UJI SITOTOKSISITAS FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL 70% BUAH PARE (Momordica charantia L.) TERHADAP SEL HeLa CYTOTOXICITY ASSAY ETHYL ACETATE FRACTION OF ETHANOL 70% EXTRACT OF BITTER MELON FRUIT (Momordica charantia L) ON HeLa CELL Amalia Zahrah, Kusmardi dan Hadi Sunaryo Fakultas Farmasi dan Sains Universitas Muhammadiyah Prof. Dr. Hamka
Abstract In previous research ethanol 70% extract of bitter melon fruit against HeLa cells had LC50 values of 51.56 µg / ml. This research aimed at determining the cytotoxic effect of ethyl acetate fraction of ethanol 70% extract of bitter melon fruit the HeLa cells. In vitro cytotoxicity assay performed by viable cell count. Fraction of ethyl acetate made of ethanol 70% extract of bitter melon fruit Five concentrations for the assay solution was 72,91; 51,56; 36,46; 25,78; 18,23 μg/ml. Cells mix to Cisplatin as a positive control with five concentration was 3; 2;, 1; 0.5; and 0.25 µg / ml. And then the test was performed of HeLa cells with an incubation period of 24 and 48 hours. Results obtained LC50 Cisplatin 24 hour incubation at 0.4075 µg / ml, the ethyl acetate fraction LC50 of ethanol 70% extract of 24 and 48 hour incubation at 34.9221 and 22,1871 µg / ml. It can be concluded that ethyl acetate fraction of ethanol 70% extract bitter melon fruit (Momordica charantia L.) have cytotoxic effect of HeLa cells are included in the range are extremely toxic 5-50 µg/ml and has the potential for anticancer drug. Keywords: Momordica charantia L., Cytotoxicity, HeLa cell Abstrak Pada penelitian sebelumnya dengan menggunakan ekstrak etanol 70% buah pare terhadap sel HeLa memiliki nilai LC50 51,56 μg/ml. Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan penelitian ini yang bertujuan untuk mengetahui efek sitotoksik fraksi etil asetat dari ekstrak etanol 70% buah pare terhadap sel HeLa sehingga diketahui nilai LC50. Uji sitotoksisitas dilakukan secara in vitro dengan metode perhitungan langsung. Fraksi etil asetat dari ekstrak etanol 70% sebagai larutan uji dibuat 5 konsentrasi yaitu 72,91; 51,56; 36,46; 25,78; 18,23 μg/ml. Sel ditambah Cisplatin sebagai kontrol positif dibuat 5 konsentrasi yaitu 3; 2; 1; 0,5; dan 0,25 µg/ml. Kemudian dilakukan pengujian terhadap sel HeLa dengan masa inkubasi dilakukan dalam waktu 24 jam dan 48 jam. Hasil didapatkan LC50 Cisplatin inkubasi 24 jam sebesar 0,4075 µg/ml, LC50 Fraksi etil asetat dari ekstrak etanol 70% inkubasi 24 dan 48 jam sebesar 34,9221 dan 22,1871 µg/ml. Dapat disimpulkan bahwa fraksi etil asetat dari ekstrak etanol 70% buah pare (Momordica charantia L.) memiliki sifat sitotoksik terhadap sel HeLa yang masuk dalam rentang amat sangat toksik yaitu 5-50 µg/ml dan memiliki potensi untuk obat antikanker. Kata kunci : Momordica charantia L., Sitotoksisitas, Sel HeLa
PENDAHULUAN Kanker adalah pertumbuhan sel yang tidak normal atau terus menerus dan tidak terkendali, dapat merusak jaringan disekitarnya serta dapat menjalar ketempat yang jauh dari asalnya. Suatu komplek sel yang mendadak menjadi liar dan memperbanyak diri secara pesat dan terus menerus (proliferasi). Akibatnya terjadi pembengkakan yang disebut tumor atau neoplasma (neo: baru, plasma : bentukan). Sel-sel kanker ini menginfiltrasi ke dalam jaringan – jaringan yang ada disekitarnya dan memusnahkannya sehingga dapat menyebabkan kematian (Indrawati, 2009). Sel kanker bersifat ganas dan dapat menyebabkan kematian, dapat berasal atau tumbuh dari setiap sel tubuh manusia,salah satunya kanker serviks . Ada berbagai faktor pemicu kanker, baik dari dalam tubuh sendiri maupun dari luar. Faktor luar pemicu kanker antara lain adalah lingkungan, zat karsinogenik, infeksi dan radikal bebas (E. Greer, 2010). Pengobatan penyakit kanker sering dilakukan dengan cara operasi atau pembedahan, penyinaran atau radiasi dan kemoterapi, yang sekarang berkembang menjadi imunoterapi. Pengobatan ini ditujukan untuk membunuh sel-sel kanker sehingga tidak dapat berkembang dan membahayakan bagi tubuh (Diyah, 2000). Pengobatan secara modern ini memerlukan biaya yang tinggi dan hasilnya seringkali tidak memuaskan sehingga pengobatan tradisional dengan menggunakan tanaman obat menjadi salah satu alternatif pengobatan penyakit kanker. Dalam pengobatan tradisional, tanaman pare (Momordica charantia L.) memberikan andil yang cukup besar bagi masyarakat. Selain kandungan gizinya yang tinggi, tanaman pare juga mengandung khasiat sebagai obat. Tanaman pare banyak dimanfaatkan untuk mengobati beberapa penyakit, seperti obat batuk, radang tenggorokan, sakit mata merah, demam, malaria, menambah nafsu makan, kencing manis, rhematik, sariawan, abses, sakit lever, sembelit, cacingan Buah pare mengandung alkaloid, flavonoid, dan saponin (Tati, S 2004). Pada penelitian sebelumnya ekstrak etanol 70% buah pare (Momordica charantia L.) mengunakan sel HeLa dengan nilai LC50 51,56 µg/ml (Martini, 2005). Penelitian ini menunjukan bahwa senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak tersebut memiliki toksisitas dan dapat diartikan bahwa senyawa yang terkandung dalam ekstrak tersebut memiliki potensi sangat sitotoksik (Priyanto, 2009).
Gambar 1. Tanaman buah pare Untuk mengetahui adanya efek sitotoksik yang terkandung dalam buah pare maka perlu dilakukan uji sitotoksik fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% buah pare (Momordica charantia L.) terhadap sel HeLa.Untuk uji sitotoksisitas penggunaan kultur sel HeLa semakin disenangi karena berbagai alasan, diantaranya mampu menurunkan biaya percobaan yang
mahal karena menggunakan hewan, waktu yang diperlukan lebih cepat. Pengembangan metode in vitro sebagai alternatif pengganti uji dengan menggunakan hewan uji mempunyai relevansi yang cukup baik yang bertujuan untuk mendeteksi potensi suatu obat pada manusia. METODOLOGI PENELITIAN Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah simplisia kering buah pare (Momordica Charantia) yang telah dideterminasi di Herbarium Bogoriensis, Bogor. Beberapa bahan kimia yang dipakai untuk mengidentifikasi bahan kimianya (alkaloid, saponin, flavonoid, triterpenoid dan steroid). Bahan-bahan lainnya adalah etanol 70% (C2H5OH), etil asetat, dimetil sulfoksida (DMSO), medium kultur Rosewell Park Memorial Institute (RPMI)1640, HEPES, Fetal Bovine Serum (FBS), penisilin-streptomisin, fungizon, natrium bikarbonat, dinatrium hidrogen fosfat, kalium dihidrogen fosfat, natrium klorida (NaCl), biru tripan, akuabidest, cisplatin. Alat Alat-alat yang digunakan untuk pembuatan ekstrak etanol 70% dan fraksi etanol terdiri dari toples kaca, timbangan analitik, gelas ukur, vakum uap (rotary evaporator), lemari es, oven, mesin penggiling, corong buchner, cawan porselen, penangas air dan corong pisah. Alat untuk uji sitotoksisitas terdiri dari gelas ukur, gelas beker, blue tip, yellow tip, tabung conical steril ukuran 15 dan 45 ml, tissue culture flask ukuran 25 dan 75 cm (TCF), tabung eppendrof, pH meter, timbangan analitik, autoklaf, sentrifuse, inkubator CO2, laminar air flow biological safety cabinet, mikroskop, pipet mikro, microplate 96 sumuran, hemositometer, cell counter, tangki nitrogen cair, membran filter steril berdiameter 0,2 µm, lemari es, kamera digital. Prosedur 1. Pembuatan ekstrak etanol 70% buah pare. Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi yaitu dengan memasukkan 1,1 kg serbuk kering simplisia kedalam botol bermulut (maserator) kemudian ditambahkan 10 bagian etanol 70%. Rendam selama 6 jam pertama sambil sesekali diaduk agar zat aktif yang terdapat pada simpisia terlarut, kemudian didiamkan selama 18 jam. Dipisahkan maserat dengan menggunakan kertas saring, diulangi proses penyarian sekurang-kurangnya dua kali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan vakum rotary evaporator pada suhu 50 °C hingga kental tetapi masih bisa dituang. Kemudian dikeringkan di dalam oven pada suhu 40 °C hingga diperoleh bobot tetap (Depkes, RI, 2008). 2. Fraksinasi etil asetat ekstrak etanol 70 % buah pare (Momordica charantia L.) Ekstrak etanol 70% dimasukkan ke dalam corong pisah. Kemudian di fraksinasi dengan pelarut n-Heksan dengan perbandingan (1:1), kocok selama ± 15 menit. Setelah didiamkan beberapa lama terbentuk 2 lapisan, yaitu lapisan n-Heksan dengan lapisan etanol 70%. Lapisan n-Heksan ( bagian atas ) dipisahkan dengan membuka kran (corong) pisah sampai lapisan etanol habis. Diambil lapisan n-Heksan kemudian dipisahkan sebagai fraksi nheksan. Lapisan etanol kemudian difraksinasi kembali dengan pelarut etil asetat dengan perbandingan (1:1), kocok selama ± 15 menit. Setelah didiamkan beberapa lama terbentuk 2 lapisan, yaitu lapisan etil asetat dan lapisan etanol 70%. Lapisan etil asetat ( bagian atas) dipisahkan dengan membuka kran corong pisah sampai lapisan etanol habis. Diambil lapisan etil asetat kemudian dipisahkan sebagai fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat diuapkan dengan vacum rotary evaporator pada suhu 50 ºC hingga kental tapi masih bisa dituang. Kemudian fraksi tersebut dikeringkan dalam oven pada suhu 40ºC hingga diperoleh bobot tetap. 3. Identifikasi golongan kimia Uji penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya kandungan alkaloid, saponin, flavonoid, dan triterpenoid.
4. Pembuatan larutan uji fraksi etil asetat dari ekstrak buah pare Fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% buah pare ditimbang sebanyak 50 mg dan dilarutkan dalam labu 10 ml sehingga konsentrasi larutan induk 5000 μg/ml. Dari larutan induk dipipet sebanyak 100 μl dan ditambahkan pelarut 900 μl sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 500 μg/ml. Dari larutan ini dibuat pengenceran dengan konsentrasi 72,91; 51,56; 36,46; 25,78; 18,23 μg/ml untuk fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% buah pare. Semua larutan uji dibuat dengan pengenceran bertingkat. Pembuatan larutan uji dilakukan secara aseptis di dalam LAF. Tabel I. Persentase kematian sel HeLa pada fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% buah pare inkubasi 24 jam. Tabel II. Persentase kematian sel HeLa pada fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% buah pare inkubasi 48 jam. Konsentr asi (µg/ml) 72,91
Log % konsentr Kemati asi (X) an 1,8628 81,4
Probit (Y) 5,9827
51,56
1,7123
68,3
5,4761
36,46
1,5618
51,7
5,0426
25,78
1,4112
32,4
4,5435
18,23
1,2608
24,2
4,3001
Y= 2,7359 + 0,7781X r = 0,9956 LC50 = 34,9221 µg/ml Konsentr Log asi konsent (µg/ml) rasi (X) 72,91 1,8628 51,56 1,7123 36,46 1,5618 25,78 1,4112 18,23 1,2608 Y= 3,0995 + 0,8279X r = 0,9934 LC50 = 22,1871 µg/ml
% Kematian
Probit (Y)
95,6 84,5 73,4 59,2 40,7
6,7060 6,0152 5,6250 5,2327 4,7647
Pembuatan larutan pembanding cisplatin Sebagai kontrol positif sel ditambah cisplatin dibuat dengan membuat larutan induk cisplatin sebanyak 0,2 ml injeksi cisplatin dengan sediaan 0,5 mg/ml dan ditambahkan pelarut 9,8 ml sehingga diperoleh konsentrasi 10 μg/ml. Kemudian dibuat 5 konsentrasi yaitu 3; 2: 1; 0,5; dan 0,25 μg/ml. Pembuatan larutan kontrol positiif dilakukan secara aseptis di dalam LAF. 5. Kepadatan sel 20 μl suspensi sel HeLa dengan 180 μl biru tripan di bawah mikroskop. Sebanyak 10 μl campuran dipipet ditaruh pada permukaan kamar hitung dengan menyinggung pinggir kaca
penutup. Biarkan kamar hitung terisi larutan perlahan-lahan sampai penuh. Sel diamati dengan pembesaran 100 kali. Jumlah Sel dihitung dengan rumus n Kepadatan sel/ml = 10 4 sel/ml 25 Keterangan: n : jumlah sel dalam 25 bilik 4 : jumlah bilik hemositometer yang dihitung P : faktor pengenceran 104 : 10.000 sel/ml 6. Uji Sitotoksisitas metode perhitungan langsung (viable cell count). Metode penghitungan langsung dilakukan dengan cara pengecatan yang menggunakan larutan biru tripan. Biru tripan akan berikatan dengan protein sel yang keluar dan membran sel yang mengalami kerusakan. Sel yang mati akan menyerap warna biru tripan sedangkan sel yang hidup tidak menyerap warna biru tripan karena tidak mengalami kerusakan pada membran sel (Khotimah, K, 2004). Persentase kematian sel dengan metode perhitungan langsung (viable cell count) dihitung dengan menggunakan rumus . jumlahsel yang hidup viabilitas 100%.......................................(3) total jumlahsel
% kematian 100% % viabilitas....................................................(4) Pada penelitian ini dibagi dalam 4 kelompok pengujian yaitu media ditambah sel sebagai kontrol negatif, sel ditambah pelarut DMSO sebagai kontrol pelarut, sel ditambah cisplatin sebagai kontrol positif dibuat sebanyak 5 konsentrasi yaitu 3; 2: 1; 0,5; dan 0,25 μg/ml. Dan pengujian larutan sampel uji fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% buah pare dibuat sebanyak 5 konsentrasi sebagai berikut: 72,91; 51,56; 36,46; 25,78; 18,23 μg/ml. Masing-masing dimasukan ke dalam mikroplate 96 sumuran sebanyak 100 μl kemudian ditambah suspensi sel sebanyak 100 μl ke dalam tiap sumuran, sehingga tiap sumuran berisi 200 μl larutan. Seri kadar dilakukan tiga kali replikasi (triplo) untuk mendapatkan hasil yang lebih valid. Selanjutnya kultur diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Untuk menghitung jumlah sel tiap sumuran diambil medianya sebanyak 50 μl kemudian ditambahkan 50 μl larutan biru tripan. Setelah kurang lebih 3 menit diresuspensi diambil 10 μl untuk dihitung jumlah selnya menggunakan hemositometer. Persen kematian yang diperoleh masing-masing konsentrasi diubah ke dalam angka probit dengan menggunakan tabel probit, Dari data ini dibuat persamaan regresi linier untuk melihat hubungan antar perlakuan dengan persen kematian sel. Perhitungan dengan cara probit ini dilakukan dengan memasukan 5 angka sebagai probit ke dalam persamaan regresi linier, kemudian hasil disubstitusi dan diganti logaritma sehingga diperoleh nilai LC50. HASIL DAN PEMBAHASAN Buah pare diekstraksi dengan cara maserasi dengan menggunakan pelarut etanol 70%. Pemilihan metode pengekstrakan dengan cara maserasi karena sederhana dan mudah dalam pelaksanaannya. Sedangkan penggunaan etanol 70% sebagai pelarut karena ekstrak yang didapat menjadi tidak mudah ditumbuhi kapang dan lebih mudah menguap sehingga waktu yang dibutuhkan untuk pemekatan dan pengeringan menjadi lebih singkat. Dari hasil identifikasi senyawa kimia ekstrak etanol 70% didapat beberapa golongan senyawa seperti, alkaloid, flavonoid, saponin, triterpenoid dan steroid. Pada fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% terdapat senyawa alkaloid, flavonoid, saponin dan steroid.
% kematian
Pada penelitian sebelumnya menggunakan ekstrak etanol 70% buah pare terhadap sel HeLa memiliki nilai LC50 51,56 μg/ml. Penelitian ini menunjukan bahwa senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak tersebut memiliki range toksik, dapat diartikan pula bahwa senyawa yang terkandung dalam ekstrak tersebut memiliki potensi sitotoksik. Maka dilakukan penelitian lanjutan dengan uji sitotoksisitas dengan menggunakan pelarut fraksi yang sama. Dan diharapkan dapat lebih banyak menarik zat yang berpotensi sebagai anti kanker. Untuk uji sitotoksisitas penggunaan kultur sel semakin disenangi karena berbagai alasan, diantaranya mampu menurunkan biaya percobaan yang mahal karena menggunakan hewan, waktu yang diperlukan lebih cepat. Pengembangan metode in vitro sebagai alternatif pengganti uji dengan menggunakan hewan uji mempunyai relevansi yang cukup baik yang bertujuan untuk mendeteksi potensi suatu obat pada manusia. Uji sitotoksisitas ini menggunakan sel HeLa karena tujuan dari penelitian ini untuk mencari obat untuk kanker serviks yang berasal dari bahan alam. Penggunaan sel HeLa ini juga karena sel HeLa merupakan turunan dari sel epitel kanker leher rahim atau serviks manusia dan sel HeLa cukup aman dan sering digunakan untuk kepentingan kultur sel. Uji sitotoksisitas dengan metode perhitungan langsung dilakukan dengan menggunakan hemositometer dengan pewarna biru tripan. Sel yang mati akan menyerap warna biru tripan karena adanya kerusakan pada membran selnya, sedangkan pada sel yang hidup biru tripan tidak dapat terserap karena membran sel masih dalam keadaan utuh. Sel yang mati akan berbentuk bulat dan berwarna keruh dan sel yang hidup berbentuk bulat panjang dan terlihat bening. Cisplatin digunakan sebagai kontrol positif karena telah banyak digunakan sebagai obat kanker leher rahim. Sitotoksisitas pemberiannya dapat terjadi pada setiap siklus sel khususnya pada fase G1 dan S. Cisplatin yang masuk akan terikat pada N7 guanin DNA membentuk hubungan melintang dan saling mengikat antara rantai – rantai DNA didalam inti sel sehingga terjadi kerusakan DNA dan RNA sel. Kerusakan ini akan menyebabkan penggandaan DNA terganggu dan proses proliferase akan terhambat. Penelitian dilakukan dengan lama waktu inkubasi 24 jam dan 48 jam karena pada inkubasi 24 jam akan diperoleh nilai LC50nya. Sedangkan pada pengujian dengan inkubasi 48 jam untuk mengetahui efektifitasnya sebagai senyawa sitotoksik. 120 100 80 60 40 20 0
y = 0,9398x + 32,158 r = 0,9074
y = 1,075x + 7,5399 r = 0,9605 0
20
40
60
80
konsentrasi (µg/ml) Inkubasi 24 jam
Inkubasi 48 jam
Linear (Inkubasi 24 jam )
Linear (Inkubasi 48 jam )
Gambar 2. Grafik hubungan konsentrasi (µg/ml) dengan persen kematian
KESIMPULAN Pada penelitian ini didapat LC50 pada fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% sebesar 34,9221 µg/ml . Berdasarkan nilai LC50 yang diperoleh dari kedua fraksi diketahui bahwa buah pare memiliki sifat sitotoksisitas. Pada penelitian lanjutan dengan inkubasi 48 jam nilai LC50 fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% adalah 22,1871 µg/ml. Hasil penelitian menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% buah pare memiliki efek sitotoksik terhadap sel HeLa dan memiliki potensi amat sangat toksik sehingga dapat dikembangkan sebagai obat antikanker. DAFTAR PUSTAKA Departemen Kesehatan RI, 2008. Farmakope Herbal Indonesia Edisi 1. Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Hal 174-175 Diyah, Nurul W, dan Sukohardjono. 2000. Antikanker, dalam: Kimia Medisinal, ed. Kedua, Airlangga University Press, Surabaya. Direktorat Pengendalian Penyakit Tidak Menular. 2009. Buku Saku Pencegahan Kanker Leher Rahim dan Kanker Payudara. Bakti Husada, Jakarta.Hal 1, 4-5. E. Greer ,Benjamin,dkk. Cervical Cancer.2010. Journal Of The National Comprehensive Cancer Network. Hal 1388,1408-1420. Indrawati. 2009. Bahaya Kanker Bagi Wanita dan Pria Pengenalan, Penanganan, dan Pencegahan Terhadap Kanker.AV Publisher, Jakarta Hal. 1-7, 164-180. Khotimah, K.2004. Uji Sitotoksisitas dan Antiproliferasi Fraksi Petroleum Eter dan Fraksi Etanol Kulit Batang Kamboja (Plumeria acuminate Ait) Terhadap Sel HeLa. Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan.Yogyakarta. Hal.21. Priyanto. 2009. Toksikologi Mekanisme, Terapi Antidotum, dan Penilaian Resiko. Lembaga Studi dan Konsultasi Farmakologi, Jawa Barat. Hal.152. Tati, S dan S. Subahar. 2004. Khasiat dan Manfaat Pare si Pahit Pembasmi Penyakit. Agromedia Pustaka. Jakarta.
