Geneticky modifikované

Mr

1

2

3

4

5

6

Nt

500 bp

100 bp

Mr 1

2 3 500 bp

4

5

6

7

8

9 Nt

200 bp

Obr. 1: Ověření možnosti amplifikace DNA Obr. 2: Ověření možnosti amplifikace DNA rostlin kukuřice pomocí PCR s primery Plant1/Plant 2. pomocí PCR s primery Plant1/Plant 2. Dráha 1: kukuřice; dráha 2: MON810; dráha 3: Bt176; dráha 4: Bt11; dráha 5: T25; dráha 6: Bt10; Nt: beztemplátová kontrola; Mr: marker 100 bp DNA ladder, očekávaná velikost produktu: 500 – 600 bp.

Dráha 1: oves; dráha 2: ječmen; dráha 3: pšenice; dráha 4: slunečnice; dráha 5: hrách; dráha 6: tabák; dráha 7: řepka; dráha 8: sója; dráha 9: kukuřice; Nt: beztemplátová kontrola; Mr: marker 100 bp DNA ladder, očekávaná velikost produktů: 500 – 600 bp.

Geneticky modifikované organismy v potravinářských technologiích: význam a detekce Kamila Zdeňková

Obsah přednášky • • • • • • • • • • • •

GMO, definice, legislativa význam GMO přehled metod detekce GMO metody založené na polymerásové řetězové reakci (PCR) metody založené na detekci proteinu biočipy PCR s detekcí v reálném čase (real on time PCR, qPCR) digitální PCR (dPCR) kvantifikace GMO referenční materiály ELGL a Konsorcium zástupců laboratoří v ČR zabývajících se detekcí GMO normy

Definice GMO GMO organismus, kromě člověka, jehož dědičný materiál byl změněn genetickou modifikací* Genetická modifikace cílená změna dědičného materiálu organismu způsobem, kterého se nedosáhne přirozenou rekombinací. Tato cílená změna dědičného materiálu může být dvojího typu: 1) zavedení cizího genu do DNA hostitelské buňky, nezávisle na příbuznosti dárce a příjemce, přičemž tento cizorodý gen nazýváme transgen, a organismy takto upravené transgenní nebo rekombinantní 2) gen do hostitelské buňky není vpraven, ale naopak je z ní vyjmut, nebo je utlumena jeho činnost Výsledkem genetické modifikace může tedy být buď získání nové vlastnosti, nebo naopak potlačení vlastnosti nežádoucí*.

Literatura a použité zdroje * Zákon č. 78/2004 Sb., o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a produkty a o změně některých souvisejících zákonů http://www.env.cz/AIS/web-pub.nsf/$pid/MZPMVF3V1K0U/$FILE/oer-zak_78_2004-20040122.pdf

.

Geneticky modifikované organismy (GMO) mikroorganismy

živočichové

rostliny

Přenos genů – horizontální přenos: Lidské geny do prasat, ovcí….. Bakteriální geny do rostlin….. Hmyzí, kvasničné a savčí geny do rostlin…..

Kde lze využít GMO Medicína • např. lidský růstový hormon (dříve z podvěsku mozkového mrtvol, dnes produkce z 10 litrů kultury rekombinantní E. coli pro několik set dětí), vakcíny, genová terapie

Zemědělství, potraviny

Dekontaminace životního prostředí

The Plant Journal 49, 276-288.

Důvody přípravy GMO • Zvýšit výnosy a nutriční hodnotu zemědělských plodin, produkci hospodářských zvířat, drůbeže a ryb a omezit chemizaci v zemědělské výrobě • Snížit ztráty při pěstování zemědělských plodin a chovu hospodářských zvířat • Zlepšit chuť, kvalitu a trvanlivost potravin, modifikací rostlin získat nové suroviny pro chemickou výrobu • Připravit enzymy s novými vlastnostmi a nové typy léčiv a biopreparátů, vyznačující se vyšší účinností bez nežádoucích účinků • Využít mikroorganismy pro ekologické čištění vody a půdy • Připravit transgenní rostliny a zvířata produkující farmakologicky aktivní látky • Zdokonalit diagnostiku dědičných nemocí a vyhledávání nosičů genetických poškození • Zavést nové způsoby léčby genetických onemocnění (genová terapie dědičných a nádorových onemocnění) • Pomoc při záchraně organismů ohrožených vymíráním

Centrální úloha E. coli • Oblíbený model pro molekulární charakterizovaných mutantů, regulace

genetiky,

existovala

řada

• Genové exprese dobře popsaná a jednoduchá, široký výběr plasmidů

• Proto jedinečná oproti ostatním mikrobiálním systémům • E. coli nejvíce využívaná i při vnášení genů do ostatních organismů (jako mezikrok)

• Technicky je klonování v E. coli jednodušší než přímo v ostatních organismech

Způsoby nakládání s GMM • Způsoby nakládání s GMM vycházejí z obecných zásad nakládání s mikroorganismy. Z hlediska bezpečnosti jsou mikroorganismy klasifikovány do čtyř skupin. Tato klasifikace mikroorganismů je akceptovaná EU legislativou a vychází z principů vypracovaných Světovou zdravotnickou organizací (WHO): 1. skupina – organismy, u kterých je nepravděpodobné, že mohou vyvolat onemocnění člověka 2. skupina – organismy, které mohou vyvolat onemocnění a mohou ohrozit obslužný personál. Je však nepravděpodobné jejich masové šíření a je známá účinná profylaxe a léčení 3. skupina – organismy, které mohou vyvolat závažná onemocnění lidí a představují vážné riziko pro obslužný personál. Je u nich nebezpečí šíření v populaci, ale je známá účinná profylaxe a léčení 4. skupina – organismy, které působí velmi závažná onemocnění lidem a mohou vážně ohrozit obslužný personál. Zároveň se mohou nebezpečně šířit v populaci. K omezení jejich šíření není k dispozici účinná profylaxe a jejich léčba není zvládnutá.

GM rostliny Zemědělství

Medicína

Remediace

- kukuřice - sójové boby - bavlník - řepka - rýže

- ječmen - len - tabák - kukuřice - brambory - hrách

- rostliny s velkým množstvím biomasy - topol, switch grass....

http://www.aros.cz/sk/krmiva/repka-olejka/ http://www.osel.cz/tisk.php?clanek=3060 http://www.svet-potravin.cz/clanek.aspx?id=2196&idreturn=0 http://www.biolib.cz/cz/taxonimage/id18074/

Transgenní rostliny • transgenní plodiny mohou nést velmi odlišné vlastnosti • výhodné pro pěstitele, spotřebitele či různá odvětví průmyslu • často se setkáváme s jejich rozdělením do několika skupin (generací)

Transgenní rostliny 1. První generace plodin • Plodin zahrnuté do této skupiny se vyznačují přínosy zejména pro pěstitele: usnadňují ochranu proti chorobám, škůdcům a plevelům. • Přínosem je i větší šetrnost k životnímu prostředí v důsledku zjednodušení dosavadních technologií • Výhoda pro spotřebitele je nepřímá a může (ale také nemusí) spočívat v nižší ceně produktu. 2. Druhá generace plodin • Transgenní plodiny odolné abiotickým stresům, například rezistence nebo tolerance k chladu, suchu, zasolení půdy či nedostatku světla. • Primárně poskytuje výhody zemědělcům. 3. Třetí generace plodin • Transgenní plodiny s vyšší nutriční hodnotou: např. vhodnější složení mastných kyselin, zastoupení deficitních aminokyselin, upravený obsah vitamínu apod. a antikancerogenními a jinými zdravotně působícími a léčivými účinky. • Přímé výhody pro spotřebitele a někdy se též označují jako plodiny s upravenými výstupními vlastnostmi.

4. Čtvrtá generace plodin • Transgenní plodiny pěstované jako ekologicky výhodné suroviny pro některá průmyslová odvětví. 5. Pátá generace plodin • Transgenní plodiny pěstované jako náhrada fosilních paliv (výroba etanolu a bionafty).

Transgenní rostliny • V současné době jsou pěstovány především plodiny první generace nesoucí transgeny pro toleranci k neselektivním herbicidům, umožňující snadnější ochranu porostů před zaplevelením, dále plodiny s vnesenou rezistencí k hmyzím škůdcům, popřípadě kombinace obou těchto vlastností.

Potraviny GM živočišného původu • Členové Evropského parlamentu preventivně odmítají dovoz masa, vajec a mléka nejen z geneticky modifikovaných, ale i klonovaných zvířat

• Naše SVS vydala prohlášení (Potravinářský zpravodaj č.6, ze 7.9.2010) ústy •

tiskového mluvčí SVS Ing. J. Dubena: „Klonů se netřeba báti, život nekrátí“. Není pochyb o tom, že ryby (nejen losos) budou prvními transgenními živočišnými produkty, které se objeví v distribuční síti.

GM losos

Klon http://www.bbc.co.uk/schools/gcsebitesize/science/edexcel/genes/reproductionandcloningrev4.shtml

http://www.tehrantimes.com/index_View.asp?code=226295

Důvody modifikace potravinářských surovin • Tolerance k herbicidům

• Rezistence vůči hmyzu, virům, bakteriím, plísním • Rezistence vůči stresovým faktorům (suchu, mokru, teplu, mrazu, zasolení půdy atd.) – vzhledem k diskutovaným změnám klimatu, zvyšování počtu obyvatel planety atd. • Zlepšení technologických vlastností (nejen pro potravinářské účely)

• Zlepšení nutriční kvality a zvýšení obsahu látek chránících naše zdraví („GM Crops for Health“)

Každoroční údaje: ISAAA • mezinárodní nezisková organizace ISAAA - Mezinárodní služba pro získávání údajů o používání zemědělských biotechnologií čili International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications • http://www.isaaa.org

Pěstování GM plodin – 134 milionů hektarů v roce 2009; 77% sojových bobů, 49% bavlníku Pěstování GM plodin – 175,2 milionů hektarů v roce 2013; 79% sojových bobů, 70% bavlníku

Literatura a použité zdroje

http://www.isaaa.org/resources/publications/briefs/44/executivesummary/default.asp

Potřeba většího množství surovin pro výživu obyvatelstva Dr. Clive James, executive director of the International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications (ISAAA), said that “In the next 50 years, the global population will consume two times as much food as humans have consumed since the beginning of agriculture 10,000 years ago,” in a keynote at the Agricultural Biotechnology International Conference (ABIC 2010) in Saskatoon

http://www.isaaa.org

Za dalších 50 let spotřebuje populace 2x více jídla než spotřebovali lidé od počátku zemědělství – před 10 000 lety.

GM plodiny pěstované ve světě • • • •

sója kukuřice bavlník řepka

• • • • • • • •

dýně papája cukrovka vojtěška rajče paprika topol brambory

• • •

karafiát petúnie modrá růže

GMO v oběhu v EU

EU pěstování

• • • • • •

kukuřice, sója, řepka, bavlník, cukrovka, mikroorganismy •Brevibacterium lactofermentum •Saccharomyces cerevisiae

Zdroj: Literatura a použité zdroje

http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm


http://eagri.cz/public/web/file/278790/Vyvoj_ploch_GM_kukurice_v_EU_2005_2013.pdf, 17.4.2014

GM potraviny - EU V dubnu 2014 je v EU povoleno pěstovat: Bt kukuřici MON810

K uvedení na evropský trh je povoleno 50 druhů genetických modifikací těchto rostlin V dubnu 2014: 29x kukuřice, 8x bavlník, 7x sója, 3x řepka olejka, 1x cukrová řepa a 2x kvasinky a bakterie.


http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm

Zdroj: GMO bez obalu

GM potraviny - EU Evropský spotřebitel dle platné legislativy má mít možnost svobodné volby v rozhodování, zda si GM potraviny koupí či nikoliv. Produkty sestávající z GMO nebo je obsahující, potraviny vyrobené z GMO nebo krmiva vyrobená z GMO, které jsou uvedené na trh v souladu s právními předpisy EU, musí mít na etiketě uvedena slova „Tento produkt obsahuje geneticky modifikované organismy“. Toto se nevztahuje na potraviny obsahující GMO, jehož podíl v jednotlivých složkách nebo v jednosložkové potravině není vyšší než 0,9 % za předpokladu, že přítomnost tohoto materiálu je náhodná nebo technicky nevyhnutelná. Zdroj: GMO bez obalu

Označovat se musí • produkty sestávající z GMO nebo obsahující GMO • produkty vyrobené z GMO • i bez důkazu přítomnosti dotčeného GMO • mouka, olej (v obchodech v ČR) apod.

• produkty klasického a ekologického zemědělství • pokud obsahují více než 0,9 % GMO • pokud obsahují jakékoliv množství záměrné příměsi GMO (náhodné a technicky nevyhnutelné příměsi do 0,9 % jsou tolerovány)

> 0,9 % GMO Zdroj:

Legislativa EU • GMO jsou součástí společné politiky EU • rozhodnutí na úrovni EU platí pro všechny členské státy • využívání (tzn. nakládání) je převážně regulováno na úrovni EU

• ČR je součástí EU (od 2004) • právní předpisy a rozhodnutí EU v oblasti GMO jsou pro ČR závazná

Základní právní předpisy v EU  směrnice 2001/18/ES o záměrném uvolňování GMO do životního prostředí a o zrušení směrnice 90/220/EHS  nařízení 1829/2003 o geneticky modifikovaných potravinách a krmivech  nařízení 1830/2003 o sledovatelnosti a označování GMO a sledovatelnosti potravin a krmiv vyrobených z GMO a o změně směrnice 2001/18/ES  nařízení 1946/2003 o přeshraničních pohybech GM  

účinnost od data vstupu ČR do EU platí přímo, kompetence a sankce v národních předpisech


http://eur-lex.europa.eu/cs/index.htm, 13.4.2012.

Základní právní předpisy v ČR  Zákon č. 78/2004 Sb., o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty, ve znění pozdějších předpisů  poslední novela č. 346/2005 Sb.  nahradil první zákon o nakládání s GMO v ČR: zákon č. 153/2000 Sb.  Prováděcí vyhlášky – Vyhláška č. 209/2004 Sb., o bližších podmínkách nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty – Vyhláška č. 29/2010 Sb., kterou se mění vyhláška č. 209/2004 Sb., o bližších podmínkách nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty, ve znění vyhlášky č. 86/2006 Sb.

• •

povinnost značit potraviny a krmiva obsahující více než 0,9 % GMO potřeba zavedení spolehlivého, účelného a rychlého kontrolního systému pro detekci GMO v potravinách a krmivech

http://eagri.cz/public/web/mze/legislativa/pravni-predpisy-mze/tematicky-prehled/Legislativa-ostatni_uplna-zneni_zakon-200478-GMO.html a http://www.cizp.cz/Pravni-normy/Ochrana-prirody (17.11.2012)

Působnost zákona GMO schopné rozmnožování a výrobky obsahující tyto organismy Nevztahuje se na uvádění do oběhu léčiv a přípravků na ochranu rostlin obsahujících GMO

Nevztahuje se na uzavřené nakládání s prokazatelně bezpečnými geneticky modifikovanými mikroorganismy (GMM)

Stav problematiky ve světě (mimo zemí EU) • problematika GMO je řešena také v rámci Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj (OECD), jíž je ČR členem a Světové zdravotní organizace (WHO) • Evropské země nenáležící do EU mají také zavedeny systémy značení GMO. • v Norsku se značí potraviny obsahující více než 2 %, ve Švýcarsku jsou značena semena obsahující více než 0,5 % GMO, potraviny obsahující více než 1 % GMO, míchané krmivo obsahující více než 2 % a složky krmiva obsahující více než 3 % příměsi GMO. Ostatní státy značící GMO produkty jsou Nový Zéland a Austrálie (1 %), Jižní Korea (3 %), Tchaj-wan a Japonsko (5 %)

• v Číně musí být semena, hospodářská zvířata, drůbež, rybí potěr a mikroorganizmy a produkty z GM zvířat, rostlin či mikroorganizmů viditelně označeny. Musí být označeny i produkty, které již GMO neobsahují, ale jsou z nich vyrobené a to i v případě, že GM ingredience nemůže být ve finálním produktu detekována

Stav problematiky ve světě (mimo zemí EU) • některé státy. označování přítomnosti GMO nevyžadují, je pouze dobrovolné (USA, Kanada, Argentina).

• v USA neexistuje zvláštní zákonná norma pro GMO, ale využívají se stávající zákony. Legislativa je v USA založena na konstatování, že potenciálně škodlivá není samotná metoda transgenoze, ale některé specifické vlastnosti organizmů, bez ohledu na to, jakým způsobem vznikly. Riziko je tedy odvozováno od vlastností organismu. Toto pravidlo platí od roku 1986 a vyplývá z něho, že např. účinnost transgenní rostliny s vloženým genem bakterie Bacillus thuringiensis, proti škůdcům je posuzována podle zákona o pesticidech. V důsledku této praxe spadá posuzování GMO pod různé instituce a pod různé zákony

Legislativa shrnutí • příprava, testování, distribuce a využívání GMO podléhají v současné době v řadě zemí celého světa platné legislativě • v EU se řídí principem předběžné opatrnosti platí tedy „co není dovoleno, je zakázáno“ • podstatnou a významnou částí legislativy je hodnocení rizika daného GMO • legislativa v oblasti používání GMO existuje již od 90. let minulého století • posuzování každého případu zvlášť na základě všech dostupných znalostí • Česká Republika jako jeden ze států Evropské Unie se řídí směrnicemi EU, a nakládání s GMO podléhá zákonům ČR

• podle zákonů všech členských zemí EU je předpokladem pro schválení GM potraviny stejná bezpečnost, výživová hodnota a zdravotní nezávadnost jako je u srovnatelného konvenčního výrobku. • dále musí být GM odrůda shodná s příslušnou konvenční odrůdou ve všech podstatných znacích s výjimkou dané genetické modifikace (Ondřej a Drobník, 2002). • testování je velice důkladné a často daleko podrobnější než u konvenčních odrůd, a proto se dá říci, že GMO jsou nejvíce kontrolované organismy používané v zemědělství, a jejich schválení lze považovat za zcela důvěryhodné.

Struktura genetických konstruktů v rostlinách KONSTRUKT

Promotor

TRANSGEN

Selekce Terminátor

Zjednodušené schéma rozboru vzorku pro splnění platné EU legislativy Detekce GMO

Monitorování přítomnosti GMO

Positivní

Identifikace

Negativní

Identifikace a určení GMO

Autorizované Neschválené GMO: Aktuální seznam na http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/e merg-unauth.html

Kvantifikace Kvantitativní rozbor jednotlivých složek Musí být značeno?

> 0,9% Značení vyžadováno

< 0,9% Značení není nutné

Neschválené Nezákonné

Metody používané pro detekci GMO Molekulárně -

Detekce

PCR a její variace (multiplex PCR, nested PCR)

biologické

DNA

Kvantitativní kompetitivní PCR (QC-PCR) PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase (qRT PCR)

metody

PCR-ELISA SNPlexTM „genotyping“ metoda Southernův přenos Biočipy, sekvenace Detekce

Reversní transkripce – PCR (RT-PCR)

RNA Northern přenos RPA (ribonuclease protein assay) Imunochemické

Detekce

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

metody

proteinu

Western přenos (imunoblot) Imunochromatografický test (Lateral flow imunoassay)

Ostatní

Určení aktivity produktu transgenu

techniky

Chromatografie Určení aktivity produktu transgenu

Literatura a použité zdroje 1

Rozšířené schéma z Zdeňková K., Pazlarová J., Macková M., Demnerová K.: Chem. Listy 96, 25-32 (2002).

Polymerasová řetězová reakce (angl. Polymerase Chain Reaction – PCR)

 in vitro reakce umožňující amplifikaci DNA  katalyzována termostabilní DNA polymerasou  k namnožení cílového úseku používá oligonukleotidových primerů  navržena Kary B. Mullisem roku 1983  Nobelova cena udělena roku 1993 Vlastní PCR - cyklické opakování 3 kroků

Fáze

Průůběěh

Teplota

1.

DENATURACE

tepelné odděělen í vláken dvojšroubovice DNA

94 - 96°C

2.

ANNEALING

přřipojen í primerůů k jejich komplementárn ím úsekůům v DNA

50 - 65°C

3.

ELONGACE

prodloužžen í primerůů polymerasou

72°C

Polymerasová řetězová reakce (angl. Polymerase Chain Reaction – PCR)

Denaturace

Nasedání primerů

Prodlužování primerů


Obrázek: Andy Vierstraete (1999)



nejdostupnější metodou detekce produktů PCR je elektroforesa v agarosovém gelu



interkalační barvivo Ethidium bromid či SYBR Green I

1000bp

500bp

-

1

2

3

4

+

429bp

Detekovaný vzorek*

Směr DNA produktů

Mr

100bp

+

-

Nemodifikovaná plodina (negativní kontrola)

1

0,1% GM plodina

2

0,5% GM plodina

3

1% GM plodina

4

2% GM plodina

+

5% GM plodina (pozitivní kontrola) Negativní a pozitivní kontroly se zařazují z důvodu odhalení případné kontaminace či technické chyby, která by mohla za konečné zkreslení výsledků. Z důvodu jistoty u celého průběhu se obě kontroly řadí mezi vzorky již na počátku celého testu.

* Ústav pro referenční materiály a měření (Institute for Reference Materials and Measurements), organizace Evropské komise EC JRC, http://www.irmm.jrc.be.

Multiplex PCR  PCR

s

primerů

násobným množstvím párů

Výhoda: + možnost analysy více parametrů Nevýhoda: - zvýšení tvorby nespecifických produktů - možná diskriminace delších DNA fragmentů

Příklad multiplex PCR Mr

Nt

1

500 bp

2

3 101 bp

4

5

6

151 bp

100 bp Detekční limit „duplex“ PCR s primery P35S 1-3´/ P35S 1-5´ a nosT 2-3´/ nosT 2-5´. Dráha 1: nemodifikovaná sója, dráha 2: 0,1% RR sója, dráha 3: 0,25% RR sója, dráha 4: 0,5% RR sója, dráha 5: 1% RR sója, dráha 6: 5% RR sója, Nt: beztemplátová kontrola. Mr: marker 100 bp DNA ladder, očekávaná velikost produktů: 101 a 151 bp.

Nested PCR  dvě po sobě následující amplifikační reakce  dva druhy oligonukleotidových primerů - vnitřní a vnější  templát první reakce - DNA extrahovaná z vyšetřovaného vzorku  templát druhé reakce - produkt získaný první amplifikací + zvýšení citlivosti a přesnosti

1. PCR

vnější primery DNA templát cílový produkt 1. PCR

2. PCR

vnitřní primery DNA templát (cílový produkt 1. PCR) Cílový produkt 2. PCR

Standardy a kontrola PCR procesu •

vhodné zařazení pozitivní, negativní či beztemplátové kontroly PCR procesu •

negativní kontrola - necílová DNA

•

beztemplátová kontrola - sterilní voda

•

pozitivní kontrola - ověřená cílová sekvence

•

negativní nebo beztemplátové kontrola: ověření kontaminace reagencií a používaných pomůcek

možné

•

pozitivní kontrola: ověření funkčnosti všech kroků

•

vhodné zařazení beztemplátové kontroly celého procesu analýzy vzorku, tzn. nejprve je podrobena izolačnímu procesu společně s analyzovaným vzorkem (beztemplátová kontrola izolačního procesu) a dále je podrobena všem PCR procesům jako analyzovaný vzorek

ad 1) Transgenní odrůda sóji Roundup Ready® Sója GTS40-3-2

Rostlinná DNA

P-E35S

Petunia EPSPS CTP

EPSPS

T-nos

Účel: Tolerance k herbicidu glyfozátu (obchodně nazývaného


http://www.agbios.com/dbase.php?action=ShowProd&data=GT200&frmat=LONG http://www.roundup.cz/roundup161.html

Rostlinná DNA

).

ad 2) Detekce GMO pomocí metody PCR


Zdeňková K., Pazlarová J., Macková M. a Demnerová K.: Přehled metod detekce GMO v potravinách a potravinářských surovinách, Chemické listy, 96 (2002), 26.

Analýza vzorku sóji 1. zisk dostupných informací o GM sóje (studium databází) 2. zisk dostupných informací o metodách detekce a kvantifikace (studium databází a studium norem (Comité Europeén de Normalisation (CEN)). Výběr vhodné a dostupné metody 3. výběr vhodného referenčního materiálu 4. vlastní analýza

ad 1) GM odrůdy sóji: svět Event

Company

Description

A2704-12, A2704- Bayer CropScience (Aventis 21, A5547-35 CropScience(AgrEvo))

Glufosinate ammonium herbicide tolerant soybean produced by inserting a modified phosphinothricin acetyltransferase (PAT) encoding gene from the soil bacterium Streptomyces viridochromogenes.

A5547-127

Bayer CropScience (Aventis CropScience(AgrEvo))


BPS-CV127-9

BASF Inc.

The introduced csr1-2 gene from Arabidopsis thaliana encodes an acetohydroxyacid synthase protein that confers tolerance to imidazolinone herbicides due to a point mutation that results in a single amino acid substitution in which the serine residue at position 653 is replaced by asparagine (S653N).

DP-305423

Pioneer Hi-Bred International Inc.

High oleic acid soybean produced by inserting additional copies of a portion of the omega-6 desaturase encoding gene, gm-fad2-1 resulting in silencing of the endogenous omega-6 desaturase gene (FAD2-1).

DP356043

Pioneer Hi-Bred International Inc.

Soybean event with two herbicide tolerance genes: glyphosate N-acetlytransferase, which detoxifies glyphosate, and a modified acetolactate synthase (ALS) gene which is tolerant to ALS-inhibitng herbicides.

G94-1, G94-19, G168

DuPont Canada Agricultural Products

High oleic acid soybean produced by inserting a second copy of the fatty acid desaturase (GmFad2-1) encoding gene from soybean, which resulted in "silencing" of the endogenous host gene.

GTS 40-3-2

Monsanto Company

Glyphosate tolerant soybean variety produced by inserting a modified 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) encoding gene from the soil bacterium Agrobacterium tumefaciens.

GU262



MON89788

Monsanto Company

Glyphosate-tolerant soybean produced by inserting a modified 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) encoding aroA (epsps) gene from Agrobacterium tumefaciens CP4.

OT96-15

Agriculture & Agri-Food Canada

Low linolenic acid soybean produced through traditional cross-breeding to incorporate the novel trait from a naturally occurring fan1 gene mutant that was selected for low linolenic acid.

W62, W98


Glufosinate ammonium herbicide tolerant soybean produced by inserting a modified phosphinothricin acetyltransferase (PAT) encoding gene from the soil bacterium Streptomyces hygroscopicus.


http://cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database, 15.4.2013, 11/2013 nedostupné

ad 1) GM odrůdy sóji povolené v EU Transformation event/ Unique ID/ Company Soybean (A2704-12) ACS-GMØØ5-3 Bayer

Genes Introduced / Characteristics

Authorized use

Authorization Expiration Date

Genetically modified soybean that contains: pat Foods and food ingredients, feed and products gene inserted to confer tolerance to the glufosinateother than food and feed containing or ammonium herbicide consisting of ACS-GMØØ5-3 soybean

07/09/2018

Soybean (MON89788) MON-89788-1 Monsanto

Genetically modified soybean that contains: cp4 epsps gene inserted to confer tolerance to the herbicide glyphosate

Foods and food ingredients, feed and products other than food and feed containing or consisting of MON-89788-1 soybean

03/12/2018

Soybean (MON40-3-2) MON-Ø4Ø32-6 Monsanto

Genetically modified soybean that contains: Foods and food ingredients, feed and products cp4 epsps gene inserted to confer tolerance to the other than food and feed containing or herbicide glyphosate consisting of MON 40-3-2 soybean

09/02/2022

Soybean (MON87701) MON-877Ø1-2 Monsanto

Genetically modified soybean that contains: cry1Ac Foods and food ingredients, feed and products gene inserted to confer protection against certain other than food and feed containing or lepidopteran pests consisting of MON-877Ø1-2 soybean

09/02/2022

Genetically modified soybean that contains: gat gene inserted to confer tolerance to the herbicide glyphosate gm-hra gene inserted to confer tolerance to the ALS-inhibiting herbicide

Foods and food ingredients, feed and products other than food and feed containing or consisting of DP-356Ø43-5 soybean

09/02/2022

Soybean (A5547-127) ACS-GMØØ6-4 Bayer

Genetically modified soybean that contains: pat gene inserted to confer tolerance to the glufosinate-ammonium herbicide

Foods and food ingredients, feed and products other than food and feed containing or consisting of ACS-GMØØ6-4 soybean

09/02/2022

Soybean (MON87701 x MON89788)

Genetically modified soybean that contains:

Foods and food ingredients containing, consisting of, or produced from MON-877Ø1-2 x MON-89788-1 soybean (including food additives)

27/06/2022

Soybean (356043) DP-356Ø43-5 Pioneer

MON-877Ø1-2 x MON89788-1 Literatura a použité zdroje

cry1Ac gene inserted to confer protection against certain lepidopteran pests cp4 epsps gene inserted to confer tolerance to the herbicide glyphosate

http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm, 11.2013

ad 1) GM odrůdy sóji povolené v EU podle databáze CERA

Event

Company

Description

A2704-12, A2704-21, A5547-35

Bayer CropScience (Aventis CropScience (AgrEvo))


Monsanto Company

Glyphosate tolerant soybean variety produced by inserting a modified 5-enolpyruvylshikimate-3phosphate synthase (EPSPS) encoding gene from the soil bacterium Agrobacterium tumefaciens.

Monsanto Company

Glyphosate-tolerant soybean produced by inserting a modified 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) encoding aroA (epsps) gene from Agrobacterium tumefaciens CP4.

GTS 40-3-2

MON89788


http://cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database, 15.4.2013

http://www.gmo-compass.org/eng/gmo/db/100.docu.html, 15.4.2013

ad 1) Transgenní odrůda sóji Roundup Ready® Sója GTS40-3-2

Rostlinná DNA

P-E35S

Petunia EPSPS CTP

EPSPS

T-nos

Účel: Tolerance k herbicidu glyfozátu (obchodně nazývaného



Rostlinná DNA

).

ad 2) Databáze JRC Ispra


http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/search?db=gmometh&q=soybean&jumpMenu2=.%2Fsearch%3Fdb%3Dgmometh% 6q%3Dac%253A (10.1.2013).

ad 2) Databáze Euginius • připravovaná databáze metod pro detekci GMO • zahrnuté všechny publikované články • poslední dodělávky, potom zkoušení. Pro veřejnost by mohla být přístupná v 2014 • http://www.euginius.eu/


http://www.wageningenur.nl/en/project/EUginius-GMO-database.htm, 30.04.2013.

ad 2) Detekce GMO pomocí metody PCR


Zdeňková K., Pazlarová J., Macková M. a Demnerová K.: Přehled metod detekce GMO v potravinách a potravinářských surovinách, Chemické listy, 96 (2002), 26.

Transgenní odrůda sóji Roundup Ready® Sója GTS40-3-2 Rostlinná DNA

P-E35S

Petunia EPSPS CTP

EPSPS

T-nos

414 bp

Le1

180 bp

92 bp

Le2 35Sp F

Rostlinná DNA

nos1

35Sr R

nos3

447 bp

GMO5

GMO9 169 bp

GMO7

GMO8

Účel: Tolerance k herbicidu glyfozátu - obchodně nazývaný Literatura a použité zdroje


Certifikované referenční materiály (CRM)

•

http://www.erm-crm.org/Pages/ermcrmCatalogue.aspx

ad 3) Referenční materiály (1/4) 1. materiály různého procentuálního zastoupení GMO

2. izolovaná genomová DNA 3. plazmidová DNA s vloženým cílovými úseky, kterými jsou nejčastěji PCR produkty 

standardy GMO jsou připravovány v Institutu pro referenční materiály a měření (Institute for Reference Materials and Measurements – IRMM, Geel, Belgie)



jedno z výzkumných center EK, spolupracuje s ostatními instituty JRC, s univerzitami, výzkumnými centry a s mezinárodními organizacemi



katalog dostupných certifikovaných referenčních materiálů (angl. certified reference material, CRM) http://www.erm-crm.org/Pages/ermcrmCatalogue.aspx

ad 3) Referenční materiály (2/4)  plazmidy jsou oproti přirozeným plazmidům upravené a obsahují tři důležité sekvence:  počátek replikace  selekční marker  polyklonovací místo (angl. polylinker). Při přípravě standardů pro detekci a kvantifikaci GMO bývají použity plazmidy, které se exprimují ve velkém počtu kopií (angl. high copy number) jako například pCR2.1 či pBR322.  mohou obsahovat jednu vloženou sekvenci (STPs, angl. single-target plasmids) nebo více vložených sekvencí (MTPs, angl. multiple-target plasmids)

 v současné době je jako standard pro kvantifikaci GMO nejčastěji používána genomová DNA izolovaná z referenčních materiálů GM odrůd  plazmidy jako kalibrátory pro kvantifikaci GMO se začaly používat v posledních patnácti letech, rozsah jejich použití rostl (max. 2006-2008), poté ustálený

TOPO TA klonovací kit Plasmid pCR2,1-TOPO, vkládání PCR produktů

katE

CTP

P-35S

StLS

pCR®2,1 – TOPO plazmid

ad 3) Referenční materiály (3/4)  státní laboratoř Velké Británie LGC provedla porovnání plazmidových a genomových DNA standardů pro kvantifikace RR sóji pomocí qRT PCR, bylo dosaženo srovnatelných výsledků s použitím obou standardů (zástupce LGC, ústní sdělení, 2006 a lit. 3)  EK – JRC - IRMM připravuje dva typy plazmidů pro diagnostiku GMO  připraveno více než 40 plazmidů označených jako pENGL pro detekci a identifikaci GMO (např. rýže Bt63: pENGL-00-EM02/0601M)  cca 10 plazmidů označených pJANUS (kvantifikace jednotlivých GMO)  uloženy v úřední sbírce LMBP-BCCMTM a jsou k dispozici od léta roku 2006 Literatura a použité zdroje

Doporučení Komise 2004/787/ES : o technických pokynech pro odběr vzorků a detekci geneticky modifikovaných organizmů a materiálu vyrobeného z geneticky modifikovaných organizmů nebo produktů s jejich obsahem podle nařízení (ES) č. 1830/2003, ze dne 4. října 2004. Internet (13. 7. 2006): http://engl.jrc.it/docs/HGE%20release%20version%201.pdf 3 http://gmoglobalconference.jrc.ec.europa.eu/2008/Posters/T.1.1%20ptetra.pdf

ad 3) Referenční materiály (4/4) 

IRMM certifikované referenční plasmidy1 1. 2. 3.

MON810 kukuřici (ERM-AD413) NK603 kukuřici (ERM-AD415) 98140 kukuřici (ERM-AD427)

 firma Nippon gene (http://www.nippongene.com) produkuje plasmidy jako referenční materiál a GMO detekční kity2

Literatura a použité zdroje 1 http://irmm.jrc.ec.europa.eu/Pages/rmcatalogue.aspx,

13.11.2013 Žel, J., Milavec, M., Morisset, D., Plan, D., Van den Eede, G., Gruden, K.: SprinqerBriefs in Food, Health and Nutrition, 2012, 1-95, DOI: 10.1007/978-1-4614-1390-5_1. 2

ad 4) Analýza reálných vzorků

1. Izolace DNA (ideálně: jednoduchá, snadno reprodukovatelná, bezpečná a levná metoda pro izolaci DNA) 2.

Druhově specifické PCR (nekódující úsek chloroplastové DNA a/nebo úsek genomu rostliny)

3.

Monitorovací PCR (P-35S CaMV promotor, selekční gen npt II nebo T-nos terminátor)

4.

Identifikace transgenu

5.

Kvantifikace obsahu GMO pomocí PCR s fluorescenční detekcí (qPCR, dPCR)

Transgenní odrůda sóji Roundup Ready® Sója GTS40-3-2 Rostlinná DNA

P-E35S

Petunia EPSPS CTP

EPSPS

T-nos

414 bp

Le1

180 bp

92 bp

Le2 35Sp F

Rostlinná DNA

nos1

35Sr R

nos3

447 bp

GMO5

GMO9 169 bp

GMO7

GMO8

Účel: Tolerance k herbicidu glyfozátu - obchodně nazývaný Literatura a použité zdroje


Výsledky analýzy vzorků semen sóji G

A

B C D1

D2 Dráhy 1-3: vzorek 1; dráhy 4-6: vzorek 2; dráhy 7-9: vzorek 3; dráha 10: 1 % RR sója. NtE: negativní kontrola izolačního procesu, Mr: marker λ/HindIII DNA (G), marker 100 bp DNA ladder (A-D2). Očekávané velikosti produktu: A – 414 bp, B – 92 bp, C – 180 bp, D1 - 447 bp a D2 169 bp.

Metody založené na detekci proteinu

 specifická interakce antigenu (Ag) s protilátkou (Ab)  běžně používány pro studium akumulace proteinů v transgenních rostlinách Pro detekci GMO je nejčastěji používána:  ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

Enzymová imunoanalysa na pevné fázi ELISA imunoanalytická metoda, které ve fázi detekce nebo kvantifikace používají enzymovou reakci 

jeden z imunoreaktantů (Ag, Ab) je vždy imobilizován na pevný nosič (membrána, skleněná podložka, stěna zkumavky nebo mikrotitrační destičky) 

nejčastější uspořádaní metody používané pro detekci GMO v potravinách je přímá nekompetitivní ELISA, tzv. sendvičový formát 

Přímá nekompetitivní ELISA

a) b) c) d) 



a)

b)

c)

protilátka imobilizovaná na povrchu mikrotitrační destičky přídavek vzorku specifická interakce protilátky a antigenu „Sendvič” antigenu a obou protilátek

d)

většinou dvě protilátky reagující s jinými determinantními skupinami na odlišné části molekuly antigenu - první Ab imobilizovaná na povrch nosiče a specificky interaguje s antigenem - druhá Ab je značená enzymem (nejčastěji peroxidasa, alkalická fosfatasa, -galaktosidasa a glukosa oxidasa). po přidání chromogenního substrátu je výsledná enzymová reakce vyhodnocena spektrofotometricky

Imunochromatografický test Lateral Flow Strip* + + + -

výsledky během 5-10 minut nízká cena jednoduchost provedení informativní stanovení, pozitivní výsledky testu musí být konfirmovány jinou metodou metoda je vhodná a v praxi používaná pro přímé získání prvních předběžných výsledků přímo na poli nebo při příjmu vzorků


* Ahmed F.E.: LabPlus international, 8-16 (2002).

Biočipy (microarrays nebo arrays)  kolekce mikroskopických spotů DNA navázaných k pevnému povrchu (např. sklo, plast nebo křemíkový čip)  až tisíce krátkých DNA sond komplementárních k hledaným sekvencím  založeno na klasické technologii hybridizace DNA  imobilizované DNA fragmenty (sondy) mohou být kratší oligonukleotidy (20-30 bp), PCR produkty, genomová DNA, umělé bakteriální chromosomy (BAC), plazmidy nebo i dlouhé oligonukleotidy  DNA biočipy jsou nejčastěji využívány k měření exprese velkého množství genů současně  NK bývají izolovány z buněk, RNA je převedena na cDNA nebo cRNA, a jsou amplifikovány pomocí PCR technik  řetězec NK hybridizuje se sondou imobilizovanou na povrchu pevného nosiče, detekce je prováděna buď stříbrem, chemiluminiscenčně (pro DIG značku) nebo přímo fluorescenčně

Biočipy (microarrays nebo arrays)

Navázaný cílový fragment Imobilizovaný DNA fragment

Pevný povrch Literatura a použité zdroje

Počítačový model prost. uspořádání na DNA biočipu. Převzato z http://www.npaci.edu/online/v4.12/dnachip_nhor_clip.jpg.

DualChip®GMO V2.0 (fa Eppendorf) 1) izolace DNA z analyzovaného vzorku 2) amplifikace DNA pomocí multiplex PCR procesů 3) hybridizace PCR prodůktů na čip 4) detekce hybridizovaných produktů 5) analysa výsledků

3h

1h

1h 30 m

10 min

Genomová DNA

DualChip® GMO V2.0 (fa Eppendorf) Screening target elements (12): • CaMV 35S promoter (p35S) • Nopaline synthase terminator (tNos) • Phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces hygroscopius (bar) • Phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes (pat) • The junction between the Nopaline synthase promoter and the neomycin phosphotransferase II gene (pNos-nptII), probe specific of Topas 19/2. • cry1Ab delta-endotoxin gene (cry1Ab) Three capture probes are used to detect this target element; each sequence is specific of the sequence present in a defined transformation event: – cry1Ab-1 probe specific of Bt176 – cry1Ab-2 probe specific of MON810 and its hybrids – cry1Ab-3/cry1Ac probe specific of Bt11, MON531, MON15985 and their hybrids • cry3Bb1 delta-endotoxin gene (cry3Bb1) • 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene (EPSPS) Three capture probes are used to detect this target element; each sequence is specific of the sequence present in a defined transformation event: – EPSPS-A probe specific of GA21 and its hybrids – EPSPS-B probe specific of RRS, NK603 and their hybrids – EPSPS-C probe specific of GT73, H7-1, MON1445 and their hybrids

Plant species target elements (7): • Invertase gene (Maize) • Cruciferin gene (Brassicaceae sp. including rapeseed) • Lectin gene (Soybean) • Glutamine synthetase gene (Sugar beet) • UDP-glucose pyrophosphorylase gene (Potato) • Oryza sativa root-specific gos9 gene (Rice) • Acyl carrier protein gene (Cotton)

Event-specific target elements (11): • Bt176 • MON810 • Bt11 • MON863 • GA21 • RRS • GT73 • T45 • MON1445 • MON531 • MON15985 Contamination control target element (1): • Cauliflower Mosaic Virus (CaMV)

DualChip® GMO microarrays enable the detection of the EU-approved genetically modified organisms (GMOs) by identifying their genetic elements. This system also facilitates the screening of other GMOs that contain corresponding transgene elements (about 60% of all GMOs worldwide). http://www.biochipnet.com/node/2952


http://www.eppendorf.com/int/index.php?l=251&action=document&sitemap=1&docnode=34901&pb=e06d300e66d607cf

Zjednodušené schéma rozboru vzorku pro splnění platné EU legislativy Detekce GMO

Monitorování přítomnosti GMO

Positivní

Identifikace

Negativní

Identifikace a určení GMO

Autorizované Neschválené GMO: Aktuální seznam na http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/e merg-unauth.html

Kvantifikace Kvantitativní rozbor jednotlivých složek Musí být značeno?

> 0,9% Značení vyžadováno

< 0,9% Značení není nutné

Neschválené Nezákonné

PCR s detekcí v reálném čase  PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase (qPCR, angl. Real on Time PCR)  monitorování vznikajícího produktu v průběhu celého amplifikačního procesu

 qPCR je nejpřesnější a nejvýhodnější v současné době dostupná kvantitativní metoda  vysoká pořizovací cena nástrojů  interkalační barviva - (např. SYBR green I, Ethidium bromid) = levnější

 fluorescenčně značené sondy - přesnější

CT

Prahový detekční cyklus CT (threshold cycle) – nejnižší cyklus ve kterém hodnota fluorescence měřeného vzorku vzroste nad hodnotu fluorescence pozadí

Fluorescence reportéru ( Rn)

Vzorek 1

2

3

4

5 beztemplátová kontrola

Ct

Amplifikační křivka Vzorek 1: 106 kopií cílového úseku vzorek 2: 105 kopií cílového úseku vzorek 3: 104 kopií cílového úseku vzorek 4: 103 kopií cílového úseku vzorek 5: 102 kopií cílového úseku zelená přímka znázorňuje mezní hodnotu pozadí

Počet cyklů

PCR  teoretická účinnost reakce - 100%  teoreticky dochází v každém cyklu ke zdvojnásobení

n

2^n 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128 8 256 9 512 10 1024 15 32768 20 1048576 25 33554432 30 1073741824 35 34359738368 40 1,09951E+12

N; N=N0*2^n No=1 No=10 1 10 2 20 4 40 8 80 16 160 32 320 64 640 128 1280 256 2560 512 5120 1024 10240 32768 327680 1048576 10485760 33554432 335544320 1073741824 10737418240 34359738368 3,43597E+11 1,09951E+12 1,09951E+13

N = N0

n (2)

N = počet molekul DNA v n-tém reakčním cyklu N0 = počet molekul DNA v 0-tém reakčním cyklu (na začátku reakce)

n = počet cyklů

Skutečná amplifikační účinnost reakce

N = N0 (1+E)n N = počet molekul DNA v n-tém reakčním cyklu N0= počet molekul DNA v 0-tém reakčním cyklu (na začátku reakce)

E = amplifikační účinnost reakce <0,1> n = počet cyklů

Amplifikační účinnost reakce E (angl. efficiency)

E=10(-1/sklon kalibrační křivky) – 1 (90-100% pokud je sklon mezi od -3,6 do -3,1) Teoreticky E=1, sklon –3,3 Standardní křivka pro zein (Bt11)

Standardní křivka P-35S (Bt 35

30

34 33

Ct

Ct

25

32

20 15

y = -3,36x + 38,54

31

y = -3,24x + 40,75

R2 = 0,99

30

R2 = 0,99

29

10 3,0

3,5

4,0

4,5

Log počtu kopií DNA

5,0

1,5

2

2,5

3


Standardní křivka druhově specifického Standardní křivka monitorovací PCR (6,25; 12,5; 25; 50 a 100 ng). s 5% Bt11 (6,25; 12,5; 25; 50 a 10

SYBR Green I Systém  SYBR Green I (SG I) interkaluje do malého žlábku dsDNA  fluorescence SG I se po navázání do dsDNA zvýší až 1000-krát  delší amplikony = více navázaného SGI = vyšší fluorescenční signál  detekce veškeré dsDNA = nižší specifičnost systému  nutnost pečlivého výběru reakčních podmínek  nutná analysa křivek tání  cenově dostupnější než detekce pomocí fluorescenčně značených sond

SYBR Green I a)

b)

c)

a) prostředí reakce po teplotní denaturaci b) nasednutí primerů a vazba barviva c) prodlužování primerů upraveno dle www.biochem.roche.com/lightcycler

Posuzované parametry PCR procesů  velikost produktu a možnost konfirmace produktu restrikčním

štěpením

 specifita  limit detekce = LOD vyjádřena v %GMO, ng DNA nebo v počtu kopií, vyjádřené jako ekvivalent haploidního genomu = HGE HGE - vypočítán ze známého množství DNA přidaného do reakce [ng] a z publikovaných hmotností haploidních genomů

Posuzované parametry qPCR  specifita

 limit detekce = LOD  limit kvantifikace (LOQ) nejnižší množství cílové sekvence, kterou lze danou metodou spolehlivě kvantifikovat

Digitální PCR (dPCR) 

Rozdělení analyzovaného vzorku do velkého počtu separátních reakčních „komor“


http://digital-pcr.gene-quantification.info/, 29.4.2013

Digitální PCR (dPCR)  Absolutní kvantifikace  Přítomnost cílového úseku je měřena přímo (není potřeba porovnání se standardní křivkou)  Jednoduché porovnání výsledků získaných z jednotlivých PCR běhů (dPCR počítá přímo cílové úseky, není ovlivněno různými použitými přístroji, standardní křivkou či zkušenostmi experimentátora).

 Relativní kvantifikace provedena kvantifikací dvou cílových úseků

poměrem

absolutních

 Vhodné i pro kvantifikaci nízké koncentrace cílového úseku ve vysokém množství doprovodné nukleové kyseliny  Citlivější než real on time PCR


http://digital-pcr.gene-quantification.info/, 29.4.2013



Díly A-E představují sérii ředění analyzovaného vzorku cDNA (1:1)



Díl F je negativní kontrola



Každý díl obsahuje 765 komůrek (individuální PCR reakce)



Černá políčka – negativní signál



Červená políčka – pozitivní signál (detekce fluorescence)



Sloupec označený „Estimated“: odhad kopií cílového úseku určený pomocí qPCR



Sloupec označený „Biomark“: odhad kopií cílového úseku pomocí dPCR

Kvantifikace GMO Absolutní kvantifikace • vyjádřena počtem kopií cílového úseku ve vzorku, odečet přímo z kalibrační křivky v případě qPCR • počet cílových úseků průměrně připadající na jednu reakční komoru v případě dPCR

Relativní kvantifikace vyjádřena v % qPCR

počet kopií GM specifické ho úseku 100 Množství GMO [%]  počet kopií referen čního úseku dPCR počet cíl .úseků GM v jedné komurce100 Množství GMO [%]  počet cíl . referen čního úseku v jedné komurce

Kvantifikace GM kukuřice obsahující P35S CaMV promotor ● dvě amplifikačních reakcí, první - druhově specifická (zein gen), druhá - monitorovací (P-35S) Standardní křivka pro zein (Bt11)

Standardní křivka P-35S (Bt11) 35

30

34 33

Ct

Ct

25

32

20 15

y = -3,36x + 38,54

31

y = -3,24x + 40,75

R2 = 0,99

30

R2 = 0,99

29

10 3,0

3,5

4,0

4,5


5,0

1,5

2

2,5

3

3,5


Standardní křivka druhově specifického Standardní křivka monitorovacího PCR PCR (6,25; 12,5; 25; 50 a 100 ng). s 5% Bt11 (6,25; 12,5; 25; 50 a 100 ng).

● LOD 5 kopií HGE kukuřice ● LOQ 12 kopií HGE kukuřice

Evropská síť laboratoří analyzujících GMO (ENGL)  angl. European Network of GMO Laboratories  spolupráce v oblasti validace a harmonizace metod a přípravy referenčních materiálů a spoluprací odborníků zabývajících se analýzou GMO  ustanovena v prosinci 2002 v Bruselu  inaugurační meeting v Praze duben 2004, 10 nových členů (včetně ČR, do té doby jen pozorovatel)  sdružuje několik desítek národních laboratoří ze všech států EU plus zástupce Norska, Švýcarska a Turecka  členem ENGL 2 laboratoře z ČR a to Laboratoř VŠCHT v Praze (http://www.vscht.cz) a Výzkumný ústav rostlinné výroby (http://www.vurv.cz).  Laboratoř VÚRV Ruzyně je Národní referenční laboratoří GMO v ČR (Reference Laboratory for GMO Detection and DNA fingerprinting)


http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/ENGL/default.html (13.04.2014).

Konsorcium zástupců laboratoří v ČR zabývajících se detekcí GMO  na základě doporučení ENGLu se v květnu 2006 ustavilo konsorcium zástupců laboratoří v ČR zabývajících se detekcí GMO, za účasti zástupců ze Slovenska  základ pro vytvoření národní sítě laboratoří detekujících GMO se slovenskou účastí ENGL Slovensko 1. State Veterinary and Food Institute, Dolny Kubín, Štátny Veterinárny a potravinový Ústav, Dolny Kubin 2. Central Control and Testing Institute of Agriculture, Ústredný kontrolný a skúšobný ústav poľnohospodársky, Oddelenie molekulárnej biológie, ÚKSÚP

Referenční laboratoř EU (CRL) •

CRL (angl. Community Reference Laboratory, http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/)

•

květen 2001 – referenční laboratoř EU pro GMO

•

European Commission, Joint Research Centre, Ispra, Itálie, IHCP

•

výsledky práce jsou zveřejňovány na internetových stránkách http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/guidancedocs.htm

•

detekční metody jsou publikovány na http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/statusofdoss.htm

Validace a harmonizace metod v EU (1/2) 

Zhodnocení metody pro testování GMO složeno ze dvou nezávislých kroků:  vyhodnocení metody předkládané žadatelem (CRL)

 vyhodnocení metody na konci validační studie pomocí mezilaboratorních kruhových testů (laboratoře ENGL) 

ENGL vydalo definici minimálních požadavků pro analytické metody používané pro testování GMO1 : použitelnost, proveditelnost, specifita, rozmezí koncentrací, přesnost, účinnosti amplifikace, R2 koeficient, reprodukovatelnost, relativní standardní odchylky (RSDr), meze kvantifikace (LOQ), meze detekce (LOD), robustnosti a správnosti metody



doporučení EK 2004/787/ES navrhuje vyjadřovat obsah genetické modifikace v komoditní složce potraviny jako procento počtu geneticky modifikovaných kopií DNA ve vztahu k počtu kopií DNA specifických pro cílový taxon vypočítané na základě ekvivalentů haploidních genomů2 (angl. Haploide Genome Equivalent, HGE)



původní vyjadřování obsahu genetické modifikace bylo v hmotnostních procentech (např. % hmotnosti RR sóji z celkové hmotnosti sóji). V dostupném certifikovaném referenčním materiálu (CRM) je vesměs vyjadřován obsah genetické modifikace v hmotnostních procentech, jsou publikované metody založení na použití CRM i plazmidů jako standardů pro kalibrační křivky a vyjádření výsledků v HGE

Literatura a použité zdroje 1 European

Network of GMO Laboratories (ENGL): Definition of Minimum Performance Requirementd for Analytical Methods of GMO Testing, 2005. Doporučení Komise 2004/787/ES : o technických pokynech pro odběr vzorků a detekci geneticky modifikovaných organizmů a materiálu vyrobeného z geneticky modifikovaných organizmů nebo produktů s jejich obsahem podle nařízení (ES) č. 1830/2003, ze dne 4. října 2004. Internet (13. 7. 2006): http://engl.jrc.it/docs/HGE%20release%20version%201.pdf 2 ENGL explanatory document on the use of „Percentage of GM-DNA copy numbers in relation to target taxon specific DNA copy numbers calculated in terms of haploid genomes“ as a general unit to express the percentage of GMOs, Internet (13. 7. 2006): http://engl.jrc.it/docs/HGE%20release%20version%201.pdf

Validace a harmonizace metod v EU (2/2)  2004/787/ES uvedeny definice pro odběr vzorků potravin a krmných produktů, osiv a jiného rostlinného materiálu  pokud je výsledek analýzy na výskyt GMO blízko stanoveného prahu 0,9 % ( 50 % jeho hodnoty), je nezbytné provést odhad spojené nejistoty vyjádřené jako směrodatná odchylka (2004/787/ES )  validací a harmonizací metod v oblasti detekce GMO byl pověřen Institut pro zdraví a ochranu spotřebitele (The Institute for Health and Consumer Protection (IHCP), Joint Research Centre of the European Commission) sídlící v Ispře v Itálii (http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/)

Literatura a použité zdroje Doporučení Komise 2004/787/ES : o technických pokynech pro odběr vzorků a detekci geneticky modifikovaných organizmů a materiálu vyrobeného z geneticky modifikovaných organizmů nebo produktů s jejich obsahem podle nařízení (ES) č. 1830/2003, ze dne 4. října 2004. Internet (13. 7. 2006): http://engl.jrc.it/docs/HGE%20release%20version%201.pdf 3 http://gmoglobalconference.jrc.ec.europa.eu/2008/Posters/T.1.1%20ptetra.pdf

Normy Comité Europeén de Normalisation (CEN) 

Pracovní skupina CEN/TC 275 číslo 11 (zabývá se „GM potravinami“) publikovány tyto technické normy (skupina 5699 - GMO):

1. ČSN EN ISO 24276 Potraviny - Metody pro detekci geneticky modifikovaných organismů a odvozených produktů - Všeobecné požadavky a definice, v českém (slovenském) jazyce, Účinnost k: 2008-02-01  stanovuje všeobecné požadavky a definuje základní pojmy vztahující se k metodám pro detekci GMO a odvozených produktů  specifikuje jak využívat normy pro strategii vzorkování (EN/TS 15568), extrakci nukleových kyselin (ISO 21571), kvalitativní analýzu nukleových kyselin (ISO 21569), kvantitativní analýzu nukleových kyselin (ISO 21570) a metody založené na proteinech (ISO 21572) a vysvětluje jejich vztah k analýze geneticky modifikovaných organizmů v potravinách  definuje základní analytické pojmy, uvádí návody postupů, charakteristiky metod, zahrnuje všeobecné požadavky na laboratoř a postupy, použití kontrolních materiálů a kontrol, doporučuje uspořádání laboratoře a zabývá se i interpretací výsledků. Popisuje, jak uvádět získané výsledky - jsou uvedeny formulace vyjádření pozitivních, negativních i nejednoznačných výsledků. Zabývá se požadavky na zabezpečení kvality a dotýká se i údajů, které musí obsahovat zpráva o zkoušce

Normy 2/2 2. ČSN EN ISO 21571 Potraviny - Metody pro detekci geneticky modifikovaných organismů a odvozených produktů - Extrakce nukleové kyseliny, ČSN vydána v českém (slovenském) jazyce, Účinnost k: 2007-04-01.

byla vytvořena pro matrice jako jsou potraviny, ale je použitelná i pro další matrice jako jsou obiloviny a krmiva  popisuje základní postupy extrakce a purifikace nukleových kyselin založené na využití. fenol/chloroformu, polyvinylpyrrolidonu (PVP), CTAB nebo oxidu křemičitém. 3. ČSN EN ISO 21569 Potraviny - Metody pro detekci geneticky modifikovaných organismů a odvozených produktů - Metody založené na kvalitativním stanovení kyseliny nukleové, ČSN 

vydána vyhlášením ve Věstníku ÚNMZ, Účinnost k: 2006-01-01.

4. ČSN EN ISO 21570 Potraviny - Metody pro detekci geneticky modifikovaných organismů a odvozených produktů - Metody založené na kvantitativním stanovení kyseliny nukleové, ČSN vydána vyhlášením ve Věstníku ÚNMZ, Účinnost k: 2006-06-01.

5. ČSN EN ISO 21572 Potraviny - Metody pro detekci geneticky modifikovaných organismů a odvozených produktů - Metody založené na stanovení proteinů, ČSN vydána v českém (slovenském) jazyce, Účinnost k: 2008-02-01.

6. ČSN P CEN/TS 15568 Potraviny - Analytické metody pro detekci geneticky modifikovaných organismů a odvozených produktů - Strategie vzorkování, ČSN vydána vyhlášením ve Věstníku ÚNMZ, Účinnost k: 2007-08-01.

7. ISO/TS 21098:2005 Foodstuffs -- Nucleic acid based methods of analysis of genetically modified organisms and derived products -- Information to be supplied and procedure for the addition of methods to ISO 21569, ISO 21570 or ISO 21571.


Zdroj: http://www.cni-normy.cz/normy/normy-skup.php?trida=5699

Odkazy na internetové stránky www.biotrin.cz www.umbr.cas.cz/ktr/

www.env.cz www.szu.cz http://ceragmc.org/index.php?action=gm_crop_database (dříve www.agbios.com)

www.osel.cz http://www.gmo-compass.org/eng/home/

V případě vašeho zájmu, nebo jakýchkoli dotazů mě neváhejte kontaktovat

E- mail : [email protected]

Geneticky modifikované

Recommend Documents