UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE. Přírodovědecká fakulta. Katedra parazitologie

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Katedra parazitologie

Molekulární diagnostika motolice obrovské (Fascioloides magna) Molecular diagnostic of liver fluke Fascioloides magna

Diplomová práce Veronika Siegelová

Školitel: RNDr. Martin Kašný, Ph.D.

Praha 2012  

Poděkování: Poděkování patří mému školiteli Martinu Kašnému za odborné vedení, konzultace, cenné rady a připomínky, trpělivost a velkou ochotu během mé práce v laboratoři i psaní diplomové práce. Velice děkuji rodičům za podporu během celého mého studia. Děkuji Mgr. Aleně Černíkové, Ph.D. za pomoc při statistickém zpracování výsledků. Děkuji také Achlovi a všem ostatním, kteří se jakkoliv podíleli na vzniku této práce.

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně, a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze,

Podpis

 

OBSAH 1. ABSTRAKT

1

2. ÚVOD

3

3. CÍLE PRÁCE

5

4. LITERÁRNÍ PŘEHLED

6

4.1 Charakteristika Fascioloides magna

6

4.2 Hlavní morfologické (diferenciační) znaky Fascioloides magna a komparativních druhů motolic

9

4.3 Rozšíření Fascioloides magna v České republice

12

4.4 Metody využívané k diagnostice jaterních motolic

12

4.4.1 Postmortální diagnostika – pato-anatomické vyšetření hostitelů

12

4.4.2 Intravitální diagnostika

13

5. MATERIÁL a METODIKA

24

5.1 Modelové organismy

24

5.2 Koprologický materiál

25

5.3 Srovnání metod zpracování koprologických vzorků

28

5.4 Mikroskopické vyšetření

29

5.5 Molekulární analýza

29

5.5.1

Izolace DNA

29

5.5.2

Příprava primerů

31

5.5.3

PCR

33

5.5.4

Real-time PCR (qPCR)

35

5.5.5

Gelová elektroforéza

35

5.5.6

Ligace

36

5.5.7

Transformace kompetentních buněk Escherichia coli TOPO 10

36

5.5.8

Sekvenace

36

5.6 Statistické vyhodnocení výsledků Real-time PCR (qPCR)

37

5.6.1

Analýza křivek amplifikace DNA

37

5.6.2

Analýza průběhu ,,tání“ DNA

37

5.7 Detekční limit molekulárních metod

38

5.8 Srovnání mikroskopických a molekulárních metod

38

5.9 Případové studie

39  

5.9.1

Případová studie 1

39

5.9.2

Případová studie 2

39

5.9.3

Případová studie 3

40

5.9.4

Případová studie 4

40

5.9.5

Případová studie 5

41

6. VÝSLEDKY

42

6.1 Sběr koprologického materiálu

42

6.2 Metody zpracování koprologických vzorků

42

6.3 Molekulární analýza

44

6.3.1

Izolace DNA

44

6.3.2

PCR

46

6.3.3

Real-time PCR

50

6.4 Statistické vyhodnocení výsledků Real-time PCR (qPCR)

57

6.4.1

Analýza křivek amplifikace DNA

57

6.4.2

Analýza průběhu ,,tání“ DNA

59

6.5 Detekční limit molekulární metody

64

6.6 Srovnání mikroskopické a molekulární analýzy koprologických vzorků

64

6.7 Případové studie

66

6.7.1

Případová studie 1

66

6.7.2

Případová studie 2

67

6.7.3

Případová studie 3

68

6.7.4

Případová studie 4

70

6.7.5

Případová studie 5

71

7. DISKUZE

74

8. ZÁVĚR

82

9. SEZNAM LITERATURY

84

 

 

1. ABSTRAKT Fascioloides magna (motolice obrovská) je veterinárně významný endoparazitický helmint parazitující u mnoha obratlovců (především u přežvýkavců), který svým hostitelům může působit vážné zdravotní problémy, jež často vedou až k jejich smrti. Tato motolice parazituje především u jelenovitých, dokáže však napadat i hospodářská zvířata. Místem definitivní lokalizace dospělců F. magna je jaterní tkáň hostitele, kde v pseudocystách dospělci dlouhodobě přežívají a produkují vajíčka. Vajíčka odchází z pseudocyst přes žlučovody do střeva a následně opouští tělo hostitele společně s trusem. Diagnostika fascioloidózy je doposud založena především na postmortálním vyšetření jater uhynulých hostitelů. Vhodnou alternativou mohou být některé přímé a nepřímé metody intravitální diagnostiky. S využitím přímé metody - mikroskopicky, na základě nálezu vajíček v koprologickém materiálu hostitele, lze parazitózu sice prokázat, ale nelze spolehlivě odlišit nákazu F. magna od dalších případných trematodóz (působených např. Fasciola hepatica a Paramphistomum cervi). Spolehlivě odlišit vajíčka F. magna od ostatních motolic je možné molekulárně. Byly testovány metody izolace parazitární DNA z dospělců, z koncentrovaných vajíček i z vajíček v trusu. DNA byla amplifikována pomocí PCR a Real-time PCR. Pro amplifikaci DNA byly navrženy druhově (ne)specifické primery pro část ITS2 regionu ribozomální DNA. Využitelnost molekulárních diagnostických metod pro F. magna byla srovnána s metodami mikroskopickými a ověřována na vzorcích z přírody v několika případových studiích. Klíčová slova: Trematoda, motolice, Fascioloides magna, Fasciola hepatica, Paramphistomum cervi, Dicrocoelium dendriticum, molekulární diagnostika, PCR, Real-time, ITS2, koprologie

1    

1. ABSTRACT Fascioloides magna (giant liver fluke) is veterinary important endoparasitic helminth parasitizing in a number of vertebrate species (primarily in ruminants), causing them severe health problems, often leading to death. This trematod primarily parasitizing in cervids, but it is also able to infect livestock. The F. magna adults are mostly localized in the liver tissue of the definitive hosts, where they survive in pseudocysts for a long time and produce eggs. The eggs are released from the pseudocysts via the bile ducts into the gut and then leave the host’s body together with faeces. Up to now, the diagnostics of fascioloidosis is primarily based on the dissection of the host’s liver. The direct and indirect intravital diagnostic methods could represent an appropriate alternative. Using the intravital diagnostic methods, the parasitosis can be revealed directly, microscopically – by discovering the eggs in the host’s faeces, but by using this method it is not possible to reliably differentiate the eggs of F. magna from the other eventual trematodes e.g. Fasciola hepatica, Dicrocoelium dendriticum, Paramphistomum cervi. Reliable differentiation of F. magna eggs from the other eventual trematodes can be performed molecularly – by isolation of parasite´s DNA followed by PCR. Several methods were tested, DNA isolation - from adults of parasite, concentrated eggs and eggs in faeces and DNA amplification PCR/Real-time PCR with non-specific/species-specific primers designed according to ITS2 region of ribosomal DNA. The results of reliability and sensitivity of molecular methods were compared to the results of routine microscopical examination and the selected molecular methods were also applied in several case studies. Key words: Trematode, fluke, Fascioloides magna, Fasciola hepatica, Paramphistomum cervi, Dicrocoelium dendriticum, molecular diagnostic, PCR, Real-time, ITS2, coprological examination

2    

2. ÚVOD Trematodóza, onemocnění způsobené motolicemi, je příčinou mnohých zdravotních komplikací zvířat i lidí na celém světě, které mohou končit až úhynem hostitele. Studium původců těchto onemocnění – motolic je tedy smysluplné nejen z pohledu základního výzkumu, ale i s ohledem na praktické využití získaných poznatků v oblastech veterinární i humánní medicíny, např. diagnostice a terapii. Tato práce se zabývá především problematikou jaterních motolic čeledi Fasciolidae, v menší míře pak také zohledňuje některé poznatky o motolicích čeledi Paramphistomidae a Dicrocoelidae. V Evropě a v České republice se vyskytují dva druhy jaterních motolic - Fascioloides magna (Bassi, 1875), parazitující především u zvířat volně žijících (Erhardová-Kotrlá 1971, Novobilský a kol. 2007b, Kráľová-Hromadová a kol. 2011, Kašný a kol. 2012), a Fasciola hepatica Linnaeus, 1758, parazitující převážně u hospodářských zvířat (Erhardová-Kotrlá 1971, Majoros a kol. 1994, Pybus 2001, Muller 2002). Na území Polska a Maďarska se vyskytuje omezeně ještě další druh, Parafasciolopsis fasciolaemorpha (Majoros a kol. 2000, Demiaszkiewicz a kol. 2005). Fascioloidóza (původcem nákazy je F. magna) je onemocnění převážně volně žijících zvířat, nákazy hospodářských zvířat jsou však také poměrně časté, a to zejména v Severní Americe – zemi původu tohoto parazita (Swales 1935, 1936, Foreyt a Todd 1972, 1976, Chroustová a kol. 1980). U napadených zvířat může docházet v souvislosti s infekcí F. magna k signifikantnímu snížení celkové kondice, které může být reprezentováno např. snížením denního váhového přírůstku a celkové dosažené hmotnosti hospodářských zvířat či menšími rozměry paroží u trofejové zvěře (Chroustová a kol. 1980). V rámci České Republiky jsou pravidelně monitorovány oblasti, kde je prevalence nákazy u volně žijících zvířat relativně vysoká, a to zejména v oblastech Jižních a Středních Čech (např. až 95,2% prevalence nákazy spárkaté zvěře v okolí Železné Rudy) (ErhardováKotrlá 1971, Chroust a kol. 2004, Novobilský a kol. 2007a, b, Kráľová-Hromadová a kol. 2011, Kašný a kol. 2012). Fasciolóza (onemocnění působené F. hepatica) je na celém světě příčinou mnohačetných lidských infekcí. V souvislosti s prevalencí fasciolózy se uvádí 2,4 – 17 milionů případů nakažených osob a dalších zhruba 180 milionů osob je vystaveno 3    

riziku nákazy (Beaver a kol. 1984, Mas-Coma a kol. 1999, Muller 2002). Nejvyšší prevalence lidské fasciolózy byla zaznamenána v oblastech Altiplano, severní Bolívie (prevalence dosahuje > 60%, Hillyer a kol. 1992, 1999). V celosvětovém měřítku má F. hepatica také nemalé dopady na hospodářská zvířata, u nichž způsobuje masové nákazy, jejichž důsledky jsou v souvislosti se zdravotním stavem zvířat často závažné a nezřídka končí až úhynem. Počty infikovaných zvířat přesahují 600 milionů (Rim a kol. 1994, Ramajo a kol. 2001), z čehož plynou také nemalé finanční ztráty (odhaduje se, že každoročně činí ekonomické ztráty způsobené fasciolózou až 3,2 miliardy USD). Zatímco u fascioloidózy zaznamenáváme trvalý každoroční nárůst případů u volně žijících zvířat (Erhardová-Kotrlá 1971, Novobilský a kol. 2007b, Kráľová-Hromadová a kol. 2011), tak z dostupných údajů vyplývá, že prevalence fasciolózy v České republice spíše dlouhodobě stagnuje na nízké úrovni (Zmunda a Chroust 2001), a na rozdíl od F. hepatica, nákaza lidí F. magna nebyla doposud prokázána. Na našem území se kromě motolic jaterních vyskytují ještě další dva poměrně časté druhy motolic parazitujících u přežvýkavců - Paramphistomum cervi (Zeder, 1790), parazit gastrointestinálního traktu působící onemocnění zvané paramphistomóza, a Dicrocoelium dendriticum (Rudolphi, 1819),  nacházející se ve žlučovodech, žlučníku a slinivce. Obě tyto motolice mohou parazitovat jak u volně žijících, tak u hospodářských zvířat. S ohledem na společné oblasti výskytu těchto motolic a motolic jaterních na našem území, a vzhledem k jejich patogenitě, by neměly zůstávat na okraji zájmu. Především z důvodu nasazení vhodné terapie, ale také za účelem správného monitoringu a v souvislosti se zamezením případného šíření trematodóz na nová území díky migraci a importům zvířat, je nezbytné umět tyto trematodózy, působené výše uvedenými druhy motolic, spolehlivě determinovat. S ohledem na potíže s mikroskopickou diferenciací vajíček a omezené možnosti intravitální diagnostiky, zejména fasciolózy, fascioloidózy a paramphistomózy, si tato práce klade za jeden z cílů definovat postup umožňující molekulární druhovou determinaci jak dospělců, tak vajíček motolic v koprologickém materiálu. Pro tyto potřeby byly testovány intravitální diagnostické metody - např. PCR detekce parazitární DNA izolované z vajíček v trusu nakažených zvířat.

4    

3. CÍLE PRÁCE 1. Nalézt vhodné metody sběru a zpracování koprologických vzorků s vajíčky motolic (F. magna, F. hepatica, D. dendriticum, P. cervi) a vybrat optimální metodu izolace DNA z tohoto typu vzorku 2. Navrhnout druhově (ne)specifické primery umožňující diagnostiku F. magna, F. hepatica, D. dendriticum, P. cervi) 3. Amplifikovat parazitární DNA s využitím metod PCR a Real-time PCR 4. Srovnat využitelnost (výhody/omezení) mikroskopických a molekulárních metod diagnostiky F. magna z koprologického materiálu

5    

4. LITERÁRNÍ PŘEHLED 4.1 Charakteristika F. magna F. magna řadíme do čeledi Fasciolidae (podtřída: Digenea, třída: Trematoda, podkmen: Neodermata, kmen: Platyhelmintes, říše: Animalia). Tato čeleď zahrnuje tři podčeledi (Fasciolinae, Fasciolopsinae, Protofasciolinae), šest rodů (Fasciola, Fascioloides, Fasciolopsis, Parafasciolopsis, Tenuifasciola, Protofasciola) a devět zástupců (Fasciola hepatica, F. gigantica, F. Jacksoni, F. nyanzae, Fascioloides magna, Parafasciolopsis fasciolaemorpha, Fasciolopsis buski, Tenuifasciola „Fasciola“ tragelaphi, Protofasciola robusta) (Ward 1917, Lotfy 2008). Všichni zástupci čeledi Fasciolidae jsou jaterními parazity savců. Do Evropy byla F. magna zavlečena ve druhé polovině 19. století s jeleny wapiti (Cervus elaphus canadensis) a jelenci běloocasými (Odocoileus virginianus), na území České republiky byla poprvé zaznamenána na konci 19. století u daňka evropského (Dama dama) (Ullrich 1930, Swales 1935, Erhardová-Kotrlá 1971). Životní cyklus F. magna zahrnuje dva hostitele – plže a savce (Swales 1935, 1936) (Obr. 1). Spektrum mezihostitelů i definitivních hostitelů je u této motolice poměrně široké a liší se v závislosti na oblasti výskytu F. magna. V Severní Americe, kde je F. magna původní, jsou nejčastějšími mezihostiteli vodní plži z čeledi Lymnaeidae (např. Lymnaea bulimoides techella, L. caperata, L. modicella), v Evropě je to hlavně Galba truntacula ze stejné čeledi (Erhardová-Kotrlá 1968a,b, Foreyt a Todd 1978, Dunkel a kol. 1996, Galaktionov a Dobrovolskij 2003). Mezi možné mezihostitele se v Evropě řadí také další běžné druhy jako Lymnaea palustris, Omphiscola glabra a plži rodu Radix, jejichž vnímavost k nákaze F. magna byla prokázána jak v přirozených podmínkách, tak experimentálně, i v pokusech prováděných v naší laboratoři (Faltýnková a kol. 2006, Rondelaud a kol. 2006, Dreyfuss a kol. 2007, Huňová a kol. 2012).

6    

Obr. 1: Životní cyklus Fascioloides magna. (Lankester 1972, Hayes a kol. 1981, http://www.fws.gov/midwest/agassiz/moosesite/fluke.html,  upraveno)

Definitivní hostitele F. magna, jimiž jsou nejčastěji přežvýkavci, členíme s ohledem na jejich specifičnost dle upraveného schématu, jež navrhla Pybus 2001. V tomto členění rozeznáváme tři základní typy hostitelů: specifické definitivní hostitele, nespecifické definitivní hostitele („dead-end“ hosts) a netypické hostitele („aberrant“ hosts) (Swales 1935, 1936, Pybus 2001, Poláková 2009 Bc. práce). Jednotlivé typy hostitelů se kromě vnímavosti k parazitóze liší také schopností diseminace vajíček motolic do prostředí. Specifičtí definitivní hostitelé zahrnují většinu zástupců čeledi Cervidae (rod Cervus). Na území Evropy jsou to především C. elaphus, Dama dama a Capreolus capreolus (Erhardová-Kotrlá 1971, Chroust a Chroustová 2004, Novobilský 2007a, Kašný a Novobilský 2008). Místem definitivní lokalizace F. magna je jaterní parenchym, kam migrují juvenilní motolice. Jaterní tkáň hostitele kolem motolice tvoří fibrózní pseudocystu, ve které motolice dospívá a produkuje vajíčka. Ta odcházejí kanálky napojenými na žlučovody do střeva a jsou diseminována z hostitelského organismu 7    

do vnějšího prostředí společně s trusem. (Swales 1935, Erhardová-Kotrlá 1971, Foreyt a kol. 1976). Nespecifičtí definitivní hostitelé zahrnují zejména zástupce z čeledi Bovidae (rod Bos). Infekce probíhá stejně jako u hostitelů specifických, v játrech se kolem červů tvoří pseudocysta, motolice pohlavně dospívají a produkují životaschopná vajíčka. Na rozdíl od specifických hostitelů, vajíčka u nespecifických hostitelů však nemohou odcházet do střeva, jelikož pseudocysta není napojena na žlučovody a propojení se střevem se neutváří nebo jsou propojovací kanálky silně obstruovány a fibrotizovány, takže je průchod vajíček limitován. Průběh kompletního životního cyklu parazita je tedy u tohoto typu hostitelů většinou znemožněn (Swales 1935, 1936, Pybus 2001). Infekce nespecifického hostitele není ve většině případů letální. Třetím typem jsou hostitelé netypičtí. Na rozdíl od specifických i nespecifických definitivních hostitelů, motolice v těle netypických hostitelů většinou trvale migruje, není schopna se usadit v jaterní tkáni, dospět ani dosáhnou pohlavní zralosti. Neustálá migrace juvenilních motolic vede v konečné fázi k rozsáhlým poškozením vnitřních orgánů a často až k úhynu napadeného hostitele. Mezi netypické hostitele patří zejména zástupci malých turovitých přežvýkavců, např. Ovis aries a Capra hircus (Swales 1935, Erhardová-Kotrlá a Blažek 1970, Foreyt a Todd 1976, 1978, Novobilský a kol. 2007c). Rozsah patogenního působení F. magna

závisí především na typu a druhu

infikovaného hostitele. Některé druhy spárkaté zvěře (např. C. elaphus) jsou vůči fascioloidóze odolnější, a i "silná" nákaza (200 ks dospělců F. magna) u nich může dlouhodobě probíhat bez zjevných příznaků, zatímco jiní hostitelé (např. C. capreolus) jsou k nákaze F. magna vnímavější a hynou už při nákaze několika motolicemi (Záhoř 1966, ústní sdělení doc. MVDr. Dušana Rajského CSc., 2007, Technická univerzita ve Zvoleni, Slovenská republika). I u zvířat přežívajících infekci F. magna bez zjevných příznaků však může docházet k negativním důsledkům parazitózy. Kromě poklesu celkové kondice zvířete, destrukce jater (součást tzv. mysliveckého práva, tj. vnitřní orgány uloveného zvířete, které náleží lovci), může docházet např. ke snížení kvality paroží či jejich předčasnému shozu (Erhardová-Kotrlá 1971, Scherer a Dvořák 2009). Podobně jako volně žijící zvěř jsou i hospodářská zvířata k infekci F. magna různě odolná. U některých druhů může nákaza probíhat bezpříznakově, jindy může být nákaza příčinou snížené produkce mléka či denního váhového přírůstku a tedy i celkově nižší hmotnosti zvířete. Pro některé druhy může být nákaza až fatální. Traumatický průběh nákazy 8    

je zaznamenáván minimálně u 50 % infikovaných netypických hostitelů (Erhardová-Kotrlá 1971, Foreyt a Leathers 1980, Foreyt 1990, 1996, Novobilský a kol. 2007c). Přestože F. magna působí v populacích volně žijící zvěře škody a hospodářská zvířata jsou v potenciálním ohrožení, je problematice diagnostiky fascioloidózy (a jejího odlišení od jiných trematodóz) ze strany příslušných úřadů v České republice prozatím věnována nedostatečná pozornost. Tato situace by se mohla změnit i v důsledku navržení spolehlivých intravitálních diagnostických metod, jejichž použití prozatím naráželo na morfologické mezidruhové podobnosti dospělců motolic a především jejich vajíček (Hood a kol. 1997, Pybus 2001, Novobilský a kol. 2007c, Kašný a kol. 2012). Za účelem navržení a ověření využitelnosti molekulárních metod pro diagnostiku fascioloidózy byly vybrány komparativní modely motolic, jejichž výskyt v rámci České republiky může být společný s výskytem F. magna. Mezi tyto modely byly zařazeny: F. hepatica (čeleď Fasciolidae) – blízce příbuzná F. magna, D. dendriticum (čeleď Dicrocoeliidae) a P. cervi (čeleď Paramphistomidae). 4.2 Hlavní morfologické (diferenciační) znaky F. magna a komparativních druhů motolic Na základě morfologie dospělců můžeme nákazu F. magna teoreticky zaměnit pouze s infekcí F. hepatica, od D. dendriticum a P. cervi je F. magna snadno odlišitelná (Obr. 2). Dospělé motolice F. magna dosahují rozměrů 25 - 100 x 20 - 35 mm (Erhardová-Kotrlá 1971, Pybus 2001, Chroust a Chroustová 2004, Novobilský 2007a). Tělo dospělců je pokryto tegumentem červenohnědé barvy (Jones a kol. 2005, Pybus 2001). Hlavními morfologickými znaky, kterými se F. magna odlišuje od F. hepatica jsou: absence hlavového kónu, varlata uložená vedle sebe a vitelária uložená pouze na ventrální straně (Erhardová-Kotrlá 1971, Kearn 1998, Špakulová a kol. 2003, Jones a kol. 2005). Rozlišení vajíček F. magna od F. hepatica a P. cervi na základě morfologie je nesnadné, odlišení je možné pouze od D. dendriticum, jejíž vajíčka dosahují mnohem menších rozměrů (Obr. 3). Vajíčka F. magna jsou oválná, žlutohnědá a opatřená operkulem. Dosahují rozměrů 120 - 185 µm × 70 - 90 µm (Erhardová-Kotrlá 1971, Pybus 2001, Špakulová a kol. 2003) (Obr. 3a). Obsah vajíčka je stejně jako v případě F. hepatica, D. dendriticum a P. cervi tvořen četnými žloutkovými granulemi a zárodečnými buňkami (Erhardová-Kotrlá 1971, Bonita a Taira 1996, Valero a kol. 2009). 9    

Fasciola hepatica: Dospělci dosahují rozměrů 20 - 40 x 8 - 13 mm, tělo má šedohnědou až zelenohnědou barvu (Erhardová-Kotrlá 1971, Pybus 2001) (Obr. 2b). Mezi morfologické znaky charakteristické pro F. hepatica patří rozvětvené střevo, přítomnost hlavového kónu, keříčkovité vaječníky, varlata uložená za sebou a dorzálně i ventrálně ležící vitelária (Špakulová a kol. 2003, Jones a kol. 2005). Místem definitivní lokalizace jsou nejčastěji žlučovody ovcí, skotu a dalších savců (včetně člověka). Juvenilní motolice je možné nalézt i přímo v jaterním parenchymu. Vajíčko F. hepatica o velikosti 128 – 142 µm x 68 – 82 µm je oválného tvaru a žlutohnědé barvy (Erhardová-Kotrlá 1971, Pybus 2001), na jednom pólu opatřené operkulem (Pybus 2001, Valero a kol. 2001, 2009) (Obr. 3b). Paramphistomum cervi: Dospělé motolice dosahují velikosti 10 - 15 x 2 - 5 mm, jsou bělavé barvy a na rozdíl od výše uvedených motolic nejsou dorzoventrálně zploštělé (Obr. 2c). Acetabulum mají posunuté dozadu. Jedná se o parazity gastrointestinálního traktu. Juvenilní stádia se nachází ve dvanáctníku a slezu, dospělé jedince nalezneme nejčastěji v bachoru nebo v jednotlivých částech předžaludků přežvýkavců (ErhardováKotrlá 1971). Vajíčka s operkulem o rozměrech 114 - 176 µm x 73 - 100 µm jsou žlutozelené barvy (Olsen a kol. 1962, Burgu 1981) (Obr. 3c). Dicrocoelium dendriticum: Dospělci dosahují rozměrů 8 - 10 x 1,5 - 3 mm, mají kopinatý tvar těla, kterým prosvítají zřetelně všechny orgány (Erhardová-Kotrlá 1971) (Obr. 2d). Tato motolice napadá především přežvýkavce (Ovis musimon, O. aries), ale může parazitovat i u ostatních savců včetně člověka (Mapes 1951, Erhardová-Kotrlá 1971, Nilsson 1971, Cengiz a kol. 2010). Dospělé jedince nalézáme ve žlučovodech, žlučníku a slinivce (Odening 1969, Pybus 2001, Ducháček a Lamka 2003). Vajíčka jsou nápadně menší než u výše popsaných motolic, dosahují rozměrů 36 - 45 µm x 20 - 30 µm, jsou tmavě hnědá, asymetricky oválná, na jednom pólu jsou opatřená operkulem (Odening 1969) (Obr. 3d). Životní cyklus je terestrický a zahrnuje dva mezihostitele (plže a mravence). D. dendriticum je v mnoha aspektech odlišné od F. magna, F. hepatica a P. cervi, k záměně s těmito motolicemi by tedy nemělo docházet.

10    

Obr. 2: Dospělci motolic: A – Fascioloides magna (foto Flukeman I.), B – Fasciola hepatica (foto University of Ottawa, Biolabs, http://biodidac.bio.uottawa.ca/thumbnails/filedet.htm?File_name=TREM084P&File_type= jpg, upraveno), C – Dicrocoelium dendriticum (foto Galería de imágenes, http://www.gefor.4t.com/parasitologia/dicrocoeliumdendriticum.html, upraveno), D – Paramphistomum cervi (foto S. J. Upton, http://www.kstate.edu/parasitology/625tutorials/Trematodes06.html, upraveno).

B

C

D

0,5  cm

0,5  cm

A

Obr. 3: Vajíčka motolic: A1 – Fascioloides magna, A2 – Fascioloides magna (prázdné vajíčko, OP; operkulum) B – Fasciola hepatica, C – Paramphistomum cervi, D – Dicrocoelium dendrtiticum (foto Cengiz a kol. 2010). A1

A2

OP  

B

           100 µm

11    

C

D

4.3 Rozšíření F. magna v České republice Výskyt F. magna v České republice je doposud enzootický (Erhardová–Kotrlá 1971, Horáčková 2007 diplomová práce, Novobilský a kol. 2007a,b, Kašný a kol. 2012). Již na počátku 70. let dvacátého století byla F. magna zaznamenávána u jelenovitých na některých lokalitách České republiky s prevalencí 70 - 80 %, zejména v oblastech Třeboňských pánví a Novohradských hor, Středočeské pahorkatiny, Brd, a dále v okolí Hluboké nad Vltavou, Bechyně a Příbrami (Erhardová–Kotrlá 1971). Studie provedená Novobilským a kol. 2007b uvádí až 95% prevalenci F. magna u D. dama na lokalitě Dobrá Voda v Novohradských horách. Některé naše studie tyto dřívější záznamy potvrzují, a vzhledem k předpokladu dalšího možného šíření F. magna na nové lokality provádíme v rámci výzkumu v helmintologické laboratoři také pravidelné mapování areálů výskytu F. magna (Kašný a kol. 2010, Kašný a kol. 2012). Jedním z hlavních výstupů těchto našich snah je loňský nález F. magna u skotu na jedné z jihočeských biofarem. Tento nález je od vydání práce Chroustová a kol. 1980 po více jak 30 letech prvním relevantním záznamem fascioloidózy u hospodářských zvířat v České republice (Siegelová a kol. 2012). Vzhledem k těmto faktům se domnívám, že celoplošný monitoring fascioloidózy (fasciolózy) za použití spolehlivých diagnostických metod je smysluplný. 4.4 Metody využívané k diagnostice jaterních motolic Diagnostické metody je možné rozdělit do několika kategorií, přičemž dvě hlavní velké skupiny tvoří metody postmortální (nejčastěji pitva) a intravitální (analýza vzorků odebraných živému zvířeti), a dále pak metody přímé a nepřímé. Metody přímé jsou založené na detekci parazita, jeho vývojových stádií či agens související s jeho přítomností (průkaz DNA parazita pomocí PCR) ve zkoumaném vzorku, zatímco metody nepřímé jsou založené nejčastěji na měřeních souvisejících s parazitózou a proměnlivých např. biochemických, hematologických a imunologických parametrech. 4.4.1 Postmortální diagnostika – pato-anatomické vyšetření hostitelů Pato-anatomické vyšetření je založeno zejména na postmortálním patologickomorfologickém vyšetření jater odlovených či uhynulých definitivních hostitelů s přímým nálezem fibrózních pseudocyst a dospělých či juvenilních stádií F. magna, především v játrech, žlučovodech a tenkém střevě (Pybus 2001, Horáčková 2007 diplomová práce). Jaterní pseudocysty jsou často dobře viditelné a rozeznatelné už při prvním ohledání jaterní 12    

tkáně. Pseudocysty obsahují kromě dospělců motolic (většinou dvou až tří) a vajíček také hnědočerný pigment tvořený natrávenou krví a žlučí (Swalles 1935, Pybus 2001, Novobilský 2007a) (Obr. 4). Důležitým diagnostickým znakem je výskyt tmavého pigmentu jak na povrchu, tak i uvnitř orgánů břišní a hrudní dutiny, nejčastěji však právě na játrech (Swales 1935, Záhoř a kol. 1968). Tyto vážné patologické změny se při infekcích definitivních hostitelů F. hepatica vyskytují ojediněle, a u D. dendriticum a P. cervi zcela výjimečně (Chroust a Chroustová 2004). Infekce F. hepatica je většinou doprovázena rozsáhlými kalcifikacemi žlučovodů, které se v důsledku parazitózy stávají neprůchodnými a dochází k jejich obstrukcím (Erhardová-Kotrlá 1971, Pybus 2001). Obr. 4: Játra C. elaphus poškozená v důsledku infekce F. magna (foto Kašný M.). A – pigmentovaná játra v důsledku infekce F. magna; FM - dospělci F. magna, B – patologické poškození jater; DG – nařízlé pseudocysty a zbytky motolic degradované v souvislosti s léčbou. FM

DG

10 cm

10 cm  

4.4.2 Intravitální diagnostika Za účelem nasazení efektivní léčby trematodóz, monitoringu motolic či zamezení jejich případnému šíření, je vhodné zvířata diagnostikovat opakovaně, intravitálně. Přestože jsou některé intravitální diagnostické metody pro dva druhy motolic zahrnutých v této práci (F. hepatica a D. dendriticum) používány v klinické praxi (Qureshi a kol. 1995, Olson a Tkach 2005, Horáčková 2007 diplomová práce, Novobilský a kol. 2007c), tak v diagnostice infekce F. magna jsou jednoduché, spolehlivé a snadno reprodukovatelné intravitální metody dosud stále vyvíjeny (Strauss a kol. 1999, Ubeira a kol. 1999, Broglia a kol. 2009, Oberhauserová a kol. 2010). Přímé intravitální diagnostické metody jsou 13    

běžně založeny na záchytu vajíček motolic či jejich DNA v koprologickém materiálu (mikroskopické a molekulární vyšetření trusu). Mezi nepřímé intravitální diagnostické metody pak řadíme např. záznam reakce protilátek s antigeny parazita (ELISA, Immunoblot), biochemickou detekci hladiny jaterních enzymů či hladiny eosinofilů hostitele (množství eosinofilů >500 /mm3 ve vzorku periferní krve) při hematologickém vyšetření krve apod. (Boray 1967, Wensvoort a Over 1982, Mitchell 2003, Dorchies 2007). Optimalizací jedné z metod nepřímé diagnostiky se v poslední době zabývá také naše laboratoř - ELISA s exkrečně-sekrečními proteiny F. magna (Beránková 2011, diplomová práce).

Výsledky prezentované v diplomové práci Beránková 2011 naznačují, že za

účelem provedení vysoce spolehlivé diagnostiky je vhodné tuto založit na opakovaném vzorkování individuálních zvířat, a to nejen pomocí metod využívajících koprologický vzorek, ale také vzorek krve – imunodiagnostika. Mikroskopické vyšetření Mikroskopické vyšetření koprologického materiálu je založeno na nálezu a klasifikaci vajíček v trusu definitivního hostitele. Vyšetření je časově nenáročné a nevyžaduje většinou zvláštní vybavení ani finanční náklady, proto je jednou z nejčastěji využívaných metod diagnostiky trematodóz. Pro některé trematodózy (např. právě F. magna) je to také zatím jediná intravitální diagnostická metoda, která se ve světě běžně používá (Wobeser a kol. 1985, Foreyt 1996, Mas-Coma a kol. 1999). Mikroskopické vyšetření trusu na přítomnost vajíček některých motolic však naráží na několik omezení, která byla zmíněna již výše; významná podobnost vajíček motolic např. F. magna, F. hepatica, F. gigantica, F.buski a P. cervi, díky které může docházet k záměnám jednotlivých trematodóz (Kaufmann 1996, Pybus 2001, Rieu a kol. 2007, Kráľová-Hromadová a kol. 2008). Rozměry vajíček některých motolic (např. F. gigantica, F. hepatica) mohou být navíc proměnlivé v závislosti na druhu parazitovaného definitivního hostitele (např. menší vajíčka byla izolována ze stolice nakažených lidí než z trusu zvířat) (Valero a kol. 2009). Situaci pak ještě více komplikuje možná koinfekce jediného hostitele více druhy motolic (F. magna, F. hepatica i P. cervi), kdy se vajíčka všech těchto motolic mohou teoreticky objevit v jednom koprologickém vzorku, což ještě více znesnadňuje jejich diagnostiku (Siegelová a kol. 2012). Mikroskopické vyšetření trusu na přítomnost vajíček motolic může být omezeno dynamikou počtu vajíček vylučovaných hostitelem; v případě negativního výsledku 14    

u individuálního zvířete je většinou nutné vzorek znovu odebrat a vyšetření opakovat. Tento problém je však možné řešit primárním vyšetřením směsného vzorku, tj. vzorků náhodně odebraných na lokalitě, kde se vyskytuje populace hostitelů, a teprve poté přikročit k vyšetření individuálnímu. Zásadní komplikace nastává také při mikroskopickém vyšetření vzorku trusu nespecifických a netypických hostitelů, u kterých nedochází k napojení pseudocyst na žlučovody a střevo, kdy vajíčka s trusem odchází jen výjimečně. Mikroskopicky je znemožněn i záchyt migrujících juvenilních motolic, které vajíčka ještě neprodukují; u motolic F. hepatica a F. magna se vajíčka objevují až přibližně tři měsíce po nákaze hostitele (O´Neill a kol. 1998, Spithill a kol. 1999, Pybus 2001, Muller 2002). Další nevýhodou mikroskopického vyšetření je poměrně vysoký detekční limit vajíček (Valero a kol. 2009), na který má vliv také metoda koncentrace vajíček z koprologického vzorku. Vajíčka motolic mají větší hustotu než voda a rychle klesají ke dnu, proto je pro diagnostiku motolic vhodné použít některou ze sedimentačních metod (Thienpont a kol. 1980, Anh a kol. 2008). Flotační metody založené na principu flotačních roztoků, které mají vyšší specifickou hmotnost než vajíčka, nejsou pro koncentraci motoličích vajíček příliš využívány; mimo jiné může v této souvislosti docházet např. k poškození vajíček flotačními roztoky (Faust a kol. 1938, 1939, Wobeser 1985, Yılmaz a Gödekmerdan 2004). Při mikroskopickém vyšetření trusu je poměrně často používaná také McMasterova počítací

komůrka

(Chalex

Corporation),

která

umožňuje

snadné

přepočítání

zaznamenaných vajíček na množství 1 g trusu (EPG = eggs per gram) (Henriksen a Aaqaard 1976, Bauer a kol. 2010). Molekulárně – diagnostické metody Molekulární metody jsou v parazitologii běžně využívány pro identifikaci a diferenciaci jednotlivých parazitárních organismů (Adlar a kol. 1993, Kráľová-Hromadová a kol. 2008, Lotfy a kol. 2008, Bazsalovicsová a kol. 2010). Velkou výhodou molekulárních metod je relativně rychlé a přesné určení druhů, poddruhů i jednotlivých populací parazitů. Principem molekulárních metod je průkaz přítomnosti parazitární DNA v analyzovaném vzorku a porovnání nukleotidových sekvencí se sekvencemi referenčními. Molekulární analýzy jsou přitom podmíněny existencí polymorfismu na úrovni DNA, což umožňuje rozlišit jednotlivé populace nebo zástupce jednotlivých druhů (Alasaad a kol. 2007, Lotfy a kol. 2008, Kráľová-Hromadová a kol. 2008, Bazsalovicsová a kol. 2010). Molekulární 15    

metody kombinují nejčastěji metody izolace parazitární DNA a její identifikace pomocí např. druhově specifických primerů a PCR. Izolace DNA: Při izolaci DNA je nutné zvolit vhodnou metodu v závislosti na typu biologického vzorku, požadované čistotě a množství finální DNA. Existuje mnoho různých metod purifikace DNA, ale jejich základní rysy jsou společné, např. na počátku izolace je vždy nutné rozrušit tkáň a homogenizovat vzorek, dále pak také odstranit proteiny vzniklé lyzí buněk (Alberts a kol. 1998, Šmarda a kol. 2008).   Izolace DNA z tkáně červů: Obecně je k izolaci DNA v dnešní době možné použít některý z množství komerčně dostupných kitů, např. QIAamp DNA mini kit (QIAGEN), který je založen na adsorpci DNA na silikátovou membránu tvořící dno izolační kolonky, následném přečištění DNA a její eluci. Alternativou ke komerčním kitům je např. fenolchloroformová metoda založená na nemísitelnosti organického rozpouštědla (chloroformu) s vodným roztokem biologického lyzátu, kdy dojde k vysrážení proteinů a jejich oddělení od DNA (Sambrook a kol. 1989, Alberts a kol. 1998, Capuano a kol. 2007, Šmarda a kol. 2008). Izolace DNA z vajíček: Zatímco samotná izolace DNA z vajíček přítomných v koprologickém vzorku je v dostupných pracích popisována většinou podobně, postupy přečištění, zkoncentrování a další úpravy vzorků před samotnou izolací se liší (Tab. 1) a naráží na několik překážek jako např. vysokou odolnost vaječné stěny, kterou je před izolací nutné nejprve rozrušit detergentem či mechanickou homogenizací (pomocí sonikátoru, pístu, nebo skleněných či keramických kuliček - Bead Beater) (Bead Beater – přístroj který díky vysokorychlostním kmitům adaptoru se zkumavkou obsahující skleněné kuličky a vzorek umožňuje účinnou homogenizaci vzorku) (Boros a kol. 1970, Harmon a kol. 2006, Oberhauserová a kol. 2010). Izolaci DNA z komplexního koprologického vzorku znesnadňuje také velké množství nečistot, žlučových solí a polyfenolických příměsí, které je rovněž nutné před započetím izolace DNA eliminovat (Deuter a kol. 1995, Verma a kol. 2003). Pro odstranění nečistot se používají různá adsorpční činidla, např. InhibitEX matrix (QIAGEN) nebo proteináza K, která napomáhá degradaci proteinů. Výsledkem izolace je pak získání nejen parazitární DNA pocházející z vajíček motolic, ale i DNA dalších biologických součástí vzorku (např. množství mikroorganismů či zbytky 16    

potravy). Vzhledem k tomu, že naprosto spolehlivá metoda izolace DNA motolic F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum z trusu nebyla doposud navržena, bylo hlavním úkolem mé experimentální práce ověřit různé metody izolace DNA a zvolit tu nejoptimálnější. Níže navržený postup do jisté míry navazuje na práci Oberhauserová a kol. 2010, významně tento postup rozvíjí a v mnohém zdokonaluje. Tab. 1: Přehled vybraných a koprologických vzorků

metod

a

modifikací

izolace

DNA

z vajíček

Metoda či modifikace izolace DNA

Princip

QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN)

Odstranění nečistot adsorpčním činidlem InhibitEX matrix, adsorpce DNA na silikátové membrány v izolačních kolonkách, následné promytí a eluce DNA.

Fenol-chloroformová metoda

Nemísitelnost organického rozpouštědla (chloroformu) s vodným roztokem buněčného lyzátu, kdy dojde k vysrážení proteinů a jejich oddělení od DNA.

Izolace DNA podle Müllera a kol. (2007)

Inkubace a centrifugace vzorku trusu s 2% roztokem Triton X-100 a 25 mM KOH, homogenizace sedimentu s roztokem sacharózy/KCl o hustotě 1.39 g/ml, naředění roztoku přidáním vody a povaření supernatantu ve vodní lázni za účelem inaktivace hydrolytických enzymů obsažených v trusu.

Izolace DNA podle Dyachenka a kol. (2008)

Koncentrace vajíček flotační metodou, promytí 0,9% roztokem NaCl a centrifugace. Smíchání suspenze s 25 1M KOH a 1M dithiotreitolem a inkubace (65 °C, 10 min) - lyze vajíček. Neutralizace lyzátu roztokem 2 mM Tris-HCl (pH 8.3) a 10 mM HCl. Extrakce DNA pufrem guanidinium thiokyanátu, etanolem a křemičitou suspenzí. Odstranění supernatantu, vysušení peletu a eluce DNA TE pufrem (10 mM Tris, 1mM EDTA).

Izolace DNA z vajíček a jejich homogenizace podle Oberhauserové a kol. (2010)

Homogenizace a rozrušení stěny vajíček teflonovým pístem (PTFE), extrakce pufrem 10 mM TRIS-HCl, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl a 2% dodecylsíranem sodným a inkubace s 20 mM dithriotreolem a proteinázou K (12 h). Extrakce DNA fenolchloroform-isoamylalkoholem (25:24:1) a vysrážení etanolem.

PCR (Polymerase Chain Reaction) a Real-time PCR: Principem PCR reakce je replikace DNA, jejíž průběh je kontrolován změnami teplot. Podstatou PCR je cyklicky se opakující syntéza nových řetězců vybraných úseků DNA ve směru 5´→3´ prostřednictvím 17    

DNA polymerázy (Alberts a kol. 1998, Campbell a kol. 2008, Šmarda a kol. 2008). Výsledným produktem PCR jsou pak amplikony definované velikosti, jejichž přítomnost a přibližnou velikost je možné prokázat při gelové elektroforéze. Real-time PCR (qPCR) je založena na stejném principu jako PCR, umožňuje však sledování průběhu amplifikace DNA přímo během reakce. Na vlákna syntetizované DNA se váží fluorescenční barviva (např. SYBR® Green) nebo sondy, jejichž fluorescenční signál odpovídá množství vznikajícího PCR produktu (Bustin a kol. 2005, Šmarda a kol. 2008). Hlavní výhodou qPCR oproti klasickému PCR je tedy možnost kvantifikace syntetizovaného produktu (Heid a kol. 1996, Klein 2000, Rasmussen 2001, Bustin a kol. 2005). Typická amplifikační křivka qPCR má esovitě zakřivený tvar a lze ji rozdělit na 3 části: 1) background fázi, kdy je amplifikované DNA tak málo, že fluorescence ještě nedosahuje

měřitelných

hodnot;

2) exponenciální

fázi,

kdy

množství

produktu

exponenciálně roste a 3) fázi plató, kdy se množství amplifikovaného produktu dále nemění a fluorescenční signál zůstává konstantní (Heid a kol. 1996, Klein 2002). Velkou nevýhodou klasické qPCR založené na odečtu fluorescenčního signálu je vazba fluorescenčních barviv na veškerou dvouvláknovou DNA přítomnou v reakční směsi, tzn. i DNA nespecificky vzniklých produktů (jako jsou např. tzv. „primers-dimers“ artefakty), které velmi často vznikají i při pečlivé optimalizaci metody (Rainer 2008). Z tohoto důvodu je za účelem určení příslušnosti amplifikované DNA po qPCR vhodné provést tzv. analýzu křivky tání (melting curve). Jako tání DNA je označován proces separace komplementárních řetězců dvouvláknové DNA indukovaný zvyšováním teploty. Účelem metody je na základě disociační křivky určit teplotu tání amplifikované DNA (rozpad dvouvláknové DNA), porovnat ji s křivkou a teplotou referenční, a následně např. určit druhovou příslušnost takové DNA. Teplota tání DNA (melting temperature, Tm) je daná zejména poměrem C-G párů, které jsou vázané trojnou vazbou (na rozdíl od A-T párů vázaných vazbou dvojnou). Čím větší je zastoupení C-G párů v amplifikované DNA, tím vyšší teplota je potřeba pro její denaturaci (rozrušení trojných vazeb). Odlišná teplota tání je tedy dána sekvenčními odlišnostmi analyzované DNA, tedy DNA příslušné jednotlivým druhům. Výše popsané metody (PCR a qPCR) byly využívány v rámci této diplomové práce. Některé další metody amplifikace DNA vhodné pro odlišení jednotlivých druhů motolic jsou popsány v Tab. 2. 18    

Tab. 2: Metody amplifikace DNA využívané pro diagnostiku motolic. PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragmenth Length Polymorphism) Stručná charakteristika

Využití

Metoda zjištění polymorfismu délky restrikčních fragmentů je založená na specifitě restrikčních enzymů - endonukleáz, které rozpoznávají různé krátké sekvence nukleotidů a následně je v tomto konkrétním místě štěpí. Podstatou metody je evolučně podmíněný vznik mutací, které vedou k vytvoření nebo ztrátě rozpoznávacích míst pro restrikční endonukleázy ve specifických oblastech genomu jednotlivých druhů. Rozdíly ve velikosti restrikčních fragmentů jsou detekovány rozdělením směsi pomocí gelové elektroforézy, porovnáním velikosti restrikčních fragmentů můžeme odlišit jednotlivé druhy motolic. PCRRFLP analýza je využitelná pro mezidruhové rozlišení jednotlivých druhů motolic, s jejím využitím není možné prokázat vnitrodruhovou variabilitu. (Alberts a kol. 1998, Hulák a kol. 2006, Campbell a kol. 2008, Šmarda a kol. 2008).

Blair a McManus (1989) rozlišovali motolice F. hepatica, F. gigantica a F. magna. U F. hepatica bylo vysledováno 18 restrikčních míst, u zbývajících dvou druhů 17. U žádné z těchto motolic nebyla pozorována více než 2 specifická restrikční místa. Kráľová-Hromadová a kol. (2008) analyzovala regiony ITS1 a ITS2 F. magna ze čtyř a F. hepatica ze dvou alopatrických populací. Analýza odhalila přítomnost odlišných restrikčních míst v ITS1 i v ITS2 sekvencích jednotlivých populací. F. magna a F. hepatica. S využitím PCR-RFLP bylo možné prokázat pouze variabilitu mezidruhovou, variabilitu jednotlivých populací stejného druhu nebylo možné prokázat. Marcilla a kol. (2002) využil PCRRFLP analýzu 28S regionu rDNA pro diferenciaci F. hepatica a F. gigantica. Sekvence obou druhů se lišily pouze několika nukleotidovými substitucemi a v rámci jednoho druhu byly vždy shodné.

PCR-RAPD (PCR-Random Amplified Polymorhic DNA) Stručná charakteristika Využití Metoda využívá jeden krátký oligonukleotid (cca 10 - 15 bp) jako primer pro amplifikaci DNA během PCR. Vzhledem ke krátké délce primeru je redukována jeho specifita, a proto nasedá na různá komplementární místa v DNA. Jednotlivé druhy příbuzných organismů jsou odlišeny na základě porovnání velikostí elektroforeticky separovaných amplikonů podle toho, kolik a jak velkých úseků DNA bylo amplifikováno. Metoda rovněž umožňuje detekovat velké množství polymorfismů, proto mohou být výsledky PCRRAPD genetickými markery pro tvorbu genetických map a měření genetické vzdáleností mezi populacemi (Roosien a kol. 1993, Simpson a kol. 1993, Šmarda a kol. 2008).

19    

McGarry a kol. (2007) provedl PCR-RAPD analýzu DNA 20 jedinců F. hepatica a F. gigantica. Byl získán fragment F. hepatica o velikosti 568 bp (a.n. GenBank; AY704404) a velikosti 396 bp pro F. gigantica (a.n. GenBank; AY704405).

LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) Stručná charakteristika

Využití

Metoda je založená na auto-amplifikaci DNA probíhající za stálé teploty, při které se využívá čtyř primerů (dva vnitřní a dva vnější) specificky navržených tak, aby rozpoznaly šest odlišných oblastí cílového genu. Výhoda metody spočívá v rychlosti (30 – 60 min) a možnosti provedení bez specializovaných laboratorních přístrojů. Citlivost reakce je srovnatelná s běžně používanou PCR. Amplifikovanou DNA je možné zobrazit za použití fluorescenčního barviva s využitím gelové elektroforézy (Notomi a kol. 2000, Nagamine a kol. 2002).

Ai a kol. 2010 využili LAMP metodu pro detekci a diferenciaci DNA Fasciola hepatica a Fasciola gigantica. Metodou byla detekována DNA z dospělců, larválních stádií i z vajíček. Druhově specifické primery byly navrženy podle sekvencí vnitřních přepisovaných úseků ribozomální DNA (IGS) F. hepatica a F. gigantica. Výhoda amplifikace DNA metodou LAMP je v jednoduchosti provedení, finanční nenáročnosti a rychlosti diagnostiky druhů Fasciola sp. v oblastech, kde není možné využít specializovaných laboratorních zařízení.

HRM (High-Resolution Melting) Stručná charakteristika

Využití

Metoda je založená na odlišné teplotě, při které dochází k rozpadu dvouvláknové DNA v závislosti na primární struktuře nukleotidové sekvence (poměr C-G párů), čímž je umožněna detekce záměny už jednoho nukleotidu. Rozpad fluorescenčně značené DNA (tání) je zaznamenáván snižující se intenzitou flouroscenčního záření při zvyšující se teplotě (Gundry a kol. 2003, Wittwer a kol. 2003).

Radvánský a kol. 2010 použil HRM metodu v analýze cox1 regionu mtDNA jednotlivých haplotypů F. magna z různých geografických oblastí. Byly navrženy tři oligonukleotidové sondy překrývající šest polymorfních míst v sekvenci analyzovaného úseku DNA. Výsledkem metody bylo nalezení odlišné teploty a tvaru křivky tání DNA pro jednotlivé haplotypy F. magna.

Molekulárně diagnostické markery: Molekulárními markery jsou myšleny specifické nukleotidové sekvence přítomné v genomu daného organismu. Tyto sekvence mohou být variabilní jak mezi jedinci různých druhů organismů (mezidruhová variabilita), tak mezi zástupci stejného druhu (vnitrodruhová variabilita). Často využívanými markery jsou úseky jaderné ribozomální a mitochondriální DNA (Luton a kol. 1992, Adlar a kol. 1993, Nolan a Cribb 2005, Semyenova a kol. 2006, Maurelli a kol. 2007, Kráľová-Hromadová a kol. 2008). Ribozomy eukaryot se skládají z 82 proteinů a ribozomální RNA (rRNA), která je rozdělena do dvou podjednotek – malé (40S), tvořené 18S ribozomální RNA (rRNA), a velké jaderné ribozomální podjednotky (60S) tvořené 5S rRNA, 5.8S rRNA a 28S rRNA. Přepisovaný úsek ribozomální DNA (rDNA) zahrnuje několik fragmentů, které na sebe těsně navazují. Jsou to " External Transcribed Spacer" (ETS), "Interernal Transcribed Spacer" (ITS např. ITS1 a ITS2) a regiony 18S, 5.8S a 28S. Tyto regiony rDNA kódující strukturní části ribozomů jsou často využívané v genetických studiích (Hillis 20    

a Dixon 1991) (Obr. 5). Pro účely taxonomických studií motolic z čeledi Fasciolidae se nečastěji využívá porovnávání nukleotidových sekvencí ITS2 regionu, který vykazuje vyšší stupeň mezidruhové variability. Obecně se ale v diagnostice motolic často uplatňuje také ITS1 a 18S region rDNA (Adlar a kol. 1993, Hoste 1995, Itagaki a Tsutsumi 1998, Kráľová- Hromadová a kol. 2008, Rokni a kol. 2010, Baszalovicsová a kol. 2010) (Tab. 3).

Obr. 5: Schematický diagram uspořádání jaderné ribozomální DNA F. magna (upraveno podle Kráľová-Hromadová a kol. 2008).

Tab. 3 : Molekulární markery rDNA používané v diagnostice motolic čeledi Fasciolidae. Markery rDNA

Stručná charakteristika

Anotační čísla sekvencí v databázi GenBank Sekvence F. magna: EF534987, EF534988, EF534990, EF534991 (Kráľová-Hromadová a kol. 2008, Benson a kol. 2008).

ITS1

Celková velikost ITS1 regionu je 430 bp. Druhově specifický fragment ITS1 F. magna je velký 127 bp (Kráľová-Hromadová a kol. 2008). Porovnáním sekvencí ITS1 regionu nebyl zjištěn vnitrodruhový polymorfismus F. magna ani F. hepatica (Itagaki a kol. 2005a,b a Mas-Coma a kol. 2001), mezidruhová variabilita F. magna a F. hepatica je 6,9% (Kráľová-Hromadová a kol. 2008).

ITS2

ITS2 region F. magna má celkovou velikost 364 bp, sekvence získané amplifikací ITS2 regionu F. magna z několika geografických oblastí byly 100% shodné, stupeň mezidruhové variability ITS2 regionu F. magna a F. hepatica dosahuje 11,3-11,9 % (Bildfell kol. 2007, Kráľová-Hromadová a kol. 2008, Lotfy a kol. 2008). Na základě sekvencí části ITS2 regionu P. cervi a D. dendriticum, které vykazují vyšší stupeň mezidruhové variability, byly navrženy druhově specifické primery pro odlišení těchto motolic (KráľováHromadová a kol. 2008, Bazsalovicsová a kol. 2010).

Sekvence F. magna: EF534992, EF534993, EF534994, EF534995 (Kráľová-Hromadová a kol. 2008), EF051080, EF612487 (Bildfell kol. 2007, Lotfy a kol. 2008), DQ683545 (anotováno Hoerweg a kol. 2006). Sekvence F. hepatica: AB010974, AB207148 (Itagaki a Tsutsumi 1998, Itagaki a kol. 2005a), AJ272053 (MasComa a kol. 2001), AJ557567, AJ557568 (Huang a kol. 2004), DQ683546 (anotováno Hoerweg a kol. 2006).

21    

18S

18S region F. magna o celkové velikosti 1934 bp zahrnuje velmi konzervativní úsek rDNA (Kráľová-Hromadová a kol. 2008). Porovnáním této sekvence s regionem 18S rDNA F. hepatica, který sekvenoval Fernandez a kol. 1998, byla zjištěna podobnost 99,3%. Vysoká podobnost sekvencí F. magna a F. hepatica neumožňuje na základě 18S regionu navržení druhově specifických primerů (Horáčková 2007 diplomová práce, Kráľová-Hromadová a kol. 2008).

Sekvence F. magna: EF534989 (Kráľová-Hromadová a kol. 2008), Sekvence F. hepatica: AJ004969 (Fernandez et al. 1998)

28S

Barker a kol. (1993) a Lotfy a kol. (2008) Sekvence F. magna: analyzovali 28S region rRNA digenetických (Lotfy a kol. 2008) motolic včetně zástupců čeledi Fasciolidae. Na základě získaných sekvencí byly sestaveny fylogramy, ve kterých je F magna je řazena jako sesterská skupina F. buski. Na základě sekvencí 18S regionu však není možné rozlišovat jednotlivé populace stejného druhu.

EU025872.1

Mitochondriální DNA (mtDNA) je maternálně dědičná, nepodléhá rekombinačním změnám, a proto umožňují analýzy mtDNA zaznamenat rozdíly v jejích sekvencích. Z tohoto důvodu je mtDNA pro mapování vnitrodruhové variability vhodnější než rDNA (Hu a kol. 2004, Semyenova a kol. 2006). MtDNA nese kromě genetické informace mitochondriální RNA a transferové RNA (tRNA), využívané při mitochondriální transkripci a translaci, také genetickou informaci pro proteiny transportního řetězce, jimiž jsou např. Nikotinamid adenin dinukleotid dehydrogenáza (nad) a Cytochrom c oxidáza (cox) (Obr. 6). Na základě analýzy cox1 a nad1 genů je možné vysledovat historickogeografický původ populace daného druhu i fylogenetické vztahy v rámci určité taxonomické skupiny (Tab. 4). Obr. 6: Schematický diagram části mitochondriální DNA F. hepatica (upraveno podle Le a kol. 2000, Kráľová-Hromadová a kol. 2008).

22    

Tab. 4: Molekulární markery mtDNA používané v diagnostice motolic čeledi Fasciolidae.

Markery mtDNA Cox1

Nad1

Stručná charakteristika

Anotační čísla sekvencí v databázi GenBank

Velikost cox1 regionu F. magna je 1545 bp. Cox1 region u jednotlivých populací F. magna z různých geografických oblastí vykazuje sekvenční polymorfismus. Sekvenční diference umožňuje studium historickogeografické mapování jednotlivých populací F. magna (Kráľová-Hromadová a kol. 2008, 2011). Obdobnou sekvenční variabilitu cox1 regionu je možné nalézt i v populacích F. hepatica (Garey a Wostenholme 1989, Le a kol. 2000).

Sekvence F. magna: EF534996, EF534997, EF534998 (KráľováHromadová a kol. 2008). Sekvence F. hepatica: AF216697 (Le a kol. 2000).

Nad1 region F. magna je úsek dlouhý 903 bp. Sekvence F. magna: Byly porovnány sekvence nad1 F. magna ze EF535000, EF535001 tří geografických oblastí, ve kterých bylo Hromadová a kol. 2008). nalezeno 13 polymorfních míst (diference 1,5 %). Mezi F. magna z ČR a SR byl na základě sekvencí nad1 prokázán nižší stupeň polymorfismu (0,9 %), než mezi F. magna z ČR a USA a stejně tak i z SR a USA (1 %). Nad1 vykazuje vyšší stupeň polymorfismu (1,9-2,3 %), než ostatní sekvence genů F. magna (Kráľová-Hromadová a kol. 2008, 2011). Vysoký stupeň polymorfismu vykazují také sekvence nad1 z různých geografických populací F. hepatica (Morozova a kol. 2004, Semyenova a kol. 2006).

23    

EF534999, (Kráľová-

5. MATERIÁL a METODIKA 5.1 Modelové organismy Jako experimentální model byli zkoumáni dospělci a vajíčka motolice F. magna, přičemž některé z provedených experimentů byly pro srovnání realizovány také s dospělci a vajíčky F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum. Dospělci F. magna byli získáváni po disekci jater odlovené, přirozeně infikované zvěře (C. elaphus, např. lokalita Křivoklátsko) a z přirozeně infikovaných hospodářských zvířat (Skotský náhorní skot - „Highland Cattle“, biofarma v Jižních Čechách). Motolice F. hepatica byly získány disekcí jater a žlučovodů přirozeně infikovaných hospodářských zvířat (např. Jatky Plzeň a.s.). Dospělci P. cervi pocházející z chovů hospodářských zvířat v Jižních Čechách poskytl doc. Ing. Martin Kváč, Ph.D. (Biologické centrum AV ČR, v.v.i., České Budějovice), D. dendriticum z oborních chovů ve Středních Čechách poskytl prof. RNDr. Jiří Lamka, CSc. (Farmaceutická fakulta v Hradci Kráľové Univerzity Karlovy). Získaní červi byli uchováni v 96 % etanolu v lednici. Larvální stádia (sporocysty, redie, cerkárie, metacerkárie) F. magna byla získávána po pitvě přirozeně i laboratorně infikovaných plžů Galba truncatula, Pseudosuccinea columela a plžů rodu Radix. Metacerkárie přichycené na skle byly odebírány z akvárií s infikovanými plži, a také po pitvě infikovaných mezihostitelů, ze kterých se uvolnily cerkárie schopné encystace. Získaná larvální stádia byla uchována v 96 % etanolu v lednici. Vajíčka F. magna a F. hepatica, která byla vyloučena dospělými motolicemi inkubovanými v RPMI 1640 médiu (SIGMA, 37 °C) s přidáním směsi antibiotik s antimykotikem (Penicilin/Streptomycin/Amphotericin B, Biowhittaker®, LONZA), byla zkoncentrována a promyta ve fyziologickém roztoku (10 mM PBS, 150 mM NaCl, pH 7,8). Některá vajíčka F. magna a F. hepatica byla získána také dekantací a koncentrací vody po vypláchnutí infikovaných disekovaných jater, pseudocyst a žlučovodů. Vajíčka P. cervi a D. dendriticum byla získávána ze vzorků trusu přirozeně infikovaných zvířat, jednotlivá vajíčka P. cervi byla z koprologického vzorku separována v průběhu mikroskopického vyšetření, v případě vajíček D. dendriticum bylo pro jejich malé rozměry nutné pracovat se vzorkem dekantovaného sedimentu. Životaschopná vajíčka byla skladována v plastových nádobách ve vodě (4 °C), která byla každé tři týdny měněna. Některá vajíčka byla fixována v 96 % etanolu. 24    

5.2 Koprologický materiál Koprologický materiál pocházející od volně žijících a hospodářských zvířat byl v průběhu let 2009 – 2012 sbírán na několika desítkách lokalit České republiky, zejména na lokalitách s publikovaným výskytem F. magna (např. Jižní Čechy, Západní Čechy, Šumava). Trus byl sbírán také na farmách, v přezimovacích obůrkách, záchytných obůrkách a v hospodářských staveních, která se vyskytovala v blízkosti vytipovaných lokalit či lokalit se záznamem o záchytu F. magna, např. chov D. dama (Obecnice, okres Příbram), oborový chov bílých jelenů (Žehušice), importovaný chov zubrů evropských (Bison bonasus, Ralsko). V jednom případě byl odebrán trus z rekta z imobilizovaného jedince C. elaphus drženého v přezimovací obůrce v NP Šumava. Vzorky trusu byly odebírány do označených plastových nádob, ve kterých byly transportovány do laboratoře. Trus byl uchováván v lednici či při teplotě -20°C. Směsné vzorky trusu anonymních jedinců pocházející z jedné oblasti byly uchovávány i zpracovávány jako jeden celek. Centrifugace vzorků probíhala na centrifuze 5415R (Eppendorf). Celkově bylo zpracováno a mikroskopicky vyšetřeno několik set koprologických vzorků. Sedimentační metoda: Metoda využívá vysoké specifické hmotnosti vajíček motolic, která klesají ke dnu nádoby. Vzorek trusu o hmotnosti 10 g byl rozmělněn v nádobě s vodou (cca 50 ml) a propasírován přes jemné sítko za účelem odstranění větších zbytků potravy do plastové falkony (50 ml). Vzniklá suspenze se nechala sedimentovat (10 - 15 min), část sedimentu s vajíčky byla odebrána Pasteurovou pipetou a prohlížena pod mikroskopem. Sediment vzorku trusu s vajíčky motolic byl dále uchováván pro následnou molekulární analýzu (4 °C). Metoda nevyužívá při zpracování koprologických vzorků žádné chemikálie a proto byly vzorky podrobené molekulární analýze zpracovány právě touto metodou. Sedimentačně-flotační metoda dle Brezy: Trus o hmotnosti přibližně 1 g byl rozmíchán ve vodě (10 - 15 ml) a propasírován přes jemné sítko do plastové falkony (50 ml). Vzorek byl centrifugován (1 min, 9800 g, 23 °C). Supernatant byl odebrán a pevný povrch kompaktního sedimentu byl 1x opláchnut vodou. Zkumavka se vzorkem byla do 4/5 doplněna flotačním roztokem thiosíranu sodného (Na 2S2O3·5H2O), ve kterém byl sediment trusu rozmíchán skleněnou tyčinkou a po odstavení 15 min byl opět centrifugován 25    

(1 min, 2000 g). Supernatant s vajíčky a malým množstvím fekálních částic byl přelit do kádinky o objemu 150 ml. Obsah kádinky byl doplněn vodou (naředění flotačního roztoku s vajíčky) a na 5 min odstaven. Vajíčka, která ve vodním prostředí sedimentovala, byla odebrána Pasteurovou pipetou a prohlížena pod mikroskopem. Flotační metoda dle Fausta: Metoda je založená na nižší specifické hmotnosti vajíček ve flotačním roztoku a je poměrně často využívanou metodou zpracování koprologických vzorků. Pro detekci vajíček motolic však tato metoda příliš vhodná není, protože vajíčka motolic jsou poměrně těžká a snadno klesají ke dnu. Trus o hmotnosti 1 g byl rozmělněn v 10 - 15 ml vody a přepasírován přes sítko do plastové falkony (50 ml). Suspenze byla centrifugována (1 min, 9800 g), supernatant byl odsát. Sediment byl rozmíchán v 33% flotačním roztoku síranu zinečnatého (331 g ZnSO4. 7H2O rozpuštěno v 1000 ml destilované vody). Zkumavka byla dále flotačním roztokem doplněna až po okraj a překryta krycím sklíčkem. Po 30 minutách bylo krycí sklíčko s „vyflotovanými“ vajíčky přeneseno na podložní sklíčko a vzorek byl prohlížen pod mikroskopem. Aparatura FLOTAC: Koprologický materiál byl zpracováván podle manuálu (Cringoli a kol. 2010). Trus o hmotnosti 10 g byl rozmíchán v 90 ml vody a přepasírován přes jemné sítko. Bylo odebráno 11 ml suspenze do plastové zkumavky (50 ml) a vzorek byl centrifugován (3 min, 170 g). Supernatant byl odsát, pelet rozmíchán v 11 ml flotačního roztoku síranu zinečnatého (ZnSO4. 7H2O) o hustotě 1,35 g/ml. Suspenze byla přepipetována do dvou komůrek flotační aparatury (Obr. 7), která byla centrifugována 3 min, 170 g. Následně byla FLOTAC aparatura přenesena pod mikroskop a prohlížena. Při zaznamenávání počtu zachycených vajíček touto metodou byla počítána i vajíčka deformovaná. Vzhledem k tomu, že aparatura FLOTAC zatím není komerčně dostupná (je možné získat jí od autora technologie), byla tato metoda testována na VFU Brno.

26    

Obr. 7: FLOTAC aparatura (obrázek Giuseppe Cringoli, autor technologie) šroub   klíč   čtecí  disk  

základ  FLOTAC  aparatury   s  flotačními  komůrkami  

adaptér  do  centrifugy  

Aparatura Parasep®: Pokus byl prováděn s koncentračními zkumavkami Mini Parasep® (DiaSys) určenými pro 1 g koprologického materiálu. Zpracování vzorků probíhalo podle manuálu dodaného výrobcem. Zpracování vzorku (oddělení větších částí trusu a sedimentace vajíček) probíhá v uzavřené koncentrační zkumavce (Obr. 8). Zkumavka se vzorkem byla centrifugována (1 min, 1000g). Veškerý sediment s vajíčky byl odebrán Pasteurovou pipetou a prohlížen pod mikroskopem. Vzhledem k tomu, že zkumavky byly výrobcem naplněné 6 ml 10% formalínu se surfaktantem Triton X-100, které komplikují izolaci DNA a inhibují následnou PCR reakci, není možné sediment trusu získaný touto metodou použít pro eventuelní molekulární analýzu.

27    

Obr. 8: Koncentrační zkumavka Mini Parasep® (obrázek http://mecos.ru/images/prepare/parasepengl.jpg) Prostor  pro  homogenizaci   vzorku  

Integrovaná  lžička  

Rovná  hrana  pro  stabilní   uložení  zkumavky   Detail   plastového   filtru  

Plastový  filtr   Zábrana  protlačení  zachycených   částic  během  centrifugace   Těsnící  bezpečnostní  uzávěr  

Kónické  dno  zkumavky  

Modifikovaný Parasep®: Modifikace zpracování trusu s koncentračními zkumavkami Mini Parasep® spočívala ve vymytí roztoku 10% formalínu a Triton X-100 ze zkumavek ještě před vložením vzorku. Namísto těchto chemikálií byla aparatura naplněna vodou. U výrobce je možné získat zkumavky, které nejsou naplněné formalínem, tyto jsem však v rámci testovacího balíčku, který poskytla firma Bio Tech, neměla k dispozici. Zkumavky se vzorkem byly centrifugovány (1 min, 1000g), veškerý získaný sediment s vajíčky byl odebrán Pasteurovou pipetou a prohlížen pod mikroskopem a eventuelně také dále využit pro molekulární analýzu. 5.3 Srovnání metod zpracování koprologických vzorků Do negativních vzorků trusu určitého objemu byl přidán přesně odpočítaný počet vajíček F. magna. (Koprologický materiál, do kterého byla vajíčka přidávána, byl předem vyšetřen mikroskopicky i molekulárně za účelem ověření nepřítomnosti vajíček a byl navíc získán z oborového chovu z oblasti, ve které dosud nebyl výskyt trematodóz nikdy zaznamenán). Vzorky s vajíčky byly zpracovány výše uvedenými metodami. Pro každou metodu byly 28    

připraveny vždy tři sady vzorků, kde v každé sadě bylo minimálně pět vzorků se stejným počtem přidaných vajíček (vzorky zpracované aparaturou FLOTAC byly prováděny pouze ve třech opakováních z důvodu deformací vajíček v průběhu koncentrační procedury). V případě vzorků trusu o hmotnosti 1 g, bylo do vzorku přidáváno 1, 5 nebo 50 vajíček a vzorek byl při mikroskopickém vyšetření prohlížen kompletně (cca 5 – 10 podložních skel). Do vzorků trusu o hmotnosti 10 g bylo přidáváno 10, 50 nebo 500 vajíček a zpracovaný vzorek byl prohlížen minimálně na pěti podložních sklíčkách. Počet nalezených vajíček v jednotlivých vzorcích byl zaznamenán, pro každou sadu vzorků byl vypočten průměrný počet nalezených vajíček a tento průměr byl porovnán mezi jednotlivými metodami. U metod, kterými byly zpracovávány vzorky trusu o hmotnosti 10 g z důvodu doporučení v manuálu (Faustova metoda, metoda podle Brezy, FLOTAC) byl průměrný počet nalezených vajíček přepočten na 1 g, aby bylo možné porovnat všechny metody mezi sebou. Vzorky trusu byly po zpracování mikroskopicky vyšetřeny, přičemž byl testován detekční limit záchytu vajíček jednotlivých metod a zároveň byla ověřována využitelnost těchto metod pro následnou molekulární analýzu vzorků. 5.4 Mikroskopické vyšetření Zpracované vzorky trusu byly prohlíženy pod světelným mikroskopem Olympus CX21 a Olympus BX50 při zvětšení 40x – 400x. Nalezená vajíčka motolic byla fotografována a měřena s využitím programů QuickPHOTO MICRO 2.0 a DP Controller. 5.5. Molekulární analýza 5.5.1 Izolace DNA Dospělci a larvální stádia: DNA byla izolována z červů fixovaných v čistém 96% etanolu. Z červů byla izolována (vystřižena) a použita tkáň z přední části těla motolic kvůli minimalizaci kontaminace obsahem střeva. Larvální stádia F. magna a menší motolice (D. dendriticum) byly za účelem izolace použity celé. Samotná izolace probíhala dle protokolu komerčně dodávaného kitu (QIAamp® DNA Mini Kit, QIAGEN), který je založený na adsorpci DNA na silikátové membrány tvořící dno izolační kolonky, následném promytí a eluci DNA. Koncentrace získané DNA byla měřena na spektrofotometru ND–1000 (NanoDrop®) a uchována v elučním pufru při teplotě -20 °C. V některých pokusech byla použita také dříve izolovaná DNA druhů Ascaris lumbricoides 29    

a Trichobillharzia szidati, která byla poskytnuta Romanem Leontovyčem a Martinem Kašným. Testována byla také izolace DNA pomocí fenol–chloroformové metody. Koncentrace získané DNA byla srovnatelná s koncentrací DNA získanou QIAamp® DNA Mini Kitem, tato metoda však v dalších pokusech využívána nebyla z důvodu její časové náročnosti (2 dny). Vajíčka: Pro izolaci DNA z vajíček a DNA z vajíček přítomných v koprologickém materiálu bylo testováno několik metod. Byla ověřována využitelnost izolačních kitů QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN) a QIAamp® DNA Stool mini kit (QIAGEN), který navíc obsahuje adsorpční činidla (InhibitEX matrix) umožňující odstranění nečistot přítomných v trusu. Manuál pro izolaci DNA dle doporučení výrobce byl různě modifikován za účelem nalezení nejvhodnějších podmínek, za kterých dojde k rozrušení odolné vaječné stěny, lyzi buněk a odstranění proteinů. Byla testována např. homogenizace vzorku plastovým pístem, homogenizace vzorku za použití Bead Beateru, inkubace vzorku s proteinázou K po dobu 10 min – 24 hod. Na základě výsledků testování různých modifikací při izolaci DNA byly vybrány a v laboratoři využívány takové kity a jejich modifikace, kterými byla nejefektivněji získávána DNA s nejvyšší koncentrací a čistotou. Jako jedna z nejlepších metod izolace DNA z koprologického materiálu byla zvolena metoda využívající modifikovaný standardní protokol z kitu QIAamp® DNA Stool mini kitu (QIAGEN) (viz dále). Sediment trusu získaný sedimentační metodou o objemu 1 ml byl přidán do 2 ml polypropylenové zkumavky (BioSpec) s 0,5 ml skleněných kuliček o průměru 1,0 mm (BioSpec) a centrifugován (1 min, 16000 g). Supernatant byl odpipetován, k peletu byl přidán 1 ml pufru ASL z QIAamp® DNA Stool kitu. Vzorek byl homogenizován v přístroji Mini-Beadbeater-1 (BioSpec) (1 min, 5800 g) a následně inkubován 10 min při teplotě 70 °C, dále centrifugován (1 min, 16000 g), supernatant přenesen do nové zkumavky a smíchán s polovinou InhibitEX® tablety dodávanou v QIAamp® DNA Stool kitu. Vzorek byl opět centrifugován (1 min, 16000 g) a veškerý supernatant byl inkubován při teplotě 70 °C s AL pufrem a proteinázou K v poměru (200:200:15 µl) po dobu 24 hodin. Po inkubaci byl do vzorku přidán 96% etanol (stejné množství jako pufru AL). Suspenze byla přenesena do kolony dodávané v kitu, DNA byla adsorbována na membránu, promyta a eluována do 20 µl AE pufru. Koncentrace DNA byla měřena na spektrofotometru ND–1000 (NanoDrop®) a uchována při teplotě -20 °C. 30    

Pro ověření metody izolace DNA byla amplifikována DNA jak z vajíček motolic ve směsných koprologických vzorcích volně žijících i oborových zvířat z různých lokalit České a Slovenské republiky, tak ze vzorků trusu, do kterých byl přidán definovaný počet vajíček (1, 5, 50 nebo 10, 50, 500). 5.5.2 Příprava primerů Pro molekulární diagnostickou analýzu byl vybrán jako vhodný marker ITS2 region rDNA (Kráľová-Hromadová a kol. 2008, Bazsalovicsová a kol. 2010). Na základě odlišností v sekvencích ITS2 regionu jednotlivých druhů motolic byly navrženy primery pro amplifikaci (Obr. 9). Obr. 9: ITS2 region rDNA (část sekvence ITS2 regionu, podle kterého byly navrženy jednotlivé primery). Pc; P. cervi, Dd; D. dendriticum, Fm; F. magna, Fh; F. hepatica. První obdélník v sekvenci příslušné barvy označuje vždy „forward“ a druhý „reverse“ primer.

Legenda: ,,Druhově specifické primery B“: F. magna, F. hepatica, P. cervi, D.   dendriticum       Univerzální primery pro   všechny čtyři druhy motolic 31    

Druhově nespecifické univerzální degenerované primery: Primery byly navrženy za účelem amplifikace druhově nespecifického ITS2 regionu, tedy tak, aby jimi bylo možné amplifikovat ITS2 úsek všech čtyř druhů motolic (F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum) (Tab. 5). Při navrhování primerů bylo dbáno na to, aby vlastnosti primerů a velikost amplikonu nesnižovaly efektivitu reakce (Innis a Gelfand 1990). Primery proto byly navrženy o délce 25 bp a velikosti výsledného amplikonu 150 bp. ,,Druhově specifické primery A“: Specifické primery pro jednotlivé druhy motolic byly navrženy na základě regionu ITS2 rDNA v pracích Kráľová-Hromadová a kol. 2008, Bazsalovicsová a kol. 2010. (Tab. 6). ,,Druhově specifické primery B“: Tyto primery byly navrženy pro úseky ITS2 regionu rDNA jednotlivých motolic na základě sekvenčních informací v databázi NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://ncbi.nlm.nih.gov) tak, aby byly druhově příslušné DNA amplikony přesně velikostně odstupňovány po 30 bp (Tab. 7). Díky velikosti jednotlivých amplikonů: 89 bp F. magna, 119 bp F. hepatica, 149 bp D. dendriticum, 179 bp P. cervi, je možné odečíst výsledek PCR už po agarózové DNA elektroforéze. Pokud je ve vzorku DNA více druhů motolic (F. magna, F. hepatica, P. cervi i D. dendriticum), je možné v PCR s těmito primery amplifikovat DNA všech motolic a díky rozdílným velikostem amplikonům pak druhově příslušnou DNA rozlišit na agarózovém gelu. Za účelem lepšího rozlišení jednotlivých analyzovaných amplikonů byl používán agarózový 3% gel. Tab. 5: Druhově nespecifické univerzální degenerované primery Druh motolice

Sekvence primeru

Univerzální primery (pro všechny čtyři druhy motolic)

Fw: 5´- CGACGCCCAAWWAGTCGTGGCTTGG -3´ Rev: 5´- ACATTAGGRWAACGCCATAGATCTG -3´

32    

amplikon

100 bp

Tab. 6: ,,Druhově specifické primery A“ podle Kráľová-Hromadová a kol. (2008) a Bazsalovicsová a kol. (2010). Druh motolice a publikace

Sekvence primeru

amplikon

Fascioloides magna Kráľová-Hromadová a kol. (2008)

Fw: 5´-ACCAGTTATCGTTGTGTTG-3´ Rev: 5´-CCGTCTTTAAACAACAG-3´

152 bp

Fasciola hepatica Kráľová-Hromadová a kol. (2008)

Fw: 5´-CTTATGATTTCTGGGATAATT-3´ Rev: 5´-CCGTCGCTATATGAAAA-3´

112 bp

Dicrocoelium dendriticum Bazsalovicsová a kol. (2010)

Fw: 5´-CCCCAGTCGGAAACGTCA-3´ Rev: 5´-GATTAGAAGGCCGTATTTCGGA-3´

176 bp

Paramphistomum cervi Bazsalovicsová a kol. (2010)

Fw: 5´-CGCGTCTTGCTGGTAGCGCAGAC-3´ Rev: 5´-GTAACAGAACACCACAGTAGGTGATCA3´

161 bp

Tab. 7: ,,Druhově specifické primery B“. Druh motolice

Sekvence primeru

amplikon

Fascioloides magna

Fw: 5´- CACTACTGTCGCTTTATCGTCG -3´ Rev: 5´- TGATCACGAAGGATACCGTCTT -3´

89 bp

Fasciola hepatica

Fw: 5´-CTTATGATTTCTGGGATAATT-3´ Rev: 5´- GCACAAACCAATGACAAAGTG -3´

119 bp

Dicrocoelium dendriticum

Fw: 5´- CTCCCCAGTCGGAAACGTCAGG -3´ Rev: 5´- GGATTAGAAGGCCGTATTTCGG -3´

149 bp

Paramphistomum cervi

Fw: 5´- TCTTGCTGGTAGCGCAGACGAG -3´ Rev: 5´- ACACCACAGTAGGTGATCATGA -3´

179 bp

5.5.3 PCR Reakce probíhala v přístroji My Cyclertm Thermal Cycler (Bio-Rad) v celkovém objemu reakční směsi 25 µl (Tab. 8). Schéma PCR reakce: denaturace DNA - iniciace 5 min 94 °C, amplifikace - 30 cyklů (30s 94 °C, Ta = Annealing Temperature; 30s 63 °C – univerzální 33    

primery, 55 °C – ,,druhově specifické primery A“, 63 °C – ,,druhově specifické primery B“, a 2 min 72 °C), ukončení amplifikace 10 min 72 °C. Po skončení reakce byla udržována konstantní teplota 4 °C. Kromě výše popsaného schématu PCR reakce, se kterým bylo dosaženo nejlepších výsledků, byly pro navržené primery testovány také jiné teploty nasedání primerů v gradientové PCR. Cílem bylo získat takovou teplotu, při které dochází k amplifikaci DNA z dospělců, larválních stádií i vajíček v trusu, aniž by docházelo k tzv. zkříženým, nespecifickým reakcím, kdy druhově specifické primery nasedají na DNA jiných druhů motolic. Amplifikované úseky DNA všech čtyř druhů motolic (při použití templátové DNA ze spolehlivě morfologicky determinovaných dospělců motolic a za použití ,,druhově specifických primerů B“) byly izolovány z gelu, smíchány na základě naměřených koncentrací (ND–1000, NanoDrop®) v poměru 1:1:1:1 a použity také jako marker - vlastní (tj. jako standardy definovaného počtu párů bází), se kterými byly srovnávány velikosti elektroforeticky separovaných DNA amplikonů motolic z některých dalších analýz (Tab. 9, DNA templát). Veškerá příprava PCR reakce byla prováděna sterilně ve flowboxu, který byl vždy 20 min před zahájením práce vystaven UV záření. Tab. 8: Reakční směs pro PCR PPP Master Mix (Top-Bio)

12,5 µl

2,5 mM MgCl2 (Top-Bio)

2,5 µl

Enhancer (Top-Bio)

0,5 µl

10 mM primer forward (tab. 2 - 4)

0,5 µl

10mM primer reverse (tab. 2 - 4)

0,5 µl

DNA templát

50 ng z červů, 100 ng z trusu

Sterilizovaná H2O

Zbytek do celkového objemu 25 µl

34    

Tab. 9: Reakční směs PCR pro přípravu vlastního markeru. PPP Master Mix (Top-Bio)

12,5 µl

2,5 mM MgCl2 (Top-Bio)

2,5 µl

Enhancer (Top-Bio)

0,5 µl

10 mM primer forward (tab. 2 - 4)

0,5 µl

10mM primer reverse (tab. 2 - 4) DNA templát

0,5 µl 50 ng z F. magna, F. hepatica, P. cervi i D. dendriticum

Sterilizovaná H2O

Zbytek do celkového objemu 25 µl

5.5.4 Real-time PCR (qPCR) Veškeré reakce byly připravovány v dubletech, reakce byly prováděny s využitím přístroje Light Cyclertm (Bio-Rad) v celkovém objemu reakční směsi 15 µl (Tab. 10). Schéma PCR reakce: denaturace DNA - iniciace 5 min 94 °C, amplifikace - 50 cyklů (30s 94 °C, 30s 63 °C a 2 min 72 °C), pro odečítání výsledků byla zvolena možnost ,,Collect Well Factors from Experimental Plate“. Bezprostředně po amplifikaci DNA byla provedena analýza teploty tání, při které byly získané amplikony zahřívány z 60 °C až na 95 °C a zároveň byl měřen pokles fluorescence v příslušené teplotě. Po skončení reakce byla odečtena tzv. křivka tání DNA. Výsledky qPCR a analýzy teploty tání byly statisticky zhodnoceny. Tab. 10: Reakční směs pro Real – time PCR. iQ TM SYBR® Green (Bio-Rad)

7 µl

10 mM primer forward (tab. 2 - 4)

0,5 µl

10mM primer reverse (tab. 2 - 4)

0,5 µl

DNA templát

50 ng z červů, 100 ng z trusu

PCR H2O

do celkového objemu 15 µl

5.5.5 Gelová elektroforéza Po PCR, a v některých případech také po qPCR amplifikaci, bylo 15µl výsledné směsi naneseno do 3% agarózového gelu. Separace DNA probíhala 30 min při napětí 100 V (složení gelu: 1,5 g agarózy, Invitrogen, 50 ml TAE pufru, Bio-Rad a 5 µl SYBR® Green I, Invitrogen). Jako marker byl použit GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder (Fermentas) nebo marker vlastní (vytvořený z DNA amplikonů dospělců F. magna, F. hepatica, P. cervi 35    

a D. dendriticum). Výsledek byl dokumentován pod UV. V případě úspěšné amplifikace byl DNA amplikon izolován (vyříznut) z gelu a dále purifikován dle protokolu komerčně dodávaného k použitému kitu MinElute gel extraction kit (QIAGEN). Koncentrace výsledného produktu byla měřena na spektrofotometru ND–1000 (NanoDrop®). Získaná DNA byla použita na ligaci nebo pro účely sekvenace. 5.5.6 Ligace Některé PCR produkty byly ligovány za účelem získání kvalitnějších a kompletnějších sekvencí. Ligační reakce o celkovém objemu 10 µl byla tvořena 5 µl PCR produktu, 2,5 µl H2O, 1 µl ligačního pufru, 1 µl PCR 2.1 vektoru a 0,5 µl T4 ligázy (vše součást TA cloning® kit, Invitrogen). Reakce probíhala v přístroji My Cyclertm Thermal Cycler (Bio-Rad) při teplotě 14 °C po dobu 12 hodin. 5.5.7 Transformace kompetentních buněk Escherichia coli TOPO 10 Ligovaný inzert (5 µl) byl pipetován do vymražených plastových zkumavek s kompetentními E. coli buňkami TOPO 10 (One Shot TOPO 10, Invitrogen) v objemu 25 µl. Zkumavky byly inkubovány na ledu po dobu 30 min a následně okamžitě zahřáty v termobloku na teplotu 42 °C po dobu 45 vteřin a bezprostředně poté uloženy na led. Po 2 min bylo k buňkám přidáno 200 µl S.O.C. media temperovaného na pokojovou teplotu. Zkumavky s buňkami byly dále inkubovány ve třepačce (37 °C, 225 rpm, INNOVATM 4000, New Brunswich Scientific). Po inkubaci byly buňky rozetřeny na Petriho misku s 25 ml LB Broth media s agarem a 50 µg antibiotika kanamycinu na 1 ml media. Takto připravená plotna s buňkami byla min. 12 h inkubována při teplotě 37 °C. 5.5.8 Sekvenace Směs na sekvenační reakci byla připravena do celkového objemu 14 µl. Skládala se z 50 ng analyzované DNA, 0,3 µl 10 mM primeru a deionizované autoklávované (sterilní) vody doplněné do požadovaného objemu. Takto připravený vzorek byl předán do laboratoře sekvence DNA (PřF UK, Viničná 7, Praha 2). Sekvenační reakcí byla pro každou sekvenci získána dvě čtení ITS2 regionu („forward“ z 5´ konce a „reverse“ z 3´ konce). Sekvence byly prohlíženy v programu Chromas. Byly hledány sekvence primerů a opravovány chyby čtení nukleotidů. Jednotlivé získané sekvence byly složeny 36    

do konečné sekvence konsensuální pomocí programu Seqman ze softwarového balíku DNASTAR® (Lasergene). Sekvence byly srovnávány se sekvencemi v databázi NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov) pomocí BLAST (The Basic Local Alignment Search Tool). 5.6 Statistické vyhodnocení výsledků Real-time PCR (qPCR) Výsledky qPCR byly podrobeny mnohorozměrné diskriminační analýze. Pro statistické zpracování byly použity hodnoty měřené v průběhu amplifikace druhově specifické DNA jednotlivých motolic, přičemž statisticky byly hodnoceny bud´ celé křivky, nebo jen některé hodnoty křivek až po zvolený limit relativní fluorescence. Analyzována byla data ze tří opakování. Celkem bylo analyzováno 72 zkřížených, nespecifických reakcí, 24 negativních kontrol a 24 specifických reakcí. Získané hodnoty byly zpracovány ve statistickém

programu R verze 2.10.1. (http://www.r-project.org) Mgr. Alenou Černíkovou, Ph.D. 5.6.1 Analýza křivek amplifikace DNA Diskriminační analýza měla ověřit, zda je možné na základě dat získaných metodou qPCR odlišit křivky odpovídající specificky amplifikované DNA z dospělců, larválních stádií a vajíček motolic od křivek reprezentujících zkřížené, nespecifické reakce (tj. amplifikace DNA příslušné motolice s druhově specifickými primery navrženými pro amplifikaci DNA jiného druhu motolice, např. kombinace templátové DNA F. magna a druhově specifické primery pro F. hepatica) a negativní kontroly (místo templátové DNA H2O). 5.6.2 Analýza průběhu „tání“ DNA Byla provedena také lineární diskriminační analýza tání dvouvláknové DNA. Cílem analýzy bylo ověření možnosti rozlišení DNA jednotlivých druhů motolic, zkřížených, nespecifických reakcí a negativních kontrol na základě křivek průběhu tání DNA. V této diskriminační analýze byla statisticky hodnocena data: A) Hodnoty relativní fluorescence (RFU = Relative Fluorescence Unit) měřené v průběhu rozpadu získaného DNA amplikonu a teplota, při které byl zaznamenán začátek a konec rozpadu dvouvláknové DNA. B) Kompletní křivky reprezentující průběh tání získaných DNA amplikonů při teplotách od 77 do 87 °C.

37    

C) Kompletní křivky reprezentující průběh tání získaných DNA amplikonů při teplotách od 77 do 87 °C a RFU hodnoty těchto křivek po derivaci dané teplotou na začátku a na konci analýzy tání DNA. D) Teplota tání získaných DNA amplikonů jednotlivých druhů motolic, která byla zaznamenána při nejvyšších hodnotách RFU. Statistické vyhodnocení bylo provedeno pouze pro DNA amplifikovanou ,,druhově specifickými primery B“, pro ,,druhově specifické primery A“ nebyla statistická analýza

realizována, protože zkřížené, nespecifické reakce se za použití těchto primerů vyskytly dříve než zkřížené reakce DNA amplifikované ,,druhově specifickými primery B“, a také z důvodu předpokládaného nevyužívání těchto ,,druhově specifických primerů A“ v dalších pokusech. Pro univerzální degenerované primery nebyla statistická analýza provedena z důvodu druhové nespecifity těchto primerů, které mohou libovolně amplifikovat DNA F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum (teoreticky také DNA jiných organismů, především z třídy Trematoda, které mají ve svém genomu podobnou nukleotidovou sekvenci). 5.7 Detekční limit molekulárních metod Pro nalezení limitního počtu vajíček (nejmenší počet), které je molekulární metodou ještě možné ve vzorku trusu prokázat, byl definovaný počet vajíček (1, 5, 50) přidáván a) do 1 ml připraveného sedimentu již zpracovaného vzorku trusu, ze kterého byla následně izolována DNA. Za b) přímo do 1 g vzorku trusu, který byl zpracováván sedimentační metodou. Ze sedimentu byla následně izolována DNA. Bylo připraveno vždy pět vzorků se stejným počtem přidaných vajíček. Koprologický materiál, do kterého byla vajíčka přidávána, byl předem vyšetřen mikroskopicky i molekulárně za účelem ověření nepřítomnosti motoličích vajíček. Tento koprologický materiál byl navíc získáván z oborového chovu z oblasti, ve které dosud nebyl výskyt trematodóz zaznamenán. 5.8 Srovnání mikroskopických a molekulárních metod Při mikroskopickém vyšetření byl zpětně zaznamenáván počet vajíček ve vzorcích trusu obohacených přesně odpočítaným množstvím vajíček. Vzorky byly zpracovávány s cílem zjistit a porovnat detekční limity mikroskopických a molekulárních metod. V závěrečném 38    

pokusu byly vzorky trusu s vajíčky určené pro definování těchto limitů zpracovávány paralelně, pro pokus byly vybrány jen ty metody zpracování trusu, kterými byl při ověřování jejich využitelnosti zachycen nejvyšší počet vajíček – tedy zpracování koprologických vzorků metodou sedimentační a s využitím zkumavek Parasep® naplněných pouze vodou. Byly připraveny čtyři stejné sady vzorků, do nichž byl přidán definovaný počet vajíček (1, 5, 50). Dvě sady vzorků byly zpracovány sedimentační metodou, sediment vzorků z jedné sady byl vyšetřen mikroskopicky, sediment druhé sady byl použit pro molekulární analýzu. Další dvě sady byly zpracovány se zkumavkami Parasep®, sediment jedné sady byl opět vyšetřen mikroskopicky, druhá sada vzorků byla použita pro molekulární analýzu. 5.9 Případové studie Optimalizované postupy molekulární diagnostiky trematodóz působených F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum, doplněné o závěry mikroskopických vyšetření byly

ověřovány na koprologických vzorcích v rámci několika případových studiích – vyšetření populací volně žijících a farmových zvířat. 5.9.1 Případová studie 1 Vzorky trusu oborově chovaných bílých jelenů Vzorky trusu oborově chovaných jelenů byly získány od Prof. Lamky (Farmaceutická fakulta v Hradci Kráľové Univerzity Karlovy) a zpracovány sedimentační metodou. Pro druhové určení motolic byla provedena molekulární analýza vajíček ve vzorcích. Z každého zpracovaného vzorku trusu byl odebrán 1 ml sedimentu, ze kterého byla izolována DNA. Získaná DNA byla amplifikována PCR metodou za použití „druhově specifických primerů A“ pro F. magna a F. hepatica. Amplifikovaná DNA byla zobrazena na 1% agarózovém gelu. 5.9.2 Případová studie 2 Vzorek trusu telemetricky monitorovaného jelena Vzorek trusu byl získán přímo z rekta imobilizovaného jelena, který byl monitorován pomocí

obojku

s

GPS

vysílačem

v rámci

jednoho

z projektů

NP

Šumava

(www.RysoviNaStope.cz). Pokud by se u tohoto jedince potvrdila nákaza F. magna, bylo by možné v rámci monitorovacího projektu sledovat jeho pohyb a tím i případné šíření 39    

nákazy prostřednictvím vylučovaných vajíček. Trus byl zpracován sedimentační metodou a byl podroben mikroskopickému i molekulárnímu vyšetření. 5.9.3 Případová studie 3 Vyšetření zubrů v karanténní oboře Do bývalého vojenského prostoru Ralsko bylo v lednu 2011 vypuštěno stádo pěti zubrů evropských (Bison bonasus) dovezené z Bělověžského a Kampinoského národního parku v Polsku. Zubři byli umístěni do aklimatizační karanténní obory, zde byli pozorováni, pravidelně byly odebírány také vzorky trusu konkrétních jedinců. Jednotlivá zvířata a vzorky jejich trusu jsou v této práci označována jako čísla 1 – 5. Koprologické vzorky byly zpracovány sedimentační metodou a mikroskopicky vyšetřeny. Ze sedimentu vzorků trusu byla také izolována DNA, která byla amplifikována metodami PCR a qPCR s „druhově specifickými primery B“ a univerzálními primery. V oblasti bývalého vojenského prostoru i samotné obory byli nalezeni mezihostitelé F. magna, F. hepatica - plži G. truncatula, čímž byly teoreticky zajištěny podmínky umožňující průběh kompletního životního cyklu. V případě potvrzení nákazy zubrů a jejich vypuštění z karanténní obory na 3780 ha zbývající plochy vojenského prostoru by tedy mohlo dojít k šíření trematodóz. Pokud by se prokázala nákaza zubrů motolicemi F. magna nebo F. hepatica, mohlo by tak prostřednictvím těchto zvířat, docházet k zavlékání parazitóz do oblastí fasciolózy a fascioloidózy prostých, např. na pastviny hospodářských zvířat. 5.9.4 Případová studie 4 Vzorky trusu z pastevních chovů hospodářských zvířat v NP Šumava V průběhu několika posledních let jsme zaznamenávali informace o úhynech hospodářských zvířat na území NP Šumava (ústní sdělení jednotlivých hospodářů) v oblastech s potvrzeným výskytem F. magna. Do těchto oblastí jsme pořádali několik výjezdů, při nichž byly sbírány směsné koprologické vzorky hospodářských zvířat i vzorky trusu konkrétních, stájově chovaných jedinců. Vzorky trusu byly zpracovány sedimentační metodou a mikroskopicky vyšetřeny. Vzorky trusu, v nichž byla nalezena vajíčka motolic, byly podrobeny molekulární analýze za použití „druhově specifických primerů B“.

40    

5.9.5 Případová studie 5 Vzorky trusu z biofarmy v Jižních Čechách Naše helmintologická laboratoř byla oslovena chovatelem z biofarmy v jihočeském kraji s podezřením na výskyt motoličnatosti v chovu Skotského náhorního skotu („Highland Cattle“). Následně byli na ekojatkách Sasov u Jihlavy poraženi dva tříletí býci pocházející z výše uvedeného chovu. Porážky se zúčastnili i někteří členové naší laboratoře. Poražená zvířata nebyla v optimální zdravotní kondici, což vyplývá i z veterinární správy (výtah z veterinární zprávy: Posouzení celých kusů - vyhublost). Pod veterinárním dohledem byla provedena pitva. Býkům byl z rekta odebrán trus, který byl zpracován sedimentační metodou a mikroskopicky vyšetřen. Za účelem determinace motolic nalezených v játrech a vajíček v trusu byla provedena molekulární analýza. DNA byla amplifikována univerzálními a „druhově specifickými primery B“ metodami PCR i qPCR.

41    

6. VÝSLEDKY 6.1 Sběr koprologického materiálu Jako nejspolehlivější metoda sběru koprologického materiálu byl logicky vyhodnocen opakovaný odběr trusu od konkrétního zvířete. Tento postup je však možné spolehlivě realizovat pouze u stájově chovaných hospodářských zvířat, imobilizovaných jedinců či u poražených jatečních zvířat. Sběr koprologického materiálu konkrétního jedince lze s omezeními provádět i u stádově chovaných zvířat na základě přímého pozorování. Tento postup je však nespolehlivý a velmi časově náročný. Pro potřeby preventivního vyšetření chovného stáda se jeví jako nejefektivnější sběr směsných koprologických vzorků, přičemž teprve v případě pozitivních nálezů je možné přistoupit k individuálním odběrům. 6.2 Metody zpracování koprologických vzorků V tabulce 11 jsou seřazeny metody zpracování koprologického materiálu podle průměrného počtu zachycených vajíček, a zároveň podle toho, zda byl vzorek zpracovaný danou metodou využitelný také pro molekulární analýzu. Tab. 11: Srovnání metod zpracování koprologických vzorků. Zvýrazněna je metoda zpracování trusu, která byla vyhodnocena jako nejlepší.

Sedimentační   metoda  

Parasep®  

10  

2  

1  

1  

3  

1  

Průměrný  počet   zaznamenaných   vajíček  (přepočteno   na  1  g  trusu)   0,16  

50  

7  

2  

3  

4  

1  

0,34  

500  

67  

64  

79  

70  

58  

6,76  

Počet  vajíček   přidaných  do  1  g   trusu  

Počet  zaznamenaných   vajíček/vzorek  

Počet  vajíček   přidaných  do  1  g   trusu   1   5  

0   1  

0   1  

0   0  

0   1  

0   1  

Průměrný  počet   zaznamenaných   vajíček     0   0,8  

50  

4  

8  

8  

6  

7  

6,6  

Počet  zaznamenaných   vajíček/vzorek  

42    

FLOTAC  

Počet  vajíček   přidaných  do  10  g   trusu   10   50   500  

Faustova   metoda  

Modifikovaná   metoda  dle   Brezy  

Průměrný  počet   zaznamenaných   vajíček  (přepočteno   na  1  g  trusu)  

Počet  zaznamenaných   vajíček/vzorek   2   12   123  

Počet  vajíček   přidaných  do  10  g   trusu  

3   7   124  

1   10   117  

X   X   X   X   X   X  

Průměrný  počet   zaznamenaných   vajíček  (přepočteno   na  1  g  trusu)  

Počet  zaznamenaných   vajíček/vzorek  

10   50   500  

1   3   23  

Počet  vajíček   přidaných  do  10  g   trusu  

0   1   31  

1   2   17  

0   2   24  

1   2   19  

Počet  vajíček  nalezených  v   jednotlivých  vzorcích  

10   50   500  

0   1   16  

0   1   17  

1   0   8  

0   1   25  

0,2   0,96   12,1  

0,06   0,2   2,28   Průměrný  počet   zaznamenaných   vajíček  (přepočteno   na  1  g  trusu)  

0   1   14  

0,02   0,08   1,6  

Sedimentační metoda (v Tab. 11. označena růžovou barvou) je pro účely prováděného výzkumu nejideálnější z několika důvodů. Tímto způsobem je možné zpracovat najednou větší množství koprologického materiálu, což je důležité zejména v případě směsných vzorků

trusu.

Velkou

výhodou

je

také

bezproblémové

využití

sedimentu

s koncentrovanými vajíčky pro následné molekulární analýzy. Provedení metody není časově, finančně ani přístrojově náročné. Při zpracování koprologických vzorků s koncentračními zkumavkami Parasep® bylo zachyceno přibližně stejné množství vajíček jako při zpracování vzorků sedimentační metodou, sediment s vajíčky však navíc obsahoval zbytky 10% formalínu, který byl součástí zkumavek dodaných výrobcem, což znemožňovalo jeho využití pro následnou molekulární analýzu. Použití zkumavek Parasep® bylo velice jednoduché a časově nenáročné. Nevýhodou zkumavek Parasep®, oproti např. metodě sedimentační, jsou vyšší finanční náklady (1180 Kč/10 ks, http://www.labtechnik.cz/veterinarni-technika/rychletesty/fecal-filter/)

při rutinním

zpracování 43  

 

trusu

pro

mikroskopické

vyšetření.

Při zpracování koprologických vzorků zkumavkami Parasep®, u kterých byla nahrazena originální náplň za vodu, byl při mikroskopickém vyšetření zpětně zaznamenán přibližně stejný počet vajíček, jako se zkumavkami Parasep® s originální náplní a sediment bylo navíc možné využít i pro molekulární analýzu. Po zpracování vzorků s aparaturou FLOTAC byla přibližně 1/3 vajíček deformovaná (promáčklá), což znesnadňovalo jejich identifikaci. Ačkoli byl průměrný počet zachycených vajíček s aparaturou FLOTAC ze všech testovaných metod nejvyšší, pro účely následné mikroskopické a molekulární determinace je metoda nevhodná vzhledem deformaci vajíček a možné inhibici případné PCR flotačním roztokem. Metody zpracování trusu podle Fausta a Brezy rovněž nejsou pro diagnostiku trematodóz vhodné z důvodu nízkého počtu zachycených vajíček a nemožnosti dalšího molekulárního zpracování vzorků. 6.3 Molekulární analýza Některé metody umožňující molekulární analýzu vzorků, jejichž diagnostický potenciál byl v této práci ověřován, byly vyhodnoceny jako využitelné pro diagnostiku motolic. Metody, které byly vyhodnoceny jako nejoptimálnější, a které byly následně využívány pro účely této práce, jsou uváděny dále. 6.3.1 Izolace DNA Byly

nalezeny

postupy

izolace

DNA

z dospělců,

larválních

stádií

i

vajíček

v koprologickém materiálu, kterými byla získána DNA o vysoké koncentraci a čistotě, tedy metody vhodné pro další molekulární analýzu (Tab. 12).

44    

Tab. 12: Testované metody izolace DNA a jejich modifikace. Zvýrazněny jsou metody izolace, kterými byla získána DNA o vysoké koncentraci i čistotě. Izolace DNA z dospělých motolic a jejich larválních stádií

Modifikace standardního protokolu

Nevýhody metody

QIAamp DNA mini kit

X

neúplná lyze některých motolic

QIAamp DNA mini kit

inkubace s proteinázou K přes noc

X

QIAamp DNA mini kit

homogenizace v Bead Beateru

Fenol - Chloroformová metoda

X

X časová náročnost (2 dny)

Izolace DNA z vajíček

Modifikace standardního protokolu

Nevýhody metody

QIAamp DNA mini kit

X

malá výtěžnost DNA

QIAamp DNA mini kit

inkubace s proteinázou K (12 h)

malá výtěžnost DNA

QIAamp DNA mini kit

homogenizace v Bead Beateru

X

DNA Stool mini kit

X

malá výtěžnost DNA

DNA Stool mini kit

homogenizace v Bead Beateru

X

Izolace DNA z vajíček v koprologickém materiálu

Modifikace standardního protokolu

Nevýhody metody

QIAamp DNA mini kit

inkubace s proteinázou K 10 min – 24 h

malá výtěžnost DNA

QIAamp DNA mini kit

homogenizace vzorků plastovým pístem, inkubace s proteinázou K 10 min - 24 h

nízká koncentrace DNA

QIAamp DNA mini kit

homogenizace v Bead Beateru, inkubace s proteinázou K 10 min - 3 h

nízká koncentrace DNA

DNA Stool mini kit

inkubace s proteinázou K 10 min - 3 h

nízká koncentrace a znečištění DNA

DNA Stool mini kit

homogenizace vzorků tyčinkou, inkubace s proteinázou K 10 min - 24 h

nízká koncentrace DNA

DNA Stool mini kit

homogenizace v Bead Beateru, inkubace s proteinázou K 10 min - 3 h

nízká koncentrace a znečištění DNA

DNA Stool mini kit

homogenizace v Bead Beateru, inkubace s proteinázou K 24 h

X

45    

6.3.2 PCR Dospělci a larvální stádia Druhově nespecifické univerzální degenerované primery: Byla zjištěna optimální teplota pro nasedání těchto primerů („annealing temperature“ - Ta 63 °C) na úseky ITS2 regionu templátové DNA izolované z dospělých jedinců F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum (Obr. 9). Byla amplifikována také DNA larválních stádií F. magna izolovaných z mezihostitelského plže G. truncatula. DNA škrkavky Ascaris lumbricoides a motolice Trichobillharzia szidati s využitím těchto primerů amplifikována nebyla (Obr. 10). Purifikované DNA amplikony byly sekvenovány, a s využitím on-line nástroje BLAST a NCBI databáze (http://ncbi.nlm.nih.gov) byla zjištěna sekvenční podobnost a jejich příslušnost jednotlivým druhům motolic. Získané sekvence vykazovaly shodu 96 - 100 %. Obr. 10: DNA amplifikovaná univerzálními primery, Ta 63 °C. Zobrazení DNA amplikonů dospělců motolic pomocí agarózové DNA elektroforézy (3% agarózový gel obarvený SYBR® Green I). M; marker, 1; DNA F. magna, 2; DNA F. hepatica, 3; DNA P. cervi, 4; DNA D. dendriticum, 5; DNA Ascaris lumbricoides 6; DNA z cerkárie F. magna, 7; DNA z redie F. magna, 8; DNA Trichobillharzia szidati. M

1

2

3

4

5

6

7

8  

bp

200

100

Druhově specifické primery A“: Byla ověřena specifita ,,druhově specifických primerů A“, kterými byla spolehlivě amplifikována DNA F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum, Ta 55 °C (Obr. 11). Purifikované DNA amplikony byly sekvenovány, a s využitím on-line nástroje BLAST a NCBI databáze (http://ncbi.nlm.nih.gov) byla zjištěna sekvenční podobnost a jejich příslušnost jednotlivým druhům motolic. Získané sekvence vykazovaly shodu 98 – 100 %. 46    

Obr. 11: DNA amplifikovaná ,,druhově specifickými primery A“, Ta 55 °C. Zobrazení DNA amplikonů dospělců motolic pomocí agarózové DNA elektroforézy (1% agarózový gel obarvený SYBR® Green I). M; marker, 1; DNA P. cervi (161 bp), 2; DNA F. magna (152 bp), 3; DNA F. hepatica (112 bp). 4; DNA D. dendriticum (176 bp). M

1

2

3

4  

bp

200 100

,,Druhově specifické primery B“: Optimálních výsledků bylo dosaženo při Ta 63 °C, kdy byla metodou PCR amplifikována DNA ze všech stádií motolic, a nedocházelo ke zkříženým, nespecifickým reakcím (Obr. 12). Pokud byla Ta nižší, docházelo ke zkříženým, nespecifickým reakcím primerů s DNA z dospělců, při Ta vyšší (např. 65 °C) docházelo pouze k amplifikaci DNA z dospělců, DNA z vajíček v trusu amplifikována nebyla. Obr. 12: DNA amplifikovaná ,,druhově specifickými primery B“, Ta 63 °C. Zobrazení DNA amplikonů dospělců motolic pomocí agarózové DNA elektroforézy (3% agarózový gel obarvený SYBR® Green I). M; vlastní marker tvořený předem amplifikovanou DNA motolic F. magna, F. hepatica, D. dendriticum, P. cervi z přípravné PCR reakce (89, 119, 149, 179 bp) (reakce obarvena 6x DNA Loading dye). 1; DNA F. magna (89 bp), 2; DNA F. hepatica (119 bp), 3; DNA D. dendriticum (149bp), 4; DNA P. cervi (179bp). M

1

M

2

M

 

3

M

4

M bp 179 149 119 89

47    

DNA amplifikovaná ,,druhově specifickými primery B“ byla odeslána na sekvenaci, získané

sekvence,

které

byly

srovnávány

se

sekvencemi

v

databázi

NCBI

(http://ncbi.nlm.nih.gov) (BLAST) vykazovaly 98 – 100 % shodu. Vajíčka v koprologickém materiálu Druhově nespecifické univerzální degenerované primery: Těmito primery se dařila amplifikovat metodou PCR (Ta 63 °C) DNA izolovaná z 1, 5 a 50 vajíček F. magna/F. hepatica, která byla přidávána do negativních vzorků trusu. DNA izolovanou z 1 vajíčka se ve vzorku podařilo jasně prokázat pouze u F. hepatica, i když amplikonu bylo opakovaně jen velmi malé množství. Amplifikace DNA izolované z 1 vajíčka F. magna je v tomto případě diskutabilní (velice špatně viditelný amplikon) (Obr. 13 a Obr. 14). Obr. 13: DNA amplifikovaná univerzálními primery, Ta 63 °C. Zobrazení DNA amplikonů vajíček motolic pomocí agarózové DNA elektroforézy (3% agarózový gel obarvený SYBR® Green I). M; marker, 1; DNA F. magna izolovaná z 1 vajíčka v trusu, 2; DNA F. magna izolovaná z 5 vajíček v trusu, 3; DNA F. magna izolovaná z 50 vajíček v trusu, 4; negativní kontrola. M

1

2

bp

200 100

48    

3

4

Obr. 14: DNA amplifikovaná univerzálními primery, Ta 63 °C. Zobrazení DNA amplikonů vajíček motolic pomocí agarózové DNA elektroforézy (3% agarózový gel obarvený SYBR® Green I). M; marker, 1; DNA F. hepatica izolovaná z 1 vajíčka v trusu, 2; DNA F. hepatica izolovaná z 5 vajíček v trusu, 3; DNA F. hepatica izolovaná z 50 vajíček v trusu, 4; negativní kontrola. 1

2

3

4

M bp

200 100

,,Druhově specifické primery A“:   Byla amplifikována DNA izolovaná z trusu (Ta 55 °C), do kterého byl přidaný definovaný počet vajíček (1, 5, 50) F. magna a F. hepatica (Obr. 15). Obr. 15: DNA amplifikovaná ,,druhově specifickými primery A“, Ta 55 °C: Zobrazení DNA amplikonů vajíček motolic pomocí agarózové DNA elektroforézy (1% agarózový gel obarvený SYBR® Green I). M; marker, 1; DNA izolovaná z koncentrovaných vajíček F. magna, 2; DNA izolovaná z koncentrovaných vajíček F. hepatica, 3-5; DNA izolovaná z 1, 5, 50 vajíček F. magna v 1 g trusu, 6-8; negativní kontroly, 9-11; DNA izolovaná z 1, 5, 50 vajíček F. hepatica v trusu, 12; DNA izolovaná z koncentrovaných vajíček P. cervi. M 1

2

3

4

5

6

bp

200 100  

49    

7

8

9

10

11 12

,,Druhově specifické primery B“:  Metodou PCR byla amplifikovaná DNA z vajíček v trusu (Ta 63 °C) (Obr. 16). Pokud byla Ta nižší, docházelo ke zkříženým, nespecifickým reakcím primerů s DNA z dospělců, při Ta vyšší (např. 65 °C) docházelo pouze k amplifikaci DNA z dospělců, DNA z vajíček v trusu amplifikována nebyla. Purifikované DNA amplikony byly sekvenovány, a s využitím on-line nástroje BLAST a NCBI databáze (http://ncbi.nlm.nih.gov) byla zjištěna sekvenční podobnost a jejich příslušnost jednotlivým druhům motolic. Získané sekvence vykazovaly shodu 98 – 100 %. Obr. 16: DNA izolovaná z trusu obohaceného vajíčky a amplifikovaná ,,druhově specifickými primery B“, Ta 63 °C. Zobrazení DNA amplikonů vajíček motolic pomocí agarózové DNA elektroforézy (3% agarózový gel obarvený SYBR® Green I). M; marker, 1–4; negativní kontroly (primery F. magna, F. hepatica, D. dendriticum a P. cervi), 5-7; DNA izolovaná z 1, 5, 50 vajíček F. magna v trusu, 8-10; DNA izolovaná z 1, 5, 50 vajíček F. hepatica v trusu, 11-12; DNA izolovaná z vajíček D. dendriticum v trusu, 13; DNA izolovaná z vajíček P. cervi v trusu. 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

M

6.3.3 Real-time PCR (qPCR) Výsledky qPCR jsou zde prezentovány na základě výsledků statistické analýzy qPCR, které jsou popsány v kapitole 6.4. Veškeré vzorky amplifikované qPCR byly připraveny v dubletech, proto jsou v grafech zobrazeny vždy dvojice křivek s podobným průběhem. Dospělci a larvální stádia Druhově nespecifické univerzální degenerované primery:

Metodou qPCR byla

amplifikována DNA izolovaná z dospělých jedinců F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum (Ta 63°C) (Obr. 17). Byla amplifikována také DNA larválních stádií F. magna izolovaných z mezihostitelského plže G. truncatula. DNA škrkavky Ascaris 50    

lumbricoides a motolice Trichobillharzia szidati s využitím těchto primerů byla amplifikována až po 30. cyklu reakce. V případě reakce těchto primerů s DNA z negativního trusu (bez vajíček motolic, jedna z negativních kontrol) nebyla DNA amplifikována vůbec (Obr. 17). Purifikované DNA amplikony byly sekvenovány, získané sekvence byly srovnávány se sekvencemi v databázi NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov), BLAST, vykazovaly 96 - 100% shodu. Výsledky prezentované na obr. 17 odpovídají výsledkům PCR (Obr. 10). Obr. 17: DNA amplifikovaná univerzálními primery metodou qPCR, Ta 63 °C. Červeně; specificky amplifikovaná DNA F. magna , F. hepatica , P. cervi , D. dendriticum . Zeleně; DNA izolovaná z larválních stádií F. magna z plže G. truncatula. Fialově; DNA Ascaris lumbricoides, Žlutě; DNA Trichobillharzia szidati, světle modře; negativní kontroly.  

 

30     28   ,,Druhově specifické primery A“: S použitím těchto primerů (Ta 55 °C) dochází ke specifické amplifikaci DNA F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum i ke vzniku zkřížených, nespecifických reakcí dříve (již ve 24. cyklu), než při amplifikaci DNA s využitím ,,druhově specifických primerů B“ (Obr. 18). Statistické vyhodnocení amplifikace DNA s ,,druhově specifickými primery A“ proto nebylo provedeno a ve většině případů byly dále používány ,,druhově specifické primery B“, které jsou v závěru práce doporučeny jako vhodnější pro molekulární diagnostiku těchto motolic.   Výsledky specificky amplifikované DNA odpovídají výsledkům PCR (Obr. 11). Zkřížené, 51    

nespecifické reakce zobrazené na obr. 18 nebyly v reakcích amplifikovaných metodou PCR (30 cyklů) patrné (výsledek nezobrazen).

Obr. 18: DNA amplifikovaná ,,druhově specifickými primery A“ metodou qPCR, Ta 55 °C. Červeně; specificky amplifikovaná DNA F. magna , F. hepatica , P. cervi , D. dendriticum , žlutě; zkřížené, nespecifické reakce, světle modře; negativní kontroly.  

 

30  

  28  

 

,,Druhově specifické primery B“: S použitím těchto primerů (Ta 63 °C) dochází ke specifické amplifikaci DNA F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum, a později také ke vzniku zkřížených, nespecifických reakcí a negativních kontrol (Obr. 19), které jsou od specificky amplifikované DNA odlišeny na základě výsledků statistické analýzy (kap. 6.4). Výsledek zobrazen na obr. 19. odpovídá výsledkům PCR (obr. 12).

52    

Obr. 19: DNA amplifikovaná s využitím ,,druhově specifických primerů B“, Ta 63 °C. Červeně; specificky amplifikovaná DNA F. magna , F. hepatica , P. cervi a D. dendriticum , žlutě; zkřížené, nespecifické reakce primerů, světle modře; negativní kontroly.  

 

30  

  28  

Vajíčka v koprologickém materiálu Druhově nespecifické univerzální degenerované primery:

Těmito primery se dařila

amplifikovat (Ta 63 °C) metodou qPCR DNA izolovaná z 1, 5 a 50 vajíček F. magna (Obr. 20) i F. hepatica, které byly přidávány do negativních vzorků trusu. Výsledek zobrazen na obr. 20 odpovídá výsledkům PCR (obr. 13).

53    

Obr. 20: DNA amplifikovaná univerzálními primery, Ta 63 °C. Červeně; pozitivní kontroly (DNA F. magna , F. hepatica , P. cervi , D. dendriticum ), modře; DNA izolovaná z 50 vajíček F. magna v trusu, oranžově; DNA izolovaná z 5 vajíček F. magna v trusu, zeleně; DNA izolovaná z 1 vajíčka F. magna v trusu, světle modře; negativní kontroly.  

   

30   28  

,,Druhově specifické primery A“: Vzhledem k tomu, že zkřížené, nespecifické reakce se při amplifikaci DNA z dospělců vyskytovaly dříve (již od 24. cyklu), než při použití ,,druhově specifických primerů B“ (Obr. 18), nebyla amplifikace DNA z vajíček za použití ,,druhově specifických primerů A“ testována. ,,Druhově specifické primery B“: Těmito primery (Ta 63 °C) se dařilo prokázat DNA izolovanou z 50 vajíček F. magna v trusu (Obr. 21 a 22 ) a 1, 5, a 50 vajíček F. hepatica v trusu (Obr. 23 a 24). Spolehlivost detekce počtu vajíček v trusu pomocí qPCR (ale i PCR) se může měnit v závislosti na úspěšnosti izolace DNA. Metodou PCR (30 cyklů) (Obr. 16) se podařilo amplifikovat a zobrazit na agarózovém gelu i DNA izolovanou z 1 a 5 vajíček F. magna, stejná DNA amplifikována metodou qPCR (Obr. 21) však byla po 28. cyklu vyhodnocena jako zkřížená, nespecifická PCR reakce. Výsledek zobrazen na Obr. 23 souvisí s výsledem PCR (Obr. 16).

54    

Obr. 21: DNA z vajíček F. magna v trusu amplifikovaná ,,druhově specifickými primery B“, Ta 63 °C. Červeně; DNA izolovaná z 1, 5, 50 vajíček F. magna v trusu (šipka označuje křivky znázorňující amplifikaci DNA izolovanou z 50 vajíček F. magna), žlutě; zkřížené, nespecifické reakce DNA F. magna z vajíček v trusu s primery pro F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum.  

 

30  

28   Obr. 22: Analýza teploty tání amplifikované DNA. Červeně; DNA F. magna izolovaná z vajíček v trusu, žlutě; zkřížené, nespecifické reakce.  

79   55    

Obr. 23: DNA z vajíček F. hepatica v trusu amplifikovaná ,,druhově specifickými primery B“, Ta 63 °C. Zeleně; DNA izolovaná z 1, 5, 50 vajíček F. hepatica v trusu, modře; DNA F. hepatica izolovaná z vajíček v trusu nespecificky amplifikovaná s primery pro F. magna, P. cervi a D. dendriticum.  

 

 

 

30   30     28   Obr. 24: Analýza teploty tání amplifikované DNA. Zeleně; DNA F. hepatica izolovaná z vajíček v trusu, modře; zkřížené, nespecifické reakce.  

82   56    

6.4 Výsledky statistické analýzy 6.4.1 Analýza křivek amplifikované DNA: Diskriminační analýza hodnot RFU v konkrétním cyklu reakce umožnila vytvoření rozhodovacích pravidel, díky kterým bylo možné rozlišit výsledky specificky amplifikované DNA F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum od zkřížených, nespecifických reakcí a negativních kontrol s využitím ,,druhově specifických primerů B“. Na základě této analýzy (tvaru křivek a hodnot RFU) byl definován hraniční cyklus reakce, od něhož začalo docházet k nespecifickému nasedání primerů na templátovou DNA a průběhu zkřížených, nespecifických reakcí nebo amplifikaci DNA v negativních kontrolách způsobené pravděpodobně kontaminací vzorku (Tab. 13). Pro hodnoty RFU 30 – 50 byl vypočten jako hraniční 28. cyklus reakce, pro hodnoty RFU 70 – 100 je hraniční 29. cyklus reakce a pro hodnoty RFU 120 je hraniční 30. cyklus reakce. Nejoptimálnější práh RFU pro definování hraničního qPCR cyklu je 28. cyklus reakce a hodnota RFU 30, tzn. veškerá amplifikovaná DNA, která dosáhne ve 28. cyklu hodnot RFU 30 a vyšších, je specificky amplifikovaná DNA. Reakce, v nichž hodnoty

RFU

křivek

odpovídající

amplifikované

DNA

nedosáhnou

hodnot

RFU 30 do 28. cyklu, je nutné považovat za nespecifické, tedy zkřížené reakce či negativní kontroly (Obr. 25). Tyto výše definované hodnoty jsou použitelné pouze pro amplifikaci DNA ,,druhově specifickými primery B“. Pro ,,druhově specifické primery A“ nebyla statistická analýza provedena, protože se zkřížené, nespecifické reakce za použití těchto primerů vyskytovaly dříve (již od 24. cyklu), než zkřížené reakce s ,,druhově specifickými primery B“, z tohoto důvodu byly ve většině pokusů využívány už jen ,,druhově specifické primery B“.

57    

Tab. 13: Hraniční hodnoty RFU v konkrétním cyklu qPCR sloužící k odlišení specificky amplifikované DNA od zkřížených, nespecifických reakcí a negativních kontrol. Zvýrazněna je optimální hodnota RFU/počet cyklů, která je ve výsledcích brána jako hraniční. Hodnota  RFU  

Číslo  cyklu  Real-­‐time  PCR   s  počínajícím  výskytem  zkřížených   reakcí    

Číslo  cyklu  Real-­‐time  PCR   s  počínajícím  výskytem  negativních   kontrol    

20  

26.64 - 47.64

33.64 - 49.64

30  

27.64  -­‐  48.64  

34.64 - 49.64

40  

27.64 - 49.64

34.64  -­‐  49.64  

50  

27.64  -­‐  49.64  

35.64 - 49.64

70  

28.64 - 49.64

35.64 - 49.64

90  

28.64 - 49.64

36.64 - 49.64

100  

28.64 - 49.64

36.64 - 49.64

120  

29.64 - 49.64

36.64 - 49.64

Obr. 25: Real time PCR s hraničními hodnotami RFU/počet cyklů spolehlivě odlišující specifické reakce (červené křivky) od zkřížených, nespecifických reakcí (žluté křivky). Červeně; specificky amplifikovaná DNA F. magna , F. hepatica , P. cervi a D. dendriticum , žlutě; zkřížené, nespecifické reakce, světle modře; negativní kontroly.  

 

30     28  

58    

6.4.2 Analýza průběhu teploty tání DNA: V případě, že necháme qPCR pokračovat i za 28. cyklem za daného rozvržení pokusu a při daném nastavení stroje, tak pomocí diskriminačních analýz průběhu křivek tání DNA pak není možné odlišit jednotlivé druhy motolic, tj. DNA amplifikovanou specificky, od DNA amplifikované nespecificky, protože např. v 50. cyklu qPCR téměř všechny křivky amplifikace dosahují maximálních hodnot. Na druhou stranu, pokud analýzu teplot tání provedeme dle statistické analýzy výše, tj. před 28. cyklem, je možné na základě nejvyšších hodnot RFU měřených v průběhu rozpadu DNA amplikonu jednotlivé druhy motolic odlišit. Dle výsledků analýzy je rovněž možné odlišit specificky amplifikovanou DNA jednotlivých motolic a zkřížené, nespecifické reakce od negativních kontrol (Obr. 26 a 27). Obr. 26: Zobrazení průběhu tání DNA. Červeně; specificky amplifikovaná DNA F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum, žlutě; zkřížené, nespecifické reakce, světle modře; negativní kontroly.  

59    

Obr. 27: Zobrazení průběhu tání DNA po derivaci. Červeně; specificky amplifikovaná DNA F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum, žlutě; zkřížené, nespecifické reakce, světle modře; negativní kontroly.  

A)

Na základě analýzy základních dat - hodnot RFU a teplot, při nichž začíná a končí

rozpad DNA, byly jednotlivé křivky DNA rozřazeny do skupin reprezentujících konkrétní druhy motolic (Tab. 14). Správně bylo přiřazeno pouze 73 % vzorků, a proto tedy není možné tímto způsobem rozlišit specificky amplifikované DNA úseky, zkřížené, nespecificky probíhající reakce ani negativní kontroly

60    

Tab. 14: Zobrazení výsledků přiřazení vzorků do skupin dle statistické analýzy – analýza základních dat. Zvýrazněn je počet vzorků, který byl analýzou přiřazen do správné skupiny. Členění do skupin dle výsledků statistické analýzy

Členění  do  skupin   před  statistickou   Zkřížené Negativní analýzou   reakce kontroly (počet  vzorků)   Zkřížené reakce (72) Negativní kontroly (24) F. magna (6) F. hepatica (6) P. cervi (6) D. dendriticum (6)

B)

F. magna

F. hepatica

P. cervi

D. dendriticum

15

4

15

5

15

18

0

19

3

1

1

0

1

0

3

1

0

1

0

0

0

6

0

0

1

0

0

1

3

1

0

0

0

1

2

3

Na základě detailní analýzy průběhu tání DNA celých křivek (definovaných

hodnotami RFU) při teplotách od 77 do 87 °C není možné odlišit křivky reprezentující specificky amplifikované úseky DNA od křivek reprezentujících zkřížené, nespecifické reakce, ale je možné je odlišit od křivek zaznamenaných u negativních kontrol (Tab. 15). Na základě analýzy bylo správně přiřazeno 47 % všech analyzovaných vzorků. Tab. 15: Zobrazení výsledků přiřazení vzorků do skupin dle statistické analýzy – analýza průběhu křivek tání DNA. Zvýrazněn je počet vzorků, který byl analýzou přiřazen do správné skupiny. Členění do skupin dle výsledků statistické analýzy

Členění  do  skupin   před  statistickou   Zkřížené Negativní analýzou   reakce kontroly (počet  vzorků)   Zkřížené reakce (72) Negativní kontroly (24) F. magna (6) F. hepatica (6) P. cervi (6) D. dendriticum (6)

F. magna

F. hepatica

P. cervi

D. dendriticum

13

8

18

11

11

11

0

24

0

0

0

0

0

1

5

0

0

0

0

1

0

5

0

0

0

0

0

0

5

1

0

0

0

1

0

5

61    

C)

Na základě detailní analýzy průběhu tání DNA celých křivek (definovaných

hodnotami RFU) v intervalu teplot 77 do 87 °C a RFU hodnot těchto křivek po derivaci, a dále na základě teplot, při kterých začíná a končí rozpad dvouvláknové DNA, není možné odlišit křivky specificky amplifikovaných úseků DNA od křivek reprezentujících zkřížené, nespecifické reakce, ale je možné je odlišit od křivek zaznamenaných u negativních kontrol (v analýze byla špatně přiřazena jen jedna negativní kontrola, a to do skupiny zkřížených reakcí) (Tab. 16). Na základě analýzy bylo správně přiřazeno 70 % všech analyzovaných vzorků, specificky amplifikovaná DNA však byla rozpoznána v menším počtu případů než v analýze B. Tab. 16: : Zobrazení skupin vzorků a jejich přiřazení do skupin na základě diskriminační analýzy. Zvýrazněn je počet vzorků, který byl analýzou přiřazen do správné skupiny. Členění do skupin dle výsledků statistické analýzy

Členění  do  skupin   před  statistickou   Zkřížené Negativní analýzou   reakce kontroly (počet  vzorků)   Zkřížené reakce (72) Negativní kontroly (24) F. magna (6) F. hepatica (6) P. cervi (6) D. dendriticum (6)

F. magna

F. hepatica

P. cervi

D. dendriticum

49

8

4

5

3

3

1

23

0

0

0

0

5

0

1

0

0

0

3

0

0

3

0

0

1

0

0

0

5

0

3

0

0

0

0

3

D) Z hodnot naměřených teplot, při kterých byla zaznamenána nejvyšší hodnota RFU v průběhu analýzy tání DNA amplikonů jednotlivých motolic, byl vypočten průměr (Tab. 17). Vzhledem k tomu, že průměrná teplota tání DNA F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum se liší jen o 1°C a rozptyl teplot tání D. dendriticum se částečně překrývá s rozptylem teplot tání F. hepatica a P. cervi, nelze zcela spolehlivě tyto druhy rozlišit. Pokud z analýzy vyloučíme motolici D. dendriticum, rozlišení F. magna, F. hepatica

62    

a P. cervi, rozptyly teplot tání F. magna, F. hepatica a P. cervi se již nepřekrývají a rozlišení je možné (Obr. 28). Tab. 17: Průměrná teplota tání DNA jednotlivých motolic.  

Průměrná  teplota  tání  DNA     při  maximálních  hodnotách  RFU  

Rozptyl  naměřených  teplot   tání  DNA  

F. magna

79  °C    

79  -­‐  80  °C  

F. hepatica

82  °C  

81,5  -­‐  83  °C  

P. cervi

84  °C  

83,5  –  84,5  °C  

D. dendriticum

83  °C  

82,5  –  83,5  

Obr. 28: Rozlišení DNA F. magna, F. hepatica a P. cervi na základě teploty tání při maximální hodnotě RFU. Červeně; DNA F. magna, modře; DNA F. hepatica, zeleně; DNA P. cervi, oranžově; D. dendriticum.  

79  

63    

82   83   84  

6.5 Detekční limit molekulární metody Z provedených pokusů a analýz vyplývá, že molekulární metody umožňují, za dodržení výše uvedených parametrů experimentu, detekovat v určitých případech už 1 a spolehlivě 5 vajíček F. magna, jejichž DNA byla izolována z 1 ml sedimentu trusu (Tab. 18). Detekční limit se tedy nachází pravděpodobně mezi 1 a 5 vajíčky. Tab. 18: Detekční limit molekulárních metod. Zvýrazněny jsou vzorky, ve kterých byla zaznamenána parazitární DNA.

Počet  vajíček  přidaných  do   1  ml  sedimentu  trusu   Molekulární  analýza  

Průkaz  parazitární  DNA  z  vajíček  v  trusu    

1  

ANO  

ANO  

NE  

NE  

NE  

5  

ANO  

ANO  

ANO  

NE  

ANO  

50  

ANO  

ANO  

ANO  

ANO  

ANO  

6.6 Srovnání mikroskopické a molekulární analýzy koprologických vzorků Při mikroskopickém vyšetření zpracovaných vzorků byl v sedimentu trusu podle očekávání zaznamenán menší počet vajíček, než kolik jich bylo do vzorku trusu přidáno (Tab. 19). Molekulární analýzou byla proto potvrzena přítomnost parazitární DNA pouze v sedimentu vzorků trusu zpracovaných sedimentační metodou a zkumavkami Parasep®, do kterých bylo před zpracováním přidáno 50 vajíček F. magna (Obr. 29, 30). Ve vzorcích s 1 a 5 vajíčky nebyla parazitární DNA detekována, a to pravděpodobně proto, že v odebrané části sedimentu použité pro molekulární analýzu nebyla vajíčka žádná, nebo jich bylo méně než 5 (ztráta vajíček při zpracování vzorků), což je blízko na hranici detekčního limitu molekulární metody. Počet vajíček zaznamenaný při mikroskopickém vyšetření vzorků zpracovaných metodou sedimentační a modifikovanou metodou se zkumavkami Parasep® přibližně odpovídá počtu vajíček zaznamenaných molekulárními metodami, proto by se dalo říci, že při zvolení správné metody zpracování vzorků trusu je mikroskopické a molekulární vyšetření srovnatelné v souvislosti s počtem vajíček, na základě mikroskopického nálezu však není možné rozlišit vajíčka F. magna, F. hepatica a P. cervi, a proto je použití molekulární metod vhodnější a přínosnější.

64    

Tab. 19: Počet vajíček zaznamenaných při mikroskopickém a molekulárním vyšetření sedimentu trusu. Zvýrazněny jsou vzorky, ve kterých byla zaznamenána parazitární DNA. Metoda zpracování vzorků trusu

1

0

Průkaz parazitární DNA z vajíček v trusu NE

1

0

NE

5

1

NE

5

0

NE

50

5

ANO

50

7

ANO

1

0

NE

1

0

NE

5

0

NE

5

2

NE

50

8

ANO

50

4

ANO

Počet vajíček Počet vajíček zachycených přidaných do 1 g trusu při mikroskopickém vyšetření

Sedimentační metoda

Parasep® s vodou

Obr. 29: DNA amplifikována s použitím „druhově specifických primerů B“ v kombinaci se sedimentační metodou, Ta 63 °C. Zobrazení DNA pomocí agarózové DNA elektroforézy (3% agarózový gel obarvený SYBR® Green I). Vzorky trusu byly zpracované sedimentační metodou. M; marker, 1 - 2; DNA izolovaná z trusu s 50 vajíčky F. magna, 3 - 4; DNA izolovaná z trusu s 5 vajíčky F. magna, 5 - 6; DNA izolovaná z trusu s 1 vajíčkem F. magna, 7; pozitivní kontrola – DNA F. magna o velikosti 89 bp, 8; negativní kontrola. M

1

2

3

4

5

bp

200 100

.

65    

6

7

8  

Obr. 30: DNA amplifikována s použitím „druhově specifických primerů B“ v kombinaci s metodou Parasep®, Ta 63 °C. Zobrazení DNA pomocí agarózové DNA elektroforézy (3% agarózový gel obarvený SYBR® Green I). Vzorky trusu byly zpracovány za použití koncentračních zkumavek Parasep®. M; marker, 1 - 2; DNA izolovaná z trusu s 50 vajíčky F. magna, 3 - 4; DNA izolovaná z trusu s 5 vajíčky F. magna, 5 - 6; DNA izolovaná z trusu s 1 vajíčkem F. magna.                                                                        M

1

2

3

4

5

6

bp

200 100

 

6.7 Případové studie Vyvinuté metody izolace DNA z vajíček motolic v trusu a amplifikace této DNA s využitím PCR a qPCR byly ověřovány v několika případových studiích 6.7.1 Případová studie 1 Vzorky trusu oborově chovaných bílých jelenů Při mikroskopickém vyšetření byla nalezena vajíčka motolic ve 4 z 15 vzorků trusu. Výsledek molekulární analýzy potvrdil nákazu jelenů motolicí F. magna (Obr. 31), DNA F. hepatica zaznamenána nebyla. Molekulární analýza potvrdila přítomnost parazitární DNA v 7 z 15 vzorků trusu. Vzorky, ve kterých byla nalezena vajíčka motolic při mikroskopickém vyšetření, korespondovaly se vzorky, v nichž byla parazitární DNA potvrzena molekulárně.

66    

Obr. 31: DNA amplifikovaná ,,druhově specifickými primery A“ pro F. magna, Ta 55°C. Zobrazení DNA pomocí gelové DNA elektroforézy (1% agarózový gel obarvený SYBR® Green I). M; marker, 1 - 15; vzorky trusu, ze kterých byla izolována DNA. Šipkami jsou označeny vzorky, ve kterých byla prokázána DNA F. magna o velikosti 152 bp. M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12 13

14

15

6.7.2 Případová studie 2 Vzorek trusu telemetricky monitorovaného jelena Při mikroskopickém vyšetření nebyla ve vzorku nalezena žádná vajíčka motolic. Molekulární analýza DNA vzorku trusu za použití ,,druhově specifických primerů B“ také neprokázala přítomnost DNA motolic (Obr. 32). Obr. 32: Výsledek PCR s ,,druhově specifickými primery B“. Zobrazení výsledku gelové DNA elektroforézy (1% agarózový gel obarvený SYBR® Green I) M; marker, 1 - 4; PCR s druhově specifickými primery F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum neprokázala přítomnost DNA motolic v trusu. M; vlastní marker připravený z DNA dospělých motolic, 5 - 8; pozitivní kontroly (5 – DNA F. magna, 6 – DNA F. hepatica, 7 – DNA D. dendriticum, 8 – DNA P. cervi). M 1 2 3 4 M 5 6 7 8  

67    

6.7.3 Případová studie 3 Vyšetření zubrů v karanténní oboře Při mikroskopickém vyšetření trusu pěti zubrů byla v některých vzorcích nalezena vajíčka motolic pravděpodobně F. magna, F. hepatica či P. cervi (Obr. 33). Obr. 33: Vajíčko motolice nalezené při mikroskopickém vyšetření vzorku trusu zubrů (zvětšení 400x).

100 µm

Za účelem druhové determinace vajíček byla provedena molekulární analýza. Z výsledků vyplývá, že ve vzorcích trusu se nalézají vajíčka F. hepatica i P. cervi (Obr. 34 - 36). Obr. 34: DNA z trusu zubrů amplifikovaná ,,druhově specifickými primery B“, Ta 63 °C. Zobrazení výsledku gelové DNA elektroforézy (3% agarózový gel obarvený SYBR® Green I). M; vlastní marker, 1 - 3; negativní kontroly, 4 - 6; DNA izolovaná z vajíček v trusu zubra 1 (4 – primery F. magna, 5 – primery F. hepatica, 6 – primery P. cervi), 7 - 9; DNA izolovaná z vajíček v trusu zubra 2 (7 – primery F. magna, 8 – primery F. hepatica, 9 – primery P. cervi), 10 - 12; pozitivní kontroly (10 - DNA F. magna, 11 – DNA F. hepatica, 12 – DNA P. cervi). Šipky označují druhově specifickou DNA, která byla prokázána v trusu zubrů. 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

M

 

68    

Obr. 35: DNA izolovaná z trusu zubrů amplifikovaná s využitím univerzálních primerů, Ta 63 °C. Červeně; pozitivní kontroly - DNA F. magna , F. hepatica , P. cervi a D. dendriticum , zeleně; DNA izolovaná z trusu zubra 1 - v trusu se podařilo prokázat DNA motolic (šipka), světle modře; negativní kontroly.

 

30   28   Obr. 36: DNA izolovaná z trusu zubrů amplifikovaná ,,druhově specifickými primery B“, Ta 63  °C. Červeně; pozitivní kontroly - DNA F. magna , F. hepatica , P. cervi a D. dendriticum , zeleně; DNA izolovaná z trusu zubra 1 amplifikována primery F. hepatica (šipka), modře; DNA izolovaná z trusu zubra 1 amplifikovaná primery pro P. cervi (šipka), žlutě; zkřížené, nespecifické reakce DNA z trusu zubra 1 s primery pro F. magna a D. dendriticum, světle modře; negativní kontroly.

 

30   28   69    

6.7.4 Případová studie 4 Vzorky trusu z pastevních chovů hospodářských zvířat v NP Šumava Při mikroskopickém vyšetření vzorků trusu hospodářských zvířat z NP Šumava byla trematodóza prokázána pouze v jednom vzorku (Tab. 20). Tab. 20: Výsledek mikroskopického vyšetření koprologických vzorků. Zvýrazněn je vzorek, ve kterém byla zjištěna přítomnost vajíček motolic. Druh zvířete

Počet nalezených vajíček při mikroskopickém vyšetření

Místo sběru vzorků trusu

Ovce

Srní - údolí

-

-

-

Ovce

Volary - Planerův mlýn

-

-

-

Skot

Volary - Planerův mlýn

-

1

-

Koza

Volary - Planerův mlýn

-

-

-

Daňci

Prášily

-

-

-

Ovce

Srní - Kvilda

-

-

-

Skot

Srní - údolí

-

-

-

Skot

Volary - Želnava

-

-

-

Daňci

Blatná

-

-

-

Molekulární analýzou pozitivního vzorku bylo zjištěno, že DNA odpovídá P. cervi (Obr. 37) Obr. 37: DNA izolovaná z trusu skotu amplifikovaná ,,druhově specifickými primery B“, Ta 63 °C. Zobrazení výsledku agarózové DNA elektroforézy (3% agarózový gel obarvený SYBR® Green I). M; marker, 1 - 3; negativní kontroly, 4 - 6; DNA izolovaná z trusu skotu (4 – primery F. magna, 5 – primery P. cervi, 6 – primery F. hepatica). Šipka označuje DNA P. cervi amplifikovanou ze vzorku trusu skotu. M 1 2 3 4 5 6

bp

200 100

 

70    

6.7.5 Případová studie 5 Vzorky trusu z biofarmy v Jižních Čechách Při ohledání jater obou býků byly na jejich povrchu zjištěny pato-anatomické změny. Po disekci jater byly ve žlučovodech obou poražených býků nalezeny dospělé motolice F.  hepatica (býk č. 1 – 187 ks a býk č. 2 - 130 ks). U býka č. 1 byly v játrech nalezeny také tři fibrózní pseudocysty vyplněné tmavou tráveninou, které dohromady obsahovaly pět dospělců F. magna (2+2+1/pseudocysta). Po inkubaci živých dospělých motolic F. hepatica a F. magna v RPMI médiu byla nalezena vyloučená vajíčka, která se mikroskopicky nepodařilo determinovat. V trusu obou býků byla při mikroskopickém vyšetření také nalezena vajíčka motolic (Obr. 38). Obr. 38: Vajíčko nalezené při mikroskopickém vyšetření vzorku trusu jednoho z býků (zvětšení 200x).

Výsledky PCR i qPCR potvrdili druhové zařazení dospělců F. magna i F. hepatica nalezených v játrech (Obr. 39, 40). DNA pocházející z vajíček přítomných v trusu a z vajíček vyloučených v RPMI mediu byla podle velikosti amplikonu klasifikována jako DNA F. hepatica (Obr. 39, 41). Získaná DNA byla odeslána na sekvenaci. S využitím on-line nástroje BLAST a NCBI databáze (http://ncbi.nlm.nih.gov) byla potvrzena druhová příslušnost dospělých motolic i vajíček nalezených v trusu. Získané sekvence vykazovaly 98% - 100% shodu se sekvencemi v databázi.

71    

Obr. 39: DNA izolovaná z dospělců motolic a vajíček v trusu býků amplifikovaná „druhově specifickými primery B“, Ta 63 °C. Zobrazení výsledku agarózové DNA elektroforézy (3% agarózový gel obarvený SYBR® Green I). M; marker, 1 - 2; kontroly (1 – amplifikace DNA F. magna neproběhla z důvodu příliš vysoké koncentrace DNA v reakci, 2 – DNA F. hepatica), 3; DNA F. magna z dospělé motolice, 4; DNA F. hepatica z dospělé motolice, 5; DNA izolovaná z trusu býka 1, primery F. magna, 6; DNA izolovaná z trusu býka 1, primery F. hepatica, 7; DNA izolovaná z trusu býka 2, primery F. hepatica, 8; DNA izolovaná z trusu býka 2, primery F. magna. M

1

2

3

4

5

6

7

8

     

Obr. 40: DNA izlovaná z červů amplifikovaná „druhově specifickými primery B“ metodou qPCR, Ta 63 °C. Červeně; pozitivní kontroly - DNA F. magna , F. hepatica ; zeleně DNA izolovaná z červa F. magna nalezeného u býka 1 amplifikována primery F. magna; modře DNA izolovaná z červa F. hepatica nalezeného u býka 1 amplifikována primery F. hepatica; světle modře negativní kontroly.  

 

 

30   28   72    

Obr. 41: DNA izolovaná z trusu zubrů amplifikovaná „druhově specifickými primery B“ metodou qPCR, Ta 63 °C. Červeně; pozitivní kontroly – DNA F. magna , F. hepatica ; zeleně DNA izolovaná z trusu býka 1 a býka 2 amplifikovaná primery F. hepatica; růžově DNA izolovaná z trusu býka 1 a býka 2 amplifikována primery F. magna; světle modře negativní kontroly.  

 

   

30    

28  

73    

7. DISKUZE Jedním z hlavních cílů této diplomové práce bylo nalézt vhodné metody sběru a zpracování koprologických vzorků s vajíčky motolic (F. magna, F. hepatica, D. dendriticum, P. cervi). Jako nejspolehlivější byl podle předpokladů definován odběr trusu konkrétním jedincům,

který

je

však

snadno

proveditelný

pouze

u

stájově

chovaných

či imobilizovaných jedinců; u stádově chovaných zvířat je takový odběr možný na základě přímého pozorování, což je metoda relativně nespolehlivá a mnohdy velmi zdlouhavá. Nejlepší a nejlépe proveditelnou metodou je proto sběr směsných koprologických vzorků z lokality, na níž se vyskytuje vyšetřované stádo. Zpracované vzorky trusu je následně možné vyšetřit mikroskopicky a molekulárně se zaměřením na přítomnost vajíček motolic. Výsledky vyšetření trusu na přítomnost vajíček motolic mohou být zkresleny dynamikou počtu vajíček vylučovaných hostitelem; v případě negativního výsledku u individuálního zvířete je proto většinou vhodné vzorek znovu odebrat a vyšetření opakovat. Tento problém je možné řešit primárním vyšetřením směsného vzorku, tj. vzorků náhodně odebraných na lokalitě, kde se vyskytuje populace hostitelů a teprve poté, na základě výsledků, přikročit k vyšetření individuálnímu. Při nízké prevalenci nákazy stáda je však současně menší šance zachycení parazitózy (nálezu vajíček motolic), a to i tehdy, jsou-li nakažená zvířata infikována větším počtem motolic; při sběru směsných koprologických vzorků může dojít k situaci, že trus parazitovaných zvířat nebude sebrán, nebo budou vajíčka motolic při vyšetřování rozptýlena v takovém objemu negativního trusu, že parazitóza bude pod limitem záchytu a výsledek vyšetření bude falešně negativní. Zásadní komplikace nastává také při mikroskopickém (i molekulárním) vyšetření vzorku trusu nespecifických a netypických hostitelů, u kterých nedochází k napojení pseudocyst na žlučovody a střevo, kdy vajíčka s trusem odchází jen výjimečně (Swales 1935, 1936, Pybus 2001). Podobně omezen je i záchyt migrujících juvenilních motolic, které vajíčka ještě neprodukují (Hillyer 1999). Z výše uvedených důvodů je optimální směsné koprologické vzorky zvířat (ve stádě) sbírat a vyšetřovat opakovaně, a zároveň rozlišovat, zda vzorek trusu pochází od specifického, nespecifického či netypického hostitele. Nevýhodou mikroskopického vyšetření je poměrně vysoký detekční limit vajíček, na který má vliv samozřejmě i metoda koncentrace vajíček z koprologického vzorku (Egwang a Slocombe 1981, Arjona a kol. 1995, Lier a kol. 2009, Valero a kol. 2009). 74    

Zpracování koprologického materiálu několika různými metodami bylo prováděno za účelem nelezení metody vhodné jak pro mikroskopické vyšetření, tak pro následnou molekulární analýzu trusu s vajíčky motolic. Jako nejvhodnější bylo vyhodnoceno zpracování směsných koprologických vzorků metodou sedimentační; touto metodou se podařil zachytit vysoký počet vajíček motolic a získaný sediment bylo možné využít i pro následnou molekulární analýzu. Použití zkumavek Parasep®, které byly také testovány při zpracování koprologických vzorků je vhodné zejména při práci s potenciálně vysoce infekčním materiálem, protože kontakt se vzorkem je omezen pouze na odběr a vložení vzorku do zkumavky, přičemž dále se pak pracuje až se sedimentem obsahujícím vajíčka - homogenizace vzorku a oddělování větších částí trusu probíhá v uzavřeném systému (Saez a kol. 2011). S ohledem na potíže s mikroskopickou diferenciací vajíček F. magna, F. hepatica a P. cervi a omezené možnosti intravitální diagnostiky fasciolózy, fascioloidózy a paramphistomózy, si tato práce kladla za další z hlavních cílů definovat postup umožňující molekulární druhovou determinaci jak dospělců, tak vajíček motolic v koprologickém materiálu. Umět tyto trematodózy působené výše uvedenými druhy motolic spolehlivě determinovat má význam nejen z důvodu nasazení vhodné terapie, ale také za účelem správného monitoringu a rovněž v souvislosti se zamezením případného šíření trematodóz na nová území díky migraci a importům infikovaných zvířat. Pro potřeby determinace F. magna, F. hepatica a P. cervi a D. dendriticum byly testovány intravitální diagnostické metody - zejména PCR detekce parazitární DNA izolované z vajíček v trusu nakažených zvířat. Zpracované vzorky trusu s vajíčky byly použity pro následnou molekulární analýzu – izolaci DNA následovanou PCR či Real-time PCR. Metoda izolace parazitární DNA z koprologického materiálu a následná amplifikace této DNA se začíná řadit k rutinním diagnostickým postupům, a využití těchto metod stoupá i v diagnostice parazitárních onemocnění, včetně trematodóz (Verma 2003, Tang a kol. 2008, Cnops a kol. 2012). Na druhou stranu, spolehlivý postup izolace DNA z vajíček F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum obsažených v trusu dosud vyvinut nebyl. Zatímco DNA z dospělých motolic je možné izolovat dle manuálů komerčně dostupných kitů (Kráľová-Hromadová a kol. 2008, Baszalovicsová a kol. 2010), izolaci DNA z vajíček motolic přítomných v koprologickém materiálu omezuje odolná vaječná stěna, kterou je před započetím izolace nutné rozrušit, dále izolaci komplikuje i přítomnost různých solí a polyfenolických látek obsažených v koprologických vzorcích, 75    

které mohou interferovat s následnou PCR (Deuter a kol. 1995, Verma a kol. 2003, Oberhauserová a kol. 2010). Cílem mé experimentální práce bylo testovat právě různé metody izolace DNA za účelem nalezení takových podmínek izolace, kdy dojde k rozrušení stěny vajíček ve směsném koprologickém vzorku, a koncentrace i čistota získané

DNA

bude

dostačující

pro

následné

molekulární

analýzy.

Navržená

a optimalizovaná metoda izolace DNA z vajíček motolic přítomných v koprologickém materiálu a následná amplifikace ITS2 regionu ,,druhově specifickými primery B“ zaručuje snadnou, rychlou a přesnou diagnostiku F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum. Přesnost molekulární diagnostiky však nesouvisí pouze s optimálním postupem izolace DNA, ale také s volbou úseku DNA vhodného pro amplifikaci, a také s návrhem vhodných primerů (Ta, délka amplifikovaného úseku apod.) (Innis a Gelfand 1990). Na základě variability nukleotidové sekvence části ITS2 regionu rDNA F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum byly navrženy degenerované univerzální primery tak, aby bylo pomocí jediné dvojice primerů možné zároveň amplifikovat DNA některé z motolic (F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum) vyskytující se ve vzorku. Takovými primery je tedy možné detekovat trematodózu v jediné reakci, a až na základě pozitivního výsledku přikročit k použití specifických primerů nasedajících specificky na DNA jednotlivých druhů. Navržené univerzální degenerované primery se osvědčily jak v experimentech s klasickou PCR, tak zejména s qPCR. Pokud bylo v reakci degenerovanými primery dosaženo pozitivních výsledků, bylo možné přistoupit k následující selektivní PCR/qPCR s druhově specifickými primery. V rámci této práce byla tedy ověřena použitelnost ,,druhově specifických primerů A“ nasedajících na část ITS2 regionu rDNA (Kráľová-Hromadová a kol. 2008, Bazsalovicsová a kol. 2010), a zároveň byly navrženy originální ,,druhově specifické primery B“, které nasedají na úseky ITS2 regionů rDNA velikostně se lišící u jednotlivých druhů motolic (pravidelný rozdíl 30bp). Amplifikace velikostně pravidelně přesně odlišných úseků amplifikované DNA u jednotlivých motolic (30 bp) umožňuje snadnější odečet výsledku PCR z gelové elektroforézy (Nolan a kol. 2007). Pokud je ve vzorku DNA více druhů motolic (F. magna, F. hepatica, P. cervi i D. dendriticum), je možné v PCR se specifickými primery amplifikovat druhově příslušnou DNA všech ve vzorku přítomných motolic v jediné reakci, a díky rozdílným velikostem amplikonů tuto DNA rozlišit (na 3% agarózovém gelu). Při použití 1% agarózového gelu nedochází vzhledem k minimálním rozdílům ve velikostech amplikonů (30 bp) k tak výrazné separaci DNA. 76    

Během příprav PCR reakce je nezbytné dbát na čistotu prostředí za účelem vyvarování se kontaminace vzorků cizorodou DNA. Veškerá příprava PCR a qPCR byla proto prováděna sterilně ve flowboxu, který byl vždy před zahájením práce vystaven UV záření (Fox a kol. 1991). Pokud byly PCR reakce připravovány bez využití flowboxu, tak byly zaznamenávány vysoké frekvence kontaminací. Výsledky reakcí připravených mimo flowbox však nejsou v této práci prezentovány. Další optimalizací PCR podmínek lze významně zvýšit spolehlivost získaných výsledků. Za tímto účelem byly testovány různé podmínky amplifikace DNA, při nichž dochází k omezenému výskytu zkřížených, nespecifických reakcí primerů s DNA jiných druhů motolic, než pro které byl primer navržen. Zkřížené, nespecifické reakce jsou závislé především na teplotě nasedání primerů. Obecně platí, že čím nižší Ta, tím méně specificky primer nasedá (Innis a Gelfand 1990). Proto i teplota nasedání primerů byla experimentálně

prověřována

s využitím

gradientové

PCR

(testovány

byly

Ta 55 °C - 67 °C, vždy po 1 °C). Pokud byla zvolena Ta příliš nízká (např. 60 °C), docházelo k nespecifickému nasedání primerů a ke zkříženým, nespecifickým reakcím. Naopak při vyšší Ta (65 °C) se dařila amplifikovat pouze DNA z dospělých motolic, DNA z vajíček v koprologickém materiálu amplifikována nebyla. Optimální se nakonec ukázala být Ta 63 °C, při které se metodou PCR i qPCR dařila amplifikovat DNA z dospělců, larválních stádií i vajíček motolic v trusu. Na základě důkladné optimalizace molekulárních metod jsem s využitím PCR a qPCR schopná provádět úspěšnou amplifikaci už pouhého jednoho vajíčka v analyzovaném vzorku trusu (1 g), přičemž spolehlivý detekční limit se pohybuje mezi jedním až pěti vajíčky. Toto odpovídá zjištění prezentované např. v článku Intapan a kol. 2005, kdy bylo detekováno 5 a méně vajíček Paragonimus heterotremus v 0,6 g trusu. Bezprostředně po qPCR byla prováděna analýza teploty tání amplifikované DNA, při které byly získané amplikony zahřívány z 60 °C až na 95 °C, a zároveň byl měřen pokles RFU v příslušené teplotě. Po skončení reakce byla odečtena tzv. křivka tání DNA. Výsledky qPCR a analýzy teploty tání byly statisticky zhodnoceny mnohorozměrnou diskriminační analýzou. Na základě qPCR a analýzy teploty tání je možné druhově rozlišit např. oocysty Cryptosporidium parvum, Toxoplasma gondii, Cyclospora cayetanensis, Eimeria, Sarcocystis, Isospora (Lalonde a Gajadhar 2011). Vzhledem k tomu, že výsledky qPCR a analýzy teploty tání DNA amplikonů byly podrobeny statistické analýze, bylo možné empiricky definovat rozhodovací pravidla, 77    

na jejichž základě je možné rozlišit specificky amplifikovanou DNA F. magna, F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum od zkřížených, nespecifických reakcí a negativních kontrol. Byly tedy nalezeny optimální hodnoty RFU v konkrétních cyklech reakce (např. hodnota RFU 30 ve 28. cyklu), při kterých je možné spolehlivě určit druh motolice a pro potvrzení této determinace ještě provést analýzu teploty tání amplifikované DNA. Na základě průměrné teploty tání DNA jsou rozlišovány např. paraziti Dirofilaria immitis a D. repens v práci Latrofa a kol. 2012. V práci Radvánský a kol. 2011 byly na základě teploty tání DNA F. magna rozlišeny dokonce jednotlivé haplotypy. Pro jednotlivé druhy motolic byla zjištěna průměrná teplota tání DNA - F. magna 79 °C, F. hepatica 82 °C, P. cervi 84 °C a D. dendriticum 83 °C. Vzhledem k tomu, že průměrná teplota tání DNA F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum se liší jen o 1 °C, a rozptyl teploty tání D. dendriticum se částečně překrývá s rozptyly teplot tání F. hepatica a P. cervi, není možné tyto motolice na základě analýzy teploty tání DNA, za hypotetického předpokladu přítomnosti DNA věch těchto motolic ve vzorku, spolehlivě odlišit. Pokud však vzorky prověříme nejdříve mikroskopicky a následně vynecháme primery pro amplifikaci DNA D. dendriticum, která je snadno determinovatelná od ostatních komparativních druhů motolic na základě morfologie dospělců i vajíček, je možné na základě analýzy průměrné teploty tání DNA odlišit DNA zbylých tří druhů motolic F. magna, F. hepatica a P. cervi. Z výsledků analýzy navíc vyplývá, že je možné na základě analýzy tání DNA odlišit pouze negativní kontroly od reakcí specifických a od reakcí zkřížených, nespecifických. Jako optimální řešení této situace se nabízí brát v úvahu vždy výsledky obou analýz, tj. provést analýzu tání jen u specificky amplifikované DNA, tedy u takové DNA, kde hodnoty relativní fluorescence (RFU) přesáhnou limit 30 v rozmezí 1-28 qPCR cyklu. Přínos v práci definovaných metod spočívá především v umožnění diagnostiky parazitóz u volně žijících i oborově chovaných zvířat bez nutnosti přímého kontaktu se zvířetem a jeho imobilizaci, která je potřeba u jiných intravitálních metod diagnostiky (např. zisk krevního séra) (Walter a kol. 2005, Hera a Holý 2010). Navržené molekulární přístupy mohou být prakticky využitelné a usnadnit diagnostiku, a tím i případný monitoring výskytu a šíření trematodóz. Navržené molekulární vyšetření vzorků trusu na přítomnost vajíček motolic je ideální provádět ve dvou krocích. Použitím nespecifických univerzálních primerů zjistíme, zda se ve vzorku DNA motolic nachází, a pouze v případě pozitivního výsledku tohoto 78    

prvního vyšetření provedeme vyšetření druhé, tedy amplifikaci DNA za použití ,,druhově specifických primerů B“. Jednou ze základních hypotéz řešené problematiky byl předpoklad výrazně vyšší spolehlivosti molekulárních metod v determinaci vybraných motolic než doposud rutinně prováděná mikroskopická vyšetření. Přestože z výsledků srovnání vyplývá, že detekční limit počtu vajíček je v případě volby nejvhodnější metody přibližně stejný, tak lze předpokládat, že molekulární metody budou v budoucnu stále častěji využívaným nástrojem v diagnostice parazitóz, trematodóz, jelikož analýzy tohoto typu poskytují spolehlivé informace nejen o pozitivitě či negativitě vzorku, ale také o druhové příslušnosti detekované parazitární DNA (Intapan a kol. 2005, Sweeny a kol. 2011). Abychom naše předpoklady o využitelnosti molekulárních metod ověřili, testovala jsem je v rámci případových studií na několika souborech vzorků trusu pocházejících z několika druhů zvířat z pěti lokalit České republiky. V případové studii č. 1 byl vyšetřován trus oborově chovaných jelenů. Při mikroskopickém vyšetření byla nalezena vajíčka motolic ve 4 z 15 vzorků trusu, která nebylo možné na základě morfologické stavby druhově specifikovat. Výsledek molekulární analýzy však potvrdil nákazu jelenů motolicí F. magna v 7 z 15 vzorků trusu, což jen naznačuje vyšší citlivost této metody. V případové studii č. 2 byl vyšetřovaný trus jelena monitorovaného v rámci projektu NP Šumava negativní. V rámci tohoto projektu by bylo zajímavé vyšetřit i další monitorované jelenovité, a pokusit se zhodnotit význam trematodóz (v této oblasti pravděpodobně fascioloidózy, kde prevalence nákazy F. magna dosahuje místy až 95 % Novobilský a kol. 2007b) v souvislosti s dalšími měřenými parametry jako je např. denní aktivita zvířete apod. Molekulární determinace vajíček motolic nalezených v trusu zubrů (případová studie č. 3) byla a doposud je jednou z nejzajímavějších studií, na kterých jsem se v rámci řešení diplomové práce podílela. S ohledem na plánované vypuštění importovaných zubrů z karanténní obory bylo nezbytné zvířata důkladně parazitologicky vyšetřit (což bohužel nebylo realizováno ještě před importem). Osobně jsem se v této souvislosti podílela na druhové determinaci trematodóz, přičemž ve vyšetřovaných vzorcích trusu byla prokázána koinfekce dvou motolic – P. cervi a F. hepatica. Na základě výsledků vyšetření pak byla zvířata v období cca jednoho roku léčena a opakovaně vyšetřována, a nakonec v dubnu 2012 vypuštěna. Pokud by však byla do volného prostředí vypuštěna zvířata 79    

infikovaná, hrozila by diseminace vajíček motolic do prostředí, a případně i na místa s chovy hospodářských zvířat trematodóz prostá. Stále nedořešenou otázkou zůstává, zda se náhodou v karanténní oboře nerozběhl cyklus F. hepatica, protože v lokalitě se nachází četná prameniště s mezihostitelskými plži (G. truncatula, mezihostitelé P. cervi nebyli objeveni). Pro ověření této teorie bylo do karanténní obory koncem dubna 2012 vypuštěno stádo 7 ovcí, které jsou k nákaze F. hepatica vnímavé. Trus těchto ovcí je stále pravidelně sbírán a vyšetřován, vajíčka motolic v něm však zatím nalezena nebyla. V případové studii č. 4 byla v trusu skotu prokázána přítomnost DNA P. cervi. DNA F. magna prokázána nebyla, současnou koinfekci F. magna však není možné vyloučit, jelikož

u nespecifických definitivních hostitelů, mezi které je skot řazen, nedochází

k napojení pseudocyst s parazity na žlučové kanálky a střevo, vajíčka F. magna tedy nejsou trusem vylučována (Swales 1935, 1936, Pybus 2001). Zvýšený počet úhynů hospodářských zvířat (nespecifických a netypických definitivních hostitelů) v těchto oblastech z důvodu infekce F. magna by byl možný prokázat pitvou uhynulých jedinců s přímým nálezem F. magna nebo některou z nepřímých intravitálních diagnostických metod (např. sérologicky), které však nebyly provedeny (Pybus 2001, Beránková 2011, diplomová práce). Z vlastních šetření mezi tamními hospodáři víme, že k úhynům hospodářských zvířat v řadě chovů skutečně dochází, ovšem přímou spojitost s trematodózami se prozatím nepodařilo prokázat. Nález F. magna u býka z biofarmy v Jižních Čechách (případová studie č. 5) potvrzuje výskyt fascioloidózy u skotu na našem území, kdy byl poslední podobný případ publikovaný před 32 lety (Chroustová a kol. 1980). Průkaz pouze vajíček F. hepatica v trusu býka 2 odpovídá již zmiňovanému faktu, že vajíčka F. magna se z pseudocyst nedostávají u nespecifických definitivních hostitelů do střeva hostitele, a nejsou tedy vylučována. Eradikace fasciolózy a fascioloidózy je v oblasti umístění biofarmy poměrně komplikovaná, v tomto případě nestačí nakažená zvířata pouze léčit, ale je potřeba provést i úpravy na pastvině samotné. Pastvina biofarmy, z níž pocházeli infikovaní býci, totiž splňuje všechny předpoklady pro průběh kompletního životního cyklu fasciolidních motolic. V prostředí areálu biofarmy se nachází vlhké biotopy optimální pro plže G. truncatula, ke kterým mají chovaná zvířata volný přístup. Na pastevní plochy mají přístup také volně žijící zvířata, v jejichž trusu byla potvrzena přítomnost vajíček F. magna. Řešení by mělo být tedy komplexní, a mělo by zahrnovat několik opatření vyúsťujících zejména v přerušení životního cyklu parazita, tzn. zamezit kontaktu 80    

hospodářských zvířat s přirozenými zdroji vody kontaminovanými vývojovými stadii motolic (posun ohradníků směrem od vlhkých míst), omezení výskytu populací mezihostitelských plžů (meliorace, drenážování), a znemožnění vstupu volně žijících zvířat na pastevní plochy (zvýšení ohradníků) (Siegelová a kol. 2012, Leontovyč a kol. 2012). Přestože F. magna působí v populacích volně žijící zvěře značné škody, a hospodářská zvířata jsou v potenciálním ohrožení, je problematice diagnostiky fascioloidózy (a jejího odlišení od jiných trematodóz)

ze strany příslušných úřadů v České republice prozatím

věnována nedostatečná pozornost. Tato situace by se mohla změnit právě i v důsledku vyvinutí spolehlivých molekulárně diagnostických metod, které jsou v této práci prezentovány.

81    

8. ZÁVĚR Tato práce se zabývá molekulární diagnostikou F. magna a jejího odlišení od některých dalších druhů motolic (F. hepatica, P. cervi a D. dendriticum), a to především na základě vajíček v trusu specifických definitivních hostitelů.

•

Byla nalezena metoda sběru a zpracování koprologických vzorků vhodná pro mikroskopické vyšetření i molekulární analýzu.

•

Podařilo se nalézt metodu izolace DNA z koncentrovaných vajíček motolic a z vajíček obsažených ve vzorcích trusu.

•

Pro amplifikaci DNA byly navrženy univerzální degenerované primery, kterými je možné prokázat trematodózu, dále byly navrženy ,,druhově specifické primery B“ umožňující diferencovat DNA F. magna od DNA dalších druhů motolic. DNA byla amplifikována metodami PCR a qPCR.

•

Byla srovnána využitelnost (výhody a omezení) mikroskopického vyšetření a molekulární analýzy v diagnostice trematodóz. Počet zachycených vajíček je při mikroskopickém a molekulárním vyšetření srovnatelný, molekulární analýza však umožňuje navíc vajíčka druhově determinovat.

•

Vyvinuté metody

molekulární diagnostiky F. magna a komparativních druhů

motolic byly ověřeny v praxi v několika případových studiích.

82    

Publikované texty vniklé v souvislosti s řešením diplomové práce: V impaktovaných časopisech: Kašný M., Beran L., Siegelová V., Siegel T., Leontovyč R. (2012): Geographical distribution of the giant liver fluke (Fascioloides magna) in the Czech Republic and potential risk of its further spread. Veterinarni  Medicina  57,  2012  (2),  101–109. V neimpaktovaných časopisech: Kašný M., Siegelová V., Siegel T., Beránková K. (2010): Aktuální rozšiření motolice velké (Fascioloides magna) v České republice, Myslivost 10/2010, str. 58. Leontovyč R., Pankrác J., Siegelová V., Kašný M. (2012): Motolice obrovská v chovu daňka evropského, Svět myslivosti 05/2012, 22-23. Siegelová V., Pankrác J., Košťáková M., Melounová K., Siegel T., Leontovyč R., Kašný M. (2012): Nález motolice obrovské u skotu a odhad možných rizik fascioloidózy v České republice, Veterinářství 07/2012, 438-441.

83    

9. SEZNAM LITERATURY Ai L., Li C., Elsheikha H. M., Hong S. J., Chen J. X., Chen S. H., Li X., Cai Q. X, Chen M. X., Zhu Q. X. (2010): Veterinary Parasitology 174, 228–233. Adlar R. D., Barker S. C., Blair D., Cribb T. H. (1993): Comparison of the second internal transcribed spacer (ribosomal DNA) from populations and species of Fasciolidae (Digenea). International Journal for Parasitology 23, 423–425. Alberts B., Bray D., Johnson A., Lewis J., Raff M., Robert K., Walter P. (1998): Základy buněčné biologie, Gerland Pulishing, 313-346. Alasaad S., Huang C. Q., Li Q. Y., Grandos J. E., García-Romero C., Pérez J. M., Zhu X. Q. (2007): Characterization of Fasciola samples from different host species and geographical localities in Spain by sequence of internal transcribed spacer of rDNA. Parasitology Research 101, 1245-1250. Alasaad S., Soriguer R. C., Abu-Madi M., El Behairy A., Jowers M. J., Baños P. D., Píriz A., Fickel J., Zhu X. Q. (2011): A TaqMan real-time PCR-based assay for the identification of Fasciola spp. Veterinary Parasitology 179 (1-3), 266-71. Anh N. T., Phuong N. T., Ha G. H., Thu L. T., Johansen M. V., Murrell D. K., Thamsborg S. M. (2008): Evaluation of techniques for detection of small trematode eggs in faeces of domestic animals. Veterinary Parasitology 156, 346-349. Arjona, R., Riancho, J. A., Aguado, J. M., Salesa, R., Gonzalez-Macias, J. (1995): Fascioliasis in developed countries: a review of classic and aberrant forms of the disease. Medicine (Baltimore) 74, 13–23. Bazsalovicsová E., Kráľová-Hromadová I., Špakulová M., Reblánová M., Oberhauserová K. (2010): Determination of ribosomal internal transcribed spacer 2 (ITS2) interspecific markers in Fasciola hepatica, Fascioloides magna, Dicrocoelium dendriticum and Paramphistomum cervi (Trematoda), parasites of wild and domestic ruminants. Helminthologia 47, 76-82. Bauer B. U., Pomroy W. E., Gueydon J., Gannac S., Scott I., Pfister K. (2010): Comparison of the FLOTAC technique with the McMaster method and the Baermann technique to determine counts of Dictyocaulus eckerti L1 and strongylid eggs in faeces of red deer (Cervus elaphus). Parasitology Research, 107(3), 555-60. Barker S. C., Blair D., Garrett A. R., Cribb T. H. (1993): Utility of D1 domain of nuclear 28S r RNA for phylogenetic inference in the Digenea. Systematic Parasitology 26, 181-188. Beaver P. C., Jung R. C., Cupp E. W. (1984): Amphistomate and Distomate Flukes. In: Clinical Parasitology. (Beaver P. C., Jung R. C., Cupp E. W., eds.) 9th edn. Lea & Febiger, Philadelphia, 451-454. 84    

Benson D. A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D. J., Ostell J., Wheeler D. L. (2008): GenBank. Nucleic Acids Research 36, 25–30. Beránková K. (2011): Vlastnosti exkrečně–sekrečních proteinů motolice Fascioloides magna. Diplomová práce, Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze, 119 pp. Bildfell R. J., Whipps Ch. M., Gillin C. M., Kent M. L. (2007): DNA-based identification of a hepatic trematode in an elk calf. Journal of Wildlife Diseases 43, 762-769. Blair D. and McManus D. P. (1989): Restriction enzyme mapping of ribosomal DNA can distinguish between fasciolid (liver fluke) species. Molecular and Biochemical Parasitology 36, 201-208. Bonita R. and Taira N. (1996): Faecal examination of Fasciola eggs fixed with formalin solution using the beads technique, Veterinary Parasitology 67, 269-273. Boray J. C. (1967): Studies of experimental infections with Fasciola hepatica with particular reference to acute fascioliasis in sheep. Annals of Tropical Medicine & Parasitology 61, 439-450. Boros D. L., Warren K. S. (1970): Delayed hypersensitivity-type granuloma formation and dermal reaction induced and elicited by a soluble factor isolated from Schistosoma mansoni eggs, The Journal of Experimental Medicine 132, 488-507. Broglia A., Heidrich J., Lanfranchi P., Nöckler K., Schuster R. (2009): Experimental ELISA for diagnosis of ovine dicrocoeliosis and application in a field survey. Parasitology Research 104, 949–953. Burgu A. (1981): Studies on the biology of Paramphistomum cervi Schrank, 1790 in sheep in the district of Eskisehir Ciftelerstate farm, Faculty of Veterinary Medicine 28, 50-71. Bustin S. A., Benes V., Nolan T., Pfaffl M. W. (2005): Quantitative real-time RT-PCR – a perspective. Journal of Molecular Endocrinogy. 34, 597-60. Campbell A. Neil, Reece B. Jane (2008): Biologie, Computer Press, 1332 pp. Capuano F., Rinaldi L., Maurelli M. P., Perugini A. G., Musella V., Cringoli G. (2007): A comparison of five methods for DNA isolation from liver and rumen flukes to perform ITS-2+ amplification. Parasitologia 49, 27-31. Cengiz Z. T., Yilmaz H., Dulger A. C., Cicek M. (2010): Human infection with Dicrocoelium dendriticum in Turkey. Annals of Saudi Medicine 30, 159-161. Cnops L., Tannich E., Polman K., Clerinx J., Esbroeck M. V. (2012): Schistosoma real-time PCR as diagnostic tool for international travellers and migrants. Tropical Medicine and International Health, doi:10.1111/j.1365-3156.2012.03060.x. 85    

Cringoli G., Rinaldi L., Maurelli M. P., Utzinger J. (2010): FLOTAC: new multivalent techniques for qualitative and quantitative copromicroscopic diagnosis of parasites in animals and humans. Nature protocols 5 (3), 503-15. Demiaszkiewicz A. W., Lachowicz J., Przybysz I., Goliszewska A. (2005): Occurrence of liver trematodes in European bison in Bialowieza Forest. Parki Narodowe i Rezerwaty Przyrody 24, 131-134. Deuter R., Peitsch S., Hertel S., Muller O. (1995): A method for preparation of faecal DNA suitable for PCR. Nucleic Acids Research 23, 3800–3801. Dorchies P. (2007): Comparison of methods for the veterinary diagnosis of liver flukes (Fasciola hepatica) in cattle. Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca 64, 14-19. Dreyfuss G., Novobilský A., Vignoles P., Bellet V., Koudela B., Rondelaud D. (2007): Prevalence and intensity of infections in the lymnaeid snail Omphiscola glabra experimentally infected with Fasciola hepatica, Fascioloides magna and Paramphistomum daubneyi. Journal of Helminthology 81, 7-12. Ducháček L. and Lamka J. (2003): Dicrocoeliosis – the present state of knowledge with respect to wildlife species. Acta Veterinaria Brno 72, 613-626. Dunkel A. M., Ronglie M. C., Johnson G. R., Knapp S. E. (1996): Distribution of potential intermediate hosts for Fasciola hepatica and Fascioloides magna in Montana, USA. Veterinary Parasitology 62, 63-70. Dyachenko V., Beck E., Pantchev N., Bauer C. (2008): Cost-effective method of DNA extraction from taeniid eggs. Parasitology Research 102, 811–813. Egwang T. G., Slocombe J. O. D. (1981): Efficiency and Sensitivity of Techniques for Recovering Nematode Eggs from Bovine Feces. Canadien Journal of Comparative Medicine, 45(3), 243–248. Erhardová-Kotrlá B. (1968a): Fascioloides magna (Bassi, 1875) motolice obrovská v podmínkách ČSSR. Doktorská disertační práce, Parazitologický ústav ČSAV Praha, 190 pp. Erhardová B. (1968b): Parthenogenesis of Fascioloides magna (Bassi, 1875) under natural conditins. Folia Parasitologica 15, 233-242. Erhardová-Kotrlá B. a Blažek K. (1970): Artificial infestation caused by the fluke Fascioloides magna. Acta Veterinaria Brno 39, 287-295. Erhardová-Kotrlá B. (1971): The occurence of Fascioloides magna (Bassi, 1875) in Czechoslovakia. Prague; Academia, 155 pp.

86    

Faltýnková A., Horáčková E., Hirtová L., Novobilský A., Modrý D., Scholz T. (2006): Is Radix peregra a new intermediate host of Fascioloides magna (Trematoda) in Europe? Field and experimental evidence. Acta Parasitologica 51, 87-90. Faust E. C., D'Antoni J. S., Odom V., Miller M. J., Peres Ch., Sawitz W., Thomen L. F., Tobie J., Walker J. H. (1938): A critical study of clinical laboratory technics for the diagnosis of protozoan cysts and helminth eggs in feces. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 18, 169-183. Faust E. C., Sawitz W., Tobie J., Odom V., Peres Ch., Lincicome D. R. (1939): Comparative efficiency of various technics for the diagnosis of protozoa and helminths in feces. The Journal of Parasitology 25, 241-262 Fernandez M., Littlewood D. T., Latorre A., Raga J. A., Rollinson D. (1998): Phylogenetic relationships of the family Campulidae (Trematoda) based on the 18S rRNA sequences. Parasitology 117, 383-391. Foreyt W. J., Todd A. C. (1972): The occurrence of Fascioloides magna and Fasciola hepatica together in the livers of naturally infected cattle in south Texas, and the incidence of the flukes in cattle, white-tailed deer, and feral hogs. The Journal of Parasitology 58, 1010-1. Foreyt W. J. a Todd A. C. (1976): Development of the large American liver fluke, Fascioloides magna, in white-tailed deer, cattle, and sheep. The Journal of Parasitology 62, 26-32. Foreyt J. W., Todd C. A. (1978): Experimental infection of lymnaeid snails in Wisconsin with miracidia of Fascioloides magna and Fasciola hepatica. The Journal of Parasitology 64, 1132-1134. Foreyt W. J., Leathers C. W. (1980): Experimental infection of domestic goats with Fascioloides magna. American Journal of Veterinary Research 41, 883-4. Foreyt W. J. (1990): Domestic sheep as a rare definitive host of the large American liver fluke Fascioloides magna. The Journal of parasitology 76, 736-9 Foreyt W. J. (1996): Susceptibility of bighorn sheep (Ovis canadensis) to experimentally induced Fascioloides magna infections. Journal of Wildlife Diseases 32, 556-559. Fox J. C., Ait-Khaled M., Webster A., Emery V. C. (1991): Eliminating PCR contamination: is UV irradiation the answer? Journal of Virological Methods, 33 (3), 375-82. Galaktionov K. V. a Dobrovolskij A. A. (2003) The biology and evolution of trematodes. An essay on the biology, morphology, life cycles, transmissions, and evolution of digenetic trematodes. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. Garey J. a Wolstenholme D. (1989): Platyhelminth mitochondrial DNA: evidence for early evolutionary origin of a tRNA (serAGN) that contains a dihydrouridine arm 87    

replacement loop, and of serine-specifying AGA and AGG codons. Journal of Molecular Evolution 28, 374-387. Gundry C. N., Vandersteen J. G., Reed G. H., Pryor R. J., Chen J., Wittwer C. T. (2003): Amplicon melting analysis with labeled primers: a closed-tube method for differentiating homozygotes and heterozygotes. Clinical Chemistry 49 (3), 396-406. Harmon A. F., Zarlenga D. S., Hildreth M. B. (2006): Improved methods for isolating DNA from Ostertagia ostertagi eggs in cattle feces. Veterinary Parasitology 18, 135(3-4): 297-302. Hayes F. A., Nettles V. F., Kellog, F. E., edited by DavidsonW. R. (1981): Diseases and Parasites of White-tailed Deer, Southeastern Cooperative Wildlife Disease Study, Department of Parasitology, College of Veterinary Medicine, University of GA., Athens, GA. Heid C. A., Stevens J., Livak K. J., Williams P. M. (1996): Real time quantitative PCR. Genome Research 6, 986-994. Henriksen S. A., Aagaard K. A. (1976): A simple flotation and McMaster method. Nordisk Veterinaermedicin 28, 392-397. Hera A., Holý J. (2010): Stanovisko ÚSKVBL k používání léčiv při imobilizaci zvěře. Myslivost 04/2010. Hillis D. M. and Dixon M.T. (1991): Ribosomal DNA: Molecular evolution and phylogenetic inference. The Quarterly Review of Biology 66, 411-53. Hillyer G. V., de Galanes M. S., Rodriguez-Perez J., Bjorland J., de Lagrava S. M., Guzman R., Bryan R. T. (1992): Use of the Falcon assay screening test – enzyme – linked immunosorbent assay (FAST-ELISA) and the enzyme – linked immunoelectrotransfer blot (EITB) to determine the prevalence of humman fascioliasis in the Bolivian Altiplano. The American journal of tropical medicine and hygiene 46, 603-609. Hillyer G. V. (1999). Immunodiagnosis of human and animal fasciolosis. In: Dalton, J. P. (Ed.), Fasciolosis. CAB International Publishing, Wallingford, Oxon, 435–447. Hood B. R., Ronglie M. C., Knapp S. E. (1997): Fascioloidiasis in game-ranched elk from Montana. Journal of Wildlife Diseases 33, 882–885. Horáčková E. (2007): Biologie a výskyt larválních stádií motolice obrovské (Fascioloides magna) v České republice. Diplomová práce, Biologická fakulta Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích, 53 pp. Hoste H., Chiltonj N. B., Gassers R. B., Beveridge I. (1995): Differences in the second internal transcribed spacer (Ribosomal DNA) between five species of Trichostrongylus (Nematoda: Trichostrongylidae). International journal for parasitology 25, 75-80. 88    

Hu M., Chilton N. B., Gasser R. B. (2004): The mitochondrial genomics of parasitic nematodes of socio-economic importance: Recent progress, and implications for population genetics and systematics. Advances in Parasitology 56, 133–212. Huang, W. Y., He B., Wang C. R., Zhu X. Q. (2004): Characterisation of Fasciola species from Mainland China by ITS-2 ribosomal DNA sequence. Veterinary Parasitology 120, 75-83. Huňová K., Kašný M., Hampl V., Leontovyč R., Kuběna A., Mikeš L., Horák P. (2012): Radix spp.: Identification of trematode intermediate host in the Czech Republic. Acta Parasitologica 57 (3), 273-284. Hulák M., Kašpar V., Flajšhans M., Linhart O. (2006): Využití molekulárních metod a DNA markerů v genetice ryb. Bulletin VÚRH Vodňany 42. Chroust K. and Chroustová E. (2004): Motolice obrovská (Fascioloides magna) u spárkaté zvěře v jihočeských lokalitách. Veterinářství 54, 296-304. Chroustová E., Hůlka J., Jaroš J. (1980): Prevence a terapie fascioloidózy skotu bithionolsulfoxidem. Veterinary Medicine (Praha) 25, 557-563. Innis M. A., Gelfand D. H., White T. J. (1991): PCR Protolols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanocish Publishers. Intapan P. M., Wongkham C., Imtawil K. J., Pumidonming W., Prasongdee T. K., Miwa M., Maleewong W. (2005): Detection of Paragonimus heterotremus eggs in experimentally infected cats by a polymerase chain reaction-based method. The Journal of Parasitology 91 (1), 195-8. Itagaki T., Tsutsumi K. (1998): Triploid form of Fasciola in Japan: genetic relationships between Fasciola hepatica and Fasciola gigantica determined by ITS-2 sequence of nuclear rDNA. International Journal for Parasitology 28, 777-781. Itagaki T., Kikawa M., Sakaguchi K., Shimo J., Terasaki K., Shibahara T., Fukuda K. (2005a): Genetic characterization of parthenogenetic Fasciola sp. in Japan on the basis of the sequences of ribosomal and mitochondrial DNA. Parasitology 131, 679–685. Itagaki T., Terasaki K, Shibahara T., Fukuda K. (2005b): Molecular characterization of parthenogenetic Fasciola sp. in Korea on the basis of DNA sequences of ribosomal ITS1 and mitochondrial ND1 gene. Journal of Veterinary Medicine Science 67, 1115–1118. Jones A., Bray R. A., Gibson D. I. (2005): Keys to trematoda, Vol. 2. CABI Publishing, London, 745 pp. Kašný M. a Novobilský A. (2008): Je naše spárkatá zvěř v Čechách ohrožena motolicí velkou? Svět myslivosti 12, 13-15.

89    

Kašný M., Siegelová V., Siegel T., Beránková K. (2010): Aktuální rozšíření motolice velké (Facioloides magna) v České republice. Svět Myslivosti 10, 58-59. Kašný M., Beran L., Siegelová V., Siegel T., Leontovyč R. (2012): Geographical distribution of the giant liver fluke (Fascioloides magna) in the Czech Republic and potential risk of its further spread. Veterinarni Medicina 57, 101–109. Kaufmann J. (1996): Parasitic infections of domestic animals. A diagnostic manual. Birkhäuser Basel, Boston, Berlin, Germany, 423 pp. Kearn G. C. (1998): Parazitism and the platyhelminthes. Chapman a Hall. London, 544 pp. Klein D. (2002): Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations. Trends in Molecular Medicine 8, 257-260. Kráľová-Hromadová I., Špakulová M., Horáčková E., Turčeková L., Novobilský A., Beck R., Koudela B., Marinkulic A., Rajský D., Pybus M. (2008): Sequence analysis of ribosomal and mitochondrial genes of the giant liver fluke Fascioloides magna (Trematoda: Fasciolidae): intraspecific variation and differentiation from Fasciola hepatica. The Journal of Parasitology 94, 58-67. Kráľová-Hromadová I., Bazsalovicsová E., Štefka J., Špakulová M., Vávrová S., Szemes T., Tkach V., Trudgett A., Pybus M. (2011): Multiple origins of European populations of the giant liver fluke Fascioloides magna (Trematoda: Fasciolidae), a liver parasite of ruminants. International Journal for Parasitology 41, 373-383. Lalonde L. F., Gajadhar A. A. (2011): Detection and Differentiation of Coccidian Oocysts by Real-Time PCR and Melting Curve Analysis. Journal of Parasitology 97(4), 725-730. Lankester M. W. (1972):" Diseases of Moose in Southeastern Manitoba.", 8th N. American Moose Conference Workshop (Proc), pp. 42-59. Latrofa M. S., Montarsi F., Ciocchetta S., Annoscia G., Dantas-Torres F., Ravagnan S., Capelli G., Otranto D. (2012): Molecular xenomonitoring of Dirofilaria immitis and Dirofilaria repens in mosquitoes from north-eastern Italy by real-time PCR coupled with melting curve analysis. Parasites and Vectors 5 (1), 76. Le T. H., Blair D., Agatsuma T., Humair P. F., Cambell N. J., Iwagami M., Littlewood D. T., Peacock B., Johnston D. A., Bartley J. (2000): Phylogenies inferred from mitochondrial gene orders: A cautionary tale from the parasitic flatworms. Molecular and Biological Evolution 17, 1123–1125. Leontovyč R., Pankrác J., Siegelová V., Kašný M. (2012): Motolice obrovská v chovu daňka evropského, Svět myslivosti 5/2012.

90    

Lier T., Simonsen G. S., Wang T., Lu D., Haukland H. H., Vennervald V. J., Johansen V. M. (2009): Low sensitivity of the formol-ethyl acetate sedimentation concentration technique in low-intensity Schistosoma japonicum infection. PLoS Neglected Tropical Diseases 3 (2), e386. Lotfy W. M., Brant S. V., DeJong R. J., Le T. H., Demiaszkiewicz A., Rajapakse R. P. V. J., Perera V. B. V. P., Laursen J. R., Loker E. S. (2008): Evolutionary origins, diversification, and biogeography of liver flukes (Digenea, Fasciolidae). American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 79, 248-255. Luton K., Walker D. & Blair D. (1992): Comparisons of ribosomal internal transcribed spacers from two congeneric species of flukes (Platyhelminthes: Trematoda: Digenea). Molecular and Biochemical Parasitology 56, 323-328. Majoros G., Sztojkov V. (1994): Appearance of the large American liver fluke Fascioloides magna (Bassi, 1875) (Trematoda: Fasciolata) in Hungary. Veterinarsky arhiv 72, 319-325. Majoros G., Erdélyi K., Sztojkov V. (2000): Occurence of Parafasciolopsis fasciolaemorpha (Trematoda : Digenea) in Hungary. Magyar Állatorvosok Lapja 122, 469-474. Mapes C. R. (1951): Studies on the biology of Dicrocoelium dendriticum (Rudolphi, 1819) Looss, 1899 (Trematoda: Dicrocoeliidae), including its relation to the intermediate host, Cionella lubrica (Müller). I. A study of Dicrocoelium dendriticum and Dicrocoelium infection. Cornell Veterinarian 41, 382–432. Marcilla A., Bargues M. D., Mas-Coma S. (2002): A PCR-RFLP assay for the distinction between Fasciola hepatica and Fasciola gigantica. Molecular and Cellular Probes 16, 327-33. Mas-Coma S., Esteban J. G., Bargues M. D. (1999): Epidemiology of human fascioliasis: a review and proposed new classification. Bulletin of the World Health Organization 77, 340-346. Mas-Coma S., Funatsu I. R., Bergeus M. D. (2001): Fasciola hepatica and lymnaeid snails occurring at very high altitude in South America. Parasitology 123, 115–127. Maurelli M. P., Rinaldi L., Capuano F., Perugini A. G., Veneziano V., Cringoli G. (2007): Characterization of the 28S and the second internal transcribed spacer of ribosomal DNA of Dicrocoelium dendriticum and Dicrocoelium hospes. Parasitology Research 101, 1251-1255. McGarry J. W., Ortiz P. L., Hodkinson J. E., Goreish I., Williams D. J. L. (2007): PCR-based differentiation of Fasciola species (Trematoda: Fasciolidae), using primers based on RAPD-derived sequences, Annals of Tropical Medicine & Parasitology 101, 415–421.

91    

Mitchell G. B. B. (2003): Treatment and control of liver fluke in sheep and cattle. Technical Note 557, SAC, Scotland. Morozova E. V., Chrisanfova G. G., Arkhipov I. A., Semyenova S. K. (2004): Polymorphism of the ND1 and CO1 mitochondrial genes in populations of liver fluke Fasciola hepatica. Russian Journal of Genetics 40, 817–820. Muller R. (2002): Worms and Human Disease, 2nd edn. CABI Publishing, Wallingford, 320 pp. Müller B., Schmidt J., Mehlhorn H. (2007): PCR diagnosis of infections with different species of Opisthorchiidae using a rapid clean-up procedure for stool samples and specific primers. Parasitology Research 100, 905–909. Nilsson O. (1971): The inter-relationship of endo-parasites in wild cervids (Capreolus capreolus L. and Alces alces L.) and domestic ruminants in Sweden. Acta Veterinaria Scandinavica 12, 36-68. Nolan M. J. a Cribb T. H. (2005): The use and implications of ribosomal DNA sequencing for the discrimination of digenean species. Advances in Parasitology 60, 101-63. Nolan D. V., Carpenter S., Barber J., Mellor P. S., Dallas J. F., Mordue Luntz A. J., Piertney S. B. (2007): Rapid diagnostic PCR assays for members of the Culicoides obsoletus and Culicoides pulicaris species complexes, implicated vectors of bluetongue virus in Europe. Veterinary Microbiology 124 (1-2), 82-94. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., Hase T. (2000): Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research 28, 63 pp. Nagamine K., Hase T., Notomi T. (2002). Accelerated reaction by look-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes 16, 223–229. Novobilský A. (2007a): The giant liver fluke Fascioloides magna in the Czech republic: distribution, intermediate hosts, and immunodiagnostics. Disertační práce, Fakulta veterinární hygieny a ekologie Veterinární a farmaceutické univerzity Brno, 88 pp. Novobilský A., Horáčková E., Hirtová L., Modrý D., Koudela B. (2007b): The giant liver fluke Fascioloides magna (Bassi 1875) in cervids in the Czech republic and potential of its spreading to Germany. Parasitology Research 100, 549-553. Novobilský A., Kašný M., Mikeš L., Kovarcík K., Koudela B. (2007c): Humoral immune responses during experimental infection with Fascioloides magna and Fasciola hepatica in goats and comparison of their excretory/secretory products. Parasitology Research 101, 357-364.

92    

Oberhauserová K., Bazsalovicsová E., Králová-Hromadová I., Major P., Reblánová M. (2010): Molecular discrimination of eggs of cervid trematodes using the Teflon (PTFE) technique for eggshell disruption, Helminthologia 47 (3), 147 – 151. Odening K. (1969): Der Lanzetteegel oder Kleine Leberegel (Dicrocoelium dendriticum). In: Eckert J., Hertzberg H. (1994): Parasite control in transhumant situations. Veterinary Parasitology 54, 103-125. Olsen O. W. (1962): Animal Parasites: Their Biology and Life Cycles. Minneapolis, Burgess Publishing Company, 346 pp. Olson P. D., Tkach V. V. (2005): Advances and trends in the molecular systematics of the parasitic Platyhelminthes. Advances in Parasitology 60, 165–243. O´Neill S. M., Parkinson M., Strauss W., Angles R., Dalton J. P. (1998): Immunodiagnosis of Fasciola hepatica infection (fascioliasis) in a human population in the Bolivian Altiplano using purified cathepsin L cysteine proteinase. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 58, 417-423. Poláková K. (2009): Rozšíření a patogenita motolice velké (Fascioloides magna), Bakalářská práce, Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze, 29 pp. Pybus M. J. (2001): Liver flukes. In: Samuel W. M., Pybus M. J., Kocan A. A. (eds.), Parasitic diseases in wild mammals, Iowa State Press, Iowa City, 394 pp. Qureshi T., Wagner G. G., Drave, D. L., Davis, D. S., Craig T. M. (1995) Enzymelinked immunoelectrotransfer blot analysis of excretory-secretory proteins of Fascioloides magna and Fasciola hepatica. Veterinary Parasitology 58, 357–363. Radvánský J., Bazsalovicsová E., Králová-Hromadová I., Minárik G., Kádaši L. (2010): Development of high-resolution melting (HRM) analysis for population studies of Fascioloidesmagna (Trematoda: Fasciolidae), the giant liver fluke of ruminants. Parasitology Research 108 (1), 201-9. Rainer B. Lanz (2008): Real-Time Quantitative PCR Assay Data Analysis, Evaluation and Optimization, A Tutorial on Data Analysis and Evaluation and Trouble-Shooting SubOptimal Real-Time QPCR Experiments. Baylor College of Medicine. Ramajo V., Oleaga A., Casanueva P., Hillyer G. V., Muro A. (2001): Vaccination of sheep against Fasciola hepatica with homologous fatty acid binding proteins. Veterinary Parasitology 97, 35-46. Rasmussen R. (2001): Quantification on the LightCycler. In Rapid Cycle Real-time PCR, Methods and Applications; Heidelberg Edited by: Meuer S, Wittwer C, Nakagawara K. Springer Press, 21-34. Rieu E., Recca A., Bénet J. J., Saana M., Dorchies P., Guillot J. (2007): Reliability of coprological diagnosis of Paramphistomum sp. infection in cows. Veterinary Parasitology, 146 (3-4), 249-53. 93    

Rim H. J., Farag H. F., Sornami S., Cross J. H. (1994): Food-borne trematodes: ignored or emerging. Parasitology Today 10, 207-209. Rokni M. B., Mirhendi H., Mizani A, Mohebali M., Sharbatkhori M., Kia E. B., Abdoli H., Izadi S. (2010): Identification and differentiation of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica using a simple PCR-restriction enzyme method. Experimental Parasitology 124, 209–213. Rondelaud D., Novobilský A., Vignoles P., Treuil P., Koudela B., Dreyfuss G. (2006): First studies on susceptibility of Omphiscola glabra (Gastropoda: Lymnaeidae) from central France to Fascioloides magna. Parasitology Research 98, 299-303. Roosien J., Van Zandvoort P. M., Folkertsma R. T., Van der Voort J. N., Goverse A., Gommers F. J., Bakker J. (1993): Single juveniles of the potato cyst nematodes Globodera rostochiensis and G. pallida differentiated by randomly amplified polymorphic DNA. Parasitology 107, 567-72. Saez A. C., Manser M. M., Andrews N., Chiodini P. L. (2011): Comparison between the Midi Parasep and Midi Parasep Solvent Free (SF) faecal parasite concentrators. Journal of Clinical Pathology 64 (10), 901-4. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (1989): Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Semyenova S. K., Morozova E. V., Chrisanfova G. G., Gorokhov V. V., Arkhipov I. A., Moskvin A. S., Movsessyan S. O., Ryskov A. P. (2006): Genetic differentiation in eastern European and western Asian populations of the liver fluke, Fasciola hepatica, as revealed by mitochondrial nad1 and cox1 genes. Journal of Parasitology 92, 525–530. Scherer P., Dvořák J. (2009): O srnčí zvěři, Lesnická práce, 192 pp. Siegelová V., Pankrác J., Košťáková M., Melounová K., Siegel t., Leontovyč R., Kašný M. (2012): Nález motolice obrovské u skotu a odhad možných rizik fascioloidózy v České republice, Veterinářství 07/2012, 438-441. Simpson A. J., Dias Neto E., Steindel M., Caballero O. L., Passos L. K., Pena S. D. (1993): The use of RAPDs for the analysis of parasites. Experientia 67, 331-337. Spithill T. W., Smooker P. M., Copeman D. B. (1999): Fasciola gigantica: Epidemiology, Control, Immunology and Molecular Biology. In Dalton (Ed.) Fasciolosis, CABI Publishing, Wallingford, United Kingdom, 465-525. Strauss W., O’Neill S. M., Parkinson M., Angles R., Dalton J. P. (1999): Short report: Diagnosis of human fascioliasis: Detection of anticathepsin L antibodies in blood samples collected on filter paper. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 60, 746–748.

94    

Swales W. E. (1935): The life cycle of Fascioloides magna (Bassi, 1875) the large liver fluke of ruminants, in Canada. With observation on the bionomics of the larval stages and the intermediate hosts, pathology of Fascioloides magna and control measures. Canadian Journal of Research 12, 177-215. Swales W. E. (1936): Further studies on Fascioloides magna (Bassi, 1875) Ward, 1917, as a parasite of ruminants. Canadian Journal of Research 14, 83-95. Sweeny J. P., Robertson I. D., Ryan U. M., Jacobson C., Woodgate R. G. (2011): Comparison of molecular and McMaster microscopy techniques to confirm the presence of naturally acquired strongylid nematode infections in sheep. Molecular and Biochemical Parasitology 80 (1), 62-7. Šmarda J., Doškař J., Pantůček R., Růžičková V. (2008): Metody molekulární biologie, Masarykova univerzita, Brno. 188 pp. Špakulová M., Rajský D., Sokol J., Vodňanský M. (2003): Cicavica obrovská (Fascioloides magna) významný pečeňový parazit prežúvavcov. Parpress, Bratislava, 61 pp. Tang J. N., Zeng Z. G., Wang H. N., Yang T., Zhang P. J., Li Y. L., Zhang A. Y., Fan W. Q., Zhang Y., Yang X., Zhao S. J., Tian G. B., Zou L. K. (2008): An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of Microbiological Methods 75 (3), 432-6. Thienpont D., Rochette F., Vanparijs O. F. J. (1980): Diagnosing Helminthiasis Through Coprological Examination. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 29, 1021 pp. Ubeira F. M., Muiño L., Valero M. A., Periago M. V., Pérez-Crespo I., Mezo M., González-Warleta M., Romarís F., Paniagua E., Cortizo S., Llovo J., Mas-Coma S. (1999): MM3-ELISA detection of Fasciola hepatica coproantigens in preserved human stool samples. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 81, 156-62. Ullrich K. (1930): Uber das Vorkommen von seltenen oder wenig bekannten Parasiten der Saugetiere und Vogel in Bohmen und Mahren. Prager Archiv fur Tiermedizin 10, 19–43. Valero M. A., Darce N. A., Panova M., Mas-Coma S. (2001): Relationships between host species and morphometric patterns in Fasciola hepatica adults and eggs from the Northern Bolivian Altiplano hyperendemic region. Veterinary Parasitology 102, 85-100. Valero M. A., Perez-Crespo I., Periago M. V., Khoubbane M. (2009): Fluke egg characteristics for the diagnosis of human and animal fascioliasis by Fasciola hepatica and F. gigantica. Acta Tropica 111, 150–159. Verma S. K., Prasad K., Nagesh N., Sultana M., Singh L. (2003): Was elusive carnivore a panther? DNA typing of faeces reveals the mystery, Forensic Science International 137, 16-20. 95    

Walter W. D., Leslie D. M. Jr., Herner-Thogmartin J. H., Smith K. G., Cartwright M. E. (2005): Efficacy of immobilizing free-ranging elk with Telazol and xylazine hydrochloride using transmitter-equipped darts. Journal of Wildlife Diseases 41(2), 395400. Ward H. B. (1917): On the structure and classification of North American parasitic worms. The Journal of Parasitology 4, 1–12. Wensvoort P. a Over H. J. (1982): Cellular proliferation of bile ducts and gammaglutamyl transpeptidase in livers and sera of young cattle following a single infection with Fasciola hepatica. The Veterinary Quarterly 4, 161-172. Wittwer C. T. (2009): High-resolution DNA melting analysis: advancements and limitations. Human Station 30 (6), 857-9. Wobeser, G., Gajadhar A. A., Hunt H. M. (1985): Fascioloides magna: Occurrence in Saskatchewan and distribution in Canada. Canadian Veterinary Journal 26, 241–244. Yılmaz H., Gödekmerdan A. (2004): Human fasciolosis in Van province, Turkey. Acta Tropica 92, 161–162. Záhoř Z. (1965): Výskyt velké motolice (Fascioloides magna, Bassi, 1875) u srnčí zvěře. Veterinářství 15, 322-324. Záhoř Z., Prokš C., Vítovec J. (1966): Nález vajíček motolice velké Fascioloides magna (Bassi, 1875) a fascioloidózních změn v játrech skotu. Veterinarni Medicina (Praha) 6, 397–404. Záhoř Z., Prokš C., Vítovec J. (1968): Morfologie změn způsobených velkou motolicí (Fascioloides magna, Bassi 1875) u skotu. Veterinarni Medicina (Praha) 13, 369 – 375. Zmunda K., Chroust K. (2001): Motoličnatost skotu v okrese Frýdek-Místek. Veterinářství 51, 181-183.

96