1
2
3
Úloha a postavenie Komisie Codex Alimetarius pri využívaní geneticky modifikovaných organizmov v potravinách Siekel, P. – Bergerová, E. – Lopašovská, M. – Stankovská, M. Výskumný ústav potravinársky, Priemyselná 4, P.O.BOX 25, 824 75, Bratislava 26
Úvod Komisia Codex Alimentarius vznikla z iniciatívy OSN menovite FAO a WHO v roku 1963 s cieľom vytvorenia štandardov pre výrobu potravín. Ideovým predchodcom bolo založenie Medzinárodnej mliekarenskej federácie v roku 1903, ktorá vypracovala medzinárodné štandardy pre mlieko a mliečne produkty. Kódexová tvorba štandardov, odporúčaných postupov, a iných k nim sa vzťahujúcich textov, sa uskutočnila pod hlavičkou Programu štandardov pre potraviny. Hlavným cieľom programu bola ochrana zdravia spotrebiteľov, a zabezpečenie rovnakých podmienok pri obchodovaní s potravinami, a zároveň podpora koordinácie prác na tvorbe štandardov potravín medzinárodných vládnych a mimovládnych organizácií. CAC je medzinárodný orgán, ktorý realizuje Spoločný program FAO/WHO pre potravinárske normy s cieľom zabezpečiť: 1. porovnateľnú úroveň kvality potravín v záujme ochrany zdravia spotrebiteľov na celom svete a 2. správne postupy pri obchodovaní s potravinami. Členmi CAC sú jednotlivé štáty, ktorých vlády sú zodpovedné za prípravu a uplatňovanie kódexových noriem a limitov. Svetová organizácia pre obchod (WTO) uznáva legislatívu Codex Alimentarius za celosvetový štandard. Slovenská republika bola r. 1994 schválená za riadneho člena CAC. Pravidlá fungovania orgánov a členských štátov CAC definuje Procedurálny manuál CAC. Naviac sa v roku 2003 k jednotlivým štátom pripojila ako člen CAC aj Európska únia a to v nadväznosti na rozhodnutie Rady EÚ zo 17. novembra 2003 o prístupe Európskeho spoločenstva ku Komisii Codex Alimentarius (2003/822/EC). Na základe schválenia na 27.
4
zasadnutí Komisie Codex Alimentarius (Ženeva, 28. jún - 3. júl 2004) je Európska únia riadnym členom CAC. V rámci EÚ sú aktivity jednotlivých členských štátov v CAC koordinované. Aktivity CAC sú sústredené do práce výborov, a to výborov pre všeobecné otázky, označovaných aj ako „horizontálne“ výbory a do komoditných výborov. Komoditné výbory riešia problematiku vymedzenú príslušnou komoditou a štandardom pre ňu napr. cereáliami, cukroma pod. Naproti tomu horizontálne výbory riešia problematiku hygieny, hodnotenia rizík, vzorkovania a analýzy, inšpekcie a certifikácie, zaoberajú sa kontaminantami (maximálnymi limitmi, detekciou, prevenciou), prídavnými látkami (limitmi), reziduami pesticídov (maximálnymi limitmi), reziduami veterinárnych liečiv (maximálnymi limitmi), a tiež regionálnymi pravidlami. Materiály sa prerokovávajú a schvaľujú v Kódeových stupňoch tzv. krokoch. Spolu je ich osem, v opodstatnených prípadoch môžu byť materiály vrátené do nižších krokov. V rámci výborov bývajú, podľa potreby, vytvorené pracovné skupiny (Task Forces ako aj Working Groups).
Biotechnologicky produkované potraviny a GMO V súvislosti s používaním geneticky modifikovaných organizmov v procese výroby potravín bola, na presne stanovenú dobu, vytvorená „Pracovná skupina pre potraviny pripravené pomocou biotechnológií“. Prvá etapa trvala od roku 1999 do 2003, nasledovaná etapou 2005 – 2009. Okrem toho fungovali tzv. spoločné expertné zasadnutia a konzultácie FAO/WHO. Konali sa nasledovne: 2000 - Biotechnológie a bezpečnosť potravín 2001 – Bezpečnostné aspekty geneticky modifikovaných potravín rastlinného pôvodu 2003 – Hodnotenie alergénnosti geneticky modifikovaných potravín 2003 - Bezpečnostné aspekty geneticky modifikovaných potravín živočíšneho pôvodu vrátane rýb 2007 – Expertné konzultácie o biotechnológii a bezpečnosti potravín
5
Problematika potravín pripravených pomocou biotechnológií sa dotýka práce viacerých výborov, napr. Výboru pre označovanie, Výboru všeobecné princípy, Výboru pre analýzy a vzorkovania a tiež komoditných výborov. Výbor pre analýzy a vzorkovanie rokoval o potravinách produkovaných pomocou biotechnológií a uvádza, že ISO and CEN vypracovali niekoľko metód pre kvalitatívne a kvantitatívne stanovenie GMO. Výbor pre označovanie v tomto roku opätovne rokoval o označovaní GM potravín a krmív, k jednotnému označovaniu na medzinárodnej úrovni zatiaľ nie sú vytvorené podmienky (Január 2008).
Detekcia geneticky upravených potravín
V roku 2000 na základe iniciatívy Pracovnej skupiny pre potraviny pripravené pomocou biotechnológií vznikla Pracovná skupina pre analytické metódy (WGAM). Úlohou WGAM bolo spracovať zoznam dostupných analytických metód pre detekciu či identifikáciu potravín a ich zložiek pripravených pomocou biotechnológií a tiež vyznačiť ich spoľahlivosť a stupeň validácie. V roku 2002 bol tento zoznam prerokovaný v Kódexovom Výbore pre metódy analýzy a vzorkovanie (CCMAS) s dodatkom, že metódy na detekciu / identifikáciu GMO sú alternatívne, využívajú DNA alebo proteíny kódované vloženým génom. Následne v roku 2004 boli v tomto výbore prerokované „Kritériá metód pre detekciu a identifikáciu potravín pripravených pomocou biotechnológií. Experti FAO, WHO a ILSI sa podieľali na pracovnom stretnutí – workshope, a prezentovali skúsenosti s metódami, najmä ako ovplyvňuje biologická povaha matríc výsledky skúšok, a ako sú tieto metódy štandardizované aj v rámci ISO.
Označovanie GM potravín Diskusia na tému označovania sa datuje od 90tych rokov. Cieľom bolo vypracovať pravidlá pre označovanie. Treba konštatovať, že Kódexovému výboru pre označovanie potravín (CCFL) sa to doteraz nepodarilo. Práce naďalej pokračujú, na 34 zasadnutí bol v roku 2007 vypracovaný návrh pravidiel pre označovanie, ktorý je zatiaľ v kroku 7 schvaľovacieho procesu.
6
Literatúra: http://www.fao.org/ag/agn/agns/biotechnology_codex_en.asp http://www.fao.org/ag/agn/agns/biotechnology_expert_en.asp http://www.fao.org/ag/agn/agns/biotechnology_detection_en.asp http://www.fao.org/ag/agn/agns/biotechnology_faowho_en.asp http://www.fao.org/ag/agn/agns/biotechnology_labelling_en.asp
7
Možnosti detekce GMO – současný stav a perspektivy Jaroslava Ovesná VÚRV Praha, v.v.i.,Drnovská 507, 161 05Praha 6 – Ruzyně, ČR e.mail
[email protected]
Geneticky modifikované organismy se staly součástí potravního řetězce. Jejich produkce meziročně roste stejně jako typy dostupných GMO. Kromě GM odolných vůči herbicidům a hmyzím škůdcům jsou na pořadu dne i GM s kombinovanou rezistencí a GM s pozměněnými nutričními hodnotami. Očekává se vývoj odrůd odolných k suchu i houbovým patogenům. Ve vývoji jsou i transgenní zvířata očekává se brzké uvolnění transgenních lososů. Na tento vývoj musí být připraveny i detekční a kontrolní laboratoře. Klířová slova: GMO detekce, rostliny, zvířata
Úvod Geneticky modifikované organismy (GMO), jsou produktem moderních biotechnologií organismy kromě člověka, jejichž dědičný materiál (DNA) byl změněn genetickou modifikací. Genetická modifikace je cílená změna dědičného materiálu organismu způsobem, kterého se nedosáhne přirozenou rekombinací, a to vnesením cizorodého dědičného materiálu do dědičného materiálu organismu nebo vynětí části dědičného materiálu z organismu. I přes nepochybné rozšíření GM mikroorganismů, které se využívají pro produkci cenných látek (farmaceutická výroba) a některých potravinových doplňků a dokonce byly vyvinuty bakterie, které produkují proteiny bohaté na lyzin nebo histidin. Ty pomohou jako krmivo vstupovat do potravního řetězce. Nejvíce diskutovanou skupinou GM organismů jsou však geneticky modifikované rostliny. Pokud se využívají, je třeba je pěstovat na poli, kde jsou součástí životního prostředí. Vstupují do potravního řetězce až už přímo nebo jako krmivo pro hospodářská zvířata. Jednou z prvních široce testovaných plodin byly v Kanadě brambory odolné vůči mandelince bramborové. Brzy se objevily plodiny odolné proti herbicidům a hmyzím škůdcům. Komerčního úspěchu se dočkala sója odolná vůči herbicidu Roundup. Snižuje vstupy do výroby sójových bobů a umožňuje efektivní boj s plevely v této plodině. V současné době až 80% světové produkce sóji je právě tato RR sója. Herbicid, který se využívá, je herbicidem totálním, působí na gen EPSPH, jehož produkt se účastní syntézy aromatických aminokyselin. . Sója se do ČR dováží a transgenní sója je součástí krmných směsí. Široce se ve světě pěstují plodiny, zejména kukuřice a bavlník, kteří odolávají vůči hmyzím škůdcům. Dnes jsou k dispozici odrůdy kukuřice, které odolávají ataku zavíječe kukuřičného nebo bázlivce. Takové GM odrůdy se pěstují i v ČR (MON810). V oblastech výskytu tohoto škůdce je využívání GM kukuřice ekonomicky výhodné (obr,1 a 2). Výrobci GM odrůd pří představování nejbližších programů uvádějí, že jsou schopni připravit odrůdy,které kombinují několik typů odolností. Např. odolnost vůči hmyzu a odolnost vůči herbicidům. Je možné vnášet odolnost až vůči 5 typů komerčně využívaných herbicidů. Taktéž existuje několik genů odolnosti vůči hmyzu. Tak jedna odrůda může kumulovat až 7 – 9 transgenních událostí. Tyto programy jsou zaměřeny zejména na kukuřici.
8
GM sója v tomto ohledu není takto rozpracovaná. Největšími producenty GM plodin jsou USA (zjm sójové boby, kukuřice, bavlna, řepka, papaya) s plochou 57.7 mil. ha v r. 2007, Argentina (sójové boby, kukuřice, bavlna na ploše 19,1 mil. ha, Brazílie (sója, bavlna) a 16 mil ha, Kanada (sójové boby, kukuřice, sója) s 7,6 mil ha a Indie (bavlník) 6 mil ha. Následovaná Čínou. Z těchto zemí lze očekávat importy GM plodin a eventuálně možné kontaminace v EU dosud neschválenými modifikacemi.
Nárůst využívání GM plodin ve světě (podle J.Clives, 2008, ISAAC)
Podíl produkce GM v rámci druhů (J.Clives, ISAAC, 2008)
9
Očekávaný vývoj v oblasti GM rostlin: Kromě kombinovaných rezistencí u kukuřice a bavlníku (herbicid a insekt rezistentní) lze již v příštím roce očekávat minimálně v USA sóju s vyšším obsahem kyseliny olejové a brzy by se měla objevit sója s vyšším obsahem omega-3mastné kyselinyGM zvířata jsou zatím ve vývoji. Očekává se uvolnění transgenního lososa v USA. Nejasná situace je na Kubě a v Číně. Velká hospodářská zvířata se ve svých GM formách používají spíše jako experimentální materiál (obr. 3)
.
Obr. 3 Vývoj transgenních zvířat pokračuje, zjm. s vývojem nových metod přenosu genů (Dalian, 2008). Obr. 3: Možné využití transgenní zvířat - (1) využití v živočišné výrobě (odolnost k nemocem, zlepšení užitkovosti), (2) využití ve výrobě farmak, (3) využití jako dárce orgánů, (4) modelové organismy Detekce GMO Stále vychází z metod na bázi PCR. Stanovuje se pomocí klasické PCR a real-time PCR. Metody na bázi proteinů nejsou příliš rozšířené. Docházá k vývoji nových postupů založených zjm na DNA čipech a hybridizaci. Metody, které byly představeny na Světové konferenci detekce GMO v Comu a na světové konferenci o biotechnologiích v Dalianu bylyyatím představeny méně výkonné metody s poměrně vysokou náročností na vybavení a materiál. Prokazuje se stále potřeba kvalitních referenčních materiálů, které jsou nedostatkové. . Takové produkty musí být pečlivě vyhodnoceny s ohledem na zdravotní bezpečnost produktu. V letech 2012 -2015 se očekávají rýže, pšenice a kukuřice odolné vůči suchu a zasolení. Pracuje se na odrůdách odolných k houbovým chorobám. Transgenní zvířata jsou zatím předmětem uzavřeného nakládání, ale transgenní losos se již brzy může objevit na trhu v USA a další ryby v Číně a na Kubě (obr. 3).
10
V souvislosti s očekávaným nárůstem GM plodin a možná i zvířat na trhu jako součást potravního řetězce lze očekávat rozvoj detekčních a kvantifikačních metod. Stále jsou základem metody na bázi PCR a real-time PCR , které umožňují stanovit v jedné reakci jednu modifikaci. Jsou představovány postupy, které mají schopnost v jednom kroku detekovat více GMO. Ty byly představeny na konferenci v Como (světová konference detekce GMO, 2008) a Dalianu (Světový biotechnologický kongres, 2008). Také bylo konstatováno, že stálým nedostatkem jsou referenční materiály . Lze proto očekávat další vývoj v oblasti zejména s ohledem na výrobky, ze kterých již byla odstraněna DNA.
Poděkování: Příspěvek byl připraven s podporou projektu MŠMT Kontakt MEB 080849, MZe NAZV 1B 46068 a smlouvy MZe 15/NRL/2008 Expertní činnost laboratoře GMO
11
DNA Microarrays - možnosti využití pro GMO skríning Jan Hodek1, Jaroslava Ovesná1, Kateřina Demnerová2 1
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2 Vysoká škola chemicko-technologická
Úvod Nakládání s geneticky modifikovanými organismy (GMO) spádá v České republice pod zákon č. 153/2000 Sb., o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a produky a o změně některých souvisejících zákonů. GMO jsou zákonem definovány jako organismus, kromě člověka, jehož dědičný materiál byl změněn genetickou modifikací. Dědičným materiálem je pak DNA nebo RNA a genetickou modifikací je myšlena cílená změna dědičného materiálu organismu způsobem, kterého se nedosáhne přirozenou rekombinací, a to vnesení cizorodého dědičného materiálu do dědičného materiálu organismu nebo vynětí části dědičného materiálu organismu1. Cílem vývoje GMO je vylepšení stávajících vlastností organismu nebo zisk nových vlastností výhodných z hlediska jejich uživatelů. Komerčně jsou GMO využívány již po dobu deseti let a v současnosti se s nimi běžně setkáme například při výrobě léčiv, potravinových doplňků, krmiv, ale staly se již i součástí našeho potravního řetězce, a to především ve formě geneticky modifikovaných kulturních rostlin a potravin z nich vyrobených. Využití geneticky modifikovaných hospodářských zvířat neni zatím tak rozšířené. V roce 2007 bylo geneticky modifikovanými plodinami oseto již přes 110mil ha zemědělských ploch (Obr. 1). Obr. 1. Zemědělská plocha osetá GM plodinami, Clive James, 20072.
V České republice je GM kukuřice MON810 uvolněná ke komerčnímu využití od roku 2005. S více jak 7000 ha plochy oseté GM kukuřicí MON810 patří České republice v roce 2008 v rámci států Evropské unie 2. místo v pomyslném žebříčku pěstování GM plodin. Produkce GMOs každý rok celosvětově roste, nakládání s nimi je omezeno zákony a je u nich uplatňován princip předběžné opatrnosti. K jejich schvalování do oběhu však v různých státech často dochází asynchronně, proto je potřeba spolehlivých a rychlých metod pro analýzu jednotlivých GMOs. 12
Laboratoře zabývající se analýzou GMOs mají k dispozici metody uvedené v ISO normách, metody uveřejněné referenční laboratoří Evropské unie Community Reference Laboratory (CRL), které jsou validované prostřednictvím laboratoří sítě ENGL (sdružení European Network of GMO Laboratory), k dispozici jsou také metody uvedené v odborné literatuře nebo má laboratoř možnost vyvinout a validovat vlastní metodu. Nejpřesnější analýza GMOs vede přes průkaz přítomnosti nově tvořeného proteinu, který má poskytovat modifikovanému organismu výhodu. To umožňují například imunochemické metody. Při těchto metodách je vzorek analyzován na přítomnost nativního proteinu. To však umožňuje analýzu jen u některých typů vzorků. Vzorky z technologicky zpracovaných matric a další, ve kterých nelze očekávat přítomnost nativního protein, jsou pak nejčastěji analyzovány na přítomnost specifické části vložené DNA sekvence. Nejvíce je tak pro analýzu GMOs využívána polymerázová řetězová reakce (Polymerace Chain Reaction- PCR), pro kvantifikaci daného GMO pak PCR v reálném čase (RT-PCR). Principem metody PCR je amplifikace specifické DNA sekvence ohraničené dvěma oligonukleotidy, tzv. primery. První přístup k analýze neznámého vzorku ale nejčastěji vede přes GMO skríning- neznámý vzorek je analyzován na přítomnost sekvencí regulačních oblastí (promotoru, terminátoru) nebo pomocných selekčních genů. V případě nepovolených GMO nebo pokročilých GMO s kombinovaně vsazenými geny může být analýza pomocí PCR značně komplikovaná. Proto by bylo výhodné použít pro takovou analýzu vysoce kapacitní metodu, která umožní vyšetření mnoha DNA sekvencí během jednoho kroku. Jednou z možností je využití DNA Microarrays. Materiál a metody Princip DNA Microarrays je v podstatě jednoduchý- na vhodnou pevnou podložku jsou naneseny a imobilizovány sondy, což je vlastně kostra DNA o daném počtu nukleotidů a známé sekvenci, analyzovaný vzorek DNA (templát) je vhodným způsobem označen (např. fluorescenční barvou, enzymaticky, radioizotopově) a poté je nanesen na čip (podložku s imobilizovanými sondami). Při daných hybridizačních podmínkách a po odmytí vzorku zůstane na čipu pouze DNA komplemenární k sekvenci imobilizovaných sond. Podle způsobu značení templátu je pak z čipu odečten signál. Cílem naší práce bylo vyvinout diagnostický čip pro detekci genetických modifikací v rostlinách a rostlinných produktech. Postup přípravy čipu začal výběrem vhodných sekvencí pro DNA sondy, pomocí PCR proběhla amplifikace vybraných sekvencí DNA, které byly poté naklonovány do kompetentních buněk, ve kterých byly při -80°C uchovávány. Na sklo byly pak pomocí spotovacího zařízení MicroGridII naneseny jak celé plasmidy, tak specifické PCR produkty a PCR produkty primerů pro univerzální plasmidové sekvence. Postup nanášení DNA na sklo bylo potřeba optimalizovat jak z hlediska dosažení vhodné koncentrace DNA, tak vybráním vhodného nanášecího pufru. Pro sondy byly vybrány DNA sekvence druhově specifických genů (např. sójový lectin, bramborový patatin, řepkový napin, kukuřičná invertáza, kukuřičná Adh1), sekvence pro regulační úseky transgenů a selekční geny (35S promotor z CaMV, NOS terminátor, 35S terminátor, NPTII) a sekvence specifické pro určité transgeny (např. RR sója, MON810, Bt176, Bt11, T25). DNA byla nanesena podle předpřipraveného designu skla (Micromax Superchip™ I) do jamek zdrojového plata, ve spotovací stanici byla nastavena humidita prostředí a pomocí jehel začal proces nanášení DNA na aminovaný povrch skla. Dráhy jehel a jejich promývání řídil přednastavený program.
13
Nanesená DNA na skle drží díky elektrostatickým vazbám mezi záporně nabitou DNA a kladně nabitými aminovými skupinami na povrchu skla. V UV crosslinkeru Ultra Lum byla DNA ke sklu spojena kovalentní vazbou. Poté bylo nutné sklo prehybridizovat, aby se odmyla nenavázaná DNA a pomocí hovězí BSA se zablokovaly volné aminoskupiny na povrchu skla. Finální denaturace DNA sond byla provedena ponořením čipu na krátkou dobu do vroucí vody a následným promytím skla ve vymrazeném 95% ethanolu. Templátová DNA byla fluorescenčně označena- testovali jsme značení během PCR se značenými nukleotidy (Cy3-, Cy5-UTP, Amersham), dále pak značení pomocí kitu Micromax ASAP RNA Labeling Kit a BioPrime Total Genomic Labeling System. Při optimalizaci hybridačního procesu byl vybrán jako nejvhodnější hybridizační pufr AmbionII, teplota hybridizace 55°C a jako dostačující čas pro hybridizace se ukázaly 2 hodiny. Naznačenou DNA byla denaturována při 95°C po dobu 3 minut a poté byla vložena do ledu. Vzorek byl smíchán s hybridizačním pufrem v poměru 1:1 a byl nanesen na DNA čip na oblast naspotované DNA. Array byl opatrně překryt krycím sklíčkem, které bylo ke sklu přilepeno. Sklo bylo vloženo do hybridizační cely a ta do temperované vodní lázně. Po hybridizaci byla odmyta nenavázaná DNA. Sklo bylo vloženo do fluorescenčního skeneru GenePix 4000A, kde je podle použité fluorescenční barvy ozářeno laserem o dané vlnové délce, obraz emitovaného záření byl pak naskenován. Získaná data byla dále zpracovávána programem TIGR SpotFinder 3.1.1., který přiřadí každému spotu číselnou intenzitu. Vzhledem k tomu, že jde v našem případě pouze o kvalitativní vyhodnocování výsledku, může tato hodnota sloužit pro porovnání intenzity signálu vzhledem k pozadí. Výsledky Sondy naspotovaných plasmidů, PCR produktů primerů pro univerzální vazebná místa plasmidů i produktů specifických primerů dávaly po hybridizaci s odpovídající templátovou DNA kvalitativně shodný signál. Jako templátová DNA byly testovány PCR produkty specifických primerů se značenými nukleotidy, které byly na sklo naneseny jak přímo po PCR, tak po přesrážení, PCR produkty specifických primerů značené kitem Micromax i BioPrime a celogenomová DNA značená kitem BioPrime. Výsledky hybridizace produktů ze značené PCR (po přesrážení i bez přesrážení) i PCR produktů značených kity Micromax a BioPrime vykazovaly kvalitativně shodný signál. Při hybridizaci celogenomové DNA značené pomocí random-primerů kitu BioPrime byl získán specifický signál jen u sond připravených optimalizovaným způsobem. Práce na vývoji diagnostického čipu pro detekci genetických modifikací v rostlinách a rostlinných produktech bude nadále pokračovat, dosavadní výsledky získané hybridizací celogenomové DNA je potřeba ověřit. Literaura: 1. Zákon č. 153/2000Sb., o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a produkty a o změně některých souvisejících zákonů, Parlament ČR, 10. 5.2000. 2. http://www.isaaa.org/resources/publications/briefs/37/executivesummary/default.html, staženo 10.11.2008 Poděkování: Práce byla podporována Ministerstvem zemědělství ČR, Národní agenturou pro zemědělský výzkum jako projekt č.1B 46068.
14
Nestabilní transgeny ve stabilních genomech, a nebo naopak? Lukáš Fischer, Eva Nocarová Katedra fyziologie rostlin, Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze Geneticky modifikované (transgenní) organismy jsou zpravidla připravovány vnesením části genetické informace (ve formě DNA) do genomu hostitelského organismu. Vnášené geny, nazývané transgeny, jsou v genomech stabilně integrovány a stávají se tak jejich nedílnou součástí. Stabilita transgenů v daném organismu je pak zcela srovnatelná se stabilitou jeho vlastních genů, i když při pohlavním rozmnožování (v meiose při tvorbě gamet) může u heterozygotních jedinců teoreticky docházet ke změnám v transgenní DNA a jejím okolí v důsledku crossing-overu chromosómů, které nejsou v důsledku začlenění cizorodé DNA zcela kolineární. Na rozdíl od víceméně stabilně integrované DNA transgenu, vlastní vyjádření (exprese) transgenů podléhá v hostitelských organismech významným změnám, které často vedou až k úplnému vymizení exprese (transgene silencing). Silencing může být realizován na posttranskripční či transkripční úrovni, podle toho, zda v buňce vzniká či nevzniká transkript příslušného genu. Signálem pro transkripční umlčení exprese, ke kterému dochází často bezprostředně po začlenění transgenu do genomu, bývá tzv. poziční efekt, tedy charakter sekvencí sousedících s transgenem. Pokud je v místě začlenění transgenu chromatin uspořádán do kompaktní formy (heterochromatin), která je těžko přístupná transkripčnímu aparátu, velmi často dochází k rozšíření heterochromatinového uspořádání i na vnesenou DNA a okamžitému umlčení exprese transgenu. Umlčování na posttranskripční úrovni je realizováno prostřednictvím malých interferujících RNA (siRNA), které se mohou podílet i na sekvenčně specifickém umlčování genů na úrovni transkripce. Signálem pro tvorbu siRNA je přítomnost dvouvláknové RNA (dsRNA) v buňce. Ta může vznikat různými způsoby, přičemž v případě umlčování transgenů zřejmě hraje nejvýznamnější roli syntéza druhého vlákna RNA dependentní RNA polymerázou, která nasedá na poškozené abundantní transkripty. DsRNA je rozpoznána a štěpena proteinem DICER. Krátké úseky jednovláknové RNA (v komplexu s proteinem ARGONAUT) uvolněné ze vzniklých štěpů jsou vlastním efektorem v různých procesech RNA silencingu: štěpení homologních mRNA komplexem RISC, interference s translací homologních mRNA či malými RNA navozená metylace DNA – heterochromatinizace a transkripční umlčení exprese. Studium umlčování exprese transgenů u bramboru ukázalo, že exprese transgenů je častěji umlčována u linií s větším počtem kopií vnášených transgenů a u linií s vyšší počáteční
15
expresí transgenu. Dva tandemově (za sebou) uspořádané transgeny vnášené do genomu bramboru byly navíc umlčovány postupně, koordinovaně a zřejmě odlišným mechanismem. Silněji exprimovaný transgen byl umlčován vždy jako první a zřejmě primárně na posttranskripční úrovni prostřednictvím siRNA. Toto posttranskripční umlčování následně přecházelo na umlčování transkripční spojené s metylací DNA. Slaběji exprimovaný transgen byl
zřejmě
umlčován
přímo
na
úrovni
transkripce,
a
to
rozšířením
metylace
(heterochromatinové struktury) ze sousedního primárně umlčeného transgenu. Celý proces postupného umlčení obou transgenů bylo možné zreprodukovat u rostlin s obnovenou expresí transgenů, které byly získány regenerací de novo po ošetření DNA demetylační drogou 5azacytidinem. Mechanismus umlčování transgenů se v evoluci zřejmě vytvořil na ochranu proti invazním nukleovým kyselinám jako jsou mobilní elementy (transpozóny) a viry, ale je využíván i při regulaci exprese vlastních genů. Mobilní elementy mají vzhledem ke své schopnosti vyštěpovat se a znovu začleňovat na různá místa genomu obrovský mutagenní potenciál. V rostlinných genomech tvoří vlastní DNA mobilních elementů či jimi mobilizovaná DNA většinu tzv. repetitivní DNA, jejíž podíl může dosahovat až 80 % velikosti genomu. Takto vysoký podíl transpozónové DNA naznačuje, že se buďto rostliny v průběhu evoluce nedokázaly této invazní DNA dostatečně bránit, a nebo, jak naznačují některé recentní studie, hrály mobilní elementy v evoluci rostlin a jejich genomů významnou pozitivní úlohu a tuto úlohu zřejmě hrají dodnes. Kromě značného významu pro strukturu a dynamický vývoj rostlinných genomů a předpokládané úlohy při vzniku nových genů se transpozóny podílejí i na regulaci exprese rostlinných genů. Aktivita transpozónů a jejich mutagenní schopnosti jsou často indukovány stresovými podmínkami a mohou tak hrát pozitivní roli v adaptivních odpovědích rostlin. Současnou podobu rostlinných genomů utvářely opakované cykly dílčích i celkových duplikací a následných redukcí a modifikací duplikovaného. Tyto procesy, spolu s genovými duplikace vedly ke vzniku mnohočetných genových rodin, které výrazně zvyšovaly plasticitu rostlinných genomů i rostlin samotných. V modifikacích duplikovaných sekvencí hrála významnou roli metylace DNA, jejímž prostřednictvím byly duplikované sekvence transkripčně inaktivovány a mohly být vystaveny silné spontánní mutagenezi bez působení selekčního tlaku. Nově vzniklé sekvence tak mohly tak dát vznik zcela novým genům, na jejichž vzniku se mohly podílet i mobilními elementy schopné vzájemně propojovat úseky DNA původně přítomné na různých místech genomu.
16
Na dynamice a změnách rostlinných genomů se zřejmě významnou měrou dodnes podílí i přenos DNA z organelových genomů (plastidů a mitochondrií). DNA z těchto organel (ať už ve formě krátkých fragmentů či např. celých kopií plastidového genomu tvoří nezanedbatelnou součást jaderného genomu rostlin. Stěhování genů mezi těmito dvěma kompartmenty bylo recentně prokázáno i přímo experimentálně pomocí transgenních rostlin. Frekvence přenosu selekčního genu z genomu plastidů bylo pozorováno až s frekvencí 1:11000 v pylových zrnech a 1:18000 v somatických buňkách. Celkově lze na základě uvedených dat konstatovat, že rostlinné genomy jsou stále velmi dynamické, což je potřeba mít na paměti i při analýzách transgenních rostlin.
17
Sledování degradace rostlinné DNA během technologických úprav potravinových matric (vliv na integritu,detekci a kvantifikaci DNA)
Bergerová, E. – Siekel, P. – Lopašovská, M. – Hrnčírová, Z. – Stankovská, M. Výskumný ústav potravinársky, Priemyselná 4, P.O.BOX 25, 824 75, Bratislava 26 ABSTRAKT Rostlinné potravinové produkty se v obchodním řetězci vyskytují určitým způsobem zpracované (tepelné a mechanické úpravy, mikrovlnné záření, pH, autoklávování, chemické činidla, enzymy atd). Při výrobních procesech dochází k postupné degradaci DNA, i když většinou není ovlivněný obsah nukleových kyselin. Změnou integrity DNA a následnou fragmentací se snižuje riziko možného horizontálního přenosu genů. Během extrakce DNA z různých rostlinných matric jsme zjistili, že kvalita získané DNA je ve velké míře ovlivněná homogenizací vzorků. Genomovou DNA z různě technologicky upravených matric jsme izolovali metodami CTAB, GeneSpin, Wizard. Jako modelové organismy jsme si zvolili kukuřici, fazolu, sóju a hrách. Degradaci DNA semen uvedených matric jsme sledovali v závislosti na teplotě, tlaku, pH a času opracování. Stupeň fragmentace jsme detekovali pomocí elektrofórezy v agarázovém gelu a amplifikací intaktních fragmentů DNA pomocí PCR. Na amplifikaci jednotlivých genů (např. lektinový a glutamín-syntetázový u hrachu a sóje) jsme použili kombinaci primerů, které jsme navrhli pomocí programu PRIMER 3. Teplota 100°C a 200°C je dostatečná na významnou degradaci DNA a snížení možnosti přenosu genetické informace. Fragment 913 bp jsme po amplifikaci detekovali do 360 minut u vařené sóje při 80°C. Při teplotách nad 100°C bez rozdílu vaření nebo pečení se 913 bp fragment amplifikoval jen do 60 minut. Při teplotě 200 °C jsme největší fragment (1129 bp) detekovali do 45 min. Po tepelné úpravě pečené sóje při 200°C jsme získali amplikony velké 120 bp, 201 bp detekovali jen do 90 minut. Při nižších teplotách je bylo možné detekovat i po 225 min. tepelném opracování. V komerčně dostupných potravinách se účinek technologického zpracování výrazně projevil v případě sójového mléka, kde bylo možné amplifikovat jen fragment velký120 bp. V případě mikrovlnného záření (700W) byla DNA o velikosti 1129 bp amplifikovatelná jen do 7.5 min, zatímco fragmenty menší než 748 bp byly amplifikovatelné i po 10 min. Po 10 min. autoklávování byly detekovatelné pouze fragmenty o velikosti 122 bp. Na detekci a kvantifikaci GMO v potravinách jsme vypracovali metody polymerázové řetězové reakce využívající analýzu izolované DNA. Vybrali jsme certifikované standardní materiály : Roundup Ready TM sóje a kukuřice MON810, Bt-176, Bt-11, GA21, NK603, ze kterých se izolovala DNA a navrhli se vhodné Real-Time PCR postupy na jejich identifikaci, stejně pro specifický vzorek z RRsóje a pěti kultivarů kukuřice. DNA z těchto vzorků jsme izolovali dvěmi odlišnými metodami (CTAB a GeneSpin). Při zavedení metod pro relativní kvantifikaci GMO jsme optimalizovali vhodné podmínky pro jednotlivé vzorky. Ověřili jsme si kvantifikaci dodaných vzorků (RRsója-92% a 4,2%) a následně jsme si připravili různé procentuální zastoupení modifikací vzorek pro RRsóju: 46%, 23%, 11%, 2,1%, 1,05%, 0,5%, pro kukuřici NK603: 0,5%, 0,9%, 1%, ale i dalších
18
druhů GM kukuřic, ze kterých jsme stanovili procenta modifikace, LOD a LOQ (pro RRsóju LOD 0,5% a LOQ 0,9% a kukuřici LOD 0,4% a LOQ 0,8%) a následně využili pro experimenty zaměřené na degradaci DNA v různých potravinářských matricích (laboratorně připravené).
TEORETICKÝ ÚVOD Technologické zpracování potravin ovlivňuje integritu DNA. Během tohoto procesu dochází k fragmentaci DNA, přičemž obsah DNA (včetně nukleotidů) v potravinách není většinou ovlivněný. Extraktibilita DNA úzce souvisí ze stanovením jejího množství v potravinách. Důležitost výtěžku extrahované DNA představuje vhodně zvolená extrakční metoda, např. dostatečný zisk DNA je po extrakci v rozsahu 1-10 µg/100 mg potraviny, v rajčatových produktech je to méně jak 1 µg/100 mg. V průběhu některých typů zpracování potravin (rafinace jedlých olejů a sacharózy) je téměř všechna DNA odstraněna [1]. Teplotní zásahy potravin mohou ovlivňovat kvalitu DNA a též i její analýzu, získanou metodu polymerázové řetězové reakce (PCR). Nejen během technologického zpracování, ale i během přechodu potravin trávicím traktem dochází k fragmentaci DNA. Tento proces není úplný, nedochází k degradaci až na nukleotidy, ale zůstávají fragmenty ve velikosti několik desítek až stovek bp. Takto se snižuje pravděpodobnost horizontálního přenosu genů (HGT) [2]. Možným zdrojem HGT je jen ta část DNA, která nebyla v průběhu zpracování potravin a během trávení degradována. Kuchyňská úprava potravin a technologické zpracování může odstranit, nebo inaktivovat většinu DNA včetně transgenní a tak odstranit resp. minimalizovat riziko přenosu genů na jiné organizmy [3]. Pomocí PCR jsme sledovali ovlivnění možnosti identifikace a detekce těchto plodin, u sóje a kukuřice i její transgenní variantu v potravinách. Na kvalitu a kvantitu DNA působí ve velké míře homogenizace. Je potřebné rostlinný materiál vhodně mechanicky a chemicky opracovat. Za přiměřený způsob se považuje mletí, při kterém nedochází k nadměrné degradaci DNA ani během uvolňování tepla. Nejvyšší množství kvalitní DNA je možné získat z malých častíc východiskového materiálu, což souvisí s extrahovatelností DNA z matrice [4]. Na DNA působí rozdílně drcení, mletí, tepelné zpracování a působení páry. Např.drcení a mletí pšenice neovlivňuje integritu DNA, její molekulovou hmotnost a kvalitu, teplota mezi 100 až 150 °C vede k úplné disrupcii DNA na úseky menší něž 100 bp [5]. Kvalita DNA může být rovněž ovlivněna: přítomností inhibitorů PCR v potravinových matricích, stupněm poškození DNA, průměrnou velikostí fragmentů extrahované DNA. Tyto faktory závisí od vnějších procesů výroby potravin a od fyzikálních a chemických parametrů použitých extrakčních metod. Extrakce, purifikace a čistota nukleových kyselin jsou kritické faktory pro PCR analýzu [6]. Nukleová kyselina musí byt detekovatelná a nesmí obsahovat inhibitory PCR [7]. Existuje více druhů extrakčních a purifikačních metod (tab.1), přičemž je důležité zvolit nejvhodnější metodu, která by poskytla kvalitní DNA dostatečné kvantity. Při výběru je důležité zohlednit cílový organismus, materiál, se kterým se pracuje (tkaniva, listy, semena, potraviny), cílovou sekvenci DNA, výtěžek a čistotu DNA, techniky amplifikace (PCR, Real- time PCR). Pěstování, produkce a zpracování geneticky modifikovaných potravin patří v současné době k diskutovaným tématům. Možný horizontální přenos genů, značení GM potravin a s tím související kvantifikace GMO se jeví jako složitý problém pro výrobce a prodejce, neboť platí povinnost označovat výrobky, které pocházejí z GMO. Novela zákona o potravinách ukládá od 1.1.2002 označení všech potravin obsahujících více než 0,9% GMO [8]. Proto je důležité vypracovat spolehlivý kontrolní systém, který zaručí přesnou a specifickou, nejen kvalitativní, ale i kvantitativní analýzu. Doposud byla vyvinuta řada postupů zaměřených na
19
stanovení GMO v potravinách a potravinářských surovinách. Základem je buď identifikace nukleových kyselin (PCR, detekce exprese transgenu na úrovni RNA) nebo bílkovin (určení aktivity bílkovin, imunometody). Některé typy GMO mohou být detekovány i chromatografií nebo infračervenou spektroskopií. Uvedené metody však mají určitá omezení, ať již citlivost, možnost ovlivnění ostatními složkami potraviny, vhodnost metody pro daný materiál nebo cenu stanovení [9]. Základní schéma detekce GMO zahrnuje odběr representativního vzorku matrice, extrakci nukleových kyselin nebo proteinů, testovací metody potvrzující přítomnost transgenu, identifikaci transgenu a jeho kvantifikaci [9]. V našem případě jsme pro určení relativní kvantifikace GMO využili metodu řetezové polymerázové reakce (PCR), resp Real-Time PCR. Fluorimetrická detekce amplikonu se uskutečňuje prostřednictvím TaqMan sondy. Vzhledem k tomu, že je PCR velmi citlivá technika vyžadující kvalitní DNA, použití vhodné extrakční metody je základním a kritickým krokem celého procesu. Při detekci GMO je rovněž důležitý výběr cílové sekvence modifikovaného genu. Ideální cílová sekvence genu je sekvence vyskytující se pouze v jedné geneticky modifikované plodině, ve stabilním a známém počtu kopií vzhledem ke genomu [10]. Příklady způsobu identifikace GMO jsou uvedené v tab.2. Na určení relativní kvantifikace jsme použili jako modelový organismus RRsóju (RoundupReady sója) ale i několik druhů kukuřice (MON810, NK603, Bt-11, Bt-176 a GA21). Sóju fazolovou (Glycine max) jsme si zvolili proto, že patří mezi strukoviny ale je též řazena mezi olejniny, semeno sóje obsahuje 18-22% oleje bez cholesterolu, 35-45% bílkovin a široké spektrum vitamínů (A, D, E, B). V důsledku vysokého obsahu bílkovin a esenciálních aminokyselin (kys. palmitová, stearová, olejová, linolenová a linolová) je velmi vhodná pro lidskou výživu stejně jako bílkovinný komponent do krmných směsí. RRsója je rezistentní vůči herbicidu glyfosátu, který inhibuje tvorbu EPSPS proteinu (5-enol pyruvylšikimát syntetázy). Ten je esencialní pro syntézu aromatických AMK [11]. Komplexní vědomosti vzhledem k degradaci endogenních a exogenních genů během zpracování rozličných druhů potravin jsou velmi potřebné. Různé způsoby zpracování DNA by měly limitovat podmínky při produkci potravin. Je zřejmé, že rozsah degradace pro konkrétní potravinový produkt se nedá předpovídat. Proto si hodnocení rizika horizontálního transferu v potravinách vyžaduje detailní analýzu jednotlivých produktů [12].
MATERIÁL A METODY Při práci jsme použili vzorky, z nichž jsou některé uvedené v tab. 3. Příprava vzorky zahrňuje metody ovlivňující účinnost extrakce DNA (homogenizace, přeosívání) a podobně metody použité při sledovaní vlivů různých způsobů opracování matrice na integritu DNA (sušení, pečení, var, autoklávování atd). Semena sóje, hrachu, fazole a kukuřice jsme vařili v destilované vodě (pH = 7,0) při 80°C, 100°C a pekli při 100, 120, 140, 200°C a následně jsme odebírali jednotlivé alikvotní části v různých časových intervalech. Takto upravené vzorky jsme homogenizovali na mixeru AY47R1 Moulinex a sušili při teplotách uvedených v tabulce 4. Po sušení následovalo přeosívání na sítech o velikosti oka 0.8mm, 0.2mm, 0.125mm (u hrachu). V případě semen transgenní sóje a kukuřice jsme je nejprve namočili na 24 hodin do destilované vody při pokojové teplotě, dále jsme je upravili v homogenizátoru (Blender HGB55E, USA) na šrot, popř. mouku. Nebo jsme získali vzorky RR sóje ve formě komponentu krmné směsi (4,2%, 92%, Podunajské Biskupice).Z dodaných vzorků (např. 92% a 4,2% RRsóje, Podunajské Biskupice) jsme si následně připravili vzorky o různém procentuálním zastoupení GM složky (46%, 23%, 11%, 2,1%, 1,05%, 0,5% RR sóje), v
20
případě kukuřice NK603 (0,5%, 0,9%, 1% ), MON810 (0,9 a 1%) a další vzorky kukuřice (VÚŽV Nitra) Bt,-11, Bt-176 a GA21 (0-1%). Podobně jsme připravili i laboratorní vzorky . Na extrakci DNA z dostupných potravinových matric (tab.3) jsme použili nasledující extrakční metody: komerční soupravy GeneSpin (GeneScan), DNAeasy Plant Mini Kit (Qiagen), Wizard (Promega) a validovaný postup CTAB (ISPRA–JRC) s úpravami. Extrahovanou DNA jsme stanovili elektroforeticky v 1 % agarózovém gelu. Použili jsme 250 bp standard molekulové hmotnosti (Invitrogen, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, USA). Na gel jsme nanesli 10 µl DNA vzorku s přidáním 2 µl nanášecího tlumivého roztoku. Elektroforézu v horizontálním uspořádání jsme uskutečnili při potenciálním spádu 5 V/cm po dobu 1,5 hodiny. Gel jsme barvili roztokem etidiumbromidu po dobu 20 min. DNA jsme vizualizovali UV zářením 2 500 W/cm2. Elektroforetické gely jsme zdokumentovali pomocí digitálního fotografického přístroje Canon. Na identifikaci jednotlivých genů jsme použili PCR. Tu jsme uskutečnili v objemu 22,5 µl reakční směsi o složení: 10 mmol/l Tris HCl, pH 8,8; 50 mmol/l KCl; 1,5 mmol/l MgCl ; 200 µmol/l dNTP (Fermentas, USA); 0,5 pmol/µl primerů, 1U HotStarTaq DNA 2
polymerázy s 15 minutovou aktivací při 95 °C), (Qiagen, Hilden, Nemecko) a 2,5 µl vzorku DNA. Jako pozitivní kontrolu jsme použili DNA izolovanou z listů rostlin pomocí komerční dostupné metody DNAeasy Plant MiniKit. Kombinace použitých primerů jsou uvedené v tab. 5. PCR reakce proběhala v termocykleru s vyhřívaným víkem GeneAmpR PCR Systém 9700 podle teplotního programu uvedeného v tab. 6. Produkty PCR jsme stanovili opět elektroforeticky v 1,5 % agarózovém gelu, kde jsme použili standard molekulové hmotnosti 100 bp (Invitrogen Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, USA). V případě GM vzorků jsme genomovou DNA izolovali metodou CTAB a komerčně dodávaným kitem GeneSpin (GeneScan, Teltow, Německo). Stejným způsobem jsme extrahovali DNA z referenčních materiálu RRsóje (IMR- Institute for Reference Materials and Measurements, Belgie) a modifikovaných kukuřic. Pro určení relativní kvantifikace transgenní složky ve vzorcích jsme použili metodu Real-Time PCR. Amplifikace daných DNA fragmentů se uskutečnila v objemu 25µl reakční směsi, která obsahovala patřičné primery a próby (Bio-Consult). Sekvence některých primerů a velikosti patřičných PCR produktů jsou uvedeny v tabulce 5. Jako transgen jsme pro RRsóju i kukuřici NK603 využili gen CP4 EPSPS a jako endogen jsme použili lektinový gen u sóje a ADH2 (alkoholdehydrogenázový) u NK603, v případě kukuřice MON810 jsme použili jako specifický gen cry1A(b) a jako referenční gen: HMG (hight mobility group). Pro vizualizaci amplikonů byla provedena klasická PCR (iQ5 cykler, Bio-Rad) a její produkty analyzovány elektroforézou v 1,5% agarózovém gelu barvené etidiumbromidem a detegované UVtransluminátorem (Caution TPC.20.LC, Francie). Jako pozitivní kontrolu jsme použili extrahovaný vzorek sóje nebo kukuřice bez příměsi transgenní složky. Negativní kontrola obsahovala pouze reakční PCR směs bez templátu. Kvantifikace transgenních vzorek byla uskutečněna v iQ5 cykleru (Bio-Rad) v programu Quant GMO : 60 cyklů; dvou krokový proces - při úvodní denaturaci DNA-polymerázi 95 ºC po dobu 15 minut.
VÝSLEDKY Nejprve jsme se zaměřili na jednotlivé technologické úpravy rostlinných matric.Různé způsoby technologického zpracování vzorků např. hrachu a sóje v závislosti na teplotě a čase, jsou uvedené v tab. 4. Po extrakci DNA jsme úroveň fragmentace DNA sledovali pomocí amplifikace PCR produktů různých velikostí. Degradace DNA sóje při všech analyzovaných teplotách a časových intervalech výrazně neovlivnila amplifikovatelnost menších fragmentů 21
v PCR, s výjimkou sušené sóje při 200 °C, tab.7. Fragmenty velikosti 120 bp, 201 bp jsme amplifikovali jen do 90 minut, v porovnaní s amlifikovatelností při ostatních teplotách, když bylo možné detekovat fragmenty i po 225 minutovém tepelném zpracování, tab. 7. Získané výsledky poukazují na vyšší stupeň degradace v případě vařené sóje při 100 °C, než u sóje pečené při uvedené teplotě. Fragment velikosti 913 bp jsme po amplifikaci detekovali do 360 min. u vařené sóji při 80 °C. Při teplotách od 100 °C sa 913 bp fragment amplifikoval jen do 60 min, tab.7. Při teplotě 200 °C jsme největší fragment o velikosti 1129 bp detekovali do 45 min. K výrazné degradaci DNA sóje a hrachu došlo při sušení 200°C. Na obr. 1.A a 1.B je zřejmé, že po 60 min při 200°C došlo k výrazné degradaci DNA. Podobné výsledky jsme získali i v případě potravinových matric kukuřice a fazole. V případě mikrovlnného zahřívání (700W) byla DNA o velikosti 1129 bp amplifikovatelná jen do 7.5 min, zatímco fragmenty menší než 748 bp byly amplifikovatelné i po 10 min. Ze všech způsobů technologického zpracování uvedených v tab. 4 má největší vliv na degradaci DNA spoluúčinnost tlaku a teploty. Už po 10 min autoklávování při teplotě 120°C dochází k výrazné degradaci viz. obr. 2. Při stanovení maximálního času amplifikace 122 bp fragmentu lektinového genu jsme zjistili, že v případě autoklávování je tento fragment detekovatelný do 30 min. V komerčně dostupných potravinových matricích jsme pomocí PCR reakce určili vliv technologických postupů na intaktnost DNA. Vliv teplotního, mechanického a chemického zpracování na úroveň amplifikovatelnosti DNA byla výraznější v případě vzorku pocházejícího ze sójového mléka. Po stanovení stupně degradace v technologicky upravených potravinových matricích ovlivňující integritu DNA i možný horizontální přenos genů, jsme se zaměřili na detekci a kvantifikaci rostlinných vzorků, jejichž část byla geneticky změněna. Vzorky transgenní sóje, kukuřice i referenčního materiálu (IRM) jsme izolovali metodou CTAB a komerčně dodávaným kitem (GenSpin). Homogenní vzorku o vhodné koncentraci DNA a požadovanou čistotou jsme získali metodou CTAB. Při zavedení metod pro relativní kvantifikaci GMO jsme optimalizovali vhodné podmínky pro jednotlivé vzorky. Klasickou PCR a následnou elektroforézou v 1,5% agarózovém gelu jsme detegovali DNA fragmenty jednotlivých genů. Jako kontrolu jsme amplifikovali i nemodifikované vzorky o různé délce PCR produktů. Ve vzorcích krmného komponentu RR sóje (Podunajské Biskupice) jsme detekovali degradaci DNA u fragmentu o velikosti 286 bp ve 225 minutě po sušení při 100ºC, obr.3 . Dále jsme si ověřili kvantifikaci dodaných vzorků (RRsója- 92% a 4,2%) pomocí metody Real-Time PCR a následně jsme si připravili různé procentuální zastoupení modifikací jednotlivých vzorků (pro RRsóju: 46%, 23%, 11%, 2,1%, 1,05%, 0,5% a pro kukuřici NK603: 0,5%, 0,9%, 1%, MON810 ale i dalších druhů GM kukuřic 0-1%), ze kterých jsme stejným způsobem stanovili procenta modifikací. Při kvantifikaci transgenní složky ve vzorcích jsme analyzovali endogen i transgen (tab.5, obr.4). Na základě počtu kopií endogenu a transgenu jsme určili procento GM složky v potravině, limit detekce (LOD) a limit kvantifikace. Stejným způsobem jsme uskutečnili i kvantifikaci všech připravených vzorků sóje a kukuřice (MON810, NK603, GA21, Bt-11a Bt-176). Podobně jsme postupovali v případě laboratorně připravených GM vzorků. ZÁVĚR V komerčně dostupných potravinových matricích jsme pomocí PCR určili vliv technologických postupů na intaktnost DNA. Celkový obsah a kvalita DNA v potravinách závisí na stupni technologického zpracování, během kterého dochází k postupné fragmentaci
22
DNA [13]. Předpokládáme, že v případě vařené sóje dochází k rychlejší fragmentaci DNA v důsledku hydratace matrice, narozdíl od pečeného vzorku. Dále jsme potvrdili účinnost extrakčních metod pro kvalitu DNA (především je vhodná CTAB metoda). Kvalita DNA v konečném důsledku výrazně ovlivňuje výsledek PCR reakce. Potvrdili jsme stupeň degradace DNA sóje a hrachu v závislosti na teplotním zpracování a čase. DNA hrachu ošetrená mikrovlným žiarením byla degradovatelná v minimální míře. Úroveň fragmentace jsme sledovali prostředníctvím amplifikace PCR produktů různých velikostí uvedených v tab. 5. Výsledky těchto experimentů potvrzují, že DNA je značně odolná vůči různým způsobům fyzikálního ošetření. Na detekci a kvantifikaci GMO v potravinách jsme vypracovali metody polymerázové řetězové rekce využívající analýzu izolované DNA. Vybrali jsme certifikované standardní materiály: Roundup ready™ sóje a kukuřice MON810, NK603, GA21, Bt-11 a Bt-176, ze kterých byla izolována DNA a byly navrženy vhodné Real-time PCR postupy na jejich identifikaci stejně jako pro specifický vzorek RRsóje a kukuřice. Z referenčních i specifických materiálů jsme izolovali DNA dvěmi odlišnými metodami (CTAB a GeneSpin). Pomocí Real-Time PCR jsme určili a ověřili dané procenta modifikací jak pro RRsóju, tak i pro modifikovanou kukuřici. Zmíněna metoda je jedna z nejcitlivějších a nejpřesnějších metod na stanovení relativní kvantifikace GM složky. Díky své vysoké citlivosti umožňuje detekci DNA o velmi nízké koncentraci a malém počtu kopií cílové DNA. Výhodou této metody je, že PCR produkt nemusí byt následně analyzovaný, čímž se předejde možné kontaminaci [14]. Na základe získaných výsledků se domníváme, že tepelně indukovaná fragmentace se projevuje stejně v transgenní i v kterékoliv jiné oblasti DNA. Ověřením kvantifikace GM složky dodaných vzorek metodou Real-time PCR a následnou kvantifikací připravených vzorek v různém procentuálním zastoupení modifikace jsme zjistili, že metoda Real-time PCR je vhodná pro kvantifikaci složek potravin. Takto připravené a ověřené vzorky s určitým množstvím GM složky budeme dále používat v experimentech, zaměřených na vliv kvantifikace technologicky opracovaných matric. Tato práce byla financovaná z úlohy podpory a vývoje ,,Rozvoj progresívnych metód a postupov pre zabezpečenie procesu kontinuálneho zvyšovania kvality a bezpečnosti vo výrobe a kontrole potravin.“ REFERENCIE [1] Klein, J., Altenbuchner, J., Mattes, R. (1998). Nucleic acid and protein elimination during the sugar manufacturing process of conventional and transgenic sugar beets. Journal of Biotechnology 60, 145 – 153. [2] Jonas, D., Almadfa, A., Engel, I., Heller, K. H. 2001 Safety consideration of DNA in food. Annals of Nutrition & Metabolism 45: 235-250. [3] Kollárovič, G., Kretová, M., Siekel, P. 2005 Sledovanie degradácie DNA v strukovinách využitím PCR metódy. Bulletin potravinárskeho výskumu 2: 43 – 52. [4] Holden, M. J., Blasic, Jr., J. R., Bussjaeger, L., Kao, Ch., Shokere, L. A., Kendall, D. C., Freese, L., Jenkins, G. R. (2003). Evaluation of Methodologies for Corn Kernel (Zea mays) DNA for Detection of Trace Amounts of Biotechnology – Derived DNA. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51, 2468 – 2474. [5] Forbes, J. M., Blair, G. E., Chiter, A., Perks, S. 1998 Effect of feed processing conditions on DNA fragmentation. Scientific Report No 236. [6] Moreano, F., Busch, U., Engel, K. H. (2005). Distortion of Genetically Modified Organism Quantification in Processed Foods: Influence of Particle Size Compositions and
23
Heat-Induced DNA Degradation. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53, 9971 – 9979. [7] Olexová, L., Dovičovičová, L., Kuchta, T. (2004). Comparison of three types of methods for the isolation of DNA from flours, biscuits and instant paps. European Food Research and Technology 4, 390 – 393. [8] Fair.: Consumer attitudes and decision-making with regard to genetically enginnered food products, 1999. Fair-96-1667, Cade-Gentech, Co-ordinator: prof. Klaus G. Grunert. [9] Holst-Jensen, A. 2001. GMO detection using PCR. National Veterinary Institute, Section of Food and Feed Microbiology. [10] Berdal, K. G., Holst-Jensen, A. 2001. Roundup Ready soybean event-specific real-time quantitative PCR assay and estimation of the practical detection and quantification limits in GMO analyses. Eur Food Research Technology 213: 432-438. [11] Bowler, P.A. 1998. Interdiciplinary Minorin Global sustainability, UCLA. [12] Bauer, T., Hammes, W. P., Haase, N. U., Hertel, CH. 2004 Effect of food components and processing parameters on DNA degradation in food: 215-223. [13] Trifa, Y., Zhang, D. 2004. DNA content in embryo and endosperm of maize kernel Zea mays L: Impact on GMO quantification. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52: 1044–1048. [14] Miragliaa M., Berdalb, K.G., Brerra, C., Corbisier, P., Van Ried, J.P.P.F. and Zagonf., J. 2004. Detection and traceability of genetically modified organism in the food production chain. Food and Chemical Toxicology 42:1157-1180.
Tabulka 1. Použité komerční extrakční soupravy a metody při extrakcii DNA z potravinářských matric Název kitu/metody Princip metody GeneSpin (GeneScan) lýze buňky, precipitace proteinů a polysacharidů, vazba DNA na silikonovou membránu, přemytí, eluce Nucleospin® Food (MACHAREY lýze buňky, precipitace proteinů a NAGEL) polysacharidů, vazba DNA na silikonovou membránu, přemytí, eluce Wizard® Magnetic Purification lýze buňky, vazba DNA na magnetické System for Food (Promega) částice, eluce Wizard® DNA Clean-Up System precipitace proteinů, precipitace DNA (Promega) pomocí rezinu DNeasy® Plant Mini Kit lýze buňky, precipitace proteinů a (QIAGEN) polysacharidů, vazba DNA na silikonovou membránu, přemytí, eluce CTAB (validovaný postup ISPRA) lýze buňky, selektivní precipitace DNA pomocí CTAB
24
Fenol-chloroform (Lin a kol., 2001) lýze buňky, precipitace proteinů pomocí fenol-chloroformu
Tabulka 2. Různé způsoby identifikace GMO prostřednictvím DNA. Typ metody
Cílová sekvence Promotor vírusu květákové mozaiky (P35S)
Skríningové metody
Terminátor nopalín syntetázy (T-Nos) Genově specifické metody
Konstrukt specifické metody
Event specifické metody
bar gen (fosfotricín acetyltransferáza) CryIA(b) gen Bt11 kukuřice:sekvence mezi intronem alkohol dehydrogenázy IVS6 a cryIA(b) genem Bt176 kukuřice: sekvence mezi promotorem CDPK (vápník dependentní protein-kinázy) a syntetickým cryIA(b) genem GA21 kukuřice: sekvence mezi OTP (enhanserom) a epsps genem (RoundupReady tolerance) Mon810 kukuřice: sekvence mezi P-35Spromotorem a heat shock proteinem (hsp) 70 Zeneca rajčata:sekvence mezi T-Nos a zkráceným genem polygalaktouronázy Bt11 kukuřice: genom hostitelské rostliny + vložená rekombinantní DNA RoundupReady sója:genom hostitelské rostliny + vložená rekombinantní DNA
Tabulka 3. Seznam některých použitých potravinových matric
25
Název výrobku
Výrobce
Hrách semena (sušený) Hrách semena (sušený) Sója zrna RoundupReady sója (šrot) Sójové kostky Sójový granulát Sójové vločky drcené Sójová mouka Sójové mléko Tofu Pražená sója
cv. Gloriosa, Bratislava firma Lagris, Bratislava firma Bali Marianna, Ivanka pri Dunaji UXUP-ústav vzoriek, BA;Podunajské Biskupice AlfaBio – Slovakia, Zvolen Pragosója, Praha Bali fa Marianna, Ivanka pri Dunaji Sójaprodukt - drietoma Zajíc plus, Zlín Alfabio, Banská Bystrica M. M. Sója, Hronská Dúbrava
Pražená sója s mořskou solí Sója boby
M. M. Sója, Hronská Dúbrava Bali fa Marianna, Ivanka při Dunaji
Kukuřice MON810
Kunovice, ČR
Tabulka 4. Způsoby zpracování hrachu a sóje Zpracovaní
Parametry
0
Sušení/pečení
100°C 200°C
+ +
Vaření
100°C
+
Mikrovlnná úprava
700W
+
Autoklávování
120°C
+
Inkubace v pH roztoku
pH 3, 5, 7, 9
+
2.5
+
5
+
7.5
+
10 + + +
Čas (min) 20 30 45 50 60 90 120 180 225 +
+ +
+ +
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
Tabulka 5. Sekvence primerů a velikosti amplikonů použitých genů Název primeru
Sekvence (5`- 3`)
CP4 EPSPS-F CP4 EPSPS-R LECTIN-F LECTIN-R Cry1A(b)-F Cry1a(b)-R HMG-F HMG-R CP4 EPSPS-F CP4 EPSPS-R ADH2-F
ttcattcaaaataagatcatacatacaggtt ggcatttgtaggagccacctt ccagcttcgccgcttccttc gaaggcaagcccatctgcaagcc tcgaaggacgaaggactctaacgt gccaccttccttttccactatctt ttggactagaaatctcgtgctga gctacatagggagccttgtcct atgaatgacctcgactaagcttgttaa aagagataacaggatccactcaaacact ccagcctcatggccaaag
ADH2-R Hrách F3 Hrách R1 Hrách F2 Hrách R1 Hrách F2 Hrách R2 Hrách F3 Hrách R3
ccttcttggcggcttatctg ttgtcataaatgcacccaacagttacaacg catactctgcgctattgaaaactccgag atggcttctcttcaaacccaaatgatctcg catactctgcgcctattgaaaactccgag atggcttctcttcaaacccaaatgatctcg gcatattctgctcctgtggtagctgag ttgtcataaatgcacccaacagttacaacg ccaaaatgttgagaggtgcacatgaacc
Velikost PCR produktu
organismus
84 bp
specifický RRsója
78 bp
referenční RRsója
92 bp
specifický kukuřiceMON810
78 bp
referenční kukuřiceMON810
108 bp
specifický kukuřiceNK603
70 bp
referenční kukuřiceNK603
122 bp
referenční hrách
417 bp
referenční hrách
748 bp
referenční hrách
1129bp
referenční hrách
Tabulka 6. Teplotní program pro amlifikaci genů jednotlivých potravinových matric 26
Úvodní denaturace aktivace Hot Star Taq DNA polymerázy 95°C 15min
Počet cyklů 40 Denaturace
Anelacea
Polymerizace
Závěrečná polymerizace
94°C 30 s
58°C 30 s
72°C 1 min
72°C 5 min
Tabulka 7. Vyhodnocení max.času amplifikace fragmentů lektinového a glutamínsyntetázového genu sóje Zpracování Sušení (100°C) Sušení (200°C)
913 bp <60 min <30 min
Velikost fragmentů 737 bp 410 bp 201 bp <120 min <225 min <225 min <60 min <60 min <90 min
120 bp <225 min <90 min
Obrázek 1A. Degradace DNA hrachu sušeném při 200°C 1. dráha standard mol. hmotností 250 bp, 2. dráha nativní DNA izolovaná z listů hrachu 3. dráha 0 min, 4. dráha 10 min, 5. dráha 20 min, 6. dráha 30 min, 7. dráha 40 min, 8. dráha 50 min, 9. dráha 60 min Obrázek 1B. Degradace DNA sóje sušené při 200°C v závislosti na čase. Elektroforetický záznam po izolaci metodou GeneSpin. 1. dráha standard mol. hmotností 250 bp, 2. dráha 0 min, 3. dráha 7 min, 4. dráha 15 min, 5. dráha 30 min, 6. dráha 45 min, 7. dráha 60 min, 8. dráha 75 min, 9. dráha 90 min, 10. dráha 120 min
27
Obrázek 2. Degradace DNA hrachu autoklávovaného při 120 °C v závislosti na čase. Elektroforetický záznam po izolaci metodou GeneSpin. 1. dráha standard mol. hmotností 250 bp, 2.dráha nativní DNA izolovaná z listů hrachu 3. dráha 0 min, 4. dráha 10 min, 5. dráha 20 min, 6. dráha 30 min, 7. dráha 45 min 8. dráha 50 min Obrázek.3. Detekce PCR fragmentů (286bp) transgenu epsps RoundupReady (92%) sójového šrotu po sušení při teplotě 100ºC v závislosti na čase. Dráha č.1 - standard mol. hmotnosti 100bp, dráha č.2 – neg. kontrola (nemodifikovaná sója), dráha č.3negkontrola (nemodifikovaná sója) dráha č.4 – pozitiv. kontrola (RR sója.), dráha č.5 – negativ. kontrola, dráha č.6 - 30 min, dráha č. 7 – neg. kontrola, dráha č. 8 – 45 min, dráha č.9 – neg. kontrola , dráha č.10 - 60 min, dráha č.11 – neg. kontrola, dráha č.12 – 120 min, dráha č.13 – neg. kontrola, dráha č.14 – 180 min, dráha č.15 – neg. kontrola, dráha č. 16 – 225 min
A
B • referenční materiál x analyzovaný vzorek
Výstup RealTreshold cyklus
Fluoresc Počet cyklů
Počet kopií
Obr. 4.A Výstup po Real-Time PCR záznamu pro kvantifikaci RRsójového šrotu (1,05%) -transgen Obr. 4.B Kalibrační křivka kvantifikace RRsójového šrotu pro transgen epsps
28
Detekce a kvantifikace genů Solanum tuberosum pomocí PCR Ivana Melenová, Anette Tizolová, Kamila Zdeňková Z nařízení (ES) 1829/2003 o geneticky modifikovaných potravinách a krmivech vyplývá povinnost značení všech potravin a krmiv obsahujících geneticky modifikované organismy a z geneticky modifikovaných organismů vyrobených. Proto je nezbytné vyvíjet spolehlivé metody kvantifikace geneticky modifikované DNA ve vzorcích. V této práci byla vyvíjena metoda pro kvalitativní stanovení přítomnosti (detekci) geneticky modifikované DNA ve vzorku bramboru a dále testována metoda pro detekci a kvantifikaci geneticky modifikovaného bramboru. Nejprve bylo nutné získat z rostlinného materiálu DNA odpovídající kvality a koncentrace a to jak ze vzorků bramboru, tak z certifikovaného geneticky modifikovaného i nemodifikovaného materiálu pro účely vytvoření kalibrační křivky, na jejím základě lze určit kvantitativně procentuální obsah geneticky modifikované DNA ve vzorku. Metody pro identifikaci a kvantifikaci určité odrůdy geneticky modifikovaného bramboru zahrnují dvě reakce – amplifikaci bramborové DNA a amplifikaci transgenního úseku. Byly testovány tři páry primerů navržené pro druhově specifickou reakci. Primery PAT specifické k patatinovému genu, primery StLS specifické ke genu stonkového/listového světlem indukovatelného proteinu a certifikované referenční primery UGP specifické ke genu pro UGPasu. Všechny zmíněné primery byly testovány pomocí Real – Time PCR s barvivem SYBR Green I® a primery StLS a UGP byly testovány pomocí Real – Time PCR se specifickými TaqMan® próbami. Pro detekci přítomnosti geneticky modifikovaného úseku bramborové DNA byly použity primery P35S specifické k 35S CaMV promotoru (z viru květákové mozaiky) a certifikované primery EVENT specifické k transgennímu úseku odrůdy EH92-527-1 (Amflora). Jak se předpokládalo, DNA byla amplifikována v obou uspořádáních Real – Time PCR s barvivem SYBR Green I® i specifickými TaqMan® próbami. Kvantifikační systém primerů UGP, EVENT a k nim navržených specifických prób byl úspěšně testován na uměle připravených vzorcích. Věříme, Ńe tato metoda bude v budoucnu použita pro kvantifikaci geneticky modifikované DNA v reálných vzorcích, které zatím nejsou k dispozici. Uvedení odrůdy Amflora do tržní sítě se po letošním odkladu plánuje na rok 2009.
29
