Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat
Geneticky podmíněné onemocnění degenerativní myelopatie psů Bakalářská práce
Vedoucí práce:
Vypracoval:
doc. Ing. Tomáš Urban, Ph.D.
Jana Křížová
Brno 2014
1
2
Čestné prohlášení
Prohlašuji, že jsem práci: Geneticky podmíněné onemocnění degenerativní myelopatie psů vypracoval/a samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 Sb.,o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:………………………..
…………………………………………………….. podpis
3
Poděkování Chtěla bych poděkovat především vedoucímu mé práce doc. Ing. Tomášovi Urbanovi, Ph.D za ochotu a trpělivost. Dále děkuji Mendelově univerzitě v Brně za tři roky vzdělávání a nabyté informace, které mi pomáhají k formování názorů, postojů a priorit. Mé díky patří také mé rodině za neustálou podporu.
4
Abstrakt Degenerativní myelopatie je onemocnění vyskytující se u psů dospělých až stárnoucích a projevuje se neurologickými komplikacemi, v první fázi zasahujícími pánevní končetiny. Důvodem je úbytek myelinu a axonů v bílé hmotě míchy. Některá plemena mají vyšší prevalenci tohoto onemocnění, např. Německý ovčák, Německý boxer a Pembroke Welsh Corgi. Studiem genomu psů byla zjištěna silná souvislost mez rozvojem onemocnění a mutacemi na genu SOD1 a to především SOD1:c.118G>A u velké řady plemen, ale také SOD1:c.52A>T u Bernského salašnického psa. Mutace na genu SOD1 způsobuje u člověka podobné neurologické onemocnění amyotrofická laterální skleróza a pes je prvním modelovým organismem pro tuto nemoc, u kterého bylo zaznamenáno spontánní propuknutí nemoci.
Klíčová slova: SOD1, mícha, genom
Abstract Degenerative myelopathy i s an adult onset neurological disease mostly in dogs at old age. First signs are ataxia and weakness of hind legs due to demyelization and axon loss in the white metter of spinal cord. There is higher prevalence of the disease i some dog breeds such as German Shepherd Dog, Boxer and Pembroke Welsh Corgi. Studies have shown strong association between risk of developement of the disease and SOD1 gene mutations. SOD1:c.118G>A appears among wide range of breeds and SOD1:c.52A>T seems to be exclusive for Bernese Mountain Dog. SOD1 gene station causes similar neurological disease amongs humans called amyotrophic lateral sclerosis and degenerative myelopathy is the first spontanously onset model for amyotrophc lateral sclerosis.
Key words: SOD1, spinal chord, genome
5
Obsah 1
ÚVOD........................................................................................................................ 7
2
CÍL PRÁCE ............................................................................................................... 8
3
SOUČASNÝ STAV POZNATKŮ............................................................................ 9 3.1
Pes a jeho původ................................................................................................. 9
3.2
Genom psa .......................................................................................................... 9
3.3
Geneticky podmíněné choroby u psů ............................................................... 10
3.3.1
Degenerativní myelopatie u psů ............................................................... 10
3.3.1.1
Klinické projevy .................................................................................... 11
3.3.1.2
Neurologická podstata ........................................................................... 12
3.3.1.3
Výskyt ................................................................................................... 13
3.3.1.4
Diagnostika ........................................................................................... 14
3.3.1.5
Terapie................................................................................................... 16
3.3.1.6
Etiologie ................................................................................................ 17
3.3.2
Genetická podstata degenerativní myelopatie .......................................... 18
3.3.2.1
Mapování genomu ................................................................................. 18
3.3.2.2
Metody vazbové analýzy....................................................................... 19
3.3.2.3
Objev genu zodpovědného za degenerativní myelopatii ...................... 20
3.3.2.4
Další výzkum ........................................................................................ 22
3.3.2.5
Popis genu SOD1 .................................................................................. 27
3.3.2.6
Superoxid dismutáza 1 .......................................................................... 27
3.3.2.7
Výskyt genu SOD1 u dalších organizmů .............................................. 29
4
ZÁVĚR .................................................................................................................... 30
5
PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY ................................................................... 31
6
SEZNAM OBRÁZKŮ ............................................................................................ 34
6
1 ÚVOD Pes domácí (Canis familiaris) je nejdéle domestikovaným živočišným druhem. Společné soužití s člověkem mělo obrovský vliv na jeho fylogenezi a je pravděpodobné, že tento vliv byl oboustranný. Existují teorie, že soužití lovců a sběračů se psy výrazně pomohlo rozvoji zemědělského způsobu obživy člověka a tím pádem i lidské civilizace. Kromě dlouhodobých společných životních podmínek sdílí oba druhy také řadu onemocnění. Pes je tedy významným modelovým organismem při studiu nemocí člověka. Díky existenci uzavřených populací jakými jsou jednotlivá plemena psů je u geneticky založených onemocnění vyhledávání genetických souvislostí značně jednodušší a rychlejší. Ve své práci se budu zabývat psem domácím a to především jeho genetickým založením a onemocněním nazývaným degenerativní myelopatie. Toto nevyléčitelné degenerativní onemocnění neurologického charakteru je do značné míry analogické s amyotrofickou laterální sklerózou u člověka a pes se tak stal prvním modelovým organismem, u kterého se podobná nemoc přirozeně vyskytuje. V současné době je degenerativní myelopatie předmětem intenzivního výzkumu, genetický základ onemocnění byl objeven ve velmi nedávné době.
7
2 CÍL PRÁCE Zpracovat nejnovější poznatky z oblasti genetického onemocnění u psů – degenerativní myelopatie, genetických testů pro odhalování variability u známých genů.
8
3 SOUČASNÝ STAV POZNATKŮ 3.1 Pes a jeho původ Otázku původu psa není jednoduché jednoznačně zodpovědět. Určitá genetická data naznačují, že domestikační proces psa domácího začal ve východní Asii před 15000 lety. Avšak nejstarší fosilie připomínající psa staré více než 30 000 let pocházejí z Evropy a
Sibiře.
Byla
provedena
analýza
mitochondriálních
genomů
18
prehistorických psovitých šelem z Eurasie a Ameriky a také komplexní skupinou psů a vlků současné doby. Mitochondriální genomy všech moderních psů jsou nejpříbuznější prehistorickým psovitým šelmám a současným vlkům Evropy a počátek domestikace je pravděpodobný před 18 000 a ž 32 000 lety. Tyto poznatky naznačují, že dnešní pes domácí je výsledkem interakce evropských lovců a sběračů s vlky. (Thalmann et al., 2013)
3.2 Genom psa
Obrázek č. 1: Karyotyp psa domácího (College of Veterinary Medicine, 2014)
9
Genom psa je již kompletně popsaný od roku 2005 díky bostonském týmu vědců pod vedením Lindbladové-Tohové. Také vypracovali s hustou mapou jednonukleotidových polymorfismů. Tyto poznatky jsou důležité z hlediska studie evoluce druhů a také umožnil
realizaci
celogenomových
asociačních
studií
k identifikování
genů
zodpovědných za vlastnosti i nemoci psů. (Lindbald-Toh, 2005) Genom psa obsahuje 2 392 715 236 párů bází. Obsahuje z 39 párů chromozomů a jeden plazmid. (Ensembl, 2014; National Center for Biotechology Information,
2014),
Tabulka č. 1: Geny v genomu psa (National Center for Biotechology Information, 2014) Počty genů Kódující geny
19,856
Krátké nekódující geny
3,774
Pseudogeny
950
Genové transkripty
29,884
3.3 Geneticky podmíněné choroby u psů 3.3.1
Degenerativní myelopatie u psů
Degeneraivní myelopatie je onemocnění psů spojené s neurologickými obtížemi, ochrnutím nejprve zadní části těla a nezvratným pomalým zhoršováním stavu. Poprvé jej popsal Averill v roce 1973u stárnoucího německého ovčáka. V roce 1975 Griffiths a Duncan popsali řadu případů s podobnými projevy a nazvali tuto nemoc jako chronickou degenerativní radikulopatii. Dlouhou dobu se toto onemocnění považovalo za výsadu německých ovčáků, dnes již víme, že se problém dotýká velkého počtu plemen. Příčina onemocnění dlouho nebyla známá a teprve až v posledních několika letech se objasňují souvislosti s genetickým založením onemocnění. (Coates, 2010)
10
3.3.1.1 Klinické projevy Pro toto pomalé, degenerativní onemocnění je typická ztráta proprioceptivní funkce, vyvíjející se v poruchu koordinace pohybů (ataxii) a slabosti pánevních končetin. První klinické známky jsou tahání pánevních končetin za sebou při pohybu, křížení končetin při stání a celková neschopnost vnímat pozici zadní části těla. Příznaky se zhoršují postupně nebo skokově až do fáze úplného ochrnutí kaudální části trupu a pánevních končetin. To způsobí svalovou atrofii v této oblasti. (Wahl, 2008). Rovněž ustupují míšní a patelární reflexy a přichází na řadu inkontinence. (Shelton, 2012)
Obrázek č. 2: Německý ovčák s degenerativní myelopatií, pozorovatelná nekoordinovanost a slabost pánevních končetin (Převzato z: http://www.willows.uk.net/en-GB/specialist-services/pet-health-information/veterinaryneurology/degenerative-myelopathy)
11
Při dalším postupu se mohou objevovat další symptomy. Jsou zasaženy také hrudní končetiny a objevuje se ztížené polykání a pohyblivost jazyka (Shelton, 2012) a také celkový úbytek svalové hmoty a ztížené dýchání (Wahl, 2008).
3.3.1.2 Neurologická podstata Svalová atrofie je vyvolána neurogenně a to degenerací motorických neuronů bílé hmoty míchy. Degenerace postihuje dolní i horní motoneuron. (halouzka vet. Patologie) Původně bylo toto onemocnění spojováno pouze s postižením horního motoneuronu. (Coates, 2010) Charakteristická je demyelinizace a úbytek axonů nejprve v torakolumbálním úseku míchy, později může postihovat i jiné úseky míchy. Mikroskopicky jsou tyto změny bílé hmoty míšní pozorovatelné jako vakuolární prostory v důsledku ztráty myelinu a úbytek axonů je pozorovatelný jako velká eosinofilní kruhovitá granula. Výsledkem je houbovitý vzhled bílé hmoty míchy. Zda dochází dříve ke ztrátám myelinu či axonů, není objasněno. (Barcalay, Haines, 1994)
Obrázek č. 3: Srovnání míchy poškozené degenerativní myelopatií (A) a míchy bez patologického nálezu (B) (Awano, 2009)
12
3.3.1.3 Výskyt Protože většina nejstarších případů byla pozorována u německého ovčáka, dlouho byla degenerativní myelopatie považována za nemoc tohoto plemene. Ačkoli se u něj vyskytuje DM nejčastěji, onemocnění postihuje řadu dalších plemen s celkovou prevalencí 0,19%. (Coates, 2010) Vyšší pravděpodobnost onemocnění byla zaznamenána především u velkých plemen psů jako například Rhodézský ridgeback, Chasapeake Bay Retriever, Bernský salašnický pes, Německý boxer, Sibiřský husky, Irský setr, Staroanglický ovčák, Kolie, Anglický mastif, a Kuvasz. (Coates, 2010) Dále byly zaznamenány případy také u plemen Belgický ovčák (Barcley, Haines, 1994) Labradorský retriever, Hovawart, Kerry Blue teriér a Irský teriér. U malých plemen se toto onemocnění vyskytuje vzácně, avšak jsou zaznamenány případy nemocných pudlů a jediné malé plemeno s vyšší predispozicí k onemocnění je Welsh Corgi, který je také častým předmětem výzkumů. (Coates, 2010) Obě pohlaví jsou k nemoci náchylná stejně. Neurologické příznaky se objevují převážně u psů starších pěti let a mladších čtrnácti, průměrně tedy v devíti letech. (Coates, 2010; Wahl, 2008) Ovšem byly zaznamenány i případy mladých psů a to dvou německých ovčáků ve věku 6 a 7 měsíců. (Coaes, 2010) Postižení psi většinou ztrácí schopnost pohybovat zadními končetinami zhruba půl roku od data diagnózy.(Coates, 2007) Průběh choroby může trvat více než 3 roky, většina majitelů však přistupuje k eutanázii do roku od diagnózy, když se jejich pes stane paraplegickým. (Awano, 209)
13
Tabulka č. 2: Srovnání prevalence degenerativní myelopatie různých plemen (Coates, 2007) Plemeno
Celkový počet psů
Počet psů trpících DM
Prevalence DM (%)
Všichni psi
432 467
821
0,19
Něměcký ovčák
19 053
383
2,01
664
10
1,51
1 567
13
0,83
807
6
0,74
Irský setr
1 754
12
0,68
Německý boxer
5 971
35
0,59
Welsh Corgi Pembroke
1 039
6
0,58
Foxteriér hrubosrstý
1 354
7
0,52
Kolie
4 970
19
0,38
Staroanglický ovčák
1 589
6
0,38
Kříženci
93 398
143
0,15
Welsh Corgi Cardigan Chesapeake Bay Retriever Rhodézský ridgeback
3.3.1.4 Diagnostika Diagnóza u živého pacienta může být stanovena pouze z klinických příznaků vyloučením ostatních nemocí s podobnými příznaky. Diferenciální diagnózy běžně bývají vyhřeznutí meziobratlové ploténky, zánětlivá onemocnění a rakovina míchy. Dysplazie kyčelního kloubu a lumbosakrální stenóza mohou být poměrně často s degenerativní myelopatií zaměněny, ale důkladné neurologické vyšetření by je měli odlišit. K vyšetření se používá rozbor mozkomíšního moku, elektrodiagnostické testy, myelografie, tomografie a magnetická rezonance. (Coates, 2007)
14
Genetické testy odhalí pouze predispozici, ale nepotvrdí či nevyvrátí přítomnost nemoci. Rentgenové snímky, myelografie ani vyšetření magnetickou rezonancí onemocnění také neodhaluje. Testy evokovaných potenciálů mohou být abnormální a obsah proteinů v mozkomíšním moku odebraného lumbální punkcí může být lehce zvýšený. (Jaggy, 2010) Rentgenové snímky a myelogramy pouze vyloučí, zda neurologické problémy nezpůsobují úrazy míchy, vyhřeznutí meziobratlové ploténky, lumbosakrální stenóza nebo nádor míchy. (Wahl, 2008) Definitivní diagnóza může být tedy potvrzena až po smrti pacienta pitvou a histopatologickým vyšetřením míchy. (Awano, 2009)
15
3.3.1.5 Terapie Účinná léčba onemocnění neexistuje. Někdy je doporučována medikace kyselinou aminokapronovou kvůli jejímu antiproteázovému účinku. Řada dalších léčiv bylo zkoušených
bez
prokázaného
zlepšení
stavu.
Například
lipidové
statiny,
kyanokobalamin a metionin. K prodloužení doby pohyblivosti postižených psů napomahá intenzivní fyzioterapie. ( Wahl 2008; Coates 2007)
Obrázek č. 4: Fyzioterapie (Převzato z http://www.animalphysionz.com/)
16
Obrázek č. 5: Zlepšení kvality života postižených psů invalidním vozíkem (Převzato z: http://www.emilydewan.com/blog/wheels-for-cassie-the-collie/)
3.3.1.6 Etiologie Příčiny vzniku degenerativních změn míchy nejsou zcela objasněny. Předmětem diskuse na toto téma byl deficit vitaminu B a E, autoimunitní a cévní poruchy. (Jaggy, 2010). Byly zaznamenány případy nízké hladiny vitaminu B12 v krevním séru. U těchto psů však nedošlo ke zmírnění příznaků podáváním B komplexu. (Wahl, 2008) Pokusy spojit DM s deficitem vitaminu E vycházely z předpokládané podobnosti onemocnění s ataxii spojenou s nedostatkem vitaminu E. Tato nemoc se vyskytuje v lidské populaci a je způsobena mutací αTTP genu a narušuje utilizaci α-tokoferolu v játrech. αTTP gen kóduje jaterní α-tokoferol transfer protein, který je zodpovědný 17
za vázbu a přesun α-tokoferolu mezi biologickými membránami a za udržování stálé hladiny vitaminu E v krevní plazmě. Tento protein se nachází pouze v hepatocytech. Jelikož byly zaznamenány případy nižší hladiny vitaminu E v krevní plazmě u psů s degenerativní myelopatií a vzhledem k podobnosti klinických příznaků obou nemocí existoval předpoklad, že by mohla být příčina stejná jako u lidského onemocnění. (Flegel, 1999) Ovšem podobná mutace nebyla nalezena a hypotéza vyvrácena. (Fechner, 2003) Dále je diskutovaná imunologická role v patogenezi degenerativní myelopatie na základě zhoršené odpovědi mitogeny závislé na brzlíku a zvýšené množství imunokomplexů v cirkulaci. Tato teorie je sice zajímavá a byly nalezeny imunohistichemické důkazy o ukládání imunoglobulinů a komplementu u psů postižených degenerativní myelopatií. Ovšem toto zatím nebylo potvrzeno jako příčina degenerativní myelopatie. Navíc této teorii odporuje fakt, že u takových psů nebyly nalezeny žádné histopatologické známky zánětu. (Coates, 2007)
3.3.2
Genetická podstata degenerativní myelopatie
3.3.2.1 Mapování genomu Další z pokusů o odhalení genetického pokladu nemoci učinil Dr. Clemmons a kolektiv v roce 2006. Podle svých poznatků považovali za příčinu degenerativní myelopatie bodovou mutaci v hypervariabilní oblasti 2 alely DLA DRB1 1*01101. Homozygotní výskyt zmutované alely měl pak být u německých ovčáků nemocných degenerativní myelopatií a heterozygotní u zdravých. V dalších studiích se toto však nepotvrdilo, dokonce ani samotná existence zmiňované mutace a proto není takové vysvětlení příčiny DM pravděpodobné. (Clark, 2008) Více odpovědí na otázky ohledně příčiny vzniku onemocnění přineslo až mapování genomu. Pes domácí trpí více než 450 nemocemi z toho asi 360 analogickými s lidskými nemocemi. Mnoho z nich je dědičných a to dělá ze psa vynikající modelový organismus pro studium u psa spontánně vznikajících onemocnění, které postihují i člověka. 18
Obrovskou výhodou je jedinečná struktura populace psů, kdy každé plemeno vzniklo z omezeného počtu zakladatelů. Navíc jsou v plemenitbě často hojně využíváni oblíbení krycí psi. V důsledku je pak každé plemeno uzavřená populace s omezenou heterogenitou a lokusem nemoci. V důsledku jsou genetické studie u psů jednodušší, přímější a rychlejší než u studií komplexních populací, mezi které patří ta lidská. Dále jsou psi evolučně bližší lidem než např. myši a mají podobnější sekvence nukleových kyselin a proteinů. Psi také sdílí společné prostředí, stravu a imunologický profil a karcinogenní zátěž. To vše ze psů dělá platný model pro výzkum geneticky založených onemocnění. (Shearin, 2010) Existuje více než 350 plemen psů necelém světě. Každé plemeno projevuje určitý fenotyp vytvořený metodami selektivního křížení. Chovatelské organizace v Evropě i Spojených státech v dnešní době nepovolují uznání jedince jako příslušníka plemene, pokud oba jeho rodiče nejsou příslušníky tohoto plemene. Takto uzavřené populace jednotlivých plemen pak vytváří soubory jedinců s vysokou fenotypovou homogenitou. Tímto se zvyšuje podobnost jedinců uvnitř plemene a značně zvyšuje genetická diverzita mezi jednotlivými plemeny. Celková průměrná rozdílnost mezi plemeny psů pak činí 27% v kontrastu rozdílnost mezi vzdálenými lidskými populacemi pouze 510%. Přísná selekce prováděná chovateli psů za účelem vytvoření homogenní populace se společnými morfologickými a povahovými rysy však vedla také k velkému výskytu dědičných onemocnění u domácích psů. Tento ne úplně příjemný fakt ale nabízí příležitost identifikovat geny, které je složité lokalizovat studiem lidských rodin a populací. (Shearin, 2010) Pro mapování genů spojených s chorobami postihujícími zároveň člověka a zvíře je využíváno zejména dvou typů postupů. Tyto mají vždy společný počáteční krok a to identifikaci populace podléhající onemocnění. (Shearin, 2010)
3.3.2.2 Metody vazbové analýzy U studií konkrétních rodin jsou vzorky odebírány od příbuzných jedinců jak nemocných tak zdravých. Pak jsou pečlivě stanoveny fenotypové projevy a je provedena vazbová analýza pomocí celogenomového skenu a jsou určeny alely odlišné 19
u jedinců se zkoumaným znakem. Pravděpodobný lokus je určen statisticky výpočtem Lod Score, který naznačuje, zda odlišnosti v genomu mají spojitost s chorobou či se objevují náhodně. Vazbové studie tak analyzuje distribuci markerů v genomu napříč generacemi. Jako markery jsou využívány mikrosatelity a polymorfismy jediného nukleotidu (SNP). Sekvenováním je pak nalezena příslušná mutace. Nevýhoda této metody spočívá ve složitosti dohledávání konkrétních příbuzných jedinců. V minulosti byl takto nalezen gen způsobující formu rakovinného onemocnění ledvin u psů známého jako Birt-Hogg-Dubé syndrom a také geny pro řadu poruch zraku. (Shearin,2010) CELOGENOMOVÉ ASOCIAČNÍ STUDIE (Genome Wide Association Studies) Celogenomové asociační studie k určení alel spojených s výskytem onemocnění (znaku) porovnává soubor genotypů jedinců vykazujících projevy nemoci s nepříbuznou kontrolní skupinnou. Při skenováni genomu se jako markery používají pouze polymorfismy jediného nukleotidu (SNP). Stejně jako u LS jsou použity statistické metody a sekvenování k určení mutace spojené s chorobou. (Shearin, 2010)
3.3.2.3 Objev genu zodpovědného za degenerativní myelopatii V roce 2009 na Columbijské univerzitě v USA provedl Awano a kolektiv celogenomovou
asociační
studii
za
účelem
zmapování
genu
zodpovědného
za generativní myelopatii. Ke studii bylo využito psů plemene Pembroke welsh Corgi, 38 nemocných a 17 kontol starších 6 let. Nejsilnější asociace byla detekována na 31. chromosomu, slabší signály na 4 dalších chromosomech (6, 18, 20 a 25)
20
Obrázek č. 6: Mapování genu spojeného s degenerativní myelopatií (Awano,2009)
Všichni nemocní psi byli na 31. Chromozomu homozygoti pro společný haplotyp od 28,91 do 29,67 Mb, který zahrnuje tři geny: SOD1, TIAM1 a SFRS15. Resekvenování SOD1 genu zdravých a nemocných psů odhalilo tranzici guaninu za adenin v exonu 2, která předpovídá genovou mutaci měnící smysl E40K. Vzorky od všech 55 psů byly vyšetřeny na SOD:c.118G>A polymorfismus s následujícími výsledky. Všech 38 vzorků od nemocných psů bylo AA homozygotních. Z kontrolní skupiny psů bez příznaků degenerativní myelopatie bylo 10 AA homozygotů, 6 AG heterozygotů a 1 GG homozygot. Tato data ukázala silnou souvislost mezi nalezenou mutací a degenerativní myelopatií. K ověření lokalizace mutace způsobující degenerativní myelopatii bylo mapováno 90 jednonukleotidových polymorfismů u pěti plemen s vysokou prevalencí k degenerativní myelopatii (Pembroke Welsh Corgi, Boxer, Rhodézský ridgeback, Chesapeake Bay Retriever a Německý ovčák) v úseku 29,04 až 30,97 Mb. Nemocní psi všech pěti plemen sdíleli 5 jednonukleotidových polymorfismů tvořící haplotyp (velikost úseku byla 195 kb), který obsahuje E40K mutaci. Tento haplotyp byl přítomen také u psů bez mutace. Neexistoval žádný jiný jednonukleotidový polymorfismus ani haplotyp , který by se vykytoval u všech plemen a zároveň byl dědičný recesivně. Tudíž velký podíl 21
mutantních AA homozygotů v kontrolním souboru a přítomnost E40K mutace na zděděném haplotyp stále přítomného v populaci mohou vysvětlit relativně malou celogenomovou asociací s touto oblastí. (Awano, 2009) Kromě této celogenomové asociační studie byl vyšetřen genom ještě větší skupiny psů pěti zmiňovaných plemen na přítomnost SOD1:c.118G>A polymorfismu. Mezi 537 psy bylo 100 psů s diagnostikovanou degenerativní myelopatií. Byl zjištěn statisticky významný vztah mezi homozygotností A alely a fenotypovým projevem nemoci v rámci jednotlivých plemen i výše zmíněných 5 plemen dohromady. Četnost A alely ve zvláštní kontrolní skupině skládající se z plemen, u nichž se vyskytuje degenerativní myelopatie pouze vzácně, byla významně nižší než v kontrolních skupinách plemen s častým výskytem
degenerativní
myelopatie.
Ze
100
diagnostikovaných
psů
bylo
96 AA homozygotů 2 AG heterozygoti a 2 GG heterozygoti. Autoři studie uvedli možnost, že tito psi mohli být fenokopie, protože jejich diagnóza byla stanovena nejméně přísnými kritérii. (Awano, 2009) Poměrné vysoký počet AA homozygotů bez klinických příznaků se dá vysvětlit neúplnou penetrancí genu mezi AA homozygoty, možná kvůli účasti dalších genů a mutací, faktorům prostředí a možnosti úmrtí psa z jiných příčin dříve než se rozvinou příznaky degenerativní myelopatie. (Awano, 2009)
3.3.2.4 Další výzkum Jiná celogenomová asociační studie byla provedena v roce 2011 u německých ovčáků. Předmětem zkoumání bylo 15 případů s diagnózou degenerativní myelopatie a 69 kontrolních jedinců nejméně 8 let starých nevykazujících žádné známky degenerativní myelopatie. Dvě nejsilnější asociace byly shledány na 31. chromosomu na SOD1 genu a to jednonukleotidový polymorfismus 31.28909487 a 31.30528862. Vyhodnocení jednotlivých genotypů v této oblasti odhaluje, že pouze 4 z 15 postižených psů bylo homozygotních pro oba jednonukleotidové polymorfismy. Pět případů bylo homozygotních pro asociovanou alelu 31.28909487 a 9 případů bylo homozygotních pro asociovanou alelu 31.30528862. V kontrolní populaci 6 z 69 psů bylo také homozygotních v alele SNP 31.28909487. Třetí významná asociace byla 22
nalezena
na
10.
chromozomu,
konkrétně
jednonukleotidový
polymorfismus
10.64801770. (Tsai, 2011) V roce 2011 byl také popsán případ feny bernského salašnického psa, která trpěla příznaky degenerativní myelopatie. Test DNA na SOD1:c.118G>A mutaci spojovanou s tímto onemocněním však vyšel negativní, tedy homozygot GG. Po eutanázii v pokročilém stadiu nemoci byla provedena pitva. Nález sice nebyl zcela typický, ale celkově potvrdil jako definitivní diagnózu degenerativní myelopatii. Resekvenování všech 5 exonů SOD1 genu odhalilo homozygotní SOD1:c.52A>T transverzi, která značí p.T18S substituci. Toto zjištění naznačuje, že SOD1:c.118G>A mutace není jediná mutace, která může u psů vyvolat degenerativní myelopatii. (Winniger, 2011)
Obrázek č. 7: Elektroforogramy nukleotidových sekvencí normálního psa a Bernského salašnického psa postiženého degenerativní myelopatií (Winniger, 2011)
V roce 2012 proběhla studie na 10 boxerech a 9 Pembroke Welsh Corgi s předběžnou diagnózou degenerativní myelopatie na základě klinických příznaků. Všichni psi ve studii byly homozygotní pro mutantní alelu SOD1:c.118A, v kontrastu s kontrolní skupinou psů bez neurologických potíží, kteří byli všichni GG homozygoti. (Shelton, 2012)
V roce 2012 proběhla japonská studie zaměřená na využití metody real-time PCR a PCR-RFLP v diagnostice degenerativní myelopatie. Obě metody se ukázaly být dobře 23
použitelné k tomuto účelu. Dalším cílem studie bylo vyšetření výskytu mutantní A alely v SOD1 genu v populaci japonských Pembroke Welsh Corgi ppmocí přímého sekvenování a real-time PCR. K tomuto byly použity vzorky DNA 122 náhodných psů plemene Pembroke Welsh Corgi bez jakýchkoliv klinických projevů degenerativní myelopatie. Výskyt alely se prokázal následovně. Z 122 psů bylo 11 (9%) GG homozygotů, 52 (42,6%) AG heterozygotů a 59 (48,4%) AA homozygotů. Celková prevalence alely A byla 69,7%, to znamená, že výskyt mutantní alely je u plemene Pembroke Welsh Corgi v Japonsku extrémně vysoký. (Chang, 2013)
Tabulka č. 3: Prevalence mutantní A alely mezi 122 náhodně vybranými jedinci plemene Pembroke Welsh Corgi bez klinických příznaků degenerativní myelopatie (Chang, 2013) Počet Věková skupina Celkem G/G (%)
G/A (%)
A/A (%)
Prevalence (%) alely A
Mladší 5 let
38
3 (8)
22 (58)
13 (34)
63,2
5 - 10 let
41
7 (17)
13 (32)
21 (51)
67,1
starší 10 let
33
1 (3)
10 (30)
22 (67)
81,8
Neučitý věk
10
0 (0)
7 (70)
3 (30)
65
Celkem
122
11 (9)
52 (43)
59 (48)
69,7
Zajímavým faktem je, že stejně jako u nemocných psů se vyskytují imunohistopatologické léze, které reagují s protilátkami proti změněnému SOD1 proteinu, ten samý jev je pozorován u nositelů zmutované alely. (Zeiler, 2013)
V roce 2014 byla publikována studie zkoumající distribuci dvou mutantních alel na SOD1 genu spojovaných s rozvojem degenerativní myelopatie. U vzorku 33 747 psů, zahrnující 32 378 zástupců 222 různých plemen a 1 368 kříženců byla zjišťována 24
přítomnost SOD1:c.G>A mutace. Téměř polovina (49%), tj. 16 550 psů, byla homozygotních pro původní G alelu, 9 112 (27%) bylo AG heterozygotů a 8 084 (24%) psů bylo homozygotních pro mutantní A alelu. Četnost A alely v celém souboru psů byla 37%. Distribuce alely byla nerovnoměrná, tato mutantní alela byla nalezena u 124 z 222 plemen (56%). Tento široký výskyt mutace mezi plemeny napovídá o jejím vzniku před vznikem jednotlivých plemen. Kvůli pozdnímu nástupu příznaků spojených s touto mutací existuje jen velmi malá míra přirozené selekce, která by četnost mutatní alely snižovala. (Zeng, 2014) Po vyčlenění podsouboru 64 plemen o minimálním počtu 50 zástupců plemene, nejvyšší četnost SOD1:c.118A alel byla zjištěna u drsnosrstého foxteriéra. Za ním se v žebříčku plemen podle četnosti výskytu alely umístili Pembroke Welsh Corgi, Boxer, kavalír King Charles španěl, Pitbull teriér, Americký vodní španěl, Australský ovčák, Kolie, Soft Coated Wheaten teriér, Hovawart, Bernský salašnický pes, Chesapeake Bay retriever a Něměcký ovčák. (Zeng, 2014) Na přítomnost alely SOD1:c.52A>T byl vyšetřen genotyp 1 613 psů, z toho 701 kříženců a 912 příslušníků 57 plemen. Mutantní alela se vyskytla výhradně u plemene Bernský salašnický pes. Z 912 Bernských salašnických psů bylo 851 AA homozygotů, 59 heterozygotů a 2 TT homozygoti. Ze dvou homozygotů se jednalo o fenu z předchozí studie postiženu degenerativní myelopatií a druhý jedinec je bez příznaků a mladší 8 let, tudíž mladší než je očekávaný věk propuknutí příznaků. (Zeng, 2014) Prevalence SOD1:c.52T alely u celého Bernských salašnických psů byla 3,5%, což je výrazně nižší číslo než prevalnce alely SOD1:c.118A (38%). (Zeng, 2014) U 912 Bernských salašnických psů byl zjištěn genotyp také v lokusu SOD1:c118.
25
Tabulka č. 4: Rozložení SOD1:c.52 genotypu v kombinaci s SOD1:c.118 genotypem u Bernských salašnických psů (Zeng, 2014) SOD1:c.118 genotyp SOD1:c.52 genotyp
G/G
G/A
A/A
A/A
316
399
136
A/T
35
24
0
T/T
2
0
0
Pozoruhodná je absence 3 genotypů (c.52T/T a c.118A/A; c.52T/T a c.118G/A; c.52A/T a c.118A/A), které by vyžadovaly přítomnost haplotypu stávajícího se z c.52T alely a c.118A alely. Tyto dvě alely koexistují v haplotypu společně velmi vzácně. Z těchto 24 jedinců bylo 11 starších 8 let. Z těchto 8 byl zjištěn klinický stav u 6. Jeden z nich byl už po smrti a zemřel ve věku 9 let z příčin nesouvisejících s degenerativní myelopatií. Druhý ve věku 8,3 let neprojevoval známky degenerativní myelopatie a zbylí 4 projevovali příznaky degenerativní myelopatie, včetně jednoho, u kterého byla provedena eutanazie kvůli pokročilému stadiu nemoci a histopatologické posmrtné vyšetření diagnózu potvrdilo. Toto podporuje domněnku, že alela SOD1:c.52T může napomáhat rozvoji degenerativní myelopatie. Přesto byl prokázán rozvoj degenerativní myelopatie také u psů heterozygotních v SOD:c.118 lokusu bez další mutace v genu SOD1. Stále je riziko vzniku zdaleka největší u SOD:c.118A homozygotů. Proto je doporučeno genetické testování plemen s vyšší četností alely SOD1:c.118A. Nejmírnějším selekčním mechanismem je při krytí kombinovat jedince s výskytem mutantní alely výhradně s SOD1:c.118G homozygoty a zabránění narození štěňat s SOD1:c.118A homozygotním genotypem spojeným s vyšším rizikem rozvoje nemoci. (Zeng, 2014)
26
3.3.2.5 Popis genu SOD1 Protein kódující gen pro superoxid dismutázu 1 psa domácího se nachází na 31. chromozomu v sekvenci NC_006613.3, ohraničený páry bazí 26540291 až 26544212. Kódující sekvence jsou v rozsahu nukleotidů 7-468. Gen kóduje 153 aminokyselin. (National Center for Biotechnology Information, 2014) GEN SOD1 1 cgagtcatgg agatgaaggc cgtgtgcgtg ttgaagggcc agggcccggt ggagggcacc 61 atccacttcg tgcagaaggg aagtgggcct gttgtggtat caggaaccat tacagggctg 121 actgaaggcg agcatggatt ccacgtccat cagtttgaag ataanacaca aggctgtact 181 agtgcaggtc ctcactttaa tcctctgtcc aaaaaacatg gtgggccaaa agatcaagag 241 aggcatgttg gagacctggg caatgtgact gctggcaagg atggcgtggc cattgtgtcc 301 atagaagatt ctctgattgc actctcagga gactattcca tcattggccg caccatggtg 361 gtccacgaga aacgagatga cttgggcaaa ggtgacaatg aagaaagtac acagacagga 421 aacgccggga gtcgtttggc ttgtggtgtc attgggatcg cccaataaac attc (National Center for Biotechnology Information, 2014)
3.3.2.6 Superoxid dismutáza 1 Superoxid dismutáza 1 je enzym obsažený v cytosolu buněk aerobních organismů. Je velmi důležitým klíčovým antioxidantem, který katalyzuje přeměnu volných kyslíkových radikálů, které patří k nejvíce škodlivým volným radikálům, na kyslík a méně toxický peroxid vodíku: 2O2·- + 2H+ => H2O2 + O2 a takto chrání organismus před účinkem superoxidu. Hlavními zdroji superoxidových radikálů jsou: dýchací řetězec v mitochondriích, biotransformace v endoplazmatickém retikulu, bílé krvinky při napadení organismu bakteriemi, ultrafialové a rentgenové záření a Fentonova reakce přechodných kovů. Tento enzym má podobu dimeru, skládajícího se ze dvou podjednotek, první obsahuje Cu2+ a druhá Zn2+. 27
Mezi superoxid dismutázy patří také superoxid dismutáza 2 a superoxid dismutáza3. Superoxid dismutasa 3 je tetrametr obsahující měď a zinek. Vyskytuje se v organismu extracelulárně. Superoxid dismutáza 2 je tetramer obsahující mangan a vyskytuje se v mitochondriální matrix (Murray, 2002; Green, 2002, Crisp, 2013)
NÁSLEDKY MUTACE GENU SOD1 Při mutaci SOD:c.118G>A dochází k tranzici guaninu za adenin na 118. nukleotidu genu kódujícího superoxid dismutázový protein, tzn nastává genová mutace měnící smysl E40K. V aminokyselinověm řetězci na 40. pozici pak nahradí lysin kyselinu glutamovou. (Chang, 2013) Při mutaci SOD1:c.52A>T dochází transverzi adeninu za thymin na 52. nukleotidu, dojde tak k p.T18S substituci. Díky tomu na 18. Pozici aminokyselinového řetězce superoxid dismutázového proteinu dochází k substituci threoninu serinem. (Winniger, 2011) Enzym superoxid dismutáza se bohužel těmito změnami nestává neaktivní, ale funguje jako aktivní dimer, který však získává toxickou funkci, což vede k projevům degenerativní myelopatie. (Crisp, 2013)
Sekvence proteinu ve FASTA formátu >gi|50978674|ref|NP_001003035.1| superoxide dismutase [Cu-Zn] [Canis lupus familiaris] MEMKAVCVLKGQGPVEGTIHFVQKGSGPVVVSGTITGLTEGEHGFHVHQFDXT QGCTSAGPHFNPLSKKHGGPKDQERHVGDLGNVTAGKDGVAIVSIEDSLIALSG YSIIGRTMVVHEKRDDLGKGDNEESTQTGNAGSRLACGVIG IAQ (National Center for Biotechnology Information, 2014)
28
3.3.2.7 Výskyt genu SOD1 u dalších organizmů SOD1 gen se kromě psa vyskytuje také v genomu druhů myš domácí (Mus musculus), potkan obecný (Rattus norvegicus), dánio pruhované (Danio rerio), háďátko obecné (Caenorhabditis elegans), Tur domácí (Bos taurus), kur domácí (Gallus Gallus), šimpanz učenlivý (Pan troglotydes). (RefGene, 2014) Také u člověka je tento gen přítomný a spojovaný s onemocněním velmi podobným degenerativní myelopatii nazývaným amyotická laterální skleróza. Je to spíše heterogenní skupina onemocnění, u kterých degenerace horního i dolního motoneuronu způsobuje postupující svalovou slabost a atrofii a končí paralýzou a smrtí. Dědičných je 5 – 10% případů amyotické laterální sklerózy a z nich je asi 20% způsobeno mutací SOD1 genu. Bylo identifikováno více než 120 mutací na SOD1 genu u pacientů postižených amyotickou laterální sklerózou. Donedávna výzkum této choroby závisel na zkoumání transgenních hlodavců, protože nebyl znám žádný model amyotické laterální sklerózy samovolně se vyskytující u zvířat. Po zjištění souvislosti degenerativní myelopatie u psů a mutacemi na SOD1 se toto ale změnilo a dnes je degenerativní myelopatie považována za modelové onemocnění zvířat pro amyotickou laterální sklerózu. (Awano, 2009)
29
4 ZÁVĚR Díky celogenomovým asociačním studiím byla spolehlivě prokázána spojitost rozvoje degenerativní myelopatie s mutacemi na SOD1 genu. Jsou to mutace SOD1:c.118G>A a SOD1:c.52 A>T. Vzhledem ke zdaleka nejvyššímu výskytu choroby u jedinců homozygotních pro mutantní alely je dědičnost choroby pravděpodobně recesivně autozomální, ale homozygotnost pro mutantní alelu nezaručuje rozvoj onemocnění, pouze ukazuje na zvýšení rizika rozvoje. Zároveň existence nemocných heterozygotů také naznačuje vliv dalších faktorů na rozvoj onemocnění. Výskyt SOD1:c.52A>T mutace se zdá být omezen pouze na plemeno Bernský salašnický pes a díky poměrně nízké četnosti zmutované alely lze doporučit negativní selekci jako nástroj ke snížení výskytu mutace v populaci. Mutace SOD1:c.118G>A se naopak vztahuje na široké spektrum plemen psů a četnost mutantní alely je poměrně vysoká, proto je snaha vymýtit mutaci v populaci psů nereálná. Ovšem je vhodné genetické testování chovných psů plemen se sklony k tomuto onemocnění za účelem zabránění odchovu AA homozygotů, u kterých je nejvyšší riziko propuknutí degenerativní myelopatie. Existuje řada metod prokazatelně spolehlivých při detekci těchto mutací, např real-time PCR. Ačkoliv zjišťování genetických příčin degenerativní myelopatie zažívá velký rozmach, terapeutické metody ke zvrácení průběhu nemoci neexistují, a proto je zvýšená pozornost k této problematice při řízeném chovu psů jediným řešením problému. Lokalizaci mutací na genu SOD1 potvrdila příbuznost s amyotrofickou laterální sklerózou u člověka a pes je nyní modelovým organismem při studiu této nemoci.
30
5 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY Awano T., Johnson G.S., Wade C.M., Katz M.L., Johnson G.C., Taylor J.F., Perloski M., Biagi T., Baranowska I., Long S., March P.A., Olby N.J., Shelton G.D., Khan S,, O'Brien D.P., Lindblad-Toh K,, Coates J.R. (2009) Genome-wide association analysis reveals a SOD1 mutation in canine degenerative myelopathy that resembles amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 106 (8): 2794-9. Barclay K.B., Haines D.M., 1994: Immunohistochemical evidence for immunoglobulin and complement deposition in spinal cord lesions in degenerative myelopathy in German shepherd dogs., Can J Vet Res., 58(1): 20–24. Capucchio M.T., Spalenza V., Biasibetti E., Bottero M.T., Rasero R., Dalmasso A., Sacchi P., 2014: Degenerative myelopathy in German Shepherd Dog: comparison of two molecular assays for the identification of the SOD1:c.118G>A mutation., Mol Biol Rep., 41(2):665-70. Clark L.A., Tsai K.L., Murphy K.E., 2008: Alleles of DLA-DRB1 are not unique in German shepherd dogs having degenerative myelopathy. Anim Genet., 39 (3): 332. Coates J.R., March P.A., Oglesbee M., Ruaux C.G., Olby N.J., Berghaus R.D., O'Brien D.P., Keating J.H., Johnson G.S., Williams D.A., 2007: Clinical characterization of a familial degenerative myelopathy in Pembroke Welsh Corgi dogs., J Vet Intern Med., 21(6):1323-31. Coates J.R., Wininger F.A., 2010: Canine degenerative myelopathy. Vet Clin North Am Small Anim Pract., 40 (5): 929-50. Crisp M.J., Beckett J., Coates J.R., Miller T.M., 2013: Canine degenerative myelopathy: biochemical characterization of superoxide dismutase 1 in the first naturally occurring non-human amyotrophic lateral sclerosis model. Exp. Neurol. 248, 1-9 Ensembl, 2014: Dog assembly and gene annotation, Databáze online [cit. 2014-04-25]. Dostupné na: http://www.ensembl.org/Canis_familiaris/Info/Annotation#assembly Flegel T., Sharp N., Olby N., et al., 1999: Analysis of the canine αTTP gene—a candidate gene for degenerative myelopathy?., J Vet Intern Med., 13 (3): 240.
31
Green S.L., Tolwani R.J., Varma S., Quignon P., Galibert F., Cork L.C., 2002: Structure, chromosomal location, and analysis of the canine Cu/Zn superoxide dismutase (SOD1) gene J. Hered. 93 (2), 119-124 HOSKINS J., 2004: Geriatrics and gerontology of the dog and cat. Saunders, St. Louis, 415 s. Chang H.S., Kamishina H., Mizukami K., Momoi Y., Katayama M., Rahman M.M., JAGGY A., 2010: Atlas and textbook of small animal neurology. Manson Publishing, Hannover, 528 s. Morgan B.R., Coates J.R., Johnson G.C., Bujnak A.C., Katz M.L., 2013: Characterization of intercostal muscle pathology in canine degenerative myelopathy: a disease model for amyotrophic lateral sclerosis., J Neurosci Res., 91(12):1639-50 Murray R. (Ed.), 2002: Harperova Biochemie. H+H, Jinočany, 873 s. National Center for Biotechnology Information, 2014: CanFam3.1, Databáze online [cit. 2010-04-25]. Dostupné na: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ College of Veterinary medicine, 2014: Canine Karyotype, Databáze online [cit. 201004-25]. Dostupné na: http://www.cvm.ncsu.edu/mbs/breen_m02.htm RefGene, 2014: SOD1 GeneID:403559 Canis lupus familiaris, Databáze online [cit. 2010-04-25]. Dostupné na: http:// www.refgene.com Shearin A.L., Ostrander E.A.., 2010: Leading the way: canine models of genomics and disease., Dis Model Mech., 3(1-2):27-34 Shelton G.D., Johnson G.C., O'Brien D.P., Katz M.L., Pesayco J.P., Chang B.J., Mizisin A.P. and Coates J.R., 2012: Degenerative myelopathy associated with a missense mutation in the superoxide dismutase 1 (SOD1) gene progresses to peripheral neuropathy in Pembroke Welsh corgis and boxers, J. Neurol. Sci. 318 (1-2), 55-64. Thalman et al., 2013: Complete mitochondrial genomes of ancient canids suggest a European origin of domestic dogs, Science, 342(6160):871-4
32
Tsai K.L., Noorai R.E., Starr-Moss A.N., Pascale Quignon P., Rinz C.J., Ostrander E.A., Steiner J.M., Murphy K.E., Clark L.A., 2012: Genome-wide association studies for multiple diseases of the German Shepherd, Dog Mamm Genome, 23:203–211 Uddin M.M., Yabuki A., Kohyama M., Yamato O., 2013: Genotyping assays for the canine degenerative myelopathy-associated c.118G>A (p.E40K) mutation of the SOD1 gene using conventional and real-time PCR methods: a high prevalence in the Pembroke Welsh Corgi breed in Japan, J. Vet. Med. Sci. 75 (6), 795-798 Vandelvelde M., Higgins R., Overmann A., 2012: Veterinary neuropatology Essentials of theory and practice. Wiley-Blackwell, Oxford, 210 s. Wahl J.M., HerbstS.M., Leigh Anne Clark L.A., Tsai K.L., PhD, Murphy K.E., 2008: A review of hereditary diseases of the German shepherd dog., Journal of Veterinary Behavior., 3, 255-265 Wininger F.A., Zeng R., Johnson G.S., Katz M.L., Johnson G.C., Bush W.W., Jarboe J.M. and Coates J.R., 2011: Degenerative myelopathy in a Bernese Mountain Dog with a novel SOD1 missense mutation., Vet. Intern. Med. 25 (5), 1166-1170 Zeiler G.E., Van der Zwan H., OosthuizenM.C., 2012: Journal of the South African Veterinary Association, Vol 84, No 1 (2013), 5 pages Zeng R., Coates J.R., Johnson G.C., Hansen L., Awano T., Kolicheski A., Ivansson E., Perloski M., Lindblad-Toh K., O'Brien D.P., Guo J., Katz M.L., Johnson G.S., 2014: J Vet Intern Med., 28(2):515-21
33
6 SEZNAM OBRÁZKŮ Obrázek č. 1: Karyotyp psa domácího
9
Obrázek č. 2: Německý ovčák s degenerativní myelopatií, pozorovatelná nekoordinovanost a slabost pánevních končetin
11
Obrázek č. 3: Srovnání míchy poškozené degenerativní myelopatií (A) a míchy bez patologického nálezu (B)
12
Obrázek č. 4: Fyzioterapie
16
Obrázek č. 5: Zlepšení kvality života postižených psů invalidním vozíkem
17
Obrázek č. 6: Mapování genu spojeného s degenerativní myelopatií
21
Obrázek č. 7: Elektroforogramy nukleotidových sekvencí normálního psa a Bernského salašnického psa postiženého degenerativní myelopatií
34
23
