UJI IN SILICO SENYAWA PRIMAQUINE SEBAGAI LIGAN PADA RESEPTOR ESTROGEN ALFA SKRIPSI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

UJI IN SILICO SENYAWA PRIMAQUINE SEBAGAI LIGAN PADA RESEPTOR ESTROGEN ALFA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Lucius Evodius Bardata NIM: 138114097

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2017


HALAMAN JUDUL


SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Lucius Evodius Bardata NIM: 138114097

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2017 i


ii


iii


HALAMAN PERSEMBAHAN

Life is and Will Never Remain an Equation Incapable of Solution, But it Contains Certain Known Factors -Nikola Tesla

Saya persembahkan Skripsi ini untuk Tuhan Yesus Kristus dan Bunda Maria serta St. Yudas Tadeus dan semua Orang Kudus yang selalu mendengar setiap doa saya, dalam suka dan duka Bapa dan Mama yang selalu menyebut nama saya dalam setiap doanya Dan

Almamater tercinta, Universitas Sanata Dharma

iv


v


vi


PRAKATA

Puji syukur dan terima kasih kepada Tuhan Yang Maha Esa untuk segala berkat serta rahmat penyertaan sehingga penulis dapat menyelesaikan Skripsi yang berjudul “UJI IN SILICO SENYAWA PRIMAQUINE SEBAGAI LIGAN PADA RESEPTOR ESTROGEN ALFA” sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Penyelesaian skripsi ini tentunya tidak lepas dari bantuan berbagai pihak, oleh karena itu penulis hendak mengucapkan terima kasih kepada: 1. Bapak Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing atas segala arahan, masukan, kesabaran serta dukungan kepada penulis dari awal hingga proses penyelesaian skripsi ini. 2. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan banyak saran dan arahan kepada penulis dalam proses penyelesaian skripsi ini. 3. Ibu Damiana Sapta Candrasari S.Si., M.Sc. selaku dosen penguji yang telah memberikan banyak saran dan arahan kepada penulis dalam proses penyelesaian skripsi ini. 4. Bapa dan Mama, Mbah Putri, Kakak Fr. Toto, Kakak Incik, Kakak Nenik, Kakak Cecik, Kakak Jimmy, Kakak Yanto, Leony, Grace dan Natalia, untuk segala dukungan dan doa selama proses penyelesaian skripsi ini. 5. Kak Felicia atas segala bimbingan, arahan dan dukungan kepada penulis dalam proses penyelesaian skripsi ini. 6. Teman seperjuangan Fenny Marisza Sihaloho untuk segala kerjasama, bantuan dan dukungan selama proses penyelesaian skripsi ini. 7. Pater Steven Mangga SVD, Mas Ugall Treble, Kak Ernus, Kak Oswal, Kak Gusty, Kak Onoze, Fortun, Logi, Raffi, Agung, Inyo, Sara, Ucil, Rency, Lala, Hovi, Ervin, Akhiles, Indra, Donny dan Chris untuk segala dukungan selama proses penyelesaian skripsi ini.

vii


8. Teman-teman FSM C 2013, FKK B 2013 serta seluruh Thirteenity untuk semua cerita kebersamaan kita selama di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Akhir kata penulis menyadari bahwa skripsi ini masih terdapat kekurangan dan jauh dari sempurna, oleh karena itu penulis mengharapkan masukkan serta saran yang membangun dari semua pihak. Semoga skripsi ini memberikan manfaat bagi pembaca.

Penulis

viii


DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL........................................................................................ i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. ii HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN ...................................................................... iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .......................................................... v LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI........................... vi PRAKATA ....................................................................................................... vii DAFTAR ISI .................................................................................................... ix DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... x DAFTAR TABEL ............................................................................................ xi DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xii ABSTRAK ....................................................................................................... xiii ABSTRACT ..................................................................................................... xiv PENDAHULUAN ........................................................................................... 1 METODE PENELITIAN ................................................................................. 3 Bahan ........................................................................................................ 3 Instrumentasi ............................................................................................. 3 Metode ...................................................................................................... 3 Pengunduhan struktur senyawa primaquine ...................................... 3 Preparasi senyawa primaquine secara molekuler .............................. 3 Penambatan molekuler senyawa primaquine ..................................... 3 Analisis hasil ...................................................................................... 4 Visualisasi pose primaquine .............................................................. 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................ 4 KESIMPULAN ................................................................................................ 7 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 8 LAMPIRAN .................................................................................................... 10 BIOGRAFI PENULIS ..................................................................................... 14

ix


DAFTAR GAMBAR Gambar 1.

Struktur 2D Primaquine ................................................................... 2

Gambar 2.

Analisis decision tree yang divisualisasikan ................................... 6

Gambar 3.

Visualisasi pose primaquine pada reseptor estrogen alfa ................ 7

x


DAFTAR TABEL Tabel I.

Nilai persen kesesuaian primaquine pada setiap jalur decision tree ...... 5

xi


DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1.

Proposal skripsi ........................................................................... 11

Lampiran 2.

Konfigurasi protokol penambatan PLANTS 1.2 ......................... 12

Lampiran 3.

Shell script untuk analisis pasca penambatan ............................. 13

xii


ABSTRAK Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang sering terdiagnosis pada wanita dan merupakan penyebab kematian kedua dalam kasus kematian yang disebabkan oleh kanker. Perkembangan sel kanker payudara ditandai dengan tingginya ekspresi reseptor estrogen alfa. Primaquine merupakan obat antimalaria, digunakan sebagai agen eradikasi terhadap parasit Plasmodium vivax dan Plasmodium ovale. Tujuan terapi baru dari sebuah obat atau drug repurposing merupakan strategi baru dalam penemuan obat antikanker, yaitu untuk mengidentifikasi obat non-antikanker yang memiliki aktivitas antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk menguji senyawa primaquine sebagai ligan pada reseptor estrogen alfa secara in silico menurut protokol yang telah dikembangkan oleh Setiawati et al. (2014) dan metode analisis pasca penambatan oleh Istyastono (2015). Perangkat lunak penambatan yang digunakan adalah PLANTS 1.2 dan analisis hasil menggunakan shell script yang mengacu decision tree, serta visualisasi pose ikatan dibuat dengan PyMOL versi 1.8.4. Hasil analisis menunjukan senyawa primaquine inaktif sebagai ligan dari reseptor estrogen alfa. Selanjutnya dilakukan pengelompokan berdasarkan tujuh jalur pada decision tree untuk mengetahui nilai persen kesesuaian primaquine sebagai ligan reseptor estrogen alfa. Hasil pengelompokan menunjukkan persen kesesuaian terbesar adalah 80% yang memenuhi aturan jalur ke enam decision tree. Visualisasi pose primaquine menggunakan aplikasi PyMOL v1.8.4 dengan replikasi ke 739, iterasi ke 1 dan skor chemPLP ≥-118,40. Kata kunci: Reseptor estrogen alfa, drug repurposing, in silico, primaquine.

xiii


ABSTRACT Breast cancer is the most prevalent case of cancers in female and also the second highest cancer related mortality. The progress of breast cancer cells is characterized by high expression of estrogen receptor alpha. Primaquine is used as an antimalarial agent based on its ability to eradicate Plasmodium vivax and Plasmodium ovale parasite. Drug repurposing refers to a reinvestigation of existing drugs includes the anticancer drug for new therapeutic interventions. This study aims to examine in silico on primaquine as a ligand of estrogen receptor alpha according to protocols that have been developed by Setiawati et al. (2014) and post-docking analysis developed by Istyastono (2015). The software used was PLANTS 1.2 and the result was analysed using a shell script that refers to the decision tree, and visualization using PyMOL 1.8.4. The results showed that primaquine was inactive as a ligand of the estrogen receptor alpha. Furthermore, the scoring is as cluster more based on seven paths of the decision tree to determine the suitability value of primaquine as a ligand. The results showed the largest suitability value was 80% which followed the sixth path of the decision tree. Finally, the primaquine’s pose inside estrogen receptor alpha binding pocket was visualized using PyMOL 1.8.4 at replication 739, iteration 1 and ChemPLP score was ≥-118,40. Keywords: Estrogen receptor alpha, drug repurposing, in silico, primaquine.

xiv


PENDAHULUAN Kanker adalah kelompok penyakit yang ditandai dengan pertumbuhan serta penyebaran sel abnormal yang tidak terkontrol (American Cancer Society, 2016). Penyakit kanker menempati posisi kedua penyebab kematian di dunia setelah penyakit kardiovaskuler (Godjali et al., 2012). Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang sering terdiagnosis pada wanita dan merupakan penyebab kematian kedua dalam kasus kematian yang disebabkan oleh kanker (Mellatyar et al., 2016). Reseptor estrogen alfa (RE-α) berperan dalam perkembangan payudara dan aktivasi signal pro-proliferasi pada payudara normal dan payudara yang menderita kanker (Caldon, 2014). Perkembangan sel kanker payudara ditandai dengan tingginya ekspresi reseptor estrogen alfa (Hayashi et al., 2011). Dengan pendalaman yang benar mengenai penyebab kanker payudara, target obat secara molekuler telah dikembangkan dan diujikan sebagai pengobatan dan pencegahan terhadap kanker payudara (Hollander et al., 2013). Drug repurposing merupakan suatu pendekatan untuk menemukan indikasi baru dari obat yang telah ada ataupun kandidat obat dengan strategi melakukan suatu reinvestigasi terhadap senyawa obat untuk menemukan tujuan terapi baru, termasuk di dalamnya obat-obat yang bukan antikanker menjadi obat antikanker (Lee and Kim, 2016). Studi in silico sering diaplikasikan dalam desain penemuan obat berbasis struktur, diawali dengan mengetahui struktur target molekuler misalnya target makromolekuler yang disebut reseptor, kemudian mengidentifikasi ligan yang potensial terhadap struktur target molekuler tersebut (Ferreira et al., 2015). Pada tahun 2012, Anita et al. mengembangkan sebuah protokol penapisan virtual berbasis struktur untuk mengidentifikasi senyawa yang berpotensi sebagai ligan pada reseptor estrogen alfa dengan hasil nilai enrichment factor 1% (EF1%) sebesar 21,2. Nilai EF1% merupakan persentase senyawa aktif (true positive) yang diidentifikasi saat pengecoh yang teridentifikasi sebagai senyawa aktif (false positives) sejumlah 1% (Anita et al., 2012). Parameter kualitas penapisan virtual secara obyektif diukur dengan nilai EF1% yang menggambarkan kemampuan protokol pada validasi retrospektif memilah senyawa aktif dari pengecoh (Istyastono, 2013). Dikembangkan sebuah perangkat lunak PyPLIF (Pythonbased Protein-Ligand Interaction Fingerprinting) yang berguna untuk mengetahui interaksi sidik jari antara protein dengan ligan (Radifar et al., 2013). PyPLIF melaksanakan interaksi sidik jari dengan mengubah interaksi protein-ligan menjadi sekumpulan data bit berdasarkan residu yang dipilih dan jenis interaksi. Dalam pengujiannya, validasi PyPLIF 1


menggunakan input protokol penambatan yang telah dikembangkan Anita et al. (2012) dan nilai EF1% meningkat menjadi 53,84 (Radifar et al., 2013). Laporan hasil penelitian Istyastono (2013) menunjukan bahwa telah dilakukan penapisan virtual pada 7240 struktur molekul pada ZINC drug database (ZDD) dengan target virtual dan konfigurasi hasil pengembangan dan validasi Anita et al. (2012) dan Radifar et al. (2013), didapatkan 60 obat yang beredar di pasar dengan berbagai indikasi sebagai ligan estrogen reseptor alfa. Pada 12 peringkat teratas ditemukan 8 obat yang digunakan untuk terapi kanker payudara dan juga celecoxib yang telah diujikan ulang secara in silico dan dikonfirmasi secara in vitro bahwa celecoxib memiliki aktivitas sebagai ligan pada reseptor estrogen alfa dengan potensi serupa dengan tamoxifen, obat pilihan untuk kanker payudara (Istyastono et al., 2015). Hal ini secara tidak langsung merupakan validasi prospektif penggunaan protokol penapisan virtual yang dikembangkan Anita et al. (2012) dan Radifar et al. (2013).Salah satu dari ke 60 senyawa yang mempunyai indikasi sebagai ligan reseptor estrogen alfa tersebut adalah primaquine (Istyastono, 2013). Primaquine (8-aminoquinoline) merupakan obat antimalaria, digunakan sebagai agen eradikasi terhadap parasit Plasmodium vivax dan Plasmodium ovale (Fernando et al., 2011).

Gambar 1. Struktur 2D primaquine.

Telah dikembangkan dan divalidasi sebuah protokol penapisan virtual berbasis struktur (PVBS) untuk mengidentifikasi ligan dari reseptor estrogen alfa menggunakan protokol penambatan PLANTS 1.2 (Setiawati et al., 2014), serta sebuah metode analisis pasca penambatan untuk menentukan aktif tidaknya suatu ligan pada reseptor estrogen alfa (Istyastono, 2015). Penelitian ini bertujuan untuk menguji senyawa primaquine sebagai ligan pada reseptor estrogen alfa secara in silico menurut protokol yang telah dikembangkan oleh Setiawati et al. (2014) dan metode analisis pasca penambatan oleh Istyastono (2015), serta mengetahui secara atomik pose ikatan primaquine dalam kantung reseptor estrogen alfa. 2


METODE PENELITIAN Bahan Konfigurasi protokol penambatan (Lampiran 2) yang telah dikembangkan dan divalidasi oleh Setiawati et al. (2014). Struktur tiga dimensi primaquine (diunduh dari zinc.docking.org dengan kode ZINC01530862). Perangkat lunak penambatan PLANTS 1.2 (Korb et al., 2009), PyPLIF (Radifar, et al., 2013) untuk identifikasi interaksi sidik jari antara protein dan ligan, dan shell script yang mengacu decision tree untuk analisis pasca penambatan (Lampiran 3), serta PyMol 1.8.4 untuk visualisasi pose ikatan primaquine pada kantung ikatan reseptor estrogen alfa. Instrumentasi Server Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan alamat IP 103.247.10.66 dengan sistem operasi Ubuntu 12.04 LTS, laptop ASUS Intel Celeron® Dual-Core CPU N3050 @1.60 GHz, RAM 2.00 GB, 64-bit operating system, dan sistem operasi Linux Ubuntu 16.04 LTS. Metode Pengunduhan struktur senyawa primaquine Struktur primaquine diunduh dari zinc.docking.org dengan kode ZINC01530862 dan disimpan dengan format .mol2. Nama file diubah menjadi ligand.mol2. Preparasi senyawa primaquine secara molekuler Struktur primaquine yang telah diunduh dalam format .mol2, dipreparasi menggunakan aplikasi SPORES dengan modul settypes (Setiawati et al., 2014). Luaran dari preparasi ini berupa file ligand_spores.mol2 yang selanjutnya digunakan untuk ditambatkan pada target virtual menggunakan PLANTS 1.2. Penambatan molekuler senyawa primaquine Luaran dari SPORES berupa file ligand_spores.mol2 ditambatkan menggunakan aplikasi PLANTS 1.2 dengan konfigurasi protokol penambatan (Lampiran 2) yang telah dikembangkan Setiawati et al. (2014). Pada setiap satu kali penambatan (1 run), dilakukan tiga kali iterasi penambatan molekuler yang masing-masing menghasilkan 50 pose. Pada setiap iterasi diambil salah satu pose terbaik dan dilakukan analisis IFP dengan PyPLIF. Luaran dari setiap run adalah 3 pose berupa skor ChemPLP dan data bitstring PLIF yang selanjutnya diambil salah satu pose dengan nilai ChemPLP terbaik (Setiawan and Istyastono, 2015). Dilakukan seribu kali run, sehingga dapat diperoleh data seribu pose

3


terbaik untuk setiap replikasi yang dilakukan. Data seribu pose terbaik ini disimpan dengan nama all_pyplif.csv. Analisis hasil Analisis hasil dilakukan menggunakan shell script (Lampiran 3) pada Linux Ubuntu 12.04 LTS yang mengacu pada masing- masing jalur decision tree (Istyastono, 2015). Luaran hasil analisis akan menampilkan senyawa primaquine aktif sebagai ligan yang ditunjukkan dengan angka 1 atau tidak aktif sebagai ligan yang ditunjukkan dengan angka 0. Visualisasi pose primaquine Visualisasi pose primaquine pada reseptor estrogen alfa menggunakan perangkat lunak PyMOL 1.8.4. Visualisasi dilakukan dengan memilih salah satu pose replikasi sebagai perwakilan yang representatif dengan ketentuan memiliki persen kesesuaian tertinggi sebagai ligan reseptor estrogen alfa.

HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian ini bertujuan untuk menguji senyawa primaquine sebagai ligan pada reseptor estrogen alfa secara in silico menurut protokol yang telah dikembangkan dan divalidasi oleh Setiawati et al. (2014) dan metode analisis pasca penambatan (Istyastono, 2015), serta mengetahui secara atomik pose ikatan primaquine pada reseptor estrogen alfa. Pengembangan dan validasi pada protokol yang digunakan adalah dengan menambahkan tiga simulasi independen untuk setiap penambatan, hasil dari validasi protokol penambatan ini berupa skor ChemPLP yang digunakan untuk evaluasi kecocokan antara reseptor dan ligan (Setiawati et al., 2014). Sedangkan untuk analisis pasca penambatan dilakukan dengan menerapkan Recursive Partition and Regression Tree (RPART). Metode ini menentukan apakah suatu senyawa berperan sebagai ligan atau sebagai senyawa pengecoh yang didasarkan pada skor penambatan dan bitstring PLIF (Istyastono, 2015). Hasil analisis berdasarkan decision tree (Istyastono, 2015) menunjukkan bahwa dari seribu replikasi penambatan, senyawa primaquine inaktif sebagai ligan pada reseptor estrogen alfa. Senyawa primaquine tidak berikatan dengan residu-residu yang berperan penting dalam interaksi ligan-protein dalam kantung ikatan reseptor estrogen alfa sehingga senyawa primaquine tidak dapat dideteksi sebagai ligan. Selanjutnya dilakukan pengelompokan mengikuti aturan decision tree dimana terdapat tujuh jalur dengan syarat skor ChemPLP dan bitstring penting. Pengelompokan dilakukan untuk mengetahui 4


perbandingan nilai persen kesesuaian primaquine sebagai ligan reseptor estrogen alfa berdasarkan deskripsi aturan setiap jalur decision tree yang selanjutnya digunakan sebagai visualisasi pose primaquine pada reseptor estrogen alfa. Nilai persen kesesuaian didapatkan berdasarkan banyaknya deskripsi aturan yang terpenuhi dibagi jumlah seluruh deskripsi aturan yang ada pada setiap jalur decision tree.

Tabel I. Nilai persen kesesuaian primaquine pada setiap jalur decision tree.

Jalur ke-

Persen kesesuaian

Frekuensi

Tertinggi Terendah Tertinggi Terendah 1

50%

0%

998

2

2

33%

33%

1000

-

3

50%

50%

1000

-

4

50%

25%

980

20

5

67%

50%

980

20

6

80%

80%

1000

-

7

63%

63%

`1000

-

Hasil pengelompokan menunjukan bahwa nilai persen kesesuaian terendah primaquine sebagai ligan reseptor estrogen alfa terdapat pada jalur ke dua yaitu dengan nilai sebesar 33%, sedangkan nilai persen kesesuaian tertinggi terdapat pada jalur ke enam dengan nilai sebesar 80%. Berdasarkan hasil analisis pengelompokan tersebut dipilih jalur ke enam yang memiliki nilai persen kesesuaian tertinggi. Hasil analisis persen kesesuaian pada jalur ke enam decision tree menunjukkan bahwa primaquine tidak berikatan hidrogen dengan GLY420 dan ARG394, tidak berikatan hidrogen dengan GLY 521, berinteraksi elektrostatik dengan ASP351 dan memiliki skor ChemPLP ≥ -118,40.

5


Gambar 3. Analisis decision tree yang divisualisasikan. Garis merah menunjukkan jalur keputusan yang dipilih yaitu jalur ke enam berdasarkan persen kesesuaian tertinggi. Lingkaran berwarna biru menunjukkan senyawa primaquine tidak memenuhi salah satu syarat bitstring penting pada jalur ke enam decision tree.

Selanjutnya dari setiap pose replikasi yang memenuhi deskripsi aturan jalur ke enam decision tree, diambil salah satu pose replikasi sebagai perwakilan yang representatif dengan nilai ChemPLP terkecil untuk digunakan sebagai visualisasi pose primaquine pada kantung ikatan reseptor estrogen alfa. Visualisasi pose primaquine dilakukan dengan menggunakan pose replikasi ke 739 dan iterasi ke 1 yang memiliki skor ChemPLP terkecil yaitu -85.5157. Hasil visualisasi menggambarkan interaksi primaquine dengan residu asam amino yang terdapat dalam kantung ikatan reseptor estrogen alfa.

6


Gambar 2. Visualisasi pose primaquine pada reseptor estrogen alfa.

Pada visualisasi pose primaquine (Gambar 2), struktur senyawa primaquine ditunjukkan oleh struktur berwarna kuning pada atom karbon. Interaksi elektrostatik terjadi antara gugus amina yang terprotonasi pada primaquine dengan gugus karboksilat pada residu asam aspartat yang ditunjukkan oleh garis putus-putus berwarna hitam. Rantai utama ditampilkan dalam mode cartoon sementara residu dalam mode stick. Semua atom hidrogen nonpolar disembunyikan sedangkan hidrogen polar ditampilkan. Lingkaran merah pada Gambar 2, menunjukkan tidak adanya interaksi antara senyawa primaquine dengan residu GLY521 sehingga primaquine inaktif sebagai ligan reseptor estrogen alfa. Lingkaran merah tersebut menunjukkan primaquine tidak memenuhi salah satu aturan bitstring penting dari deskripsi jalur ke enam decision tree.

KESIMPULAN Senyawa primaquine tidak dapat dideteksi sebagai ligan aktif dari reseptor estrogen alfa secara in silico berdasarkan protokol yang dikembangkan Setiawati et al. (2014) dan analisis pasca penambatan oleh Istyastono (2015). Senyawa primaquine tidak berikatan dengan residu-residu yang berperan penting dalam interaksi ligan-protein dalam kantung ikatan reseptor estrogen alfa sehingga senyawa primaquine tidak dapat dideteksi sebagai ligan. Saran dari penelitian ini adalah perlu dilakukan pengembangan atau modifikasi lebih lanjut pada struktur primaquine terkait interaksi penting antara liganprotein. 7


DAFTAR PUSTAKA American Cancer Society, 2016. Cancer Fact And Figures. American Cancer Society Incorporation, 6-10. Anita, Y., Radifar, M., Kardono, L., Hanafi, M., Istyastono, E.P., 2012. Structure-Based Design of Eugenol Analogs as Potential Estrogen Receptor Antagonist. Bioinformation, 8, 901-906. Caldon, C.E., 2014. Estrogen Signaling And The DNA Damage Response In Hormone Dependent Breast Cancers. Frontiers In Oncology, 4 (106), 1-6. Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S., 2011. Primaquine In Vivax Malaria: An Update And Review On Management Issues. Malaria Journal, 10 (351), 1-4. Ferreira, L.G., Santos, R.N., Oliva, G., Andricopulo, A.D., 2015. Molecular Docking And Structure-Based Drug Design Strategies. Molecules, 20, 13384-13400. Godjali, D.D., Pardamean B., Suzanna E., 2012. Pengembangan Sistem Registrasi Kanker Di Indonesia. Indonesian Journal of Cancer, 6 (2), 61-62. Hayashi, S.I., Eguchi, H., Tanimoto, K., Yoshida, T., Omoto, Y., Inoue, A., 2003. The Expression And Function Of Estrogen Receptor α And β In Human Breast Cancer And Its Clinical Application. Endocrine-Related Cancer, 10, 193-202. Hollander, P.D., Savage, M.I., Brown, P.H., 2013. Targeted Therapy For Breast Cancer Prevention. Departement of Clinical Cancer Prevention, 3 (250), 1-11. Istyastono, E.P., 2013. Aplikasi Penapisan Virtual Pada ZINC Drug Database Guna Penemuan Senyawa Antagonis Reseptor Estrogen α Baru: Laporan Hasil Penelitian, Lembaga Penelitian dan Pengembangan Masyarakat, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Istyastono, E.P., 2015. Employing Recursive Partition And Regression Tree Method To Increase The Quality Of Structure-Based Virtual Screening In The Estrogen Receptor Alpha Ligands Identification. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 8(6), 207-210. Istyastono, E.P., Riswanto, F.D.O., and Yuliani, S.H., 2015. Computer-Aided Drug Repurposing: A Cyclooxygenase-2 Inhibitor Celecoxib As A Ligand For Estrogen Alpha , Indonesian Journal of Chemistry, 15 (3), 274 – 280. Korb, O., Stützle, T., and Exner, T.E., 2009. Empirical Scoring Functions for Advanced Protein-Ligand Docking with PLANTS. Journal of Chemical Information and Modeling, 49, 84-96. 8


Lee, H.M., and Kim, Y., 2016. Drug Repurposing Is New Opportunity For Developing Drugs Against Neuropsychiatric Disorders. Hindawi Publishing Corporation, 1-2. Lill, M.A., and Danielson, M.L., 2010. Computer-aided Drug Design Platform Using PyMOL. Journal of Computer-Aided Molecular Design, 25 (1), 13-19. Mellatyar, H., Talaei, S., Koshki, K.N., Akbarzadeh, A., 2016. Targeting HSP90 Gene Expression With 17-DMAG Nanoparticles In Breast Cancer Cells. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 17 (5), 2453-2457. Radifar, M., Yuniarti, N., Istyastono, E.P., 2013. PyPLIF: Python-based Protein-Ligand Interaction Fingerprinting. Bioinformation, 9(6), 325-328. Setiawan F.F., Istyastono, E.P., 2015. Uji In Silico Senyawa 2,6-Dihidroksiantraquinon Sebagai Ligan Pada Reseptor Estrogen Alfa. Jurnal Farmasi Sains dan Komunitas, 12(2), 77-80. Setiawati, A., Riswanto, F.D.O., Yuliani, S.H., Istyastono, E.P., 2014. Retrospective Validation of A Structure-Based Virtual Screening Protocol To Identify Ligands For Estrogen Receptor Alpha and Its Application To Identify The AlphaMangostin Binding Pose. Indonesian Journal of Chemistry, 14(2), 103-108.

9


LAMPIRAN

10


Lampiran 1. Proposal skripsi


Proposal Skripsi

Diajukan oleh: Lucius Evodius Bardata NIM: 138114097

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016 11


HALAMAN JUDUL UJI IN SILICO SENYAWA PRIMAQUINE SEBAGAI LIGAN PADA RESEPTOR ESTROGEN ALFA

Proposal Skripsi

Diajukan oleh: Lucius Evodius Bardata NIM: 138114097

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016 i


ii


DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL...................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................ ii DAFTAR ISI .................................................................................................. iii DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... v DAFTAR TABEL .......................................................................................... vi INTISARI....................................................................................................... vii BAB I. PENDAHULUAN ............................................................................. 1 A. Latar Belakang ................................................................................... 1 B. Permasalahan...................................................................................... 2 C. Urgensi Penelitian .............................................................................. 3 D. Luaran Penelitian ............................................................................... 3 E. Manfaat Penelitian ............................................................................. 3 a. Manfaat teoretis ...................................................................... 3 b. Manfaat praktis....................................................................... 3 F. Tujuan Penelitian ............................................................................... 3 1. Tujuan umum ......................................................................... 3 2. Tujuan khusus ........................................................................ 3 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA............................................................ 4 A. Kanker Payudara ................................................................................ 4 B. Reseptor estrogen alfa ........................................................................ 4 C. Primaquine ......................................................................................... 5 D. Uji in silico ......................................................................................... 6 E. Molecular docking ............................................................................. 6 F. Protokol penelitian ............................................................................. 7 G. Landasan teori .................................................................................... 9 H. Hipotesis............................................................................................. 10 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ..................................................... 11 A. Bahan.................................................................................................. 11 B. Alat ..................................................................................................... 11

iii


C. Prosedur penelitian ............................................................................. 11 D. Analisis hasil ...................................................................................... 12 JADWAL KEGIATAN .................................................................................. 13 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 14

iv


DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Struktur Primaquine ..................................................................... 7 Gambar 2. Pohon keputusan RPART ............................................................ 10

v


DAFTAR TABEL Tabel I. Bitstring yang digunakan dalam pohon keputusan ........................... 10 Tabel II. Jadwal Kegiatan .............................................................................. 15

vi


INTISARI Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang sering terdiagnosis pada wanita dan merupakan penyebab kematian kedua dalam kasus kematian yang disebabkan oleh kanker. Reseptor estrogen alfa (RE-α) berperan utama dalam ekspresi jaringan payudara dan rahim. Perkembangan sel kanker payudara ditandai dengan tingginya ekspresi RE-α. Primaquine merupakan obat antimalaria, digunakan sebagai agen eradikasi terhadap parasit Plasmodium vivax dan Plasmodium ovale. Tujuan terapi baru dari sebuah obat atau repurposing drug atau repositioning drug merupakan strategi baru dalam penemuan obat anti kanker, artinya adanya perhatian untuk mengidentifikasi obat non-anti kanker yang memiliki aktivitas antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk menguji senyawa primaquine sebagai ligan pada reseptor estrogen alfa secara in silico menurut protokol yang telah dikembangkan oleh Setiawati et al. (2014) dan metode analisis pasca penambatan oleh Istyastono (2015). Perangkat lunak penambatan yang digunakan adalah PLANTS 1.2 dan analisis hasil dilakukan dengan uji statistik menggunakan aplikasi R versi 3.0.1 serta visualisasi pose ikatan dibuat dengan PyMol versi 1.2. Kata kunci: Reseptor estrogen alfa, repurposing drug, repositioning drug, in silico, primaquine.

vii


BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Muncul dan tumbuhnya kanker merupakan hasil dari kerusakan sel normal secara terus menerus, dimana terjadi perubahan fungsional gen yang disebabkan oleh mutasi pada DNA. Hal ini menyebabkan perubahan ekspresi protein sel normal (Chada and Ramesh, 2016). Penyakit kanker menempati posisi kedua penyebab kematian di dunia setelah penyakit kardiovaskuler (Godjali et al. 2012). Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang sering terdiagnosis pada wanita dan merupakan penyebab kematian kedua dalam kasus kematian yang disebabkan oleh kanker (Mellatyar et al. 2016). Menurut American Cancer Society, pada tahun 2016 serangan kanker payudara terdiagnosis pada 246.660 wanita dan 2600 pria. Di Indonesia, berdasarkan hasil estimasi provider deteksi dini kanker payudara pada tahun 2013, terdapat 61.682 kasus kanker payudara. Dengan persentasi tiga tertinggi ditempati provinsi Jawa Tengah dengan 11.511 kasus, Jawa Timur 9.688 kasus, dan Jawa Barat 6.701 kasus (Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 2015). Estrogen berperan penting dalam regulasi pertumbuhan dan diferensiasi sel normal, terutama sel epitel payudara. Reseptor estrogen berperan dalam memediasi efek dari hormon endogen (Debeb and Berihu, 2015). Terdapat dua reseptor estrogen yaitu reseptor estrogen alfa (RE-α) dan beta (RE-β). Reseptor estrogen alfa berperan utama dalam ekspresi jaringan payudara dan rahim (Mandusic et al. 2011). Perkembangan sel kanker payudara ditandai dengan tingginya ekspresi RE-α (Hayashi et al. 2011). Primaquine digunakan sebagai agen eradikasi untuk parasit Plasmodium vivax pada hati yang belum terdeteksi. Dengan pemberian dosis standar untuk tiap harinya selama 14 hari (Burgoine et al. 2010; Pareek et al. 2015). Menurut Stenvang et al. (2013), tujuan terapi baru dari sebuah obat atau repurposing drug atau repositioning drug merupakan strategi baru dalam penemuan obat anti

1


kanker, artinya adanya perhatian untuk mengidentifikasi obat non-anti kanker yang memiliki aktivitas antikanker. Dengan pendalaman yang benar mengenai penyebab kanker payudara, target obat secara molekuler telah dikembangkan dan diujikan sebagai pengobatan dan pencegahan terhadap kanker payudara (Hollander et al. 2013). Gabungan strategi komputasi dan eksperimental memiliki nilai yang besar terhadap identifikasi dan pengembangan suatu senyawa obat baru. Pendekatan ini juga memperkirakan energi bebas dari interaksi antara ligan dan reseptor dengan mengevaluasi fenomena penting yang terlibat dalam proses interaksi antarmolekul (Ferreira et al. 2015). Studi in silico dilakukan untuk skrining suatu senyawa murni dimana bergantung pada kompleksitas struktural, gugus fungsi dan modifikasinya serta muatan dan interaksi yang terjadi (Venilla et al. 2014). Uji in silico mengenai aktivitas primaquine pada reseptor estrogen alfa didasarkan pada penapisan virtual berbasis struktur (PVBS). Telah dikembangkan protokol untuk mengidentifikasi pose ikatan alfa mangostin di kantung ikatan reseptor estrogen alfa (Setiawati et al. 2014) dan analisis pasca penambatan oleh Istyastono (2015). Pada penelitian ini, pose primaquine pada kantung ikatan reseptor estrogen alfa diseleksi menggunakan protokol Setiawati et al. (2014) dan analisis pasca penambatan oleh Istyastono (2015).

B. Permasalahan Sebelumnya telah dikembangkan protokol untuk mengidentifikasi pose ikatan alfa mangostin di kantung ikatan reseptor estrogen alfa (Setiawati et al. 2014) dan analisis pasca penambatan oleh Istyastono (2015). Sejauh penelusuran pustaka, dengan metode yang ada belum pernah dilakukan uji in silico senyawa primaquine terhadap RE-α, oleh karena itu akan dilakukan uji in silico senyawa primaquine sebagai ligan pada RE-α dengan menggunakan protokol yang dikembangkan oleh Setiawati et al. (2014) dan analisis pasca penambatan oleh Istyastono (2015).

2


C. Urgensi Penelitian Penelitian ini penting untuk memberi informasi terkait uji in silico senyawa primaquine terhadap RE-α untuk selanjutnya dapat dikembangkan dalam pengobatan kanker payudara. D. Luaran Penelitian Luaran berupa naskah untuk publikasi tentang uji in silico senyawa primaquine sebagai ligan terhadap reseptor estrogen alfa.

E. Manfaat Penelitian 1.

Manfaat teoretis Memberikan tambahan pengetahuan mengenai ikatan antara primaquine dan reseptor estrogen alfa, serta kemampuan primaquine sebagai ligan terhadap RE-α sehingga dapat dijadikan acuan untuk penelitian lebih lanjut.

2. Manfaat praktis Hasil penelitian ini diharapkan berguna untuk pengaplikasian dan pengembangan protokol penambatan virtual sebagai penemuan obat baru.

F. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum Tujuan umum penelitian ini adalah menguji senyawa primaquine sebagai ligan pada reseptor estrogen alfa secara in silico menurut protokol yang telah dikembangkan oleh Setiawati et al. (2014) dan metode analisis pasca penambatan oleh Istyastono (2015). 2. Tujuan khusus Mengetahui secara atomik pose ikatan primaquine dalam kantung RE-α serta menguji protokol penambatan virtual yang telah dikembangkan oleh Setiawati et al. (2014) dan metode analisis pasca penambatan oleh Istyastono (2015) dalam mengenali primaquine sebagai ligan pada kantung RE-α.

3


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Kanker payudara Kanker adalah kelompok penyakit yang ditandai dengan pertumbuhan serta penyebaran sel abnormal yang tidak terkontrol (American Cancer Society, 2016). Kanker payudara adalah tipe kanker epitel yang sering terjadi pada wanita (Heo et al. 2016). Kanker payudara yang terjadi pada wanita yang membawa gen mutasi pada Breast Cancer susceptibility gene 1 (BRCA1) dikategorikan sebagai kanker payudara reseptor estrogen (RE) negatif; sementara mereka yang terjadi mutasi pada gen BRCA2 biasanya dikategorikan kanker payudara reseptor estrogen positif, mirip dengan kanker payudara sporadik (Rosen and Issacs, 2016). Gejala kanker payudara sering tidak disadari atau dirasakan dengan jelas oleh penderita, sehingga banyak penderita yang datang dalam keadaan stadium lanjut (Firdaus et al. 2016). Estrogen dan reseptor estrogen merupakan faktor penting dalam perkembangan kanker payudara, oleh karena itu telah ditemukan dan dikembangkan obat-obat dengan reseptor estrogen sebagai target yang disebut modulator selektif untuk reseptor estrogen (SERMs). Obat ini bekerja dengan menghambat jalur sinyal estrogen pada wanita dengan kanker payudara (Hollander et al. 2013).

B. Reseptor estrogen alfa Estrogen dibutuhkan dalam pertumbuhan dan perkembangan jaringan payudara, tetapi tingginya level estrogen merupakan faktor resiko utama penyebab kanker payudara (Caldon, 2014). Terdapat dua cara dimana estrogen dapat menunjang terjadinya kanker, yang pertama melalui efek proliferatif dimana terjadi peningkatan serta akumulasi mutasi pada DNA dan divisi sel. Kedua, terjadinya akumulasi akibat dari peningkatan senyawa intermediet hasil metabolisme estrogen yang menyebabkan efek genotoksik pada sel (Mandusic et

4


al. 2011). Sebagian besar kasus kanker payudara bergantung pada signal yang diterima oleh reseptor estrogen, maka strategi pengobatan sebagian besar difokuskan dengan memblokir sinyal yang melewati reseptor estrogen (Chien et al. 2016). Reseptor estrogen merupakan salah satu reseptor intrasel yang terdiri dari dua isoform yaitu reseptor estrogen alfa (RE-α) dan reseptor estrogen beta (RE-β), dan merupakan G-protein coupled receptor (Ma and Gollahon, 2016). Reseptor estrogen alfa berperan penting dalam regulasi dan ekspresi jaringan uterus dan payudara (Mandusic et al. 2011). Reseptor estrogen alfa berperan penting dalam perkembangan payudara dan aktivasi signal pro-proliferasi pada payudara normal dan payudara yang menderita kanker (Caldon, 2014). Sedangkan reseptor estrogen beta (RE-β) diduga berperan dalam sensitivitas dan resistensi hormonal. Belum ada bukti ilmiah tentang ekspresi RE-β dalam kaitannya dengan kasus kanker payudara (Debeb and Berihu, 2015). Secara umum, ekspresi berlebihan reseptor estrogen alfa (RE-α) merupakan indikasi utama dalam kasus kanker payudara. Produksi estrogen intratumoral pada sel karsinoma payudara manusia merupakan akibat dari ekspresi berlebihan reseptor estrogen alfa (RE-α) dengan menstimulasi ekspresi gen estrogen-androgen converting enzyme, dan aromatisasi menggunakan promotor spesifik sel tumor (Debeb and Berihu, 2015).

C. Primaquine Primaquine (8-aminoquinoline) merupakan obat antimalaria, digunakan sebagai agen eradikasi terhadap parasit Plasmodium vivax dan Plasmodium ovale (Hill et al. 2006, Fernando et al. 2011). Drug repurposing merupakan suatu strategi dimana adanya pendekatan untuk menemukan indikasi baru dari obat yang telah ada ataupun kandidat obat. Drug repurposing atau drug repositioning merupakan suatu re-investigasi terhadap senyawa obat yang telah ada untuk menemukan tujuan terapi baru, termasuk didalamnya obat-obat yang bukan anti kanker menjadi obat anti kanker (Lee and Kim, 2016).

5


Gambar 1. Struktur 2D primaquine

D. Uji in silico Studi in silico digunakan dalam penemuan obat melalui Structure-Based Drug Design (SBDD). Dalam SBDD, diawali dengan mengetahui struktur target molekuler misalnya target makromolekuler yang disebut reseptor, dan pendekatan secara in silico biasanya digunakan untuk mengidentifikasi ligan yang potensial terhadap struktur target molekuler tersebut (Ferreira et al. 2015). Studi in silico merupakan suatu teknik eksperimental dalam desain senyawa obat yang dilakukan dengan komputasi. Studi in silico mencakup penggunaan database, Quantitative Sturucture-Activity Relationship (QSAR), identifikasi pharmacophore serta pemodelan homologi yang menggunakan komputer (Ekins et al. 2007).

E. Molecular Docking Molecular docking merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengetahui secara molekuler konformasi ligan pada binding site secara tepat dengan tingkat akurasi yang besar, dan merupakan suatu metode yang sangat dibutuhkan dalam penemuan obat. Selanjutnya algoritma molecular docking digunakan untuk memprediksi energi suatu ikatan secara kuantitatif dan menyajikan data tingkatan afinitas ikatan ligan-reseptor (Ferreira et al. 2015). Dalam penambatan secara molekuler (molecular docking), struktur dari suatu ligan dapat ditentukan dengan pemodelan pharmacophore. Pharmacophore merupakan kerangka molekuler yang membawa struktur/fitur yang esensial dari suatu ligan yang mana dibutuhkan sebagai penentu aktivitas biologis yang dihasilkan (Lee et al. 2011). Penambatan molekuler sering diimplementasikan

6


dalam alur kerja desain obat berbantukan komputer yaitu untuk menjelaskan interaksi ligan dan target biologis (Kumalo et al. 2015).

F. Protokol penelitian Skrining virtual merupakan aplikasi dari metode in silico untuk seleksi senyawa-senyawa yang diinginkan dari database senyawa kimia. Strategi skrining virtual terbagi dalam dua yaitu (i) Penapisan Virtual Berbasis Ligan (PVBL), dan (ii) Penapisan Virtual Berbasis Struktur (PVBS). PVBS terdiri dari beberapa langkah antara lain, (i) preparasi target molekuler, (ii) seleksi senyawa yang akan ditambatkan, (iii) penambatan molekuler, (iv) analisis pasca penambatan (Ferreira et al. 2015). Pada penambatan molekuler dengan metode penapisan virtual berbasis struktur (PVBS), model pharmacophore sering diaplikasikan, selain itu model pharmacophore juga sering digunakan untuk proses output virtual dalam skrining virtual (Lee et al. 2011). PLANTS (Protein-Ligand ANT System) merupakan suatu algoritma yang memperlakukan ligan secara fleksibel dan berdasarkan pada Ant Colony Optimization (ACO). Algoritma ACO menyusun solusi dengan memilih satu nilai untuk setiap derajat kebebasan. Fleksibilitas protein dipertimbangkan dengan optimasi atom hidrogen yang terlibat dalam ikatan hidrogen (Korb et al. 2007). Telah dikembangkan dan divalidasi sebuah protokol penapisan virtual berbasis struktur (PVBS) untuk mengidentifikasi ligan dari reseptor estrogen alfa, menggunakan protokol penambatan PLANTS 1.2 (Setiawati et al. 2014). Pengembangan dan modifikasi yang dilakukan adalah dengan menambahkan tiga simulasi independen untuk setiap penambatan, sementara pada protokol sebelumya hanya dilakukan satu kali penambatan. Protokol penambatan ini divalidasi dengan menggunakan Directory of Useful Decoy-Enhanced (DUD-E). Hasil dari validasi protokol penambatan ini berupa skor ChemPLP yang digunakan untuk evaluasi kecocokan antara reseptor dan ligan. Istyastono (2015) telah mengembangkan suatu metode analisis pasca penambatan untuk penentuan aktif tidaknya suatu ligan pada reseptor estrogen

7


alfa. Metode ini dilakukan dengan menerapkan Recursive Partition and Regression Tree (RPART). Metode ini menentukan apakah suatu senyawa berperan sebagai ligan atau sebagai senyawa pengecoh yang didasarkan pada skor penambatan dan bitstring PLIF.

Gambar 2. Pohon keputusan RPART (Istyastono, 2015). Jika jawaban “ya” menuju ke arah kiri, jika “tidak” ke arah kanan.

Tabel I. PLIF bitstring penting menurut decision tree (Istyastono, 2015) Nomor bitstring 320 242 117 411 473 105 201 470 170 171 323

Residu GLY 420 ARG 394 GLU 353 GLY 521 CYS 530 ASP 351 LEU 387 CYS 530 TRP 383 TRP 383 MET 421

Jenis interaksi Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) Ikatan hidrogen (protein sebagai donor) Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) Ikatan hidrogen (protein sebagai donor) Interaksi elektrostatik (protein sebagai anion) Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) Interaksi non polar Aromatis (face to face) Aromatis (edge to edge) Interaksi non-polar 8


G. Landasan Teori Kanker adalah kelompok penyakit yang ditandai dengan pertumbuhan serta penyebaran sel abnormal yang tidak terkontrol. Muncul dan tumbuhnya kanker merupakan hasil dari kerusakan sel normal secara terus menerus, dimana terjadi perubahan fungsional gen yang disebabkan oleh mutasi pada DNA. Hal ini menyebabkan perubahan ekspresi protein sel normal. Penyakit kanker menempati posisi kedua penyebab kematian di dunia setelah penyakit kardiovaskuler. Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang sering terdiagnosis pada wanita dan merupakan penyebab kematian kedua dalam kasus kematian yang disebabkan oleh kanker. Di Indonesia, berdasarkan hasil estimasi provider deteksi dini kanker payudara sampai dengan tahun 2013, terdapat 61.682 kasus kanker payudara. Estrogen berperan penting dalam regulasi pertumbuhan dan diferensiasi sel normal, terutama sel epitel payudara. Reseptor estrogen berperan dalam memediasi efek dari hormon endogen. Terdapat dua reseptor estrogen yaitu reseptor estrogen alfa (RE-α) dan beta (RE-β). Reseptor estrogen alfa berperan utama dalam ekspresi jaringan payudara dan rahim. Perkembangan sel kanker payudara ditandai dengan tingginya ekspresi RE-α. Primaquine digunakan sebagai agen eradikasi untuk parasit Plasmodium vivax pada hati yang belum terdeteksi. Dengan pemberian dosis standar untuk tiap harinya selama 14 hari. Tujuan terapi baru dari sebuah obat atau repurposing drug merupakan strategi baru dalam penemuan obat anti kanker, artinya adanya perhatian untuk mengidentifikasi obat non-anti kanker yang memiliki aktivitas antikanker. Gabungan strategi komputasi dan eksperimental memiliki nilai yang besar terhadap identifikasi dan pengembangan suatu senyawa obat baru. Pendekatan ini juga memperkirakan energi bebas dari interaksi antara ligan dan reseptor dengan mengevaluasi fenomena penting yang terlibat dalam proses interaksi antarmolekul. Studi in silico dilakukan untuk skrining suatu senyawa murni dimana bergantung pada kompleksitas struktural, gugus fungsi dan modifikasinya serta muatan dan interaksi yang terjadi. Akan dilakukan uji in silico senyawa primaquine sebagai ligan pada reseptor estrogen alfa menggunakan protokol penapisan virtual dengan aplikasi PLANTS 1.2 yang telah divalidasi oleh

9


Setiawati et al. (2014) dan dilanjutkan analisis pasca penambatan menggunakan protokol yang divalidasi oleh Istyastono (2015).

H. Hipotesis Senyawa primaquine merupakan ligan dari reseptor estrogen alfa secara in silico berdasarkan protokol penambatan yang dikembangkan Setiawati et al. (2014) dan analisis pasca penambatan oleh Istyastono (2015).

10


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah protokol yang dikembangkan dan divalidasi oleh Setiawati et al. (2014), struktur tiga dimensi primaquine (diperoleh dari zinc.docking.org dengan kode ZINC01530862), perangkat lunak penambatan PLANTS 1.2 (Korb et al. 2009) untuk simulasi penambatan molekuler, PyPLIF (Radifar, et al. 2013) untuk identifikasi proteinligan interaction fingerprint, R versi 3.0.1 (R Development Core Team, 2013) untuk perhitungan dan analisis statistik, serta PyMol 1.2rl (Lill and Danielson, 2010) untuk visualisasi pose ikatan primaquine.

B. Alat Server Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan alamat IP 103.247.10.66 dengan sistem operasi Ubuntu 12.04 LTS, ASUS Intel® Atom™ CPU 2600 @1.60 GHz, RAM 2.00 GB, 32-bit operating system, dan sistem operasi Linux Ubuntu 12.04 LTS.

C. Prosedur penelitian 1. Pengunduhan struktur senyawa primaquine Struktur primaquine diunduh dari zinc.docking.org dengan kode ZINC01530862 dan disimpan dengan format .mol2. 2. Preparasi senyawa primaquine secara molekuler Struktur primaquine yang telah diunduh dalam format .mol2, dipreparasi dengan menggunakan aplikasi SPORES (modul: settypes) agar selanjutnya dapat digunakan untuk ditambatkan pada target virtual menggunakan aplikasi PLANTS 1.2.

11


3. Penambatan molekuler senyawa primaquine Luaran dari SPORES ditambatkan menggunakan aplikasi PLANTS 1.2 dengan konfigurasi mengacu pada protokol yang telah dikembangkan Setiawati et al. (2014). Pada setiap satu kali penambatan (1 run), dilakukan tiga kali iterasi penambatan molekuler yang masing-masing menghasilkan 50 pose. Pada setiap iterasi diambil salah satu pose terbaik dan dilakukan analisis IFP dengan PyPLIF. Luaran dari setiap run adalah 3 pose berupa skor ChemPLP dan data bitstring PLIF yang selanjutnya diambil salah satu pose dengan nilai ChemPLP terbaik. Dilakukan seribu kali run,sehingga dapat diperoleh data seribu pose terbaik untuk setiap replikasi yang dilakukan.

D. Analisis Hasil Analisis hasil dilakukan menggunakan perangkat lunak statistik R versi 3.0.2 (R Development Team, 2015) dan dengan protokol analisis yang telah dikembangan oleh Istyastono (2015). Hasil penambatan berupa skor ChemPLP dan PLIF bitstring yang selanjutnya dimasukkan pada decision tree melalui metode RPART dengan aplikasi statistik R 3.0.2 (R Development Team, 2015). Data dari hasil analisis akan menampilkan senyawa primaquine aktif sebagai ligan yang ditunjukkan dengan angka 1 atau tidak aktif sebagai ligan yang ditunjukkan dengan angka 0. Selanjutnya visualisasi pose senyawa primaquine pada reseptor estrogen alfa menggunakan PyMOL 1.2 (Lill and Danielson, 2010) dilakukan dengan memilih pose ikatan dengan kriteria: 1. Pose dengan bitstring 320 aktif dan skor ChemPLP terkecil. 2. Pose dengan skor ChemPLP tertinggi. 3. Jika tidak ada pose ikatan yang aktif pada bitstring 320, dipilih pose ikatan dengan skor ChemPLP terkecil.

12


JADWAL KEGIATAN Tabel II. Jadwal kegiatan penelitian Lamanya kegiatan Tahapan

Bulan ke1

2

Persiapan Studi Pustaka Penambatan molekuler Analisis hasil Penyusunan naskah

13

3

4

5


DAFTAR PUSTAKA American Cancer Society, 2016. Cancer Fact And Figures. American Cancer Society Incorporation, 6-10. Burgoine, K.L., Bancone, G., Nosten, F., 2010. The Reality Using Of Primaquine. Malaria Journal, 9 (376), 1-2. Caldon, C.E., 2014. Estrogen Signaling And The DNA Damage Response In Hormone Dependent Breast Cancers. Frontiers In Oncology, 4 (106), 16. Chada, S. and Ramesh, R., 2016. Delivery Of Protein and Peptide Drugs In Cancer. LA TROBE University, 15, 336. Chien, C.D., Riegel, A., Wellstein, A., 2016. Coregulators And Their Role In Selective Estrogen Receptor Modulator Action. Weizmann Institute Of Science, 7, 153-159. Debeb, Y.G., and Berihu, B.A., 2015. Review On The Role Of Estrogen Receptors In Breast Cancer. International Journal of Pharma Sciences and Research (IJPSR), 6 (8), 1100-1103. Ekins, S., Mestres, J., Testa, B., 2007. In Silico Pharmacology For Drug Discovery: Methods For Virtual Ligand Screening And Profiling. British Journal of Pharmacology, 152, 9-20. Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S., 2011. Primaquine In Vivax Malaria: An Update And Review On Management Issues. Malaria Journal, 10 (351), 1-4. Ferreira, L.G., Santos, R.N., Oliva, G., Andricopulo, A.D., 2015. Molecular Docking And Structure-Based Drug Design Strategies. Molecules, 20, 13384-13400. Firdaus, V.R.P., Asri, A., Khambri, D., Harahap, W.A., 2016. Hubungan Grading Histopatologi dan Imfiltrasi Limfovaskular dengan Subtipe Molekuler Pada Kanker Payudara Invasif. Jurnal Kesehatan Andalas, 5 (1), 165166.

14


Godjali, D.D., Pardamean B., Suzanna E., 2012. Pengembangan Sistem Registrasi Kanker Di Indonesia. Indonesian Jurnal of Cancer, 6 (2), 61-62. Hayashi, S.I., Eguchi, H., Tanimoto, K., Yoshida, T., Omoto, Y., Inoue, A., 2003. The Expression And Function Of Estrogen Receptor α And β In Human Breast Cancer And Its Clinical Application. Endocrine-Related Cancer, 10, 193-202. Heo, J.C., Na, A.Y., Sung, J.Y., Lee, J.H., Kim, Y.N., Kim, D.K., 2016. No Association Of The rs17822931 Polymorphism In ABCC11 With Breast Cancer In Koreans. Asian Pacific Journal Of Cancer Prevention, 17 (5), 2625-2627. Hill, D.R., Baird, J.K., Parise, M.E., Lewis, L.S., Ryan, E.T., Magill, A.J., 2006. Primaquine:

Report

From

CDC

Expert

Meeting

On

Malaria

Chemoprophylaxis. The American Society Of Tropical Medicine And Hygiene, 75 (3), 402-405). Hollander, P.D., Savage, M.I., Brown, P.H., 2013. Targeted Therapy For Breast Cancer Prevention. Departement of Clinical Cancer Prevention, 3 (250), 1-11. Istyastono, E.P., 2015. Employing Recursive Partition And Regression Tree Method To Increase The Quality Of Structure-Based Virtual Screening In The Estrogen Receptor Alpha Ligands Identification. Asian Jorunal of Pharmaceutical and Clinical Research, 8(6), 207-210. Kementrian Kesehatan Republik Indonesia, 2015. Buletin Jendela Data & Informasi Kesehatan: Situasi Penyakit Kanker, Kementrian Kesehatan Republik Indonesia, 1, 7-15. Korb, O., Stützle, T., and Exner, T.E., 2007. An Ant Colony Optimization Approach to Flexible Protein-Ligand Docking. Swarm Intell, 1, 115-134. Korb, O., Stützle, T., and Exner, T.E., 2009. Empirical Scoring Functionsfor Advanced Protein-Ligand Docking with PLANTS. J. Chem. Inf. Model, 49, 84-96.

15


Kumalo, H.M., Bhakat, S., Soliman, M.E.S., 2015. Theory And Applications Covalent Docking In Drug Discovery: Merits And Pitfalls. Molecules, 20, 1984-1985. Lee, H.M., and Kim, Y., 2016. Drug Repurposing Is New Opportunity For Developing Drugs Against Neuropsychiatric Disorders. Hindawi Publishing Corporation, 1-2. Lee, C.H., Huang, C.H., Juan, H.F., 2011. Reviewing Ligand-Based Rational Drug Design: The Search For An ATP Synthase Inhibitor. International Journal Of Molecular Sciences, 12, 5304-5314. Lill, M.A., and Danielson, M.L., 2010. Computer-aided Drug Design Platform Using PyMOL. Journal of Computer-Aided Molecular Design, 25 (1), 13-19. Ma, H., and Gollahon, S.L., 2016. RE-α Mediates Estrogen-Induced Expression Of The Breast Cancer Metastasis Suppresor Gene BRMS1. International Journal Of Molecular Sciences, 17 (158), 1-2. Mandusic, V., Radak, D., Markicevic, M., Perovic, M., Obradovic, M., Mikhailidis, D.P., 2011. Role Of Estrogen And Estrogen Receptors In Cancer Pathology. Endocrinology Studies, 1 (5), 18-20. Mellatyar, H., Talaei, S., Koshki, K.N., Akbarzadeh, A., 2016. Targeting HSP90 Gene Expression With 17-DMAG Nanoparticles In Breast Cancer Cells. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 17 (5), 2453-2457. Parek, A., Chandurkar, N., Gogtay, N., Deshpande, A., Kakrani, A., Kaneria, M., 2015. Sustained Release Formulation Of Primaquine For Prevention Of Relapse

Of

Plasmodium

Vivax

Malaria.

Hindawi

Publishing

Corporation Malaria Research and Treatment, 1-2. Radifar, M., Yuniarti, N., Istyastono, E.P., 2013. PyPLIF: Python-based ProteinLigand Interaction Fingerprinting. Bioinformation, 9(6), 325-328. Rosen, E., and Issacs, C., 2016. Role Of Estrogen In Familial Breast Cancer. LA TROBE University, 8, 175-176. Setiawati, A., Riswanto, F.D.O., Yuliani, S.H., Istyastono, E.P., 2014. Retrospective Validation of A Structure-Based Virtual Screening

16


Protocol To Identify Ligands For Estrogen Receptor Alpha and Its Application To Identify The Alpha-Mangostin Binding Pose. Indo J. Chem, 14(2), 103-108. Stenvang, J., Kumler, I., Nygard, S.B., Smith, D.H., Nielsen D., Brunner, N., 2013. Biomarker-Guided Repurposing Of Chemotherapeutics Drugs For Cancer Therapy : A Novel Strategy In Drug Development. University Of Copenhagen, 3 (313), 1-4. Venilla, S., Bupesh, G., Saravanamurali, K., Kumar, S.V., Sentilraja, R., Saran, N., 2014. In Silico Docking Study Of Compounds Elucidated From Helicteres

Isora

Fruits

With

Bioinformation, 10 (5), 263-264.

17

Ampiknase-Insulin

Receptor.


Lampiran 2. Konfigurasi protokol penambatan PLANTS 1.2 (plants.config) # scoring function and search settings scoring_function chemplp search_speed speed2 # input protein_file protein.mol2 ligand_file ligand_input.mol2 # output output_dir results # write single mol2 files (e.g., for RMSD calculation) write_multi_mol2 0 # cluster algorithm cluster_structures 50 cluster_rmsd 1.0 # binding site definition bindingsite_center 31.5746 -1.59038 25.5995 bindingsite_radius 12.8348 # water water_molecule 22.565 -0.072 25.818 1 0 1 water_molecule_definition water.mol2

12


Lampiran 3. Shell script untuk analisis pasca penambatan dengan mengacu decision tree. #!/bin/sh > awk –F, ‘BEGIN {OFS=”,”};{if($4<-84.82 && $325==1) hasil=”aktif”; >

else

if($4<-118.40

&&

$325==0

&&

$122==1)

hasil=”aktif”; > else if($4<-118.40 && $325==0 && $122==0 && 206==1) hasil=”aktif”; > else if($4<-85.23 && $325==0 && $247==1 && 206==1) hasil=”aktif”; > else if($4<-85.23 && $325==0 && $247==1 && 206==0 && 122==1 && 328==1) hasil=”aktif”; > else if($4>=-118.40 && $325==0 && 247==0 && 416==1 && 110==1) hasil=”aktif”; > else if($4>=-118.40 && $325==0 && 247==0 && 416==0 && 478==1 && 475==0 && 175==1 && 176==1) hasil=”aktif”; >

else

hasil=”inaktif”}

{print$1,hasil}’

analisis_dectree.csv

13

data.csv

>


BIOGRAFI PENULIS Lucius Evodius Bardata lahir di Pagal, ManggaraiFlores, Nusa Tenggara Timur pada tanggal 6 Mei 1995. Riwayat pendidikan formal yang ditempuh oleh penulis adalah SD Katolik Pagal II (2000-2006), SMP Negeri 1 Cibal (2006-2009), SMA Negeri 1 Cibal (2009-2012). Pada tahun 2013 penulis melanjutkan pendidikan ke jenjang

yang

lebih

tinggi

di

Fakultas

Farmasi

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan menulis skripsi “Uji In Silico Senyawa Primaquine Sebagai Ligan Pada Reseptor Estrogen Alfa”. Selama menjalani perkuliahan, penulis pernah aktif dalam berbagai Unit Kegiatan Mahasiswa dan kepanitiaan serta pernah berperan aktif sebagai asisten praktikum Anatomi Fisiologi Manusia.

14

UJI IN SILICO SENYAWA PRIMAQUINE SEBAGAI LIGAN PADA RESEPTOR ESTROGEN ALFA SKRIPSI

Recommend Documents