UJI IN SILICO SENYAWA GENISTEIN SEBAGAI LIGAN PADA RESEPTOR ESTROGEN ALFA SKRIPSI. Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

UJI IN SILICO SENYAWA GENISTEIN SEBAGAI LIGAN PADA RESEPTOR ESTROGEN ALFA

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Aprilini Khaterin Johan NIM : 128114036

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016


UJI IN SILICO SENYAWA GENISTEIN SEBAGAI LIGAN PADA RESEPTOR ESTROGEN ALFA

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Aprilini Khaterin Johan NIM : 128114036

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016

i




iv


v


HALAMAN PERSEMBAHAN

“I am only one; but still I am one. I cannot do everything, but still I can do something. I will not refuse to do something I can do.” – Helen Keller

“ If you can’t fly then run, if you can’t run then walk, if you can’t walk then crawl, but whatever you do you have to keep moving forward.” – Martin Luther King Jr. “ I can do everything through Him who gives me strength.” – Philippians 4 : 13

“ Kamu adalah garam dunia. Jika garam itu menjadi tawar, dengan apakah ia diasinkan? Tidak ada lagi gunanya selain dibuang dan diinjak orang. Kamu adalah terang dunia. Kota yang terleyak di atas gunung tidak mungkin tersembunyi. Lagipula orang tidak menyalakan pelita lalu meletakkannya di bawah gantang, melainkan di atas kaki dian sehingga menerangi semua orang di dalam rumah.” – Matius 5 : 13-15

Kupersembahkan untuk :

Tuhan Yang Maha Esa Mama dan David Alfonso Teman-teman Farmasi Sanata Dharma Diriku sendiri Almamaterku

vi


PRAKATA Puji Syukur penulis ucapkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas berkat-Nya penyusunan skripsi yang berjudul “UJI IN SILICO SENYAWA GENISTEIN SEBAGAI LIGAN PADA RESEPTOR ESTROGEN-ALFA” dapat dilaksanakan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Selama proses penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis mendapatkan banyak bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 2. Dr. Sri Hartati Yuliani, Apt., selaku Ketua Program Studi S1 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 3. Dita Maria Virginia, M.Sc., Apt., selaku Wakil Kepala Program Studi S1 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan dukungan dan motivasi. 4. Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing skripsi dan akademik yang telah memberikan masukan, pengarahan,

serta

motivasi dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini. 5. Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku dosen penguji skripsi yang telah memberikan masukan dalam penyusunan skripsi ini.

vii


6. Florentinus Dika Octa Riswanto, M. Sc., selaku dosen penguji skripsi yang telah memberikan masukan dalam penyusunan skripsi ini. 7. Mama dan David Alfonso yang telah memberikan dukungan penuh kepada penulis selama proses penyusunan skripsi. 8. Clara Felicia, Felicia Fraulein, Liliana, dan Karla Violeta, teman-teman seperjuangan skripsi yang telah mendukung dan mengingatkan penulis. 9. Sahabatku, Abal, Ave, Edo, Ela, Indra, Irest, Mic, Resta, dan Rina, terima kasih atas kebersamaan serta canda dan tawa selama pengerjaan skripsi ini. 10. Putra, Adis, Dara, Tari, dan Ike serta teman-teman pengurus Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas segala kerja keras dan dukungan untuk penulis dalam menyelesaikan skripsi ini. 11. Teman-teman FST A 2012 atas pengalaman dan kebersamaan yang berharga selama menjalani perkulihan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma 12. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu atas bantuan dalam proses penyusunan skripsi ini. Akhir kata, penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini mengingat keterbatasan kemampuan dan pengetahuan penulis. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua pihak. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi pembaca.

Penulis

viii


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL....................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN ....................................................................... ii PENGESAHAN SKRIPSI ............................................................................ iii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... iv PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI……………………...…...v HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... vi PRAKATA ................................................................................................... vii DAFTAR ISI ................................................................................................. ix DAFTAR TABEL ........................................................................................ xii DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xiii INTISARI.................................................................................................... xiv ABSTRACT ................................................................................................... xv BAB I PENDAHULUAN .............................................................................. 1 A. Latar Belakang .......................................................................................... 1 1. Permasalahan...................................................................................... 2 2. Keaslian Penelitian ............................................................................. 3 3. Manfaat Penelitian ............................................................................. 3 B. Tujuan Penelitian ....................................................................................... 4 1. Tujuan Umum .................................................................................... 4 2. Tujuan Khusus ................................................................................... 4 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA............................................................. 5 A. Kanker Payudara ....................................................................................... 5 B. Reseptor Estrogen Alfa.............................................................................. 6

ix


C. Genistein .................................................................................................... 7 D. Uji In Silico ............................................................................................... 9 E. Penapisan Virtual Berbasis Struktur .......................................................... 9 F. Landasan Teori ........................................................................................ 13 G. Hipotesis .................................................................................................. 13 BAB III METODE PENELITIAN ............................................................... 14 A. Jenis dan Rancangan Penelitian .............................................................. 14 B. Variabel Penelitian .................................................................................. 14 1. Variabel penelitian ........................................................................... 14 C. Definisi Operasional ................................................................................ 15 1. Ligan ................................................................................................ 15 2. PLIF bitstring ................................................................................... 15 3. Pose genistein ................................................................................... 15 4. Protokol penelitian ........................................................................... 15 5. Protokol post docking analysis......................................................... 15 6. PVBS ................................................................................................ 15 7. Senyawa Marginal ............................................................................ 15 8. Senyawa yang diuji .......................................................................... 15 9. Skor ChemPLP ................................................................................. 15 D. Bahan dan Alat Penelitian ....................................................................... 16 1. Bahan yang digunakan dalam penelitian.......................................... 16 2. Alat atau instrumen penelitian ......................................................... 16 E. Tata Cara Penelitian ................................................................................. 17

x


1. Preparasi genistein ........................................................................... 17 2. Penambatan genistein ....................................................................... 17 F. Tata Cara Analisis Hasil .......................................................................... 17 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 19 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN....................................................... 23 A. Kesimpulan.............................................................................................. 23 B. Saran ........................................................................................................ 23 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. 24 BIOGRAFI PENULIS ................................................................................. 26

xi


DAFTAR TABEL Halaman Tabel I. PLIF bitstring yang penting dalam decision tree ............................. 12 Tabel II. Data bitstring pose yang divisualisasikan...................................... 19 Tabel III. Skor pada PLIF bitstring penting ................................................. 23

xii


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Contoh ligan untuk reseptor estrogen........................................... 7 Gambar 2. Klasifikasi utama fitoestrogen ...................................................... 8 Gambar 3. Contoh dari Senyawa yang masuk golongan Isoflavon ............... 8 Gambar 4. Decision tree yang dikembangkan oleh Istyastono .................... 13 Gambar 5. Pose visulisasi genistein pada kantung ikatan REα.................... 20 Gambar 6. Alur decision tree yang diperoleh berdasarkan data genistein... 21

xiii


INTISARI Kejadian kanker payudara di Indonesia mencapai 13% dari total seluruh kejadian kanker. Reseptor estrogen alfa (REα) berperan dalam difusi dari estrogen yang dikaitkan dengan induksi dan pertumbuhan kanker payudara. Genistein secara in vitro diketahui memiliki aktivitas sebagai antikanker, sehingga untuk menambah informasi tentang kemampuan genistein sebagai ligan antikanker pada REα dilakukan uji in silico terhadap REα. Pada penelitian ini dilakukan penambatan pada luaran SPORES menggunakan PLANTS1.2. Iterasi penambatan molekul dilakukan tiga kali. Luaran berupa 1000 pose yang mempunyai skor ChemPLP dan PLIF bitstring yang digunakan untuk menilai keaktifan genistein sebagai ligan dengan decision tree pada post docking analysis yang digunakan. Pengamatan visual interaksi genistein dengan REα dilakukan menggunakan PyMol 1.2R1. Hasil dari penelitian ini adalah genistein merupakan ligan reseptor estrogen alfa (REα). Genistein memenuhi syarat pada decision tree, yaitu PLIF bitstring 320 on dan skor ChemPLP yang lebih kecil dari -84,8200, yaitu -84,9031. Kata kunci : Kanker payudara, REα, genistein, in silico, PLANTS1.2, PyMOL1.2r1., skor ChemPLP, PLIF bitstring.

xiv


ABSTRACT Breast cancer incidence in Indonesia reached 13% of the total incidence of cancer. Estrogen Receptor Alpha (ERα) plays a role in the diffusion of estrogen associated with breast cancer induction and growth. Previous in vitro study showed that genistein had anticancer activity, therefore in silico study of genistein is needed to add information about the ability of genistein as a ligand on ERα. In this study, the output from SPORES was docked using PLANTS1.2. Iteration of molecular docking had been done three times. The outputs are 1000 poses that have ChemPLP score and PLIF bitstring as the results. They were used to assess the activity of genistein as ligand with the decision tree that was used in post docking analysis. Visual observation of the interaction of genistein with ERα was performed using PyMol 1.2R1. Results from this study showed that genistein is ligand in the binding pocket of ERα. That is because genistein’s PLIF bitstring 320 is on and the score of ChemPLP of genistein smaller than -84,8200, i.e., -84,9031 that is in agreement with the decision tree. Key words : Breast cancer, ERα, genistein, in silico, PLANTS1.2, PyMOL1.2rs1., ChemPLP Scores, PLIF bitstring.

xv


BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Kanker atau neoplasma merupakan suatu penyakit akibat adanya pertumbuhan yang abnormal dari sel-sel jaringan tubuh yang mengakibatkan invasi ke jaringan-jaringan normal. Kanker dapat menyebar pada bagian tertentu seperti payudara. Kanker payudara (Carcinoma mammae) merupakan salah satu jenis kanker yang mempunyai prevalensi yang cukup tinggi (Siswono, 2003). Diperkirakan pada tahun 2012 terdapat 1,7 juta wanita didiagnosa menderita kanker payudara (WCRF, 2015). Menurut Pusat Data dan Informasi Kementerian Kesehatan Republik Indonesia pada tahun 2013 kejadian kanker payudara di Indonesia mencapai sebesar 61.682 manusia. Estrogen dikaitkan dengan induksi dan pertumbuhan kanker payudara. Mekanisme yang tepat untuk estrogen menstimulasi proliferasi sel kanker payudara masih belum diketahui, tetapi kemungkinan besar melibatkan genotoksitas estrogen dan juga induksi gen yang mengatur produksi faktor pertumbuhan, mempromosikan distroma dan sel epitel payudara serta merangsang poliferasi. Estrogen sebagai hormon endokrin, berdifusi ke dalam jaringan payudara dan beredar secara sistemik dengan berinteraksi dengan reseptor steroid, khususnya reseptor estrogen alfa dan reseptor estrogen beta (REα dan REβ) (Berry, 2008).

1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2

Genistein merupakan salah satu fitoestrogen yang dapat berinteraksi dengan reseptor estrogen untuk menghasilkan efek estrogenik lemah atau antiestrogenik. Struktur kimia yang khas dari fitoestrogen adalah adanya cincin fenolik adalah prasyarat untuk mengikat reseptor estrogen. Secara in vitro genistein telah diketahui memiliki aktivitas untuk menghambat REα pada sel kanker payudara (Hsieh, 1998). Uji in silico mengenai aktivitas REα didasarkan pada metode Penapisan Virtual Berbasis Struktur (PVBS). PVBS berdasarkan struktur tiga dimensi (3D) target makromolekul diterapkan secara luas untuk mengidentifikasi kemungkinan untuk mengikat target. Prinsip dari penapisan ini membutuhkan struktur dari molekul target dan senyawa uji. Setiap senyawa uji ditambatkan secara virtual pada molekul target melalui perangkat lunak penambatan yang memodelkan ligan dengan target secara komputasi untuk mendapatkan sifat fisika kimia yang optimal (Wadood, 2013). Dalam penelitian ini, pose genistein dalam kantung ikatan REα diseleksi menggunakan protokol penambatan virtual oleh Setiawati, Riswanto, Yuliani and Istyastono (2014) dan protokol post docking analysis oleh Istyastono (2015). Penelitian ini digunakan untuk memberikan tambahan informasi mengenai genistein sebagai ligan pada REα dengan protokol yang digunakan. 1. Permasalahan Apakah genistein bertindak sebagai ligan pada REα secara in silico menurut protokol penambatan yang dikembangkan oleh Setiawati et al. (2014) dan post docking analysis yang dikembangkan oleh Istyastono (2015)?


2. Keaslian penelitian Adapun jurnal terkait antara lain “Retrospective Validation of a StructureBased Virtual Screening Protocol To Identify Ligands For Estrogen Receptor Alpha and Its Application To Identify The Alpha-Mangostin Binding Pose” oleh Setiawati, Riswanto, Yuliani, and Istyastono pada tahun 2014 dan “Employing Recursive Partition and Regression Tree Method To Increase The Quality of Structure-Based Virtual Screening In The Estrogen Receptor Alpha Ligands Identification” oleh Istyastono pada tahun 2015. Sejauh pengetahuan peneliti, penelitian mengenai uji in silico senyawa genistein sebagai ligan reseptor estrogen alfa dengan protokol Setiawati, et al. (2014) dan post docking analysis oleh Istyastono (2015) belum pernah dilakukan. 3. Manfaat Penelitian a. Manfaat teoretis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan informasi mengenai kemampuan genistein sebagai ligan pada REα dan mengetahui pose genistein dalam kantung ikatan REα. b. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat mengaplikasikan protokol penambatan virtual untuk penemuan obat baru. c. Manfaat metodologis Penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai validasi eksternal protokol penambatan virtual oleh Setiawati et al. (2014) dan protokol post docking analysis menurut Istyastono (2015).


B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan Umum Tujuan umum penelitian ini adalah mengetahui kemampuan potensi senyawa genistein sebagai senyawa antikanker secara in silico. 2. Tujuan Khusus a. Mengetahui dan menguji kemampuan protokol penambatan virtual in silico yang telah dikembangkan oleh Setiawati et al (2014) dan protokol post docking analysis oleh Istyastono (2015) dalam mengenali genistein sebagai ligan pada REα. b. Mengetahui pada tingkat molekuler pose genistein dalam kantung ikatan REα.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Kanker Payudara Kanker atau neoplasma merupakan suatu penyakit akibat adanya pertumbuhan yang abnormal dari sel-sel jaringan tubuh yang mengakibatkan invasi ke jaringan-jaringan normal. Kanker dapat menyebar pada bagian tertentu seperti payudara (Brunce, 2008). Payudara terdiri dari jaringan duktural, fibrosa yang mengikat lobus-lobus, dan jaringan lemak di dalam dan di antara lobus-lobus. Jaringan payudara 85% terdiri dari lemak. Sedikit di bawah pusat payudara dewasa terdapat puting (papila mamaria), tonjolan yang berpigmen dikelilingi oleh areola (Santi, 2015). Kanker payudara (Carcinoma mammae) merupakan salah satu jenis kanker yang mempunyai prevalensi yang cukup tinggi (Siswono, 2003). Diperkirakan pada tahun 2012 terdapat 1,7 juta wanita didiagnosa menderita kanker payudara (WCRF, 2015). Menurut Pusat Data dan Informasi Kementerian Kesehatan Republik Indonesia pada tahun 2013 kejadian kanker payudara di Indonesia mencapai sebesar 61.682 manusia. Kanker payudara muncul sebagai akibat sel-sel yang abnormal terbentuk pada payudara dengan kecepatan tidak terkontrol dan tidak beraturan. Sel-sel tersebut merupakan hasil mutasi gen dengan perubahan-perubahan bentuk, ukuran, maupun fungsinya (Santi, 2015).

5


B. Reseptor Estrogen Estrogen memiliki peranan penting dalam perkembangan, diferensiasi dan fungsi dari sistem reproduksi (Berry, 2008). Estrogen akan masuk ke dalam sel, tetapi hanya sel yang mengandung reseptor estrogen yang akan merespon. Di dalam tubuh terdapat dua reseptor estrogen yang dikenal, yaitu reseptor estrogen alfa (REα) dan reseptor estrogen beta (REβ) (Beshay, 2013). Jika suatu reseptor estrogen berikatan dengan estrogen, maka akan terjadi perubahan konformasi reseptor yang memungkinkan terjadinya ikatan dengan koaktivator dan mengaktifkan faktor transkripsi. Aktivasi transkripsi gen akan mengarahkan sintesis protein tertentu yang kemudian mempengaruhi berbagai fungsi sel tergantung macam dan targetnya (Putra, 2008). Estrogen berikatan dengan reseptor estrogen (RE) membentuk kompleks aktif dan mempengaruhi transkripsi gen yang mengatur proliferasi sel (Gibbs, 2000). Salah satu titik tangkap pengobatan kanker khususnya kanker payudara adalah dengan menghambat aktivitas estrogen pada reseptor estrogen alfa (REα). Pada kasus kanker payudara, REα berikatan dengan estrogen dan berpoliferasi secara abnormal (Putra, 2008). REα memiliki tiga tempat ikatan spesifik, yaitu terhadap ligan yang disebut ligand binding domain (AF-2), terhadap growth factor (AF-1), dan terhadap DNA (DNA-binding domain). Ligan yang mengikat reseptor estrogen dan berkompetisi dengan estrogen disebut Selective Estrogen Receptor Modulators (SERMs). Senyawa SERMs dapat bertindak sebagai antagonis maupun agonis tergantung pada letak reseptor pada jaringan target. Hal

ini


disebabkan karena pada jaringan yang berbeda, REα memiliki konformasi yang berbeda. (Putra, 2008). REα merupakan protein dengan berat 66kDa dengan asamasam amino pada kantung ikatannya antara lain MET 343, LEU 346, LEU 349, ALA 350, GLU 353, TRP 383, LEU 384, LEU 387, MET 388, LEU 391, ARG 394, PHE 404, MET 421, ILE 424, PHE 425, LEU 428, HIS 524, LEU 525, dan GLY 529 (Mustarichie, 2014). Gambar 1 di bawah ini menunjukkan contoh dari beberapa ligan untuk reseptor estrogen.

Gambar 1. Contoh ligan untuk reseptor estrogen (Berry, 2008) C. Genistein Fitoestrogen merupakan suatu senyawa yang bersifat estrogenik yang berasal dari tumbuhan. Fitoestrogen dapat digolongkan menjadi isoflavonoid dan


lignan. Isoflavonoid dibagi menjadi tiga kelompok yaitu isoflavon, isoflavan, dan coumestan. Genistein dan daidzein merupakan contoh isoflavon (Whitten dan Pattisaul, 2001). Gambar 2 di bawah ini menunjukkan kalsifikasi pada fitoestrogen dan Gambar 3 menunjukkan bahwa genistein terdapat dalam golongan isoflavon.

Gambar 2. Klasifikasi utama fitoestrogen (Barlow, 2007)

Gambar 3. Contoh dari senyawa yang masuk golongan isoflavon (Barlow, 2007) Genistein adalah fitoestrogen yang berasal dari

prekursor

tertentu, seperti biji kedelai dan kacang-kacangan lainnya (Hsieh,

tanaman 1998).

Genistein merupakan golongan fitoestrogen bekerja sebagai SERMs, sehingga memiliki efek estrogenik dan antiestrogenik. Genistein telah terbukti

dapat


menghambat proliferasi sel pada kanker payudara secara in vitro di dosis > 10µM dan menstimulasi proliferasi sel pada dosis < 10µM (Khairiah, 2014). Menurut penelitian Khairiah (2014), genistein bersifat antagonis dan menurunkan efek estrogenik pada kultur sel stroma dan kelenjar endometrium yang tinggi tingkat estrogennya. Hasil dari penelitiannya menunjukkan bahwa genistein mampu menurunkan poliferasi sel stroma pada payudara didosis 50µM dengan waktu inkubasi 24 jam. Menurut penelitian in vitro dengan suspensi MCF-7 (2000 sel/ 100μL) yang dilakukan oleh Matsuda et al (2001), IC50 untuk genistein adalah 1,3 µM dan Ki untuk genistein adalah 0,37µM. D. Uji In Silico Uji in silico adalah suatu istilah untuk percobaan atau uji yang dilakukan dengan metode simulasi komputer. Uji in silico telah menjadi metode yang digunakan untuk mengawali penemuan senyawa obat baru dan untuk meningkatkan efisiensi dalam optimasi aktivitas senyawa induk. Kegunaan uji in silico adalah memprediksi, memberi hipotesis, memberi penemuan baru atau kemajuan baru dalam pengobatan dan terapi (Hardjono, 2013). Salah satu uji in silico dilakukan dengan melakukan docking molekul kandidat senyawa obat dengan reseptor yang dipilih. Docking adalah suatu upaya untuk menselaraskan antara ligan yang merupakan molekul kecil ke dalam reseptor yang merupakan molekul protein yang besar, dengan memperhatikan sifat keduanya (Jensen, 2007).


E. Penapisan Virtual Berbasis Struktur (PVBS) Penapisan Virtual Berbasis Struktur (PVBS) adalah penapisan virtual yang mengacu pada evaluasi sifat-sifat senyawa secara in silico seperti aktivitas dari beberapa penyusunan molekul yang berbeda. Penapisan virtual berdasarkan struktur 3D target makromolekul diterapkan secara luas untuk mengidentifikasi kemungkinan untuk mengikat target berupa ligan. Prinsip dari penapisan ini membutuhkan struktur dari molekul target dan senyawa uji. Setiap senyawa uji ditambatkan secara virtual pada molekul target melalui perangkat lunak penambatan yang memodelkan ligan dengan target secara komputasi untuk mendapatkan sifat fisika kimia yang optimal (Wadood, 2013). PVBS yang digunakan dalam penelitian ini adalah protokol penambatan yang dikembangkan dan telah divalidasi oleh Setiawati et al. (2014). Protokol penambatan ini menggunakan Structure Protonation and Recognition System (SPORES) (Brink dan Exner, 2009) yang berfungsi untuk mempersiapkan senyawa yang akan ditambatkan di Protein-Ligand ANT System versi 1.2 (PLANTS1.2) (Korb et al., 2006), PLANTS1.2 (Korb et al., 2006) untuk menambatkan senyawa pada kantung ikatan REα dan Python-based ProteinLigand Interaction Fingerprinting (PyPLIF) (Radifar et al., 2013) untuk mengidentifikasi Protein-Ligan Interaction Fingerprint (PLIF). Protokol Setiawati et al. (2014) divalidasi dengan menggunakan Directory of Useful Decoy Enhanced (DUD-E) (Mysinger, Carchia, Irwin, Shoicher, 2012). DUD-E merupakan kumpulan dari 102 data berisi target obat dalam bentuk molekuler. Hasil dari validasi protokol penambatan ini berupa skor ChemPLP


yang berfungsi untuk membantu mengevaluasi kecocokan antara reseptor dan ligan. Protokol post docking analysis yang digunakan adalah protokol yang dikembangkan oleh Istyastono (2015) dengan metode Recursive Partition and Regression Tree (RPART). Analisis statistik digunakan aplikasi R 3.0.2 (R Development Core Team, 2015). Skor ChemPLP yang merupakan hasil pada PLANTS1.2 memberi skor menurut faktor ikatan dan interaksi akseptor metal antara ligan dengan protein (Korb, Stutzle dan Exner, 2007). PyPLIF merupakan program Interaction Fingerprinting (IFP) yang bergantung pada Open Babel. Pada protokol ini PyPLIF berfungsi sebagai IFP dengan cara merubah interaksi molekul antara ligan dan protein menjadi data bit (bitstring) menurut pilihan residu dan jenis interaksi (Radifar, Yuniarti dan Istyastono, 2013). Open Babel merupakan sebuah perpustakaan kimia untuk memberikan alat IFP gratis yang dapat digunakan dan dimodifikasi sesuai kebutuhan. Hasil yang didapat berupa bitstring dan digunakan untuk post docking analysis dengan protokol Istyastono (2015). Metode RPART pada protokol post docking analysis Istyastono (2015) menggunakan skor ChemPLP dan PLIF bitstring hasil dari penambatan yang dilakukan

untuk

membuat

sebuah

decision

tree,

sehingga

membantu

mengidentifikasi aktifitas dalam ikatan protein dengan ligan. Decision tree ini berfungsi untuk menentukan keaktifan suatu senyawa sebagai ligan pada REα, sehingga dapat diperoleh hasil berupa decoy atau ligan senyawa yang diujikan.


Gambar 4. Decision tree yang dikembangkan oleh Istyastono (2015) Berikut ini disertakan tabel yang menjelaskan PLIF bitstring yang penting menurut decision tree di atas. Tabel I. PLIF bitstring penting dalam decision tree (Istyastono, 2015) Bitstring Nomor Residu Jenis interaksi 320 GLY 420 Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) 242 ARG 394 Ikatan hidrogen (protein sebagai donor) 117 GLU 353 Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) 411 GLY 521 Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) 473 CYS 530 Ikatan hidrogen (protein sebagai donor) 105 ASP 351 Interaksi elektrostatik ( protein sebagai anion) 201 LEU 387 Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) 470 CYS 530 Interaksi non-polar 170 TRP 383 Aromatik face-to-face 171 TRP 383 Aromatik edge-to-edge 323 MET 421 Interaksi non polar


F. Landasan Teori Kanker payudara dapat terjadi akibat adanya perkembangan sel-sel secara abnormal pada payudara. Hal ini dapat disebabkan adanya mutasi gen, sehingga berdampak pada perubahan bentuk dan ukuran. Estrogen berperan penting dalam perkembangan sistem reproduksi, salah satunya adalah payudara. Estrogen dikaitkan juga dengan induksi dan pertumbuhan kanker payudara. REα adalah salah satu dari reseptor yang terdapat pada payudara dan dapat berikatan dengan estrogen, sehingga estrogen dapat berdifusi kedalam jaringan payudara. Genistein yang merupakan senyawa golongan isoflavon telah terbukti secara in vitro dan in vivo berfungsi sebagai antikanker. Struktur genistein juga menunjukkan adanya cincin fenolik yang merupakan syarat untuk berikatan dengan REα. Penetuan pose yang berupa skor ChemPLP dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak PLANTS1.2 dan dengan protokol yang dibuat oleh Setiawati et al (2014) dilakukan penambatan molekuler dan dipilih dari skor terbaik (terendah) serta PLIF bitstring yang akan digunakan dalam penentuan decoy atau ligan dari senyawa uji (genistein) menggunakan decision tree pada post docking analysis yang dikembangkan oleh Istyastono (2015). G. Hipotesis Genistein bertindak sebagai ligan pada REα secara in silico menurut protokol penambatan yang dikembangkan oleh Setiawati et al (2014) dan post docking analysis yang dikembangkan oleh Istyastono (2015).


BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian dengan judul “Uji In Silico Senyawa Genistein sebagai Ligan pada Reseptor Estrogen Alfa” termasuk penelitian eksperimental berbantukan komputer. B. Variabel Penelitian 1. Variabel Penelitian a. Variabel utama 1) Variabel bebas

: Pose senyawa genistein dalam kantung ikatan REα

2) Variabel tergantung

: Skor ChemPLP dan PLIF bitstring

b. Variabel pengacau 1)

Variabel pengacau terkendali

: spesifikasi perangkat keras dan versi

perangkat

lunak

yang

digunakan peneliti. 2) Variabel pengacau tidak terkendali : ketidakstabilan yang disebabkan oleh bentuk cembung permukaan partikel (Lyapunov instability) (Posch, Hoover, 2006).

14


C. Definisi Operasional 1.

Ligan

: Ligan aktif.

2.

PLIF bitstring

: luaran dari post docking analysis menggunakan PyPLIF.

3. Pose genistein

: Pose senyawa di dalam kantung ikatan REα yang dipilih secara obyektif kuantitatif berdasarkan nilai ChemPLP dan PLIF bitsring.

4.

Protokol penelitian

: Protokol penambatan virtual yang dikembangkan dan divalidasi oleh Setiawati et al. (2014).

5.

Protokol post docking analysis

: Protokol analisis yang mengacu pada protokol post docking oleh Istyastono (2015).

6.

PVBS

: Penapisan Virtual Berbasis Struktur

7.

Senyawa Marginal

: Senyawa yang berada pada perbatasan sebagai ligan aktif atau tidak aktif.

8.

Senyawa yang diuji

: Senyawa genistein dalam bentuk berkas digital.

9.

Skor ChemPLP

: Skor yang dihasilkan oleh perangkat lunak PLANTS1.2 (Korb et al., 2006) yang menunjukkan ikatan antara senyawa yang diuji dan REα.


D. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan yang digunakan dalam penelitian a. Protokol penelitian. b. Protokol post docking analysis. c. Struktur tiga dimensi genistein (didapat dari zinc.docking.org, kode: ZINC188253300). d. Perangkat lunak penambatan PLANTS1.2 (Korb et al., 2006) untuk melakukan simulasi penambatan molekuler sehingga didapat skor ChemPLP, SPORES (Brink dan Exner, 2010) untuk memastikan format .mol2 dapat digunakan oleh perangkat lunak PLANTS1.2, PyPLIF (Radifar et al., 2013) untuk mengidentifikasi protein-ligan interaction fingerprint, PyMol 1.2r1 (Lill dan Danielson, 2011) untuk menghasilkan gambar molekuler, serta R versi 3.0.2 (R Development Core Team, 2013) untuk analisis statistik. 2. Alat atau Instrumen Penelitian Server Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan nomor alamat IP 103.247.10.66 (pharcomp.usd), laptop HP 430 dengan spesifikasi: prosesor Intel Core i3-2330 2,2 Ghz, RAM 2GB 1067 MHz DDR3, dengan sistem operasi ubuntu 12.04 versi kernel 3.5.0-23-genetic. E. Tata Cara Penelitian 1. Preparasi genistein Struktur

genistein

dalam

format

.mol2

diunduh

dari

ZINC

(zinc.docking.org) dengan kode ZINC188253300. Struktur .mol2 dipreparasi


menggunakan aplikasi SPORES agar dapat ditambatkan pada penambatan molekuler menggunakan PLANTS1.2. 2. Penambatan genistein Luaran dari SPORES ditambatkan menggunakan PLANTS1.2 dengan konfigurasi mengacu pada Setiawati et al. (2014) dan dianalisis IFP menggunakan PyPLIF. Setiap kali penambatan (1 run) dilakukan tiga kali iterasi penambatan molekuler, masing-masing menghasilkan 50 pose. Diperoleh 3 x 50 pose lalu diambil satu pose yang terbaik dengan ChemPLP. Dilakukan 1000 kali run hingga didapat 1000 pose terbaik beserta data PLIF bitstring. F. Tata Cara Analisis Hasil Analisis hasil dilakukan dengan menguji 1000 pose hasil penambatan menggunakan aplikasi statistik R versi 3.0.2 dengan protokol post docking analysis yang dikembangkan Istyastono (2015). Hasil penambatan berupa skor ChemPLP dan PLIF bitstring yang dimasukkan pada decision tree melalui metode RPART dengan aplikasi statistik R versi 3.0.2 (R Development Core Team, 2015). Data hasil analisis dari decision tree akan memperlihatkan senyawa genistein aktif sebagai ligan yang ditunjukkan dengan angka 1 atau tidak aktif dalam ligan yang ditunjukkan dengan angka 0. Pose

dari

senyawa

genistein

dilihat

interaksinya

dengan

REα

menggunakan PyMol. Visualisasi pose dengan PyMol1.2r1 dilakukan dengan memilih pose dengan kriteria:


1. Pose dengan bitstring 320 aktif dan skor ChemPLP terkecil. 2. Pose dengan skor ChemPLP terkecil. 3. Jika skor ChemPLP poin 2 lebih rendah dari poin 1, maka kedua pose divisualisasikan.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian mengenai uji in silico genistein terhadap REα bertujuan untuk mengetahui kemampuan senyawa genistein sebagai ligan pada REα melalui protokol penambatan virtual yang dikembangkan dan divalidasi oleh Setiawati et al. (2014) dan protokol post docking analysis oleh Istyastono (2015). Tujuan lainnya adalah untuk mengetahui dan menguji kemampuan protokol penambatan virtual in silico yang telah dikembangkan oleh Setiawati et al (2014) dan protokol post docking analysis oleh Istyastono (2015) dalam mengenali genistein sebagai ligan pada REα, serta untuk mengetahui tingkat molekuler pose genistein dalam kantung ikatan REα. Hasil luaran dari PyPLIF menunjukkan pose aktif pada bitstring 320 (GLY 420), 242 (ARG394), 117 (GLU 353), 411 (GLY 521), 473 (CYS 530), 105 (ASP 351), 201 (LEU 387), 470 (CYS 530), 170 (TRP 383), dan 323 (MET 421). Pose inaktif ditunjukkan oleh bitstring 171 (TRP 383). Tabel II. Data bitstring pose yang divisualisasikan Nomor Bitstring Aktif/Inaktif 320 Aktif 242 Aktif 117 Aktif 411 Aktif 473 Aktif 105 Aktif 201 Aktif 470 Aktif 170 Aktif 171 Tidak Aktif 323 Aktif

19


Untuk visualisasi pose senyawa genistein, digunakan pose replikasi ke950 yang memiliki skor ChemPLP –84,9031 yang merupakan skor ChemPLP terendah. Hasil visualisasi menunjukkan adanya interaksi antara senyawa genistein dengan tiga residu yang berperan penting dalam interaksi ligan-protein, yaitu ARG 394 dengan bitstring ke-242 mempunyai jarak 1.8 A dan GLU 353 dengan bitstring ke-117 mempunyai jarak 1.8 A serta GLY 420 dengan bitstring ke-320 mempunyai jarak 2.1 A. Ikatan yang terbentuk dengan ARG 394 adalah ikatan hidrogen dengan protein sebagai donor, dan ikatan dengan GLU 353 dan GLY 420 adalah ikatan hidrogen dengan protein sebagai akseptor. Senyawa genistein yang divisualisasikan (Gambar 5) terlihat memiliki ikatan dengan residu HIS 520 yang berjarak 2.6 A. Jarak antar ligan dan reseptor untuk dikatakan punya ikatan yang kuat adalah 4.5 A (Clark, 2006). Pada jarak HIS 520 dan ligan (dalam hal ini genistein) dapat dikatakan sudah cukup memiliki ikatan yang kuat. Ikatan yang terjadi antar HIS 520 dengan genistein adalah ikatan hidrogen. Pada reseptor estrogen alfa terdapat beberapa residu penting berdasarkan PLIF bitstring pada decision tree, dan apabila mengacu pada post docking analysis oleh Istyastono (2015), PLIF bitstring dijadikan parameter dalam analisis RPART karena meningkatkan kualitas dari penapisan virtual berbasis struktur. Hal ini dapat terjadi karena hasil dari analisis RPART adalah decision tree seperti terlihat pada Gambar 4 dan dengan decision tree terdapat perbedaan signifikan yang lebih baik untuk nilai akurasinya dibandingkan dengan protokol yang diacu Istyastono (2015), yaitu 0,989. Residu-residu

yang sesuai dengan PLIF bitstring


membantu agar ligan yang dianalisis menggunakan metode RPART menghasilkan data yang lebih akurat untuk identifikasi terhadap potensi ligan terhadap REα. Selain hasil dari visualisasi yang telah disebutkan diatas, cincin fenolik pada genistein diasumsikan membantu menguatkan posisi genistein dalam kantung ikatan REα. Hal ini diperkuat karena adanya residu Triptofan (TRP) dalam daftar residu penting yang sesuai dengan PLIF bitstring pada decision tree, yang mempunyai jenis interaksi aromatis yang kemungkinan besar akan berinteraksi dengan cincin fenolik yang ada pada senyawa genistein.

Gambar 5. Pose visualisasi genistein pada kantung ikatan REα Interaksi polar ditunjukkan dengan garis putus-putus berwarna hitam Berdasarkan decision tree genistein merupakan ligan dikarenakan memenuhi syarat yang ada pada decision tree, yaitu nilai pada bitstring 320 adalah 1 (satu) yang bisa diartikan on dan skor ChemPLP yang lebih kecil dari -


84,82, yaitu -84,9031. Hal ini sesuai dengan hipotesis yang mengatakan senyawa genistein secara in silico dapat bertindak sebagai ligan bagi REα dengan protokol yang digunakan. Alur dari decision tree yang diperoleh berdasarkan data genistein terlihat pada Gambar 6.

No No

Gambar 6. Alur decision tree yang diperoleh berdasarkan data genistein Panah merah menunjukkan alur pembuatan keputusan apakah senyawa merupakan ligan atau decoy. Pose yang digunakan adalah pose yang divisualisasikan. Apabila jawaban dari pertanyan di decision tree “ya” mengikuti garis skema ke kiri, dan sebaliknya


Tabel dibawah ini akan memperlihatkan skor pada PLIF bitstring penting serta presentase skor yang memiliki nilai 1(on) ataupun 0 (off). Terlihat pada tabel bahwa PLIF bitstring penting yang memiliki 100% nilai 1 ada 4, yaitu 320, 242, 117, dan 323, sedangkan yang memiliki nilai 0 100% ada 7,

yaitu 411, 473, 105,

201, 470, 170 dan 171. Tabel III. Skor pada PLIF bitstring penting 320

242

117

411

473

105

201

470

170

171

323

1

100%

100%

100%

0%

0%

0%

0%

0%

0%

0%

100%

0

0%

0%

0%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

0%

Senyawa dapat dikatakan sebagai ligan aktif apabila memiliki afinitas (IC50, EC50, Ki, Kd, dan variasi lognya) pada konsentrasi di bawah 1 µM. Senyawa dianggap decoy apabila memiliki afinitas 30µM ke atas. Selain itu terdapat senyawa marginal, yang memiliki afinitas antara 1-30µM (Mysinger, et al., 2012). Senyawa genistein memiliki nilai IC50 1,3 µM dan nilai Ki 0,37µM. Berdasarkan nilai IC50, genistein termasuk senyawa marginal, sedangkan berdasarkan nilai Ki, genistein termasuk ligan aktif. Menurut protokol yang sudah dilakukan, genistein termasuk ligan. Hal ini menunjukkan protokol dapat mendeteksi genistein sebagai ligan pada kantung ikatan REα.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan Genistein merupakan ligan Reseptor Estrogen alfa (REα) menurut protokol Setiawati et al. (2014) dan post docking analysis oleh Istyastono (2015).

B. Saran Genistein dapat dikembangkan dan diformulasikan menjadi obat baru untuk menghambat pertumbuhan kanker payudara terutama pada REα.

24


DAFTAR PUSTAKA

Barlow, J, Johnson, J.A., Scofield, L., 2007, Fact Sheet on the Phytoestrogen Genistein,BCERC COTC Fact Sheet, Maryland, pp. 47-48. Berry, N. B., 2008, Regulation of Estrogen Receptor-alpha Ubiquitination and Proteasomemediated Receptor Degradation, ProQuest, Champaign, pp.35. Brink, Tim ten, Exner, Thomas E., 2009, Influence of Protonation, Tautomeric, and Tereoisomeric States on Protein-Ligand Docking Results, J. Chem. Inf. Model,49, 1535-1546. Brunce, C. A., Elisabeth, C., 2008. Development and Spread of Cancer, Merck Manual, United States. Clark, A. M., 2006, Ligand Interaction Diagrams, Chemical Computing Group Inc., Canada. Dixon, R., A., Ferreira, D., 2002, Phytochemistry, Elsevier, 60, 205. Hardjono S., 2013, Sintesis dan Uji Aktivitas Antikanker Senyawa 1-(2Klorobenzoiloksi)urea da 1-(4-klorobenzoiloksi)urea, Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, 2 (1), 1. Hsiesh, C., Santell, R.C., Haslam, S.Z., Helferich, W.G., 1998. Esterogic Effects of Genisteinon the Growth of Estrogen Receptor-positive Human Breast Cancer (MCF-7) Cells inVitro and in Vivo, Cacer Research, 58(1), 1. Istyastono, E. P., 2015, Employing Recursive Partition and Regression Tree Method to Increase The Quality of Structure-Based Virtual Screening in The Estrogen Receptor Alpha Ligands Identification, Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 8, 208. Jensen F., 2007, Introduction to Computational Chemistry, 2nd Ed, Odense, Denmark : 415-416. Korb, O., Stützle, T., Exner, T. E., 2007, An Ant Colony Optimization Approach to Flexible Protein-Ligand Docking, Swarm Intell, 1, 115-134. Lil, Markus A, Danielson, Matthew L., 2011, Computer-Aided Drug Design Platform Using PyMOL, J Comput Aided Mol Des, 25, 13-19. Matsuda, H., Shimoda, H., Morikawa, T., and Yoshikawa M., 2001, Phytoestrogens from the Roots of Polygonum cuspidatum (Polygonaceae): Structure-Requirement of Hydroxyantraquinones for Estrogenic Activity, Bioorgan & Medicinal Chemistry Letters 11, 1842. Marcou, G., Rognan, D., 2006, Optimizing Fragment and Scaffold Docking by Use of Molecular Interaction Fingerprints, Journal Chemistry, p.195. Mustarichie, R., Levitas, J., Arpina, J., 2014, In silico study of curcumol, curcumenol, isocurcumenol, and β-sitosterol as potential inhibitors of estrogen receptor alpha of breast cancer, Med J Indones 23 (1), 16. Mysinger, Michael M., Carchia, Michael, Irwin, John J., Shoichet, Brian K., 2012, Directory of Useful Decoys, Enhanced (DUD-E): Better Ligands and Decoys for Better Benchmarking, J. Med. Chen., 55, 6582-6594.


Pawiroharsono, S., 2001, Prospek dan Manfaat Isoflavin untuk Kesehatan. http://www.tempo.co.id/medika/arsip/042001/pus-2.htm, 16 Januari 2016. Posch, H. A., Hoover, W. G., 2006, Lyapunov Instability of Classical Many-Body Systems, Journal of Physics: Conference Series, 31, 9-17. Pusat Data dan Informasi Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 2013, Info Datin : Stop Kanker. Kementerian Kesehatan RI, Jakarta. hal. 4. Putra, I. G. N. S., Nurcahya, B.M., Rachmattika, B., Wynanda, Sudarmanto, B. S. A., Meiyanto, E., 2008, Kurkumin dan Analognya sebagai Selective Estrogen Receptor Modulators (SERMS): Kajian Berdasarkan Metode Docking pada Reseptor Estrogen Alfa, Pharmacon, 9 (1), 7-9. Radifar, Muhammad, Yuniarti, Nunung, Enade, Istyastono, 2013, PyPLIF: Python-based Protein-Ligand Interaction Fingerprinting, Bioinformation, 9(6), 325-328. Ramirez, M. C., 2007, Regulation of Estrogen Receptor Alpha Expression in Breast CancerCells by Sulforaphane, ProQuest, Champaign, pp. 1-2. R Development Core Team, R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Foundation for Statistival Computing, Vienna, Austria, http://www.R-project.org/, 2015. Santi, D. A., 2015, Mencegah dan Mengobati Kanker Payudara, Deuyis, Yogyakarta, hal.3,4. Setiawati, A., Riswanto, F. D. O., Yuliani, S. H., Istyastono, E. P., 2014, Retrospective Validation of a Structure-Based Virtual Screening Protocol to Identify Ligands forEstrogen Receptor Alpha and Its Application to Identify the Alpha-Mangostin BindingPose, Indo. J. Chem, 14 (2), 104106. Siswono. (2003), Kanker Payudara Bisa Dideteksi Sendiri, http://www.gizi.net/cgi-bin/berita/fullnew.cgi?newsid1010552074,29807, diaksestanggal 09 Mei 2015. Sperandio, O., Villoutreix, B.O., Miteva, M.A., 2011, In Silico Lead Discovery, BenthamScience Publishers Ltd., France, pp. 20-21. Wadood, A., Ahmed, N., Shah, L., Ahmad, A., Hassan, H., Shams, S., 2013, In Silico drug design: An approach whish revolutionarised the drug discovery process, OA Drug Design & Delivery, 1(1), 2. Whitten, Patricia, L., dan Pattisaul, H. B., 2001, Cross-species dan interassay Comparison of Phytoestrogen Action : Enviromental Helath Prespectives Supplements Volume 109, Department Anthropology and Center for Behavioural Neuroscience Emory University, Georgia, USA. WCRF, 2015, Breast Cancer Statistics, WCRF International, London.


BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi dengan judul “ Uji In Silico Senyawa Genistein sebagai Ligan pada Reseptor Estrogen Alfa” memiliki nama lengkap Aprilini Khaterin Johan. Penulis lahir di Belitung pada tanggal 21 April 1995 dari pasangan Johan dan Diana sebagai anak pertama dari dua bersaudara. Pendidikan formal yang ditempuh penulis dimulai dari TK Regina Pacis Tanjungpandan Belitung (1998-2000), SD Regina Pacis Tanjungpandan Belitung (2000-2006), SMP Regina Pacis Tanjungpandan Belitung (2006-2009), dan melanjutkan pendidikan menengah atas di SMA Negeri 1 Tanjungpandan Belitung (2009-2012). Pada tahun 2012 penulis melanjutkan pendidikan ke jenjang Perguruan Tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis pernah menjadi anggota divisi acara Tiga Hari Temu Akrab Farmasi (2013), koordinator divisi acara Tiga Hari Temu Akrab Farmasi (2014), Gubernur BEMF Farmasi periode 2015-2016. Penulis juga berperan aktif menjadi asisten praktikum Analisis Farmasi dan Validasi Metode Analisis (2014), dan Kimia Analisis (2015).

UJI IN SILICO SENYAWA GENISTEIN SEBAGAI LIGAN PADA RESEPTOR ESTROGEN ALFA SKRIPSI. Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Recommend Documents