UJI ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT DAN FRAKSI AIR EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU MELALUI PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL DENGAN METODE DEOKSIRIBOSA SKRIPSI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

UJI ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT DAN FRAKSI AIR EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU MELALUI PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL DENGAN METODE DEOKSIRIBOSA

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Sarjana Farmasi

Oleh : Dedy NIM : 018114027

Oleh : Aprilliana Sari Dewi NIM : 028114176

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007



SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Sarjana Farmasi

Oleh : Dedy NIM : 018114027

Oleh : Aprilliana Sari Dewi NIM : 028114176

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007

ii



Yang diajukan oleh : Aprilliana Sari Dewi NIM : 028114176

Skripsi ini telah disetujui oleh:

Pembimbing

Dra. A. Nora Iska Harnita, M.Si., Apt. Tanggal : 19 Februari 2007

iii


iv


Kupersembahkan skripsi ini untuk: Tuhan Yesus

yang selalu memberiku kasih, kekuatan, dan penghiburan Bapak dan Ibuku yang sangat aku sayangi Adikku Daniel yang selalu mendukungku

Almamaterku

v


PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas segala kasih dan rahmatNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji Antioksidan Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air Ekstrak Etanol Teh Hijau Melalui Penangkapan Radikal Hidroksil dengan Metode Deoksiribosa” sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama perkuliahan, penelitian, dan penyusunan skripsi ini, penulis telah banyak mendapat bantuan dari berbagai pihak berupa bimbingan, nasehat, dorongan, pengarahan, kritik, saran, dan sarana. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaiakan penghargaan dan ucapan terima kasih kepada: 1. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Dra. A. Nora Iska Harnita, M.Si., Apt. selaku Dosen Pembimbing Skripsi atas segala masukan, kritik, semangat, dan sarannya. 3. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen Penguji atas bimbingan, saran, dan pengarahannya baik selama penelitian dan dalam penyusunan skripsi ini. 4. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. selaku dosen Penguji atas bimbingan, saran, dan pengarahannya baik selama penelitian dan dalam penyusunan skripsi ini.

vi


5. Enade Istyastono, S.F., Apt. atas dukungan, perhatian, waktu, semangat, saran dan kritiknya. 6. Romo Drs. P. Sunu H. S.J., atas bimbingan, nasehat, semangat, waktu, saran, dan bantuannya. 7. Segenap dosen atas kesabarannya dalam membimbing penulis selama perkuliahan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 8. Segenap laboran dan karyawan atas bantuan dan kerjasamanya selama penulis menempuh perkuliahan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 9. PT. Pagilaran Yogyakarta atas informasi yang diberikan tentang proses pembuatan teh. 10. Bapak, Ibu, dan adikku Daniel yang sangat aku sayangi. 11. Teman-teman “Skripsi Ceria” (Riri, Leny, Vini, dan Ardhyan), atas persahabatan, semangat, bantuan, dan kerjasamanya. 12. Teman-teman kost Davita dan almamaternya (Mbak Yanti, Mbak Siska, Mbak Utin, Mbak Wulan, Aris, Clara, Yosi, I’ie), Bapak & Ibu kost, dik Ana dan dik Anik, atas cinta dan kasih sayang kalian. 13. Teman-teman KKN-ku (Mbak Ade, Kak Enzo, Mas Chandra, Tisa, Ndus, Reni, Ika, Wida, Lambok) atas waktu sejenak yang berarti buatku. 14. Arya, Kristian, Danang, Heri, Mas Made, Mas Sam, Mas Hendri, Yuni, Duma, Rinta, Santi, Mas Koko, Bang Agus, Ponco, Duta, Mas Christ, Mas Rocky, Nono, Yon, Mas Pras, Kak Sani, Dik Kus, dan Ina atas bantuan dan dukungannya.

vii


15. Teman-teman kelas C terutama kelompok F angkatan 2002, atas persahabatan, kebersamaan, dan kerjasama kita selama ini. 16. Semua pihak yang telah memberi bantuan, semangat, dan dukungan yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

Akhir kata, penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna mengingat keterbatasan kemampuan dan pengalaman yang dimiliki. Oleh sebab itu, kritik dan saran yang membangun sangat diperlukan oleh penulis demi kesempurnaan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Yogyakarta, 13 Februari 2007

Penulis

viii


PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta, 13 Februari 2007 Penulis

Aprilliana Sari Dewi

ix


INTISARI

Teh hijau mengandung kira-kira 30 % senyawa polifenol terutama dari golongan flavonoid. Komponen flavonoid dalam teh hijau dengan gugus hidroksi fenoliknya, memungkinkan teh hijau mempunyai aktivitas antioksidan dengan mekanisme penangkapan radikal hidroksil. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas dan nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau melalui penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental karena subyek uji diberi perlakuan. Metode yang digunakan adalah metode deoksiribosa, dengan reagen Fenton untuk menghasilkan radikal hidroksil. Penyerangan radikal hidroksil terhadap deoksiribosa menghasilkan malondialdehid (MDA), yang kemudian direaksikan dengan asam tiobarbiturat (TBA) dalam suasana asam dan dengan pemanasan membentuk kromogen berwarna merah muda. Absorbansi dari kromogen ini kemudian diukur pada panjang gelombang 532 nm. Aktivitas antioksidan melalui penangkapan radikal hidroksil dari fraksi etil asetat dan fraksi air diketahui dari nilai % scavenging. Nilai aktivitas antioksidan kedua fraksi tersebut diketahui dengan cara menetapkan ES50 (penangkapan efektif radikal hidroksil sebesar 50 %) melalui analisis regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi fraksi etil asetat dan konsentrasi fraksi air dengan % scavenging. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat dan fraksi air mempunyai aktivitas antioksidan melalui penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat berbeda tidak bermakna dibanding aktivitas antioksidan fraksi air dengan nilai ES50 fraksi etil asetat sebesar 0,22 (mg/ml) (hasil ekstrapolasi) dan nilai ES50 fraksi air sebesar 0,23 (mg/ml) (hasil ekstrapolasi). Kata kunci : antioksidan, fraksi etil asetat, fraksi air, ekstrak etanol teh hijau, radikal hidroksil, metode deoksiribosa.

x


ABSTRACT Green tea contains approximately 30 % polyphenols especially from the flavonoid compound. Hydroxy phenolic group of flavonoid component in green tea makes green tea have antioxidant activity by hydroxyl radical scavenging mechanism. The aim of this research is to know antioxidant activity and value of the activity of ethyl acetate fraction and water fraction of green tea ethanolic extract by hydroxyl radical scavenging with deoxyribose method.. This research is an experimental research since the subject tested was given treatment. Method used is deoxyribose method, with Fenton’s reagent to produce hydroxyl radical that attack deoxyribose produce malondialdehid (MDA) then reacts with thiobarbituric acid (TBA) in acid condition and with heating produce pink chromogen. The absorbance of this chromogen measured at 532 nm. Antioxidant activity by hydroxyl radical scavenging from ethyl acetate and water fraction expressed as % scavenging value. The antioxidant activity value is known by count ES50 (50 % hydroxyl radical effective scavenging) through linear regression analysis from relation between ethyl acetate and water fraction concentration and % scavenging. The result of this research revealed that ethyl acetate and water fraction has the antioxidant activity by hydroxyl radical scavenging with deoxyribose method. Antioxidant activity of ethyl acetate fraction has insignificant difference in comparison with water fraction, ES50 value of ethyl acetate fraction is 0.22 (mg/ml) (extrapolation result) and ES50 value of water fraction is 0.23 (mg/ml) (extrapolation result). Keywords: antioxidant, ethyl acetate fraction, water fraction, green tea ethanolic extract, hydroxyl radical, deoxyribose method.

xi


DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL...............................................................................................ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ....................................................iii HALAMAN PENGESAHAN................................................................................ iv HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................. v PRAKATA ............................................................................................................. vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................ix INTISARI................................................................................................................ x ABSTRACT .............................................................................................................xi DAFTAR ISI .........................................................................................................xii DAFTAR TABEL ................................................................................................xvi DAFTAR GAMBAR ..........................................................................................xvii DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................xviii BAB I PENGANTAR ............................................................................................. 1 A. Latar Belakang ............................................................................................ 1 B. Perumusan Masalah .................................................................................... 5 C. Keaslian Penelitian...................................................................................... 5 D. Manfaat Penelitian ...................................................................................... 6 E. Tujuan Penelitian ........................................................................................ 6 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA...................................................................... 7 A. Teh Hijau...................................................................................................... 7

xii


1. Klasifikasi teh dan proses pengolahannya ........................................ 7 2. Kandungan kimia teh hijau ............................................................... 7 3. Khasiat teh hijau................................................................................ 8 B. Flavonoid ...................................................................................................... 8 1. Pengertian flavonoid ......................................................................... 8 2. Flavonoid dalam teh hijau ................................................................. 9 3. Sifat antioksidan flavonoid ............................................................. 10 4. Penyarian flavonoid ........................................................................ 11 C. Metode Penyarian ....................................................................................... 11 1. Maserasi dan remaserasi ................................................................. 11 2. Perkolasi .......................................................................................... 12 3. Infundasi.......................................................................................... 12 4. Penyarian berkesinambungan.......................................................... 13 D. Radikal Hidroksil (HO)............................................................................. 13 1. Pengertian radikal hidroksil ............................................................ 13 2. Pembentukan radikal hidroksil........................................................ 13 3. Metode deteksi radikal hidroksil..................................................... 14 E. Metode Deoksiribosa .................................................................................. 15 F. Antioksidan ................................................................................................. 17 G. Spektrofotometri Sinar Tampak ................................................................. 20 H. Landasan Teori ........................................................................................... 22 I. Hipotesis ...................................................................................................... 24 BAB III METODOLOGI PENELITIAN.............................................................. 25

xiii


A. Jenis dan Rancangan Penelitian ................................................................ 25 B. Variabel Penelitian .................................................................................... 25 C. Definisi Operasional.................................................................................. 25 D. Bahan......................................................................................................... 26 E. Alat ............................................................................................................ 27 F. Tata Cara Penelitian .................................................................................. 27 1. Pengambilan sampel………................................................................ 27 2. Pembuatan serbuk teh hijau………. ................................................... 27 3. Preparasi sampel………...................................................................... 28 a. Pembuatan ekstak etanol teh hijau .................................................. 28 b. Pembuatan fraksi etil asetat dan fraksi air....................................... 28 4. Persiapan uji penangkapan radikal hidroksil....................................... 30 a. Pembuatan larutan bufer fosfat pH 7,4............................................ 30 b. Pembuatan larutan deoksiribosa 2,5 mM ........................................ 30 c. Pembuatan reagen Fenton ............................................................... 30 d. Pembuatan larutan TCA 5 % .......................................................... 31 e. Pembuatan larutan TBA 1 %........................................................... 31 f. Pembuatan larutan uji fraksi etil asetat 1 mg/ml.............................. 32 g. Pembuatan larutan uji fraksi air 1 mg/ml ........................................ 32 5. Penentuan OperatingTime (OT)............................................................ 32 6. Penentuan panjang gelombang maksimum (maks) ............................... 33 7. Pembuatan larutan kontrol .................................................................... 33 8. Uji penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat ...................... 34

xiv


9. Uji penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi air ................................. 34 G. Analisis Data .............................................................................................. 35 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................. 36 A. Pengambilan Sampel .................................................................................. 36 B. Pembuatan Serbuk Teh Hijau ..................................................................... 37 C. Preparasi Sampel ........................................................................................ 37 1. Pembuatan ekstrak etanol teh hijau ....................................................... 37 2. Fraksinasi ekstrak etanol teh hijau ........................................................ 38 D. Penentuan Operating Time (OT)................................................................ 39 E. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (maks) ................................... 41 F. Uji Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air Teh Hijau............................................................................ 45 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN................................................................ 53 A. Kesimpulan ............................................................................................... 53 B. Saran.......................................................................................................... 53 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 54 DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... 58 BIOGRAFI PENULIS .......................................................................................... 72

xv


DAFTAR TABEL

Hal Tabel I. Metode dan prinsip deteksi radikal hidroksil........................................ 14 Tabel II. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan sampel fraksi etil asetat dengan berbagai konsentrasi ....................................... 46 Tabel III. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan sampel fraksi air dengan berbagai konsentrasi .................................................. 46 Tabel IV. Nilai persentase penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat dan fraksi air teh hijau ................................................ 48

xvi


DAFTAR GAMBAR

Hal Gambar 1. Kerangka dasar flavonoid beserta penomorannya .............................. 8 Gambar 2. Struktur kimia katekin teh dan epimernya .......................................... 9 Gambar 3. Struktur flavonol teh.......................................................................... 10 Gambar 4. Struktur deoksiribosa......................................................................... 15 Gambar 5. Reaksi penyerangan radikal hidroksil pada deoksiribosa ................. 16 Gambar 6. Reaksi pembentukan radikal gula peroksil........................................ 16 Gambar 7. Struktur malondialdehid (MDA) ....................................................... 17 Gambar 8. Tingkat energi elektron molekul ....................................................... 21 Gambar 9. Skema tata cara preparasi sampel (ekstraksi dan fraksinasi) ............ 29 Gambar 10. Kurva hubungan waktu vs absorbansi pada pengukuran operating time (OT) .......................................................................... 40 Gambar 11. Kurva panjang gelombang maksimum kromogen MDA-TBA ......... 41 Gambar 12. Reaksi pembentukan gugus enol pada TBA ..................................... 43 Gambar 13. Usulan reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA.......................... 44 Gambar 14. Struktur kromogen MDA-TBA ......................................................... 45 Gambar 15. Kurva hubungan konsentrasi fraksi etil asetat dengan % scavenging .................................................................................... 48 Gambar 16. Kurva hubungan konsentrasi fraksi air dengan % scavenging......... 48 Gambar 17. Kurva regresi fraksi etil asetat teh hijau (hasil konversi) .................. 49 Gambar 18. Kurva regresi fraksi air teh hijau (hasil konversi) ............................. 49 Gambar 19. Reaksi penangkapan radikal hidroksil oleh senyawa flavonoid........ 51 Gambar 20. Reaksi kopling radikal fenoksil dengan radikal lain pada tahap terminasi ............................................................................................ 52

xvii


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Pembuatan larutan bufer fosfat pH 7,4............................................58 Lampiran 2. Pembuatan larutan deoksiribosa 2,5 mM. .......................................59 Lampiran 3. Pembuatan reagen Fenton................................................................60 Lampiran 4. Pembuatan larutan TCA 5 % dan TBA 1 %. ...................................65 Lampiran 5. Perhitungan persentase penangkapan radikal hidroksil oleh senyawa uji (% scavenging). ....................................................66 Lampiran 6. Perhitungan penangkapan efektif radikal hidroksil sebesar 50 % (Effective Scavenging 50 (ES50)) ............................................67 Lampiran 7. Tabel koefisien korelasi (r)..............................................................70 Lampiran 8. Tabel random sampling (random numbers table). ..........................71

xviii


BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang Radikal bebas terutama spesies oksigen reaktif (Reactive Oxygen Species , ROS) merupakan radikal bebas yang umum dihasilkan dalam sistem biologi, baik melalui proses fisiologi maupun patologi. ROS dapat juga dihasilkan dari sumber eksogen misalnya dari komponen makanan, dan radiasi ultraviolet. ROS terdiri dari radikal superoksid (O 2•-), radikal peroksil (ROO•), radikal alkoksil (RO•), radikal oksida nitrit (NO•), dan radikal hidroksil (HO •) (Ames et al., 1993 cit Siswono, 2003). ROS bersifat reaktif karena adanya elektron yang tidak berpasangan pada orbital terluarnya. Diantara beberapa jenis ROS tersebut, radikal hidroksil merupakan radikal yang paling reaktif (Halliwell dan Gutteridge, 1999). Karena alasan itulah dalam penelitian ini digunakan radikal hidroksil sebagai model radikal bebas yang berbahaya. Secara normal radikal bebas-radikal bebas tersebut dapat diatasi oleh antioksidan endogen (misalnya enzim superoksida dismutase, katalase, dan glutation peroksidase). Apabila radikal bebas yang dihasilkan melebihi kemampuan antioksidan endogen, maka akan terjadi akumulasi radikal bebas dalam tubuh. Hal tersebut dapat menimbulkan stres oksidatif yang diketahui berperan dalam penuaan dini dan timbulnya penyakit degeneratif seperti artherosklerosis, penyakit jantung, dan kanker. Selama ini upaya pengobatan terhadap penyakit-penyakit akibat stress oksidatif tersebut masih sangat minim,

1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2

dan perawatan seringkali terbatas hanya pada penghilangan gejala daripada ke arah pencegahan penyebab penyakit (Cutler and Cutler, 2000). Berdasarkan hal tersebut, akhir-akhir ini radikal bebas mendapat perhatian cukup besar dalam bidang gizi, farmasi, dan kedokteran (Mulihal, 1991). Untuk mencegah terjadinya stress oksidatif tersebut diperlukan antioksidan eksogen yang efektif dan aman untuk membantu kerja antioksidan endogen dalam menangkap radikal bebas. Antioksidan eksogen dapat berupa antioksidan alami maupun antioksidan sintetik. Akhir-akhir ini diketahui bahwa beberapa senyawa antioksidan sintetik seperti butylated hydroxy anisole (BHA) dan butylated hydroxy toluene (BHT) telah diragukan keamanannya karena memiliki efek samping yang besar misalnya menyebabkan kerusakan hati. Hal tersebut mendorong tahap pengembangan antioksidan ke arah bahan-bahan alami yang diyakini mempunyai jaminan keamanan yang lebih tinggi karena memiliki efek samping yang minimal (Kikuzaki and Nakatani, 1993 cit Hertiani et al., 2001). Salah satu sumber antioksidan alami adalah teh hijau, yang merupakan bahan minuman hasil pengolahan tanaman teh (Camellia sinensis L.). Ekstrak teh mempunyai kemampuan yang kuat dalam menangkap ROS (Rohdiana, 2001). Kandungan zat kimia yang paling banyak dalam teh hijau adalah senyawa polifenol yaitu sekitar 30 % (Oki, 1996 cit Handajani, 2002). Aktivitas antioksidan teh hijau disebabkan oleh senyawa polifenol tersebut, terutama golongan flavonoid tipe flavanol (komponen katekin yang terdiri dari: epigalokatekin galat (EGCG), epikatekin galat (ECG), epigalokatekin (EGC) dan


epikatekin (EC)) dan tipe flavonol (kuersetin, kemferol, dan mirisetin). Berdasarkan hal tersebut, dalam penelitian ini ekstraksi dititikberatkan pada penyarian senyawa flavonoid dalam teh hijau. Aktivitas antioksidan flavonoid teh hijau disebabkan oleh adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Saat bereaksi dengan radikal bebas (dalam hal ini radikal hidroksil), flavonoid akan membentuk radikal bebas baru yang lebih stabil, sehingga fase propagasi dari radikal hidroksil dapat dihambat (Cuvelier et al., 1991 cit Rohdiana, 2001). Pada penelitian ini teh hijau diekstraksi dengan alkohol (etanol 70 %) untuk menyari flavonoid secara optimal. Ekstrak etanol yang didapat kemudian difraksinasi dengan kloroform untuk menghilangkan lemak dan klorofil yang dapat mengganggu analisis (Markham, 1988). Fraksinasi berikutnya dilakukan menggunakan etil asetat untuk memisahkan flavonoid yang berbentuk aglikon dan flavonoid yang terikat dengan gula (bentuk glikosida) (Robinson, 1995). Proses fraksinasi tersebut menghasilkan fraksi etil asetat dan fraksi air. Berdasarkan sifat kelarutan

sesuai

dengan

strukturnya,

flavonoid

dalam

bentuk

aglikon

dimungkinkan terdistribusi ke dalam fraksi etil asetat dan flavonoid dalam bentuk glikosida terdistribusi ke dalam fraksi air. Kandungan polifenol terutama flavonoid dalam kedua fraksi tersebut akan memberikan aktivitas penangkapan radikal hidroksil. Penelitian ini difokuskan untuk mengetahui aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh masing-masing fraksi. Belum dapat diketahui dengan pasti komponen apa saja yang ada dalam fraksi etil asetat maupun fraksi air karena


tidak dilakukan uji kualitatif secara lengkap maupun pemisahan menjadi senyawa tunggal terhadap fraksi etil asetat dan fraksi air tersebut. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode deoksiribosa. Metode ini dipilih dengan alasan menggunakan deoksiribosa sebagai substrat yang akan diserang radikal hidroksil. Diketahui bahwa deoksiribosa merupakan gugus gula penyusun Deoxyribo Nucleic Acid (DNA) sehingga dapat memberi gambaran penyerangan radikal hidroksil di dalam tubuh. Selain itu, metode tersebut telah divalidasi untuk menguji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh suatu senyawa antioksidan, seperti vitamin C (Purwantoko, 2006). Dalam metode tersebut, deoksiribosa diserang oleh radikal hidroksil menghasilkan produk degradasi yang apabila direaksikan dengan asam tiobarbiturat dalam suasana asam dan dengan pemanasan akan menjadi suatu kromogen berwarna merah muda (pink). Kromogen ini dapat diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometri visibel pada panjang gelombang 532 nm (Halliwell et al., 1987). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau melalui uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa, dan untuk mengetahui nilai aktivitas penangkapannya. Aktivitas antioksidan yaitu kemampuan masing-masing fraksi dalam menangkap radikal hidroksil dinyatakan dalam % scavenging. Nilai aktivitas antioksidan dinyatakan sebagai konsentrasi yang diperlukan untuk menangkap radikal hidroksil sebanyak 50 % (effective scavenging 50 (ES50)).


B. Perumusan Masalah 1. Apakah fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau mempunyai aktivitas antioksidan melalui uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan dengan % scavenging? 2. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau melalui uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa, yang dinyatakan sebagai effective scavenging 50 (ES5 0)?

C. Keaslian Penelitian Telah dilakukan beberapa penelitian tentang uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa yaitu validasi metode deoksiribosa sebagai uji penangkapan radikal hidroksil oleh vitamin C secara in vitro (Purwantoko, 2006); uji penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak teh hitam dengan metode deoksiribosa (Setyawati, 2007). Uji antioksidan melalui penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa

yang

dilakukan

berbeda

dengan

penelitian

sebelumnya.

Perbedaannya terletak pada sampel yang digunakan, yaitu fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau. Berdasarkan hal tersebut sejauh pengamatan penulis, uji antioksidan fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau melalui penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa belum pernah dilakukan.


D. Manfaat Penelitian 1. Manfaat teoritis Melengkapi bukti-bukti ilmiah tentang aktivitas antioksidan ekstrak etanol teh hijau terutama dari fraksi etil asetat dan fraksi air. 2. Manfaat metodologis Memberikan informasi mengenai aplikasi penggunaan metode deoksiribosa sebagai uji antioksidan untuk bahan-bahan alam yang mengandung banyak senyawa. 3. Manfaat praktis Memberikan tambahan informasi kepada masyarakat mengenai penggunaan teh hijau sebagai sumber antioksidan alami.

E. Tujuan Penelitian Berdasarkan latar belakang dan permasalahan yang ada, maka penelitian ini bertujuan untuk: 1. Mengetahui aktivitas antioksidan fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau melalui uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan dengan % scavenging. 2. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau melalui uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa, yang dinyatakan sebagai effective scavenging 50 (ES50 ).


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Teh Hijau

1. Klasifikasi teh dan proses pengolahannya Teh hijau berasal dari tanaman teh yaitu dari suku Theacheae dengan nama ilmiah Camellia sinensis L. (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1991). Komoditas teh dihasilkan dari pucuk daun tanaman teh melalui proses pengolahan tertentu. Secara umum berdasarkan cara/proses pengolahannya, teh dapat diklasifikasikan menjadi tiga jenis, yaitu teh hijau, teh oolong, dan teh hitam. Teh hijau dibuat dengan cara menginaktivasi enzim oksidase/fenolase yang ada dalam pucuk daun teh segar, dengan cara pemanasan atau penguapan, sehingga oksidasi enzimatik terhadap katekin dapat dicegah. Teh hitam dibuat dengan cara memanfaatkan terjadinya oksidasi enzimatis terhadap kandungan katekin teh. Teh oolong dihasilkan melalui proses pemanasan yang dilakukan segera setelah proses rolling/penggulungan daun, dengan tujuan untuk menghentikan proses fermentasi (Hartoyo, 2003).

2. Kandungan kimia teh hijau Zat kimia yang terkandung dalam teh hijau adalah polifenol 30 % (katekin 0,10 %; epikatekin 0,54 %; epigalokatekin 6,35 %; epikatekin galat 1,08 %; epigalokatekin galat 3,53 %, mirisetin 1,59 %; kuersetin 4,05 %; kemferol

7


3,31 %), kafein 4 %, gula dan getah 3 %, asam amino 7 %, mineral 4 %, protein 16 %, lemak 8 %, klorofil dan pigmen 1,5 %, pati 0,5 %, serat kasar, lignin, dan lain-lain 22% (Indrawati dan Devijanti, 1996 cit Handajani, 2002).

3. Khasiat teh hijau Teh hijau berkhasiat sebagai antioksidan, antimutagenik, antibakteri, hipokolesterolemik, dan pencegah kanker (Hartoyo, 2003).

B. Flavonoid 1. Pengertian flavonoid Flavonoid adalah senyawa polifenol yang mengandung 15 atom karbon dalam inti dasarnya, yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6 yaitu dua cincin aromatik yang dihubungkan oleh satuan tiga karbon yang dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga. Untuk mempermudah, cincin diberi tanda A, B, dan C (gambar 1). Atom karbon dinomori menurut sistem penomoran yang menggunakan angka biasa untuk cincin A dan C, serta angka beraksen untuk cincin B, tetapi khusus untuk khalkon, sistem penomorannya dimodifikasi (Markham, 1988). 3' 2'

8 7

(8a) 9

5'

2 1' 6'

C

A

4'

B

1 O

3

6 5

10 (4a)

4 O

Gambar 1 . Kerangka dasar flavonoid beserta penomorannya


2. Flavonoid dalam teh hijau Zat bioaktif yang ada dalam teh, terutama merupakan polifenol golongan flavonoid yaitu flavanol tipe katekin dan flavonol (Hartoyo, 2003). Komponen katekin teh yang utama (gambar 2) adalah epigalokatekin galat (EGCG), epikatekin galat (ECG), epigalokatekin (EGC), dan epikatekin (EC) (Hartoyo, 2003). Keempat komponen katekin tersebut merupakan antioksidan utama dalam teh hijau (Rohdiana, 2001). OH

3' 1

8

HO

1'

O

8a

OH

4'

2'

Epikatekin: R1 = R2 = H Epigalokatekin: R1 = OH, R2 = H Epikatekin galat: R 1 = H, R2 = X Epigalokatekin galat: R1 = OH, R2 = X

5'

2

7

R1

6' 3

6

4a

5

OR2

4 OH

OH

3' 4'

2' 1

8

HO

8a

O

1'

OH

Katekin: R1 = R2 = H Galokatekin: R1 = OH, R2 = H Katekin galat: R 1 = H, R2 = X Galokatekin galat: R1 = OH, R2 = X

5'

2

7

R1

6' 3

6

4a

5

4

OR2

OH

O

X=

OH

OH

C

OH

Gambar 2 . Struktur kimia katekin teh dan epimernya

Flavonol utama yang ada dalam teh adalah kuersetin, kemferol, dan mirisetin (gambar 3). Flavonol ini, terutama terdapat dalam bentuk glikosidanya


(berikatan dengan molekul gula) dan sedikit dalam bentuk aglikonnya (Hartoyo, 2003). R2

3' 4'

2' 1

8

HO

8a

O

1'

5'

2

7

6' 3

6

4a

5 OH

4

OH

R3

Mirisetin Kuersetin Kemferol

: R1 = R2 = R3 = OH : R1 = R2 = OH, R3 = H : R1 = OH, R2 = R3 = H

R1

O

Gambar 3. Struktur flavonol teh

3. Sifat antioksidan flavonoid Flavonoid merupakan senyawa pereduksi yang baik dan banyak menghambat reaksi oksidasi dan bertindak sebagai penangkap radikal yang baik dari radikal hidroksil dan superoksida (Robinson, 1995). Flavonoid memiliki potensial reduksi rendah (0,23 < E7 < 0,75) sehingga dapat mereduksi secara termodinamik radikal bebas dengan potensial oksidasi sebesar 2,13-1,0 V (Siswono, 2003). Aktivitas sebagai antioksidan dimiliki oleh sebagian besar flavonoid disebabkan oleh adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Ketika bereaksi dengan radikal bebas, flavonoid membentuk radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi inti aromatik. Hal ini menyebabkan fase propagasi pada reaksi radikal bebas tersebut dapat dihambat (Cuvelier et al., 1991 cit Rohdiana, 2001).


4. Penyarian Flavonoid Pelarut-pelarut alkoholik umumnya merupakan pelarut pilihan untuk mengekstraksi semua golongan flavonoid. Biasanya digunakan metanol, etanol, dan propanol. Bahan-bahan segar dapat diekstraksi dengan pelarut alkohol absolut. Bahan-bahan kering dan berkayu dapat digunakan alkohol berair (Harborne, 1987). Glikosida flavonoid kurang larut dalam pelarut organik dan lebih mudah larut dalam air dibanding bentuk aglikonnya. Pengekstraksian kembali larutan dalam air dengan pelarut organik yang tidak bercampur dengan air tetapi agak polar sering kali bermanfaat untuk memisahkan bentuk aglikon dari senyawa yang lebih polar. Etil asetat merupakan pelarut yang baik untuk menangani katekin dan proantosianidin dengan cara ini (Robinson, 1995).

C. Metode Penyarian

Metode penyarian ada beberapa macam: 1. Maserasi dan remaserasi Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana, dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Pada saat proses maserasi, cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang pekat didesak keluar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Maserasi


umumnya digunakan untuk simplisia yang tidak keras, dan tidak kompak (Anonim, 1986). Remaserasi adalah modifikasi cara penyarian maserasi. Pada proses remaserasi cairan penyari dibagi 2. Seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah dienap tuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari yang kedua (Anonim, 1986).

2. Perkolasi Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Aliran cairan penyari menyebabkan adanya pergantian larutan yang mempunyai konsentrasi tinggi dengan larutan yang konsentrasinya lebih rendah sehingga akan meningkatkan derajat konsentrasi. Perkolasi umumnya digunakan untuk menyari simplisia keras dan kompak (Anonim, 1986).

3. Infundasi Infundasi adalah metode penyarian yang menggunakan penyari air dengan pemanasan pada suhu 90 ºC selama 15 menit. Metode ini digunakan untuk menyari simplisia yang larut dalam air dan tahan terhadap pemanasan (Anonim, 1986).


4. Penyarian berkesinambungan Pada metode penyarian ini cairan penyari dididihkan sehingga akan menguap dan mengembun karena adanya pendingin. Cairan penyari yang mengembun akan turun membasahi simplisia, demikian seterusnya. Metode penyarian ini sesuai untuk simplisia yang bahan aktifnya tahan terhadap pemanasan (Anonim, 1986).

D. Radikal Hidroksil (HO•) 1. Pengertian radikal hidroksil Radikal hidroksil (HO •) adalah radikal oksigen yang diketahui paling reaktif. Radikal hidroksil memilki standar potensial reduksi positif yang tinggi yaitu 2,31 V. Radikal hidroksil bereaksi sangat cepat dengan hampir semua tipe molekul yang ditemukan dalam sel hidup seperti gula, asam amino, fosfolipid, basa Deoxyribose Nucleic Acid (DNA), dan asam organik (Halliwell dan Gutteridge, 1999). Karena sangat reaktif, efek radikal ini hanya berlangsung di daerah yang dekat dengan tempat terbentuknya, dan dalam kondisi fisiologik normal tidak ditemukan radikal hidroksil dalam kadar yang besar (Gitawati, 1995). 2. Pembentukan radikal hidroksil Radikal hidroksil dapat dihasilkan dari reaksi fisi homolitik ikatan O-O pada H2O2 yang dapat terjadi karena pengaruh panas atau radiasi ionisasi. Selain itu, radikal hidroksil juga dapat terbentuk dari H2O2 dengan adanya ion-ion logam (Fe2+, Cu+ ) menurut reaksi Fenton (Gitawati, 1995).


Reaksi Fenton merupakan reaksi yang penting untuk menghasilkan radikal bebas hidroksil. Dalam reaksi Fenton ion ferro (Fe2+ ) akan bereaksi dengan hidrogen peroksida (H2O2) menghasilkan radikal hidroksil. Kecepatan reaksi Fe2+ dengan H2O2 adalah rendah yaitu kurang dari 100 M -1s-1, oleh karena itu untuk meningkatkan kecepatan reaksinya perlu ditambah dengan suatu ligan. EDTA merupakan ligan yang baik untuk digunakan dalam reagen Fenton (Halliwell dan Gutteridge, 1999).

3. Metode deteksi radikal hidroksil Macam-macam metode dan prinsip deteksi radikal hidroksil dapat dilihat pada tabel I di bawah ini: Tabel I. Metode dan prinsip deteksi radikal hidroksil (Bors et al., 1979) No

Metode

Prinsip Metode

1.

Metode pemucatan pnitrosodimetilanilin (p-NDA)

p-nitrosodimetilanilin bereaksi cepat dengan radikal hidroksil (HO•) tetapi tidak bereaksi dengan O 2- atau singlet oksigen. Reaksi ini akan diikuti pengurangan warna kuning (pemucatan).

2.

Metode deoksiribosa

Reaksi antara radikal hidroksil dengan deoksiribosa menghasilkan produk senyawa tertentu, lalu dipanaskan dengan tiobarbiturat pada pH rendah akan menghasilkan warna.

3.

Metode triptofan

Reaksi antara radikal hidroksil dengan triptofan menghasilkan satu set produk yang khas.

4.

Metode dimetilsulfoksida (DMSO)

Radikal hidroksil bereaksi dengan dimetilsulfoksida (DMSO) menghasilkan senyawa: OH H3C

S

C H3

O

Perubahan senyawa di atas menghasilkan produkproduk antara lain gas metana yang dapat dideteksi dengan Gas Liquid Chromatography.


E. Metode Deoksiribosa Deoksiribosa (2-deoksi-D-ribosa) merupakan unsur gula lima karbon yang terdapat dalam DNA (Page, 1989). Deoksiribosa dapat didegradasi oleh radikal hidroksil baik yang dihasilkan oleh radiasi maupun oleh reaksi Fenton (Halliwell et al., 1987). Struktur deoksiribosa dapat dilihat pada gambar 4 berikut:

Gambar 4. Struktur deoksiribosa

Metode deoksiribosa terdiri dari dua tahap, yaitu (Halliwell et al., 1987): 1. Tahap pembentukan radikal hidroksil. Radikal hidroksil dihasilkan dari reaksi Fenton dengan inkubasi pada 37

ºC selama 30 menit. Reagen Fenton terdiri dari FeCl 3, EDTA, H2O2, dan asam askorbat (vitamin C). Reaksi pembentukan radikal hidroksil digambarkan sebagai berikut: Fe3+ - EDTA + vitamin C → Fe2+ - EDTA + vitamin Cteroksidasi Fe2+ - EDTA + H 2O2 → Fe3+ - EDTA + OH¯+ HO• Penambahan EDTA (sebagai ligan) berfungsi untuk meningkatkan konstante kecepatan reaksi antara Fe2+ dengan H2O2 (Halliwell dan Gutteridge,


1999). Vitamin C (asam askorbat) berfungsi untuk mempercepat proses reduksi Fe3+ menjadi Fe2+ sehingga akan mempercepat terbentuknya radikal hidroksil. 2. Tahap degradasi deoksiribosa Penyerangan radikal hidroksil terhadap deoksiribosa akan menyebabkan deoksiribosa terdegradasi menjadi beberapa produk karbonil. Radikal hidroksil akan menyerang deoksiribosa dengan cara abstraksi (pemisahan) hidrogen dan membentuk suatu radikal deoksiribosa (gambar 5) yang dengan adanya oksigen akan secara cepat diubah menjadi radikal gula peroksil (gambar 6).

HO

HO O

H2 C

O

+ HO

H

HO

_ H O 2

O

H 2C

O H

H

HO

Deoksiribosa

Gambar 5. Reaksi penyerangan radikal hidroksil pada deoksiribosa

HO

HO O

H 2C

O

O

H2C

O

H

H

+ HO

O O HO

OO

Radikal Gula Peroksil

Gambar 6. Reaksi pembentukan radikal gula peroksil

Selanjutnya, radikal gula peroksil ini akan mengalami serangkaian reaksi yang meliputi disproporsionasi, penataan ulang, eliminasi air, dan pemecahan


ikatan C–C sehingga menghasilkan beberapa macam produk karbonil. Produk karbonil yang dihasilkan jika dipanaskan di bawah kondisi asam akan membentuk malondialdehid (MDA) (gambar 7). O

O

H

H

Gambar 7 . Struktur malondialdehid (MDA)

MDA dapat dideteksi melalui kemampuannya untuk bereaksi dengan asam tiobarbiturat (TBA) membentuk suatu kromogen berwarna merah muda (pink) yang absorbansinya dapat diukur pada panjang gelombang 532 nm (Halliwell et al., 1987). Molekul lain yang memiliki kemampuan untuk bereaksi dengan radikal hidroksil dapat ditambahkan ke dalam campuran tersebut. Molekul ini dapat berkompetisi dengan deoksiribosa supaya dapat bereaksi dengan radikal hidroksil. Hal ini sangat bergantung dari konstante kecepatan reaksinya dengan radikal hidroksil dan juga konsentrasi relatif deoksiribosa. Jika kecepatan reaksi molekul ini lebih cepat dibandingkan kecepatan reaksi deoksiribosa dengan radikal hidroksil, maka molekul ini dapat berfungsi untuk menurunkan kecepatan degradasi deoksiribosa (Halliwell et al., 1987).

F. Antioksidan Dalam bidang kimia yang dimaksud dengan antioksidan adalah suatu senyawa atau bahan kimia yang dapat menghambat proses oksidasi. Pada umumnya senyawa-senyawa tersebut merupakan suatu reduktan, yakni atom atau senyawa yang menyumbangkan elektron (Himawati, 2001).


Dalam bidang kedokteran, pengertian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah senyawa-senyawa yang dapat melindungi sistem biologis terhadap efek yang merusak dari proses-proses atau reaksi-reaksi yang dapat menyebabkan oksidasi berlebihan (Krinsky, 1992 cit Himawati, 2001). Oleh karena itu, pembagian antioksidan biologis tidak hanya meliputi senyawa-senyawa reduktan, melainkan bisa meliputi pengikat logam dan enzim-enzim tertentu yang mengkatalisis peredaman senyawa oksidan atau radikal bebas. Antioksidan dan peredam radikal bebas biologis dapat digolongkan sebagai berikut (Grieb, 1992 cit Himawati, 2001): 1. Berdasarkan sasaran a.

Antioksidan

pencegah,

yaitu

antioksidan

yang

dapat

mencegah

terbentuknya oksidan atau mencegah tertimbunnya oksidan. Misalnya: superoksida

dismutase

(SOD),

katalase,

bermacam-macam

enzim

peroksidase (misalnya glutation peroksidase), dan senyawa yang mengandung gugusan sulfidril (glutation, sistein, dan kaptopril). b.

Antioksidan pemutus reaksi rantai, misalnya: vitamin E (tokoferol), vitamin C (asam askorbat), dan β-karoten.

2. Berdasarkan mekanisme kerja a. Antioksidan enzimatik, misalnya: katalase (CAT), superoksida dismutase (SOD), dan glutation peroksidase (GSH-Px). b. Antioksidan non-enzimatik, misalnya: vitamin E (α-tokoferol), vitamin C (asam askorbat), dan β-karoten.


3. Berdasarkan sifat-sifat fisiko-kimia a. Antioksidan hidrofilik Antioksidan hidrofilik bekerja dalam sitosol dan cairan ekstrasel, misalnya: vitamin C, asam urat, glutation, sistein, kreatinin. b. Antioksidan lipofilik Antioksidan lipofilik bekerja pada membran sel (terlarut dalam lipid membran), misalnya: vitamin E, β-karoten, ubikuinol, bilirubin, protein pengikat logam (transferin, laktoferin, seruloplasmin, dan albumin).

4. Berdasarkan sumbernya a. Antioksidan endogen Beberapa antioksidan endogen yang dikenal antara lain: sitokrom oksidase (mitokondria), superoksida dismutase, katalase, glutation peroksidase. b. Antioksidan eksogen Antioksidan eksogen yang telah dikenal dan beredar di pasaran diantaranya: vitamin E, vitamin C, β-karoten. Penangkapan radikal bebas oleh enzim dan senyawa antioksidan dapat dilakukan melalui empat cara, yaitu (Aruoma, 2000): 1. Reaksi pemecahan ikatan. 2. Mengurangi konsentrasi ROS, sebagai contoh adalah glutation. 3. Menangkap radikal bebas, contohnya adalah enzim superoksida dismutase menangkap radikal bebas superoksid. 4. Mengkelat katalis logam transisi.


G. Spektrofotometri Sinar Tampak Spektrofotometri adalah metode analisis yang mengamati interaksi radiasi elektromagnetik dengan materi. Spektrofotometri memiliki beberapa ciriciri, yaitu dapat digunakan pada sistem organik dan anorganik, memiliki selektivitas sedang sampai tinggi, akurasinya baik, dan mudah dilakukan (Skoog et al., 1998). Spektrofotometri yang menggunakan radiasi dengan panjang gelombang 380 nm sampai 780 nm disebut spektrofotometri cahaya tampak (Anonim, 1995). Pada umumnya prinsip kerja spektrofotometri adalah berdasarkan atas interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan materi (dapat berupa atom, ion, atau molekul), sedangkan radiasi elektromagnetik merupakan salah satu jenis energi yang ditransmisikan dalam ruang kecepatan tinggi (Khopkar, 1990). Interaksi radiasi elektromagnetik dengan materi yaitu bila cahaya jatuh pada senyawa maka sebagian dari cahaya diserap oleh molekul-molekul sesuai struktur molekul (Sastrohamidjojo, 1991). Absorbsi cahaya ultraviolet atau cahaya tampak mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi elektron-elektron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi berenergi lebih tinggi (Fessenden dan Fessenden, 1994). Transisi elektronik senyawa organik yang dapat terjadi yaitu transisi dari orbital σ→ σ*, π→ π*, n → σ*, dan n → π* yang ditunjukkan oleh gambar 8 berikut:


σ* π*

Antibonding Antibonding

n π

Nonbonding Bonding

σ

Bonding

Gambar 8. Tingkat energi elektron molekul (Skoog et al., 1998)

Aplikasi spektroskopi serapan untuk senyawa organik didasarkan pada transisi n atau πke π* karena energi yang dibutuhkan untuk proses ini membawa puncak absorbsi ke daerah spektra 200-700 nm. Kedua transisi ini membutuhkan gugus tidak jenuh yang memberikan orbital π(Skoog et al., 1994). Spektrofotometri

dapat

digunakan untuk

analisis

kualitatif

dan

kuantitatif. Oleh karena transisi elektronik ditentukan oleh konfigurasi elektron dari molekul yang bersangkutan, maka transisi ditentukan oleh struktur molekul. Oleh sebab itu, molekul yang berbeda strukturnya juga mempunyai level energi yang berbeda dan setiap jenis molekul menyerap radiasi pada daerah spektrum tertentu. Hal inilah yang menjadi dasar analisis kualitatif dengan metode spektrofotometri. Banyaknya cahaya yang diserap pada frekuensi atau panjang gelombang tertentu sesuai dengan jumlah molekul yang ada. Hal ini menentukan banyaknya intensitas absorbsi yang merupakan dasar analisis kuantitatif pada analisis dengan metode spektrofotometri (Willard et al., 1988). Intensitas serapan dapat dinyatakan sebagai transmitan (T) yang didefinisikan sebagai berikut:

T I Io


I0 adalah intensitas dari energi pancaran yang mengenai cuplikan dan I adalah intensitas pancaran yang keluar dari cuplikan. Rumusan yang lebih tepat untuk intensitas serapan adalah yang diturunkan dari hukum Lambert dan hukum Beer yang dikenal dengan hukum Lambert-Beer. Hukum ini menyatakan hubungan antara transmitan dengan tebalnya cuplikan dan konsentrasi bahan penyerap. Hubungan tersebut dinyatakan sebagai berikut: A log

I0  .c.b I

Keterangan : T = persen transmitan I0 = intensitas radiasi yang datang I = intensitas radiasi yang diteruskan ε= absorptivitas molar (L.mol-1.cm-1) c = konsentrasi larutan (mol. L-1) b = tebal larutan (cm) A= absorbansi (Silverstein, 1991)

H. Landasan Teori Teh hijau diketahui mengandung sekitar 30 % polifenol terutama golongan flavonoid tipe flavanol dan flavonol. Polifenol golongan flavonoid tersebut menyebabkan teh hijau mempunyai aktivitas antioksidan melalui mekanisme penangkapan radikal bebas. Secara umum aktivitas antioksidan flavonoid disebabkan oleh adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Saat bereaksi dengan radikal


hidroksil, senyawa ini akan membentuk molekul air yang stabil dan radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi inti aromatik yaitu radikal fenoksil yang lebih stabil, sehingga fase propagasi radikal hidroksil tersebut dapat dihambat. Selain itu, flavonoid mempunyai potensial reduksi yang sangat rendah yaitu 0,23 0,75, sedangkan radikal hidroksil mempunyai potensial reduksi yang sangat tinggi, yaitu 2,31 V. Hal ini menyebabkan flavonoid dapat mereduksi radikal hidroksil menjadi bentuk yang lebih stabil dengan mudah. Ekstraksi teh hijau menggunakan etanol akan menyari flavonoid secara efektif, sehingga ekstrak etanol yang didapat akan mengandung flavonoid dalam jumlah yang optimal. Fraksinasi dengan kloroform akan menghilangkan lemak dan klorofil yang akan mengganggu analisis serta mengurangi jumlah senyawa lain seperti alkaloid, terpena, dan xantofil, sedangkan fraksinasi menggunakan etil asetat akan memisahkan flavonoid yang berbentuk aglikon dan flavonoid yang terikat dengan gula (bentuk glikosida). Berdasarkan uji polifenol pada uji tabung yang dilakukan oleh Pertiwi (2006) diketahui bahwa fraksi etil asetat dan fraksi air menunjukkan hasil yang positif. Hal ini mengindikasikan bahwa kedua fraksi tersebut mengandung polifenol. Telah disebutkan bahwa polifenol utama dalam teh hijau adalah dari golongan flavonoid. Dengan demikian, kedua fraksi tersebut mungkin mengandung flavonoid. Berdasarkan sifat kelarutannya, flavonoid dalam bentuk aglikon (seperti senyawa flavanol terutama komponen katekin) akan lebih terdistribusi ke dalam fraksi etil asetat, sedangkan flavonoid bentuk glikosida (seperti glikosida flavonoid dengan aglikon flavonol) akan lebih terdistribusi ke


dalam fraksi air. Diketahui bahwa aktivitas antioksidan utama teh hijau berasal dari kelas flavanol yaitu dari komponen katekin yang pada fraksinasi akan lebih terdistribusi ke dalam fraksi etil asetat. Hal ini memungkinkan aktivitas antioksidan fraksi etil asetat akan lebih besar dari fraksi air. Dalam metode deoksiribosa digunakan gula deoksiribosa sebagai substrat yang ditargetkan akan diserang oleh radikal hidroksil. Jika ada senyawa lain yang bersifat sebagai antioksidan dan mempunyai kemampuan dalam menangkap radikal hidroksil (seperti flavonoid) dimasukkan ke dalam sistem, maka senyawa tersebut akan mengurangi produk degradasi deoksiribosa. Hal ini dikarenakan senyawa tersebut akan menangkap sebagian radikal hidroksil yang akan menyerang deoksiribosa. Efek penangkapan radikal hidroksil oleh senyawa tersebut diperlihatkan dengan berkurangnya absorbansi kromogen MDA-TBA yang terbentuk.

I. Hipotesis Berdasarkan landasan teori di atas, dapat dihipotesiskan bahwa: 1. Fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau mempunyai aktivitas

antioksidan

melalui

uji

penangkapan

radikal

hidroksil

menggunakan metode deoksiribosa. 2. Aktivitas antioksidan melalui penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa fraksi etil asetat lebih besar dari fraksi air.


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental karena subyek uji diberi perlakuan.

B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat dan fraksi air dari ekstrak etanol teh hijau. 2. Variabel tergantung berupa persen penangkapan radikal hidroksil (% scavenging). 3. Variabel pengacau terkendali berupa proses ekstraksi dan fraksinasi, suhu, waktu inkubasi, dan merk sampel. 4. Variabel pengacau tidak terkendali berupa proses pembuatan teh hijau.

C. Definisi Operasional 1. Fraksi etil asetat adalah fase etil asetat yang diperoleh dari fraksinasi (dengan corong pisah) ekstrak etanol teh hijau menggunakan larutan penyari etil asetat dan air sampai fraksi etil asetat jernih. 2. Fraksi air adalah fase air yang diperoleh dari fraksinasi (dengan corong pisah) ekstrak etanol teh hijau menggunakan larutan penyari etil asetat dan air sampai fraksi etil asetat jernih.

25


3. Ekstrak etanol teh hijau adalah ekstrak yang diperoleh dari remaserasi serbuk teh hijau menggunakan etanol 70 %. 4. Larutan kontrol adalah larutan yang mengandung reagen Fenton, larutan deoksiribosa, bufer fosfat, asam trikloroasetat, dan asam tiobarbiturat. 5. Larutan sampel adalah larutan kontrol yang diberi fraksi etil asetat dan fraksi air dari ekstrak etanol teh hijau sebagai senyawa antioksidan. 6. Persen scavenging adalah persentase yang menyatakan kemampuan suatu senyawa dalam menangkap radikal bebas. % Scavenging =

Absorbansi larutan kontrol- Absorbansi larutan sampel x 100 % Absorbansi larutan kontrol

7. Effective Scavenging 50 (ES50) merupakan nilai konsentrasi sampel yang menghasilkan 50 % penangkapan radikal hidroksil.

D. Bahan Bahan-bahan berikut berkualitas p.a. Merck: kloroform; etil asetat; ferri klorida heksahidrat (FeCl3. 6H2O); dinatrium etilendiamin tetraasetat dihidrat (C10H14N2Na2O8. 2H2O); L (+) asam askorbat.; asam 2-tiobarbiturat (TBA) (C4H4N2O2S); asam trikloroasetat (TCA) (CCl 3COOH); dinatrium hidrogen fosfat (Na2HPO4); kalium dihidrogen fosfat (KH 2PO4). Bahan-bahan yang lain: teh hijau merk X; etanol 96 % kualitas farmasetis (Brataco); 2-deoksi-D-ribosa (C5 H10O4) p.a., Sigma USA; larutan hidrogen peroksida 30 % kualitas farmasetis, ph. Eur, BP, USP; dan akuades (Laboratorium Kimia Organik Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta).


E. Alat Spektrofotometer UV-Vis Perkin Elmer Lamda 20; pH meter Metrohm 632; timbangan BP 160 P, scaltec SBC 22, dan precision balance model GB-3002 (Mettler Toledo); mikropipet 10-100 l, 100-1000 l (Acura 825, Socorex); mikropipet 0,5-5,0 ml (Socorex); tabung reaksi bertutup (Pyrex-Germany); vaccum rotaevaporator (Buchi rotaevaporator); waterbath (Abo-Tech); blender, dan alat-alat gelas yang lazim.

F. Tata Cara Penelitian 1. Pengambilan sampel Diambil 100 bungkus sampel teh hijau merk X dari satu perusahaan teh di Yogyakarta dengan nomor batch yang sama. Seluruh sampel kemudian diambil 80 % (80 bungkus) berdasarkan tabel Krecjie (Sugiyono, 2005). Pengambilan sampel dilakukan secara acak menggunakan random numbers table (lampiran 8).

2. Pembuatan serbuk teh hijau Diambil 20 bungkus (1800 g) teh hijau, dihomogenkan, digiling dan dihaluskan menggunakan blender. Serbuk yang didapat kemudian diayak dengan ayakan nomor mesh 12 sampai 50 (derajat halus serbuk 4/18). Serbuk yang digunakan adalah serbuk yang berada di atas ayakan nomor mesh 50 dan di bawah ayakan nomor mesh 12.


3. Preparasi sampel a. Pembuatan ekstrak etanol teh hijau Pembuatan fraksi etil asetat dan fraksi air diawali dengan pembuatan ekstrak etanol teh hijau menggunakan metode penyarian remaserasi (Anonim, 1986). Serbuk teh hijau sebanyak 300 g dimaserasi dengan cara direndam dalam 1 liter etanol 70 % selama 24 jam di dalam bejana bertutup. Maserat yang didapat disaring, filtrat dikumpulkan. Ampas dimaserasi lagi dengan 500 ml etanol 70 % selama 24 jam, kemudian disaring, filtrat dikumpulkan, ampas dimaserasi lagi, demikian seterusnya sampai filtrat hasil penyaringan jernih. Seluruh filtrat hasil remaserasi dicampur dan diuapkan pelarutnya dengan rotaevaporator sampai kental. Ekstrak kental yang didapat diuapkan di atas penangas air hingga diperoleh ekstrak kering.

b. Pembuatan fraksi etil asetat dan fraksi air Ekstrak etanol kering hasil remaserasi ditimbang sebanyak 75 g dan dilarutkan dalam 150 ml air, kemudian difraksinasi dengan 100 ml kloroform menggunakan corong pisah, dengan pengulangan 6 kali. Fraksi air (A1) yang didapat kemudian dikumpulkan dan difraksinasi dengan 50 ml etil asetat menggunakan corong pisah dengan pengulangan 12 kali sampai fraksi etil asetat jernih untuk mendapatkan jumlah senyawa terlarut dalam fraksi etil asetat yang optimum. Fraksi etil asetat dan fraksi air (A2) yang diperoleh kemudian dikumpulkan, lalu diuapkan menggunakan rotaevaporator hingga kental. Sisa penguapan diuapkan lagi di atas waterbath hingga kering, lalu disimpan dalam


desikator. Serbuk yang diperoleh kemudian ditimbang, dihitung rendemennya, dan digunakan sebagai sampel untuk uji penangkapan radikal hidroksil menggunakan metode deoksiribosa. Proses preparasi sampel dapat dilihat pada gambar 9. 300 g serbuk teh hijau

Dimaserasi dengan 1000 ml etanol 70 %, disaring

Filtrat dikumpulkan

Residu dimaserasi dengan 500 ml etanol 70 %, disaring (diulangi sampai filtrat jernih)

Filtrat dikumpulkan Residu dibuang Dievaporasi

Ekstrak kering

Ditimbang 75 g ekstrak kering

Dilarutkan dalam 150 ml air

Difraksinasi dengan 100 ml kloroform (6 kali) Fraksi kloroform

Fraksi air (A1)

Dibuang

Difraksinasi dengan etil asetat 50 ml (12 kali) Fraksi etil asetat

Fraksi air (A2 )

Diuji aktivitas penangkapan radikal hidroksilnya dengan metode deoksiribosa

Gambar 9. Skema tata cara preparasi sampel (ekstraksi dan fraksinasi)


4. Persiapan uji penangkapan radikal hidroksil a. Pembuatan larutan bufer fosfat pH 7,4 Ditimbang seksama sebanyak 1,4196 g Na2HPO4 kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 500,0 ml sehingga dicapai kadar 20 mM. Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,6805 g KH2PO4 kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 250,0 ml sehingga dicapai kadar 20 mM. Kedua larutan tersebut dicampur sampai didapat larutan bufer fosfat dengan pH 7,4.

b. Pembuatan larutan deoksiribosa 2,5 mM Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,02012 g 2-deoksi-D-ribosa, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai kadar 15 mM. Dari larutan tersebut diambil 4,2 ml dan dilarutkan dalam akuades sampai 25,0 ml, sehingga didapat kadar 2,5 mM.

c. Pembuatan reagen Fenton Reagen Fenton yang digunakan terdiri dari FeCl3 1 mM, EDTA 1 mM, H2O2 20 mM, dan Vitamin C 1 mM. 1). Larutan FeCl3 1 mM Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,01352 g FeCl3. 6 H2O, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai kadar 5 mM. Dari larutan tersebut diambil 2,0 ml dan dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml, sehingga diperoleh kadar 1 mM.


2). Larutan EDTA 1 mM Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,01861 g Na2EDTA. 2 H2O, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai kadar 5 mM. Dari larutan tersebut diambil 2,0 ml dan dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml, sehingga diperoleh kadar 1 mM. 3). Larutan H2O2 20 mM Diambil 0,091 ml H2O2 30 %, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai kadar 80 mM. Dari larutan tersebut diambil 2,5 ml dan dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml, sehingga diperoleh kadar 20 mM. 4). Larutan Vitamin C 1 mM Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,01761 g vitamin C, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai kadar 10 mM. Dari larutan tersebut diambil 1,0 ml dan dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml, sehingga diperoleh kadar 1 mM.

d. Pembuatan larutan TCA 5 % Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 1,25 g TCA, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 25,0 ml sehingga dicapai kadar 5 % b/v.

e. Pembuatan larutan TBA 1 % Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,25 g TBA, dimasukkan ke dalam beakerglass 100 ml dan ditambah akuades secukupnya, kemudian


dipanaskan di atas hot plate hingga seluruh TBA larut. Setelah itu, dilarutkan dalam akuades sampai 25,0 ml sehingga dicapai kadar 1 % b/v.

f. Pembuatan larutan uji fraksi etil asetat 1 mg/ml Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 10 mg serbuk fraksi etil asetat, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai konsentrasi 1 mg/ml.

g. Pembuatan larutan uji fraksi air 1 mg/ml Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 10 mg serbuk fraksi air, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai konsentrasi 1 mg/ml.

5. Penentuan operating time (OT) Diambil 600 l larutan deoksiribosa 2,5 mM, dimasukkan dalam tabung reaksi bertutup, kemudian ditambah dengan 300 l FeCl3 1 mM, 300 l EDTA 1 mM, 300 l H2O2 20 mM, 4,2 ml bufer fosfat pH 7,4, dan 300 l vitamin C 1 mM. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37  C selama 30 menit. Setelah itu ditambah 1,0 ml TCA 5 % dan 1,0 ml TBA 1 %, dipanaskan dalam waterbath pada suhu 80  C selama 30 menit sampai terbentuk kromogen MDATBA yang berwarna merah muda, kemudian didinginkan, dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum teoritis (maks teoritis) 532 nm selama 60 menit.


6. Penentuan panjang gelombang maksimum (maks) Diambil 100, 300, dan 600 l larutan deoksiribosa 2,5 mM, dimasukkan dalam tabung reaksi bertutup, kemudian masing-masing ditambah dengan 300 l FeCl3 1 mM, 300 l EDTA 1 mM, 300 l H2O2 20 mM, bufer fosfat pH 7,4 (penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan volume larutan deoksiribosa yang ditambahkan sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml), dan 300 l vitamin C 1 mM. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37  C selama 30 menit. Setelah itu ditambah 1,0 ml TCA 5 % dan 1,0 ml TBA 1 %, dipanaskan dalam waterbath pada suhu 80  C selama 30 menit, sampai terbentuk kromogen MDATBA yang berwarna merah muda, kemudian didinginkan, dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 400-600 nm selama operating time.

7. Pembuatan larutan kontrol Diambil 600 l deoksiribosa 2,5 mM, dimasukkan dalam tabung reaksi bertutup, kemudian ditambah dengan 300 l FeCl3 1 mM, 300 l EDTA 1 mM, 300 l H2O2 20 mM, 4,2 ml bufer fosfat pH 7,4, dan 300 l vitamin C 1 mM. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37  C selama 30 menit. Setelah itu ditambah 1,0 ml TCA 5 % dan 1,0 ml TBA 1 %, dipanaskan dalam waterbath pada suhu 80  C selama 30 menit sampai terbentuk kromogen MDATBA yang berwarna merah muda, kemudian didinginkan, dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi selama operating time.


8. Uji penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat Diambil fraksi etil asetat 1 mg/ml dengan volume 200, 400, 600, 800, dan 1000 l, masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup. Ke dalam tiap-tiap tabung tersebut kemudian ditambah dengan 600 l deoksiribosa 2,5 mM, 300 l FeCl 3 1 mM, 300 l EDTA 1 mM, 300 l H2 O2 20 mM, bufer fosfat pH 7,4 (penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan volume larutan fraksi etil asetat yang ditambahkan sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml), dan 300 l vitamin C 1 mM. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37  C selama 30 menit. Setelah itu ditambah 1,0 ml TCA 5 % dan 1,0 ml TBA 1 %, dipanaskan dalam waterbath pada suhu 80  C selama 30 menit, sampai terbentuk kromogen MDA-TBA yang berwarna merah muda, kemudian didinginkan, dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi selama operating time.

9. Uji penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi air Diambil fraksi air 1 mg/ml dengan volume 200, 400, 600, 800, dan 1000 l, masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup. Kemudian ke dalam tiap-tiap tabung tersebut ditambah dengan 600 l deoksiribosa 2,5 mM, 300 l FeCl3 1 mM, 300 l EDTA 1 mM, 300 l H2O2 20 mM, bufer fosfat pH 7,4 (penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan volume larutan fraksi air yang ditambahkan sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml), dan 300 l vitamin C 1 mM. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37  C selama 30 menit. Setelah itu ditambah 1,0 ml TCA 5 % dan 1,0 ml TBA 1 %, dipanaskan dalam


waterbath pada suhu 80  C selama 30 menit, sampai terbentuk kromogen MDATBA yang berwarna merah muda, kemudian didinginkan, dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi selama operating time.

G. Analisis Data Data yang diperoleh adalah absorbansi senyawa berwarna merah muda hasil reaksi antara produk degradasi deoksiribosa yaitu malondialdehid dengan asam tiobarbiturat (kromogen MDA-TBA). Data absorbansi tersebut kemudian digunakan untuk menghitung persen penangkapan radikal hidroksil (% scavenging), dengan rumus: % Scavenging =

Absorbansi larutan kontrol- Absorbansi larutan sampel x100 % Absorbansi larutan kontrol

Efektivitas penangkapan radikal hidroksil sebesar 50 % (ES50) ditentukan dengan menggunakan persamaan garis regresi linier antara konsentrasi fraksi etil asetat dan konsentrasi fraksi air (sumbu x) dengan % scavenging (sumbu y).


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pengambilan Sampel Sampel dalam penelitian ini diambil dari satu merk teh hijau (merk X) yang berasal dari satu perusahaan teh di Yogyakarta. Pengambilan sampel dari satu merk ini bertujuan untuk mengendalikan kualitas dan kadar senyawa kimia dalam sampel, sehingga variasi kandungan kimia dalam sampel kecil. Selain itu, pengambilan sampel dari satu perusahaan tersebut dimaksudkan untuk memudahkan penelusuran asal-usul sampel dan cara pengolahannya secara jelas sehingga dapat digunakan sebagai penunjang informasi penelitian lebih lanjut. Pengambilan sampel dalam penelitian ini dilakukan secara acak, sehingga setiap bungkus teh hijau mempunyai kesempatan yang sama untuk diambil sebagai sampel. Pengambilan sampel secara acak didasarkan pada random numbers table (lampiran 8) dan mengacu pada tabel Krecjie (Sugiyono, 2005). Jumlah teh hijau yang digunakan adalah 100 bungkus dengan nomor batch yang sama. Berdasarkan tabel Krecjie, pengambilan sampel dari 100 populasi adalah 80 %-nya. Hal ini berarti jika digunakan 100 bungkus teh hijau maka yang diambil sebagai sampel adalah 80 bungkus. Sampel hasil sampling tersebut kemudian dicampur dan secara acak diambil sesuai yang diperlukan (20 bungkus) untuk diserbuk.

36


B. Pembuatan Serbuk Teh Hijau Pembuatan serbuk bertujuan untuk meningkatkan luas permukaan simplisia sehingga akan mengoptimalkan proses penyarian. Sampel teh hijau yang sudah dipilih diserbuk dengan menggunakan blender, kemudian diayak dengan derajat halus serbuk 4/18 menggunakan ayakan dengan nomor mesh 12 sampai 50. Derajat halus serbuk tersebut dipilih berdasarkan ketentuan umum Materia Medika Indonesia (1989) jilid V, yang menyatakan jika tidak dinyatakan lain maka simplisia harus dihaluskan menjadi serbuk 4/18. Nilai 4/18 ini menunjukkan jumlah lubang tiap cm dihitung searah panjang kawat. Konversi derajat halus serbuk ke nomor ayakan dilakukan dengan mengalikannya dengan 1 inci (2,54 cm). Dalam penelitian ini seharusnya digunakan ayakan dengan nomor mesh 10 sampai 45, namun karena keterbatasan alat maka nomor mesh yang digunakan adalah nomor mesh yang mendekati yaitu 12 sampai 50.

C. Preparasi Sampel 1. Pembuatan ekstrak etanol teh hijau Pembuatan fraksi etil asetat dan fraksi air didahului dengan proses penyarian yang dilakukan dengan metode remaserasi (Anonim, 1986). Metode remaserasi dipilih sebagai metode penyarian pada penelitian ini dengan alasan simplisia yang digunakan (dalam hal ini teh hijau) tidak keras, disamping itu metode remaserasi relatif mudah dikerjakan dan membutuhkan peralatan yang sederhana.


Pada penelitian ini penyarian ditujukan untuk mengambil flavonoid dari serbuk teh hijau, karena diketahui bahwa senyawa aktif yang berperan sebagai antioksidan dalam teh hijau adalah flavonoid (Hartoyo, 2003). Digunakan etanol 70 % sebagai pelarut untuk menyari flavonoid dalam serbuk teh hijau, dengan alasan flavonoid teh hijau berada dalam vakuola sel sehingga diperlukan penyari yang bersifat relatif hidrofilik untuk menyarinya. Pelarut alkoholik terutama etanol merupakan pelarut pilihan untuk mengekstraksi flavonoid secara optimal, selain itu etanol tidak beracun, netral, kapang dan kuman sulit tumbuh dalam etanol dengan kadar lebih dari 20 %. Selama proses maserasi, zat aktif dalam serbuk teh hijau akan berdifusi keluar dari sel karena adanya perbedaan konsentrasi zat aktif di dalam sel dan di luar sel. Difusi ini terus berlangsung sampai terjadi keseimbangan konsentrasi zat aktif dalam sel dengan penyari di luar sel. Maserasi yang berulang (remaserasi) akan mengambil flavonoid secara bertahap sehingga penyarian menjadi lebih optimal. Dari hasil ekstraksi menggunakan etanol 70 % didapatkan ekstrak etanol dengan berat ekstrak kering sebesar 108,39 g dan rendemen sebesar 36,13 %.

2. Fraksinasi ekstrak etanol teh hijau Etanol merupakan pelarut universal yang dapat menyari banyak senyawa dalam tumbuhan, sehingga dimungkinkan selain flavonoid terdapat senyawa lain yang ikut tersari walaupun mungkin hanya dalam jumlah yang kecil. Zat-zat pengotor seperti lemak dan klorofil dinilai akan mengganggu analisis spektrofotometri yang akan dilakukan. Untuk menghilangkan zat pengotor


terutama lemak dan klorofil tersebut dilakukan fraksinasi menggunakan kloroform yang bersifat non polar. Fraksinasi dengan kloroform menghasilkan fraksi berair yang bebas lemak dan klorofil. Selain itu kloroform juga akan menyari senyawa selain flavonoid seperti alkaloid, terpena, dan xantofil. Fraksi air (A1) yang didapat dimungkinkan berisi flavonoid baik dalam bentuk aglikon maupun dalam bentuk glikosida (terikat dengan gula). Fraksinasi dengan etil asetat terhadap fraksi air (A1) akan memisahkan dua jenis flavonoid tersebut. Masing-masing jenis flavonoid tersebut akan terdistribusi ke dalam salah satu pelarut sesuai dengan sifat kelarutan dan polaritasnya. Etil asetat mempunyai polaritas yang lebih rendah dari air, dengan demikian pada saat fraksinasi flavonoid yang berbentuk aglikon akan lebih terdistribusi ke dalam fraksi etil asetat, sedangkan flavonoid yang terikat dengan gula akan lebih terdistribusi ke dalam fraksi air. Hal ini dikarenakan flavonoid yang berbentuk aglikon bersifat kurang polar dibandingkan flavonoid yang terikat gula. Berat serbuk kering fraksi etil asetat yang diperoleh adalah 11,52 g dengan rendemen sebesar 5,54 %, sedangkan berat serbuk kering fraksi air adalah 21,83 g dengan rendemen sebesar 10,5 %.

D. Penentuan Operating Time (OT) Penentuan OT bertujuan untuk mengetahui rentang waktu yang tepat yang dapat digunakan untuk melakukan pengukuran absorbansi suatu senyawa. Pada rentang waktu tersebut senyawa berada dalam keadaan yang relatif stabil,


yang ditunjukkan dengan nilai absorbansi yang relatif stabil juga. Dengan demikian diharapkan pengukuran absorbansi yang dilakukan pada OT akan meminimalkan terjadinya kesalahan analisis yang disebabkan oleh kesalahan pengukuran. Hasil penentuan OT ini dapat dilihat pada kurva hubungan waktu vs absorbansi yang tersaji pada gambar 10.

Gambar 10. Kurva hubungan waktu vs absorbansi kromogen MDA-TBA pada pengukuran Operating Time (OT)

Dalam penelitian ini pengukuran absorbansi ditujukan pada senyawa kromogen MDA-TBA yang merupakan senyawa hasil reaksi yang berwarna merah muda (pink). Pengukuran OT dimulai dari menit ke-0 sampai menit ke-60 pada panjang gelombang maksimal teoritis 532 nm. Menit ke-0 dihitung 5 menit setelah campuran reaksi dipanaskan pada suhu 80  C dan didinginkan dengan air mengalir untuk menghambat reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA. Kurva pada gambar 10 memperlihatkan nilai absorbansi kromogen MDA-TBA yang stabil dari menit ke-0 sampai menit ke-60 dengan absorbansi 0,974. Hal ini menunjukkan bahwa selama 60 menit tersebut kromogen MDA-


TBA berada dalam keadaan yang stabil sehingga pengukuran absorbansi yang dilakukan selama waktu tersebut mempunyai reprodusibilitas yang tinggi.

E. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (maks) Panjang gelombang maksimum merupakan panjang gelombang dari suatu senyawa yang menghasilkan absorbansi maksimum. Pengukuran absorbansi pada maks bertujuan untuk menghasilkan kepekaan dan keakuratan yang tinggi karena pada panjang gelombang tersebut perubahan absorbansi yang disebabkan oleh konsentrasi juga maksimum. Gambar 11 menyajikan data kurva panjang gelombang maksimum yang digunakan.

Gambar 11. Kurva panjang gelombang maksimum kromogen MDA-TBA

Pada penelitian ini scanning dilakukan terhadap kromogen MDA-TBA pada panjang gelombang antara 400-600 nm. Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan pada konsentrasi deoksiribosa yang berbeda yaitu 41,66,


125,00, dan 250,00 μM untuk memberikan gambaran yang jelas tentang perubahan absorbansinya. Ketiga konsentrasi tersebut secara berturut-turut menghasilkan nilai panjang gelombang maksimum 531,7, 531,7, dan 531,8 nm. Panjang gelombang maksimum yang kemudian digunakan adalah 531,8 nm, dengan alasan nilai inilah yang paling mendekati nilai panjang gelombang maksimum secara teoritis (532 nm). MDA dihasilkan saat proses inkubasi pada suhu 37  C selama 30 menit. Digunakan suhu 37  C dengan alasan untuk menyamakan kondisi seperti pada tubuh manusia normal. Pada inkubasi ini terjadi reaksi antara deoksiribosa dengan radikal hidroksil yang dihasilkan dari reaksi Fenton. Radikal hidroksil akan menyerang deoksiribosa sehingga deoksiribosa akan mengalami degradasi atau kerusakan. Produk degradasi tersebut adalah malondialdehid (MDA) (gambar 7). MDA merupakan senyawa yang tidak berwarna, maka perlu dilakukan reaksi pengkoplingan yang akan memperpanjang gugus kromofor dan menambah gugus auksokrom, sehingga menjadi senyawa yang berwarna dan dapat dideteksi di daerah panjang gelombang sinar tampak menggunakan spektrofotometer visibel. Dalam penelitian ini digunakan asam tiobarbiturat (TBA) sebagai senyawa pengkopling. Reaksi antara MDA dan TBA dilakukan dalam suasana asam dan dengan pemanasan pada suhu 80  C. Suasana asam diperoleh dengan menambahkan asam trikloroasetat (TCA) ke dalam campuran reaksi. Dalam hal ini TCA mempunyai fungsi menurunkan kecepatan reaksi degradasi deoksiribosa. Dalam suasana asam oksidasi vitamin C akan terhambat, sehingga pembentukan


radikal hidroksil juga akan terhambat. Hal ini mengakibatkan kecepatan reaksi degadrasi deoksiribosa akan menurun, sehingga kestabilan kromogen MDA-TBA dapat dikendalikan. Fungsi TCA yang kedua adalah sebagai katalis reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA. Dalam suasana asam, gugus keton dari TBA akan berubah menjadi suatu gugus enol (gambar 12). Dengan adanya gugus enol tersebut TBA menjadi lebih reaktif sehingga dapat bereaksi dengan MDA melalui reaksi pengkoplingan membentuk kromogen MDA-TBA. MDA sendiri merupakan senyawa yang tidak berwarna, namun setelah direaksikan dengan TBA akan terjadi reaksi pengkoplingan yang memperpanjang gugus kromofor dan menambah gugus auksokrom sehingga menjadi berwarna merah muda. Keseluruhan reaksi tersebut dapat dilihat pada gambar 13, sedangkan struktur kromogen MDA-TBA dapat dilihat pada gambar 14.

H S

N

H O

S

N

O H

+ H H

N H

H O

+ H

N H

H O

TBA

Gambar 12. Reaksi pembentukan gugus enol pada TBA


H S

H

H

N

O

O

H

S

H

+

N H

N

O

O

N

H H

N H

H

O

S

+

H

H

N

H

OH

+ H

O

H

H

O

O

O

MDA + H

H S

H

N

O

O

H

H

H

N

N

S

S

+H _

H

H O

OH

OH

H

O

O

O

H N H

O

H

N

OH

H

_

O

H 2O

H

N

S

H

+H

S

N

N

O

H

O

H

H

H2 O

N

N

H

S

S

N

H O

O

N

S

H H

+ H N

N

H

H O

H

N

N

H

H

O

O

O

+H

S

N

OH

HO

N

S

S

N

OH

HO

N

SH

+H N

N

N

N

H OH

OH

OH

OH

MDA-TBA (berwarna merah muda)

Gambar 13. Usulan reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA (Purwantoko, 2006)


S

N

OH

HO

N

N

SH

N

OH

OH

( - - - - ) Gugus kromofor ( - - - - ) Gugus auksokrom Gambar 14. Struktur kromogen MDA-TBA

F. Uji Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air Teh Hijau Uji penangkapan radikal hidroksil dalam penelitian ini mengacu pada metode deoksiribosa yang telah divalidasi oleh Purwantoko (2006). Dipilih metode deoksiribosa karena metode ini menggunakan gula deoksiribosa yang merupakan gula penyusun faktor genetik manusia yaitu DNA sehingga dapat mewakili proses yang terjadi dalam tubuh. Selain itu, metode ini lebih mudah dibanding metode penangkapan radikal hidroksil yang lain. Alasan lain yaitu berdasarkan penelitian sebelumnya (Purwantoko, 2006), metode ini terbukti memiliki validitas yang baik untuk menguji daya antioksidan melalui penangkapan radikal hidroksil oleh vitamin C yang merupakan salah satu senyawa antioksidan. Pada penelitian ini digunakan sampel fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau. Masing-masing fraksi diuji daya tangkapnya terhadap radikal hidroksil dengan memasukkannya pada campuran yang berisi reagen Fenton dan deoksiribosa. Dalam penelitian ini digunakan 5 konsentrasi sampel yang berbeda-beda yaitu 0,033 ;0,067 ; 0,100; 0,133; dan 0,167 mg/ml dengan 5


kali replikasi. Pemilihan konsentrasi tersebut supaya secara teknis mempermudah pengambilan sampel uji (fraksi etil asetat dan fraksi air) dengan alat yang digunakan (mikropipet). Data yang diperoleh dari uji penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat dan fraksi air masing-masing disajikan pada tabel II dan tabel III. Tabel II. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan sampel fraksi etil asetat dengan berbagai konsentrasi Konsentrasi Fraksi Etil Asetat (mg/ml) Replikasi I II III IV V Purata SD CV (%)

0 (Kontrol)

0,033

0,067

0,100

0,133

0,167

0,951 0,985 0,999 0,931 0,956 0,964 0,027 2,834

0,838 0,846 0,831 0,775 0,775 0,813 0,035 4,316

0,783 0,782 0,777 0,735 0,700 0,755 0,037 4,873

0,711 0,715 0,695 0,659 0,629 0,682 0,037 5,407

0,659 0,648 0,637 0,604 0,590 0,628 0,029 4,687

0,614 0,595 0,597 0,545 0,553 0,581 0,030 5,180

Tabel III. Absorbansi kromogen MDA -TBA pada penambahan sampel fraksi air dengan berbagai konsentrasi Konsentrasi Fraksi Air (mg/ml) Replikasi I II III IV V Purata SD CV (%)

0 (Kontrol)

0,033

0,067

0,100

0,133

0,167

0,973 0,989 0,925 0,906 0,964 0,951 0,035 3,640

0,683 0,683 0,663 0,652 0,705 0,677 0,020 3,023

0,650 0,645 0,630 0,630 0,668 0,645 0,016 2,457

0,626 0,617 0,588 0,578 0,620 0,606 0,021 3,526

0,583 0,575 0,564 0,543 0,590 0,571 0,018 3,222

0,567 0,522 0,549 0,508 0,575 0,544 0,029 5,274


Kedua tabel tersebut menunjukkan nilai absorbansi kontrol yang lebih besar dibanding nilai absorbansi perlakuan. Ini berarti kromogen MDA-TBA yang terbentuk pada kelompok perlakuan lebih sedikit dibanding dengan kelompok kontrol. Absorbansi kelompok perlakuan yang lebih rendah dari kelompok kontrol ini menunjukkan adanya aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh kedua fraksi. Aktivitas ini menyebabkan jumlah radikal hidroksil yang menyerang deoksiribosa menjadi berkurang, karena radikal hidroksil yang dihasilkan dari reaksi Fenton sebagian ditangkap oleh senyawa-senyawa yang ada dalam kedua fraksi. Akibatnya, kromogen MDA-TBA yang terbentuk juga berkurang sehingga absorbansi pada kelompok perlakuan menjadi lebih rendah dibanding kelompok kontrol. Absorbansi kelompok perlakuan tergantung dari konsentrasi fraksi yang ditambahkan. Semakin besar konsentrasi fraksi maka absorbansi juga semakin berkurang. Hal ini karena semakin bertambahnya konsentrasi fraksi maka jumlah senyawa yang menangkap radikal hidroksil juga semakin bertambah sehingga semakin banyak radikal hidroksil yang ditangkap oleh senyawa tersebut. Dengan demikian radikal hidroksil yang menyerang deoksiribosa semakin berkurang, sehingga kromogen MDA-TBA yang terbentuk juga semakin berkurang. Aktivitas penangkapan radikal hidroksil dinyatakan dalam % scavenging yang dihitung dari selisih antara purata absorbansi kontrol dengan purata absorbansi sampel pada konsentrasi tertentu dibagi purata absorbansi kontrol dikalikan 100 %. Data % scavenging kedua fraksi tersebut dapat dilihat pada tabel IV.


Tabel IV. Nilai persentase penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat dan fraksi air Konsentrasi Fraksi (mg/ml)

% Scavenging Fraksi Etil Asetat Fraksi Air Teh Hijau Teh Hijau

0,033 0,067 0,100 0,133 0,167

15,699 21,672 29,303 34,923 39,776

28,821 32,247 36,325 39,983 42,800

Hubungan antara konsentrasi fraksi etil asetat dan fraksi air dengan % scavenging dapat disajikan dalam suatu kurva yang ditunjukkan pada gambar 15 dan 16 berikut: 45.0 40.0 % Scavengi ng

35.0 30.0 25.0 20.0 15.0 10.0 5.0 0.0 0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

Konsentrasi fraksi etil asetat teh hijau (mg/ml)

Gambar 15. Kurva hubungan konsentrasi fraksi etil asetat teh hijau dengan % scavenging

45.0 40.0

% Scavenging

35.0 30.0 25.0 20.0 15.0 10.0 5.0 0.0 0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

Konsentrasi fraksi air teh hijau (mg/ml)

Gambar 16. Kurva hubungan konsentrasi fraksi air teh hijau dengan % scavenging


Analisis regresi linier dari hubungan konsentrasi fraksi etil asetat dan fraksi air dengan % scavenging menghasilkan persamaan regresi y = 1,225 x + 9,895 (hasil konversi) untuk fraksi etil asetat dan y = 0,712 x + 25,351 (hasil konversi) untuk fraksi air. Nilai koefisien korelasi (r) yang dihasilkan dari analisis regresi linier tersebut adalah 0,994 untuk fraksi etil asetat dan 0,996 untuk fraksi air. Nilai r dari kedua fraksi tersebut lebih besar dari nilai r tabel untuk taraf kepercayaan 95 % dan derajat bebas 3 yaitu 0,878. Ini berarti ada hubungan yang kuat antara konsentrasi fraksi etil asetat maupun fraksi air dengan % scavenging, artinya kenaikan konsentrasi proporsional dengan kenaikan % scavenging. Kurva

% S caven g in g

regresi fraksi etil asetat dan fraksi air ditunjukkan pada gambar 17 dan gambar 18. 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0

5

10

15

20

25

30

Konsentrasi fraksi etil asetat teh hijau (m g/150 ml)

Gambar 17. Kurva regresi fraksi etil asetat teh hijau (hasil konversi)

50

% S caveng in g

40 30 20 10 0 0

5

10

15

20

25

30

Konsentrasi fraksi air teh hijau (m g/150 ml)

Gambar 18. Kurva regresi fraksi air teh hijau (hasil konversi)


Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat dan fraksi air dapat ditunjukkan dengan ES50. Nilai tersebut menyatakan konsentrasi fraksi etil asetat maupun fraksi air yang menghasilkan penangkapan efektif terhadap radikal hidroksil sebesar 50 %. Dengan analisis regresi linier, didapatkan nilai ES50 dari masing-masing fraksi. Pada penelitian ini diperoleh nilai ES 50 untuk fraksi etil asetat sebesar 0,22 mg/ml (hasil ekstrapolasi) dan untuk fraksi air sebesar 0,23 mg/ml (hasil ekstrapolasi). Dari kedua nilai tersebut terlihat bahwa nilai ES50 fraksi etil asetat lebih kecil dibanding nilai ES50 fraksi air, namun kedua nilai tersebut berbeda tidak bermakna. Ini menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan melalui penangkapan radikal hidroksil fraksi etil asetat berbeda tidak bermakna dibanding fraksi air. Aktivitas antioksidan pada fraksi etil asetat dan fraksi air mungkin disebabkan oleh terdapatnya senyawa polifenol terutama flavonoid. Adanya senyawa polifenol ini telah didukung oleh penelitian yang dilakukan oleh Pertiwi (2006), dengan sampel yang sama, yaitu dengan uji polifenol pada uji tabung. Hasil pada uji polifenol tersebut menunjukkan hasil yang positif untuk kedua fraksi, yaitu terbentuk warna hijau biru saat kedua fraksi direaksikan dengan FeCl3. Berdasarkan teori, fraksinasi menggunakan etil asetat dan air akan memisahkan flavonoid dalam ekstrak etanol menjadi dua bagian dengan polaritas dan kelarutan yang berbeda, yaitu bentuk aglikon dan bentuk yang terikat dengan gula, masing-masing akan terdistribusi ke dalam fraksi etil asetat dan fraksi air sesuai kelarutan dan polaritasnya. Flavonoid dalam bentuk aglikon akan lebih


terdistribusi ke dalam fraksi etil asetat sedangkan flavonoid dalam bentuk glikosida akan lebih terdistribusi ke dalam fraksi air. Dengan demikian aktivitas penangkapan radikal hidroksil pada fraksi etil asetat mungkin disebabkan oleh polifenol flavonoid bentuk aglikon yang ada dalam teh hijau seperti senyawa kelas flavanol terutama komponen katekin, sedangkan aktivitas penangkapan radikal hidroksil pada fraksi air mungkin disebabkan oleh flavonoid yang terikat gula seperti glikosida flavonol (misalnya glikosida flavonoid dengan aglikon mirisetin, kuersetin, dan kemferol). Penelitian ini belum dapat mengetahui secara pasti senyawa yang menyebabkan aktivitas antioksidan tersebut. Oleh karena itu, diperlukan penelitian lebih lanjut. Aktivitas antioksidan melalui mekanisme penangkapan radikal hidroksil dari senyawa flavonoid (FlOH) dalam fraksi etil asetat dan fraksi air disebabkan oleh adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Gugus ini mempunyai potensi besar dalam mendonorkan atom hidrogennya ketika diserang oleh radikal hidroksil. Saat diserang oleh radikal hidroksil, flavonoid-flavonoid tersebut akan membentuk radikal bebas baru yang lebih stabil (yaitu radikal fenoksil (FlO•) dan molekul air yang stabil (gambar 19). FlOH + HO• → FlO• + H2O Gambar 19 . Reaksi penangkapan radikal hidroksil oleh senyawa flavonoid (Amié et al., 2003)

Radikal fenoksil (FlO•) tersebut kemudian mengalami efek resonansi pada cincin aromatiknya, hal inilah yang menyebabkan radikal fenoksil mempunyai stabilitas yang lebih tinggi dari OH•. Lebih jauh, radikal fenoksil akan mengalami reaksi terminasi untuk menstabilkan diri, yaitu bergabung dengan


radikal bebas yang lain. Reaksi terminasi ini bisa terjadi antara radikal fenoksil dengan radikal hidroksil maupun antar radikal fenoksil sendiri (gambar 20). FlO• + HO• → FlO-OH FlO• + FlO• → FlO-OFl Gambar 20. Reaksi kopling radikal fenoksil dengan radikal lain pada tahap terminasi (Amié et al., 2003)

Dengan adanya kemampuan flavonoid dalam menangkap radikal hidroksil, menyebabkan fase propagasi dari radikal hidroksil dapat dihambat. Hal inilah yang menyebabkan berkurangnya radikal hidroksil yang menyerang deoksiribosa pada saat fraksi etil asetat dan fraksi air yang mungkin berisi flavonoid ditambahkan ke dalam campuran yang berisi reagen Fenton dan deoksiribosa. Setiap bertambahnya konsentrasi fraksi menyebabkan absorbansi yang terukur semakin berkurang. Hal ini karena semakin bertambahnya konsentrasi, senyawa flavonoid yang menangkap radikal hidroksil semakin bertambah, sehingga akan semakin sedikit molekul deoksiribosa yang didegradasi. Akibatnya kromogen MDA-TBA yang terbentuk juga akan semakin sedikit sehingga absorbansi semakin berkurang.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan Dari hasil penelitian ini dapat diambil kesimpulan sebagai berikut: 1. Fraksi etil asetat dan fraksi air dari ekstrak etanol teh hijau mempunyai aktivitas antioksidan melalui penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa. 2. Aktivitas antioksidan melalui penangkapan radikal hidroksil fraksi etil asetat berbeda tidak bermakna dibanding aktivitas antioksidan melalui penangkapan radikal hidroksil fraksi air dengan nilai ES50 untuk fraksi etil asetat (0,22 mg/ml) (hasil ekstrapolasi) dan ES50 fraksi air (0,23 mg/ml) (hasil ekstrapolasi).

B. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang kandungan senyawa polifenol terutama flavonoid yang ada dalam fraksi etil asetat dan fraksi air dari ekstrak etanol teh hijau, serta uji antioksidan melalui penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa dari senyawa-senyawa yang ada dalam kedua fraksi tersebut (terutama senyawa flavonoid seperti komponen katekin, serta glikosida flavonoid dengan aglikon kuersetin, mirisetin, atau kemferol).

53


DAFTAR PUSTAKA

Ames, B.N., Shigenaga, M.K., and Hagen, T.M., 1993, Oxidants, Antioxidants, and The Generative Disease of Aging, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90, 7915-7922. Amié, D., Amié, D.D., Beš lo, D., and Trinajstié, N., 2003, Structure-Radical Scavenging Activity Relationships of Flavonoid, Croat. Chem. Acta., 76(1), 55-61. Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 10-13, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 1989, Materia Medika Indonesia jilid V, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi 4, 1061, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Aruoma, O.I., 2000, Conceptualization of the Prooxidant and Antioxidant Action of Plant Food Chemicals, in Shahidi, F. and Chi-Tang Ho (Ed.), Phytochemicals and Phytopharmaceuticals, 30, AOCS Press, Illinois. Bors, H., Michel, C., and Saran, M., 1979, On the Natural of Biochemically Generated Hidroxyl Radicals : Studies using the Bleaching of pNitrosodimethylaniline as a Direct Assay Methode, Eur. J. Biochem., 95, 621-627. Cutler, S. J. and Cutler, H. G., 2000, Biologically Active Natural Products: Pharmaceuticals, 133-137, CRC Press, London. Cuvelier, M.E., Richards, H., and Bessets, C., 1991, Comparison of The Antioxidative of Some Acid Phenols: structure activity Relationship, Biosch. Biotech. Biochem., 56 (2), 324-325. Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S., 1994, Kimia Organik Jilid I, diterjemahkan oleh Pudjaatmaka, A.H., 436-444, Edisi ketiga, Penerbit Erlangga, Jakarta. Gitawati, R., 1995, Radikal Bebas Sifat dan Peranannya dalam Menimbulkan Kerusakan/Kematian Sel, Cermin Dunia Kedokteran, 33-35, 102. Grieb, P., 1992, Antioxidant Systems – Physiology and Pharmacotherapy Trends, Materia Medica Polona, Fasc. 4(84):217-222.


Halliwel, B., Gutteridge, J.M.C., and Aruoma, O.I., 1987, The Deoxyribose Method: A Simple “Test-Tube” Assay for Determination of Rate Constants for Reaction of Hydroxyl Radicals, Anal. Biochem., 165, 215 – 219, Academic Press, London. Halliwell, B., dan Gutteridge, J.M.C., 1999, Free Radicals in Biology and Medicine, third edition, Oxford University Press, New York. Handajani, J., 2002, Pengaruh Ekstrak Daun Teh Segar (Camellia sinensis) Konsentrasi 2% Terhadap Pembentukan Plak Gigi, Gerbang Inovasi Jurnal Lembaga Pengabdian kepada Masyarakat Universitas Gadjah Mada, 7 (1516), 9-13. Harborne, J. B., 1987, Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro, edisi ke-2, 47-122, Penerbit ITB, Bandung. Hartoyo, A., 2003, Teh dan Khasiatnya Bagi Kesehatan Sebuah Tinjauan Ilmiah, Kanisius, Yogyakarta. Hertiani, T., Pramono, S., dan Supardjan, A.M., 2001, Uji Daya Antioksidan Senyawa Flavonoid Daun Plantago major L, Majalah Farmasi Indonesia, 12(1), 32-37. Himawati, E.R., 2001, Antioksidan dan Peredam Radikal Bebas Biologis, Majalah Farmasi Indonesia (Indonesian Journal of Pharmacy), 12(1), 5560. Indrawati, R. dan Devijanti, R., 1996, Beda Daya Antibakteri Kandungan Teh Segar Dan Teh Hitam terhadap Kuman Penyebab Karies Gigi, Ceramah Poster FKG Unair, Surabaya. Khopkar, S. M., 1990, Basic Concepts of Analytical Chemistry, alih bahasa Saptoraharjo, A., 193; 204, Universitas Indonesia Press, Jakarta. Kikuzaki, H. and Nakatani, N., 1993, Antioxidant Effects of Some Ginger Constituents, J. Food Sci., 58(6), 1407. Krinsky, N. I., 1992, Mechanism of Action of Biological Antioxidants. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 200(2); 248-254. Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, 1-37, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung. Mulihal, 1991, Teori Radikal Bebas dalam Gizi dan Kedokteran, Cermin Dunia Kedokteran, 73, 9-11.


Muth, J.E., 1999, Basic Statistic and Pharmaceutical Analysis, 572, 585, Marcel, Dekker, Inc., New York, Basel. Oki, A.S., 1996, Pengaruh Pemberian Teh Hijau (Camelia sinensis) terhadap Agregasi Platelet, Ceramah singkat FKG Unair, 7, 925. Page, D.S., 1989, Prinsip-prinsip Biokimia, edisi kedua, diterjemahkan oleh R. Soendoro, Penerbit Erlangga, Jakarta. Pertiwi, M.V., 2006, Penetapan Kadar Flavonoid Total Terhitung sebagai Kuersetin dengan Metode Kolorimetri dalam Teh Hijau dan Teh Hitam (merk X), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Purwantoko, A., 2006, Uji Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Vitamin C secara In Vitro, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Robinson, T., 1995, Kandungan Kimia Organik Tumbuhan Tinggi, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., ed. 6, 191-217, Penerbit ITB, Bandung. Rohdiana, D., 2001, Aktivitas Daya Tangkap Radikal Polifenol dalam Daun Teh, Majalah Farmasi Indonesia, 12 (1), 53-58. Sastrohamidjojo, H., 1991, Spektroskopi, 1-15, Liberty, Yogyakarta. Setyawati, L., 2007, Uji Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air Ekstrak Teh Hitam dengan Metode Deoksiribosa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Silverstein, R.M., 1991, Spectrometric Identification of Organic Compounds, 5 th Ed., 289-294, John Wiley and Sons Inc., Singapore. Siswono, H., 2003, Mekanisme Kerja Vitamin B2, Asam Galat dan Somatotropin pada Penghambatan Proses Penuaan Dini, Kajian Aktivitas Senyawa Gizi, Non Gizi, dan Hormon Pertumbuhan, sebagai Bahan Penghambat Proses Penuaan Dini, Available from URL: http://www.ns.ui.ac.id/seminar2005/Data/SPF-04.pdf., diakses 12 Oktober 2006. Skoog, D.A., Holler, F.J., and Nieman, T.A., 1998, Principles of Instrumental Analysis, 5th Ed., 182-220, 403-419, Harcourt Brace College, Philadelphia.


Skoog, D. A., West, D. M., and Holler, F. J., 1994, Analytical Chemistry (An introduction), 6th Ed., 383-432, Sounders College Publishing, Philadelphia. Sugiyono, 2005, Statistika untuk Penelitian, CV. Alfabeta, Bandung. Syamsuhidayat, S.S. dan Hutapea, J. R., 1991, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, edisi I, 106-107, Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Willard, H.H., Merritt, J.R.L., Dean, J.A., and Settle, J.F., 1988, Instrumental Methods of Analysis, 7 th Ed., 125-160, Wadsworth Publishing Company, California.


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Pembuatan larutan bufer fosfat pH 7,4 a. Berat molekul senyawa yang digunakan: - Na2HPO4

= 141,96 g/mol

- KH2PO 4

= 136,09 g/mol

b. Perhitungan bahan *Contoh perhitungan pembuatan 500 ml larutan Na2HPO4 20 mM. 20 mM = 20 mmol/L = 20 x 141,96 mg/L = 10 x 141,96 mg/500 ml = 1,4196 g/500 ml Larutan Na2HPO4 20 mM dibuat dengan menimbang 1,4196 g Na2HPO4 kemudian dilarutkan dalam 500,0 ml akuades.


Lampiran 2. Pembuatan larutan deoksiribosa 2,5 mM Berat molekul (BM) deoksiribosa = 134,1 g/mol Perhitungan bahan: a. Pembuatan 10 ml larutan stok deoksiribosa 15 mM 15 mM = 15 mmol/L = 15 x 134,1 mg/L = 0,15 x 134,1 mg/10 ml = 20,115 mg/10 ml = 0,02012 g/10 ml Larutan deoksiribosa 15 mM dibuat dengan cara melarutkan 0,02012 g deoksiribosa dalam 10,0 ml akuades. b. Pembuatan 10 ml larutan deoksiribosa 2,5 mM Larutan deoksiribosa 2,5 mM dibuat dengan pengenceran dari larutan stok deoksiribosa 15 mM. Perhitungan pengenceran: C1 x V1 = C2 x V2 15 mM x V1 = 2,5 mM x 25 ml V1 = 4,16667 ml ~ 4,2 ml Larutan deoksiribosa 2,5 mM dibuat dengan mengambil 4,2 ml larutan deoksiribosa 15 mM kemudian diencerkan dengan akuades hingga volume 25,0 ml.


Lampiran 3. Pembuatan reagen Fenton a. Berat molekul senyawa yang digunakan - FeCl3. 6 H2O

:

270,33 g/mol

- Na2EDTA. 2 H2 O

:

372,24 g/mol

- Vitamin C

:

176,13 g/mol

- H2O2

:

34,02 g/mol

b. Perhitungan Bahan  Pembuatan larutan FeCl3 1 mM 1. Pembuatan larutan FeCl3 5 mM BM FeCl3 = 270,33 – (6 x 18,02) = 270,33 – 108,12 = 162,21 g/mol Bobot FeCl 3 yang seharusnya ditimbang: 5 mM = 5 mmol/L = 5 x 162,21 mg/L = 0,05 x 162,21 mg/10 ml = 8,1105 mg/10 ml = 0,00811 g/10ml Bobot FeCl 3. 6 H2O yang ditimbang untuk memperoleh FeCl 3 5 mM: FeCl3. 6 H2O =

270,33 g/mol x 0,00811 g 162,21 g/mol

= 0,01352 g Larutan FeCl 3 5 mM dibuat dengan cara melarutkan 0,01352 g FeCl3. 6 H2O dalam 10,0 ml akuades. 2. Pembuatan larutan FeCl3 1 mM Larutan FeCl 3 1 mM dibuat dengan pengenceran dari larutan FeCl3 5 mM.


Perhitungan pengenceran: C1 x V1 = C2 x V2 5 mM x V1 = 1 mM x 10 ml V1 = 2 ml Larutan dibuat dengan mengambil 2,0 ml larutan FeCl 3 5 mM kemudian diencerkan dengan akuades hingga volume 10,0 ml.  Pembuatan larutan EDTA 1 mM 1. Pembuatan larutan EDTA 5 mM BM EDTA = 372,24 – (2 x 22,99) – (2 x 18,02) = 290,22 g/mol Bobot EDTA yang seharusnya ditimbang: 5 mM = 5 mmol/L = 5 x 290,22 mg/L = 0,05 x 290,22 mg/10 ml = 14,511 mg/10 ml = 0,01451 g/10 ml Bobot Na2EDTA. 2 H 2O yang ditimbang untuk mendapatkan 5 mM EDTA: Na2EDTA. 2 H2 O =

372,24 g/mol x 0, 01451 g 290,22 g/mol

= 0,01861 g Larutan EDTA 5 mM dibuat dengan cara melarutkan 0,01861 g Na2EDTA. 2 H2O dalam 10,0 ml akuades. 2. Pembuatan larutan EDTA 1 mM Larutan EDTA 1 mM dibuat dengan pengenceran dari larutan EDTA 5 mM. Perhitungan pengenceran:


C1 x V1 = C2 x V2 5 mM x V1 = 1 mM x 10 ml V1 = 2 ml Larutan dibuat dengan mengambil 2,0 ml larutan EDTA 5 mM kemudian diencerkan dengan akuades hingga volume 10,0 ml.  Pembuatan larutan vitamin C 1 mM 1. Pembuatan larutan vitamin C 10 mM 10 mM = 10 mmol/ L = 10 x 176,13 mg/L = 0,1 x 176,13 mg/10 ml = 17,613 mg/10 ml = 0,01761 g/10 ml Larutan vitamin C 10 mM dibuat dengan cara melarutkan 0,01761 g dalam 10,0 ml akuades. 2. Pembuatan larutan vitamin C 1 mM Larutan vitamin C 1 mM dibuat dengan pengenceran dari larutan vitamin C 10 mM. Perhitungan pengenceran: C1 x V1 = C2 x V2 10 mM x V1 = 1 mM x 10 ml V1 = 1 ml Larutan dibuat dengan mengambil 1,0 ml larutan vitamin C 10 mM kemudian diencerkan dengan akuades hingga volume 10,0 ml.


 Pembuatan larutan H2O2 20 mM Larutan H2O2 yang tersedia adalah larutan H2O2 30 %. BM H2O2 = 34,02 g/mol 30 % =

30g 100ml

Konsentrasi H2O2 dalam molar: M=

=

1000 g x V BM

1000 30 x 100 34,02

= 8,818 M = 8,818 x 103 mM  Pembuatan larutan H2O2 80 mM Volume larutan H2O2 30 % yang diambil untuk mendapatkan 10 ml larutan H2O2 80 mM adalah: V1 x C1 = V2 x C2 V1 x 8,818 x 103 mM = 10 ml x 80 mM V1 = 0,091 ml Volume H2O2 30 % yang diambil : 0,091 ml Perhitungan konsentrasi: V1 x C1 = V2 x C2 0,091 ml x 8,818 x 103 mM = 10 ml x C2 C2 = 80,244 mM


 Pembuatan larutan H2O2 20 mM Larutan H2O2 20 mM dibuat dengan pengenceran dari larutan H2O2 80 mM. Perhitungan pengenceran: V1 x C1 = V 2 x C2 V1 x 80 mM = 10 ml x 20 mM V1 = 2,5 ml Larutan dibuat dengan mengambil 2,5 ml larutan H2O2 80 mM kemudian diencerkan dengan akuades hingga volume 10,0 ml.


Lampiran 4. Pembuatan larutan TCA 5 % dan TBA 1 % Berat molekul (BM) masing-masing senyawa TCA = 163,39 g/mol TBA = 144,15 g/mol *Contoh pembuatan 25 ml larutan TCA 5 %: TCA 5 % =

5g 100ml

Jika akan dibuat 25,0 ml maka perhitungannya menjadi: TCA 5 % =

5g / 4 100ml / 4

TCA 5 % =

5g / 4 100ml / 4

=

1,25 g 25ml

Jadi, larutan TCA 5 % dibuat dengan menimbang 1,25 g TCA kemudian dilarutkan dalam 25,0 ml akuades.


Lampiran 5. Perhitungan persentase penangkapan radikal hidroksil oleh senyawa uji (% scavenging)

Persentase penangkapan radikal hidroksil oleh sampel (% scavenging) diperoleh dari rumus: % Scavenging =

Absorbansi larutan kontrol- Absorbansi larutan sampel x 100 % Absorbansi larutan kontrol

Contoh perhitungan: Diketahui : absorbansi larutan kontrol = 0,951 absorbansi larutan sampel = 0,838 0,951 0,838 %Scavenging  x100% 0,951 = 11,882 %


Lampiran 6. Perhitungan penangkapan efektif radikal hidroksil sebesar 50 % (Effective Scavenging 50 (ES50))

Nilai ES50 diperoleh dari regresi linier antara konsentrasi fraksi etil asetat dan konsentrasi fraksi air (sumbu x) vs % scavenging (sumbu y). 1. Fraksi etil asetat teh hijau Konsentrasi Fraksi Etil Asetat Teh Hijau (mg/ml)

% Scavenging

0,033 0,067 0,100 0,133 0,167

15,699 21,672 29,303 34,923 39,776

Analisis regresi linier antara konsentrasi fraksi etil asetat menghasilkan nilai: A = 9,895 B = 183,800 → sudut kemiringan (α): 89,67º r = 0,994 Persamaan yang didapat: y = 183,800 x + 9,895

Nilai ES50 fraksi etil asetat teh hijau =

50 9,895 183,800

= 0,22 mg/ml

vs % scavenging


Kurva yang ditampilkan oleh persamaan y = 183,800 x + 9,895 tidak layak saji karena memiliki nilai B yang besar (sudut kemiringan (α) mendekati 90º). Oleh karena itu perlu dilakukan konversi supaya sudut yang terbentuk ± 45º sehingga akan memperbaiki penampilan kurva. Sebelum konversi Konsentrasi fraksi etil asetat % Scavenging teh hijau (mg/ml)

0,033 0,067 0,100 0,133 0,167

Setelah konversi Konsentrasi fraksi etil asetat % Scavenging teh hijau (mg/150ml)

15,699 21,672 29,303 34,923 39,776

Persamaan garis regresi y = 183,800 x + 9,895 α= 89,69º

4,950 10,050 15,000 19,950 25,050

15,699 21,672 29,303 34,923 39,776

Persamaan garis regresi y = 1,225 x + 9,895 α= 50,77º

2. Fraksi air Konsentrasi Fraksi Air Teh Hijau (mg/ml)

% Scavenging

0,033 0,067 0,100 0,133 0,167

28,821 32,247 36,325 39,983 42,800

Analisis regresi linier antara konsentrasi fraksi etil asetat menghasilkan nilai: A = 25,351 B = 106,840 → sudut kemiringan (α): 89,46º r = 0,996 Persamaan yang didapat:

vs % scavenging


y = 106,840 x + 25,351 Nilai ES50 fraksi air teh hijau =

50 25,351 106,840

= 0,23 mg/ml Kurva yang ditampilkan oleh persamaan y = 106,840 x + 25,351 tidak layak saji karena memiliki nilai B yang besar (sudut kemiringan (α) mendekati 90º). Oleh karena itu perlu dilakukan konversi supaya sudut yang terbentuk ± 45º sehingga akan memperbaiki penampilan kurva. Sebelum konversi Konsentrasi fraksi air teh hijau % Scavenging (mg/ml)

0,033 0,067 0,100 0,133 0,167 Persamaan garis regresi y = 106,840 x + 25,351 α= 89,46º

28,821 32,247 36,325 39,983 42,800

Setelah konversi Konsentrasi fraksi air teh hijau % Scavenging (mg/150ml)

4,950 10,050 15,000 19,950 25,050 Persamaan garis regresi y = 0,712 x + 25,351 α= 35,45º

28,821 32,247 36,325 39,983 42,800


Lampiran 7. Tabel koefisien korelasi (r) (Muth, 1999)


Lampiran 8. Tabel random sampling (random numbers table) (Muth, 1999)


BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Uji Antioksidan Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air Ekstrak Etanol Teh Hijau melalui

Penangkapan

Metode

Deoksiribosa”

Radikal

Hidroksil

memiliki

nama

dengan lengkap

Aprilliana Sari Dewi. Penulis lahir di Magetan, Jawa Timur pada tanggal 21 April 1983, merupakan anak pertama dari dua bersaudara dari pasangan Sutrisno, B.A., dan Sri Sukanti. Pendidikan formal yang telah ditempuh oleh penulis: TK Tunas Harapan Bendo Magetan pada tahun 1988-1989, SD Negeri 2 Dukuh-Bendo Magetan pada tahun 1989-1995, SLTP Negeri 4 Magetan pada tahun 1995-1998, SMU Negeri 1 Magetan pada tahun 1998-2001 dan selanjutnya penulis melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2002. Selama kuliah penulis pernah menjadi asisten dosen untuk mata kuliah praktikum Farmakognosi-Fitokimia III, serta menjadi panitia dalam beberapa kegiatan kemahasiswaan.

UJI ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT DAN FRAKSI AIR EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU MELALUI PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL DENGAN METODE DEOKSIRIBOSA SKRIPSI

Recommend Documents