ROZSYPAL,2005).
Dalším způsobem jak může dojít k změně genetické informace je rekombinace (crossingover). V roce 1931 Harriet Creightonová a barbara McClintocková prokázaly že genetická informace souvisí s fyzickou výměnou mezi chromozomy. Rekombinací je tudíž novou kombinací nukleotidových sekvencí ve vazbové skupině, která je způsobená crossingoverem. Jako crossing over se označují výměna nukleotidových sekvencí mezi dvěma homologickými molekulami DNA, probíhající zlomem a znovuspojením (SNUSTAD D.P.,SIMMONS M.J., 2009). Transkripce je složitý, enzymaticky katalyzovaný a autoregulovaný proces, při kterém se genetická
informace,
obsažená
ve
formě
lineárně
uspořádané
sekvence
deoxyribonukleotidu v určitém úseku DNA, přepíše do komplementární lineárně uspořádané sekvence ribonukleotidu, označované jako mediátorová RNA(mRNA), resp. primární transkript (IPSER J., 2006)
8 Antigenní zvrat u chřipky Je náhlá a zásadní změna v antigenních vlastnostech viru, která je výsledkem přeskupení mezi segmentovanými genomy viru stejného druhu, které se liší v antigenních vlastnostech. To má v lidské populaci nejdříve za následek, že není připravena
19 imunologicky rozeznat nový antigenní typ a virus má pak volnou cestu k svému šíření. Jestliže je hostitelská buňka infikována dvěma viry, které se genetický liší může se přeskupením mezi dvěma segmentovanými osmicemi geonomu vytvořit 28 , tj. 256 nových kombinací. Téměř každá nová pandemie
chřipky byla vyvolaná virem influenzy A
vzniklým přeskupením geonomových segmentů. V historii se lidstvo střetlo hned s několika pandemiemi V roce 1918-1919 to byla pandemie španělské chřipky, kterou vyvolal virus s antigeny H1N1. Tato pandemie si vyžádala dvacet miliónu lidských životů. Virus byl přenesen do Evropy americkými vojáky z Kansasu.Virus H1N1 cirkuloval v lidské populaci až do roku 1957 kdy byl nahrazen novým subtypem
H2N2, který šířil pandemii asijské chřipky. V roce 1968
nastupuje virus Hong Kong s antigenem H3N2. V roce 1977 se o slovo z novu hlásí virus H1N1 způsobí pandemii ruské chřipky. Zatím co nástup asijské chřipky v roce 1957 a viru Hong Kong Hong H3N2 byl doprovázen rychlým vymizením předcházející virového kmene z lidské populace, cirkulují v ní poprvé dva virové kmeny současně H3N2 a H1N1 (ROZSYPAL,2005) Jak už bylo zmíněno, látkou
kterou se virus váže na hostitelskou buňku je
hemaglutinin, jenž snadno podléhá změnám. Vědci však objevili, na molekule hemaglutininu místo, které je překvapivě stabilní. Nachází se na „krčku“ hemaglutininu. „Hlavička“ této molekuly rozhoduje o navázání viru na lidské buňky a funguje i po poměrně rozsáhlých obměnách. „Krček“ sehrává klíčovou roli při vnášení dědičné informace viru do nakažené buňky a je na významnější změny velice háklivý. Tyto poznatky uveřejnil vědecký tým z Harvard Medical Schoul.S protilátkami účinnými proti širokému spektru chřipkových virů, přišli po sobě hned dva nezávislé vědecké týmy. První již zmíněný vědecký tým z Harvard Medical Schoul druhý pak ze Scripps Research Institute v americkém San Diegu. Práce obou týmů otevírá nové možnosti v boji proti chřipce. I přesto může výroba nových protilátek narazit na vážné potíže. Výroba protilátek není jednoduchá a jejich cena je proto vysoká. Pro obyvatele mnoha zemí by byly protilátky vzhledem k jejich ceně nedostižným luxusem (PETR J. 2009). Další nadějí v boji proti chřipkovým virům by mohl být nový lék tlumící přemrštěnou imunitní odpověď. Nová účinná substance nese označení OX40:Ig. Princip účinnosti nového léku je odvozen od molekuly nazývané OX40, která hraje specifickou úlohu při vzniku zánětu. V běžné situace, když na plicní tkáň zaútočí virus, aktivují se T-lymfocyty. Ty migrují do napadené tkáně kde reagují na napadení virem, současně ale také navozují
20 druhou fázi obrany imunitního systému proti mikrobům. Tato druhá fáze obrany bývá nazývána „cytokinový útok“. Toto útočné vyplavení cytokinů způsobuje zánět. Celý obraná reakce probíhá následovně. Po jednom až dvou dnech T-lymfocyty zvýší produkci látky, která dostala jméno OX40. Tato molekula dává T-lymfocytům signál, který způsobí, že T-lymfocyty obklopí nejrizikovější místo vstupu infekce do organismu – plicní tkáň a „přilepí“ se k ní a tak zde zůstávají přichyceny po dlouhou dobu. Mezitím přichází stále nové T-lymfocyty a ty rovněž navozují a prohlubují útok cytokinů. Další zvyšování hladiny cytokinů již ale mnohdy není pro organismus nezbytně nutné, navíc zhoršuje zánět. Nový lék, anglických vědců, působí tak, že se naváže na receptory T-lymfocytů a zabrání tak jejich aktivaci. Lék tak zastavuje příznaky chřipky. Než se však dostane na trh bude muset projít ještě řadou
testů. Zatím byli úspěšně provedeny testy na myších.
Výsledek u myší jimž byla látka podána byl fakt, že k popsaným symptomům vážného onemocnění nedošlo. Důležité pro budoucí praktické užití této léčby bylo také zjištění, že schopnost myší bránit se opakované infekci nebyla snížena (PAZDERA J.,2003).
9 Princip genetického inženýrství Genetické inženýrství je vědní obor zabývající se přirozeně nebo uměle vytvořenou změnou v DNA Patří sem veškeré techniky vedoucí k tvorbě geneticky pozměněných buněk nebo přímo celých organismů zásahem do jejich DNA. Výsledkem takového procesu jsou pak nově vzniklé modifikované genomy transgenních organismů, které by se za klasických přirozených podmínek v daném prostředí nemohly vyvinout. Nejobvyklejší metodou takového zásahu do DNA je genový knock-out. Je to metoda „výměny“ vyřazením dříve nežádoucího genu za pro nás důležitý cizí DNA segment.
Materiál, metodika Ve vlastním pokusu bych použila několik inaktivovaných virů H1N1 a prasečí TLymfocyty.
21 Izolovala bych RNA standardním způsobem od virů H1N1 a DA od T-Lymfocytů. Následně bych získané produkty smíchala a vložila společně s
Obrázek č. 1 ( genový knock-out ) Epidemiologie a imunologie,doplňkové učební texty k přednáškám,Sestavil MUDr. Jan Mareček Na počátku zásahu do DNA je nejprve třeba si identifikovat a izolovat gen, který z našeho hlediska nese onu zlepšující charakteristiku pro výsledný transgenní organismus. Modifikujeme daný izolovaný gen. Bez této modifikace by jsme nemuseli správně odhadnout, zda bude tato integrace a exprese genu úspěšná. Dále je třeba pozorně zvážit daného příjemce pro přenos genetického segmentu. A v téměř finální části se zabýváme jakou metodu pro danou změnu použijeme. Proto je vhodné si celý genetické segment určený k experimentu rozčlenit na marker, promotor, transgen a terminační sekvenci. Marker gen vládáme z důvodu zpětné identifikace o úspěšném nebo neúspěšném včlenění transgenu. K promotu je přidána jeho sekvence, jejíž hlavní rolí je správná exprese genu ( překlad do proteinového produktu). Zatímco terminační sekvence, nás informuje o zakončení sekvence genu.
Obrázek číslo 2 ( Genetický segment )
10 IMUNITA
10.1 Specifická imunita Nejpodstatnější linie obrany specifické imunity z hlediska mojí práce je třetí, kterou reprezentují lymfocyty.Všeobecně lze říci, že jakmile se setká patogen s lymfocyty, rozběhne se v těle selektivní specifická imunitní odpověď proti tomuto konkrétnímu patogenu nebo cizorodé látce.Jakmile makrofág (nebo tzv. dendritická buňka) fagocytuje
22 mikroba, fagocyt začne vylučovat cytokiny, což jsou proteiny, které pomáhají aktivovat lymfocyty a další buňky imunitního systému. Pro lepší orientaci tímto typem imunity, bych ráda přiblížila několik základních pojmů. Existují dva druhy lymfocytů: T lymfocyty B lymfocyty,podobně jako makrofágy cirkulují oba typy lymfocytů v krvi a lymfě a jsou koncentrovány ve slezině, lymfatických uzlících a dalších lymfatických tkáních.Antigen = antibody generator = cizí molekula, vyvolávající specifickou imunitní odpověď (molekuly na povrchu virů, bakterií, prvoků, parazitických ploštěnců či hlístic, transplantovaných tkání, pyl, toxiny včelího bodnutí. Antibody = proteiny produkované B lymfocyty proti konkrétnímu antigenu.Antigenní receptory = membránové antibody = membránové imunoglobuliny = molekuly protilátek, které jsou navázány na povrchu B a T lymfocytů a které jsou schopny se navázat na konkrétní antigen.T lymfocyty mají imunoglobuliny navázané na povrchu svých buněk, ale na rozdíl od B lymfocytů je nikdy netvoří jako volné.
Obrázek číslo 3 (Imunoglobuliny na povrchu B buněk a T buněk Antigenní determinanty = epitopy) Imunologie,Jan Hájek 2005
Imunoglobuliny u B lymfocytů se umí navázat na volný antigen na povrchu patogenního organismu. Imunoglobuliny T lymfocytů se umí navázat pouze na antigen již „představený“ pomocí MHC komplexu. Jednotlivý B nebo T lymfocyt nese na svém povrchu asi 100 000 receptorů pro antigen, v jedné konkrétní buňce jsou všechny tyto receptory stejné lymfocyty jsou po diferenciaci připraveny se navázat k jakémukoli antigenu a reagují dokonce i na antigeny uměle vytvořené člověkem
jako všechny
23 krvinky, lymfocyty vznikají v kostní dřeni z kmenových buněk odtud se některé dostávají do thymu, kde dozrávají v T lymfocyty jiné zůstávají v kostní dřeni kde dozrávají v B lymfocyty.Vzhledem k tomu, že v lymfocytech živočišného těla je obrovská rozmanitost pro různé typy antigenů, pro jeden daný konkrétní patogen bude citlivá jen velmi malá část antigenních receptorů...jak je pak vůbec možné, že se antigenní receptor vůbec setká se „svým“ patogenem. ( J.HÁJEK, 2005 )
10.2 Klonální selekce Ačkoliv se mikroorganismus v těle setkává s mnoha B a T buňkami, naváže se pouze na lymfocyty, nesoucí na svém povrchu antigenní receptory, schopné se navázat k jejich antigenům tím podnítí B lymfocyt k tomu, aby se začal dělit a diferencovat nakonec se B lymfocyt diferencuje do dvou klonů buněk:Efektorové buňky - krátce žijící buňky, bojující s daným antigenem. Paměťové buňky - dlouho žijící buňky, nesoucí na svém povrchu receptor pro daný antigen.
Obrázek číslo 4 ( Kolonální Selekce ) ,Jan Hájek 2005
24
10.3 Efektové buňky :
Selektivní proliferace a diferenciace (množení a rozrůznění na efektorové a paměťové) lymfocytů, které nastávají po první setkáním se s antigenem se nazývá primární imunitní odpověď. Během této doby B buňky vytváří efektorové B buňky zvané plasmatické buňky (plasma cells) T buňky vytváří efektorové T buňky. Při sekundární odpovědi se navíc antigen váže na imunoglobuliny pevněji. Schopnost imunitního systému si pamatovat antigen a vytvořit sekundární odpověď je zvána imunitní paměť (immunological memory). Jako všechny krvinky, lymfocyty vznikají v kostní dřeni z kmenových buněk odtud se některé dostávají do thymu kde dozrávají v T lymfocyty jiné zůstávají v kostní dřeni, kde dozrávají v B lymfocyty. Zatímco u prasete je místem vývoje protilátkového repertoáru lymfatická tkáň střeva.
Nejprve vypadají všechny stejně, záleží na tom, kde bude jejich vývoj pokračovat. Lymfocyty, které migrují do brzlíku (thymus) se stanou T lymfocyty (Thymus) lymfocyty, které zůstanou v kostní dřeni se stanou B lymfocytyoba typy buněk kolují v krvi a lymfě.Oba typy buněk mají v plasmalemě až
100
000
antigenních
receptorů, které jsou pro jednu konkrétní buňku vždy stejné každý lymfocyt je tedy specifický pro jeden konkrétní antigen
25
Obrázek číslo 5 ( Migrace Lymfocytů )
10.4 Receptory B – lymfocytů Receptor má tvar písmene „Y“ nebo „T“ a sestává ze dvou identických těžkých řetězců a dvou identických lehkých řetězců, spojených disulfidickými můstky na obou koncích „Y“ jsou jak u lehkých tak i u těžkých řetězců variabilní (V) oblasti v těchto variabilních oblastech má každá buňka jiné složení aminokyselin. Každý receptor má tedy dvě identická, antigen-vázající místa. B – lymfocyty ale umí na rozdíl od T – lymfocytů i vylučovat volné proteiny, tzv. imunoglobuliny. Imunoglobuliny vypadají velmi podobně jako membránové receptory, pouze jim chybí oblast, kterou jsou zanořeny v membráně. Receptory B buněk jsou pro tuto podobnost někdy zvány jako membránové imunoglobuliny. Tyto receptory se sestávají ze dvou odlišných řetězců, zvaných α řetězec a β řetězec, které jsou spolu spojeny disulfidickými můstky na vnějším konci molekuly mají oba řetězce variabilní oblasti. Zatímco receptory na B buňkách jsou schopny poznat neporušený antigen, receptory T buněk umí rozpoznat malý kousek antigenu, který ale musí být navázán na membránovou bílkovinu normální buňky, tato bílkovina je zvaná MHC komplex.
10.5 T buňky : Existují dva hlavní typy T lymfocytů: cytotoxické T buňky (TC) a pomocné T buňky (TH)Cytotoxické T buňky reagují na glykoprotein MHC I.Pomocné T buňky reagují na glykoprotein MHC II.Zda T lymfocyty budou schopny odpovědět na patogen, závisí na schopnosti MHC glykoproteinu presentovat antigen.
26
Obrázek číslo 6 ( Reakce Tc a Th buněk ) Přehled imunopatologie, František Fakan,2004
Glykoproteiny MHC I. jsou téměř ve všech buňkách těla a presentují jako antigeny fragmenty proteinů bakterií či virů cytotoxickým T buňkám glykoproteiny třídy MHC II. se nachází pouze v několika buněčných typech, především se jedná o makrofágy dendritické buňky B buňky. Buňky těchto tří skupin se souhrnně označují jako APC buňky (Antigen Presenting Cells) APC buňky fagocytují bakterii či virus, zničí je a kusy jejich proteinů presentují pomocným T buňkám. MHC glykoproteiny mají rovněž rozhodující vliv na zrání T buněk v thymu, vyvíjející se T buňky reagují v brzlíku s okolními buňkami, které na sobě nesou jak MHC I. tak i MHC II. Maturity dosáhnou pouze ty T buňky, které jsou schopny vazby na MHC glykoproteiny. T buňky projevující afinitu k MHC I. se stanou cytotoxickými T buňkami, T buňky projevující afinitu k MHC II. se stanou pomocnými T buňkami. Pomocné T buňky se začnou bouřlivě dělit po presentaci antigenu. Antigen jim presentují většinou dendritické buňky, ale obecně z jakékoliv APC buněk vznikne klon pomocných T buněk, který se rozdělí na paměťové pomocné T buňky aktivované pomocné T buňky tyto vylučují cytokiny, které pomáhají v proliferaci B buňkám a cytotoxickým T buňkám. Po dobu svého zrání v kostní dřeni či thymu, antigenní receptory lymfocytů jsou testovány pro potenciální reaktivitu na buňky vlastního těla. Lymfocyty, které reagují na buňky vlastního těla, jsou buď učiněny nefunkčními, nebo je u nich navozena apoptóza. Tato schopnost odlišit vlastní buňky od cizích (self od non-self) se ještě rozvíjí, když lymfocyty migrují do lymfatických orgánů dospělý organismus tak nemá lymfocyty, které by reagovaly na komponenty vlastního těla. Dnes se odhaduje, že
27 v organismu je asi milion různých B buněk a asi 10 milionů odlišných T buněk proto je repertoár lymfocytů schopen odpovědět na virtuálně jakýkoli antigen.
11 MATERIÁL, METODIKA: Ve vlastním pokusu bych použila několik inaktivovaných virů H1N1 a prasečí T lymfocyty. Izolovala bych standardním způsobem od virů H1N1 DNA.Vzhledem k nestabilnímu potenciálu třetího segmentu bych aplikovala genový knock-out a jako transgen bych přidala přecitlivělost na methyparaben, což je účinná látka veterinárního léčiva Rometar 2%, který nemá žádné vedlejší účinky na prasata. Bohužel i nadále má tento segment vysoké tendence nestability, proto je třeba použít postreplikačního opravného mechanismu a pojistit tento třetí segment. Tento mechanismus ( mismatch repair ) je řízen metylací a dochází při něm k opravení chybného párování bází. Můžeme si to představit, jako druh pojistky dané replikační korektury, protože opravuje chybně zařazené nukleotidy, které zůstaly v DNA po replikaci. Tato pojistka rozpozná danou skutečnost na základě identifikace matricového řetězce,
28 který obsahuje původní nukleotidovou sekvenci, a nově syntetizovaného řetězce, který obsahuje chybně vloženou bázi. Je třeba si uvědomit, že po určitou dobu je matricový řetězec stylovaný, zatímco nově syntetizovaný řetězec je dosud nemetylovaný. Tento rozdíl v metylaci využívá systém opravy chybného párování, který z nově vzniklého řetězce vyštěpí nesprávně zařazený nukleotid a nahradí jej správným nukleotidem s využitím stylovaného řetězce DNA jako matrice. (SNUSTAD D.P.,SIMMONS M.J., 2009). Dále bych standardním způsobem izolovala z prasečích T lymfocytů DNA. Následně chyb takto získaný produkt s pozměněnou DNA viru H1N1 smíchala a vložila společně s glykoproteiny trimeru hemaglutininu ( HA) a tetrametrem neuraminidázy ( NA ) vložila do centrifugy. Tímto mi vznikne nový virus, který je bez receptorů inaktivní. Dále bych mu aplikovala na povrch receptory CD4 ( nachází se na povrchu T lymfocytů) a receptory M2 ( pomocní nich virus rozeznává sám sebe ). Vznikne nový aktivní virus v určitém stupni mezi hostitelskou buňkou a virem H1N1, takový aby ho jak buňka T lymfocytů, tak virus považoval za jednoho z vlastních.
12 VÝSLEDKY, DISKUSE Výsledkem mojí práce bylo po vytvoření inovačního námětu a jeho následná aplikace na konkrétní virus. S ohledem na nedávnou publicitu viru prasečí chřipky H1N1, jsem se rozhodla aplikovat svoji hypotézu přímo na něm. Ve výsledku jsem dosáhla vytvoření transgenního viru, jehož funkcí bylo naprosto eliminovat virus H1N1 v těle napadeného organismu s klinickými příznaky chřipkového onemocnění. Tato genová terapie má svá pozitiva hlavně v rychlosti a v nepotřebnosti využití jakýchkoliv farmaceutik, díky kterým bychom nemuseli nemocného jedince poslat na jatka. Vzhledem k současné praxi bychom dosáhli také značných ekonomických úspor, jelikož by již dále nebulo nutné při výskytu nemocného jedince posílat na nucenou porážku celé stádo. A to i z důvodu preventivně zoohygienického. Protože pokaždé, pokud má chovatel rozhodovat ve prospěch stáda, tak pokaždé zvolí raději razantnější cestu. Pokud se ještě vrátím k imunologické terapii založené na OX40, myslím si, že má svoje opodstatnění z hlediska imunologického. Pokud bychom byli schopni touto terapií vybudit imunologickou reakci živočišného těla natolik, abychom zcela zabránili průniku a
29 následnému onemocnění, pak by to byla metoda velmi silná a efektivní. Srovnám-li tuto metodu se svojí, pak bych ještě jednou vyzdvihla výhody transgenního viru. S dostatečným zásahem do třetího segmentu, který má největší tendence k mutagenitě, je pak transgenní virus agresivnější vůči onemocnění chřipkovým virem H1N1 a to hlavně v tom rozsahu, že společně s patogenem koluje v krvi. Zatímco OX40 spíše inklinuje k omezení vstupní brány pro infekci. Naprosto ideální mi přijde, pokud by tyto dvě metody šly kombinovat. Tím bychom snížili množství patogenních virů H1N1 a zároveň, co by vniklo bylo by zlikvidováno transgenním virem.
14 ZÁVĚR Závěrem lze konstatovat, že riziko z onemocnění chřipkovými viry je stále aktuální otázkou z hlediska epidemiologie. Jak bylo již v předešlém textu řečeno, tak se k nám různé subtypy chřipkových virů ve vlnách vrací, a často i v nezanedbatelné velikosti pandemií. Právě z těchto důvodů jsem se věnovala alternativní genetické terapii, kterou vidím jako jeden ze způsobů léčby virových onemocnění. Jelikož je prozíravé očekávat v blízké budoucnosti rychlý vzestup biotechnologií, je dle mého názoru na místě se intenzivně věnovat možnostem jejich využití v praxi, a to i navzdory faktu, že je tato práce v současnosti převážně teoretická. Proto si myslím, že mnou aplikovaná hypotéza na viru H1N1, má praktický význam. Je pravděpodobné, že mnohé odpůrce genetických manipulací můj inovační námět spíše pohorší, než zaujme, ale věřím, že po provedení náležitých pokusů a případném uvedení do praxe by moji práci hodnotili kladně.
30
13 Použitá literatura : ROSYPAL, S. Úvod do molekulární biologie : Vstup do molekulární biologie, molekulární biologie prokaryotické buňky . První díl. 4. vyd. Brno: S. Rosypal, 2005, 289 s. ISBN 80902562-5-2. SNUSTAD D.P., SIMMONS M.J., GENETIKA, Copyright Edition Czech, 2009, 871s. ISBN 978-80-210-4852-2 JELÍNEK J., ZICHÁČEK V., BIOLOGIE PRO GYMNÁZIA,NAKLADATELSTVÍ OLOMOUC, 2005, 575s. ISBN 80-7182-177-2 BEDNÁŘ M., FRAŇKOVÁ V., SCHINDLER J., SOUČEK A., VÁVRA J., Lékařská mikrobiologie, MARVIN, PRAHA,1999, 213s. Kolektiv autorů, MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL Fifth Edition, Garland Science, 2008, 1268s., ISBN 978-0-8153-4106-2 VAN REGENMORTEL M.H.V., MAHY B.W.J., DESK ENCYKLOPEDIA OF ANIMAL AND BACTERIAL VIROLOGY, 2010, 617str., ISBN 978-0-12-375144-7 IPSER J., GENETIKA, BIOLOGIE(Online),2006,( cit. 09/04/2010) www.biology.cz/vyuka/file.php/1/opory
31
INTERNET: PETR, Jaroslav. Osel.cz/index.php?obsah=6&clanek=3514 [online]. 2008 [cit. 2010-0430]. Kde se rodí chřipka. Dostupné z WWW: <www.osel.cz>. PAZDERA, Josef. Osel.cz/index.php?obsah=6&clanek=446 [online]. 2003 [cit. 2010-0430]. Lék proti smrtelnému kmenu chřipky. Dostupné z WWW: <www.osel.cz>. PETR, Jaroslav. Osel.cz/index.php?obsah=6&clanek=4424 [online]. 2009 [cit. 2010-0430]. Lidé nad šedesát jsou vůči mexické chřipce odolnější. Dostupné z WWW: www.osel.cz PETR, Jaroslav. Osel.cz/index.php?obsah=6&clanek=4519 [online]. 2009 [cit. 2010-0430]. Mexická chřipka vytlačuje dosavadní chřipkové viry. Dostupné z WWW: <www.osel.cz>. PETR, Jaroslav. Osel.cz/index.php?obsah=6&clanek=4366 [online]. 2009 [cit. 2010-0430]. „Prasečí chřipka“ v USA a Mexiku. Dostupné z WWW: www.osel.cz PETR, Jaroslav. Osel.cz/index.php?obsah=6&clanek=4270 [online]. 2009 [cit. 2010-0430]. Univerzální protilátky proti chřipce. Dostupné z WWW: <www.osel.cz>. PETR, Jaroslav. Osel.cz/index.php?obsah=6&clanek=3054 [online]. 2007 [cit. 2010-0430]. Zima chřipce svědčí. Dostupné z WWW: <www.osel.cz>. PETR, Jaroslav. Osel.cz/index.php?obsah=6&clanek=1619 [online]. 2006 [cit. 2010-0430]. Viry. Dostupné z WWW: <www.osel.cz>. PETR, Jaroslav. Osel.cz/index.php?obsah=6&clanek=2447 [online]. 2007 [cit. 2010-0430]. Viry staví mosty. Dostupné z WWW: <www.osel.cz>. Chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Proteins11.html [online]. 2005 [cit. 2010-04-30]. Disulfide bonds. Dostupné z WWW: <www.chemistry.umeche.maine.edu.com>. Ictvonline.org/index.asp?bhcp=1 [online]. 2005 [cit. 2010-04-30]. Virus taxonomy. Dostupné z WWW: www.ictvonline.org
32
