Detekce geneticky modifikovaných organizmů v potravinách a potravinářských surovinách Kamila Zdeňková Transgenní rostliny, tj. takové rostliny, do jejichž dědičného základu byly metodami genového inženýrství vneseny geny z jiných, často nepříbuzných organizmů, mají řešit otázky spojené s potřebou rychlého zvyšování zemědělské produkce, která úzce souvisí s růstem lidské populace. Dalším problémem, s jehož řešením mohou pomoci, jsou každoroční ztráty úrody po napadení škůdci nebo chorobami, protože množství chemikálií používaných na ochranu proti nim není z ekologického hlediska možné neustále zvyšovat. Hlavním cílem genetických modifikací (GM) je tedy zasáhnout do rostlinného genomu tak, aby došlo k vytvoření organismů rezistentních k herbicidům, odolných vůči škůdcům, bakteriálním, plísňovým a virovým infekcím, extrémním podmínkám, nebo ke zvýšení nutriční hodnoty potravin. Přestože celosvětově výměra ploch, na kterých jsou pěstovány transgenní plodiny, překročila v roce 2005 již 90 milionů hektarů, je stále respektována možnost nežádoucích projevů, které by mohly hypoteticky negativně ovlivňovat ostatní organizmy včetně člověka. V současné době existují v řadě zemí celého světa určitá omezení pro distribuci, prodej a využití geneticky modifikovaných organizmů (GMO). V České republice je použití GMO upraveno zákonem č. 346/2005 Sb., o nakládání s GMO a produkty, který zahrnuje problematiku uzavřeného nakládání s GMO a uvádění GMO do životního prostředí či do oběhu. Dále pak stanoví povinnost značit potraviny a krmiva obsahující více než 0,9 % GMO. Z legislativních požadavků plyne potřeba zavedení spolehlivého, účelného a rychlého kontrolního systému pro detekci GMO v potravinách, potravinářských surovinách a krmivech. Kontrola potravinářských surovin i samotných potravin a určování přítomnosti transgenů je dnes široce se rozvíjející vědní oblastí, která spojuje znalosti genetického inženýrství, biochemie, mikrobiologie a dalších vědních disciplín. V principu jsou metody detekce a kvantifikace
GMO
založeny
buď
na stanovení
specifických
nukleových
kyselin
(polymerasová řetězová reakce (PCR) či detekce exprese transgenu na úrovni RNA) nebo na stanovení bílkovin (určení přítomnosti bílkovin, imunochemické metody). Některé typy GMO mohou být detekovány také chromatograficky či infračervenou spektroskopií. Ve vědeckých i analytických laboratořích je nejčastěji prováděna detekce GMO pomocí PCR, kvantifikace pak pomocí PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase (qRT PCR). Běžně používané testovací postupy jsou shrnuty v tabulce I. Všechny uvedené metody mají určitá omezení, ať již citlivost, možnost ovlivnění ostatními složkami potraviny, vhodnost metody - 23 -
pro daný vzorek nebo cenu stanovení. Tato prezentace shrnuje aplikace uvedených technologií pro analýzu GMO a uvádí přednosti a specifická omezení jejich použití. Tab. I: Metody používané pro detekce GMO. Molekulárně biologické metody
Imunochemické metody Ostatní techniky
Detekce DNA
PCR a její variace (multiplex PCR, nested PCR) Kvantitativní kompetitivní PCR (QC-PCR) PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase (qRT PCR) Southernův přenos DNA čipy PCR-ELISA Detekce RNA Reversní transkripce – PCR (RT-PCR) Northern přenos RPA (ribonuclease protein assay) Detekce proteinu ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Western přenos (Imunoblot) Určení aktivity produktu transgenu Chromatografie Infračervená spektroskopie
Metody založené na detekci nukleových kyselin Pro detekci GMO bývají nejčastěji používány metody založené na detekci nukleových kyselin (NK). Mezi tyto metody patří PCR a její variace – multiplex PCR, nested PCR, kvantitativní kompetitivní PCR (QC-PCR), PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase (qRT PCR), reversní transkripce - PCR (RT-PCR); Southernův přenos; Northern přenos a ribonuclease protein assay (RPA), založená na specifické vazbě bílkoviny na NK. Jedním z prvních kroků testů založených na detekci NK je jejich izolace z testovaného vzorku potravin a potravinářských surovin, která zahrnuje lyzi buněčných membrán, inaktivaci nukleas a separaci nukleových kyselin od zbytků buněk. Efektivita metod založených na detekci NK záleží na kvalitě a čistotě izolovaných NK. Tyto ukazatele jsou důležitými faktory při stanovení GMO, a proto je významným bodem celé analysy výběr vhodné izolační metody a purifikačního procesu. Polymerasová řetězová reakce (PCR)
Polymerasová řetězová reakce (angl. polymerase chain reaction) je in vitro reakce umožňující mnohonásobné namnožení definovaných úseků DNA. Reakce je katalyzovaná termostabilní DNA polymerasou, např. Taq DNA polymerasou izolovanou z termofilní bakterie Thermus aquaticus. K namnožení cílové DNA se používá dvou oligonukleotidových primerů, které jsou komplementární k 3´ a 5´ koncovým sekvencím cílového úseku.
- 24 -
Vzhledem k tomu, že se jedná o řetězovou reakci, poskytuje tato metoda až 106 násobné pomnožení cílového úseku DNA během 2 - 3 hodin. Vlastní PCR se skládá z cyklického opakování 3 základních kroků (Obr. 1): 1) Oddělení vláken dvojšroubovice DNA teplotní denaturací při teplotě vyšší než 92°C. 2) Připojení primerů k jejich komplementárním úsekům v DNA (angl. annealing) při teplotě 45 - 60°C. 3) Prodloužení připojených primerů termostabilní DNA polymerasou (angl. elongace) při teplotě 70 - 75°C. Počet těchto cyklů (zpravidla 35 nebo 40) závisí na koncentračních poměrech v reakční směsi, požadovaném výtěžku a životnosti enzymu. Cyklickým opakováním kroků dochází k syntéze úseku definovaného primery, který tvoří hlavní produkt reakce. Užívané primery jsou synteticky připravené oligonukleotidy, které zpravidla obsahují 17 - 30 nukleotidů a jejichž sekvence jsou komplementární k požadovaným úsekům DNA. Umístění primerů ovlivňuje informační hodnotu PCR. Obr. 1: Polymerasová řetězová reakce (upraveno dle www.flmnh.ufl.edu/cowries/PCR.gif).
1
2
3
K identifikaci, separaci a purifikaci stejně dlouhých úseků DNA, tzv. amplikonů, získaných pomocí PCR se nejčastěji používá elektroforéza v agarozovém gelu. Při tomto způsobu detekce amplifikovaných produktů existuje možnost záměny nespecificky namnoženého úseku a specifického PCR produktu, zvláště pokud se jedná o produkty podobné velikosti. Pro snížení rizika získání falešně pozitivních výsledků je v některých
- 25 -
případech vhodné zařadit další analýzu produktu, například Southern přenosem, štěpení restrikčními endonukleasami, sekvenováním nebo pomocí značek zabudovaných přímo do primerů či nukleotidů nebo do hybridizační sondy specifické k určitému PCR produktu (radioaktivní a neradioaktivní značky). Multiplex PCR a Nested PCR Obměnou tradiční polymerasové řetězové reakce je metoda multiplex PCR založená na přidání násobné množství párů primerů do reakční směsi, což umožňuje analyzovat více parametrů v průběhu jednoho reakčního procesu. Tento způsob amplifikace je uplatňován například při kvantitativní detekci transgenní DNA, při které je jeden pár používaných primerů komplementární k internímu genu a druhý pár primerů k transgenu. Porovnáním množství PCR produktů vzniklých namnožením obou cílových úseků bývá kvantifikována transgenní DNA v analyzovaném vzorku. Ke zvýšení citlivosti a přesnosti může být použita tzv. nested PCR, která je složena ze dvou po sobě následujících amplifikačních reakcí s 25-40 reakčními cykly. Templátem první reakce je DNA získaná izolací vzorku, templátem druhé je produkt získaní první reakcí (Obr. 2). Jako primery jsou použity dva druhy oligonukleotidové sekvence (vnitřní a vnější). Vnitřní primery jsou komplementární k oblasti produktu získaného první reakcí. Zvýšená přesnost této techniky je důsledkem eliminace namnožených nespecifických amplifikačních produktů. 1. PCR
vnější primery DNA templát
cílový produkt 1. PCR
2. PCR
vnitřní primery DNA templát (cílový produkt 1. PCR) cílový produkt 2. PCR
Obr. 2: Nested PCR (upraveno dle Čikoš a kol., 2001). PCR systém používaný pro detekci GMO pomocí PCR
- 26 -
Na obrázku 3 je znázorněn používaný PCR systém detekce GMO pomocí PCR. Obrázek ukazuje předem připravenou rostlinnou transkripční jednotku
(konstrukt) obsahující
promotor (P), kódující sekvence (A,B) a terminátor (T). Dále jsou znázorněny rozdílné pozice komplementárních primerů a informace, které je možno získat z výsledků PCR. Pokud jsou v dané reakci použity primery komplementární k genomové DNA, ze získaných výsledků můžeme určit, je-li izolovaná NK schopna namnožení PCR procesem (viz. schéma – úroveň A, Druhově specifické PCR). Např. u potravin částečně vyrobených z transformované sóji je prováděna detekce sójového lecitinového genu. V případě použití primerů komplementárních k regulačním sekvencím mohou získané výsledky potvrdit přítomnost transgenní DNA v testovaném vzorku potraviny nebo potravinářské suroviny (úroveň BI, Monitorovací PCR). Příkladem je kvalitativním PCR systém specifický pro originální sekvence 35S promotoru viru žilkové mozaiky květáku (P-35S CaMV promotor) či T-nos terminátoru půdní bakterie Agrobacterium tumefaciens, jež patří mezi nejčastěji používané regulační sekvence při cíleném přenosu genů do rostlinných buněk. Prostřednictvím primerů nasedajících uvnitř transgenní DNA bývá určen vložený gen (úroveň BII, Amplifikace transgenu). Primery komplementární k regulační sekvenci a genu určují vloženou transkripční jednotku (úroveň BIII, Konstrukt specifické PCR) a primery amplifikující úsek mezi regulační sekvencí a genomovou DNA určují druh transgenního organizmu (úroveň BIV, Odrůdově specifické PCR).
- 27 -
A Druhově specifické PCR BI Monitorovací PCR
BII Amplifikace transgenu
BIII Konstrukt specifické PCR BIV Odrůdově specifické PCR
Obr. 3: Používaný systém PCR detekce GMO (upraveno dle Zdeňková, 2002). P: promotor, T: terminátor, Gen A a gen B: vložené geny Metoda PCR představuje významnou techniku pro detekci GMO v potravinách. Nukleové kyseliny nejsou považovány za důležitou složku potravin, jejich přítomnost nezvyšuje nutriční hodnotu výrobku a neexistuje přímá vazba mezi DNA a kvalitou potraviny, přesto jsou hlavním nástrojem při detekci GMO. Zatímco proteiny jsou teplotně nestabilní molekuly a v průběhu zpracování potravin degradují, nukleové kyseliny jsou odolnější vůči zvýšené teplotě i změnám pH. Kromě toho metoda PCR je vysoce specifická, citlivá a rychlá. Umožňuje najít teoreticky jedinou odlišnou molekulu DNA ve vzorku materiálu během několika hodin, čehož je využíváno pro rychlé analýzy velkého počtů vzorků. Detekční limity PCR metod se pohybují v rozmezí 0,001 až 1 % GMO. Pomocí PCR je však prokázána pouze přítomnost sekvencí komplementárních ke zvoleným primerům. Výsledky nenaznačují, zda je DNA sekvence integrována do genomu rostliny ani její koncentraci. Kvantifikace GMO v potravinách pomocí PCR Hlavním nedostatkem tradiční PCR je nepřesná kvantifikace, která je závislá na účinnosti amplifikačního procesu. Jestliže je účinnost amplifikace (angl. efficiency, E) konstantní
- 28 -
pro každý reakční cyklus, koncentrace PCR produktu je úměrná počátečnímu množství cílové DNA. Účinnost amplifikace však není parametrem konstantním, ale proměnným. A to v rámci různých reakcí i v průběhu jedné reakce, zejména v posledních cyklech, kdy jsou produkty tvořené v neexponenciální fázi neznámou reakční rychlostí. Pro dosažení vysoké citlivosti PCR procesu je množství vytvořeného produktu měřeno v závěrečné fázi, kdy amplikon dosáhne maximálního výtěžku (známé jako „plato fáze“). V „plato fázi“ procesu je korelace mezi koncentrací produktu a počátečním množstvím cílové DNA jen velmi nízká. Pro kvantifikaci DNA jsou používány metody, které vyřešily problém určení vztahu mezi koncentrací cílové DNA sekvence a množstvím PCR produktu vytvářeného během amplifikace. Používané techniky jsou následující: Společná amplifikace cílové sekvence a vnitřního standardu pomocí kvantitativní kompetitivní PCR (QC-PCR). Měření PCR produktu v počátečních fázích reakce, kdy je účinnost amplifikace (E) stále ještě konstantní a proto jsou koncentrace produktu v korelaci s počátečním množstvím cílové DNA sekvence. Tohoto principu využívají metody PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase (qRT PCR) a spojení metod PCR-ELISA. Kvantitativní kompetitivní polymerasová řetězová reakce (QC-PCR) Metoda kvantitativní kompetitivní PCR (QC-PCR) je založena na společné amplifikaci cílové sekvence vzorku a vnitřního standardu o známé koncentraci. Synteticky připravený vnitřní standard i analyzovaný vzorek jsou amplifikovány prostřednictvím stejných primerů, čímž je zajištěna podobná amplifikační účinnost. Produkt amplifikace vnitřního standardu by měl obsahovat stejné procentuální zastoupení guanidinu a cytosinu jako cílová sekvence testovaného vzorku, dále musí mít velikost umožňující jeho snadné odlišení od kvantifikované cílové sekvence. Rozdíl ve velikosti produktů se pohybuje maximálně v desítkách párů bazí. Při QC-PCR je vždy zapotřebí analyzovat sérii PCR reakcí jedné koncentrace DNA analyzovaného vzorku s přídavky různých koncentrací DNA vnitřního standardu. DNA standardu a cílového úseku „soupeří” o primery, nukleotidy i polymerasu. Pokud je na začátku reakce výrazný nadbytek jedné cílové DNA, je produkt amplifikace tohoto úseku ve značném přebytku. Kvantitativní vyhodnocení je získáno odečtením po elektroforetickém rozdělení PCR produktů (Obr. 4). Množství cílové sekvence je odečteno z bodu ekvivalence, ve kterém je shodná intenzita signálu PCR produktu vzorku se signálem vnitřního standardu o známé koncentraci. Nevýhodou této metody je semikvantitativní odhad koncentrace cílové sekvence ve vzorku, výhodou je odhalení případné inhibice PCR procesu. - 29 -
Obr. 4: Princip QC-PCR – společná amplifikace neměnného množství cílové sekvence s rozdílnými množstvími vnitřního standardu (upraveno dle www.gmotraining.jrc.it). Zvýšující se přídavek koncentrace vnitřního standardu. Amplifikovaná cílová sekvence.
↑ Bod ekvivalence
PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase (qRT PCR) Principem qRT PCR je rychlé a přesné zaznamenávání produktů PCR bezprostředně po jejich vzniku, v každém jednotlivém cyklu reakce. K detekci vznikajícího produktu mohou být použity různé systémy založené na stanovení změny intenzity fluorescenčního záření během amplifikace. Jeden z používaných systémů využívá interkalační barvivo SYBR Green I (SG I), další jsou založeny na použití fluorescenčně značených sond nebo primerů. Pro kvantifikaci DNA je využíváno schopnosti interkalačního barviva SG I vázat se do malého žlábku dvojvlákna DNA (dsDNA), princip qRT PCR se SG I je vysvětlen na obrázku 5. V průběhu cyklu je nejprve DNA denaturována teplotou na jednotlivá vlákna, do kterých se barvivo neinterkaluje (Obr. 5a). Intenzita jeho fluorescenčního signálu je tedy velmi nízká. Po snížení teploty dojde k nasednutí primerů a vytvoření krátkého úseku dvouvláknové DNA. Barvivo SG I je vázáno na nově vzniklou dsDNA (Obr. 5b). V průběhu prodlužování primerů vzrůstá množství barviva navázaného do dsDNA a tím i intenzita fluorescence, která je měřena na konci elongační fáze každého cyklu (Obr. 5c). Začátek vzrůstu fluorescence měřeného vzorku nad hodnotu fluorescence pozadí je závislý na počáteční koncentraci cílové DNA. Obr. 5: Interkalace barviva SG I mezi www.biochem.roche.com/lightcycler). Legenda: a) Prostředí reakce po teplotní denaturaci b) Nasednutí primerů a vazba barviva c) Prodlužování primerů a)
b)
řetězce
c)
- 30 -
dsDNA
(upraveno
dle
Pro specifickou detekci DNA při qRT PCR jsou používány sondy komplementární k vnitřní části cílového úseku, méně často pak LUX systém využívající jednoho fluorescenčně značeného primeru. Sondy nejsou většinou v průběhu reakce rozštěpeny, pouze hydrolyzační TaqMan sondy jsou v průběhu amplifikační reakce rozštěpeny 5´-3´ exonukleasovou aktivitou Taq polymerasy. TaqMan fluorescenčně značené sondy jsou složeny z krátkého DNA fragmentu, který obsahuje dvojici fluoroforů. Jeden z nich, na 5´ konci sondy, má funkci zářiče (angl. reporter; „R“) a druhý, na 3´ konci sondy, má funkci zhášeče fluorescence (angl. quencher; „Q“). Díky jejich vzájemné blízkosti je u sondy v inaktivním stavu potlačováno zhášečem všechno záření emitované zářičem. V průběhu každého cyklu je stejně jako při klasické PCR dvojvlákno DNA nejdříve separováno na jednotlivá vlákna, dále dochází k nasednutí primerů a TaqMan sondy. Posledním krokem je polymerace DNA polymerasou. DNA polymerasy používané v qRT PCR vykazují silnou 5’-3’ exonukleasovou aktivitu, podle podmínek reakce může při polymeraci štěpit vnitřní sondu na jednotlivé nukleotidy. Po rozštěpení TaqMan sondy se zhášeč a fluorofor již nenacházejí v těsné blízkosti. Dochází k ukončení efektu zhášení a tím k nárůstu fluorescenčního signálu. Vzniklá fluorescence je měřena na konci každé elongační fáze (Obr. 6). Obr. 6: Princip TaqMan sond (upraveno dle www.molecularprobes.com).
Při qRT PCR je využíván jev známý pod zkratkou FRET (Fluorescenční rezonanční přenos energie; angl. Fluorescence Resonance Energy Transfer), který je založen na přenosu - 31 -
energie mezi fluorofory. Na obrázku 7 je zobrazen systém Dual Oligo FRET sond založený na použití dvou vnitřních sond s fluoroforem na 3’ konci sondy 1 a fluoroforem na 5’ konci sondy 2. Sondy jsou navržené k nasednutí blízko sebe uvnitř cílové sekvence. První fluorofor po excitaci vnějším zdrojem emituje zelené fluorescenční světlo. Při dostatečné blízkosti druhé sondy druhý fluorofor zachycuje emitované světlo a excituje světlo červené o vyšší vlnové délce. Celý systém sond je měřen na konci annelingu (Obr 7c). FRET (Obr. 7c) je závislý na vzdálenosti sond, efektivní transfer probíhá pouze mezi sondami v těsné blízkosti (1-5 nukleotidů). V průběhu elongace dochází k uvolnění vnitřních sond, a tím k jejích oddálení. Druhá sonda tedy nezachytává energii vysílanou první, tím dochází k nárůstu fluorescence (Obr 7b). Obr. 7: Princip FRET sond (upraveno dle www.biochem.roche.com/lightcycler). Legenda: a) Prostředí reakce po teplotní denaturaci. d) Ozáření nenavázaných sond. b) Ozáření po nasednutí sond na cílové sekvence (měřena je fluorescence emitovaná druhým fluoroforem).
LUX systém (Light Upon eXtension) nevyužívá pro fluorescenční detekci vznikajících produktů sondu, fluorescenčně je značen jeden z primerů. Zhášení fluorescence značeného primeru je dáno jeho sekundární strukturou (smyčka), k vzrůstu fluorescence dochází po nasednutí primeru na cílovou sekvenci a při jeho prodlužování. Ačkoliv je vysoká cena přístrojů a specifických reagencií překážkou pro mnoho
- 32 -
laboratoří, qRT PCR může být v současné době považována za nejpřesnější a nejvýhodnější dostupnou kvantitativní metodu. DNA čipy Rychlý rozvoj molekulárně-biologických metod umožňuje přípravu GMO, které obsahují nové znaky, rozmanitost a vyšší množství vkládaných genů i regulačních prvků. Již v roce 1997 Hemmer publikoval některé schválené GM plodiny neobsahující P-35S promotor ani Tnos terminátor. Z toho vyplývá potřeba analýzy dalších genetických modifikací. Toto vyžaduje vývoj nových automatizovaných systémů, které mohou snížit nejen čas, ale i náklady analýz. Detekovat přítomnost různých sekvencí v molekule NK lze také pomocí biočipů (angl. microarrays nebo arrays), což jsou kolekce mikroskopických spotů DNA navázaných k pevnému povrchu, jako například sklu, plastu nebo křemíkovému čipu. Na velmi malé plošce čipu jsou umístěny tisíce krátkých DNA sond komplementárních k hledaným sekvencím sledovaného vzorku. Navázané DNA fragmenty se označují jako sondy, kterých můžou být na jediném biočipu tisíce. Technika DNA čipů je založena na klasické technologii hybridizace DNA. Principem je detekce sekvencí NK na základě specifické interakce komplementárních úseků analyzované molekuly a DNA sondy. Jako sondy mohou být využívány kratší oligonukleotidy (20-30 bp), PCR produkty, genomová DNA, umělé bakteriální chromosomy (BAC z angl. bacterial artificial chromosome), plazmidy nebo i dlouhé oligonukleotidy (do 70 bp). DNA biočipy jsou nejčastěji využívány k měření exprese velkého množství genů současně. NK bývají izolovány z buněk, RNA je a poté převedena na cDNA nebo cRNA, a jsou amplifikovány pomocí PCR technik. Fluorescenční značky mohou být přímo zabudovány do nově syntetizovaného řetězce (pokud je použito značených nukleotidů) nebo chemicky navázány k řetězcům jednořetězové DNA nebo RNA. Vzorky jsou naneseny na filtry odděleně a jsou inkubovány se sondou a promyty. Řetězec NK hybridizuje se sondou imobilizovanou na povrchu pevného nosiče. Hybridizované sondy jsou detekovány buď chemiluminiscenčně nebo přímo fluorescenčně. V místech, kde došlo k hybridizaci na základě komplementarity příslušných úseků, je fluorescence emitována laserovým paprskem a intensita každé skvrny je měřena CCD kamerou a data jsou počítačově vyhodnocena. Pro detekci GMO byly použity např. v práci Xu a kol. (2006) pro monitorování přítomnosti GMO pomocí detekce P-35S, T-nos a specifických úseků transgenů. Pomocí čipu navrženého ve zmiňované práci lze detekovat 95 % v současné době povolených GM odrůd, detekční limit tohoto čipu je 0,5 % GM sóji a 1 % GM kukuřice. - 33 -
Analysa RNA V mnoha případech jsou analýzy exprese transgenů zaměřeny na proteiny nebo jiné finální produkty, jejichž akumulace má být fenotypovým projevem exprese. Ne vždy je možní provést analýzu proteinů. Požadovaných výsledků lze také dosáhnout analysou RNA transkriptů. Dokonce v případech, kdy jsou známy výsledky analýzy proteinů, poskytla analýza RNA užitečné informace o akumulaci transkriptu a jeho stabilitě. Pomáhá i při objasňování nepředpokládaných fenotypových projevů. Pro měření množství RNA mohou být použity takové techniky jako reverzní transkripce - PCR (RT-PCR), Northern přenos a ribonuclease protein assay (RPA). Principem RT-PCR je spojení PCR s reverzní transkripcí. Nejdříve je provedena izolace totální RNA nebo čisté mRNA z testovaného vzorku. Pomocí DNasy jsou odstraněny zbytky DNA, následně je RNA podrobena reverzní transkripci a polymerasové řetězové reakci. Popisovaná metoda může být použita jako rychlá a relativně vysoce účinná screeningová metoda určení přítomnosti specifického transkriptu. Výhody RT-PCR, v porovnání s Northern přenosem a RPA, jsou malá množství potřebného materiálu, vysoká citlivost a snadnost přípravy vzorku. Nevýhodou při práci s RNA je vysoké riziko její degradace RNasami, které jsou velmi stabilní a nevyžadují žádné kofaktory. Jestliže použijeme RT-PCR je nutné umět rozlišit mezi produkty vzniklými z amplifikace genomové DNA vzorku a produkty syntézy cDNA z RNA vzorku in vitro. Proto je požadováno zpracování vzorku pomocí DNas a dále by měli být použity takové primery, aby amplifikace vzorku DNA byla buď nemožná nebo aby amplifikované produkty měly rozdílnou velikost než amplikony vzniklé z cDNA. Metody založené na detekci proteinu Metody založené na detekci proteinu (imunochemické a enzymové) – detekují produkt transgenu nebo metabolity, jejichž produkce je ovlivněna vloženým genem. Pro stanovení GMO v potravinách a potravinářských surovinách mají tyto metody podstatné limity, které významně omezují jejich běžné použití. První nevýhodou je dispozice jen velmi mála protilátek specifických proti proteinům produkovaným expresí vloženého genu, není však určen vložený transgen. Druhou nevýhodou pro aplikaci těchto analýz je degradace a změny v konformaci proteinů v průběhu zpracování potravin. V případě, že jsou vhodné protilátky k dispozici, jsou vyvinuté metody vhodné pouze pro čerstvé potravinové suroviny a neupravené potraviny. Nicméně tyto metody jsou citlivé, specifické, efektivní a jsou běžně - 34 -
používány pro studium akumulace proteinů v transgenních rostlinách. Detekční limit se pohybuje mezi 0,3 až 1 % GMO. Správnost a přesnost stanovení však může být nepříznivě ovlivněna ve složitých matricích, kde možné interference mohou způsobovat nespecifické interakce protilátek. Imunochemické metody Základem všech imunochemických detekčních metod je specifická interakce antigenu (Ag) s protilátkou (Ab). Jsou běžně používány pro studium akumulace proteinů v transgenních
rostlinách.
Pro detekci
GMO
jsou
nejčastěji
používány
dva
typy
imunochemických metod: a) Western přenos (imunoblotting) b) ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Při Western přenosu je směs proteinů přenesena z gelu na nitrocelulosovou membránu a jednotlivé proteiny jsou identifikovány podle toho, jak se váží s příslušnými značenými protilátkami. Enzymová imunoanalýza na pevné fázi ELISA patří mezi imunoanalytické metody, které ve fázi detekce nebo kvantifikace používají enzymovou reakci. Jeden z imunoreaktantů (Ag, Ab) je vždy imobilizován na pevný nosič, kterým může být např. membrána, skleněná podložka, stěna zkumavky nebo mikrotitrační destičky. Nejčastější uspořádaní metody používané pro detekci GMO v potravinách je přímá nekompetitivní ELISA, tzv. sendvičový formát (Obr. 8). Využívá většinou dvou protilátek, z nichž první je imobilizovaná na povrch nosiče a specificky interaguje s antigenem. Druhá protilátka, značená enzymem (nejčastěji peroxidasa, alkalická fosfatasa, β-galaktosidasa a glukosa oxidasa) reaguje s jinými determinantními skupinami na odlišné části molekuly antigenu. Po přidání chromogenního substrátu je výsledná enzymová reakce vyhodnocena spektrofotometricky. Obr. 8: Přímá nekompetitivní ELISA. Legenda: a) Imobilizovaná protilátka b) Přídavek vzorku c) Specifická interakce protilátky a antigenu d) „Sendvič” antigenu a obou protilátek
a)
b)
c) - 35 -
d)
Výhoda Western přenosu oproti ELISA je schopnost stanovit molekulární hmotnost proteinu, reprodukovatelné výsledky mohou být dosaženy i při použití ne zcela přečištěných protilátek. Western hybridizace je však časově náročnější a kvantitativní výsledky jsou určovány s menší přesností. Naproti tomu ELISA metody jsou vysoce specifické, citlivé a relativně snadno proveditelné. Mezi nevýhody ELISA metod patří občasný výskyt falešně pozitivních výsledků získaných např. použitím protilátek s nízkou specifitu. Sendvičová ELISA je používána například pro stanovení enzymu 5-enolpyruvátšikimát-3--fosfosynthasy (CP4 EPSPS) exprimovaného v transgenní sóji, odolné vůči herbicidu Roundup. Při spojení PCR-ELISA je detekce produktu polymerační reakce provedena pomocí protilátek. Amplifikační produkt je značen digoxigeninem začleňovaným během amplifikační reakce probíhající v přítomnosti digoxigenin-11-dUTP (DIG-dUTP). Produkt PCR reakce hybridizuje s komplementární sondou značenou biotinem a poté je hybrid imobilizován na mikrotitrační destičky pokryté streptavidinem. Imobilizace je závislá na interakci biotinu navázaného na sondě se streptavidinem, jímž je potažen povrch jamek destičky. Po promytí volných nespecifických amplifikačních produktů je kvantifikováno množství navázaných PCR produktů pomocí protilátky proti digoxigeninu s konjugovaným enzymem. Detekce je zprostředkována reakcí enzymu s chromogenním substrátem. Princip metody je schématicky znázorněn na obrázku 9. Tato metoda je velmi citlivá, specifická a rychlá. Pokud je polymerasová řetězová reakce zastavena před poklesem amplifikační účinnosti, je možné použít metodu PCR-ELISA pro kvantifikaci GMO. Při použití mikrotitračních destiček může být charakterizováno a kvantifikováno až 96 produktů během 1 - 5 hodin. I když byla tato metoda aplikována na různé vzorky a GMO detekční kit využívající tohoto principu je na trhu dostupný, nenašla široké uplatnění při kvantifikaci obsahu GMO v potravinách a potravinářských výrobcích. Obr. 9: Princip detekce produktu PCR pomocí ELISA (upraveno dle www.roche-appliedscience.com).
- 36 -
Strip test Na principu
imunochromatografie
v sendvičovém
uspořádání
(Lateral
Flow
Immunoassay, LFIA) jsou založeny nitrocelulosové testovací proužky Lateral Flow Strip, jejichž princip je vysvětlen na obrázku 10. Stripy umožňují testování jednotlivých vzorků potravin a potravinářských surovin. Test používá dva typy monoklonálních protilátek, specifických pro stanovovaný protein. První typ protilátky je imobilizován na membráně testovacího proužku, druhý je konjugován s koloidním zlatem nebo barevnými latexovými částicemi. Pokud je ve vzorku transgenní protein, vytváří sendvič se značenými a imobilizovanými protilátkami. Pozitivním výsledkem je barevná linka uprostřed testu. V horní části testovacího proužku je imobilizována kontrolní protilátka, která váže přebytek značených protilátek nezávisle na tom, zda je antigen ve vzorku přítomen. Jestliže je výsledek testu negativní a sledovaný protein není přítomen v extraktu, objeví se pouze jedna linka v horní části testovacího proužku vypovídající o funkčnosti a správnosti prováděného testu. Jestliže je transgenní protein přítomen, jsou zbarveny obě linky. Lateral Flow Strip poskytují výsledky během 5-10 minut. Kromě časové nenáročnosti jsou dalšími výhodami nízká cena a jednoduchost provedení. Lateral Flow Strip se používají pouze pro informativní stanovení, pozitivní výsledky testu musejí být konfirmovány jinou metodou. Z těchto důvodů je metoda vhodná a v praxi používaná pro přímé získání prvních předběžných výsledků. Obr. 10: Lateral Flow Strip (upraveno dle Lipton a kol., 2000). - 37 -
Určení aktivity produktu transgenu Cíleným fenotypovým projevem vloženého genu bývá nejčastěji protein se specifickou aktivitou. Aktivita může být měřena pomocí biochemických metod a/nebo biometod – např. rezistence rostliny vůči hmyzu nebo patogenům. V každém případě je důležité uvědomit si, že tato aktivita je v mnoha případech nejvíce řízená fenotypem rostliny. Tento fakt může být rozhodující pro pochopení fenotypového projevu. Ostatní techniky používané pro detekci GMO Chromatografie Pokud se liší složení GMO od nemodifikovaného organismu, např. zastoupení mastných kyselin nebo triglyceridů, mohou být tyto rozdíly detekovány prostřednictvím tradičních chemických metod založených na chromatografickém principu. Toto je možné využít například při detekci oleje získaného z GM kanoly pomocí HPLC (vysokotlaká kapalinová chromatografie) spojené s hmotnostní ionizační spektrometrií (HPLC-MS). Nicméně, tato metoda je průkazná pouze tehdy, pokud je složení GM rostlin nebo získaných produktů významně odlišné od složení nemodifikovaných organismů. Mimo to jsou tyto metody vhodné spíše pro kvalitativní analýzu než pro kvantifikaci GMO. Infračervená spektroskopie
- 38 -
Určité zásahy do genomu organizmu mohou změnit i strukturu vláken v rostlinách, přestože nejsou detekovatelné žádné významné rozdíly ve složení proteinů nebo olejů (např. Roundup Ready sója). Změny ve struktuře mohou být zaznamenány pomocí infračervené spektroskopie. Nicméně schopnost rozlišit malé množství GMO v nemodifikovaných produktech je v tomto případě rovněž značně obtížné, stejně jako v případě použití chromatografických metod. Závěr V současné době existuje řada principiálně rozdílných metod, jež mohou být použity pro kvantifikaci a charakterizaci transgenní DNA, eventuelně výsledného produktu její exprese. Při výběru vhodných detekčních metod pro konkrétní materiál je vždy předem nutné zvážit výpovědní hodnotu, citlivost, specifičnost a další výhody i nevýhody každého metodického postupu. V souvislosti s tím je důležité přihlédnout též k charakteru, složení a původu testovaného materiálu, který může ovlivnit izolaci DNA nebo bílkovin. Vzhledem k tomu, že se vždy jedná o analýzy citlivé na přesnost provedení, je laboratorní zručnost a zkušenost v dané problematice nezbytnou podmínkou pro úspěšné testování GMO. Nejčastěji jsou průkaz a kvantifikace GMO prováděny molekulárně - biologickou metodou PCR, založenou na detekci nukleových kyselin nebo imunochemickou metodou ELISA, založenou na detekci specifických proteinů pomocí protilátek.
- 39 -
