Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2012-2013

HET GEBRUIK VAN PLAATJESRIJK PLASMA VOOR DE WONDBEHANDELING BIJ PAARD EN KLEINE HUISDIEREN Door Valerie DE CLERCK

Promotoren: Prof. Dr. Lieven Vlaminck Eva Pint DAP

Literatuurstudie in het kader van de Masterproef © 2013 Valerie De Clerck

VOORWOORD Graag zou ik mijn hoofdpromotor Prof. Dr. Lieven Vlaminck en copromotor Eva Pint DAP willen bedanken. Ondanks hun drukke agenda hebben ze mij steeds geholpen en bijgestaan om deze literatuurstudie te kunnen realiseren. Mede zou ik Theo Gooris, diensthoofd Perfusie van het OLV Ziekenhuis in Aalst, en Jaak Vogeleer DAP willen bedanken om mij in te leiden in het onderwerp “PlaatjesRijk Plasma” en mij van de nodige informatie te voorzien. Ik heb deze masterproef met veel inzet en interesse tot een goed einde proberen brengen.

INHOUDSOPGAVE VOORBLAD (vrijwaringsclausule) INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING...........................................................................................................................................p.1 INLEIDING.....................................................................................................................................................p.2 LITERATUURSTUDIE...................................................................................................................................p.3 1. DE ROL VAN BLOEDPLAATJES IN DE WONDHELING 1.1. Ultrastructuur van de bloedplaatjes..........................................................................................p.3 1.2. Activatie van de bloedplaatjes..................................................................................................p.3 1.3. Invloed van de bloedplaatjes en hun groeifactoren op de wondheling.....................................p.4 1.3.1. De belangrijkste groeifactoren en hun functie.........................................................p.4 1.3.2. Fase I: acute inflammatie........................................................................................p.7 1.3.3. Fase II: cellulaire proliferatie...................................................................................p.8 1.3.3.1. Fibroplasie.............................................................................................p.8 1.3.3.2. Angiogenese..........................................................................................p.8 1.3.3.3. Epithelisatie...........................................................................................p.8 1.3.4. Fase III: wondcontractie..........................................................................................p.8 1.3.5. Fase IV: remodellering............................................................................................p.9 2. WAT IS PRP? 2.1. Definitie PRP............................................................................................................................p.9 2.2. Het nut van het gebruik van PRP.............................................................................................p.9 2.3. Concentratie bloedplaatjes in PRP...........................................................................................p.11 2.4. PRP vs. Single recombinant growth factors.............................................................................p.11 3. BEREIDEN EN APPLICATIE VAN PRP OP DE WONDE 3.1. Bereiding van plaatjesrijk plasma.............................................................................................p.11 3.1.1. De dubbele centrifugatiemethode of buffy coat methode........................................p.12 3.1.2. De apheresismethode.............................................................................................p.13 3.2. Applicatie van PRP op de wonde: de autologe platelet gel......................................................p.15 3.3. Fixatie van de autologe platelet gel..........................................................................................p.17 3.4. Applicatieduur en applicatiefrequentie......................................................................................p.17 4. PRP-WONDBEHANDELING BIJ PAARD EN KLEINE HUISDIEREN 4.1. PRP-wondbehandeling bij paarden..........................................................................................p.18 4.2. PRP-wondbehandeling bij kleine huisdieren............................................................................p.20 BESPREKING...............................................................................................................................................p.21 REFERENTIELIJST.......................................................................................................................................p.22 BIJLAGEN......................................................................................................................................................p.26

SAMENVATTING Plaatjes-Rijk Plamsa wondbehandeling is een veelbelovende therapie voor de behandeling van verwondingen. De thrombocyten spelen een essentiële rol in de wondheling door het vrijstellen van hun groeifactoren na activatie. In PRP is de concentratie aan thrombocyten en aldus aan groeifactoren 4 tot 8 keer hoger dan de normale concentratie in het bloed. Deze hoge concentratie aan groeifactoren zou verantwoordelijk zijn voor een snellere heling en epithelisatie, minder inflammatie, minder vorming van granulatieweefsel en betere organisatie van de collageenbundels. Daarnaast zou het PRP door de hoge concentratie aan thrombocyten en WBC ook een antibacterieel effect hebben. Als laatste wordt ook een pijnstillend effect toegewezen aan PRP. PRP wordt bereid a.d.h.v. autoloog bloed en is daardoor veilig voor de patiënt, wat betreft bepaalde overdraagbare aandoeningen en immunologische afweerreacties. Deze techniek van wondbehandeling wordt in de diergeneeskunde nog niet frequent gebruikt, alhoewel de eerste resultaten van enkele veterinaire studies veelbelovend zijn.

1

INLEIDING Wondheling is een levensbelangrijke eigenschap van levende organismen die hen in staat stelt om weefsels die beschadigd geraken te herstellen. De wondheling gaat gepaard met een complexe interactie tussen verschillende bloedcomponenten, de extracellulaire matrix en mesenchymale cellen. De verschillende bloedcomponenten zijn de rode bloedcellen of erythrocyten, de bloedplaatjes of thrombocyten, de witte bloedcellen of leucocyten en de macrofagen. De extracellulaire matrix bestaat uit fibrine, collageen en proteoglycanen. De mesenchymale cellen tenslotte omvatten de fibroblasten, de endotheelcellen en de epitheelcellen. Deze complexe interacties worden gemedieerd door zogenaamde groeifactoren en/of cytokines. De groeifactoren zijn cytokines die worden vrijgesteld door onder andere de thrombocyten na activatie (Everts et al. 2006). Plaatjes-rijk plasma is een volume autoloog plasma waarin de concentratie aan bloedplaatjes gemiddeld 4 tot 8 keer hoger is dan in het normaal bloed, met als gevolg dat de concentratie aan groeifactoren ook veel hoger ligt (Marx 2004, Everts et al. 2006). Aan dit PRP wordt vervolgens een activator toegevoegd waardoor we een autologe platelet gel krijgen (APG) die vervolgens op de wonde kan geappliceerd worden (Marx 2004, Everts et al. 2006). Dit zou een positieve invloed hebben op de wondheling (Marx, 2004). Deze groeifactoren hebben vooral een mitogene activiteit (Steed 1997, Koveker 2000, Everts et al. 2006, Maciel et al. 2012). PRP wordt in de humane geneeskunde reeds frequent gebruikt in de wondbehandeling, de behandeling van pezen en in de tandheelkunde (Whitman et al. 1997, Marx 1998, Marx 2004, Margolis et al. 2001, Crovetti et al. 2004, Cieslik-Bielecka et al. 2009). In de diergeneeskunde is het gebruik nog beperkt en het meest frequent wordt het gebruikt in de orthopedie bij paarden (Carmona et al. 2005, Arguelles et al. 2008, Waselau et al. 2008, Bosch et al. 2009, Kissich et al. 2012). In deze literatuurstudie wordt meer specifiek ingegaan op de wondbehandeling met PRP bij paarden en kleine huisdieren. Er wordt beschreven wat PRP precies is, hoe PRP wordt bereid, hoe het wordt geappliceerd op de wonde en in welke mate het reeds doorgedrongen is tot de veterinaire wetenschap.

2

LITERATUURSTUDIE 1. DE ROL VAN BLOEDPLAATJES IN DE WONDHELING 1.1. DE ULTRASTRUCTUUR VAN DE BLOEDPLAATJES In het bloed van zoogdieren zijn drie soorten bloedcellen aanwezig; de rode bloedcellen of erythrocyten, de witte bloedcellen of leucocyten en de bloedplaatjes of thrombocyten. De thrombocyten worden gevormd in het beenmerg. Het zijn afgesnoerde cytoplasmafragmenten van de megakaryocyten en hebben bijgevolg geen kern. Ze zijn discoïd van vorm in het inactieve stadium en hebben een diameter van 1-3 µm. In deze toestand circuleren de thrombocyten normaal in het organisme (Everts et al. 2006, Pretorius et al. 2007, Blair en Flaumenhaft 2009, Zandim et al. 2011). In het cytoplasma van de thrombocyt bevinden zich naast mitochondria, een dens tubulair systeem, een open canaliculair systeem, glycogeen partikels, peroxisomen en lysosomen, ook nog twee types secretiegranules: de α-granules en de dense granules (Everts et al. 2006, Blockmans et al. 1995, Freson et al. 2007, Pretorius et al. 2007, Alsousou et al. 2009, Blair en Flaumenhaft 2009, Zandim et al. 2011). De α-granules nemen ongeveer 10% in van het totale celvolume en zijn cruciaal voor het normaal functioneren van de thrombocyt (Blair en Flaumenhaft, 2009). Deze bevatten de stollingsfactoren, de groeifactoren en andere proteïnen (Everts et al. 2006). De dense granules bevatten ADP, ATP, serotonine en calcium (Everts et al., 2006). 1.2 ACTIVATIE VAN DE BLOEDPLAATJES Om hun rol in het lichaam te kunnen vervullen moeten thrombocyten geactiveerd worden. Dit kan gebeuren onder invloed van verschillende farmacologische en fysiologische stimuli (Zandim et al. 2011). Bij verwonding wordt de membraan van de endotheelcellen beschadigd, waardoor fosfolipiden vrijgesteld worden die een cascadereactie ontketenen waarbij onder andere thromboxaan, platelet activating factor, serotonine, epinefrine en cyclische endoperoxide anologen worden vrijgesteld, die de bloedplaatjes activeren (Zandim et al. 2011). Activerende farmacologische agentia zijn onder andere adenosinedifosfaat (ADP), bovien thrombine, thromboplastine, collageen, calcium chloride en calcium gluconaat. Deze farmacologische agentia kunnen aldus toegevoegd worden aan het PRP om dit te activeren (Zandim et al. 2011). Wanneer de thrombocyten geactiveerd worden ondergaan deze een vormverandering; ze worden rond en ontwikkelen pseudopodiën (Figuur 1) waarmee ze zich door beschadigde weefsels kunnen voortbewegen en kunnen adhereren aan de beschadigde endotheelcellen om een hemostatische prop te vormen die de wonde afsluit (Everts et al. 2006). Deze vormverandering is mogelijk dankzij het cytoskelet dat opgebouwd is uit microtubuli en actine- en myosine filamenten (Blockmans et al. 1995, Everts et al. 2006a, Zandim et al. 2011). Dit fenomeeen ‘thrombocyten aggregatie’ genaamd, gaat bovendien gepaard

3

met degranulatie van de thrombocyten (Zandim et al. 2011). De stoffen die gesynthetiseerd en opgeslagen worden in hun intracellulaire granules worden dan afgeven aan het extracellulair milieu. Dit gebeurt door fusie van de granules met het open canaliculair systeem dat in verbinding staat met het extracellulaire milieu of door fusie van de membraan van de granules met de thrombocytenmembraan (exocytose) (Zandim et al. 2011).

Figuur 1: een schematisch overzicht van de thrombocyt in rust (links) en de geactiveerde thrombocyt (rechts) (uit Everts et al. 2006).

1.3. INVLOED VAN DE BLOEDPLAATJES EN HUN GROEIFACTOREN OP DE WONDHELING 1.3.1. De belangrijkste groeifactoren en hun functie De wondheling is een complex proces van opeenvolgende gebeurtenissen, waarbij de thrombocyten een cruciale rol spelen. Eens de thrombocyten geactiveerd zijn zullen deze degranuleren en een heel gamma aan mediatoren vrijstellen, waaronder de groeifactoren, die belangrijk zijn in de wondheling. De groeifactoren spelen een belangrijkre rol in de wondheling als boodschappers in de cel-cel interacties en de cel-matrix interacties. De rol van de belangrijkste groeifactoren in de verschillende fasen van de wondheling is samengevat in Tabel 1 en Figuur 2.

4

Tabel 1: Overzicht van de rol van de groeifactoren in de wondheling (Steed 1997, Koveker 2000, Everts et al. 2006, Maciel et al. 2012)

GROEIFACTOR

INFLAMMATIEFASE

PROLIFERATIEFASE

REMODELLERINGSFASE

Platelet Derived

- krachtig chemoattractant

- proliferatie mesenchymale cellen

- stimuleert collagenase

Growth Factor

voor monocyten,

- fibroplasie:

productie

(PDGF)

macrofagen en

* proliferatie fibroblasten en gladde

- versnelt de vorming van een

neutrofielen naar de

spiercellen

extracellulaire matrix

wonde

* chemotaxis fibroblasten en

- activatie van de

gladde spiercellen naar de wonde

macrofagen

* collageenproductie door fibroblasten - angiogenese: proliferatie endotheelcellen - epithelisatie: proliferatie epitheelcellen - heling botweefsel: proliferatie osteoblasten

Transforming

- Chemotaxis fibroblasten

- proliferatie mesenchymale cellen

- versnelt de vorming van een

Growth Factor

en macrofagen naar

- fibroplasie:

extracellulaire matrix

Beta (TGF-ß)

wonde

* proliferatie fibroblasten

- activatie macrofagen

* chemotaxis fibroblasten

- reguleren van de

* collageenproductie door

inflammatie als een

fibroblasten

immunosuppressief agens

- angiogenese: proliferatie endotheelcellen - Heling van botweefsel (Robey et al. 1987) * Chemotaxis osteoblasten * Proliferatie osteoblasten * Depositie van osteoblasen thv de beenmatrix

Transforming

- Epithelisatie: proliferatie van de

Growth Factor

epitheelcellen

Alfa (TGF-α) Fibroblast

- fibroplasie:

- versnelt de vorming van een

Growth Factor

* proliferatie en differentiatie van

matrix

(FGF)

de fibroblasten * chemotaxis van de fibroblasten * collageenproductie door de fibroblasten - angiogenese: proliferatie endotheelcellen

5

- eptihelisatie: proliferatie van keratinocyten - heling botweefsel: stimuleren van de proliferatie en differentiatie van precursoren van chrondrocyten en osteoblasten Vascular

- angiogenese: proliferatie

Endothelial

endotheelcellen

Growth Factor (VEGF) Epidermal

- stimuleren van de

- fibroplasie: prolliferatie

Growth Factor

endotheliale chemotaxis

fibroblasen en gladde spiercellen

(EGF)

- stimuleert de

- angiogenese: stimuleren van de

cytokinesecretie door

endotheliale chemotaxis

andere cellen

- epithelisatie: stimuleert de mobilisatie en proliferatie van de keratinocyten

Connective

- thrombocyten adhesie

- fibroplasie

Tissue Growth

- angiogenese (stimuleert ook de

Factor (CTGF)

angiogenese tijdens embryonale ontwikkeling, placentatie en tumorontwikkeling) - kraakbeenregeneratie

Insuline Like

- chemotaxis van

- stimuleert collageenproductie

- stimuleert collagenase gen-

Growth Factor -1

endotheliale cellen

door fibroblasten

expressie

(IGF-1) Keratinocyt

- stimuleert de proliferatie van

Growth Factor

keratinocyten

(KGF)

6

Figuur 2: schematische illustratie van de rol van de belangrijkste groeifactoren in de wondheling. De nummering geeft de opeenvolging van de gebeurtenissen weer (Uit Everts et al., 2006).

1.3.2. Fase I: acute inflammatie De eerste fase in de wondheling is de acute inflammatie. Tijdens de acute inflammatiefase wordt de stollingscascade geactiveerd, hetgeen resulteert in de vorming van een bloed-fibrineklonter die de wonde afsluit. Tevens worden er een heleboel onstekingsmediatoren vrijgesteld die belangrijk zijn voor de initiatie van de volgende helingsfasen. De belangrijkste factoren die deze fase mediëren zijn de veranderingen in de beschadigde endotheelcellen en de geactiveerde thrombocyten (Everts et al. 2006). De dense granules stellen serotonine en ADP vrij. Serotonine zou een rol spelen in de vasoconstrictie thv de wonde, terwijl ADP de degranulatie van andere thrombocyten stimuleert en ervoor zorgt dat de thrombocyten aan elkaar gaan kleven en aldus een hemostatische prop vormen (Everts et al. 2006). De

α-granules bevatten grote polypeptiden, waarvan fibrinogeen en von Willebrand factor (vWf) de

belangrijkste rol spelen in de stollingscascade (Blair en Flaumenhaft 2009). Von Willebrand factor medieert de interactie tussen de thrombocyten onderling en de interactie thrombocyt-endotheel. De αgranules bevatten daarnaast ook nog andere stollingsfactoren en co-factoren die verantwoordelijk zijn voor de secundaire hemostase. Concreet betekent dit dat fibrine wordt omgezet naar fibrinogeen, waardoor er een fibrinenetwerk wordt gevormd tussen de thrombocyten hetgeen de hemostatische prop stabiliseert (Everts et al., 2006, Blair en Flaumenhaft, 2009). Overdreven activatie van stollingssystemen wordt vermeden door het activeren van

leucocyten, die

cytokines vrijstellen die verantwoordelijk zijn voor de fibrinolyse. (Everts et al., 2006, Blair en Flaumenhaft, 2009). 7

De thrombocyten gaan tevens de macrofagen activeren die op hun beurt groeifactoren gaan vrijstellen: transforming growth factors (TGF-a, TGF-b), platelet derived growth factors (PDGF), interleukine-1 (IL-1) en fibroblast growth factor (FGF). 1.3.3. Fase II: cellulaire proliferatie Na dag 3 start de tweede fase of proliferatiefase. Deze omvat de fibroplasie of bindweefselvorming, de angiogenese of bloedvatvorming en de epithelisatie of epitheelvorming. 1.3.3.1. Fibroplasie De fibroblasten migreren langsheen het fibrine-netwerk in de bloedklonter. Eenmaal de fibroblasten hun eindpositie hebben bereikt zullen deze prolifereren en collageen synthetiseren en produceren. De belangrijkste groeifactoren die deze fase moduleren zijn PDGF, TGF-b, FGF en EGP (Everts et al. 2006). 1.3.3.2. Angiogenese De angiogenese of nieuwvorming van bloedvaten is belangrijk voor de aanvoer van O2 thv van het wondbed. Hoe meer O2, hoe meer collageen gevormd kan worden. Door de vrijstelling van zowel pro- als anti-angiogenische proteïnen, zoals VEGF, FGF, PDGF, TGF-b en EGF kunnen geactiveerde thrombocyten de angiogenese moduleren (Blair en Flaumenhaft 2009, Everts et al. 2006). 1.3.3.3. Epithelisatie De epithelisatie zorgt ervoor dat het epitheel van de huid hersteld wordt. De epithelisatie start vanuit de wondranden en gaat zo geleidelijk het defect overbruggen. De epitheelcellen aan de randen worden mobiel en gaan migreren naar het centrum van de wonde. Aan de wondranden worden ondertussen nieuwe epitheelcellen gevormd door proliferatie. De belangrijkste groeifactoren die een rol spelen in deze fase zijn: PDGF en EGF (Everts et al. 2006). 1.3.4. Fase III: wondcontractie De derde fase in de wondheling is de wondcontractie. Dit speelt vooral een rol bij wonden van de volledige huiddikte. De wondcontractie is het resultaat van een interactie tussen de extracellulaire matrix, de cytokines/groeifactoren en de myofibroblasten. Deze interacties worden gemedieerd door o.a. PDGF en FGF.

8

1.3.5. Fase IV: remodellering De vierde en laatste fase in de wondheling is de remodelleringsfase of rijpingsfase. Het granulatieweefsel wordt omgevormd tot littekenweefsel. Dit houdt in dat het collageen type III wordt afgebroken door collagenase en vervangen wordt door collageen type I. 2. WAT IS PRP? 2.1. DEFINITIE PRP Plaatjes rijk plasma (PRP) wordt verkregen door autoloog bloed van de patiënt te concentreren waardoor het enkel bestaat uit een hoge concentratie bloedplaatjes, leucocyten en enkele verse erythrocyten in een klein volume autoloog plasma (Marx 2001, Marx 2004). 2.2. HET NUT VAN HET GEBRUIK VAN PRP PRP werd voor het eerst gebruikt door Ferrari et al. (1987) na een open hartoperatie. Het werd gebruikt als autologe bloedcomponent voor transfusie om een homologe bloedtransfusie (donorbloed) te vermijden (Ferrari et al. 1987, Everts et al. 2006). Daar PRP bereid wordt uitgaande van autoloog bloed van de patiënt is er geen gevaar voor de overdracht van infectieuze ziekten of immunologische afweerreacties (Whitman et al. 1997). Het gebruik van PRP voor de behandeling van wonden werd in 1990 voor de eerste keer gerapporteerd (Knighton et al. 1990). Whitman et al. 1997 introduceerden PRP voor het eerst in de orale chirurgie door het te gebruiken als alternatief voor fibrin glue. Dit maakt het een vrij recente ontwikkeling in de biotechnologie die als doel heeft het stimuleren en versnellen van de heling van zachte weefsels en beenweefsel (Marx, 2001). Uit de humane geneeskunde zijn er reeds een significant aantal studies voorhanden die positieve resultaten melden na PRP-behandeling voor de heling van botweefsel en zachte weefsels (Marx et al. 2004). Het werd met succes gebruikt in verschillende vakgebieden: de otolaryngology, hoofd- en nekchirurgie, neurochirurgie, algemene chirurgie en de orale- en maxillofaciale chirurgie (Whitman et al. 1997, Marx et al. 1998). Het gebruik van PRP in de diergeneeskunde is nog vrij beperkt. Momenteel wordt het vooral gebruikt in de orthopedie bij paarden. De meest voorkomende indicaties zijn tendinitis, osteoarthritis, synovitis en insertiedesmopathie (Kissich et al. 2012). Door de behandeling van wonden met PRP beoogt men een snellere en meer complete wondheling, met minder littekenweefsel en een betere huidpigmentatie (R. Marx 2004). De wondbehandeling met PRP leidt namelijk tot snellere epithelisatie en een betere organisatie van de nieuwgevormde collageenbundels in de huid in vergelijking met de controletherapieën (Carter et al. 2003, DeRossi et al. 2009, Maciel 2012). Margolis et al. (2001) en Yuan et al. (2009) tonen in een studie aan dat de behandeling van chronische, slecht helende wonden en zeer diepe wonden met PRP effectiever is dan wanneer men zich beperkt tot 9

de standaard wondbehandeling. PRP zou na applicatie ook een pijnstillend en antimicrobieel effect hebben. (Crovetti et al. 2004, Bielecki et al. 2007, Cieslik-Bielecka 2009). Het antimicrobieel effect van PRP berust op de aanwezigheid van hoge concentraties thrombocyten en leucocyten in het PRP. De concentratie leucocyten kan tot 7 x hoger zijn in PRP in vergelijking met de basisconcentratie in normaal bloed (Bielecki et al. 2007). De rol van de leucocyten in het PRP is nog voor discussie vatbaar. Enerzijds zou een hoge concentratie aan leucocyten een voordeel zijn in de wondheling, daar ze een antibacteriële werking hebben (Bielecki et al. 2007, Cieslik-Bielecka et al. 2009) en de concentratie aan groeifactoren in het PRP zouden verhogen (Zimmerman et al. 2003, Castillo et al. 2011). Dit doordat ze enerzijds zelf groeifactoren vrijstellen en anderzijds door het stimuleren van de thrombocyten tot degranulatie (Zimmerman et al. 2003, Castillo et al. 2011). Anderzijds zouden vnl de neutrofielen de wondheling kunnen belemmeren doordat ze een verhoogde lokale inflammatiereactie veroorzaken (Castillo et al. 2011). Er zijn echter nog geen studies beschikbaar die bewijzen dat dit werkelijk nadelig zou zijn (Castillo et al. 2011). Ook de thrombocyten spelen een belangrijke rol in de afweer tegen micro-organismen. Naast hun belangrijke rol in de inflammatie zijn de thrombocyten ook in staat om zuurstofradicalen vrij te stellen die een anti-bacterieel effect hebben. Daarenboven gaan de thrombocyten ook direct interageren met microorganismen, die zich in het bloed bevinden, om deze op te ruimen en spelen ze actief een rol in de antigeen-specifieke cytotoxiciteit tegen pathogene micro-organismen (Bielecki et al. 2007). Uit de humane thrombocyten zijn reeds 7 antimicrobiële peptiden geïsoleerd na activatie met thrombine: fibrino-peptide A, fibrino-peptide B, thymosine beta 4, platelet basic protein, connective-tissue-activating peptide 3, RANTES en platelet factor 4 (Tang et al. 2002). In een in vitro studie van Bielecki et al. (2007) werd aangetoond dat PRP een positief effect kan hebben op de wondheling van geïnfecteerd wonden, doordat het de groei van methicilline gevoelige Staphylococcus aureus (MSSA), methicilline resistente Staphylococcus aureus (MRSA) en Escherichia coli (Extended Spectrum Beta Lactamase, ESBL) inhibeert. Dit zijn drie bacteriën die regelmatig de oorzaak zijn van ernstige wondinfecties. Enkel bij wonden die geïnfecteerd zijn met Pseudomonas aeruginosa is het gebruik van PRP gecontraindiceerd aangezien PRP mogelijk een opflakkering van Ps. Aeruginosa zou kunnen veroorzaken. Er was geen antibacterieel effect waar te nemen tegen K. Pneumoniae en E. Faecalis. Zowel de geactiveerde als de niet geactiveerde PRP vertonen de eerste 12 uur na inoculatie met MRSA een bactericied effect en een bacteriostatische effect tot 24 uur na inoculatie (Álvareza et al. 2011).

2.3. CONCENTRATIE BLOEDPLAATJES IN PRP

10

Het aantal bloedplaatjes in humaan bloed bedraagt tussen de 150.000/µL en 350.000/µL (gemiddeld 6

200.000/µL) (Marx et al. 2001). In PRP wordt een gemiddeld aantal bloedplaajtes van 10 /µL aangeraden (Marx 2004, Everts et al. 2006). Dit is aldus een concentratie aan bloedplaatjes die 4 tot 5 keer hoger is dan de basisconcentratie in het bloed. Er zijn zelfs apparatuur op de markt die PRP bereiden met een concentratie die 6 tot 10 keer hoger is dan de basisconcentratie in het bloed (Everts et al. 2006). De vraag is of dit noodzakelijk is en of dit PRP een betere werking heeft. Weibrich et al. (2004) beweren namelijk 6

dat concentraties boven de 10 /µL een paradoxale inhibitorische werking kunnen hebben (Everts et al. 2006). Doch de tegenstrijdige bewering van Haynesworth et al. (2002) lijkt geloofwaardiger te zijn. Zij tonen met een dosis-response curve aan dat de proliferatie van mesenchymale cellen proportioneel is met de concentratie aan thrombocyten in het PRP, en dit net vanaf een concentratie die 4 à 5 keer hoger 6

(=10 /µL) ligt dan de basisconcentratie in het bloed (Marx 2004). 2.4. PRP vs. ‘SINGLE RECOMBINANT GROWTH FACTORS Single recombinant growth factors zijn humane groeifactoren, die afzonderlijk worden toegediend in een hoge dosis door middel van een carriër, die niet afkomstig is van de patiënt zelf. Deze carriër kan een synthetische carriër zijn of afkomstig van dierlijke proteïnen. Deze single recombinant growth factors worden gesynthetiseerd door het in cultuur brengen van ovariële cellen van de Chinese hamster, na insertie van een humaan gen in hun nucleus d.m.v. een bacteriële plasmide vector (Marx, 2001). Een groot voordeel van PRP t.o.v. ‘single recombinant growth factors’ is de synergistische werking tussen de verschillende groeifactoren onderling, daar deze in hun fysiologische verhoudingen aanwezig zijn in het PRP (Everts et al. 2001). 3. BEREIDEN EN APPLICATIE VAN PRP OP DE WONDE 3.1. BEREIDING VAN PLAATJESRIJK PLASMA In de diergeneeskunde worden momenteel

2 methodes voor het bereiden van PRP beschreven bij

paarden: (1) de dubbele centrifugatie methode en (2) de apheresis methode (Everts et al. 2006, Ramirez 2006). Verder kan er nog een onderscheid gemaakt worden tussen de manuele en de automatische methodes (Sutter et al. 2004). Door de evolutie op het gebied van methodes en toestellen is het vaak moeilijk om de verschillende commerciële toestellen en methodes onder te brengen in één categorie (Sutter et al. 2004). Om PRP te bereiden met een concentratie binnen de therapeutische marge en met een minimum aan beschadigde thrombocyten, is het noodzakelijk dat de gebruikte apparatuur voldoet aan de normen van de Food and Drug Administration (FDA) (USA) of de Certification Europe Organisation (Marx 2004). 3.1.1. De dubbele centrifugatie methode of buffy coat methode 11

De eerste stap in de bereiding van het PRP is de bloedafname bij de patiënt, ongeacht welke methode er nadien gebruikt wordt. Er wordt steeds gebruik gemaakt van een naald met een minimum diameter van 17 gauge om de schade aan de trombocyten zoveel mogelijk te beperken (Everts et al. 2006). PRP kan enkel bereid worden uitgaande van ongestold bloed. Wanneer het bloed namelijk gestold is zal de meerderheid van de bloedplaatjes in de bloedklonter zitten en het serum zal bijgevolg arm zijn aan bloedplaatjes. Er moet dus een anti-coagulant toegevoegd worden aan het bloedbuisje. Hiervoor gebruikt men het anticoagulant citraat dextrose-A (ACD-A)

of Citraat Fosfaat Dextrose 10% (CFD). Beide producten

ondersteunen het metabolisme van de thrombocyten en zorgen ervoor dat deze bij het centrifugeren niet beschadigd worden. Een voorkeur gaat uit naar ACD-A aangezien studies hebben aangetoond dat CFD 10% minder effectief is (Marx, 2001). Everts et al. (2006) adviseren een verhouding van 1mL ACD-A op 7-8 mL bloed. De tweede stap is het centrifugeren van het bloed. Dit gebeurt in een 2-stappen proces (Marx 2001). De toestellen die hiervoor gebruikt worden zijn de ‘tabletop centrifuges’ (Everts et al. 2006).

De

voorgeschreven centrifugatieprotocols verschillen naargelang de verschillende studies wat betreft de tijd en de kracht van het centrifugeren (J. Ramirez, 2006, Marx et al. 2001, plateletex® instructions). Arguëlles et al. (2006) beschrijven een centrifugatieprotocol, voor paardenbloed, met een eerste centrifugatie aan 120 x g gedurende 5 min en een tweede centrifugatie aan 240 x g gedurende 5 min. De eerste centrifugatie (soft spin) zal het plasma en de buffy coat scheiden van de erytrhocyten (Figuur 5). De buffy coat bevat de bloedplaatjes, witte bloedcellen, stollingsfactoren en enkele verse erytrhocyten (Everts et al. 2006). Afhankelijk van het type toestel worden ofwel de erythrocyten afgezonderd en opgevangen en blijft de buffy coat en het plasma achter in de tube (= automatisch systeem met 2 spuiten (Kissich et al. 2012)) (Everts et al. 2006, Magellan® gebruiksaanwijzing) ofwel worden de buffy coat en het plasma afgezonderd en manueel in een andere tube gebracht (Figuur 6, plateltex® instructions).

Figuur 5: De bloedbluisjes na de eerste centrifugatiestap en een detailtekening van een bloedbuisje met de verschillende bloedcomponenten (Naar Plateltex® gebruiksaanwijzing).

Vervolgens wordt in de tweede centrifugatie (hard spin) het PRP (onderste fase) afgezonderd van het resterende PPP (bovenste fase) en opgevangen. Afhankelijk van het type tabletop centrifuge worden de verschillende componenten afzonderlijk opgevangen of wordt enkel het PRP afgezonderd en opgevangen

12

(Everts et al., 2006).

De concentratie bloedplaatjes in het resterende PRP is afhankelijk van de

overgebleven hoeveelheid PPP (Plateltex® gebruiksaanwijzing).

Figuur 6: Het scheiden van de buffy coat en het plasma van de rode bloedcellen en de tweede centrifugatiestap voor het scheiden van het platelet concentrate van het platelet poor plasma. (Naar plateltex® gebruiksaanwijzing)

3.1.2. De apheresis methode. De apheresis methode maakt gebruik van cell savers/separators (Everts et al. 2006). Cell savers worden meestal gebruikt tijdens operaties met veel bloedverlies, in tegenstelling tot de buffy coat methode, waar de hoeveelheid bloed die getrokken wordt bij de patiënt eerder gering is. Bij de apheresis methode wordt het bloed tijdens de operatie opgevangen in bloeddonorzakken met een anticoagulant. Na afzondering van het PRP kunnen de erytrhocyten en het platelet poor plasma (PPP) vervolgens via een autoinfuus terug toegediend worden aan de patiënt (Everts et al. 2006). De volgorde van opvangen van de verschillende bloedcomponenten bij de apheresis methode is verschillend van deze bij de buffy coat methode. Bij de apheresis methode wordt namelijk eerst het PPP gescheiden van de buffy coat en de erythrocyten, na een centrifugatie aan 5600 rpm. Dit PPP wordt opgevangen in een bloedzak. Vervolgens wordt de centrifuge vertraagd tot 2400 rpm waarna de buffy coat, bestaande uit PRP, leucocyten en enkele verse erythrocyten, kan afgescheiden en opgevangen worden. Ten slotte worden dan de erythrocyten opgevangen in een aparte bloed zak (Everts et al., 2006). De keuze van de methode is aldus afhankelijk van verschillende factoren zoals, de soort ingreep, het beschikbare materiaal, het gewenste volume PRP, de gewenste concentratie aan groeifactoren, de kostprijs, enz. In Tabel 2 wordt er een overzicht gegeven van de belangrijkste voor- en nadelen van de tabletop centrifuges t.o.v. de cell savers/separtors

13

Tabel 2: De belangrijkste voor- en nadelen van de tabletop centrifuges t.o.v. de cell savers/separtors (Sutter et al. 2004, J. Ramirez, 2006)

BUFFY COAT METHODE

CELL SAVERS/SEPARATORS

VOORDEEL

NADEEL

- eenvoudige en compacte apparatuur

- hoger risico op bacteriële contaminatie (voornamelijk bij de manuele methode)

- hogere concentratie aan leucocyten

- kleinere volumes PRP

- lage risico op bacteriële contaminatie

- duur en gespecialiseerd materiaal en personeel nodig

- hoge concentratie aan thrombocyten en groeifactoren in het PRP - groot volume PRP

Opmerking: de concentratie aan leucocyten in het PRP verkregen met de buffy coat-methode hangt echter ook sterk af van het gebruikte toestel; zo produceert het Cascade® toestel PRP dat arm is aan leucocyten, terwijl het GPS-III® en het magellan®-toestel leucocyt-rijk PRP produceren (Castillo et al. 2011). Sutter et al. (2004) vermelden nog een methode om het PRP, verkregen via de apheresis methode, nog eens extra te filteren. Hiervoor maakt men gebruik van een commerciële filter (cellulose basis) die water en substanties met laag moleculair gewicht tegenhoudt. De concentratie bloedplaatjes is dan finaal tot 13 keer hoger dan de basisconcentratie in het bloed. Tabel 3 geeft een overzicht weer van de concentratie aan thrombocyten, leucocyten, rode bloedcellen en drie groeifactoren (TGF-b1, TGF-b2 en IGF-1) verkregen via verschillende methoden. De concentraties worden weergegeven voor (1) normaal bloed, (2) PRP en PPP bereid met de buffy coat methode, (3) PRP en PPP bereid met de apheresis methode en (4) PRP bereid met de apheresis methode gevolgd door filtratie.

14

Tabel 3: Mediaanwaarden van de variabelen in bloedfracties (Sutter et al. 2004).

In de humane geneeskunde wordt ook het gebruik van de manuele tube methode beschreven. Deze werd voor het eerste beschreven in 1999 door Anitua en is aldus de oudste, goedkoopste en meest eenvoudige methode. Doch Argüelles et al.(2006) en Ramirez (2006) tonen in een studie aan dat deze methode niet geschikt is voor de bereiding van PRP uitgaande van het bloed van paarden. De thrombocyten van paarden sedimenteren nl. op een andere manier dan de humane thrombocyten. Het gevolg is dat bij het gebruik van dit centrifugatieprotocol (450 x g gedurende 8 min) voor paardenbloed de concentratie aan thrombocyten gelijk is in de onderste (RBC) en bovenste (plasma) fractie van het bloed. In tegenstelling tot het humaan bloed waar het grootste deel van de thrombocyten zich bevindt in de buffy coat en in de eerste 75% van het plasma net boven de buffy coat. Het is dit deel van het bloed dat wordt afgezonderd van de rest en als PRP wordt beschouwd, hetgeen bij paarden aldus onmogelijk is (Ramirez 2006). 3.2. APPLICATIE VAN PRP OP DE WONDE: DE AUTOLOGE PLATELET GEL Om het vloeibare PRP makkelijker op een wondoppervlak aan te brengen wordt dit veelal eerst omgevormd naar een gelvorm. De autologe platelet gel (APG) is een biologische gel die bestaat uit een combinatie van PRP en een activator, die de gelvorming induceert. De functie van de activator is het anticoagulerende effect van citraat te antagoniseren en de bloedblaatjes te activeren waardoor de stollingsreactie in gang treedt en er een visceuze APG gevormd wordt (Everts et al. 2006). De functie van de APG is de bloedplaatjes als het ware ‘vasthouden’ in een semi-solide netwerk van gepolymerizeerd fibrine en deze activeren waardoor ze hun groeifactoren gaan vrijstellen. De vorming van de APG kan gebeuren door toevoeging van een activator aan het PRP op het moment van applicatie. Het PRP wordt dan met de activator op de wonde gesprayed (Figuur 5), waardoor

er ideaal na 10 seconden een

thrombocyten coagulaat gevormd wordt, dat een soort gel vormt (Plateltex®). De gelvorming kan ook op voorhand geïnduceerd worden in een petrischaal waarna deze gelmassa als soort van biologisch membraan op de wonde kan aangebracht worden (Everts et al. 2006, Maciel et al. 2012).

15

© Arteriocyte Medical Systems, Inc. Figuur 5: een voorbeeld van een platelet gel applicator. (Uit the Magellan® Autologous Separator System Sales Training, 2008)

Mogelijke activators van PRP zijn adenosinedifosfaat (ADP), bovien thrombine, thromboplastine, collageen, calcium chloride en calcium gluconaat of een combinatie van twee, zoals bovien trhombine en calcium chloride (Zandim et al. 2011). Lange tijd is het gebruik van bovien thrombine met 10% calcium chloride de gouden standaard geweest voor het bereiden van APG in de VS (Everts et al. 2006). Het gebruik van bovien thrombine is onder vuur komen te liggen door de problematiek van ‘de dolle koeien ziekte’. Toch zou het bovien thrombine veilig zijn, aangezien deze ziekte wordt overgedragen door prionen die enkel aanwezig zijn in het neuronaal weefsel. Het bovien thrombine daarentegen is afkomstig van het bloed en heeft een hitte-behandeling ondergaan (Marx 2004). Een ander gerapporteerd nadeel van bovien thrombine is de kans op het ontwikkelen van antistoffen tegen stollingsfactoren hetgeen kan leiden tot levensbedreigende coagulopathieën (Everts et al. 2006). Marx (2004) ontkracht dit argument daar hij beweert dat er geen antistoffen werden gevormd tegen bovien thrombine of tegen humaan thrombine, maar wel tegen bovien factor Va, een contaminant die aanwezig was in enkele commerciële bereidingen van bovien thrombine. Het waren deze antistoffen, tegen bovien factor Va, die een kruisreactie veroorzaakten tegen de humane factor Va en daardoor verantwoordelijk waren voor de coagulopathieën. Sinds 1997 is deze contaminerende factor door Gentrac geëlimineerd uit de commerciële bovien thrombine preparaten en zijn deze aldus veilig voor gebruik (Marx 2004). Een alternatief voor bovien thrombine is het gebruik van autoloog thrombine (Everts et al. 2006). Autoloog trhombine blijkt uit een studie van Textor en Tablin (2012) echter de minst geschikte activator voor de activatie van PRP van paarden. Calcium chloride (23mM) daarentegen is een zeer geschikte activator voor PRP van paarden (Textor en Tablin, 2012, Zandim et al, 2011). Eénmaal de activator is toegevoegd aan het PRP zal de stollingsreactie in gang treden en zullen de thrombocyten hun groeifactoren binnen de 10 min beginnen vrijstellen. Binnen het uur is 95% van de groeifactoren reeds vrijgesteld. Het is dus noodzakelijk dat het PRP, éénmaal het geactiveerd is, binnen de 10 min wordt geappliceerd op de wonde (R. Marx, 2004). Recenter werd het gebruik van batroxobine met calcium

gluconaat geïntroduceerd als gelactivator

(Plateltex®) (Mazzucco et al.2008). Batroxobine is een thrombine-like enzyme afkomstig van het gif van 16

de Bothrops artrox slang. Fibrinogeen wordt door thrombine omgezet in fibrine door het afsplitsen van de Fibrinogeen A en B peptiden, batroxobine daarentegen splitst enkel het fibrinopeptide A af. Thrombine activeert verschillende coagulatiefactoren zoals factor V, VIII, en XIII, thrombocyten, endotheelcellen en gladde spiercellen, batroxobine heeft op deze factoren geen directe invloed (You et al. 2004). Het verschil is aldus dat thrombocyten, behandeld met thrombine, meteen geactiveerd worden en hun groeifactoren onmiddellijk en massaal vrijstellen. Bij gebruik van batroxobine treedt er een vertraagde stollingsreactie op en gaan de thrombocyten hun groeifactoren geleidelijk gaan vrijstellen. Op deze manier zijn er langer groeifactoren beschikbaar thv de wonde (Mazzucoo et al. 2008). Op gebied van rendement, efficiëntie en het aantal vrijgestelde groeifactoren blijkt uit een studie van Mazzucco et al. (2008) dat de humane APGsystemen geactiveerd met fibrine vergelijkbaar zijn met Plateltex®. Dit werd nog niet aangetoond in een studie met paarden of kleine huisdieren. Deze gedachtengang wordt gestaafd in de studie van Zandim et al. (2011) die aantoonden dat het activeren van de thrombocyten in het PRP niet noodzakelijk is. De thrombocyten in rust die aanwezig zijn in het niet geactiveerde PRP kunnen namelijk geactiveerd worden door de endogene activerende substanties die aanwezig zijn in de wonde. Toevoeging van een exogene activator zou aldus overbodig zijn. Er zijn reeds enkele positieve resultaten bekend uit studies waarbij peesblessures bij paarden behandeld werden met PRP, dat vooraf niet geactiveerd werd met exogene substanties (Sutter et al. 2004, Smith et al. 2006, Schnabel et al. 2007, Bosch et al. 2009, McCarrel & Fortier 2009). In welke gevallen het dan wel of niet aangeraden is om het PRP te activeren is nog niet duidelijk uit de literatuur. 3.3. FIXATIE VAN DE AUTOLOGE PLATELET GEL De autologe platelet gel kan op verschillende manieren gefixeerd worden in een wondbed zoals via een vetgaas, een hydrocolloïd dressing (Carter et al. 2003), een antimicrobiële wonddressing of een (semi-) occlusieve synthetische wonddressing (Dijkmans 2009, DeRossi et al. 2009). In de studie van Cater et al. (2003), betreffende de wondbehandeling met PRP van chronische niethelende wonden, distaaal op de ledematen bij paarden, wordt de APG vanaf dag 28 gefixeerd met een semi-occlusief gaasverband en bedekt met Vet Wrap bandages. Dit stelt de wonde in staat te ‘ademen’ waardoor er minder hypergranulatieweefsel gevormd wordt. 3.4. APPLICATIEDUUR EN APPLICATIEFREQUENTIE Uit een humane literatuurstudie van Dijkmans (2009) blijkt dat er geen consensus is omtrent de applicatieduur en – frequentie. De frequentie van appliceren varieert sterk. Dit kan gaan van tweemaal per dag tot eenmaal om de 2 weken. De duur van de applicatie varieert gemiddeld van 12 uur tot 7 dagen (Dijkmans 2009).

17

Uit enkele studies bij paarden blijkt dat ook hier de applicatieduur en - frequentie sterk kan verschillen. Dit kan gaan van om de 3 à 4 dagen, en na 28 dagen om de 8 dagen, tot de wonde volledig genezen is (Maciel et al. 2012, Carter et al.2013) tot éénmaal om de 3 weken en 3 maal in totaal (Iacopetti et al. 2012). DeRossi et al. (2009) appliceren ook slechts 1 maal PRP op de wonde, waarna de wonde nadien verder verzorgt door de wonddressing regelmatig te verversen. De conclusie is aldus dat er nog geen degelijke studie voorhanden is die weergeeft wat de ideale applicatieduur en – frequentie is. Dit zal ook sterk afhangen van verschillende factoren zoals het type wonde, de grootte van de wonde, de patiënt en de kosteneffectiviteit. 4. PRP WONDBEHANDELING BIJ PAARD EN KLEINE HUISDIEREN 4.1. PRP WONDBEHANDELING BIJ PAARDEN PRP wordt bij paarden voornamelijk gebruikt in de orthopedie (Kissich et al. 2012) en het meest frequent voor de behandeling van peesletsels, waarbij de vloeibare vorm rechtstreeks in de letsels ingespoten wordt (Argüelles et al. 2008, Waselau et al. 2008, Bosch et al. 2009). Bosch et al. (2009) en Argüelles et al. (2008) tonen in hun studie het positief effect aan van PRP voor de behandeling van letsels van de oppervlakkig buigpees van het voorbeen. Typisch voor pezen is de trage heling en het nieuwgevormde peesweefsel dat functioneel inferieur is aan het oorspronkelijke peesweefsel (Bosch et al. 2009). De pezen behandeld met PRP hadden een betere treksterkte en elasticiteit in vergelijking met de controletherapieën. Net zoals bij de wondheling is dit het resultaat van de gestegen mitogene activiteit, de betere organisatie van het collageen en de gestegen metabolische activiteit, allen te wijten aan de hoge concentratie aan groeifactoren in het PRP (vnl. PDGF en TGF-ß) (Bosch et al. 2009). Waselau et al. (2008) behandelden met succes milde tot ernstige letsels van de interosseus bij racepaarden. Alle paarden konden na behandeling opnieuw racen, hetgeen zeer positief is, aangezien een interosseusletsel vaak het einde van een carrière als racepaard betekent (Waselau et al. 2008). Carmona et al. (2005) tonen aan dat PRP ook met succes gebruikt kan worden voor de behandeling van osteoarthritis en osteochondrose. In de humane geneeskunde zijn er reeds enkele positieve resultaten voorhanden die het positief effect van PRP aantonen voor de behandeling van wonden (Margolis et al. 2001, R. Marx 2004, Cieslik-Bielecka et al. 2009, Yuan et al. 2009). Het gebruik van PRP voor de behandeling van wonden bij paarden is nog vrij beperkt, maar toch worden er reeds enkele positieve resultaten in verschillende studies gerapporteerd (Carter et al. 2003, DeRossi et al. 2009, Iacopetti et al. 2012, Maciel et al. 2012). Wonden distaal aan de ledematen bij paarden helen doorgaans slecht, zelfs bij dieren die klinisch perfect gezond zijn. Dit resulteert in chronisch moeilijk helende wonden met veel hypergranulatieweefsel waardoor de epithelisatie en de wondcontractie op hun beurt in het gedrang komen (Dart et al. 2005). De 18

wondheling bij pony’s verloopt doorgaans beter dan bij paarden. De reden hiervoor is de sterkere initiële inflammatiefase bij pony’s en de daardoor hogere productie van ontstekingsmediatoren (Dart et al. 2005). De oorzaak van de slecht helende wonden distaal aan de ledematen bij paarden is de inefficiënte inflammatoire respons, de minder goede bloedvoorziening en aldus lagere O2-voorziening, de lagere temperatuur, het onevenwicht tussen collageensynthese en –afbraak, de gebrekkige apoptose van de cellulaire componenten van het hypergranulatieweefsel en de minder goede verhouding van de groeifactoren (DeRossi et al. 2009, Monteiro et al. 2009). Binnen de eerste 24 uur na verwonding is er een sterke stijging van de pro-fibrotische isovormen van TGF-ß, nl. TGF-ß1 en TGF- ß2. Vijf tot negen dagen na verwonding zal TGF-ß1 dalen, waardoor het anti-fibrotische TGF- ß3 sterk zal stijgen. TGF- ß3 zorgt er aldus voor dat de inflammatiefase binnen bepaalde grenzen blijft en er geen overmatige ontwikkeling is van hypergranulatieweefsel. Bij wonden distaal aan de ledematen bij paarden is er een initiële zwakke inflammatiefase die persisteert door continu hoge concentraties aan TGF-ß1, waardoor TGF- ß3 bijgevolg onvoldoende gaat stijgen (Dart et al. 2005). Deze problematische

wondheling wordt doorgaans niet

waargenomen bij wonden thv thorax en het hoofd bij paarden (Monteiro et al. 2009). De behandeling van wonden, inclusief brandwonden, met PRP leidt tot snellere epithelisatie en een betere organisatie van de nieuwgevormde collageenbundels in de huid in vergelijking met de controletherapieën (Carter et al. 2003, DeRossi et al. 2009, Maciel 2012). Dit zowel voor wonden thv de ledematen (Carter et al. 2003) als thv de hals (DeRossi et al. 2009). In een ‘case report’ van Iacopetti et al. (2012) werd een grote, slecht helende, necrotische wonde in de elleboogstreek van een 17-jarige Arabische merrie met succes behandeld met PRP (zie bijlage I). De klinische verbetering van de wonde was vrijwel meteen zichtbaar na applicatie van het PRP. Er was duidelijk minder exsudaat en fibrinevorming aanwezig en er werd granulatieweefsel gevormd. Vijf maanden na de eerste behandeling was de wondheling voltooid met minimaal littekenweefsel en een goed esthetisch resultaat. Nog eens een half jaar later was de haargroei tenslotte ook voltooid. Deze positieve resultaten op de heling van wonden distaal aan de voorbenen bij paarden worden echter niet waargenomen in een experimentele studie van Monteiro et al. (2009). Zij concluderen dat de wondbehandeling met PRP vooral effectief zou zijn voor wonden met veel weefselverlies of chronische moeilijk helende wonden met een gebrek aan voldoende mediatoren voor de heling. Voor acute ‘propere’ wonden distaal aan de ledematen bij paarden, zoals in deze studie, konden zij echter geen versnelde heling waarnemen in vergelijking met de standaard wondbehandeling. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat de concentratie aan groeifactoren in het PRP aan de lage kant is in vergelijking met de studie van DeRossi et al. 2009. De concentratie aan groeifactoren is respectievelijk 3,5 keer hoger (Monteiro et al. 2009) en 4 tot 8 keer hoger (DeRossi et al. 2009) dan de basisconcentrie in het bloed. Doch de concentratie aan thrombocyten in de studie van Monteiro et al. (2009) is niet significant verschillend met de concentratie aan trhombocyten in de studie van Carter et al. (2003) en Iacopetti et al. (2012). Het PRP wordt in de studie van Monteiro et al. (2009) echter wel bereid met de manuele tube methode, hetgeen voor paardenbloed geen geschikte methode is (Ramirez, 2006). In de andere studies daarentegen (Carter

19

et al., 2003, DeRossi et al. ,2009, Iacopetti et al.,2012,) wordt gebruik gemaakt van de dubbele centrifugatie methode. Naast de concentratie aan thrombocyten is ook de tijd tussen het activeren van het PRP en het appliceren van de APG belangrijk. Deze varieert van onmiddellijke applicatie (Monteiro et al. 2009, Iacopetti et al. 2012) tot 40 min na activatie (DeRossi et al. 2009). Marx (2004) beveelt aan dat de gel binnen de 10 min op de wonde moet worden geappliceerd, hetgeen zou kunnen betekenen dat de resultaten waargenomen in bepaalde studies (DeRossi et al. 2009, Carter et al. 2003) nog zouden kunnen verbeterd worden door de gel na activatie sneller te appliceren. Uit deze studies blijkt aldus dat de bereiding van het PRP en de applicatie van de APG sterk kan verschillen en dit niet altijd volgens de regels van de kunst gebeurt, hetgeen de betrouwbaarheid van de resultaten kan beïnvloeden. 4.2. PRP WONDBEHANDELING BIJ KLEINE HUISDIEREN Over het gebruik van PRP bij de behandeling van wonden bij kleine huisdieren is slechts zeer weinig literatuur voorhanden. Kovacs et al. (2005) en Suaid et al. (2009) evalueren het gebruik van PRP in de tandheelkunde bij honden. Zij concluderen dat PRP zorgt voor een snellere vorming van cement en een betere heling en mineralisatie van het alveolair botweefsel (Kovacs et al. 2005, Suaid et al. 2009). Suaid e

et al. (2009) behandelen 2 graads furcatieletsels bij de hond met PRP in combinatie met ‘guided tissue regeneration (GTR)’ en ‘bioactive glass (BG)’ hetgeen resulteerde in een betere periodontale regeneratie. Dit is het gevolg van de stimulerende werking van de groeifactoren, in het PRP, op de groei en differentiatie van het periodontaal ligament en het alveolaire bot. Een ander voordeel van het PRP is dat het dankzij zijn hoge concentratie aan fibrine een kleverige consistentie heeft, waardoor het de botgreffe stabiliseert. In een ‘case studie’ van Kim et al. (2009) werd een necrotische wonde aan de staart bij een hond behandeld met PRP. Na 2 weken met standaard wondbehandeling (fysiologische zoutoplossing + cephalexin®) was er nog geen verbetering zichtbaar in de wondheling. Het PRP werd bereid a.d.h.v. de dubbele centrifugatiemethode en de concentratie thrombocyten in het PRP bedroeg 1.0 – 1.2 × 10

6

thormbocyten/µL. Het PRP werd vervolgens geactiveerd met 10% calcium chloride en onmiddellijk na activatie werd de PRP-gel op de wonde geappliceerd. Welke wonddressing er werd gebruikt om de PRPgel te fixeren wordt in deze studie niet vermeld. Twee dagen na applicatie was de wonde klinisch reeds zichtbaar beter en na 14 dagen was de necrotische huid bijna volledig geregenereerd. Na 4 weken was ook de zwelling weg, waren er geen korsten en erosies meer aanwezig en was er beginnende haargroei aan de randen van het letsel. Na 2 maanden was de haargroei t.h.v. de wonde compleet maar was er wel hyperpigmentatie aanwezig. Deze is na 4 maanden spontaan verdwenen. (Bijlage II)

20

BESPREKING Omtrent de PRP-wondbehandeling bij dieren zijn de experimentele en klinische studies nog zeer beperkt. Toch zijn er reeds veel positieve resultaten uit de humane geneeskunde voorhanden (Whitman et al. 1997, Marx et al. 1998, Margolis et al., 2001, Crovetti et al. 2004, Marx 2004, Yuan et al. 2009), waardoor het gebruik van PRP-wondbehandeling zowel in de humane als in de diergeneeskunde toeneemt. Het moeilijke aan het vergelijken van de verschillende studies zijn de verschillende bereidingsmethoden van PRP en de PRP-gel. Er is in de studies geen éénduidigheid over welke methode, welke apparatuur en welke activator het meest geschikt zijn om PRP-gel van goede kwaliteit, d.w.z. voldoende hoge concentratie en minimale beschadiging van de thrombocyten, te verkrijgen. Wel zou de apparatuur moeten voldoen aan de normen van de Food and Drug Administration (FDA) (USA) of de Certification Europe Organisation (R. Marx 2004). De kostprijs van de PRP-wondbehandeling is afhankelijk van de bereidingsmethode en de gebruikte apparatuur en is aldus moeilijk te bepalen. Toch wordt in enkele studies gemeld dat er aan minimale kostprijs toch degelijk PRP kan bereid worden (Everts et al. 2006, Argüelles et al., 2006, Textor en Tablin 2012). PRP wordt in de diergeneeskunde hoofdzakelijk gebruikt in de orthopedie bij paarden en het meest frequent voor de behandeling van peesletsels (Carmona et al. 2005, Argüelles et al. 2008, Waselau et al. 2008, Bosch et al. 2009, Kissich et al. 2012). De resultaten van deze studies zijn veelbelovend net zoals de voorlopig beperkte resultaten omtrent wondbehandeling (Carter et al. 2003, DeRossi et al. 2009, Iacopetti et al. 2012, Maciel et al. 2012). De wondbehandeling met PRP zou vooral effectief zijn voor chronische moeilijk helende wonden, geïnfecteerde wonden en wonden met veel weefselverlies (Monteiro et al.,2009). Wat betreft het gebruik van PRP bij kleine huisdieren zijn nog minder resultaten bekend dan bij paarden. Enkele zeldzame studies melden een positief resultaat na wondbehandeling van chronische moeilijk helende wonden (Kim et al. 2009) en in de tandheelkunde (Suaid et al. 2009).

21

REFERENTIELIJST 1. Alsousou J., Thompson M., Hulley P., Noble A. & Willett K, (2009), The biology of platelet-rich plasma and its application in trauma and orthopaedic surgery, J. Bone Joint Surg Brit., 91b, 987-996. 2. Álvareza M.E., Lópeza C., Giraldoa C.E., Samudioc I. & Carmona J.U., (2011), In vitro bactericidal activity of equine platelet concentrates, platelet poor plasma, and plasma against methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Arch Med Vet, 43, 155-161 3. Anitua E., (1999), Plasma rich in growth factors: preliminary results of use in the preparation of future sites for implants. International Journal of Maxillofacial Implants, 14, 529-535. 4. Argüelles D, Carmona J.U., Pastor J., Iborra A., Vinals L., Martinez P., Bach E. & Prades M., (2006), Evaluation of single and double centrifugation tube methods for concentrating equine platelets, Research in Veterinary Science, 81, 237-245 5. Argüelles D., Carmona J.U., Climent F., et al., (2008), Autologous platelet concentrates as a treatment for musculoskeletal lesions

in five horses, Vet Rec, 162, 208 – 211.

6. Bielecki T.M., Gazdzik T.S., Arendt J., Szczepanski T., Król W. & Wielkoszynski T., (2007), Antibacterial effect of autologous platelet gel enriched with growth factors and other active substances: AN IN VITRO STUDY, J Bone Joint Surgery, 89-B, 417-420. 7. Blair P. & Flaumenhaft R, (2009), Platelet α-granules: basic biology and clinical correlates, Blood, 23, 177-189. 8. Blockmans D., Deckmyn H. & Vermylen J, (1995), Platelet activation, Blood, 9, 143-156. 9. Bosch G., van Schie H.T.M., Groot M.W., Cadby J.A., van De Lest C.H.A., Barneveld A. & van Weeren P.R., (2009), Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: a placebo-controlled experimental study, Journal of Orthopaedic Research, 28, 211-217. 10. Carmona J.U., Argüelles D., Climent F., Prades M., Soler R,. Vidal F., Orozco L., (2005), Autologous platelet-rich plasma injected intraarticularly diminished synovial effusion and degree of lameness in horses affected with severe joint disease, Part of this study was presented as an oral communication in the resident forum of the 14th Annual Scientific Meeting of the European College of Veterinary Surgeons. Lyon, France. July 7-9, 2005. 11. Carter A.C., Jolly D.G., Worden Sr. C. E., Hendren D.G., Kane C.J.M. (2003), Platelet-rich plasma gel promotes differentiation and regeneration during equine wound healing, Experimental and molecular pathology, 74, 244-255. 12. Castillo T.N., Pouliot M.A., Kim H.J. & Dragoo J.L., (2010), Comparison of Growth Factor and Platelet Concentration From Commercial Platelet-Rich Plasma Separation Systems, American Journal of Sports Medicine, 39, 266 – 272. 13. Cieslik-Bielecka A., Bielecki T., Gazdzik T.S., Arendt J., Król W. & Szczepanski T.,

(2009),

Autologous platelets and leukocytes can improve healing of infected high-energy soft tissue injury, Transfusion and Apheresis Science, 41 , 9–12 22

14. Crovetti G, Martinelli G, Issi M, Barone M, Guizzardi M, Campanati B, Moroni M, Carabelli A, (2004), Platelet gel for healing cutaneous chronic wounds, Transfusion and Apheresis Science, 30, 145-151. 15. Dart A.J., Dowling B.A., Smith C.L., (2005), Topical Treatments in Equine Wound Management, Vet Clin Equine, 21, 77-89 16. DeRossi R., Anciliero de Oliveira Coelho A.C., Silveira de Mello G., Frazilio F.O., Leal C.R.B., Goncalves Facco G. & Bonucieli Brum K., (2009), Effects of platelet-rich plasma gel on skin healing in surgical wound in horses, Acta Cirurgica Brasileira, 24, 276-280. 17. Dijkmans E., (2009), Hoe effectief is autologe bloedplaatjes gel bij veneuze ulcera? Een literatuurstudie, WCS nieuws, 25, 58-60. 18. Everts P.A.M., Knape J.T.A., Weibrich G., Schönberger J.P.A.M., Hoffmann J., Pverdevest E.P., Box H.A.M. & van Zundert A, (2006), Platelet-rich plasma and platelet gel: a review, The Journal of The American Society of Extra Corporeal Technology, 38, 174-187. 19. Ferrari M., Zia S., Valbonesi M., Henriguet F., Venere G., Spagnolo S., Grasso M.A., Panzani I., (1987), A new technique for hemodilution, preparation of autologous platelet-rich plasma and intraoperative blood salvage in cardiac surgery. International Journal of Artificial Organs, 10, 47–50. 20. Haynesworth S.E., Kadiyala S., Liang L.N., et al., (2002), Mitogenic stimulation of human mesenchymal stem cells by platelet release suggest a mechanism for enhancement of bone repair by platelet concentrates. Presented at the 48th Meeting of the Orthopedic Research Society, Boston, MA 21. Iacopetti I., Perazzi A., Ferrari V. & Busetto R., (2012), Application of Platelet-Rich Gel to Enhance Wound Healing in the Horse: A Case Report, Journal of Equine Veterinary Science, 32, 123-128. 22. Kissich C., Gottschalk J., Lochmann G., Einspanier A., Böttcher P., Winter K., Brehm W. und Claude Ionita J.-C., (2012), Biochemische Eigenschaften des equinen Autologous Conditioned Plasma® (ACP), Pferdeheilkunde, 28, 258-267. 23. Knighton D.R., Cirisi K., Fiegel V.D., Schumerth S., Butler E. & Cerra F., (1990), Stimulation of repair in chronic, non healing, cutaneous ulcers using platelet-derived wound healing formule. Surg Gynecol Obstet, 170, 56–60. 24. Kovacs K., Velich N., Huszar T., Fenyves B., Suba Z., Szabo G., (2005), Histomorphometric and densitometric evaluation of the effects of platelet-rich plasma on the remodeling of beta-tricalcium phosphate in beagle dogs, JOURNAL OF CRANIOFACIAL SURGERY, 16, 150-154 25. Koveker GB., (2000), Growth factors in clinical practice, Internal Journal of Clinical Practice, 54, 590593. 26. Maciel F.B., DeRossi R., Modolo T.J.C., Pagliosa R.C., Leal C.R.J., Delben A.A.S.T., (2012), Scanning electron microscopy and microbiological evaluation of equine burn wound repair after plateletrich plasma gel treatment, Elsevier, 38, 1058-1065 27. Margolis D.J., Kantor J., Santanna J., Strom B.L., Berlin J.A., (2001), Effectiveness of platelet releasate for the treatment of diabetic neuropathic foot ulcers, Diabetes Care, 24, 483–8. 28. Marx R.E., Carlson E.R., Eichstaedt R.M., Schimmele S.R., James E Strauss J.E., Georgeff K.R., (1998), Platelet-rich plasma: Growth factor enhancement for bone grafts, Oral Surg Oral Med Oral Pathol 23

Oral Radiol Endod, 85, 638 29. Marx R.E., (2001), Platelet-Rich Plasma (PRP): What is PRP and What Is Not PRP?, Reprinted from IMPLANT DENTISTRY, 10, 225-228. 30. Marx R.E., (2004), Platelet-Rich Plasma: Evidence to Support Its Use, Journal of Oral Maxillofacial Surgery, 62, 489-496. 31. Mazzucco L., Balbo V., Cattana E. & Borzini P., (2008), Platelet-rich plasma and platelet gel preparation using Plateltex®, Journal compilation © 2008 Blackwell Publishing Ltd. DOI: 10.1111/j.14230410.2007.01027.x 32. McCarrel T. & Fortier L., (2009), Temporal growth factor release from platelet-rich plasma, trehalose lyophilized platelets, and bone marrow aspirate and their effect on tendon and ligament gene expression, Journal of Orthopaedic Resaerch, 27, 1033-1042. 33. Monteiro S.O., Lepage O.M., Theoret C.L., (2009), Effects of platelet-rich plasma on the repair of wounds on the distal aspect of the forelimb in horses, American Journal of Veterinary Research, 70, 277282. 34. Pretorius E., Briedenhann S., Marx J., Smit E., Merwe C.V.D., Pieters M. & Franz C., (2007), Ultrastructural comparison of the morphology of three different platelet and fibrin fiber preparations, Anatomical record-advances in integrative anatomy and evolutionary biology, 290 , 188-198 35. Ramirez J. U. C., (2006), Use of autologous platelet concentrates for the treatment of musculoskeletal injuries in the horse, PhD Thesis, supervised by Professor Marta Prades Robles, Department of Animal Medicine and Surgery, Faculty of Veterinary Medicine, Universitat Autònoma de Barcelona 36. Robey P.G., Young K.C., Flanders K.C., Roche N.S., Kondaiah P., Reddi A.H., Termine J.D., Sporn M.B., Roberts A.B., (1987), Osteoblasts synthesize and respond to transforming growth factor-type beta (TGF-beta) in vitro, Journal of Cell Biology, 105, 457–6 37. Schnabel L.V., Mohammed H.O., Miller B.J., McDermott W.G., Jacobson M.S., Santangelo K.S. & Fortier L.A. 2007. Platelet Rich Plasma (PRP) enhances anabolic gene expression patterns in flexor digitorum superficialis tendons, Journal of Orthopaedic Research, 25, 230-240. 38. Smith J.J., Ross M.W. & Smith R.K.W., (2006), Anabolic effects of acellular bone marrow, platelet rich plasma, and serum on equine suspensory ligament fibroblasts in vitro. Vet. Comp. Orthop. Traumatol, 19, 43-47. 39. Steed D.L., (1997), The role of growth factors in wound healing, Surgical clinics of North America, 77, 575-586 40. Sutter W.W., Kaneps A.J. & Bertone A.L., (2004), Comparison of hematologic values and transforming growth factor-beta and insulin-like growth factor concentrations in platelet concentrates obtained by use of buffy coat and apheresis methods from equine blood, American Journal of Veterinary Research, 65, 924930. 41. Suaid F.F., Carvalho M.D., Ambrosano G.M.B., Nociti Junior F.H., Casati M.Z., Sallium E.A., (2009), Platelet-rich plasma in the treatment of Class II furcation defects: a histometrical study in dogs, Journal of applied oral science., 20, 162-169. 24

42. Tang Y.Q., Yeaman M.R., Selsted M.E., (2002), Antimicrobial peptides from human platelets, Infection and immunity, 70, 6524-6533. 43. Textor J.A. & Tablin F., (2012), Activation of Equine Platelet-Rich Plasma: Comparison of Methods and Characterization of Equine Autologous Thrombin, Veterinary Surgery, 41, 784–794 44. Waselau M., Sutter W.W., Genovese R.L., et al., (2008), Intralesional injection of platelet-rich plasma followed by controlled exercise for treatment of midbody suspensory ligament desmitis in Standardbred racehorses, Journal of American Veterinary Medicine Association, 232,1515–1520. 45. Weibrich G., Hansen T., Kleis W., Buch R., Hitzler W.E., (2004), Effect of platelet concentration in platelet-rich plasma on peri-implant bone regeneration, Bone, 34, 665–71. 46. Whitman D.H., Berry R.L. & Green D.M., (1997), Platelet Gel: An Autologous Alternative to Fibrin Glue With Applications in Oral and Maxillofacial Surgery, Journal of Oral Maxillofacial Surgery, 55, 1294-1299. 47. You W.K., Choi W.S., Koh Y.S., Shin H.C., Jang Y., Chung K.H., (2004), Functional characterization of recombinant batroxobin, a snake venom thrombin-like enzyme, expressed from Pichia pastoris, FEBS Letters, 571, 67–73 48. Yuan T., Zhang C., Tang M., Guo S., Zeng B., (2009), Autologous Platelet-rich Plasma Enhances Healing of Chronic Wounds, Wounds, 21, 280-285 49. Zandim B.M., de Souza M.V., Magalhães P.C., Benjamin L.A., Maia L., de Oliveira A.C., Pinto J. & Ribeiro J.I., (2011), Platelet activation: Ultrastructure and morphometry in platelet-rich plasma of horses, Pesquisa Veterinaria Brasileira, 32, 83-92. 50. Zimmermann R, Arnold D, Strasser E, et al., 2003, Sample preparation technique and white cell content influence the detectable levels of growth factors in platelet concentrates, Vox Sang, 85, 283-289.

25

BIJLAGEN Bijlage I: Evolutie van de wondheling na PRP-behandeling. (Uit Iacopetti et al. (2012))

Foto 1 (links): Initiële ‘verse’ wonde. Foto 2 (rechts): Wonde na debridement en primair hechten (drain aanwezig).

Foto 3 (links): wonddehiscentie 2 dagen na hechten. Foto 4 (rechts): De wonde 10 dagen na de initiële verwonding: slecht helende wonde met necrose.

Foto 5 (links): De wonde twee weken na de PRP-behandeling. Foto 6 (rechts): De wonde vijf weken na de PRP-behandeling: kleiner en met duidelijk zichtbaar nieuwgevormd gevasculariseerd weefsel.

26

Foto 7: De wonde 4 maanden posttrauma: duidelijke klinische verbetering. Foto 8: Finaal resultaat na 12 maanden: klein litteken met haargroei.

Bijlage II: Evolutie van de wondheling na PRP-behandeling bij een 10-jarige gecastreerd shih-tzu reu (Uit een studie van Kim et al. (2009)). (a) 1 week na biopsiename was er duidelijk necrose aanwezig thv de biopsieplaats. (b) 2 weken na biopsiename was er nog steeds necrose aanwezig en daarom werd besloten om de wonde te behandelen met PRP. (c) De wonde 2 dagen na de PRP-applicatie. Er is een duidelijke verbetering van de korsten en erosies zichtbaar. (d) 14 dagen na applicatie van de PRP is er een duidelijke klinische verbetering

en

omvangsvermindering

van

de

wonde

zichtbaar. (e) 6 weken na de PRP- applicatie is de wondheling compleet. Er is nog hyperpigmentatie zichtbaar. (f) 4 maanden na PRP-applicatie is de wonde volledig hersteld met normale haargroei en de hyperpigmentatie is verdwenen.

27