UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta katedra parazitologie Studijní program: Biologie Studijní obor: Parazitologie
Bc. Alžběta Krupičková Sekreční systém typu II v mitochondriích Naegleria gruberi Type II secretion system in the mitochondria of Naegleria gruberi DIPLOMOVÁ PRÁCE Školitel: Mgr. Pavel Doležal, Ph.D.
Praha 2016
Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze dne 15. 8. 2016
…………….……..
Především bych na tomto místě ráda poděkovala svému školiteli Pavlu Doležalovi za poskytnuté rady, vědecké vedení, nadšení a humor. Děkuji Lubošovi a Vlaďce za veškerou ochotu a pomoc. Děkuji Markétě za provázení v laboratorních začátcích. Děkuji Lence za spolupráci na T2SS, Vojtovi za nalezení genů a všem, kteří se pro toto téma nadchli. Děkuji všem kolegům z naší laboratoře za příjemné pracovní prostředí. Díky rodině a všem svým blízkým za podporu a pomoc, kterou jsem u nich vždy našla.
Abstrakt V membránách gramnegativních bakterií se nachází několik typů transportních (sekrečních) systémů, které exportují proteiny do vnějšího prostředí bakterie. Mezi takové sekreční systémy patří i sekreční systém typu II (T2SS), který transportuje sbalené proteiny přes vnější membránu. Klíčové podjednotky T2SS byly objeveny v genomech některých prvoků patřících do skupiny Discoba a Malawimonada, včetně druhů Naegleria gruberi a Malawimonas sp. str. 249. Naše experimenty ukazují, že jsou tyto podjednotky lokalizovány v mitochondrii těchto prvoků. Objev těchto genů u eukaryot je překvapivý, a pokud by v mitochondriích těchto protist fungoval T2SS jako exportní sekreční systém, jednalo by se o mitochondrii na evolučním mezistupni, která je schopna jak proteiny importovat tak exportovat. V experimentální části této práce jsme studovali, jestli a jak spolu proteiny N. gruberi a M. sp. str. 249 interagují. Prokázali jsme četné interakce mezi proteiny, které odpovídají bakteriálnímu uspořádání T2SS. K tomu jsme využili metod kvasinkového dvouhybridního systému a bakteriálního dvouhybridního systému. Dále jsme zkoumali import klíčové podjednotky T2SS, pseudopilinu, N. gruberi do vnitřní membrány mitochondrií a import sekretinu M. sp. str. 249 do vnější membrány mitochondrií.
Abstract Several types of the transport (secretion) systems can be found in the membranes of gram-negative bacteria. These systems export proteins into the extracellular milieu of bacteria. One of them, type II secretion system (T2SS), exports the folded proteins through the outer bacterial membrane. The core subunits of T2SS were discovered in the genomes of several protists belonging to the Discoba and Malawimonada groups, including Naegleria gruberi and Malawimonas sp. str. 249. Our experiments suggest that these subunits are localized in the mitochondria of these protists. The discovery of these genes in eukaryotes is surprising. If the T2SS was active in these mitochondria, it would represent an evolutionary intermediate stage of the organelle, which can export and import the proteins. In experimental part of the thesis, we studied how the proteins of N. gruberi and M. sp. str. 249 interact. We demonstrated several interactions, which correspond to the function of bacterial T2SS. To this aim, we employed bacterial and yeast two-hybrid systems. Further, we explored the import of the core subunit of T2SS, pseudopilin, of N. gruberi into the inner mitochondrial membrane. And we also investigated the import of M. sp. str. 249 secretin into the outer mitochondrial membrane.
Obsah 1.
Úvod ................................................................................................................................... 1
2.
Literární přehled ................................................................................................................. 2 2.1. Sekreční systémy u gramnegativních bakterií ................................................................. 2 2.2. Sec a Tat dráha ................................................................................................................. 3 2.3. T2SS ................................................................................................................................ 4 2.4. Složení a skládání T2SS .................................................................................................. 6 2.4.1. Komplex vnější membrány....................................................................................... 6 2.4.2. Komplex vnitřní membrány ..................................................................................... 8 2.4.3. Sekreční ATPáza ....................................................................................................... 9 2.4.4. Pseudopilus ............................................................................................................... 9 2.5. Mechanismus sekrece T2SS .......................................................................................... 11 2.6. Import proteinů do mitochondrií ................................................................................... 13 2.7. Velké mitochondriální genomy u skupiny Jakobida ...................................................... 15 2.8. T2SS v mitochondriích některých prvoků ..................................................................... 16
3.
Cíle ................................................................................................................................... 17
4.
Materiál a metodika .......................................................................................................... 18 4.1. Organismy a jejich kultivace ......................................................................................... 18 4.1.1. Naegleria gruberi ................................................................................................... 18 4.1.2. Escherichia coli ...................................................................................................... 18 4.1.3. Saccharomyces cerevisiae ...................................................................................... 19 4.2. Plazmidy ........................................................................................................................ 20 4.3. Amplifikace genů ........................................................................................................... 21 4.4. Izolace a klonování DNA fragmentů ............................................................................. 24 4.5. Transformace bakterií .................................................................................................... 25 4.6. Import proteinu do mitochondrií ................................................................................... 25 4.6.1. In vitro translace ..................................................................................................... 25 4.6.2. Izolace mitochondrií N. gruberi ............................................................................. 26 4.6.3. Izolace kvasinkových mitochondrií ........................................................................ 26 4.6.4. Import proteinu do mitochondrií ............................................................................ 28 4.6.5. SDS-PAGE ............................................................................................................. 30 4.6.6. Vysušení gelu, založení, vyvolání........................................................................... 30
4.7. Bakteriální dvouhybridní systém ................................................................................... 31 4.7.1. Zaklonování genů do vektorů ................................................................................. 32 4.7.2. Příprava kompetentních bakterií ............................................................................. 32 4.7.3. Kotransformace bakterií ......................................................................................... 33 4.7.4. Měření β-galaktosidázy (výpočet Millerových jednotek) ...................................... 33 4.8. Kvasinkový dvouhybridní systém (Y2H) ...................................................................... 34 4.8.1. Kotransformace kvasinek ....................................................................................... 34 4.8.2. Rozkapání (Serial dilution test) .............................................................................. 35 4.9. Fluorescenční značení S. cerevisiae .............................................................................. 36 4.9.1. Transformace buněk S. cerevisiae .......................................................................... 36 4.9.2. Fluorescenční značení buněk S. cerevisiae ............................................................. 37 5.
Výsledky ........................................................................................................................... 38 5.1. Bioinformatická analýza Gsp ........................................................................................ 38 5.1.1. Alignmenty Gsp proteinů ....................................................................................... 39 5.1.2. Analýza GspG ......................................................................................................... 44 5.1.3. Mitochondriální presekvence Gsp proteinů ............................................................ 46 5.2. Naegleria gruberi .......................................................................................................... 46 5.2.1. Interakce mezi Gsp proteiny pomocí Y2H ............................................................ 46 5.2.2. Interakce mezi Gsp proteiny pomocí BACTH ....................................................... 47 5.2.3. Import NgGspG do mitochondrií............................................................................ 48 5.3. Malawimonas sp. str. 249 .............................................................................................. 51 5.3.1. Interakce mezi Gsp proteiny pomocí Y2H ............................................................. 51 5.3.2. Interakce mezi Gsp proteiny pomocí BACTH ....................................................... 54 5.3.3. Lokalizace M249GspD ........................................................................................... 57
6.
Diskuze ............................................................................................................................. 58 6.1. Podjednotky T2SS u N. gruberi .................................................................................... 58 6.2. Podjednotky T2SS u M. sp. str. 249 .............................................................................. 60 6.3. T2SS v mitochondriích .................................................................................................. 63
7.
Závěr ................................................................................................................................. 64
8.
Seznam často používaných zkratek .................................................................................. 65
9.
Seznam použité literatury ................................................................................................. 66
1. Úvod Mitochondrie je organela endosymbiotického původu vzniklá z α-proteobakterie. Ze své bakteriální minulosti si toho současná mitochondrie už mnoho neponechala. Většina mitochondrií si ve svém genomu zachovala pouze několik genů, které nebyly ani eliminovány ani přeneseny do jádra. Je překvapivé, že v genomech některých eukaryotických organismů patřících do skupiny Discoba a u rodu Malawimonas, jehož fylogenetické postavení je stále předmětem diskuze, byly nalezeny klíčové podjednotky sekrečního systému typu II (T2SS). Konkrétně se jedná o parazitický druh Naegleria fowleri, který u lidí způsobuje primární amébovou meningoencefalitidu (PAM), onemocnění postihující mozek s vysokou smrtností. Dále se jedná o jejího neparazitického příbuzného Naegleria gruberi, dále o Neovahlkampfia damariscottae, Reclinomonas americana, Andalucia godoyi, Malawimonas jakobiformis a Malawimonas sp. str. 249. T2SS se vyskytuje u gramnegativních bakterií a přenáší složené proteiny přes vnější membránu. Sestává se ze čtyř hlavních složek: komplexu vnější membrány tvořící sekretinový pór, pseudopilu, komplexu vnitřní membrány a sekreční ATPázy. Pokud by T2SS měl v mitochondriích těchto eukaryot stejnou funkci jako v bakteriích, jednalo by se o první známý transport proteinů směrem z mitochondrie a bylo by zajímavé studovat jeho mechanismus a proteiny, které by exportoval. Podrobnější ko-evoluční analýzou byl zatím pouze navržen potenciální substrát pro mitochondriální T2SS. Literární rešerše je zaměřena na charakterizaci bakteriálního T2SS, popis struktury a funkce jednotlivých podjednotek a mechanismu sekrece. Také jsou stručně popsány bakteriální dráhy, které s ním spolupracují (Sec a Tat) a mitochondriální komplexy zodpovědné za import proteinů. Nakonec jsou krátce představeni eukaryotičtí zástupci, u kterých byl T2SS nalezen. Experimentální část je zaměřena na klíčové podjednotky T2SS u Naegleria gruberi a Malawimonas sp. str. 249, především na jejich interakce a na import hlavní komponenty pseudopilu GspG do mitochondrie.
1
2. Literární přehled 2.1. Sekreční systémy u gramnegativních bakterií Bakterie sekretují do vnějšího prostředí řadu biomolekul. Může se jednat o virulenční faktory, proteiny sloužící k adhesi či získávání živin, malé organické molekuly nebo DNA. Gramnegativní bakterie na rozdíl od grampozitivních mají tuto situaci ztíženu existencí dvou buněčných membrán. Díky přítomnosti vnitřní a vnější membrány se tak u nich vyvinulo množství transportních proteinových komplexů, tzv. sekrečních systémů. Sekreční systémy můžeme rozdělit na několik typů (Obr. 1). Některé překlenují vnitřní i vnější membránu, jedná se o sekreční systém typu I (T1SS), II (T2SS), III (T3SS), IV (T4SS), VI (T6SS). Jiné se vyskytují pouze ve vnější membráně, kam patří sekreční systém typu V (T5SS). Dalším transportním komplexem řadícím se do sekrečních systémů je sekreční systém typu VII (T7SS), který se nachází u mykobakterií a jiných gram-pozitivních bakterií. V širším pojetí je však sekrečních systémů ještě více, můžeme mezi ně řadit RND pumpu, „chaperone-usher“ dráhu nebo dráhu biogeneze Curli vláken (Costa et al., 2015). Jinou odlišností mezi sekrečními systémy je schopnost transportovat sbalené proteiny. Mezi takové sekreční systémy patří T2SS (Hirst and Holmgrent, 1987) nebo T7SS (Sysoeva et al., 2014).
Obrázek 1: Zjednodušený pohled na základní části jednotlivých sekrečních systémů. HM (host membrane = hostitelská membrána), OM (outer membrane = vnější membrána), IM (inner membrane = vnitřní membrána), MM (mycomembrane = mykomembrána), OMP (outer membrane protein = protein vnější membrány), MFP (membrane fusion protein = membránový fúzní protein), ATPázy a chaperony znázorněny žlutě. Převzato z (Tseng et al., 2009).
2
2.2. Sec a Tat dráha Některé sekreční systémy (např.: T2SS, T5SS) transportují proteiny pouze přes vnější membránu. Pro transport přes vnitřní membránu proto využívají dráhy Sec nebo Tat (Voulhoux et al., 2001). Sec dráha přenáší nesložené nebo nascentní polypeptidy přes membránu nebo je přímo do membrány vkládá. Vyskytuje se u prokaryot i eukaryot (v tomto případě se jedná o membránu endoplazmatického retikula). Transportované proteiny mají N-terminální signální peptid, který je rozpoznáván ribonukleoproteinem SRP (signal recognition particle) nebo SecB chaperonem a naváděn na translokázový kanál. SRP se váže na signální peptid a kotranslačně odvádí vznikající protein i s ribozomem na membránový receptor FtsZ. SecB se váže na signální peptid a kotranslačně nebo posttranslačně odvádí protein na podjednotku SecA (Papanikou et al., 2007). Membránový kanál se sestává ze tří podjednotek: SecY, SecE, SecG (Sec61α, Sec61β, Sec61γ), z nichž nejvýznamnější je SecY, který vytváří samotný membránový kanál (van den Berg et al., 2003). Transport je poháněn ATPázou SecA a protonmotivní silou (Schiebel et al., 1991). Po uvolnění nesloženého proteinu štěpí signální peptidáza signální sekvenci a protein je sbalen do své nativní konformace (Paetzel et al., 2000). Naproti tomu Tat (twin-arginine translocation) dráha umožňuje díky svému unikátnímu mechanismu transport složených proteinů. Ty jsou mnohem objemnější než nesložené polypeptidy a navíc jsou rozměry jednotlivých přenášených substrátů velmi různorodé. Tat dráha se nachází ve většině bakterií, některých archaeí, chloroplastech a některých mitochondrií. U naprosté většiny živočichů a hub však tato dráha chybí. Substráty mají N-terminální signální peptid, ve kterém se nacházejí dva sousední argininy, od kterých je odvozen název dráhy. Tat dráha je složena z proteinových komplexů obsahujících membránové
proteiny
pouze
z dvou
proteinových
rodin:
TatA obsahující
jeden
transmembránový helix a TatC obsahující šest transmembránových helixů. Dalším proteinem patřícím do proteinové rodiny TatA je TatB (Berks, 2015). Nejdříve je rozpoznán Nterminální signální peptid substrátu, který se váže na membránový komplex TatB/C (Cline and Mori, 2001). Poté co je substrát rozpoznán se spouští oligomerizace TatA za přítomnosti protonmotivní síly (Mori and Cline, 2002). Oligomer TatA obklopující přenášený protein pak zřejmě zprostředkovává i vlastní transport přes membránu. Signální peptidáza poté štěpí signální peptid (Lüke et al., 2009) a TatA se uvolňuje z komplexu TatA/B/C (Mori and Cline, 2002). 3
2.3. T2SS Přestože T2SS překlenuje svými podjednotkami vnitřní i vnější membránu je schopen transportu substrátů pouze přes vnější membránu. V této práci je užíváno označení jednotlivých proteinů T2SS jako general secretory pathway (Gsp) následované velkým písmenem, ale tato nomenklatura není bezvýhradně přijímána. T2SS komponenty u Vibrio cholerae se označují Eps (extracellular protein secretion), u Klebsiella oxytoca jako Pul (pullulanase secretion) nebo u Pseudomonas aeruginosa jako Xcp. T2SS byl objeven d’Enfert et al. (1987), když Escherichia coli, transformovaná genem pullulanázy (lipoprotein štěpící větvící se škroby) spolu se sekrečními geny Klebsiella pneumoniae, začala pullulanázu sekretovat. Bylo také zjištěno, že gen pro pullulanázu byl součastí operonu pro sekreční systém. Tento sekreční systém se skládá ze čtyř hlavních částí: komplexu vnější membrány, pseudopilu, komplexu vnitřní membrány a sekreční ATPázy (Obr. 2, Tab. 1). Do T2SS patří ještě proteiny GspB, GspH a GspN, které se však nevyskytují u všech T2SS a nejsou esenciální pro jeho funkci (Possot et al., 2000).
Obrázek 2: Molekulární model T2SS: hexamer GspE (zeleně), dimer GspF (růžově), dva heterodimery GspL (tmavě modře) - GspM (světle modře), minoritní pseudopiliny: GspK (tmavě zeleně), GspJ, GspI, GspH (světle zeleně), čtyři monomery hlavního pseudopilinu GspG (šedě), dodekamer GspD s vyznačenými N doménami (červeně), GspC (oranžově). Převzato z (McLaughlin et al., 2012).
4
Tabulka 1: Přehled hlavních podjednotek T2SS.
Komplex vnější membrány
GspD
tvoří pór ve vnější membráně
GspS
lipoprotein pilotin, periplazmatický chaperon navádějící GspD do vnější membrány
Komplex vnitřní membrány
GspM
interaguje s GspL
GspF
polytopický transmembránový protein, interaguje s GspL
GspL
interaguje s GspE, GspM a GspF
GspC
periplazmatická spojka vnitřní a vnější membrány
Sekreční ATPáza
GspE
dodává energii pro T2SS hydrolýzou ATP
Pseudopilus
GspG
hlavní pseudopilin, podjednotky GspG tvoří pseudopilus
GspI
iniciuje skládání pseudopilu
GspJ
umožňuje vazbu GspH na ostatní minoritní pseudopiliny na špičce pseudopilu, řídí délku
GspK
pseudopilu spojka mezi špičkou pseudopilu
GspH
z minoritních pseudopilinů a vlastním pseudopilem z GspG podjednotek
Srovnávací analýzy ukázaly, že T2SS má zřejmě společný původ s pilusovým systémem typu IV (T4PS), systémem syntézy archeálního bičíku a bakteriálním transformačním systémem. Všechny tyto systémy obsahují cytoplazmatickou ATPázu; komplex vnitřní membrány s proteiny obsahujícími transmembránové α-helixy; pilin, pseudopilin nebo flagelin a specifickou membránovou proteázu. Komplex vnější membrány se nachází pouze u T4PS, protože archaea ani grampozitivní bakterie vnější membránu nemají. T4PS i T2SS mají sekretinový pór ve vnější membráně a jsou si zřejmě evolučně nejpříbuznější. (Korotkov et al., 2012).
5
2.4. Složení a skládání T2SS 2.4.1. Komplex vnější membrány Komplex vnější membrány se skládá především z vlastního póru, patřícího do třídy sekretinů, GspD. Ten je tvořen 12 podjednotkami (Nouwen et al., 1999). Nedávná studie u Pseudomonas aeruginosa (Van der Meeren et al., 2013) navrhla trochu odlišné uspořádání póru, který by měl být tvořen hexamerem sekretinových dimerů. Obecně sekretiny tvoří multidoménové kanály ve vnější membráně s velmi konzervovanou sekretinovou doménou na C-terminálním konci (Genin and Boucher, 1994). C-terminální doméně předcházejí tři vysoce homologní N-domény (N3, N2, N1) a N0 doména. N-domény jsou mezi sebou spojeny pohyblivými smyčkami (Korotkov et al., 2010). Reichow et al. (2010) popsali velmi dobře strukturu sekretinu u Vibrio cholerae za použití elektronové kryomikroskopie (Obr. 3). Tento kanál má průměr 155 Å a je 200 Å dlouhý. Má periplazmatickou doménu, na kterou navazuje doména vnější membrány. Na úplném vrchu je pak extracelulární doména. V periplazmatické doméně je periplazmatický vestibul s konstrikčním místem tvořeným N3 doménou, která může iniciovat konformační změny během sekrece proteinu. Periplazmatický vestibul je oddělen periplazmatickou bránou od extracelulární dutiny, která je na druhém konci uzavřena extracelulární bránou.
Obrázek 3: Struktura GspD u Vibrio cholerae (VcGspD). (a) Postranní pohled rekonstrukce VcGspD v rozlišení 19 Å. Identifikovány tři domény: periplazmatická doména, doména vnější membrány a extracelulární konec. (b) Pohled do podélně rozříznutého kanálu odhaluje periplazmatický vestibul s konstrikčním místem, periplazmatickou bránu, extracelulární dutinu a extracelulární bránu. Extracelulární dutina je ∼ 100 Å široká, zatímco periplazmatický vestibul má pouze ∼ 75 Å v průměru. Periplazmatické konstrikční místo zužuje periplazmatický vestibul na ∼ 55 Å, zatímco extracelulární brána se otvírá pouze na 10 Å. (c) Konstrikční místo periplazmatické domény je tvořeno N3 doménou. Převzato z (Reichow et al., 2010).
6
Sekretiny se vyskytují ve vnější membráně i jako součást několika dalších sekrečních drah. Všechny sekretiny mají podobné doménové uspořádání, C-terminální sekretinovou doménu a za ní nejméně dvě periplazmatické domény (Reichow et al., 2010). Sekretiny vytvářejí různé symetrie, pohybují se od C12 do C20 (Korotkov et al., 2011a). T2SS sekretinu se nejvíce podobá sekretin dráhy T3SS. I ten se u Shigella flexneri skládá z 12 podjednotek a ve vnější membráně vytváří strukturu několika kruhovitých částí (Hodgkinson et al., 2009). Jiným systémem, ve kterém se nachází sekretin, je pilusový systém typu IV (T4PS). Neisseria meningitidis T4PS sekretin vykazuje kvartérní (kvazi-dodekamerickou (C12)) symetrii (Collins et al., 2004). Jiný sekretin používají někteří bakteriofágové k opuštění hostitelské buňky. Tento kanál má C14 symetrii a je složen z tří kruhovitých domén (Opalka et al., 2003). Je známo, že většina proteinů vnější membrány se skládá za pomoci BAM komplexu („β-barrel assembly machinery“). To bylo potvrzeno i u sekretinu T4PS Neisseria meningitidis (Voulhoux et al., 2003). Skládání sekretinu T2SS Escherichia coli je však zřejmě nezávislé na BAM komplexu (Collin et al., 2007). Dalším proteinem komplexu vnější membrány je lipoprotein pilotin, GspS. GspS funguje jako periplazmatický chaperon, který chrání C-terminální doménu GspD před degradací a také navádí GspD do vnější membrány. Za absence GspS se v periplazmě objevují degradační agregáty GspD (Hardie et al., 1996). Tosi et al. (2011) popsali strukturu a vazebné místo GspS. Pilotin je složen ze 4 helixů, které jsou spojeny krátkými smyčkami. Žlábek, do kterého se váže sekretinová doména GspD, je složen z nabitých i hydrofobních oblastí. GspS také brání multimerizaci GspD před vložením do vnější membrány. Samotný GspS však nestačí, aby se GspD vložilo do vnější membrány, váže se na heterodimer GspSGspD ještě LolA (Collin et al., 2011). LolA je periplazmatický chaperon, který patří do tzv. Lol dráhy. LolA navádí lipoprotein na LolB, což je lipoproteinový receptor ukotvený ve vnější membráně. Do Lol dráhy patří ještě ABC transporter LolCDE komplex (Tokuda, 2009). Zajímavá variace na uvedený mechanismus tvorby sekretinového póru byla popsaná u druhu Pseudomonas aeruginosa. Jeho sekretin je lipoprotein, jehož N-terminální lipidická kotva přebírá funkci pilotinu. Upravený sekretin bez lipidického N-konce se nedostal do vnější membrány a vytvářel multimery ve vnitřní membráně (Viarre et al., 2009).
7
2.4.2. Komplex vnitřní membrány Komplex vnitřní membrány je tvořen třemi hlavními proteiny: GspM, GspL a GspF. GspM obsahuje krátkou cytoplazmatickou oblast, transmembránový helix a periplazmatickou doménu. Periplazmatická doména má sekundární strukturu složenou ze dvou α-helixů a čtyřech antiparalelních
β-listů (αββ – αββ), tato struktura se nejvíce podobá
feredoxinovému „foldu“. Periplazmatická doména GspM se podílí na dimerizaci proteinu (Abendroth et al., 2004). GspL je zřejmě hlavní protein komplexu vnitřní membrány, vytváří homodimery. GspL
má
velkou
cytoplazmatickou
doménu,
transmembránový
helix
a
malou
periplazmatickou doménu. V cytoplazmatické oblasti se nachází důlek, který interaguje s N-terminální doménou sekreční ATPázy, GspE (Abendroth et al., 2005). Gray et al. (2011) potvrdili interakci periplazmatické domény GspL s procesovaným pseudopilinem GspG. GspL by tak mohl být spojkou, která převádí konformační změny mezi cytoplazmatickou ATPázou (GspE) a periplazmatickým pseudopilem, jehož hlavní komponentou je pseudopilin GspG. Na základě koimunoprecipitací a kvasinkových dvouhybridních systémů Py et al. (2001) zjistili, že GspL interaguje s GspM přes jejich periplasmatické domény. Dále GspL tvoří komplex s GspE (jak bylo zmíněno výše) a GspF. GspL je vyžadováno pro vznik komplexu GspE-GspF, zatímco komplex GspE-GspL nevyžaduje pro svůj vznik GspF. GspF je jako jediný z těchto proteinů polytopický, obsahuje tři transmembránové domény (TMD) a dvě cytoplasmatické, které spolu tvoří dimer, v němž se nacházejí dvě Ca2+ vazebná místa. Cytoplazmatické domény jsou si podobné, obě mají strukturu 6 α-helixů. (Abendroth et al., 2009). Komplexy membrán spojuje periplazmatická spojka, GspC, která se skládá z několika domén: TMDs, HR (homology region) domény a coiled coil nebo PDZ domény. Posledně zmíněné jsou dobře známy pro svoji schopnost interakce s jinými proteiny/doménami, zde slouží zřejmě k vytvoření homomultimeru GspC (Gérard-Vincent et al., 2002). HR doména GspC interaguje s periplazmatickou N0 doménou GspD (Korotkov et al., 2011b). Biogeneze komplexu vnitřní membrány je zřejmě závislá na komplexu vnější membrány. Lybarger et al. (2009) pomocí fluorescenčních pokusů ukázali, že GspD je důležité pro správnou lokalizaci GspC a GspM. Na základě toho navrhli, že GspD-GspC vytváří základ T2SS, na který se následně skládají další komponenty T2SS.
8
2.4.3. Sekreční ATPáza Sekreční ATPáza GspE je cytoplazmatický protein spojený s komplexem vnitřní membrány, který hydrolýzou ATP dodává energii pro T2SS. Sestává se z N1, N2, C1, CM a C2 domény. V C2 doméně se vyskytuje několik konzervovaných oblastí: Walker A, Asp box, Walker B, His box. Walker A je vazebným místem pro nukleotid a je esenciální pro správnou funkci GspE (Possot and Pugsley, 1994). ATPáza T2SS patří do velké rodiny sekrečních ATPáz stejně jako např. archeální ATPáza nebo ATPáza T4PS, obě vytvářejí hexamer (Satyshur et al., 2007; Yamagata and Tainer, 2007). Pro svou aktivitu GspE vyžaduje přítomnost Mg2+. Navíc obsahuje i kationty Zn2+ koordinované tetracysteinovým motivem. Kationty tohoto kovu nejsou esenciální pro vlastní ATPázovou funkci, ale katalytická aktivita je snížena o necelých 50 %. GspE je často izolován jako monomer, ale ATPázová hydrolytická aktivita je závislá na koncentraci, což je vlastnost typická pro oligomery (Camberg and Sandkvist, 2005). ATPázová aktivita hexameru GspE je asi 20krát vyšší než u monomeru (Lu et al., 2013). Dále ATPázovou aktivitu zvyšuje vazba GspE-GspL a kyselé fosfolipidy jako je např. cardiolipin (Camberg et al., 2007).
2.4.4. Pseudopilus Pseudopilus T2SS je struktura velmi podobná pilu T4PS. Pseudopilus se skládá v periplazmě a slouží jako zatažitelná zátka pro pór ve vnější membráně nebo jako píst, který tlačí sekretované substráty přes vnější membránu (viz 2.5. Mechanismus sekrece T2SS).
9
Obrázek 4: Struktury pseudopilinových podjednotek. N-terminální α-helixy (modře), konzervované β-listy (zeleně), variabilní oblasti (fialově), α-doména GspK (světle modře). Páskové modely jednotlivých pseudopilinů: hlavní pseudopilin GspG Klebsiella oxytoca (PulG); GspH Vibrio cholerae (EpsH); GspI, GspJ, GspK ETEC (enterotoxigenní E. coli). Spodní topologické modely: β-vlákna znázorněny jako šipky, N-terminální α-helixy jako elipsy, ostatní α-helixy jako kroužky. Převzato z (Korotkov and Hol, 2008).
Skládá se z hlavního pseudopilinu GspG a čtyř vedlejších pseudopilinů GspH, GspI, GspJ a GspK. Pseudopiliny vykazují stejnou strukturu: dlouhý N-terminální α-helix následovaný variabilní oblastí a C-terminálním β-listem (Obr. 4), stejně jako pilinové podjednotky v T4PS (Köhler et al., 2004). Bylo zjištěno, že GspG váže Ca2+, který je koordinován dvěma konzervovanými aspartáty. Pokud byly asparáty zaměněny za alaniny, sekrece T2SS zkolabovala (Korotkov et al., 2009). Z toho vyplývá, že vazba Ca2+ je nezbytná pro správnou funkci GspG. GspH má N-terminální α-helix následovaný dvěma β-listy: β-list I tvořený β1, β2, β3, β4 a β6, β-list II tvořený β5, β7, β8 a β9. Mezi N-terminálním α-helixem a β-listy I a II se nachází hydrofobní štěrbina obsahujících 17 konzervovaných zbytků, která zřejmě slouží pro vazbu na jiný protein (Yanez et al., 2008a). GspK má složení typické pro piliny, ale ještě navíc obsahuje tzv. α-doménu. α-doména je vložena mezi β2 a β3 vlákno pilinové domény a obsahuje 12 α-helixů, 4 krátká β vlákna a několik smyček. Také v ní bylo nalezeno dvojvazebné místo pro Ca2+ kationty. Dále byla v α-doméně potvrzena disulfidická vazba mezi dvěma cysteiny, která se vyskytuje mezi pseudopiliny pouze v GspK (Korotkov and Hol, 2008). Pseudopilin GspK je také výjimečný tím, že jako jediný nemá na +5 pozici glutamát (Bleves et al., 1998). Struktura GspI opět obsahuje N-terminální α-helix následovaný čtyřmi antipararelními β-vlákny skládajícími se do jednoho β-listu. Je ale zajímavé, že mezi α-helixem a β-listem není téměř žádná variabilní oblast (Yanez et al., 2008b). GspJ má za N-terminální α-helixem dva β-listy skládajících se z pěti a čtyř β-vláken a navíc krátké β2’-vlákno, které není součástí ani jednoho β-listu. GspJ má na rozdíl od GspI rozsáhlou variabilní pilinovou oblast (Yanez et al., 2008b). Tři posledně jmenované podjednotky spolu vytvářejí pravotočivý heterotrimer GspKI-J tvarově připomínající baseballovou rukavici. Největší styčná plocha je mezi pilinovou i αdoménou GspK a GspJ. Uprostřed spolu interagují všechny tři N-terminální α-helixy. Ze struktury vyplývá, že tento heterotrimer se nachází na vrchu pseudopilu, α-doména GspK je nejvýše a přesahuje GspI a GspJ (Korotkov and Hol, 2008). Lokalizace GspK strukturně potvrzuje dříve pozorovaný jev, že GspK řídí délku pseudopilu (Vignon et al., 2003). 10
Douzi et al. (2009) navrhují (na základě kopurifikací solubilních domén minoritních pseudopilinů) GspI jako iniciátora skládání pseudopilu. GspI se váže na odlišná místa GspK a GspJ. Dohromady tvoří výše zmiňovaný heterotrimer K-I-J, na který se přes GspJ váže GspH. GspH by mělo tvořit spojku mezi špičkou pseudopilu složenou z minoritních pseudopilinů a vlastním pseudopilem tvořeným z jednotek hlavního pseudopilinu, GspG. Podjednotky GspG vytvářejí pseudopilus díky N-terminálním hydrofobním α-helixům, které tvoří svazek uprostřed pseudopilu (Köhler et al., 2004). Aby mohl vzniknout pseudopilus, musí se nejdříve GspG a další pseudopiliny transportovat do periplazmy. GspG k inzerci využívá SRP dráhu, která rozpozná hydrofobní N-konec a kotranslačně ho navádí do Sec translokonu. GspG se tak díky Sec translokonu dostává do vnitřní membrány (Francetic et al., 2007). Stejně jako prekurzory pilinových podjednotek T4PS i prekurzor GspG je po vložení do vnitřní membrány štěpen prepilin peptidázou. Tento enzym rozpoznává rozhraní mezi krátkou pozitivně nabitou sekvencí a hydrofobní sekvencí aminokyselin, kterou štěpí za přítomnosti fosfolipidů (Nunn and Lory, 1991). Prepilin peptidáza je bifunkční enzym, který má proteolytickou funkci, ale také metyltransferázovou funkci. Po odštěpení prekurzorové sekvence metyluje N-konec GspG (Strom et al., 1993).
2.5. Mechanismus sekrece T2SS Jak již bylo zmíněno dříve, T2SS přenáší sbalené proteiny přes vnější membránu. Nenašel se však žádný signál ani specifický motiv společný pro proteiny sekretované T2SS. Prerekvizitou pro přenos je zřejmě správné složení proteinu. Obecně se dá říci, že sekretované proteiny jsou bohaté na β-vlákna (Sandkvist, 2001). Exoprotein (exportovaný protein) zřejmě interaguje s N0 doménou GspD (konkrétně s β2-vláknem), která je schopna vázat β-vlákno jiného proteinu (Korotkov et al., 2010). Douzi et al. (2011) zjistili, že exoprotein P. aeruginosa elastáza LasB interaguje s GspC a také s komplexem minoritních pseudopilinů GspK-I-J-H na špičce pseudopilu. Poslední zmiňované interakce exoproteinu podporují první a více diskutovaný model mechanismu T2SS, tzv. pístový model. Vazba exoproteinu na podjednotky T2SS by měla stimulovat ATPázu, to by vedlo k přidávání GspG a prodlužování pseudopilu, který by tlačil sekretované proteiny skrz sekretinový pór. Tento model podporuje i Reichow et al. (2010), kteří studovali sekreci cholera toxinu u Vibrio cholerae za použití elektronové kryomikroskopie (Obr. 5). Hlavními nejasnostmi tohoto modelu je neznámá struktura 11
a dynamika komplexu vnitřní membrány a zatahování pseudopilu po sekreci exoproteinu (Korotkov et al., 2012). Druhým modelem je šroubový model či model Archimédova šroubu. GspG by zde fungovalo jako spirálovitý eskalátor poháněný komplexem GspE-GspF. Komplex minoritních pseudopilinů by pak zapříčiňoval zapnutí šroubu. Jakmile by byl v pohybu transportoval by proteiny dokud by nedošel jeden ze zdrojů: podjednotky GspG nebo energie. I tento model má nezodpovězené otázky, jako např. objasnění jak exoproteiny vstupují do této dráhy (Nivaskumar and Francetic, 2014).
Obrázek 5: Možný mechanismus sekrece T2SS. ATPáza GspE znázorněna oranžově, proteiny komplexu vnitřní membrány zeleně (PDZ a HR doména GspC), minoritní proteiny pseudopilu stříbrně (GspK-I-J), hlavní pseudopilin GspG růžově, sekretinový kanál ve vnější membráně zeleně, modře a fialově. Vlevo je zobrazena architektura T2SS před vazbou exoproteinu. Druhá struktura ukazuje T2SS s exoproteinem (v tomto případě AB5 cholerový toxin) v periplazmatickém vestibulu sekretinu. Po rozpoznání proteinu GspD/C by byl dán signál ATPáze GspE k indukci ATP hydrolýzy. ATP hydrolýza by vedla ke konformačním změnám v hexameru GspE. Tyto pohyby by byly přenášeny od ATPázy k pseudopilinu pomocí GspL, který by mohl být zapojen do přidávání pseudopilinových podjednotek. Pseudopilus by se prodlužoval do té doby než by exoprotein nebo špička pseudopilu dosáhly kontaktu s konstrikčním místem periplazmatického vestibulu sekretinu. Další přidávání GspG podjednotek pseudopilu by vedlo k dalšímu kontaktu exoproteinu a pseudopilu se sekretinem, což by vyvolalo konformační změny (šipky) a vyloučení exoproteinu přes periplazmatickou a extracelulární bránu. Převzato z (Korotkov et al., 2012; Reichow et al., 2010).
12
2.6. Import proteinů do mitochondrií Eukaryotické buňky jsou složitě kompartmentalizovány. Většina proteinů se syntetizuje v cytosolu a mnoho z nich se musí transportovat přes jednu i více membrán aby dosáhly své správné lokalizace. Proteiny tedy musí být směrovány do cílových organel, transportovány přes hydrofóbní membrány tříděny a správně skládány. Jednou z těchto organel je i mitochondrie, která obsahuje čtyři specifické „sub-kompartmenty“: vnější membránu, vnitřní membránu s kristami, mezimembránový prostor a lumen mitochondrie zvané matrix. Mnoho experimentů bylo provedeno na modelovém organismu Saccharomyces cerevisiae. Mitochondrie S. cerevisiae obsahuje více než 750 proteinů, 25 % z nich se podílí na údržbě genomu nebo genové expresi, 14% se zapojuje do energetického metabolismu, další proteiny jsou neznámé funkce nebo se podílí na transportu proteinů či metabolitů, signalizaci, metabolismu aminokyselin, lipidů či železa, mitochondriální morfologii (Sickmann et al., 2003). 1 % proteinů je syntetizováno v mitochondriální matrix, tyto proteiny byly zděděny od prokaryotního předka a patří sem především klíčové podjednotky vnitřní membrány účastnící se oxidativní fosforylace. K transportu těchto proteinů do vnitřní membrány byla v mitochondrii zachována OXA dráha („insertase/export machinery of the inner membrane“), která sestává z podjednotek Oxa1 a Oxa2 a jejímž bakteriálním homologem je YidC (Preuss et al., 2005). Zbývajících 99 % proteinů je syntetizováno v cytosolu, tyto proteiny jsou odvozeny od prokaryot a geny, které je kódují, byly přeneseny do jádra nebo byly během evoluce vynalezeny eukaryotní buňkou. Všechny tyto proteiny se transportují do jednotlivých mitochondriálních „sub-kompartmentů“ mitochondrie pomocí jedné z několika odlišných transportních drah (Obr. 6). Vstupní bránou pro většinu mitochondriální proteinů je TOM komplex („translocase of the outer membrane“), hlavní komponentou tohoto komplexu je Tom40 tvořící vlastní kanál (Ahting et al., 2001). Do SAM komplexu („sorting and assembly machinery“) dále pokračují β-barelové proteiny vnější membrány (Wiedemann et al., 2003). Podjednotka Sam50 tvoří kanál, zatímco Sam35 je zodpovědný za rozpoznání tzv. β-signálu na C-terminálním konci β-barelových proteinů (Kutik et al., 2008). Pro proteiny periplazmatického prostoru je určena tzv. MIA dráha („mitochondrial intermembrane space assembly“) formující disulfidické můstky, jejíž hlavní složkou je Mia40 (Chacinska et al., 2004). Mia40 vytváří přes cysteinové zbytky dočasné disulfidické můstky s importovanými periplazmatickými proteiny a iniciuje tak následné složení proteinů (Milenkovic et al., 2007). 13
Sulfhydryl oxidáza Erv1 pak přijímá elektrony od Mia40 (reoxidace cysteinů Mia40) a přenáší je přes cytochrom c do dýchacího řetězce (Bihlmaier et al., 2007). Do TIM23 komplexu („presequence translocase of the inner membrane“) směřují proteiny vnitřní membrány, proteiny mitochondriální matrix nebo dokonce proteiny mezimembránového prostoru. TIM23 komplex je složitý aparát interagující i s okolními komplexy. Sestává se ze tří hlavních složek: Tim50, Tim23 a Tim17. Tim50 slouží jako receptor směřující proteiny z TOM komplexu do TIM23 komplexu (Mokranjac et al., 2009). Tim23 vytváří kanál v membráně a Tim17 se uplatňuje v začlenění PAM („presequence translocase-associated motor“). PAM je další důležitou částí TIM23 komplexu, jeho významnou složkou je chaperon Hsp70, který se váže na polypeptidový řetězec a řídí import do matrix za hydrolýzy ATP (Chacinska et al., 2009). Poslední hlavní translokázou je TIM22 („carrier translocase of the inner membrane“), který směřuje proteiny do vnitřní membrány. Na hydrofobní části těchto proteinů se v periplazmatickém prostoru váže hexamer chaperonů Tim9-Tim10 a navádí je na komplex TIM22 (Curran et al., 2002). Podjednotka tvořící kanál, Tim22, je pak transportuje za využití membránového potenciálu (Kovermann et al., 2002).
Obrázek 6: Třídění proteinů v mitochondrii. Translokáza vnější membrány (TOM komplex) je hlavní bránou do mitochondrie. Poté proteiny směřují do různých drah: SAM (třídicí a skládací komplex vnější membrány), MIA (dráha mezimembránového prostoru), TIM22 a TIM23 (translokázy vnitřní membrány), OXA (vkládací dráha vnitřní membrány). Převzato z (Chacinska et al., 2009).
14
2.7. Velké mitochondriální genomy u skupiny Jakobida Většina mitochondriálních genomů je hojně redukovaná, z původního bakteriálního předka jich je u většiny zachováno zhruba 1 % genetické informace. Mitochondriální genomy jsou redukovány eliminací nadbytečných genů nebo přenesením genů do jádra. Existují však výjimky jako je exkavátní skupina Jakobida do níž se řadí rody Jakoba, Histiona, Andalucia nebo Reclinomonas. Právě mitochondriální genom Reclinomonas americana byl dlouho považován za genově nejbohatší a jeho analýza objevila geny pro podjednotky RNA polymerázy eubakteriálního typu nebo gen pro podjednotku Sec translokonu, které nebyly dříve nalezeny v žádném mitochondriálním genomu (Lang et al., 1997). Burger et al. (2013) analyzovali osm mitochondriálních genomů ze skupiny Jakobida a zjistili, že všechny se podobají bakteriálnímu genomu více než jakákoli do této doby zkoumaná mitochondriální DNA (mtDNA). Přestože v mitochondriálním genomu Andalucia godoyi chybí podjednotka Sec dráhy, bylo zde identifikováno více genů než v mitochondriálním genomu Reclinomonas americana (Obr. 7). MtDNA u Jakobidů obsahuje geny, jejichž produkty se účastní elektrontransportního řetězce a ATP syntézy, translace a transkripce, importu proteinů (podjednotky Tat a Sec dráhy) a dalších funkcí.
Obrázek 7: Mapa mitochondriálních genomů Reclinomonas americana a Andalucia godoyi. Barvy názvů genů podle taxonomického rozšíření: černá (geny běžné pro mtDNA), modrá (geny vyskytující se především mtDNA protist a rostlin), červená (geny nalezeny především v mtDNA Jakobidů), zelená (hypotetické protein-kódující geny). V černých elipsách zvýrazněny geny kódující proteiny účastnící se transportu proteinů. Upraveno z (Burger et al., 2013).
15
2.8. T2SS v mitochondriích některých prvoků Některé klíčové podjednotky T2SS byly v naší laboratoři objeveny v genomu těchto protist: Malawimonas jakobiformis, Malawimonas sp. str. 249, Andalucia godoyi, Reclinomonas
americana,
Naegleria
gruberi,
Naegleria
fowleri,
Neovahlkampfia
damariscottae. Většina těchto protist patří do superskupiny Excavata, přesněji do skupin Jakobida nebo Heterolobosea, které ještě se skupinou Euglenozoa tvoří Discoba (Hampl et al., 2009). Výjimku tvoří rod Malawimonas, který je v poslední době často diskutován a jeho fylogenetické postavení není jasné. Nejprve byl vyloučen ze skupiny Jakobida (Hampl et al., 2009) a poté i ze superskupiny Excavata (Derelle and Lang, 2012). Malawimonas je podobný organismům ze skupiny Jakobida a má exkavátní morfologické znaky (O’Kelly and Nerad, 1999). Andaluci godoyi a Reclinomonas americana patří do skupiny Jakobida. Jakobida jsou volně žijící, dvoubičíkaté organismy, které se živí bakteriemi. Posteriorní bičík probíhá potravním žlábkem na ventrální straně těla (O’Kelly, 1993). Jak bylo zmíněno výše Jakobida jsou známí svými velkými mitochondriálními genomy, které se podobají bakteriálním více než jakákoli jiná mtDNA. Heterolobosea jsou zde zastoupeny rody Neovahlkampfia a Naegleria. Medicínsky nejvýznamnějším druhem je Naegleria fowleri způsobující onemocnění primární amébová meningoencefalitida (PAM), která byla pojmenována po doktoru (Dr. Malcolm Fowler), který jako první izoloval N. fowleri a popsal nemoc kterou způsobuje (Carter, 1970). Zatím největší epidemie proběhla v České Republice mezi roky 1962 a 1965, během níž zemřelo 16 mladých lidí, kteří se nakazili v plaveckém bazénu (Cerva and Novak, 1968). Při infekci proniká N. fowleri nosem do mozku, k onemocnění jsou náchylní především děti, které se mohou nakazit infikovanou vodou. Nedávno byl popsán případ, kdy se nakazilo dítě dokonce z kohoutkové vody při sprchování (Cope et al., 2015). Nepatogenním příbuzným N. fowleri je N. gruberi, obě améby jsou celosvětově rozšířeny. Rod Vahlkampfia se rozpadl na čtyři rody, včetně rodu Neovahlkampfia (Brown and De Jonckheere, 1999), a tyto rody jsou si více či méně příbuzné (De Jonckheere and Brown, 2005). Některé „vahlkampfidní“ améby byly podezřívány z působení lidských keratitid (Aitken et al., 1996). T2SS je v genomech těchto eukaryot zastoupen proteiny GspD, GspE, GspF, GspG (viz níže).
16
3. Cíle Hlavním cílem této práce bylo charakterizovat klíčové podjednotky T2SS u Naegleria gruberi a Malawimonas sp. str. 249. Praktické cíle: 1) Objasnit interakce jednotlivých komponent T2SS u N. gruberi a M. sp. str. 249 v heterologním buněčném systému pomocí kvasinkového a bakteriálního dvouhybridního systému. 2) Sledovat import podjednotky GspG N. gruberi do mitochondrie. 3) Otestovat import podjednotky GspD M. sp. str. 249 do mitochondrie.
17
4. Materiál a metodika 4.1. Organismy a jejich kultivace 4.1.1. Naegleria gruberi Axenická buněčná kultura trofozoitů N. gruberi byla použita pro izolaci mitochondrií a následný import proteinu NgGspG. Buňky byly kultivovány v médiu M7 (Fulton et al., 1984) při 27 °C s antibiotikem Pen-Strep (finální koncentrace 10 jednotek penicilinu a 10 µg/ml streptomycinu). M7 médium L-methionin (Sigma)
22,5 mg
Na2HPO4 . 12 H2O (Sigma)
0,63 g
KH2PO4 (Sigma)
0,181 g
yeast extract (Oxoid)
2,5 g
D-Glukóza (Sigma)
2,7 g
dH2O
450 ml
inaktivované fetální bovinní sérum (gibco) 50 ml Všechny složky (kromě inaktivovaného séra) byly naváženy a rozpuštěny. Poté byl roztok sterilizován přefiltrováním a bylo přidáno inaktivované fetální bovinní sérum. Fetální bovinní sérum bylo inaktivováno při 56 °C po dobu 30 min.
antibiotika:
Pen-Strep (Sigma)
10 000 jednotek penicilinu a 10 mg streptomycinu/ml
4.1.2. Escherichia coli Bakterie E. coli kmene TOP10 byly použity pro namnožení rekombinantních plazmidů. Bakterie byly kultivovány v LB médiu při 37 °C s příslušnými antibiotiky pro selekci pozitivních kolonií, ampicilin (finální koncentrace 100 µg/ml) nebo kanamycin (finální koncentrace 50 µg/ml). Bakterie E. coli kmene DHT1 byly použity pro bakteriální dvouhybridní systém (BACTH = bacterial two-hybrid). Bakterie byly kultivovány v LB médiu při 37 °C.
18
LB médium LB (Sigma)
20g
dH2O
500 ml
LB plotny LB + agar (Sigma)
17 g
dH2O
500 ml
antibiotika:
ampicilin (Sigma)
100 mg/ml
kanamycin (Sigma)
50 mg/ml
4.1.3. Saccharomyces cerevisiae Kvasinky S. cerevisiae kmene YPH499 byly použity pro izolaci mitochondrií. Kvasinky S. cerevisiae kmene AH109 byly použity pro kvasinkový dvouhybridní systém (Y2H = yeast two-hybrid). Kvasinky byly kultivovány na příslušných plotnách či v tekutých médiích při 30 °C. YPGal médium yeast extract (Oxoid)
8g
pepton (Oxoid)
16 g
galaktóza (Serva)
16 g
dH2O
500 ml
2 × YPAD médium yeast extract
8g
pepton
16 g
D-glukóza (Sigma)
16 g
adenin hemisulfát (Sigma)
40 mg
dH2O
500 ml
19
YPD plotny yeast extract
5g
pepton
10 g
D-glukóza
10 g
agar (Amresco)
6g
dH2O
500 ml
SD -TRP/-LEU médium/plotny yeast nitrogen base (Sigma)
3,35 g
drop out -TRP/-LEU (Sigma)
0,77 g
D-glukóza
10 g
(agar)
6g
dH2O
500 ml
SD -TRP/-LEU/-HIS plotny yeast nitrogen base
3,35 g
drop out -TRP/-LEU/-HIS (Sigma) 0,73 g D-glukóza
10 g
agar
6g
dH2O
500 ml
SRAF -URA yeast nitrogen base
3,35 g
drop out -URA
0,96 g
rafinóza (Sigma)
10 g
agar
6g
dH2O
500 ml
4.2. Plazmidy Pro BACTH byly použity plazmidy pUT18c a pKT25.
Pro Y2H byly použity
plazmidy pGADT7 a pGBKT7. Pro in vitro translaci NgGspG byl použit kontrolní plazmid s dihydrofolát reduktázou (DHFR). Pro expresi M249GspD v kvasinkách byl použit plazmid pYES2.0 se zaklonovaným GFP. 20
4.3. Amplifikace genů Příslušné geny byly amplifikovány pomocí metody PCR (polymerase chain reaction). Jako templátová DNA byla použita genomová DNA Naegleria gruberi nebo uměle nasyntetizovaná DNA v případě genů pro Malawimonas. sp. str. 249 (Genscript). Primery byly navrženy podle sekvencí genů a obsahovaly restrikční místa pro klonování. V případě více než 50% obsahu GC párů v sekvenci byl použit enhancer. Tabulky primerů: primery vytvoření konstruktů pro import NgGspG do mitochondrií: GspG, restrikční místa NdeI, BamHI forward
CATGCATATGCACAATAGCAAAACC
reverse
CATGGGATCCTTATTCGCCACCACCGCT
primery vytvoření konstruktů pro interakci proteinů N. gruberi pomocí metody Y2H: GspD, restrikční místa NdeI, BamHI forward
GACTCATATGTTCAAAAGCCCGATT
reverse
CTGAGGATCCTTAATCGTTTTTCAGGCT
GspE bez N-koncové mitochondriální presekvence, restrikční místa NdeI, BamHI forward
GACTCATATGCCTGCAACTGATGTCAAA
reverse
CTGAGGATCCTTAAACACTGTTCTGTAA
GspF bez N-koncové mitochondriální presekvence, restrikční místa NdeI, BamHI forward
GACTCATATGTCTCATCCAGGTTTGTTG
reverse
CTGAGGATCCTTACTTATTAGCAGTGAC
GspG bez N-koncové mitochondriální presekvence, restrikční místa NdeI, BamHI forward
CATGCATATGCACAATAGCAAAACC
reverse
CATGGGATCCTTATTCGCCACCACCGCT
21
primery vytvoření konstruktů pro interakci proteinů M. sp. str. 249 pomocí metody Y2H: GspD, restrikční místa NdeI, BamHI forward
CATGCATATGATGAGCTGCAGCGCGGAG
reverse
CATGGGATCCTTACAGCGCGGTTTGCAC
N-koncová doména GspD, restrikční místa NdeI, BamHI forward
CATGCATATGGCGAGCGCGCCGGAGCCG
reverse
CATGGGATCCTTAAAATTCGAAGTTGCT
GspE bez N-koncové mitochondriální presekvence, restrikční místa NdeI, BamHI forward
CATGCATATGGTTGCATTGCCAAGAACT
reverse
CATGGGATCCTTAAACAAAATTTTCTAA
GspF bez N-koncové mitochondriální presekvence, restrikční místa NdeI, BamHI forward
CATGCATATGAGACAATCAAAGCCATCT
reverse
CATGGGATCCTTATTGTGCGTCACCACC
GspG1 bez N-koncové mitochondriální presekvence, restrikční místa NdeI, BamHI forward
CATGCATATGAGATTGGCTGAAGCAAGA
reverse
CATGGGATCCTTATCTTTGTAAAACTTG
GspG2 bez N-koncové mitochondriální presekvence, restrikční místa NdeI, BamHI forward
CATGCATATGAGAAAGTTGCAAGATATG
reverse
CATGGGATCCTTATTCCAAAGATTCAGC
Potenciální substrát T2SS GspZ, restrikční místa NdeI, BamHI forward
CATGCATATGGAGGACGATGCGAACCGT
reverse
CATGGGATCCTTAAACTTTGGTCCAGTT
22
primery pro interakci proteinů M. sp. str. 249 pomocí metody BACTH: GspD, restrikční místa XbaI, BamHI forward
CACTCTAGAGATGAGCTGCAGCGCGGAG
reverse
CACGGATCCTTACAGCGCGGTTTGCAC
N-koncová doména GspD, restrikční místa XbaI, BamHI forward
CACTCTAGAGATGGCGAGCGCGCCGG
reverse
CACGGATCCTTAAAATTCGAAGTTGCTG
GspE, restrikční místa XbaI, KpnI forward
CACTCTAGAGATGAATTTGGAAATCGA
reverse
CACGGTACCTTAAACAAAATTTTCTAAG
GspF, restrikční místa EcoRV, BamHI forward
CACGATATCGATGTTAGGTTCAGGTAG
reverse
CACGGATCCTTATTGTGCGTCACCAC
GspG1, restrikční místa XbaI, BamHI forward
CACTCTAGACACTTTAGTTGAAATGTT
reverse
CACGGATCCTTATCTTTGTAAAACTTG
GspG2, restrikční místa EcoRV, BamHI forward
CACGATATCCTCTTTGGCAGAAATCG
reverse
CACGGATCCTTATTCCAAAGATTCAG
GspZ, restrikční místa XbaI, BamHI forward
CACTCTAGAGATGGAGGACGATGCGA
reverse
CACGGATCCTTAAACTTTGGTCCAGTTT
23
50µl PCR reakce: 5 × Q5 reaction buffer
10 µl
Q5 High-fidelity DNA polymerase
0,5 µl
10mM dNTPs
1 µl
100µM forward primer
0,5 µl
100µM reverse primer
0,5 µl
templátová DNA
0,5 - 1 µl
(5 × Q5 High GC enhancer)
10 µl
sterilní H2O
x µl
PCR program: 1. 98 °C
30 s
2. 98 °C
10 s
3. 55 °C
20 s
4. 72 °C
30 s
5. 30 cyklů kroků 2-4 6. 72 °C
2 min
7. 4 °C
∞ Některé DNA fragmenty se nepodařilo amplifikovat pomocí tohoto základního PCR
programu. V těchto případech se prováděla optimalizace teploty nasedání primerů nebo byl použit optimalizovaný PCR program, ve kterém se v každém cyklu zvyšovala teplota o 1 °C.
4.4. Izolace a klonování DNA fragmentů Vzorky DNA byly analyzovány na horizontální elektroforéze v 1% agarózovém gelu. DNA byla detekována pomocí UV transiluminátoru díky přidání interkalačního barviva SYBR
Safe
(Invitrogen)
před
zatuhnutím
gelu.
Nejprve
byl
vzorek
smíchán
s 6 × koncentrovaným vzorkovým pufrem (Fermentas) a nanesen na gel. Velikosti DNA byly vztaženy k standardu Gene Ruler DNA Ladder Mix (Fermentas). DNA byla izolována z gelu použitím High Pure PCR Product Purification Kit (Roche). Vektor (plazmid) i inzert (požadovaný fragment DNA) byly štěpeny restrikčními enzymy (Fermentas, NEB) podle uvedeného protokolu. Restrikční produkty byly vyčištěny opět za pomoci High Pure PCR Product Purification Kit (Roche). Naštěpený vektor i inzert byly dále ligovány T4 DNA ligázou (Fermentas) podle uvedeného protokolu při 16 °C přes noc. 24
4.5. Transformace bakterií K chemicky kompetentním bakteriím E. coli byla po rozmražení přidána ligační reakce. Po krátkém protřepání byla reakce ponechána 15 min na ledu. K uzavření buněčné membrány kompetentních bakterií došlo tepelným šokem 45 s při 42 °C. Poté byla reakce vrácena na led. Po uplynutí 5 min bylo přidáno 500 µl LB média. Bakterie byly dále inkubovány 1 hodinu na třepačce při 37 °C, 220 RPM. Poté byly bakterie rozetřeny na LB plotny s náležitým selekčním antibiotikem a inkubovány při 37 °C přes noc. Několik narostlých kolonií bylo vždy otestováno na přítomnost daného genu pomocí PCR. Jako templátová DNA sloužila DNA z rozbitých bakterií. Výsledek byl analyzován pomocí horizontální elektroforézy. Pozitivní kolonie byly inkubovány v 5 ml LB média s příslušným selekčním antibiotikem na třepačce při 37 °C, 220 RPM přes noc. Z bakteriální kultury byl izolován plazmid použitím High-Speed Plasmid Mini Kit (Geneaid). Koncentrace daného miniprepu byla měřena na nanodropu. Dále byla provedena kontrolní restrikce příslušnými restrikčními enzymy a výsledek byl opět analyzován na horizontální elektrofréze. Při správném vyštěpení inzertu byla DNA osekvenována.
4.6. Import proteinu do mitochondrií 4.6.1. In vitro translace Pro in vitro translaci byl použit PURE Express In Vitro Protein Synthesis Kit (NEB). Nejprve byl do kontrolního (DHFR) vektoru s T7 promotorem zaklonován NgGspG. Do dalšího kontrolního vektoru s T7 promotorem byl zaklonován chimerický gen Su9 (podjednotka 9 kvasinkové ATPázy s myší DHFR). Do translačních reakcí byl přidán (mimo roztoky obsažené v kitu) RNAsin (Promega) jako inhibitor RNáz a radioaktivně značený methionin (35S-methionin, MP). Translační reakce byly inkubovány při 37 °C po dobu 2 hodin.
25
translační reakce (25 µl) : solution A
10 µl
solution B
7,5 µl
RNAsin (Promega)
1 µl
plasmid
250 ng
35
2 µl
H2O
x µl
S-Met
4.6.2. Izolace mitochondrií N. gruberi Mitochondrie pro jednu importní řadu byly izolovány z 200 ml narostlé kultury N. gruberi. Buňky byly stočeny při 1 500 × g, 10 min, 4 °C. Vzniklý pelet byl resuspendován v 1 × PBS. Buňky byly znovu stočeny při 1 500 × g, 10 min, 4 °C. Pelet byl resuspendován v 20 ml ST pufru s inhibitory proteáz (Roche). Buňky byly sonikovány na sonikátoru Q125 (Qsonica) po dobu 1 min (puls 1 s, pauza 1 s, amplituda 30 %) a stočeny při 800 × g, 15 min, 4 °C. Pelet obohacený o mitochondrie byl resuspendován v 100 µl ST pufru s inhibitory proteáz a použit na import proteinu nebo zmrazen v tekutém dusíku a skladován v -80 °C.
ST pufr sacharóza
42,85 g
TRIS (Sigma)
0,6 g
KCl
18,5 mg
dH2O
do 500 ml
Upravit pH na hodnotu 7,2 pomocí HCl a uchovávat v –20 °C.
4.6.3. Izolace kvasinkových mitochondrií Nejprve byla provedena měření růstu buněk a zhotovena růstová křivka (jak rychle daný kmen bakterií roste v daném médiu). Pro izolaci kvasinkových mitochondrií byl použit kmen YPH499. Prekultura kvasinek byla nasazena do 4 l YPG média na OD600 = 0,05 a kvasinky byly kultivovány přes noc (12 h) při 30 °C, 220 RPM do OD600 = 0,1. Buňky byly stočeny při 3 000 × g, 10 min a resuspendovány v 20 ml destilované H2O. Poté znovu stočeny při 3 000 × g, 5 min. Buňky byly resuspendovány v 20 ml Tris-DTT pufru a inkubovány při 30 °C, 15 min s mírným třepáním. Buňky byly stočeny při 3 000 × g, 5 min. Buňky byly resuspendovány v 20 ml
26
předehřátého (30 °C) 1,2M sorbitol pufru a stočeny při 3 000 × g, 5 min. Bylo odváženo 2,5 mg zymolyázy na každý gram buněk. Zymolyáza byla rozpuštěna v předehřátém (30 °C) sorbitol pufru (2 ml na každý gram buněk). Pelet buněk byl resuspendován v tomto roztoku a inkubován při 30 °C, 30 min s mírným třepáním. Buňky zbavené buněčné stěny byly stočeny při 3 000 × g, 5 min. Od této doby byly všechny kroky prováděny na ledu nebo ve 4 °C. Buňky byly dvakrát resuspendovány v 15 ml 1,2M sorbitol pufru a stočeny při 3 000 × g, 5 min, 4 °C. Po druhém stočení byly buňky resuspendovány v 25 ml BB 6,0 obsahující inhibitory proteáz (Roche). Buňky byly homogenizovány mechanicky pomocí těsného
Dounceova
homogenizátoru
a
po
každých
30
stlačeních
zkontrolovány
pod mikroskopem. Homogenát byl stočen při 3 000 × g, 5 min, 4 °C. Supernatant byl přenesen do nové zkumavky a držen na ledu. Pelet byl opět resuspendován v 25 ml BB 6,0 obsahující inhibitory proteáz, mechanicky homogenizován a homogenát stočen za stejných podmínek. Oba supernatanty byly spojeny a stočeny při 4 000 × g, 5 min, 4 °C pro odstranění tzv.
low-speed
peletu,
který
obsahuje
převážně
zbytky
buněčné
membrány
a endoplazmatického retikula. Tento krok byl dvakrát opakován a vytvořený pelet odstraněn. Výsledný supernatant byl stočen při 12 000 × g, 30 min, 4 °C. Pelety byly opatrně resuspendovány v 0,5 ml BB 6,0. Poté byla přibližně určena koncentrace mitochondrií: měření A280 2 vzorků. Jako blank bylo použito 10 µl BB 6,0 s 990 µl 0,6% SDS, jako vzorek na stanovení koncentrace 10 µl mitochondriálního peletu s 990 µl 0,6% SDS. Hodnota 0,21 odpovídá zhruba koncentraci 10 mg/ml v neředěné směsi. Následně byl vzorek znovu stočen při 12 000 × g, 10 min, 4 °C. Vzniklý pelet byl resuspendován v BB 7,4 do koncentrace 25 mg/ml a bylo přidáno fatty acid free BSA do koncentrace 10 mg/ml. Mitochondrie byly rozpipetovány do alikvót po 10 µl a rychle zmraženy v tekutém dusíku. Následně byly skladovány v -80 °C. YPG médium yeast extract
50 g
pepton
100 g
glycerol
150 ml
dH2O
do 5l
Pufrovat kyselinou mléčnou na pH 5.
27
Tris-DTT pufr: 0,1M Tris-SO4, upravit na pH 9,4 (pomocí H2SO4) / 10mM DTT 1M Tris-SO4, pH 9,4
10 ml
1M DTT
1 ml
dH2O
do 100 ml
Namíchat čerstvý před použitím.
1,2M Sorbitol pufr: 1,2M sorbitol / 20mM KPi pH 7,4 2,4M sorbitol
250 ml
1M KPi, pH 7,4
10 ml
dH2O
do 500 ml
1M KPi pH 7,4 1M K2HPO4
80,2 ml
1M KH2PO4
19,8 ml
Upravit pH na 7,4. BB 6,0: 0,6M sorbitol / 20mM K+MES, pH 6,0 2,4M sorbitol
200 ml
1M K+MES, pH 6.0
16 ml
dH2O
do 800 ml
BB 7,4: 0,6M sorbitol / 20mM K+HEPES, pH 7,4 2,4M sorbitol
25 ml
1M K+HEPES, pH 7,4
2 ml
dH2O
do 100 ml
2,4M sorbitol byl rozmíchán v deionizované H2O.
4.6.4. Import proteinu do mitochondrií Import proteinu byl sledován v časech 0, 1, 2, 4, 8 a 16 min. v čase 16* min byl sledován import do mitochondrií s narušeným membránovám potenciálem. Nejprve byly připraveny mikrozkumavky s 100 µl STOP pufru. Radioaktivně značený substrát byl smíchán s 8M ureou (v poměru 1:1) pro denaturaci proteinu. K vyizolovaným mitochondriím byl přidán 1 ml BSA importního pufru a organely byly stočeny při 10 000 × g, 5 min, 4 °C. Pelet 28
byl resuspendován v importním mixu a inkubován při 25 °C, 5 min. Mezitím byla odebrána poměrná část do mikrozkumavky se STOP pufrem označená časem 0 min a byl k ní přidán radioaktivně značený substrát. Dále byla zvlášť odebrána poměrná část mitochondrií do mikrozkumavky s 1 µl AVO mixu (16* min) a inkubována stejně jako zbytek mitochondrií v 25 °C. Ke zbylým po 5 min aktivovaným mitochondriím a ke vzorku 16* byl přidán radioaktivní substrát s ureou. V jednotlivých časech byla odebírána poměrná část mitochondrií do předem připravených mikrozkumavek se STOP pufrem, které byly drženy na ledu. Nakonec byl takto zastaven import i v oddělené mikrozkumavce s AVO mixem (16* min). Dále bylo do všech zkumavek přidáno 16 µl proteinázy K (0,5 mg/ml) a směs byla inkubována 10 min na ledu. Poté bylo do všech mikrozkumavek přidáno 4 µl 100 × PMSF (inhibitor serinových proteáz). Importní směsi byly stočeny při 16 600 × g, 10 min, 4 °C. Supernatant byl opatrně odstraněn, aby nebyl porušen pelet. Pelety byly promyty v promývacím pufru a opět stočeny při 16 600 × g, 10 min, 4 °C. Supernatant byl opět opatrně odstraněn. Dále byly vzorky resuspendovány v 20 µl vzorkového pufru pro SDS-PAGE. BSA importní pufr fatty-acid free BSA (bovine serum albumin)
6g
sacharóza
17,1 g
KCl
1,19 g
MgCl2 . 6H2O
0,2 g
KH2PO4
54 mg
methionin
0,15 g
MOPS
0,42 g
dH2O
do 200 ml
Upravit pH pomocí KOH na 7,2. Importní mix BSA import pufr
800 µl
0,2M NADH
10 µl
0,2M ATP
10 µl
0,1M methionin
50 µl
kreatin kináza (10mg/ml)
10 µl
0,5M kreatin fosfát
20 µl
29
AVO mix: 1uM valinomycin, 20uM oligomycin, 8uM antimycin valinomycin (1mM zásobní roztok v etanolu)
100 µl
oligomycin (10mM zásobní roztok v etanolu)
200 µl
antimycin (8mM zásobní roztok v etanolu)
100 µl
ethanol
600 µl
stop pufr: 2 × CCCP 5mM CCCP
25 µl
BSA importní pufr
1 ml
promývací pufr: 1 × CCCP 5mM CCCP
50 µl
BSA importní pufr
4 ml
5mM CCCP (carbonylcyanide 3-chlorophenylhydrazone) rozpustit v ethanolu a skladovat v -80 °C.
4.6.5. SDS-PAGE Pro analýzu importu proteinu v jednotlivých časech byla použita metoda SDS-PAGE, elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsíranu sodného. Proteinové vzorky byly smíchány s 20 µl vzorkového pufru (1 × koncentrovaný), denaturovány v bločku při 80 °C po dobu 10 min a naneseny na gel. Byl použit 13,5% gel. SDS-PAGE byla pod napětím 90 - 150 V. Relativní molekulová hmotnost byla určena pomocí standardu (ThermoFisher).
4.6.6. Vysušení gelu, založení, vyvolání Po SDS-PAGE byl gel vysušen v sušičce gelů a založen do desek pro expozici radioaktivně značeného vzorku. V prvních pokusech byl na detekci radioaktivity použit rentgenový film, který byl exponován přes noc a poté vyvolán. V pozdějších pokusech byla na detekci radioaktivity použita deska pro phosphorimaging. Pro detekci signálu byl využit zobrazovací přístroj Typhoon FLA 7000 (GE Healthcare), který umožňuje rychlejší zobrazení a snadnou kvantifikaci značeného vzorku. Následná analýza vzorku byla provedena pomocí programu ImageQuant.
30
4.7. Bakteriální dvouhybridní systém Bakteriální dvouhybridní systém (BACTH) byl popsán v publikaci Karimova et al. (1998). BACTH umožňuje detekovat interakci dvou proteinů díky katalytické doméně adenylátcyklázy Bordetella pertusis (původce černého kašle). Tato katalytická doména se skládá ze dvou komplementárních fragmentů T25 a T18 (názvy podle velikosti: 25 a 18kDa), (Obr. 8).
Obrázek 8: Organizace adenylátcyklázy Bordetella pertusis a základ BACTH metody založen na reorganizaci T18 a T25 podjednotek. A: Zbytková syntéza cAMP při expresi adenylát cyklázy v E. coli cya- kmene. B: Žádné cAMP není produkováno, pokud jsou podjednotky T18 a T25 produkovány odděleně. C: Pokud dojde ke kontaktu podjednotek T18 a T25 díky interakci dvou proteinů X a Y, je v buňce obnovena produkce cAMP. D: Princip metody pro membránové proteiny. Převzato z (Battesti and Bouveret, 2012).
Pokud jsou tyto podjednotky v cya- kmeni (deletovaný gen kódující adenylátcyklázu) bakterie E. coli asociovány s interagujícími proteiny (tj. dochází ke kontaktu T18 a T25 podjednotek), spouští syntézu cAMP, který indukuje expresi β-galaktosidázy (Obr. 9). Síla interakce může být měřena kolorimetricky na plotnách (LB-X-gal nebo MacConkey médium s maltózou) nebo měřením β-galaktosidázové aktivity.
31
Obrázek 9: Protokol pro BACTH metodu. A: E. coli cya- kmen je transformován dvěma kompatibilními plazmidy nesoucích hybridy s T18 a T25 podjednotkami. Interakce proteinů X a Y zapříčiňuje, že se podjednotky dostanou k sobě a obnovují syntézu cAMP. cAMP indukuje expresi operonů laktózy a maltózy a také zvyšuje expresi hybridních genů. B: Transformované bakterie jsou vysety na LB plotny s ampicilinem a kanamycinem. Kolonie jsou poté kultivovány přes noc v tekutém médiu a následně je stanovena interakce proteinů pomocí kolorimetrických měření nebo pomocí měření β-galaktosidázy. Převzato z (Battesti and Bouveret, 2012).
4.7.1. Zaklonování genů do vektorů Nejprve byly geny zaklonovány do vektorů pUT18c (obsahující gen pro 18 kDa podjednotku adenylátcyklázy) a pKT25 (obsahující gen pro 25 kDa podjednotku adenylátcyklázy).
4.7.2. Příprava kompetentních bakterií Pro přípravu kompetentních bakterií byl použit druh E. coli kmene DHT1. Nové kompetentní bakterie nejprve podstoupily tepelný šok (45 s při 42 °C, poté na led). Dále byly natřeny na LB plotnu s X-gal (Sigma) a IPTG (Sigma). 1 bílá (světlá) kolonie byla vyizolována, inokulována do 5 ml LB média a kultivována při 37 °C přes noc. 2 ml prekultury byly inokulovány do 500 ml LB média a kultivovány při 37 °C do OD600 = 0,6. Kultivační láhev byla zchlazena na ledu na kývačce po dobu 10 min. Bakterie byly stočeny v předchlazených (na ledu) zkumavkách a rotoru při 4 200 × g, 10 min. Supernatant byl odstraněn a bakterie byly opatrně resuspendovány v 200 ml studeného sterilního 0,1M CaCl2. Poté byly bakterie inkubovány 20 min na ledu, stočeny při 4 200 × g, 10 min. Supernatant byl odstraněn a bakterie byly resuspendovány v 8 ml studeného 0,1M CaCl2 a přidán glycerol 32
(finální koncentrace 15 %). Alikvóty 0,5 ml bakteriální suspenze byly rozděleny do 1,5 ml zkumavek a zmrazeny v tekutém dusíku (skladovány v -80 °C) nebo ihned použity k transformaci.
4.7.3. Kotransformace bakterií Do mikrozkumavek byly pipetovány 1 - 3 µl každého rekombinantního plazmidu (pUT18c, pKT25) s vloženým příslušným genem, prázdné plazmidy jako negativní kontrola a rekombinantní plazmidy s geny kódující ověřené interagující proteiny jako pozitivní kontrola. Množství plazmidu bylo upravováno podle úspěšnosti transformace, obecně by měla koncentrace plazmidu dosahovat 20 - 50 ng. Zkumavky s plazmidy byly zchlazeny na ledu a do každé zkumavky bylo přidáno 50 µl DHT1 kompetentních bakterií. Dále byly inkubovány 30 min na ledu a poté byly vystaveny tepelnému šoku při 42 °C po dobu 1 min a poté zchlazeny na ledu. Bakterie byly převrstveny 250 µl LB média a kultivovány při 37 °C, 220 RPM. Po uplynutí 30 min byly bakterie rozetřeny na plotny obsahující ampicilin (100 µg/ml) a kanamycin (50 µg/ml). Kotransformované bakterie byly kultivovány při 30 °C, 48 – 96 hodin.
4.7.4. Měření β-galaktosidázy (výpočet Millerových jednotek) Z každé plotny byly vybrány 3 kolonie. 1 kolonie byla inokulována do zkumavky obsahující 1 ml LB média s ampicilinem (100 µg/ml) a kanamycinem (50 µg/ml). Bakterie byly kultivovány přes noc v 30 °C, 220 RPM. Další den ráno bylo inokulováno 0,25 ml prekultury do 5 ml LB média obsahující stejnou koncentraci ampicilinu a kanamycinu a 1mM IPTG. Bakterie byly kultivovány při 30 °C, 220 RPM do OD600 = 1 - 1,5. Byla změřena OD600 bakteriální kultury (pro přesnější měření byla kultura 10 × naředěna). Ve skleněných zkumavkách bylo smícháno 0,5 ml bakterií s 0,5 ml Z pufru. K této směsi bylo přidáno 20 µl chloroformu a každá zkumavka byla vortexována 10 s. Zkumavky byly inkubovány 5 min při 28 °C ve vodní lázni. Reakce byla započata přidáním 0,2 ml ONPG (4 mg/ml, čerstvě naředěného v Z pufru). Jakmile se vyvinula citrónově žlutá barva, byla reakce ukončena přidáním 0,5 ml 1M Na2CO3. Doba reakce byla zaznamenána v minutách. Reakční mix byl stočen při 16 600 × g, 5 min. Nakonec byla změřena OD420 supernatantu a vypočítány Millerovy jednotky podle běžného vzorce:
33
Z pufr M63 médium
50 ml
1M DTT
40 µl
10% SDS
15 µl
M63 médium KH2PO4
13,6 g
(NH4)2SO4
2g
FeSO4 . 7H2O
500 µl
MgSO4 . 7H2O
245 mg
dH2O
do 1000 ml
Upravit pH na 7 (KOH).
4.8. Kvasinkový dvouhybridní systém (Y2H) Kvasinkový
dvouhybridní
systém
(Y2H)
umožňuje detekovat interakci dvou proteinů. Poprvé byl popsán Fields and Song (1989). Proteiny jsou spojeny s doménami transkripčního faktoru (Obr. 10). Pokud proteiny interagují, dostávají se k sobě GAL4 aktivační a vázající doména transkripčního faktoru a je spuštěna transkripce daného genu (v našem případě HIS3). Tuto transkripční aktivitu můžeme detekovat na plotnách s minimálním médiem. Obrázek 10: Y2H. A: DNA vázající hybridní doména neaktivuje transkripci, pokud protein X neobsahuje aktivační doménu. B: Aktivační hybridní doména neaktivuje transkripci, protože není lokalizována na DNA vázající doménu. C: Interakce mezi proteiny X a Y přináší aktivační doménu do blízkosti DNA vázající domény a spouští transkripci. Převzato z (Phizicky and Fields, 1995).
4.8.1. Kotransformace kvasinek Nejprve byly geny zaklonovány do vektorů pGADT7 (obsahující gen pro aktivační doménu transkripčního faktoru) a pGBKT7 (obsahující gen vazebnou doménu transkripčního faktoru). 34
První den byl kvasinkový kmen AH109 inokulován do 5 ml 2 × YPAD média a inkubován přes noc na třepačce při 30 °C, 200 RPM. Druhý den byla změřena OD600 narostlé kultury (naředěno, aby se hodnota pohybovala do 1). Kvasinková kultura byla naředěna do 50 ml 2 × YPAD média s OD600 = 0,2 a inkubována na třepačce při 30 °C, 200 RPM do OD600 = 0,8. Buňky byly stočeny při 3 000 × g, 5 min, promyty v 25 ml sterilní H2O a resuspendovány v 1 ml sterilní vody. Mezitím byla denaturována (95 °C, 5 min) přenašečová DNA (salmon sperm DNA = SS DNA) a poté zchlazena na ledu (zamezení DNA renaturaci). Buňky byly dány do mikrozkumavky a stočeny při 3 000 × g, 1 min, byl odstraněn supernatant. Dále bylo 100 µl buněk resuspendováno v 400 µl H2O, zvortexováno a rozděleno po 50 µl do mikrozkumavek pro každou transformaci. Buňky byly stočeny při 3 000 × g, 1 min a byl odstraněn supernatant. Dále byly k buňkám postupně přidávány jednotlivé roztoky v daném pořadí. PEG 3500 50% w/v
240 µl
LiAc 1.0 M
36 µl
denaturovaná SS DNA
50 µl
plazmidová DNA (5 µl + 5 µl) + voda
34 µl
celkem
360 µl
Každá transformace byla následně vortexována 1 min. Transformované buňky byly inkubovány při 42 °C po dobu 40 min. Buňky byly stočeny při 3 000 × g, 1 min a byl odstraněn supernatant. Kvasinky byly dále resuspendovány v 500 µl vody a natřeny na plotny: 250 µl na plotnu SD -TRP/-LEU, 250 µl na plotnu SD -TRP/-LEU/-HIS. Na každou plotnu bylo také rozetřeno antibiotikum kanamycin (finální koncentrace 50 µg/ml). Plotny byly inkubovány při 30 °C po dobu 3 - 4 dnů, dokud se neobjevily kolonie.
4.8.2. Rozkapání (Serial dilution test) Z plotny byla inokulována 1 kolonie do 5 ml SD -TRP/-LEU s ampicilinem (finální koncentrace 100 µg/ml) a inkubována přes noc při 30 °C, 200 RPM. Buňky byly stočeny při 3 000 × g, 1 min, supernatant byl odstraněn. Kvasinky byly rozmíchány ve sterilní vodě do OD600 = 0,2 a dále rozředěny do ředící řady (Obr. 11). Plotny byly inkubovány při 30 °C.
35
Obrázek 11: Původní suspenze buněk o OD600 = 0,2 byla postupně ředěna ředící řadou 20 ×, 200×, 2 000×, 20 000×, 200 000×. 2 µl z každého ředění byly naneseny do řady na plotně. Plotny byly inkubovány při 30 °C.
4.9. Fluorescenční značení S. cerevisiae 4.9.1. Transformace buněk S. cerevisiae K transformaci byla použita kultura S. cerevisiae kmene AH109 narostlá na plotně YPD. Z plotny byla do mikrozkumavky seškrábnuta suspenze přibližně 100 µl buněk a následně promyta v 0,5 ml H2O. Buňky byly stočeny při 3 000 × g, 1 min a supernatant odsán. K peletu buněk byl přidán 1 ml 100mM LiAc, mix byl jemně promíchán a stočen při 3 000 × g, 1 min. (Mezitím byla denaturována (95 °C, 5 min) přenašečová DNA (salmon sperm DNA = SS DNA) a poté zchlazena na ledu (zamezení DNA renaturaci)). Byl odstraněn supernatant, k peletu bylo přidáno 400 µl 100mM LiAc a buňky rozsuspendovány. 50 µl buněk bylo přendáno do nové mikrozkumavky, do níž byly dále postupně přidány a jemně promíchány tyto složky (v předepsaném pořadí): 240 µl 40% PEG, 36 µl 1M LiAc, 50 µl SS DNA, 3 µl plazmidu (pYES2.0-EGFP + M249GspD) + 31 µl H2O. Mix byl vortexován 1 min a dále inkubován při 30 °C po dobu 30 min a poté při 42 °C po dobu 30 min. Transformované buňky byly stočeny při 3 000 × g, 30 s, resuspendovány v 300 µl H2O, rozetřeny na plotnu SRAF-URA a inkubovány při 30 °C po dobu 3 dnů, dokud se neobjevily kolonie. Zdroj uhlíku byl zajištěn rafinózou, aby se potlačila exprese z galaktózového promotoru plazmidu. Plazmid obsahoval gen URA3, který umožnil transformovaným kvasinkám růst na plotně s minimálním médiem bez uracilu.
36
4.9.2. Fluorescenční značení buněk S. cerevisiae Transformované kvasinky byly setřeny z plotny SRAF-URA, rozmíchány v 5 ml YPGal a třepány při 30 °C, 220 RPM po dobu 4 hodin k navození indukce exprese konstruktu M249GspD-GFP. Poté byly stočeny při 3 000 × g, 2 min. Kvasinky byly resuspendovány v 1 ml 1 × PBS a byla k nim přidána fluorescenční barva MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen) v ředění 1 : 10 000, která umožňuje specifické živé značení mitochondrií. Od této doby byly kvasinky drženy ve tmě. Následovala inkubace při 30 °C po dobu 20 min. Dále byly kvasinky stočeny při 3 000 × g, 1 min a dvakrát promyty v 1 × PBS. Na podložním skle bylo smícháno 15 µl buněk s 15 µl rozehřáté 2% low-melting agarózy (Sigma), vzniklá suspenze byla přikryta krycím sklem. Poté jsme vzorek ihned pozorovali na mikroskopu (Nikon Eclipse Ti).
37
5. Výsledky 5.1. Bioinformatická analýza Gsp Nejprve byly v naší laboratoři (Mgr. Vojtěch Žárský) objeveny čtyři podjednotky T2SS (GspD, GspE, GspF, GspG) u těchto eukaryotických organismů: Naegleria fowleri, Naegleria gruberi, Neovahlkampfia damariscottae, Reclinomonas americana, Andalucia godoyi, Malawimonas jakobiformis a Malawimonas sp. str. 249, patřících do skupiny Discoba a Malawimonada. Poté byly manuálně dohledány (Doc. Mgr. Marek Eliáš, Ph.D., Romain Derelle, Ph.D.) další izomery některých genů (GspE1, E2, E3, E4; GspG1, G2). Pro identifikaci dalších možných komponent byla ve spolupráci s Romainem Derellem provedena srovnávací analýza genomů výše zmíněných organismů. V seznamu takto identifikovaných 42 genech unikátních pro studované genomy byly nalezeny GspND (Nterminální doména GspD) a potenciální substrát GspZ. GspZ byl navržen jako případný substrát kvůli několika konzervovaným histidinům (často váží hemy) a cysteinům (často váží FeS centra), viz 5.1.1. Alignmenty Gsp proteinů. Právě proteiny vážící hemy nebo FeS centra jsou častými substráty T2SS. U výše zmíněných organismů bylo postupně odhaleno osm genů T2SS včetně izomerních forem, komplexita bakteriálního T2SS je však mnohem větší (Tab. 2). Tabulka 2: Přehled bakteriálních a eukaryotických komponent T2SS. Barvy (zeleně - přítomnost, červeně nepřítomnost) značí výskyt Gsp genů u daných druhů organismů, první dva druhy zastupují bakterie.
38
5.1.1. Alignmenty Gsp proteinů Z alignmentů jednotlivých proteinů je dobře rozpoznatelná homologie s bakteriálními komponentami T2SS. V alignmentech jsou zastoupeny bakteriální organismy: Escherichia coli, Klebsiella oxytoca a eukaryotní organismy: Andalucia godoyi, Reclinomonas americana, Naegleria gruberi, Naegleria fowleri, Neovahlkampfia damariscottae, Malawimonas jakobiformis, Malawimonas sp. str. 249 (Obr. 12-16). V posledním alignmentu GspZ zastoupeném pouze protisty je dobře vidět několik konzervovaných cysteinů a histidinů (Obr. 17). Alignmenty byly vytvořeny využitím ClustalW, který je součástí programu BioEdit. Analýzou eukaryotických sekvencí byla u proteinů GspE, GspF a GspG identifikována pravděpodobná mitochondriální presekvence (MTS = „mitochondrial targeting sequence“), viz 5.1.3. Mitochondriální presekvence Gsp proteinů.
Obrázek 12: Alignment později objevené N-koncové domény GspD. Žlutě vyznačena N1 doména, zeleně N2 doména, modře N3 doména. Předcházející N0 doména se vyskytuje pouze u bakteriálních zástupců. Vlastní membránová doména sekretinu je u eukaryot obsažena jako samostatný protein (viz obrázek níže).
39
Obrázek 13: Alignment GspD. Z alignmentu je patrná absence N-terminální části proteinu u eukaryotických zástupců. Tato část proteinu, která představuje jeho solubilní periplazmatickou část, existuje u studovaných eukaryot jako samostatný protein (viz obrázek výše).
40
Obrázek 14: Alignment GspE. U N. gruberi a M. sp. str. 249 podtrženy MTS. MTS byly určeny pomocí alignmentu s bakteriálními organismy a predikčních programů: TargetP, MitoProt, PSORT II,
viz 5.1.3.
Mitochondriální presekvence. V rámečcích vyznačeny ATPázové motivy: červeně – Walker A motiv, modře – Asp boxy, oranžově – His box, fialově - Walker B motiv.
41
Obrázek 15: Alignment GspF. U N. gruberi a M. sp. str. 249 podtrženy MTS. MTS byly určeny pomocí alignmentu s bakteriálními organismy a predikčních programů: TargetP, MitoProt, PSORT II, viz 5.1.3. Mitochondriální presekvence. Ve fialových rámečcích zvýrazněny 3 TMDs na základě predikčního programu TMHMM.
42
Obrázek 16: Alignment GspG. U N. gruberi a M. sp. str. 249 podtrženy MTS. MTS byly určeny pomocí alignmentu s bakteriálními organismy a predikčních programů: TargetP, MitoProt, PSORT II, viz 5.1.3. Mitochondriální presekvence. Červená šipka ukazuje procesující místo prepilin peptidázy. Motiv pro prepilin peptidázu chybí u eukaryotických zástupců, což ukazuje na odlišné procesování proteinu. Ve fialovém rámečku zvýrazněna TMD na základě predikčního programu TMHMM.
43
Obrázek 17: Alignment potenciálního substrátu GspZ. Hlavními důvody pro jeho substrátovou funkci byly (i) ko-evoluce s podjednotkami T2SS u eukaryot a (ii) konzervované funkční
aminokyselinové zbytky.
V červených rámečcích zvýrazněny konzervované cysteiny, v modrých rámečcích zvýrazněny konzervované histidiny. Proteiny vážící hemy nebo FeS centra jsou častými substráty T2SS.
5.1.2. Analýza GspG Hlavní pseudopilinové podjednotky bakteriálních i eukaryotických T2SS mají krátký cca 25 - 30 aminokyselin dlouhý hydrofobní úsek (predikční program TMHMM), který je kotví ve vnitřní mitochondriální membráně. Tomuto transmembránovému úseku předchází prepilin peptidázové procesující místo a následuje (pseudo)pilinová doména (Obr. 18). Absence prepilin peptidázového motivu v eukaryotických GspG ukazuje na odlišný způsob procesování a transportu proteinu. Namísto signálního peptidu u bakteriálních proteinů je u eukaryot přítomna velice dlouhá (až 260 aminokyselin u N. fowleri) nehomologická sekvence, jež pravděpodobně obsahuje MTS (viz níže). Evoluce pilinů a pseudopilinů je příliš složitá, abychom dokázali objasnit vztahy mezi jednotlivými skupinami bakterií. Naše předběžné analýzy ukazují, že zatímco nejsme schopni rozlišit původ eukaryotického T2SS, předpokládáme, že tento systém je monofyletický, tzn. že všichni eukaryotičtí zástupci ho zdědili od jednoho společného předka (Obr. 19).
44
Obrázek 18: Srovnání bakteriálního a eukaryotického GspG.
Obrázek 19: Fylogenetická analýza pilinů a pseudopilinů. Alignment byl vytvořen pomocí ClustalW, který je součástí programu BioEdit, poté manuálně editován a použit (146 pozic) pro fylogenetickou analýzu pomocí PhyMl. * - hodnoty bootstrapu pod 50, II – pseudopilin T2SS, IV – pilin T4PS
45
5.1.3. Mitochondriální presekvence Gsp proteinů Ke studiu interakcí mezi proteiny pomocí Y2H bylo třeba odstranit MTS. Vytvoření fúzního proteinu obsahujícího na N-konci doménu transkripčního faktoru totiž znemožňuje odštěpení MTS. V proteinové sekvenci byla u GspE, GspF a GspG (proteiny směřující do vnitřní membrány mitochondrie) určena MTS (Tab. 3) kombinací několika technik: predikční programy TargetP, MitoProt, PSORT II; alignment příbuzných a bakteriálních organismů. Tabulka 3: Přehled proteinů, u kterých byla zkrácena MTS.
název proteinu
původní velikost
konec presekvence
velikost bez presekvence
NgGspE
442 bp
IGF 129| PAT
314 bp
NgGspF
502 bp
DPT 129| SHP
374 bp
NgGspG
394 bp
IHH 164| LSM
231 bp
M249GspE
1062 bp
RAG 118| VAL
945 bp
M249GspF
1317 bp
TAS 181| RQS
1137 bp
M249GspG1
828 bp
LLA 298| RLA
531 bp
M249GspG2
924 bp
MYP 328| RKL
603 bp
5.2. Naegleria gruberi 5.2.1. Interakce mezi Gsp proteiny pomocí Y2H Po úspěšném zaklonování Gsp genů (NgGspD, bez MTS: NgGspE, NgGspF, NgGspG) do Y2H plazmidů pGADT7 a pGBKT7 byly kvasinky S. cerevisiae kmene AH109 kotransformovány vybranými dvojicemi rekombinantních plazmidů (Tab. 4). Jako negativní kontrola byl rekombinantní plazmid každého NgGsp genu jednou kotransformován s prázdným plazmidem.
46
Tabulka 4: Vybrané dvojice rekombinantních plazmidů s Gsp geny N. gruberi, kterými byly kotransformovány kvasinky S. cerevisiae kmene AH109.
pGBKT7
pGADT7
pGBKT7
pGADT7
NgGspD
prázdný
NgGspF
prázdný
NgGspD
NgGspD
NgGspF
NgGspF
NgGspD
NgGspG
NgGspF
NgGspG
NgGspE
prázdný
NgGspG
prázdný
NgGspE
NgGspE
NgGspG
NgGspD
NgGspE
NgGspF
NgGspG
NgGspF
NgGspG
NgGspG
Kotransformované kvasinky byly vysety na plotnu SD -TRP/-LEU pro ověření, že buňky byly transformovány oběma plazmidy a na plotnu SD -TRP/-LEU/-HIS pro průkaz interakce. Dále byly kvasinky rozkapány do ředící řady na plotnu SD-TRP/-LEU/-HIS. Pouze interakce mezi NgGspG a NgGspD byla pozitivní (Obr. 20). Bohužel, jak bylo později zjištěno, byl gen NgGspD kratší na N-konci, kvůli špatné anotaci genomu.
Obrázek 20: Rozkapání (serial dilution test) transformovaných kvasinek do ředící řady. Pozitivní interakce pouze mezi NgGspG a NgGspD (bez N-konce). Jako negativní kontrola byl použit pGBKT7 se zaklonovaným NgGspG a prázdný pGADT7.
5.2.2. Interakce mezi Gsp proteiny pomocí BACTH Nejdříve byly zaklonovány NgGsp geny do BACTH plazmidů pUT18c a pKT25. Dále byly vybranými dvojicemi transformovány bakterie E. coli kmene DHT1. Po úspěšné transformaci byla stanovena β-galaktosidázová aktivita (výpočet Millerových jednotek). Jako negativní kontrola byla použita transformace prázdnými plazmidy pUT18c a pKT25, také rekombinantní plazmid pKT25 s NgGsp genem byl vždy transformován s prázdným plazmidem pUT18c. Jako pozitivní kontrola byly použity rekombinantní plazmidy s motivem leucinového zipu (pKT25_Zip + pUT18c_Zip). 47
BACTH metodu u NgGsp genů provedla Mgr. Lenka Horváthová, Ph.D. Byla detekována interakce mezi NgGspG a NgGspG (Graf 1).
Graf 1: Výsledky měření β-galaktosidázové aktivity (výpočet Millerových jednotek) NgGsp. První sloupec (černý) představuje negativní kontrolu: prázdné plazmidy pUT18c-pKT25 (T18-T25), druhý sloupec (šedý) je pozitivní kontrola: pUT18c_Zip-pKT25_Zip (T18Z-T25Z), třetí sloupec (světle modrý) je prokázaná interakce mezi NgGspG: pUT18c_ NgGspG-pKT25_ NgGspG (T18G-T25G), čtvrtý a pátý sloupec (světle a tmavě oranžový) jsou negativní kontroly pro NgGspG: pUT18c_ NgGspG-pKT25 (T18G-T25) a pUT18c-pKT25_ NgGspG (T18-T25G). Ostatní barevné sloupce jsou neprokázané interakce mezi NgGspG, NgGspF a NgGspE.
5.2.3. Import NgGspG do mitochondrií Z důvodu analýzy mitochondriálního targetování NgGspG byly zahájeny in vitro importní studie. NgGspG gen byl nejprve zaklonován do kontrolního DHFR plazmidu, DHFR gen byl zaměněn za NgGspG gen. Do dalšího kontrolního DHFR plazmidu byla zaklonován chimerický gen Su9 (podjednotka 9 kvasinkové ATPázy) s myší DHFR. Tyto rekombinantní plazmidy byly použity do in vitro translačních reakcí. Tato metoda nebyla v naší laboratoři zavedena a výsledná správnost i množství proteinu bylo nečekaným úspěchem (Obr. 21).
48
Obrázek 21: Kontrola výsledku translační reakce. 0,5 µl reakce bylo naneseno a analyzováno pomocí SDSPAGE. Gel byl poté vysušen a radioaktivita byla detekována na film, který byl exponován přes noc a vyvolán.
Po úspěšné translaci NgGspG byly izolovány mitochondrie kvasinek S. cerevisiae kmene YPH499. Importní pokusy byly navrženy tak, aby se mj. zjistila potřeba membránového potenciálu (∆Ψ) pro import do vnitřní mitochondriální membrány. Nejdříve byl optimalizován import pozitivní kontroly Su9 (Obr. 22, 23). Na jednotlivých importech je vidět malý posun importovaných „bandů“, který odpovídá procesování kvasinkové Su9.
Obrázek 22: Příklady optimalizace importů Su9 do mitochondrií kvasinek YPH499. a) Velké množství proteinu
a málo proteinázy K. b) Místo proteinázy K použit trypsin (2 µl trypsinu (10 mg/ml)) a místo PMSF použito TPI (20 µl TPI (20 mg/ml)). ∆Ψ - membránový potenciál, p – prekurzor, m – maturovaný (procesovaný) protein
49
Obrázek 23: Import a graf importu Su9 do mitochondrií kvasinek (YPH499). ∆Ψ - membránový potenciál
Následně byl proveden import NgGspG do kvasinkových mitochondrií (Obr. 24). Importy bylo třeba optimalizovat, ale pozitivní kontrola i studovaný NgGspG se úspěšně importovaly. Byla prokázána potřeba membránového potenciálu k importu a vlastní import obou proteinů do mitochondrií. Koncový úbytek proteinu NgGspG může být způsoben možnou degradací v nespecifickém heterologním buněčném systému. Navíc nebylo pozorováno předpokládané odštěpení MTS.
Obrázek 24: Import a graf importu NgGspG do mitochondrií kvasinek (YPH499). ∆Ψ - membránový potenciál
Poté byly izolovány mitochondrie N. gruberi. A následně byl do nich proveden import NgGspG (Obr. 25). Na rozdíl od mitochondrií S. cerevisiae došlo během importu k procesování. Jestli je ovšem procesování specifické bude třeba dále otestovat.
50
Obrázek 25: Import NgGspG do mitochondrií N. gruberi. „Bandy“ s hvězdičkou jsou kandidáti pro procesování NgGspG.
5.3. Malawimonas sp. str. 249 Pro studium interakcí eukaryotických Gsp proteinů byly vybrány i geny Malawimonas sp. str. 249. Hlavními důvody pro tento záměr byly: (i) vysoká kvalita zjištěné genomové sekvence a následné genové predikce (publikovaný genom N. gruberi obsahuje řadu chybějících úseků), (ii) relativně krátké MTS a (iii) vyšší podobnost s bakteriálními Gsp proteiny zjištěná vzájemným porovnáváním jednotlivých homologů.
5.3.1. Interakce mezi Gsp proteiny pomocí Y2H Po úspěšném zaklonování Gsp genů (M249GspD, M249GspND, M249GspZ, bez MTS: M249GspE, M249GspF, M249GspG1, M249GspG2) do Y2H plazmidů pGADT7 a pGBKT7 byly kvasinky S. cerevisiae kmene AH109 kotransformovány vybranými dvojicemi rekombinantních plazmidů (Tab. 5). Jako negativní kontrola byla použita dvojice prázdných plazmidů pGADT7 a pGBKT7.
51
Tabulka 5: Vybrané dvojice rekombinantních plazmidů s Gsp geny M. sp. str. 249, kterými byly kotransformovány kvasinky S. cerevisiae kmene AH109.
pGADT7
pGBKT7
pGADT7
pGBKT7
prázdný
prázdný
M249GspG1
M249GspD
M249GspD
M249GspD
M249GspG1
M249GspND
M249GspD
M249GspND
M249GspG1
M249GspG1
M249GspD
M249GspG1
M249GspG1
M249GspG2
M249GspD
M249GspG2
M249GspG1
M249GspZ
M249GspND
M249GspD
M249GspG1
M249GspF
M249GspND
M249GspG1
M249GspG2
M249GspD
M249GspND
M249GspG2
M249GspG2
M249GspND
M249GspND
M249GspZ
M249GspG2
M249GspG1
M249GspE
M249GspE
M249GspG2
M249GspG2
M249GspE
M249GspF
M249GspG2
M249GspZ
M249GspF
M249GspG1
M249GspG2
M249GspF
M249GspF
M249GspG2
M249GspZ
M249GspND
M249GspF
M249GspE
M249GspZ
M249GspG1
M249GspF
M249GspF
M249GspZ
M249GspG2
Kotransformované kvasinky byly vysety na plotnu SD -TRP/-LEU pro ověření, že buňky byly transformovány oběma plazmidy a na plotnu SD -TRP/-LEU/-HIS pro průkaz interakce. Některé kotransformanty, které více porostly plotny SD -TRP/-LEU/-HIS (Obr. 26), byly testovány dále. Kvasinky byly rozkapány do ředící řady na plotnu SD-TRP/-LEU/-HIS. Z šesti dříve narostlých kotransformantů, však byla spolehlivě potvrzena pouze interakce mezi dvěma GspD, slaběji pak vyšly interakce mezi GspD a GspND (N-koncová mezimembránová část GspD) a mezi GspND a potenciálním substrátem GspZ (Obr. 27).
52
Obrázek 26: Vybrané kvasinkové kotransformace, které více porostly plotny SD-TRP/-LEU/-HIS. Tři možné interakce
(M249GspD+M249GspD,
M249GspD+M249GspND,
M249GspND+M249GspZ)
potvrzeny
po následném ředícím růstovém testu (Obr. 27). Jediná kotransformace narostlá v obou kombinacích plazmidů (M249GspG2+M249GspND) nebyla potvrzena, stejně jako z této sady nejméně narostlá plotna s kotransformací M249GspG1+M249GspND.
Obrázek 27: Rozkapání (serial dilution test) transformovaných kvasinek do ředící řady. Pozitivní interakce mezi M249GspD a M249GspD, slaběji pak mezi M249GspD a M249GspND a mezi M249GspND a potenciálním substrátem M249GspZ. Jako negativní kontrola byly použity kvasinky s prázdnými plazmidy pGBKT7 a pGADT7.
53
5.3.2. Interakce mezi Gsp proteiny pomocí BACTH Geny M249Gsp byly zaklonovány do BACTH plazmidů pUT18c a pKT25. Dále byly vybranými dvojicemi (Tab. 6), transformovány bakterie E. coli kmene DHT1. Po úspěšné transformaci byla stanovena β-galaktosidázová aktivita (výpočet Millerových jednotek). Jako negativní kontrola byla použita transformace prázdnými plazmidy pUT18c a pKT25, také rekombinantní plazmid pKT25 s M249Gsp genem byl vždy transformován s prázdným plazmidem pUT18c. Jako pozitivní kontrola byly použity rekombinantní plazmidy s motivem leucinového zipu (pKT25_Zip + pUT18c_Zip). V naší laboratoři se nepodařilo prokázat žádnou z testovaných interakcí (Graf 2, 3, 4). I pozitivní kontroly nedosahovaly tak vysokých hodnot jako je obvyklé. Proto byly rekombinantní plazmidy poslány do laboratoře Makromolekulárních systémů a signalizace (Institut Pasteur, Paris), kde je BACTH metoda zavedená. Tam se povedlo potvrdit interakce mezi GspG1 a GspG1, také byly detekovány interakce mezi GspE a GspE a mezi GspG2 a GspF (Graf 5), které nebyly mezi původními námi testovanými. V současnosti pracujeme na reanalýze výsledků. Tabulka 6: Vybrané dvojice rekombinantních plazmidů s Gsp geny M. sp. str. 249, kterými byly kotransformovány bakterie E. coli kmene DHT1.
pGADT7
pGBKT7
pGADT7
pGBKT7
prázdný
prázdný
M249GspG1
M249GspD
M249GspD
M249GspD
M249GspG1
M249GspND
M249GspD
M249GspND
M249GspG1
M249GspG1
M249GspD
M249GspG1
M249GspG1
M249GspG2
M249GspD
M249GspG2
M249GspG1
M249GspZ
M249GspND
M249GspD
M249GspG1
M249GspF
M249GspND
M249GspG1
M249GspG2
M249GspD
M249GspND
M249GspG2
M249GspG2
M249GspND
M249GspND
M249GspZ
M249GspG2
M249GspG1
M249GspE
M249GspE
M249GspG2
M249GspG2
M249GspE
M249GspF
M249GspG2
M249GspZ
M249GspF
M249GspG1
M249GspG2
M249GspF
M249GspF
M249GspG2
M249GspZ
M249GspND
M249GspF
M249GspE
M249GspZ
M249GspG1
M249GspF
M249GspF
M249GspZ
M249GspG2
54
Graf 2: Výsledky β-galaktosidázové aktivity při testovaných interakcích M249GspND, GspD.
Graf 3: Výsledky β-galaktosidázové aktivity při testovaných interakcích M249GspG1, GspG2.
55
Graf 4: Výsledky β-galaktosidázové aktivity při testovaných interakcích M249GspZ. Grafy 2-4: Tmavě modré sloupce představují negativní kontroly. Světle modré sloupce reprezentují pozitivní kontroly. Ostatní modré sloupce jsou negativní testované interakce.
Graf 5: Výsledky β-galaktosidázové aktivity při testovaných interakcích M249Gsp obdržené z Institut Pasteur, Paris. Tmavě modrý sloupec představuje negativní kontrolu. Světle modrý sloupec reprezentuje pozitivní kontrolu. Zelený, oranžový a fialový sloupec ukazují slabě pozitivní interakce. Ostatní moudré sloupce jsou negativní testované interakce.
56
5.3.3. Lokalizace M249GspD Sekretin M. sp. str. 249 (M249GspD) nemá na rozdíl od jiných proteinů T2SS (GspE, GspF, GspG) MTS. GspD by měl směřovat do vnější mitochondriální membrány stejně jako jeho bakteriální homolog. Aby byla potvrzena tato hypotéza, byl M249GspD exprimován v buňkách S. cerevisiae. Gen M249GspD byl nejprve zaklonován do plazmidu pYES2.0 s vloženým GFP genem. Poté byly kvasinky S. cerevisiae kmene AH109 transformovány tímto rekombinatním plazmidem, obarveny fluorescenční barvou MitoTracker Red CMXRos značící mitochondrie a pozorovány. Protein M249GspD kolokalizoval s mitochondriemi (Obr. 28). Menší rozšíření M249GspD může být způsobeno negativním ovlivněním mitochondriálních funkcí po vložení sekretinu do mitochondriální membrány a celkovým špatným stavem kvasinek po indukci exprese proteinu.
Obrázek 28: Lokalizace M249GspD. Zleva: buňka v DIC (diferenční interferenční kontrast), M249GspD značený GFP, mitochondrie značené MitoTracker Red CMXRos, překryv; měřítko 2 µm.
57
6. Diskuze Transportní systémy v mitochondrii jsou mozaikou bakteriálních pozůstatků a eukaryotních vynálezů. Doposud však nebylo objeveno, že by mitochondrie měla či potřebovala transportní systém pro export proteinů přes vnější membránu. Objev klíčových genů T2SS u eukaryotických organismů je překvapující, a kdyby byl T2SS schopen obdobné funkce jako v bakteriálních membránách, bylo by zajímavé zjistit, jaké proteiny přenáší. Tzn. jestli a jaké proteiny mitochondrie exportuje. Tuto hypotézu podporuje i objev genů transportních exportních mechanismů (Sec a Tat dráha transportující proteiny přes vnitřní membránu) spolupracujících s T2SS v mtDNA jakobidů (Burger et al., 2013).
6.1. Podjednotky T2SS u N. gruberi V počáteční fázi pokusů s N. gruberi, která je v naší laboratoři axenicky kultivována, byly objeveny pouze čtyři klíčové geny T2SS (GspD, GspE, GspF, GspG). Produkty těchto genů byly lokalizovány Mgr. Lenkou Horváthovou, Ph.D. v mitochondriích N. gruberi pomocí specifických polyklonálních protilátek (data nepublikována). Po tomto potvrzení, že proteiny směřují do mitochondrie, byly provedeny pokusy možných interakcí pomocí dvou metod: Y2H a BACTH. Obě tyto metody jsou heterologními experimentálními systémy, ke kterým bylo přistoupeno z důvodu absence základních molekulárně-biologických technik u N. gruberi. V současné době je v naší a ostatních laboratořích testována řada technik, pomocí kterých by bylo možné N. gruberi transformovat. Pomocí Y2H bylo testováno několik dvojic předpokládaných interagujících proteinů. Pozitivní interakce byla detekována pouze u GspD a GspG. Později jsme však zjistili, že byla použita nesprávná délka genu GspD kvůli špatné anotaci genomu. Proto budeme tento experiment opakovat s novým konstruktem. Z hlediska funkce T2SS je tato interakce smysluplná, neboť by se měla uplatňovat během průchodu substrátu (exoproteinu) skrz sekretinový pór díky síle pseudopilu, který pórem také prochází. Vlastní mechanismus sekrece však není plně objasněn ani u bakteriálního T2SS. Metodu BACTH u proteinů N. gruberi provedla Mgr. Lenka Horváthová, Ph.D. Pozitivně vyšla jediná interakce GspG a GspG. Tento výsledek je v souladu s objevem, že podjednotky GspG jsou hlavní pseudopiliny tvořící pseudopilus T2SS (Vignon et al., 2003). V obou heterologních systémech zvolených ke studiu interakce proteinů vyšel jako interagující protein GspG, proto jsme se rozhodli více se na něj zaměřit. GspG podjednotky 58
napříč všemi námi studovanými eukaryoty vykazovaly stejnou strukturu obdobnou s prokaryotickými GspG podjednotkami: hydrofóbní úsek, kterým by měly mezi sebou GspG podjednotky interagovat (Köhler et al., 2004) následovaný vlastní pseudopilinovou doménou. Pro studium transportu a maturace GspG byl protein in vitro přeložen a importován do izolovaných mitochondrií. Metoda in vitro translace nebyla v naší laboratoři dříve aplikována, a proto bylo nečekaným úspěchem množství i správnost přeloženého proteinu pomocí zvoleného PURE express systému. Ten na rozdíl od lyzátu retikulocytů, který je rutinně k těmto pokusům používán, obsahuje pouze purifikované bakteriální ribosomy a potřebné RNA molekuly. Následně bylo provedeno několik importů, které byly postupně optimalizovány. Množství takto připraveného proteinu je dobře viditelné i na SDS-PAGE gelu barveném Coomassie Brilliant Blue. To umožňuje využití pro budoucí in vitro pokusy, jako např. in vitro skládání pseudopilu. Prodloužený pseudopilus T2SS byl již několikrát pozorován pomocí imunoznačení a následné elektronové mikroskopie (Sauvonnet et al., 2000; Vignon et al., 2003). Další možností je tzv. „piliation assay“, založená na in vitro skládání pseudopilu a následné rozdílné sedimentaci monomerů pseudopilinů a polymerních pseudopilinových vláknech. V naší laboratoři byly zatím provedeny importní pokusy. Nejdříve byly proteiny importovány do kvasinkových mitochondrií, na jejichž izolaci je v naší laboratoři zavedený protokol. Importy pozitivní kontroly chimerického proteinu Su9 (podjednotka 9 kvasinkové mitochondriální ATPázy spojená s myší DHFR) i NgGspG do kvasinkových (YPH499) mitochondrií byly úspěšné. Byl prokázán import obou proteinů do mitochondrií a potřeba membránového potenciálu značící import proteinu do vnitřní mitochondriální membrány (Martin et al., 1991). U pozitivní kontroly Su9 je znatelný posun importovaného proteinu značící procesování kvasinkovou mitochondriální procesující peptidázou. Na rozdíl od importu NgGspG, kde žádný posun vidět není. Kvasinková mitochondriální procesující peptidáza zřejmě nerozpozná štěpící místo u NgGspG. Dále byla provedena izolace mitochondrií N. gruberi a následně import NgGspG. Tento import již nebyl tak úspěšný. Je na něm vidět mnoho bandů, u kterých se můžeme dohadovat o procesování NgGspG, ale import tu není tak znatelný jako u kvasinkových mitochondrií. Důvodem bude zřejmě špatný stav mitochondrií, na jejichž izolaci není ustálený osvědčený protokol. Nejrizikovějším bodem izolace mitochondrií N. gruberi je očividně homogenizace buněk. V našem protokolu je homogenizace prováděna sonikací. Možností rozbití membrán je ale více, např.: homogenizace pomocí pístového Dounceova homogenizátoru (používáno k narušení membrán kvasinek, které jsou díky buněčné stěně odolnější), cykly mražení a tání nebo lyze detergentem, která se používá k narušení membrán trypanosom pomocí nízké koncentrace digitoninu (Vercesi et al., 1991). 59
Studium importu GspG je zajímavé z důvodu biogeneze pseudopilu a vlastní sekrece subrátů T2SS. Přesto, že je funkce GspG vázaná na mezimembránový prostor – nutnost membránového potenciálu pro import proteinu (i když v heterologním systému kvasinkové mitochondrie), naznačuje jeho import do mitochondriální matrix. Jako jednodušší řešení se jeví přímý import pouze přes vnější membránu (Obr. 29). Topologie importu byla ale zřejmě v rámci evoluce shodná s bakteriálním systémem, tj. export podjednotek pseudopilinu z cytoplasmy/mitochondriální matrix (Francetic et al., 2007).
Obrázek 29: Způsoby importu GspG do mezimembránového prostoru. Nejjednodušší možná eukaryotní cesta se zřejmě neuplatňuje.
Podobný příklad můžeme vidět i jinde v mitochondriální membráně. SAM komplex, translokon pomáhající složení β-barelovým proteinům vnější mitochondriální membrány, má stále stejnou topologii importu jako jeho bakteriální homolog BAM komplex. Proteiny se do SAM komplexu dostávají z mezimembránového prostoru, i když jednodušší by bylo vkládání těchto proteinů do vnější mitochondriální membrány přímo z cytosolu (Chacinska et al., 2009).
6.2. Podjednotky T2SS u M. sp. str. 249 Alignmenty T2SS proteinů ukázaly, že aminokyselinové sekvence N. gruberi jsou velmi divergentní a MTS příliš dlouhé. Navíc publikovaný genom N. gruberi obsahuje řadu chybějících úseků. Proto jsme se rozhodli, že ačkoli máme možnost axenicky kultivovat pouze N. gruberi, budeme dále pokračovat ve studiu těchto genů i u rodu Malawimonas. Genové sekvence T2SS u druhu M. sp. str. 249 jsou kvalitnější než u N. gruberi. Gsp proteiny M. sp. str. 249 mají kratší MTS a také vyšší podobnost s bakteriálními Gsp proteiny.
60
Toto rozhodnutí znamenalo mj. i to, že studium proteinů bude probíhat využitím heterologních biologických systémů. V této době už byly objeveny všechny současné podjednotky eukaryotického T2SS (GspD, GspND, GspE1-E4, GspF, GspG1-2, potenciální substrát GspZ), proto jsou pokusy u M. sp. str. 249 obsáhlejší než u N. gruberi. Do experimentů ke zjištění interakcí byly zahrnuty tyto proteiny: GspD, GspND, GspE, GspF, GspG1, GspG2, GspZ. I u těchto proteinů bylo jejich vzájemné působení zjišťováno pomocí metod Y2H a BACTH. Nejprve byly provedeny Y2H pokusy. V nich byla jasně potvrzena interakce mezi GspD a GspD, což je v souladu se strukturou bakteriálního GspD, který tvoří symetrický sekretinový pór v membráně složený z několika podjednotek (Nouwen et al., 1999). Dále byla detekována slabá interakce mezi GspND a GspD. I toto vzájemné působení je logické a odpovídá bakteriálnímu uspořádání T2SS. Eukaryotický GspD je rozdělen na dva proteiny: N-terminální mezimembránovou část a C-terminální transmembránovou část. Obě části sekretinu by měly zaujímat stejnou strukturu a funkci jako u prokaryot, která je dobře popsána u sekretinového póru Vibrio cholerae (Reichow et al., 2010), a tím pádem spolu interagovat. Zajímavá je detekce slabé interakce mezi GspND a potenciálním substrátem GspZ. Pokud by GspZ byl skutečně substrátem pro mitochondriální T2SS, s N-terminální doménou GspD (GspND) by mohl při exportu opravdu interagovat (Korotkov et al., 2010). Poté byly provedeny BACTH pokusy, avšak v naší laboratoři nebyla mimo pozitivní kontroly prokázána žádná interakce. Pozitivní kontroly sice byly detekovány, ale s daleko menší intenzitou než je u BACTH metody obvyklé, tzn. že i případné špatně detekovatelné slabé interakce mohly zaniknout. Připravené konstrukty byly poslány do laboratoře našich spolupracovníků (dr. Olivera Francetic, Institut Pasteur), kde mají s BACTH metodou zkušenosti a v současnosti se pracuje na reanalýze dat. Průběžné výsledky ukazují interakci mezi GspG1 a GspG1, což je jediná dosud detekovaná interakce shodná s proteiny N. gruberi, značící formování pseudopilu (Vignon et al., 2003). Dále byla detekována interakce mezi GspE a GspE. Bakteriální sekreční ATPáza GspE pravděpodobně vytváří hexamer (Lu et al., 2013), takže i tato interakce má své opodstatnění. Poté byla detekována ještě interakce mezi GspG2 a GspF. Tato intearkce nebyla v bakteriálním T2SS identifikována. Vysvětlením by mohlo být, že GspF je jediným proteinem vnitřní membrány u eukarot, mohl by tedy zastávat i funkce, které v bakteriálním T2SS patří jiným proteinům. Eukaryotický GspF by tak mohl fungovat jako GspL, spojka, která převádí konformační změny mezi sekreční ATPázou GspE a pseudopilem (Gray et al., 2011), jehož hlavní podjednotky jsou pseudopiliny GspG. Za takového předpokladu by spojení mezi GspF a GspG bylo logické. 61
V Y2H a BACTH experimentech byly obdrženy jiné výsledky, které se vzájemně doplňují a utvářejí obraz, jak by spolu mohly eukaryotické podjednotky T2SS interagovat. Žádná interakce nikdy nevyšla oběma směry, tzn. stejné geny zaklonované do opačných vektorů, i když byly vždy testovány. Tento jev se stává poměrně často. Může být způsoben rozdílným skládáním fúzních proteinů i negativním efektem studovaných proteinů na funkci reportérového transkripčního faktoru. Je třeba pamatovat, že obě tyto metody jsou heterologními biologickými systémy a proteiny v buňkách eukaryotických organismů mohou fungovat odlišně. Např. interakce mezi GspD proteiny nikdy nevyšla za využití BACTH metody. To by mohlo být způsobeno tím, že sekretinový pór v bakteriální membráně může být mnohem toxičtější, než pokud se vytvoří v již semipermeabilní mitochondriální membráně. Avšak souhrn všech obdržených interakcí naznačuje, že T2SS by skutečně mohl tvořit komplex podobný tomu v bakteriálních membránách. Naše genomické analýzy ukázaly, že v mitochondriálních membránách zástupců Discoba a Malawimonada se vyskytují „klasické“ TIM, TOM a SAM komplexy pro import proteinů do mitochondrie. T2SS tak nezastupuje úlohu importní mašinerie a mohl by s importem koexistovat nezávisle ve své původní exportní funkci (Obr. 30).
Obrázek 30: Představa mitochondriální membrány zástupců Discoba a Malawimonada. V mitochondriálních membránách těchto organismů se nachází kompletní importní mašinerie, kterou představuje řada proteinů: TOM komplex (Tom40), TIM23 komplex s PAM (Tim23, 44, 18, 16; Mge1), mitochondriální procesující peptidáza (MPP) a TIM 22 komplex (Tim22). Komponenty vyznačené v černé barvě (Sam50, Oxa1, TatC) mají jasné bakteriální homology. V pravé části obrázku ukázány klíčové podjednotky T2SS (GspD, ND, E, F, G).
62
6.3. T2SS v mitochondriích Další zajímavou neznámou v tomto projektu je potenciální substrát GspZ. Z alignmentu je patrné množství konzervovaných cysteinů a histidinů, což značí, že by se mohlo jednat o hemový nebo FeS protein. Právě tyto proteiny jsou častými substráty T2SS jako je tomu např. u bakterie Geobacter, která exportuje pomocí T2SS cytochrom účastnící se extracelulárního elektrontransportního řetězce (Leang et al., 2010). Eukaryotické geny T2SS jsou pravděpodobně monofyletické, z čehož zřejmě vyplývá, že eukaryotický T2SS pochází z mitochondriálního předka. To by znamenalo, že původní mitochondrie byla schopna sekretovat proteiny do svého hostitele a bylo by tak velmi zajímavé identifikovat substrát, který by pomohl objasnit vztah původního endosymbionta a hostitele. Tyto zjištění by tak mohly vést k objasnění příčiny vlastní endosymbiózy, která vedla ke vzniku mitochondrie. Za úvahu stojí i myšlenka, že mitochondrie naprosté většiny eukaryot, které T2SS nemají, jsou schopny sekrece proteinů, byť pomocí jiného a dosud neznámého mechanismu.
63
7. Závěr Tato práce shrnuje dosavadní poznatky o bakteriálním T2SS, krátce se zabývá importem proteinů do mitochondrií a popisuje prvoky, u kterých byly nalezeny klíčové podjednotky T2SS. Experimentální část je pak zaměřena právě na podjednotky T2SS u N. gruberi a M. sp. str. 249, kam patří sekretinový pór vnější membrány GspD, protein vnitřní membrány GspF, sekreční ATPáza GspE a hlavní pseudopilin GspG tvořící pseudopilus. Dále byla nalezena podjednotka GspND a potenciální substrát T2SS GspZ. Pomocí dvouhybridního kvasinkového a bakteriálního systému se podařilo potvrdit četné interakce naznačující stejnou architekturu T2SS u protist jako u bakterií. Dále jsme in vitro přeložili NgGspG a studovali jeho import do izolovaných mitochondrií S. cerevisiae a N. gruberi. Také jsme zkoumali import M249GspD do mitochondrie S. cerevisiae. Na závěr je diskutován biologický a evoluční význam tohoto objevu.
64
8. Seznam často používaných zkratek BACTH
bakteriální dvouhybridní systém („bacterial two-hybrid“)
BAM
„β-barrel assembly machinery“
DHFR
dihydrofolát reduktáza
Gsp
„general secretory pathway“
GspC
spojka vnitřní a vnější membrány T2SS
GspD
sekretin T2SS
GspE
sekreční ATPáza T2SS
GspF, M, L
proteiny vnitřní membrány T2SS
GspG
hlavní pseudopilin T2SS
GspH, I, J, K
minoritní pseudopiliny T2SS
GspND
N-terminální doména sekretinu T2SS
GspZ
potenciální substrát T2SS
mtDNA
mitochondriální DNA
MTS
mitochondriální presekvence ("mitochondrial targeting sequence")
M249Gsp
Gsp protein Malawimonas sp. str. 249
NgGsp
Gsp protein Naegleria gruberi
PAM
„presequence translocase-associated motor“
SAM
„sorting and assembly machinery“
SRP
„signal recognition particle“
T2SS
sekreční systém typu II („type II secretion system“)
T3SS
sekreční systém typu III („type III secretion system“)
T4PS
pilusový systém typu IV („type IV pilus system“)
TIM
„translocase of the inner membrane“
TMD
transmembránová doména („transmembrane domain“)
TOM
„translocase of the outer membrane“
Y2H
kvasinkový dvouhybridní systém („yeast two-hybrid“)
65
9. Seznam použité literatury Abendroth, J., Rice, A.E., McLuskey, K., Bagdasarian, M., and Hol, W.G.J. (2004). The crystal structure of the periplasmic domain of the type II secretion system protein EpsM from Vibrio cholerae: the simplest version of the ferredoxin fold. J. Mol. Biol. 338, 585–596. Abendroth, J., Murphy, P., Sandkvist, M., Bagdasarian, M., and Hol, W.G.J. (2005). The Xray structure of the type II secretion system complex formed by the N-terminal domain of EpsE and the cytoplasmic domain of EpsL of Vibrio cholerae. J. Mol. Biol. 348, 845–855. Abendroth, J., Mitchell, D.D., Korotkov, K. V., Johnson, T.L., Kreger, A., Sandkvist, M., and Hol, W.G.J. (2009). The three-dimensional structure of the cytoplasmic domains of EpsF from the type 2 secretion system of Vibrio cholerae. J. Struct. Biol. 166, 303–315. Ahting, U., Thieffry, M., Engelhardt, H., Hegerl, R., Neupert, W., and Nussberger, S. (2001). Tom40, the pore-forming component of the protein-conducting TOM channel in the outer membrane of mitochondria. J. Cell Biol. 153, 1151–1160. Aitken, D., Hay, J., Kinnear, F.B., Kirkness, C.M., Lee, W.R., and Seal, D. V. (1996). Amebic keratitis in a wearer of disposable contact lenses due to a mixed Vahlkampfia and Hartmannella infection. Ophthalmology 103, 485–494. Battesti, A., and Bouveret, E. (2012). The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli. Methods 58, 325–334. van den Berg, B., Clemons Jr, W.M., Collinson, I., Modis, Y., Hartmann, E., Harrison, S.C., and Rapoport, T.A. (2003). X-ray structure of a protein-conducting channel. Nature 427, 36– 44. Berks, B.C. (2015). The twin-arginine protein translocation pathway. Annu. Rev. Biochem. 84, 843–864. Bihlmaier, K., Mesecke, N., Terziyska, N., Bien, M., Hell, K., and Herrmann, J.M. (2007). The disulfide relay system of mitochondria is connected to the respiratory chain. J. Cell Biol. 179, 389–395. Bleves, S., Voulhoux, R., Michel, G., Lazdunski, A., Tommassen, J., and Filloux, A. (1998). The secretion apparatus of Pseudomonas aeruginosa: identification of a fifth pseudopilin, XcpX (GspK family). Mol. Microbiol. 27, 31–40. Brown, S., and De Jonckheere, J.F. (1999). A reevaluation of the amoeba genus Vahlkampfia based on SSUrDNA sequences. Eur. J. Protistol. 35, 49–54. Burger, G., Gray, M.W., Forget, L., and Lang, B.F. (2013). Strikingly bacteria-like and generichmitochondrial genomes throughout jakobid protists. Genome Biol. Evol. 5, 418–438. Camberg, J.L., and Sandkvist, M. (2005). Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE. J. Bacteriol. 187, 249–256. 66
Camberg, J.L., Johnson, T.L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W.G.J., and Sandkvist, M. (2007). Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids. EMBO J. 26, 19–27. Carter, R.F. (1970). Description of a Naegleria sp. isolated from two cases of primary amoebic meningoencephalitis, and of the experimental pathological changes induced by it. J. Pathol. 100, 217–244. Cerva, L., and Novak, K. (1968). Amoebic meningoencephalitis: sixteen fatalities. Science 160, 92. Cline, K., and Mori, H. (2001). Thylakoid ∆pH-dependent precursor proteins bind to a cpTatC-Hcf106 complex before Tha4-dependent transport. J. Cell Biol. 154, 719–729. Collin, S., Guilvout, I., Chami, M., and Pugsley, A.P. (2007). YaeT-independent multimerization and outer membrane association of secretin PulD. Mol. Microbiol. 64, 1350– 1357. Collin, S., Guilvout, I., Nickerson, N.N., and Pugsley, A.P. (2011). Sorting of an integral outer membrane protein via the lipoprotein-specific Lol pathway and a dedicated lipoprotein pilotin. Mol. Microbiol. 80, 655–665. Collins, R.F., Frye, S.A., Kitmitto, A., Ford, R.C., Tønjum, T., and Derrick, J.P. (2004). Structure of the Neisseria meningitidis outer membrane PilQ secretin complex at 12 Å resolution. J. Biol. Chem. 279, 39750–39756. Cope, J.R., Ratard, R.C., Hill, V.R., Sokol, T., Causey, J.J., Yoder, J.S., Mirani, G., Mull, B., Mukerjee, K.A., Narayanan, J., et al. (2015). The first association of a primary amebic meningoencephalitis death with culturable Naegleria fowleri in tap water from a US treated public drinking water system. Clin. Infect. Dis. 60, e36–e42. Costa, T.R.D., Felisberto-Rodrigues, C., Meir, A., Prevost, M.S., Redzej, A., Trokter, M., and Waksman, G. (2015). Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat. Rev. Microbiol. 13, 343–359. Curran, S.P., Leuenberger, D., Oppliger, W., and Koehler, C.M. (2002). The Tim9p-Tim10p complex binds to the transmembrane domains of the ADP/ATP carrier. EMBO J. 21. D’Enfert, C., Ryter, A., and Pugsley, A.P. (1987). Cloning and expression in Escherichia coli of the Klebsiella pneumoniae genes for production, surface localization and secretion of the lipoprotein pullulanase. EMBO J. 6, 3531–3538. Derelle, R., and Lang, B.F. (2012). Rooting the eukaryotic tree with mitochondrial and bacterial proteins. Mol. Biol. Evol. 29, 1277–1289. Douzi, B., Durand, E., Bernard, C., Alphonse, S., Cambillau, C., Filloux, A., Tegoni, M., and Voulhoux, R. (2009). The XcpV/GspI pseudopilin has a central role in the assembly of a quaternary complex within the T2SS pseudopilus. J. Biol. Chem. 284, 34580–34589.
67
Douzi, B., Ball, G., Cambillau, C., Tegoni, M., and Voulhoux, R. (2011). Deciphering the Xcp Pseudomonas aeruginosa type II secretion machinery through multiple interactions with substrates. J. Biol. Chem. 286, 40792–40801. Fields, S., and Song, O. (1989). A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340, 245–246. Francetic, O., Buddelmeijer, N., Lewenza, S., Kumamoto, C.A., and Pugsley, A.P. (2007). Signal recognition particle-dependent inner membrane targeting of the PulG pseudopilin component of a type II secretion system. J. Bacteriol. 189, 1783–1793. Fulton, C., Webster, C., and Wu, J.S. (1984). Chemically defined media for cultivation of Naegleria gruberi. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2406–2410. Genin, S., and Boucher, C.A. (1994). A superfamily of proteins involved in different secretion pathways in gram-negative bacteria: modular structure and specificity of the N-terminal domain. Mol. Gen. Genet. 243, 112–118. Gérard-Vincent, M., Robert, V., Ball, G., Bleves, S., Michel, G.P.F., Lazdunski, A., and Filloux, A. (2002). Identification of XcpP domains that confer functionality and specificity to the Pseudomonas aeruginosa type II secretion apparatus. Mol. Microbiol. 44, 1651–1665. Gray, M.D., Bagdasarian, M., Hol, W.G.J., and Sandkvist, M. (2011). In vivo cross-linking of EpsG to EpsL suggests a role for EpsL as an ATPase-pseudopilin coupling protein in the type II secretion system of Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 79, 786–798. Hampl, V., Hug, L., Leigh, J.W., Dacks, J.B., Lang, B.F., Simpson, A.G.B., and Roger, A.J. (2009). Phylogenomic analyses support the monophyly of Excavata and resolve relationships among eukaryotic “supergroups”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 3859–3864. Hardie, K.R., Lory, S., and Pugsley, A.P. (1996). Insertion of an outer membrane protein in Escherichia coli requires a chaperone-like protein. EMBO J. 15, 978–988. Hirst, T.R., and Holmgrent, J. (1987). Conformation of protein secreted across bacterial outer membranes: a study of enterotoxin translocation from Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7418–7422. Hodgkinson, J.L., Horsley, A., Stabat, D., Simon, M., Johnson, S., da Fonseca, P.C.A., Morris, E.P., Wall, J.S., Lea, S.M., and Blocker, A.J. (2009). Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 477–485. Chacinska, A., Pfannschmidt, S., Wiedemann, N., Kozjak, V., Sanjuán Szklarz, L.K., Schulze-Specking, A., Truscott, K.N., Guiard, B., Meisinger, C., and Pfanner, N. (2004). Essential role of Mia40 in import and assembly of mitochondrial intermembrane space proteins. EMBO J. 23, 3735–3746. Chacinska, A., Koehler, C.M., Milenkovic, D., Lithgow, T., and Pfanner, N. (2009). Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell 138, 628–644.
68
De Jonckheere, J.F., and Brown, S. (2005). The identification of vahlkampfiid amoebae by ITS sequencing. Protist 156, 89–96. Karimova, G., Pidoux, J., Ullmann, A., and Ladant, D. (1998). A bacterial two-hybrid system based on a reconstituted signal transduction pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5752– 5756. Köhler, R., Schäfer, K., Müller, S., Vignon, G., Diederichs, K., Philippsen, A., Ringler, P., Pugsley, A.P., Engel, A., and Welte, W. (2004). Structure and assembly of the pseudopilin PulG. Mol. Microbiol. 54, 647–664. Korotkov, K. V, and Hol, W.G.J. (2008). Structure of the GspK-GspI-GspJ complex from the enterotoxigenic Escherichia coli type 2 secretion system. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 462–468. Korotkov, K., Pardon, E., Steyaert, J., and Hol, W.G. (2010). Crystal strcuture of the Nterminal domain of the scretin GspD from ETEC determined with the assistance of a nanobody. Structure 17, 255–265. Korotkov, K. V, Sandkvist, M., and Hol, W.G.J. (2012). The type II secretion system: biogenesis, molecular architecture and mechanism. Nat. Rev. Microbiol. 10, 336–351. Korotkov, K. V., Gray, M.D., Kreger, A., Turley, S., Sandkvist, M., and Hol, W.G.J. (2009). Calcium is essential for the major pseudopilin in the type 2 secretion system. J. Biol. Chem. 284, 25466–25470. Korotkov, K. V., Gonen, T., and Hol, W.G.J. (2011a). Secretins: dynamic channels for protein transport across membranes. Trends Biochem. Sci. 36, 433–443. Korotkov, K. V., Johnson, T.L., Jobling, M.G., Pruneda, J., Pardon, E., Héroux, A., Turley, S., Steyaert, J., Holmes, R.K., Sandkvist, M., et al. (2011b). Structural and functional studies on the interaction of GspC and GspD in the type II secretion system. PLoS Pathog. 7. Kovermann, P., Truscott, K.N., Guiard, B., Rehling, P., Sepuri, N.B., Müller, H., Jensen, R.E., Wagner, R., and Pfanner, N. (2002). Tim22, the essential core of the mitochondrial protein insertion complex, forms a voltage-activated and signal-gated channel. Mol. Cell 9, 363–373. Kutik, S., Stojanovski, D., Becker, L., Becker, T., Meinecke, M., Krüger, V., Prinz, C., Meisinger, C., Guiard, B., Wagner, R., et al. (2008). Dissecting membrane insertion of mitochondrial β-barrel proteins. Cell 132, 1011–1024. Lang, B.F., Burger, G., O’Kelly, C.J., Cedergren, R., Golding, G.B., Lemieux, C., Sankoff, D., Turmel, M., and Gray, M.W. (1997). An ancestral mitochondrial DNA resembling a eubacterial genome in miniature. Nature 387, 493–497. Leang, C., Qian, X., Mester, T., and Lovley, D.R. (2010). Alignment of the c-type cytochrome OmcS along pili of Geobacter sulfurreducens. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4080–4084.
69
Lu, C., Turley, S., Marionni, S.T., Park, Y.J., Lee, K.K., Patrick, M., Shah, R., Sandkvist, M., Bush, M.F., and Hol, W.G.J. (2013). Hexamers of the type II secretion ATPase GspE from Vibrio cholerae with increased ATPase activity. Structure 21, 1707–1717. Lüke, I., Handford, J.I., Palmer, T., and Sargent, F. (2009). Proteolytic processing of Escherichia coli twin-arginine signal peptides by LepB. Arch. Microbiol. 191, 919–925. Lybarger, S.R., Johnson, T.L., Gray, M.D., Sikora, A.E., and Sandkvist, M. (2009). Docking and assembly of the type II secretion complex of Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 191, 3149– 3161. Martin, J., Mahlke, K., and Pfanner, N. (1991). Role of an energized inner membrane in mitochondrial protein import: ΔΨ drives the movement of presequences. J. Biol. Chem. 266, 18051–18057. McLaughlin, L.S., Haft, R.J.F., and Forest, K.T. (2012). Structural insights into the type II secretion nanomachine. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 208–216. Van der Meeren, R., Wen, Y., Van Gelder, P., Tommassen, J., Devreese, B., and Savvides, S.N. (2013). New insights into the assembly of bacterial secretins: structural studies of the periplasmic domain of XcpQ from Pseudomonas aeruginosa. J. Biol. Chem. 288, 1214–1225. Milenkovic, D., Gabriel, K., Guiard, B., Schulze-Specking, A., Pfanner, N., and Chacinska, A. (2007). Biogenesis of the essential Tim9-Tim10 chaperone complex of mitochondria: sitespecific recognition of cysteine residues by the intermembrane space receptor Mia40. J. Biol. Chem. 282, 22472–22480. Mokranjac, D., Sichting, M., Popov-Čeleketić, D., Mapa, K., Gevorkyan-Airapetov, L., Zohary, K., Hell, K., Azem, A., and Neupert, W. (2009). Role of Tim50 in the transfer of precursor proteins from the outer to the inner membrane of mitochondria. Mol. Biol. Cell 20, 1400–1407. Mori, H., and Cline, K. (2002). A twin arginine signal peptide and the pH gradient trigger reversible assembly of the thylakoid ∆pH/Tat translocase. J. Cell Biol. 157, 205–210. Nivaskumar, M., and Francetic, O. (2014). Type II secretion system: a magic beanstalk or a protein escalator. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1843, 1568–1577. Nouwen, N., Ranson, N., Saibil, H., Wolpensinger, B., Engel, A., Ghazi, A., and Pugsley, A.P. (1999). Secretin PulD: association with pilot PulS, structure, and ion-conducting channel formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 8173–8177. Nunn, D.N., and Lory, S. (1991). Product of the Pseudomonas aeruginosa gene PilD is a prepilin leader peptidase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3281–3285. O’Kelly, C.J. (1993). The Jakobid flagellates: structural features of Jakoba, Reclinomonas and Histiona and implications for the early diversification of eukaryotes. J. Eukaryot. Microbiol. 40, 627–636.
70
O’Kelly, C.J., and Nerad, T.A. (1999). Malawimonas jakobiformis n. gen., n. sp. (Malawimonadidae n. fam.): a Jakoba-like heterotrophic nanoflagellate with discoidal mitochondrial cristae. J. Eukaryot. Microbiol. 46, 522–531. Opalka, N., Beckmann, R., Boisset, N., Simon, M.N., Russel, M., and Darst, S.A. (2003). Structure of the filamentous phage pIV multimer by cryo-electron microscopy. J. Mol. Biol. 325, 461–470. Paetzel, M., Dalbey, R.E., and Strynadka, N.C.. (2000). The structure and mechanism of bacterial type I signal peptidases. Pharmacol. Ther. 87, 27–49. Papanikou, E., Karamanou, S., and Economou, A. (2007). Bacterial protein secretion through the translocase nanomachine. Nat. Rev. Microbiol. 5, 839–851. Phizicky, E.M., and Fields, S. (1995). Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol. Rev. 59, 94–123. Possot, O., and Pugsley, A.P. (1994). Molecular characterization of PulE, a protein required for pullulanase secretion. Mol. Microbiol. 12, 287–299. Possot, O.M., Vignon, G., Bomchil, N., Ebel, F., and Pugsley, A.P. (2000). Multiple interactions between pullulanase secreton components involved in stabilization and cytoplasmic membrane association of PulE. J. Bacteriol. 182, 2142–2152. Preuss, M., Ott, M., Funes, S., Luirink, J., and Herrmann, J.M. (2005). Evolution of mitochondrial Oxa proteins from bacterial YidC: inherited and acquired functions of a conserved protein insertion machinery. J. Biol. Chem. 280, 13004–13011. Py, B., Loiseau, L., and Barras, F. (2001). An inner membrane platform in the type II secretion machinery of gram-negative bacteria. EMBO Rep. 2, 244–248. Reichow, S.L., Korotkov, K. V, Hol, W.G.J., and Gonen, T. (2010). Structure of the cholera toxin secretion channel in its closed state. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1226–1232. Sandkvist, M. (2001). Biology of type II secretion. Mol. Microbiol. 40, 271–283. Satyshur, K.A., Worzalla, G.A., Meyer, L.S., Heiniger, E.K., Aukema, K.G., Misic, A.M., and Forest, K.T. (2007). Crystal structures of the pilus retraction motor PilT suggest large domain movements and subunit cooperation drive motility. Structure 15, 363–376. Sauvonnet, N., Vignon, G., Pugsley, A.P., and Gounon, P. (2000). Pilus formation and protein secretion by the same machinery in Escherichia coli. EMBO J. 19, 2221–2228. Schiebel, E., Driessen, A.J.M., Hartl, F.U., and Wickner, W. (1991). ∆μH+ and ATP function at different steps of the catalytic cycle of preprotein translocase. Cell 64, 927–939. Sickmann, A., Reinders, J., Wagner, Y., Joppich, C., Zahedi, R., Meyer, H.E., Schönfisch, B., Perschil, I., Chacinska, A., Guiard, B., et al. (2003). The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 13207–13212.
71
Strom, M.S., Nunn, D.N., and Lory, S. (1993). A single bifunctional enzyme, PilD, catalyzes cleavage and N-methylation of proteins belonging to the type IV pilin family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2404–2408. Sysoeva, T.A., Zepeda-Rivera, M.A., Huppert, L.A., and Burton, B.M. (2014). Dimer recognition and secretion by the ESX secretion system in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111, 201322200. Tokuda, H. (2009). Biogenesis of outer membranes in gram-negative bacteria. Biosci. Biotechnol. Biochem. 73, 465–473. Tosi, T., Nickerson, N.N., Mollica, L., Jensen, M.R., Blackledge, M., Baron, B., England, P., Pugsley, A.P., and Dessen, A. (2011). Pilotin-secretin recognition in the type II secretion system of Klebsiella oxytoca. Mol. Microbiol. 82, 1422–1432. Tseng, T.-T., Tyler, B.M., and Setubal, J.C. (2009). Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9. Vercesi, A.E., Bernardes, C.F., Hoffmann, M.E., Gadelha, F.R., and Docampo, R. (1991). Digitonin permeabilization does not affect mitochondrial function and allows the determination of the mitochondrial membrane potential of Trypanosoma cruzi in situ. J. Biol. Chem. 266, 14431–14434. Viarre, V., Cascales, E., Ball, G., Michel, G.P.F., Filloux, A., and Voulhoux, R. (2009). HxcQ liposecretin is self-piloted to the outer membrane by its N-terminal lipid anchor. J. Biol. Chem. 284, 33815–33823. Vignon, G., Köhler, R., Larquet, E., Giroux, S., Prévost, M.-C., Roux, P., and Pugsley, A.P. (2003). Type IV-like pili formed by the type II secreton: specificity, composition, bundling, polar localization, and surface presentation of peptides. J. Bacteriol. 185, 3416–3428. Voulhoux, R., Ball, G., Ize, B., Vasil, M.L., Lazdunski, A., Wu, L.-F., and Filloux, A. (2001). Involvement of the twin-arginine translocation system in protein secretion via the type II pathway. EMBO J. 20, 6735–6741. Voulhoux, R., Bos, M.P., Geurtsen, J., Mols, M., and Tommassen, J. (2003). Role of a highly conserved bacterial protein in outer membrane protein assembly. Science 299, 262–265. Wiedemann, N., Kozjak, V., Chacinska, A., Schönfisch, B., Rospert, S., Ryan, M.T., Pfanner, N., and Meisinger, C. (2003). Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane. Nature 424, 5–10. Yamagata, A., and Tainer, J.A. (2007). Hexameric structures of the archaeal secretion ATPase GspE and implications for a universal secretion mechanism. EMBO Journalournal 26, 878– 890. Yanez, M.E., Korotkov, K. V., Abendroth, J., and Hol, W.G.J. (2008a). Structure of the minor pseudopilin EpsH from the type 2 secretion system of Vibrio cholerae. J. Mol. Biol. 377, 91– 103.
72
Yanez, M.E., Korotkov, K. V., Abendroth, J., and Hol, W.G.J. (2008b). The crystal structure of a binary complex of two pseudopilins: EpsI and EpsJ from the type 2 secretion system of Vibrio vulnificus. J. Mol. Biol. 375, 471–486.
73
