UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl) EKSTRAK BROMELAIN BUAH NANAS (Ananas comosus (L.) Merr

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl) EKSTRAK BROMELAIN BUAH NANAS (Ananas comosus (L.) Merr.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Richard Andrison Sadeli NIM : 128114120

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016



SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi


FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016 i


Persetujuan Pembimbing


Skripsi yang diajukan oleh: Richard Andrison Sadeli NIM : 128114120

telah disetujui oleh:

Pembimbing Utama

(Dr. Yustina Sri Hartini, Apt.)

tanggal 23 Juni 2016

ii


Pengesahan Skripsi Berjudul



Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Pada tanggal : 23 Agustus 2016

Mengetahui Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Dekan

(Aris Widayati, M.Si., Apt., Ph.D.)

Panitia Penguji :

Tanda tangan

1. Dr. Yustina Sri Hartini, Apt.

...................................

2. Maywan Hariono, Ph.D., Apt.

...................................

3. Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc.

...................................

iii


Karya ilmiah ini kupersembahkan untuk: Tri Tunggal Mahakudus dan seluruh umat manusia yang menganggap karya ini bermanfaat.

iv


PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah. Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundangundangan yang berlaku.

Yogyakarta, 20 Mei 2016 Penulis

Richard Andrison Sadeli

v


LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama

: Richard Andrison Sadeli

Nomor mahasiswa

: 128114120

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul: “UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl) EKSTRAK BROMELAIN BUAH NANAS (Ananas comosus (L.) Merr.)” Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pengkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama saya tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Dengan demikian penyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 20 Mei 2016 Yang menyatakan

(Richard Andrison Sadeli)

vi


PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat, kasih, dan penyertaany-Nya yang begitu besar, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH (1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl) Ekstrak Bromelain Buah Nanas (Ananas comosus (L.) Merr.)” dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat dalam memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Dalam proses penelitian dan penyusunan skripsi, penulis mendapatkan banyak bantuan, bimbingan, saran, kritik, dan dukungan dari banyak pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Apt., Ph.D., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Ibu Dr. Sri Hartati Yuliani, Apt., selaku Ketua Program Studi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 3. Ibu dr. Fenty, M.Kes., Sp.PK., selaku Dosen Pembimbing Akademik penulis atas bimbingan dan nasehat yang diberikan selama ini. 4. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dosen Pembimbing Skripsi atas kesabaran dalam memberikan bimbingan, saran, kritik, dan dukungan hingga terselesaikannya skripsi ini dengan baik.

vii


5. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku Dosen Penguji Skripsi atas saran dan kritik yang membangun, serta atas kesediaannya dalam menguji skripsi ini. 6. Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc., selaku Dosen Penguji Skripsi atas saran dan kritik yang membangun, serta atas kesediaannya dalam menguji skripsi ini. 7. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 8. Mas Wagiran dan Pak Musrifin, selaku laboran di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia dan Laboratorium Formulasi Teknologi Sediaan Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas bantuan yang telah banyak diberikan kepada penulis saat proses penelitian. 9. Yohanes Bintang Pambudi, sebagai teman seperjuangan dalam penelitian, atas semangat, kerjasama, dan diskusi selama ini. 10. Maria Septi Iriana, atas semangat, dukungan, dan kasih sayang yang selalu menyertai perjalanan penulis. 11. Sona Karisnata Inriano dan Adis Pranaya Yakin, sebagai tim At a Glance, sahabat dan partner dalam menjalani perkuliahan, atas semangat, dukungan, saran, kritik, dan hal-hal lainnya. 12. Teman-teman FKK B angkatan 2012 atas kebersamaan dan keceriaan selama ini. 13. Mereka yang mengubah dunia dengan karyanya: penemu komputer yaitu Charles Babbage, penemu Microsoft yaitu Bill Gates dan Paul Allen, penemu

viii


Internet yaitu Robert E. Kahn dan Vinton G. Cerf, penemu Google yaitu Larry Page dan Sergey Brin, penemu alat cetak yaitu Johann Gutenberg, dan penemu kertas yaitu Cai Lun. Tanpa keberadaan mereka maka skripsi ini pun tidak akan pernah terwujud. 14. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu, atas doa dan dukungan yang telah diberikan kepada penulis. Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, dengan kerendahan hati penulis bersedia menerima saran dan kritik dalam menyempurnakan skripsi ini. Penulis berharap skripsi ini dapat bermanfaat bagi para pembaca dan pengembangan ilmu pengetahuan, khususnya di bidang farmasi.

Yogyakarta, 20 Mei 2016 Penulis

Richard Andrison Sadeli

ix


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ...............................................................................

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................

ii

HALAMAN PENGESAHAN .................................................................

iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ..............................................................

iv

LEMBAR PENYATAAN KEASLIAN KARYA ...................................

v

LEMBAR PENYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ......

vi

PRAKATA ...............................................................................................

vii

DAFTAR ISI ............................................................................................

x

DAFTAR TABEL ....................................................................................

xv

DAFTAR GAMBAR ...............................................................................

xvi

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................

xvii

INTISARI ................................................................................................

xviii

ABSTRACT .............................................................................................

xix

BAB I PENGANTAR ..............................................................................

1

A. Latar Belakang ...................................................................................

1

1. Permasalahan ...............................................................................

3

2. Keaslian penelitian .......................................................................

3

3. Manfaat penelitian .......................................................................

4

a. Manfaat teoritis ......................................................................

4

b. Manfaat praktis ......................................................................

4

B. Tujuan Penelitian ...............................................................................

5

x


1. Tujuan umum ................................................................................

5

2. Tujuan khusus ...............................................................................

5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ......................................................

6

A. Nanas ..................................................................................................

6

1. Taksonomi....................................................................................

6

2. Morfologi .....................................................................................

6

3. Kegunaan .....................................................................................

8

4. Kandungan kimia .........................................................................

8

B. Bromelain ...........................................................................................

8

1. Sifat fisika dan biokimia ..............................................................

8

2. Sifat farmakologi .........................................................................

9

3. Bioavailabilitas dan toksisitas ......................................................

10

4. Isolasi ...........................................................................................

10

C. Metode Ninhidrin ...............................................................................

11

D. Radikal Bebas ....................................................................................

12

E. Antioksidan ........................................................................................

13

F. Metode DPPH ....................................................................................

14

G. Landasan Teori ...................................................................................

15

H. Hipotesis ............................................................................................

17

BAB III METODE PENELITIAN ..........................................................

18

A. Jenis dan Rancangan Penelitian .........................................................

18

B. Variabel dan Definisi Operasional .....................................................

18

1. Variabel utama ............................................................................

18

xi


a. Variabel bebas .......................................................................

18

b. Variabel tergantung ...............................................................

18

2. Variabel pengacau .......................................................................

18

a. Variabel pengacau terkendali ................................................

18

b. Variabel pengacau tidak terkendali .......................................

18

3. Definisi operasional ....................................................................

19

a. Aktivitas antioksidan .............................................................

19

b. Ekstrak bromelain..................................................................

19

c. Kadar enzim ..........................................................................

19

d. Persen inhibition concetration (%IC)....................................

19

e. Inhibition concetration 50 (IC50)...........................................

19

C. Bahan Penelitian .................................................................................

19

D. Alat Penelitian ....................................................................................

20

E. Tata Cara Penelitian............................................................................

20

1. Determinasi buah nanas ..............................................................

20

2. Pengumpulan buah nanas ............................................................

21

3. Pembuatan ekstrak bromelain daging buah nanas ......................

21

a. Ekstraksi buah nanas .............................................................

21

b. Purifikasi ekstrak bromelain dengan teknik ethanol precipitation ..........................................................................

21

4. Analisis kualitatif bromelain .......................................................

22

a. Reaksi warna .........................................................................

22

5. Penetapan kadar enzim bromelain ..............................................

22

xii


a. Pembuatan larutan uji ............................................................

22

b. Pembuatan larutan baku ........................................................

23

c. Penentuan operating time (OT) .............................................

23

d. Penetapan panjang gelombang maksimum ...........................

23

e. Pengukuran absorbansi larutan baku dan uji .........................

23

f. Estimasi kadar enzim.............................................................

24

6. Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan ................................

24

a. Pembuatan larutan DPPH.......................................................

24

b. Pembuatan larutan rutin .........................................................

24

c. Pembuatan larutan uji ............................................................

24

7. Uji aktivitas antioksidan ..............................................................

25

a. Uji pendahuluan .....................................................................

25

b. Penentuan operating time (OT)..............................................

25

c. Penetapan panjang gelombang maksimum ............................

25

d. Pengukuran absorbansi larutan kontrol DPPH.......................

26

e. Pengukuran absorbansi larutan rutin dan uji ..........................

26

f. Estimasi aktivitas antioksidan ................................................

26

F. Analisis Hasil ......................................................................................

27

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................

28

A. Hasil Determinasi Tanaman ...............................................................

28

B. Hasil Pengumpulan Bahan .................................................................

28

C. Hasil Isolasi Bromelain ......................................................................

29

D. Hasil Analisis Kualitatif Ekstrak Bromelain ......................................

33

xiii


E. Hasil Optimasi Metode Penatapan Kadar Bromelain ........................

36

1. Penentuan operating time (OT)....................................................

36

2. Penetapan panjang gelombang maksimum ..................................

37

F. Hasil Penetapan Kadar Bromelain .....................................................

38

G. Hasil Optimasi Uji Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH ....

42

1. Penentuan operating time (OT)....................................................

42

2. Penetapan panjang gelombang maksimum ..................................

44

H. Hasil Uji Pendahuluan Aktivitas Antioksidan ...................................

46

I.

Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH ...........

47

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN....................................................

56

A. Kesimpulan ........................................................................................

56

B. Saran ..................................................................................................

56

DAFTAR PUSTAKA ...............................................................................

57

LAMPIRAN ..............................................................................................

61

BIOGRAFI PENULIS ..............................................................................

88

xiv


DAFTAR TABEL Halaman Tabel I.

Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum BSA ........................................................................................

38

Hasil pengukuran seri baku BSA ...........................................

40

Tabel III. Kadar bromelain ekstrak bromelain daging buah nanas ........

41

Tabel II.

Tabel IV. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum DPPH...................................................................................... Tabel V.

45

Hasil pengukuran aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH......................................................................................

51

Tabel VI. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak bromelain daging buah nanas dengan metode DPPH..............................

51

Tabel VII. Hasil IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas ....

52

xv


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.

Struktur ninhidrin ..............................................................

12

Gambar 2.

Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan .......

15

Gambar 3.

Proses ekstraksi dan isolasi enzim bromelain ...................

33

Gambar 4.

Reaksi asam amino dengan ninhidrin ................................

34

Gambar 5.

Hasil uji ninhidrin dan perubahan warnanya .....................

35

Gambar 6.

Grafik penentuan OT BSA ...............................................

36

Gambar 7.

Kurva baku BSA untuk penetapan kadar bromelain ekstrak bromelain daging buah nanas ................................

41

Gambar 8.

Grafik penentuan OT Rutin ...............................................

43

Gambar 9.

Gugus kromofor dan auksokrom radikal DPPH ...............

44

Gambar 10. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan ......................

47

Gambar 11. Perubahan warna larutan DPPH akibat reaksi dengan antioksidan .........................................................................

48

Gambar 12. Struktur rutin .....................................................................

50

xvi


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1.

Surat pengesahan determinasi tanaman nanas ................

61

Lampiran 2.

Gambar buah nanas .........................................................

62

Lampiran 3.

Perhitungan rendemen .....................................................

63

Lampiran 4.

Penimbangan analisis kualitatif bromelain .....................

64

Lampiran 5.

Penimbangan penetapan kadar enzim bromelain ............

64

Lampiran 6.

Optimasi penetapan kadar bromelain ..............................

65

Lampiran 7.

Penetapan kadar enzim bromelain ..................................

68

Lampiran 8.

Penimbangan pengujian aktivitas antioksidan. ...............

72

Lampiran 9.

Perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding, dan larutan uji ..................................................................

73

Lampiran 10. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan ......................

75

Lampiran 11. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH ...

80

Lampiran 12. Perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas ...........................................................

82

Lampiran 13. Uji statistik ......................................................................

85

xvii


INTISARI Buah nanas (Ananas comosus (L.) Merr.) memiliki kandungan enzim bromelain. Bromelain merupakan salah satu enzim protease yang bisa digunakan dalam perawatan luka yang berhubungan dengan radikal bebas. Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi radikal bebas dalam tubuh. Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan kadar enzim dan menguji aktivitas antioksidan ekstrak bromelain daging buah nanas. Identifikasi enzim ditentukan secara kualitatif dengan metode uji warna ninhidrin yang memiliki prinsip pembentukan warna biru-ungu dari reaksi antara ninhidrin dan asam amino, dan secara kuantitaif dengan metode spektrofotometri ultraviolet dan baku standar berupa bovine serum albumine (BSA) yang memiliki prinsip pengukuran absorbansi dari cincin aromatik yang dimiliki oleh enzim. Aktivitas antioksidan ditentukan dengan metode DPPH yang memiliki prinsip penurunan intensitas absorbansi DPPH yang sebanding dengan kenaikan konsentrasi senyawa antioksidan yang dinyatakan dalam IC50 (Inhibition Concentration 50). Penelitian menunjukan bahwa kadar enzim ekstrak bromelain buah nanas sebesar 8,4967±0,0289 % b/b dan aktivitas antioksidan ekstrak bromelain buah nanas dengan nilai IC50 sebesar 4,7221±0,0287 mg/mL. Kata kunci: enzim, bromelain, Ananas comosus (L.) Merr., aktivitas antioksidan, DPPH, IC50.

xviii


ABSTRACT

Pineapple fruits (Ananas comosus (L.) Merr.) contain bromelain enzyme. Bromelain is one of proteases that have been used for wound treatment which associated with free radical. Antioxidant is a compound that can inhibit the reaction of free radicals within the body. The aims of this study are to determine enzyme content and antioxidant activity of bromelain extracted from pineapple fruit. Enzyme identification was determined qualitatively using ninhydrin, in which it’s principle is a production of Ruhemann’s purple from the reaction between ninhydrin and amino acids. UV spectrophotometric method was applied to determine the enzyme content based on bovine serum albumine (BSA) as the reference. The principle of this method is according to the aromatic ring of enzyme’s absorbance measurement. Antioxidant activity was determined using DPPH radical scavenging method based on the principle that the DPPH absorbance intensity is decreasing proportionaly with the increasing of the compound’s concentration. Antioxidant activity was expressed as IC50 (Inhibition Concentration 50). Research demonstrated that the enzyme content of the pineapple fruit bromelain extract is 8,4967±0,0289 % b/b and it’s antioxidant activity with the IC50 value is 4,7221±0,0287 mg/mL. Keywords: enzyme, bromelain, Ananas comosus (L.) Merr., antioxidant activity, DPPH, IC50, total protein content.

xix


BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang Istilah antioksidan dan radikal bebas merupakan istilah yang cukup populer di kalangan ahli gizi dan tenaga kesehatan profesional lainnya. Dalam beberapa tahun ini, istilah tersebut semakin sering digunakan dan mulai menyita perhatian publik, khususnya masyarakat yang memiliki kepedulian pada kesehatan dan gaya hidup. Beberapa penelitian juga mengungkapkan peran dari stress oksidatif yang disebabkan oleh radikal bebas dalam berbagai penyakit yang berbahaya, seperti penyakit kanker, penyakit yang berhubungan dengan kardiovaskular, dan penyakit degeneratif. Penelitian-penelitian tersebut juga menyampaikan bahwa antioksidan memiliki nilai terapetik pada penyakit-penyakit tersebut (Barhe dan Tchouya, 2014). Radikal bebas adalah suatu atom atau molekul yang mempunyai elektron tidak berpasangan. Elektron tidak berpasangan tersebut menyebabkan radikal bebas sangat reaktif yang kemudian akan menangkap atau mengambil elektron dari senyawa lain seperti protein, lipid, karbohidrat, dan DNA untuk menetralkan diri. Radikal bebas dapat masuk ke dalam tubuh dan menyerang sel-sel yang sehat dan menyebabkan sel-sel tersebut kehilangan fungsi dan strukturnya. Akumulasi dari kerusakan

tersebut

berkontribusi

terhadap beberapa penyakit

dan

menyebabkan kondisi yang biasa disebut sebagai penuaan dini (Liochev, 2013).

1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2

Efek negatif radikal bebas terhadap tubuh dapat dicegah dengan senyawa yang disebut antioksidan. Antioksidan memiliki kemampuan memberikan elektron, mengikat dan mengakhiri reaksi berantai radikal bebas (Halliwell, 2012). Antioksidan dibagi menjadi dua kelompok, yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetik. Antioksidan alami berasal dari hasil ekstraksi bahan alami yang berpotensi menangkap radikal bebas, sedangkan antioksidan sintetik diperoleh dari hasil sintesis secara kimia (Isfahlan, dkk., 2010). Namun, adanya kekhawatiran

terhadap

efek

samping

penggunaan

antioksidan

sintetik

menyebabkan banyak penelitian tentang potensi antioksidan alami yang berasal dari tanaman (Saleh, Clark, Woodard, dan Deolu, 2010). Nanas (Ananas comosus (L.) Merr.) adalah salah satu dari tiga buah tropis yang paling penting setelah pisang dan jeruk. Nanas merupakan buah yang mempunyai kandungan sangat kompleks, kaya akan mineral baik makro maupun mikro, zat organik, air dan juga vitamin. Nanas mengandung gula, asam, asam askorbat, senyawa fenolik, mineral, dan enzim bromelain (Yahia, 2011). Enzim bromelain termasuk ke dalam golongan enzim protease yang mampu memecah protein rantai panjang menjadi fragmen protein yang lebih kecil bahkan sampai ke bentuk asam amino (Ali, Milala, dan Gulani 2015). Enzim bromelain adalah salah satu enzim protease yang digunakan dalam perawatan luka dan mempercepat proses regenerasi jaringan (Maurer, 2001). Enzim protease yang digunakan secara luas dalam bidang kosmetik untuk merawat kulit dan luka, regenerasi jaringan, dan mencegah timbulnya keloid umumnya memiliki aktivitas antioksidan. Antioksidan diasosiasikan dengan


regenerasi jaringan karena pembentukan keloid disebabkan oleh adanya akumulasi dari jaringan kolagen dan pembentukan jaringan pyridinoline yang dihubungkankan dengan radikal bebas (Pendzhiev, 2002). Untuk melihat potensi antioksidan dari bromelain yang telah digunakan untuk perawatan luka, dalam penelitian ini dilakukan pemeriksaan aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) secara spektrofotometri. Metode DPPH dipilih karena sederhana, mudah, cepat, dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel. Parameter yang digunakan untuk uji penangkapan radikal DPPH adalah IC50 yaitu konsentrasi ekstrak atau fraksi uji yang dibutuhkan untuk menangkap radikal DPPH sebanyak 50% (Zou, Lu, dan Wei, 2004). Pengukuran kadar enzim dari ekstrak bromelain daging buah nanas dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri ultraviolet (uv) yang merupakan salah satu metode yang cepat dan sederhana dalam menentukan kandungan enzim bromelain (Chaurasiya dan Hebbar, 2013). 1. Permasalahan a. Berapa nilai aktivitas antioksidan ekstrak bromelain daging buah nanas yang dinyatakan dengan IC50? b. Berapa kadar enzim ekstrak bromelain daging buah nanas yang dinyatakan dengan persen (% b/b)? 2. Keaslian penelitian Sejauh penelusuran peneliti, penelitian yang serupa pernah dilakukan oleh Manosroi, Chankhampan, Pattamapun, Manosroi, dan Manosroi, 2014, dengan judul “Antioxidant and Gelatinolytic Activities of Papain from Papaya


Latex and Bromelain from Pineapple Fruits”. Penelitian ini menggunakan buah nanas yang diperoleh di Chiang Mai (Thailand), purifikasi menggunakan etanol 95% dengan perbandingan 1:1 selama 30 menit, uji kualitatif dan pengukuran kadar enzim menggunakan HPLC (high performance liquid chromatography), dan

uji

aktivitas

antioksidan

dengan

metode

DPPH

(1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazyl). Perbedaan penelitian ini dengan penelitian yang pernah dilakukan tersebut teletak pada letak pemanenan buah nanas, metode purifikasi, dan metode uji kualitatif dan penetapan kadar enzim. Penelitian ini menggunakan buah nanas yang diperoleh di pasar Stan (Yogyakarta), purifikasi menggunakan etanol 90% dengan perbandingan 1:3 selama 24 jam, uji kualitatif menggunakan uji ninhidrin, dan penetapan kadar enzim menggunakan metode spektrofotometri uv. 3. Manfaat penelitian a.

Manfaat Teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya ilmu kefarmasian tentang aktivitas antioksidan ekstrak bromelain daging buah nanas. b.

Manfaat Praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat tentang aktivitas antioksidan ekstrak bromelain daging buah nanas sehingga bisa dimanfaatkan untuk memelihara kesehatan.


B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi kemanfaatan daging buah nanas sebagai antioksidan. 2. Tujuan khusus Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui nilai aktivitas antioksidan ekstrak bromelain daging buah nanas dengan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50 dan kadarnya dengan baku standar BSA yang dinyatakan dengan persen (% b/b).


BAB II TINJAUAN PUSTAKA

A. Nanas 1. Taksonomi Klasifikasi tanaman menurut Pullaiah (1998) sebagai berikut: Kingdom

: Plantae

Subkingdom : Viridiplantae Superdivision : Embryophyta Division

: Tracheophyta

Class

: Magnoliopsida

Superorder

: Lilianae

Order

: Poales

Family

: Bromeliaceae

Genus

: Ananas Mill.

Species

: Ananas comosus (L.) Merr.

2. Morfologi Tanaman nanas berbentuk semak dan hidupnya bersifat tahunan (parenial). Susunan tubuh tumbuhan nanas terdiri dari bagian utama meliputi: akar, batang, daun, bunga, dan tunas-tunas. Biji nanas berkeping tunggal. Bentuk batang nanas mirip gada, berukuran panjang antara 20-25 cm atau lebih, tebal dengan diameter 2,0-3,5 cm, beruas-ruas (buku-buku) pendek. Tangkai bunga atau

6


buah merupakan perpanjangan batang. Daun nanas tumbuh memanjang sekitar 130-150 cm, lebar antara 3-5 cm atau lebih, pinggir daun ada yang berduri atau tanpa duri, permukaan daun sebelah atas halus mengkilap berwarna hijau tua atau merah tua bergaris atau coklat kemerah-merahan, sedangkan permukaan daun dan bagian bawah berwarna keputih-putihan atau keperak-perakan. Daun mahkota lepas bentuk garis memanjang, panjang lebih kurang 2 cm, putih dan ungu, dari dalam dan pangkalnya dengan dua pinggiran menonjol, berkuku. Buah semu berdaging, hijau sampai orange, biji kecil dan kerap kali tidak menonjol. Jumlah daun tiap batang (tanaman) amat bervariasi antara 70-80 helai yang tata letaknya seperti spiral, yakni mengelilingi batang mulai dari bawah ke arah atas kanan dan kiri (Van Steenis, 1992). Bunga atau buah nanas muncul pada ujung tanaman. Bunga nanas tersusun dalam tangkai berukuran panjang antara 7-5 cm atau lebih. Tiap tangkai bunga terdiri dari 100-200 kuntum bunga yang melekat saling berhimpitan (berdempetan). Sifat pembungaan nanas termasuk menyerbuk silang, tanpa melalui penyerbukan silang buah nanas tidak akan menghasilkan biji. Kumpulan kuntuk buanga dengan adanya proses penyerbukan akan menghasilkan kumpulan buah kecil berjumlah 100-200 buah. Buah-buahan kecil tersebut bergabung menjadi satu dan dihubungkan oleh batang tengah yang disebut hati, sehingga penampakan visual seolah-olah hanya ada satu buah berbentuk bulat dengan bagian ujung kerucut (Rukmana, 1996).


3. Kegunaan Cairan buah nanas berkhasiat sebagai obat rasa penuh di lambung, sembelit, radang tenggorokan, menurunkan berat badan, beri-beri, keseleo, bengkak terpukul, darah mudah menggumpal, penyempitan pembuluh darah, menghambat pertumbuhan tumor, meningkatkan penyerapan obat, mempercepat haid, dan cacingan. Hal yang menjadi catatan khusus adalah ibu hamil dilarang meminum perasan buah nanas muda. Buah nanas dalam saluran cerna akan difermentasi menjadi alkohol yang dapat menimbulkan kambuhnya rematik gout (Pavan, Jain, Shraddha, dan Kumar, 2012). 4. Kandungan kimia Buah, daun, dan akar nanas mengandung saponin, flavonoid, dan polifenol, ergosterol, peroksida, asam annasat, asam sitrat, enzim bromelain, vitamin (A dan C), kalsium, fosfor, magnesium, besi, natrium, kalium, kalsium oksalat, dekstrosa, sukrosa, dan pectic substances. Buah nanas juga mengandung selulosa, hemiselulosa dan karbohidrat lain (Bartholomew, Paull, dan Rohrbach, 2002).

B. Bromelain 1. Sifat fisika dan biokimia Bromelain tergolong jenis enzim protease sulfhidril yang mampu menghidrolisis ikatan pepetida pada protein atau polipeptida menjadi molekul yang lebih kecil yaitu asam amino. Bromelain merupan campuran antara thiol endopeptidase dan komponen lainnya seperti fosfatase, glukosidase, peroksidase,


selulase,

glikoprotein,

karbohidrat,

dan

protease

inhibitor.

Berdasarkan

sumbernya, bromelain dibagi menjadi stem bromelain dan fruit bromelain. Terdapat perbedaan berat molekuler, titik isoelektrik, rantai asam amino, dan aktivitas proteolitik antara kedua tipe bromelain tersebut. Bromelain ini berbentuk serbuk amorf dengan warna putih bening sampai kekuning-kuningan, berbau khas, larut sebagian dalam: aseton, eter, stabil pada pH: 5,0-7,0. Suhu optimum enzim bromelain adalah 50˚C-60˚C (Maurer, 2001). 2. Sifat farmakologi Bromelain memiliki beberapa sifat farmakologi yang disebabkan oleh aktivitas proteolitiknya maupun non-proteolitiknya. Dari berbagai uji in vitro dan in vivo, maupun dari uji klinik yang terkontrol dan tidak terkontrol, bromelain memiliki kemampuan sebagai berikut:  Mencegah pembentukan edema dan mengurangi edema  Mengurangi kadar fibrinogen dalam darah  Membantu proses fibrinolisis  Mengaktifkan plasmin  Memperpanjang waktu protrombin dan parsial tromboplastin  Mencegah agregasi platelet darah dan adesi dari platelet ke sel endotelial pembuluh darah  Mengurangi kadar plasmakinin dalam darah  Mengurangi kadar prostaglandin E2 dan tromboksan A2 pada inflamasi akut dan berperan sebagai agen antiinflamasi


 Menginduksi sekresi dari interleukin (Il)-1, Il-6, Il-8, dan tumor necrosis factor (TNF)-α dari monosit dan granulosit  Meningkatkan permeabilitas jaringan dari antibiotik  Mencegah metastasis  Membantu proses debridemen kulit pada luka bakar (Bhattacharyya, 2008). 3. Bioavailabilitas dan toksisitas Bromelain diabsorbsi di saluran cerna dan masuk ke dalam peredaran darah sebanyak 40% setelah penggunaan oral pada tikus. Konsentrasi tertinggi bromelain dalam darah didapatkan setelah 1 jam dengan waktu paruh selama 6-9 jam. Penelitian melaporkan bahwa tidak ada efek toksik pada mencit, tikus, dan kelinci bila diberikan dosis sebesar 10 mg/kgBB. Pada pemberian secara intravena diperoleh LD50 pada mencit 30 mg/kgBB dan kelinci 20 mg/kgBB, sedangkan pada pemberian secara intraperitonial diperoleh LD50 pada mencit 37 mg/kgBB dan tikus 85 mg/kgBB. Penelitian toksistas kronis pada tikus pada satu periode selama 3 bulan memperlihatkan tidak adanya perubahan patologi pada organ-organ vital (Moss, Frazier, dan Martin, 1963). 4. Isolasi Bromelain terdapat pada tangkai, kulit, daun, buah, maupun batang dalam jumlah yang berbeda. Kandungan enzim bromelain lebih banyak pada batang namun selama ini kurang dimanfaatkan. Distribusi bromelain pada nanas tidak merata dan tergantung pada umur tanaman. Kandungan bromelain pada jaringan yang umurnya belum tua terutama yang bergetah sangat sedikit sekali


bahkan kadang-kadang tidak ada sama sekali, sedangkan bagian tengah batang mengandung bromelain lebih banyak dibandingkan bagian tepinya. Pada buah nanas, kandungan bromelain lebih banyak pada buah nanas yang masih hijau atau belum matang dibandingkan buah nanas segar yang sudah matang (Harrach, Schulze, Nuck, Grunow, dan Maurer, 1995). Salah satu metode yang digunakan untuk mengisolasi bromelain adalah penambahan pelarut organik. Bromelain diisolasi dari bagian tanaman nanas yang sudah berupa sari buah atau perasannya dengan menambahkan pelarut organik sebagai bahan pengendap, biasa yang digunakan adalah alkohol, aseton, dan ammonium sulfat. Cara pengendapannya berbeda-beda, ada beberapa peneliti yang melakukan pengendapan dengan menambahkan larutan pada pH tertentu dan ada yang melakukan pengendapan dengan membuat kondisi pada suhu tertentu. Hasil isolasi dengan metode ini disebut dengan crude bromelain extract (Nadzirah, Zainal, Noriham, dan Normah, 2013).

C. Metode Ninhidrin Uji kualitatif dari protein dilakukan dengan menggunakan senyawa ninhidrin. Prinsip dari metode ini adalah ninhidrin yang mula-mula berwarna kuning akan bereaksi dengan asam amino dan berubah warna menjadi biru-ungu. Warna biru-ungu yang terbentuk kepekatannya setara dengan konsentrasi asam amino, artinya semakin besar konsentrasi asam amino, maka semakin banyak ninhidrin yang bereaksi dengan asam amino menjadi senyawa kompleks


Ruhemman yang berwarna ungu, sehingga warna biru yang dihasilkan semakin pekat (Boyer, 2011). Ninhidrin bereaksi dengan gugus amino alfa yang terdapat dalam semua asam amino, peptida, dan protein. Uji ini merupakan uji yang cepat dan sensitif dalam mendeteksi asam amino, namun uji ini tidak selektif sehingga tidak bisa digunakan dalam menentukan asam amino dalam tingkat individu apabila digunakan dalam larutan yang berisi campuran asam amino. Struktur ninhidrin ditunjukan dalam gambar di bawah ini.

Gambar 1. Struktur ninhidrin (Bettelheim dan Landesberg, 2009)

D. Radikal Bebas Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang memiliki elektron bebas yang tak berpasangan (unpaired electron). Hal ini dapat dilihat misalnya pada air (H2O). Ikatan atom oksigen dengan hidrogen pada air merupakan ikatan kovalen, yaitu ikatan kimia yang timbul karena sepasang elektron dimiliki bersama oleh dua atom. Elektron yang tidak memiliki pasangan cenderung akan menarik eletron dari senyawa lainnya, sehingga elektron tersebut akan dimiliki bersama oleh dua atom atau senyawa dan terbentuk suatu senyawa radikal bebas baru yang lebih reaktif. Reaktivitas yang meningkat tersebut menyebabkan


senyawa radikal bebas menjadi lebih mudah untuk menyerang sel-sel sehat dalam tubuh. Jika pertahanan tubuh lemah maka sel-sel tersebut menjadi sakit atau rusak (Uppu, Murthy, Pryor, dan Parinandi, 2010). Radikal bebas tersebut memiliki 2 sifat yaitu: 1.

Reaktivitasnya yang tinggi karena akan cenderung menarik elektron dari senyawa yang lainnya lagi.

2.

Memiliki kemampuan untuk mengubah suatu molekul, atom, atau senyawa untuk menjadi suatu radikal baru (Morello, Shahidi, Ho, 2002). Target utama radikal bebas adalah protein, karbohidrat, asam lemak tak

jenuh dan lipoprotein, serta unsur-unsur DNA. Dari molekul-molekul target tersebut, yang paling rentan terhadap serangan radikal bebas adalah asam lemak tak jenuh. Senyawa radikal bebas di dalam tubuh dapat merusak asam lemak tak jenuh ganda pada membran sel sehingga dinding sel menjadi rapuh, merusak basa DNA sehingga mengacaukan sistem genetika, dan berlanjut pada pembentukan sel kanker. Radikal bebas akan terus mencari elektron dari molekul-molekul di sekitarnya dan apabila tidak dikendalikan reaksi berantai ini dapat berlangsung secara terus menerus (Halliwell dan Gutteridge, 2000).

E. Antioksidan Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau reduktan. Senyawa ini mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi, dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Antioksidan juga dapat didefinisikan sebagai senyawa yang apabila dalam konsentrasi rendah berada bersama substrat


yang dapat teroksidasi, dapat menunda atau menghambat oksidasi senyawa tersebut (Sunardi, 2007). Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan diklasifikasikan menjadi dua kategori, yaitu antioksidan pencegah dan antioksidan pemutus rantai. Antioksidan pencegah bekerja dengan menghambat pembentukan reactive oxygen species (ROS), seperti enzim katalase, peroksidase, superoksida dismutase, dan transferin. Antioksidan pemutus rantai merupakan senyawa yang menangkap radikal oksigen kemudian memutus rangkaian rantai reaksi radikal, contohnya vitamin C, vitamin E, asam urat, bilirubin, polifenol, dan sebagainya. Antioksidan pemutus rantai memiliki dua jaul reaksi. Jalur pertama merupakan jalur transfer atom hidrogen dengan mekanisme radikal oksigen menangkap hidrogen dari antioksidan sehingga terbentuk kompleks antioksidan radikal yang bersifat stabil. Jalur kedua, antioksidan mendeaktivasi radikal bebas dengan transfer elektron tunggal. Transfer elektron tunggal sangat dipengaruhi oleh kestablilan pelarut pada muatan tertentu (Ou, Huang, Woodill, Flanagan, dan Deemer, 2002).

F. Metode DPPH Metode DPPH merupakan metode yang cepat, sederhana, dan tidak membutuhkan biaya

tinggi

dalam

menentukan kemampuan antioksidan

menggunakan radikal bebas 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Metode ini sering digunakan untuk menguji senyawa yang berperan sebagai free radical scavengers atau donor hidrogen dan mengevaluasi aktivitas antioksidannya, serta mengkuantifikasi jumlah kompleks radikal-antioksidan yang terbentuk. Metode


DPPH dapat digunakan untuk sampel yang berupa padatan maupun cairan (Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2001). Gugus kromofor dan auksokrom pada radikal bebas DPPH memberikan absorbansi maksimum pada panjang gelombang 517 nm sehingga menimbulkan warna ungu. Warna DPPH akan berubah dari ungu menjadi kuning seiring penambahan antioksidan yaitu saat elektron tunggal pada DPPH berpasangan dengan hidrogen dari antioksidan. Hasil dekolorisasi oleh antioksidan setara dengan jumlah elektron yang tertangkap. Mekanisme penangkapan radikal ditunjukan pada reaksi di bawah ini.

Gambar 2. Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan (AH=Antioksidan, ox=Oksidasi, red=Reduksi) (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009)

G. Landasan Teori Reaksi oksidasi berlebihan yang terjadi di dalam tubuh dapat memicu terbentuknya radikal bebas. Radikal bebas merupakan suatu senyawa yang memiliki elektron tidak berpasangan, sehingga tidak stabil. Untuk mencapai kestabilan, elektron tidak berpasangan akan mencari pasangan elektron di sekitarnya. Radikal bebas dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lipid, DNA,


dan dapat memicu penyakit degeneratif (Uppu, Murthy, Pryor, dan Parinandi, 2010). Senyawa antioksidan dapat meredam radikal bebas dan menghambat reaksi oksidatif, sehingga kerusakan sel akibat radikal bebas dapat dicegah (Ou, Huang, Woodill, Flanagan, dan Deemer, 2002). Nanas merupakan tanaman yang mudah ditemukan di daerah tropis. Kandungan buah nanas yang sudah banyak diteliti dan dipublikasikan salah satunya adalah bromelain (Bartholomew, Paull, dan Rohrbach, 2002). Bromelain merupakan salah satu enzim protease yang umum digunakan dalam perawatan luka. Enzim protease yang digunakan dalam perawatan luka untuk regenerasi jaringan dan mencegah timbulnya keloid berpotensi memiliki aktivitas antioksidan (Bhattacharyya, 2008). Kandungan enzim dalam suatu sampel dapat dianalisis secara kualitatif dengan menggunakan metode uji ninhidrin dan kuantitatif dengan menggunakan metode spektrofotometri uv. Prinsip uji ninhidrin yaitu pembentukan warna biruungu dari reaksi antara ninhidrin dan asam amino (Boyer, 2011). Prinsip spektrofotometri yaitu protein yang memiliki cincin aromatik seperti fenilalanin, triptofan, histidin, dan tirosin memiliki serapan yang kuat pada panjang gelombang 280 nm. Intensitas serapan pada panjang gelombang tersebut sebanding dengan jumlah enzim dalam sampel (Walker, 2002). Metode DPPH merupakan metode pengujian aktivitas antioksidan yang sederhana dan cepat. Metode ini menggunakan radikal bebas DPPH untuk menguji suatu senyawa antioksidan dalam meredam radikal bebas. Gugus kromofor dan auksokrom DPPH memberikan serapan yang kuat pada panjang


gelombang 517 nm dengan warna ungu. Warna ungu akan berubah menjadi kuning ketika terdapat senyawa antioksidan yang meredam radikal bebas DPPH (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009).

H. Hipotesis 1.

Ekstrak bromelain daging buah nanas (Ananas comosus (L.) Merr.) memiliki aktivitas antioksidan yang dinyatakan dengan IC50.

2.

Ekstrak bromelain daging buah nanas (Ananas comosus (L.) Merr.) memiliki kadar enzim yang dinyatakan dengan persen (% b/b).


BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Operasional Variabel – variabel yang digunakan pada penelitian ini adalah: 1. Variabel utama a. Variabel bebas Variasi konsentrasi ekstrak bromelain daging buah nanas. b. Variabel tergantung Aktivitas antioksidan (%IC) dan kadar enzim ekstrak bromelain daging buah nanas. 2. Variabel pengacau a. Variabel pengacau terkendali Jenis tanaman, tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan, umur buah yang dipanen, cara panen, jumlah (g) buah yang digunakan, suhu evaporasi, waktu pengendapan, dan lama penyimpanan ekstrak bromelain. b. Variabel pengacau tidak terkendali Suhu blender, suhu sentrifugasi.

18


3. Definisi operasional a. Aktivitas antioksidan Aktivitas

antoksidan

adalah

kemampuan

ekstrak

bromelain

untuk

menangkap radikal DPPH dibandingkan dengan kontrol negatif. b. Ekstrak bromelain Ekstrak bromelain adalah crude bromelain extract yang diperoleh dari presipitasi dan pengeringan ekstrak daging buah nanas. c. Kadar enzim Kadar enzim adalah suatu nilai yang dinyatakan dalam bentuk persen yang menyatakan kadar enzim bromelain dalam ekstrak bromelain. d. Persen inhibition concetration (%IC) Persen inhibition concetration adalah suatu nilai yang dinyatakan dalam bentuk persentase yang menyatakan kemampuan ekstrak bromelain dalam menangkap radikal DPPH. e. Inhibition concetration 50 (IC50) Inhibition concetration 50 adalah nilai dosis ekstrak bromelain yang dapat menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH.

C. Bahan Penelitian Bahan uji yang digunakan adalah daging buah nanas yang dibeli pada bulan Februari - Maret 2016 dan diperoleh dari pasar Stan, kabupaten Sleman, Yogyakarta. Bahan kimia kualitas farmasetis yang digunakan dalam penelitian ini yaitu aquadest; bahan kimia kualitas teknis (CV. General Labora) berupa ethanol


dan deionized water; bahan kimia kualitas pro analitik (E. Merck) berupa metanol dan ninhidrin; bahan kimia kualitas pro analitik (Sigma Chem. Co.) berupa rutin dan DPPH; bahan kimia kualitas pro analitik (DiaSys) berupa bovine serum albumine (BSA).

D. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini, antara lain: blender (Maspion), corong Buchner (Desaga), mikropipet 50-200 µL (Socorex), vortex (Stuart Scientific), sentrifuge (Hettich), magnetic stirrer (Thermo Scientific), vacuum rotary evaporator (Butchi), waterbath (Memmert), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV mini-1240 UV-Vis Spektrofotometer), neraca analitik ketelitian 0,1 mg (Mettler Toledo), serta alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium (Pyrex-Germany).

E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi buah nanas Determinasi buah nanas dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta berdasarkan Backer dan Bakhuizen van Den Brink (1963) dengan mencocokan karakteristik buah nanas yang digunakan dengan gambar, taksonomi, dan keterangan kelompok tumbuhan.


2. Pengumpulan buah nanas Buah nanas diperoleh dari desa pasar Stan, kabupaten Sleman, Yogyakarta, dan buah yang diambil memiliki jenis dan tingkat kematangan yang sama. 3. Pembuatan ekstrak bromelain daging buah nanas Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Soares, Vaz, Correia, Pessoa, dan Carneiro-da-Cunha (2012) dengan beberapa modifikasi. a. Ekstraksi buah nanas Buah nanas dicuci dengan air mengalir, dikeringkan, dan dikupas. Daging buah sebanyak 70,0 g dipotong kecil-kecil kemudian dicampur dengan deionized water 4°C (1:1 w/w) dan dihaluskan menggunakan blender. Larutan jus disaring dengan menggunakan kain katun tipis lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan dikumpulkan dalam gelas beker sebagai ekstrak daging buah nanas. b. Purifikasi dengan teknik ethanol precipitation Ekstrak daging buah nanas sebanyak 100,0 mL didinginkan sampai suhunya 4°C lalu ditambahkan dengan etanol (90%;4°C) dengan perbandingan 1:3 sebanyak 300,0 mL. Campuran diaduk menggunakan magnetic stirrer selama 5 menit dan didiamkan selama 24 jam pada suhu 4°C sehingga didapatkan endapan koloidal putih hingga kuning muda. Setelah terjadi pengendapan, campuran diuapkan menggunakan vacuum rotary evaporator dengan suhu 50°C selama 30 menit. Endapan dikumpulkan dalam cawan petri dan diuapkan kembali menggunakan


waterbath dengan suhu 50°C selama 3 jam. Cairan kental berwarna kekuningan dikumpulkan sebagai ekstrak bromelain. 4. Analisis kualitatif bromelain Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Panda (2000) dengan beberapa modifikasi. a. Reaksi Warna Senyawa BSA sebanyak 0,5 mL dengan konsentrasi 50 mg/mL dilarutkan ke dalam 10,0 mL deionized water, ekstrak bromelain sebanyak 250,0 mg dilarutkan ke dalam 50,0 mL deionized water, dan ninhidrin sebanyak 350,0 mg dilarutkan ke dalam 100,0 mL etanol 90%. Larutan BSA diambil sebanyak 1 mL lalu dimasukan ke dalam tabung reaksi dan ditambah dengan larutan ninhidrin sebanyak 5 mL. Campuran dipanaskan pada suhu 100°C selama 15 menit sehingga muncul warna biru-ungu yang menandakan terjadi reaksi antara asam amino dengan ninhidrin. Analisis yang sama juga dilakukan untuk larutan bromelain dan air deionisasi. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. 5. Penetapan kadar enzim bromelain Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Ahmed (2005) dengan beberapa modifikasi. a. Pembuatan larutan uji Ekstrak bromelain sebanyak 250,0 mg ditimbang dan dilarutkan ke dalam 25,0 mL aquadest (5°C) sehingga diperoleh kosentrasi larutan uji sebesar 10000 µg/mL.


b. Pembuatan larutan baku Senyawa BSA sebanyak 0,5 mL dengan konsentrasi 50 mg/mL dilarutkan ke dalam 25,0 mL aquadest (5°C). Larutan tersebut diambil sebanyak 4,0; 5,5; 7,0; 8,5 dan 10,0 mL lalu ditambah dengan aquadest (5°C) hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku bromelain sebesar 400, 550, 700, 850 dan 1000 µg/mL. c. Penentuan operating time (OT) Larutan baku BSA dengan konsentrasi 400, 700, dan 1000 µg/mL divortex selama 30 detik dan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer uv pada panjang gelombang 280 nm tiap 5 menit selama 30 menit. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. d. Penetapan panjang gelombang maksimum Larutan baku BSA dengan konsentrasi 400, 700, dan 1000 µg/mL dimasukan ke dalam tabung reaksi dan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan selama OT. Larutan diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm. e. Pengukuran absorbansi larutan baku dan uji Larutan BSA dengan konsentrasi 400, 550, 700, 850 dan 1000 µg/mL diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum terhadap blanko yang terdiri dari aquadest (5°C). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. Kemudian, larutan uji dengan konsentrasi 10000 µg/mL diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum terhadap blanko yang terdiri dari aquadest (5°C). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.


f. Estimasi kadar enzim Berdasarkan hasil dari prosedur 5 d untuk BSA dan ekstrak bromelain kemudian dihitung nilai % kadar enzim. 6. Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Thangaraj (2016) dengan beberapa modifikasi. a. Pembuatan larutan DPPH Senyawa DPPH sebanyak 15,8 mg ditimbang dan dilarutkan ke dalam metanol p.a hingga 100,0 mL, sehingga diperoleh kosentrasi larutan DPPH sebesar 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru. b. Pembuatan larutan rutin Senyawa rutin sebanyak 5,0 mg dilarutkan ke dalam metanol p.a hingga 100,0 mL. Larutan tersebut diambil sebanyak 2,0; 3,0; 4,0; 5.0 dan 6,0 mL lalu ditambah dengan metanol p.a hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar rutin sebesar 10, 15, 20, 25, dan 30 µg/mL. c. Pembuatan larutan uji Ekstrak bromelain sebanyak 250,0 mg ditimbang dan dilarutkan ke dalam aquadest hingga 25,0 mL. Larutan tersebut diambil sebanyak 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 dan 5,0 mL lalu ditambah dengan aquadest (5°C) hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku bromelain sebesar 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 dan 5,0 mg/mL.


7. Uji aktivitas antioksidan Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Thangaraj (2016) dengan beberapa modifikasi. a. Uji pendahuluan Dalam tiga buah tabung reaksi, masing-masing ditambah dengan larutan DPPH dan air deionisasi, larutan rutin 25 µg/mL, dan larutan bromelain 5 mg/mL sebanyak 1,0 mL kemudian ditambah dengan metanol p.a sebanyak 3 mL. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan didiamkan selama 30 menit. Setelah 30 menit, warna larutan diamati. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. b. Penentuan operating time (OT) Dalam tiga buah labu ukur 5 mL, masing-masing ditambah dengan larutan DPPH dan larutan rutin 5, 15, dan 25 µg/mL sebanyak 1,0 mL kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik dan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometes visibel pada panjang gelombang 517 nm tiap 5 menit selama 1 jam. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. c. Penetapan panjang gelombang maksimum Dalam tiga buah labu ukur 10 mL, masing-masing ditambah dengan larutan DPPH sebanyak 0,5; 1,0; dan 1,5 mL, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi DPPH sebesar 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan dimasukan ke dalam


tabung reaksi dan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan selama OT. Larutan diukur serapannya pada panjang gelombang 400-600 nm. d. Pengukuran absorbansi larutan kontrol DPPH Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Setelah OT, larutan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. Larutan ini digunakan sebagai larutan kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji. e. Pengukuran absorbansi larutan rutin dan uji Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah dengan 2 mL larutan pembanding dan larutan uji pada berbagai seri konsentrasi yang telah dibuat, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan selama OT. Setelah OT, larutan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. f. Estimasi aktivitas antioksidan Berdasarkan hasil dari prosedur 7 d dan e untuk rutin dan ekstrak bromelain kemudian dihitung niai %IC dan IC50.


F. Analisis Hasil Kadar enzim dalam ekstrak bromelain dinyatakan dalam persen. Nilai absorbansi larutan uji dimasukan ke dalam persamaan regresi linier kurva baku BSA dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan baku, sedangkan sumbu y adalah absorbansi sehingga diperoleh konsentrasi enzim yang kemudian dikonversi menjadi persen kadar enzim dalam ekstrak bromelain. Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%IC) dihitung berdasarkan rumus:

Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 menggunakan persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun pembanding, sedangkan sumbu y adalah %IC. Data lalu dianalisis secara statistik untuk menentukan ada atau tidaknya perbedaan bermakna antara nilai IC50 larutan pembanding dan larutan uji. Analisis statistik dilakukan dengan panduan Bolton dan Bon (2010) dan dengan software R 3.2.5. Nilai IC50 diuji dengan Shapiro-Wilk pada taraf kepercayaan 95% untuk mengetahui distribusi data tiap kelompok. Hasil analisis berupa distribusi data yang normal selanjutnya dianalisis dengan uji F pada taraf kepercayaan 95% untuk mengetahui homogenitas data kelompok. Hasil analisis berupa data yang tidak homogen selanjutnya dianalisis dengan uji T-Independent unequal variances (Welch’s T-test) pada taraf kepercayaan 95% untuk melihat perbedaan antar kelompok bermakna (signifikan) (p<0,05) atau tidak bermakna (tidak signifikan) (p>0,05).


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman Determinasi merupakan langkah awal yang dilakukan dalam suatu penelitian dengan menggunakan tanaman. Determinasi tanaman ini bertujuan untuk mengetahui dan memastikan kebenaran identitas tanaman yang akan digunakan dalam penelitian serta untuk menghindari terjadinya kesalahan dalam pengambilan sampel untuk analisis fitokimia. Determinasi tanaman nanas dilakukan

di

Laboratorium

Farmakognosi-Fitokimia,

Fakultas

Farmasi

Universitas Sanata Dharma pada tanggal 20 Maret 2016 dengan acuan Backer dan Bakhuizen van Den Brink (1963), yang membuktikan bahwa tanaman yang digunakan untuk penelitian adalah tanaman nanas (Ananas comosus (L.) Merr.). Pembuktian dipertegas dengan surat determinasi (lampiran 1) tanaman yang dikeluarkan oleh Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

B. Hasil Pengumpulan Bahan Nanas yang digunakan sebagai bahan penelitian bentuknya kecil dan diambil dari pasar Stan, kabupaten Sleman, Yogyakarta. Batang nanas tidak dipilih karena ketersediaannya yang relatif tidak banyak dibandingkan dengan buah nanas. Varietas tanaman nanas, umur buah nanas, dan tempat tumbuh tanaman nanas merupakan faktor-faktor yang dapat mempengaruhi kandungan

28


bromelain buah nanas. Usaha yang dilakukan untuk meminimalkan variasi kandungan bromelain dalam buah nanas adalah sampel diambil dari satu kios buah sama sehingga sampel buah nanas tersebut memiliki varietas, umur, dan berasal dari suplier yang sama. Buah nanas yang digunakan adalah buah nanas yang kulitnya masih hijau dengan kondisi belum matang. Hal ini bertujuan untuk mendapatkan kandungan bromelain yang masih tinggi. Berdasarkan penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya, buah nanas yang belum matang memiliki kandungan bromelain yang lebih banyak dibandingkan dengan buah nanas yang sudah matang (Chaurasiya dan Hebbar, 2013).

C. Hasil Isolasi Bromelain Proses pembuatan ekstrak bromelain daging buah nanas dimulai dengan proses pengupasan buah nanas dan pemotongan daging buah menjadi bentuk yang lebih kecil yang bertujuan untuk memperkecil ukuran partikel sehingga luas pemukaan daging buah yang mengalami kontak dengan pelarut semakin besar. Kontak dengan pelarut yang semakin besar dapat meningkatkan proses penarikan senyawa kimia yang diinginkan sehingga hasil ekstraksi menjadi lebih optimal. Pelarut yang digunakan adalah deionized water dengan suhu 4˚C. Deionized water merupakan pelarut yang mampu digunakan dalam ekstraksi bromelain karena sifat enzim bromelain yang hidrofilik, memiliki pH 6 yang cenderung netral, dan dapat mencegah denaturasi bromelain selama proses ekstraksi. Pelarut ini juga digunakan dalam beberapa penelitian terkait bromelain oleh Soares, Vaz, Correia, Pessoa, dan Cameiro-da-cunha (2012), Ketnawa,


Rawdkuen, dan Chaiwut (2010), dan Devakate, Patil, Waje, dan Thorat (2008). Suhu dingin yaitu 4˚C digunakan dengan tujuan mencegah proses denaturasi bromelain, memperlambat terjadinya reaksi enzimatik yang dapat merusak bromelain, dan meningkatkan kelarutan bromelain dalam proses ekstraksi. Walaupun begitu, ada penelitian oleh Chaurasiya dan Hebbar (2013) yang menyatakan bahwa efek dari suhu selama proses ekstraksi bromelain terhadap perubahan kadar dan aktivitas enzimatik bromelain tidak signifikan sehingga ekstraksi bisa dilakukan pada suhu ruangan (25˚C). Daging buah yang sudah dipotong kecil kecil kemudian dicampur dengan pelarutnya dan dihomogenkan dengan blender. Proses homogenisasi bertujuan untuk mengeluarkan enzim dari sel-sel jaringan buah nanas. Enzim biasanya terletak di dalam dinding sel sehingga proses perusakan dinding sel diperlukan agar enzim bisa dilarutkan dan diekstraksi secara sempurna. Homogenisasi menggunakan blender merupakan mechanical lysis yang dipilih karena prosesnya yang ekonomis, cepat, mudah dilakukan, dan tidak memerlukan penambahan senyawa kimia. Metode ini juga merupakan salah satu metode terbaik dalam merusak sel jaringan tanaman (Tolldra dan Nollet, 2013). Kelemahan dari metode ini adalah terjadinya peningkatan suhu dan munculnya busa dalam proses ekstraksi yang dapat merusak enzim di permukaan cairan. Campuran yang sudah dihomogenkan kemudian disaring menggunakan kain katun tipis dan corong buchner dengan bantuan pompa vakum yang berguna untuk mempercepat proses penyaringan. Penyaringan bertujuan untuk memisahkan cairan yang berisi enzim dengan sisa jaringan tanaman yang tidak digunakan.


Campuran yang sudah didinginkan kembali kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Sentrifugasi merupakan proses fraksinasi yang bertujuan untuk memisahkan enzim bromelain dengan senyawa lainnya dalam suatu campuran. Prinsip fraksinasi dari metode sentrifugasi adalah perbedaan pergerakan senyawa dalam gaya sentrifugal yang disebabkan oleh perbedaan berat molekul, ukuran, dan bentuk dari senyawa (Cutler, 2004). Metode ini dipilih karena sentrifugasi adalah metode fraksinasi enzim dan protein yang paling mudah dilakukan. Kelemahan dari metode ini adalah spesifisitasnya rendah dibandingkan dengan metode lain seperti kromatografi dan elektroforesis. Setelah proses sentrifugasi selesai, supernatan dikumpulkan dan didinginkan kembali. Supernatan kemudian dicampur etanol 90% dengan perbandingan 1: 3 dan diaduk secara konstan dengan bantuan magnetic stirrer. Pengadukan yang konstan berfungsi untuk mencegah terkonsentrasinya etanol pada bagian tertentu saja dan meratakan pencampuran antara etanol dengan deionized water. Campuran kemudian didiamkan selama 24 jam pada suhu 4°C hingga menghasilkan endapan koloidal yang mengandung enzim bromelain. Proses ini merupakan proses purifikasi yang bertujuan untuk memurnikan enzim bromelain dan memisahkannya dari senyawa lain yang tidak diperlukan. Metode purifikasi yang digunakan adalah metode presipitasi dengan pelarut organik. Prinsip dari metode ini perubahan kelarutan dari protein dengan penambahan pelarut lainnya. Bromelain merupakan enzim yang hidrofil sehingga larut dalam pelarut deionized water, apabila kepolaran pelarut berkurang karena deionized water ditambahkan dengan pelarut organik lainnya maka kelarutan dari protein


akan berkurang. Ketika protein menjadi kurang larut, maka protein akan cenderung untuk berkumpul dan mengendap (Hatti-Kaul dan Mattiasson, 2003). Pelarut organik yang dipilih adalah etanol karena kepolaran etanol lebih rendah dibandingan dengan deionized water, mampu bercampur dengan deionized water secara sempurna, tidak bereaksi dengan enzim bromelain, dan memiliki efek presipitasi yang cukup baik. Kelemahan dari metode ini adalah waktu pengerjaan yang cukup lama (24 jam) sehingga tidak cocok untuk enzim yang tidak tahan lama dalam penyimpanan, hasil presipitasi susah untuk dikumpulkan karena berbentuk endapan koloidal, dan perlu dilakukan metode lanjutan untuk mengisolasi enzim dan protein yang lebih spesifik (Dennison,2003). Endapan koloidal kemudian dikeringkan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator dengan suhu dan tekanan rendah. Suhu dijaga pada 50 °C untuk mencegah proses denaturasi enzim dan protein akibat suhu yang terlalu tinggi (Chaurasiya dan Hebbar, 2013). Tekanan yang rendah akan mempercepat proses penguapan karena pelarut yang digunakan yaitu campuran antara deionized water dan etanol 90% akan menguap di bawah titik didihnya. Setelah sebagian besar pelarut teruapkan, cairan koloidal berwana kuning ditaruh dalam cawan porselen dan diletakan di atas waterbath agar pelarut yang tersisa dapat menguap. Penguapan dilakukan hingga didapatkan bobot tetap ekstrak kental bromelain. Bobot tetap menurut Farmakope Indonesia (1979) yaitu dua kali penimbangan berturut-turut berbeda tidak lebih dari 0,5 mg tiap gram sisa yang ditimbang. Ekstrak kental yang diperoleh kemudian dibungkus dengan alumunium foil dan disimpan dalam desikator supaya tidak terpapar dengan lembab yang dapat


merusak enzim bromelain karena proses hidrolisis. Bobot ekstrak bromelain daging buah nanas yang didapatkan yaitu 3,5567 gram. Rendemen yang didapat yaitu 1,6937 % b/b. Proses ekstraksi dan isolasi enzim bromelain dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

Gambar 3. Proses ekstraksi dan isolasi enzim bromelain (1=Daging buah nanas; 2=Hasil blender; 3=Supernatan; 4=Campuran supernatan dan etanol; 5=Endapan koloidal; 6=Ekstrak kental bromelain)

D. Hasil Analisis Kualitatif Ekstrak Bromelain Analisis kualitatif dimaksudkan untuk mengetahui secara kualitatif keberadaan enzim bromelain dalam ekstrak bromelain daging buah nanas. Pengujian secara kualitatif ini penting dilakukan sebelum melakukan pengujian secara kuantitatif. Analisis kualitatif dengan ninhidrin dilakukan dengan prinsip reaksi pembentukan senyawa kompleks Ruhemman yang berwarna ungu dari ninhidrin dan asam amino. Reaksi yang terjadi antara ninhidrin dan asam amino


bisa secara singkat bisa dijelaskan sebagai berikut: pertama, terjadi oksidasi amino alfa oleh ninhidirin dan dihasilkan hidroksidiketohidrindin, aldehid, amoniak, dan karbondioksida. Kedua, terjadi kondensasi antara amoniak, ninhidrin, dan hidroksidiketohidrindin dan dihasilkan senyawa Ruhemman yang berwarna biru-ungu. Reaksi yang terjadi ditunjukan pada gambar di bawah ini.

Gambar 4. Reaksi asam amino dengan ninhidrin (Bottom, Hanna, dan Siehr, 1978)

Uji ninhidrin dilakukan menggunakan kontrol positif dan kontrol negatif. Kontrol positif yang digunakan yaitu larutan BSA yang dicampurkan dengan larutan ninhidrin untuk menunjukan perubahan warna saat hasil uji positif. BSA digunakan sebagai senyawa pembanding karena BSA merupakan protein yang biasa digunakan untuk menganalisis kandungan protein dan enzim secara kualitatif dan kuantitatif dan mampu digunakan dalam berbagai metode uji (Murachi, 1970). Kontrol negatif yang digunakan yaitu pelarut deionized water yang dicampurkan dengan larutan ninhidrin untuk menunjukan warna saat hasilnya negatif dan memastikan tidak ada intervensi dari pelarut yang digunakan. Pengujian dilakukan menggunakan tabung reaksi dengan replikasi 3 kali. Masing-masing tabung reaksi ditambahkan dengan larutan uji sebanyak 1 mL dan


larutan ninhidrin sebanyak 5 mL. Campuran dipanaskan pada suhu 100°C selama 15 menit sehingga muncul warna biru-ungu yang menandakan terjadi reaksi antara asam amino dengan ninhidrin. Pemanasan bertujuan untuk memecah protein dan enzim menjadi asam amino sehingga dapat bereaksi dengan ninhidrin. Pengujian yang dilakukan menunjukan hasil yang positif untuk sampel dan kontrol positif yaitu terbentuknya warna biru ungu. Hal ini menunjukan bahwa sampel hasil isolasi bromelain dari daging buah nanas mengandung enzim bromelain. Hasil uji ninhidrin dan proses perubahan warnanya bisa dilihat pada gambar di bawah ini.

Gambar 5. Hasil uji ninhidrin dan perubahan warnanya (A=Larutan sebelum dipanaskan; B= Kontrol negatif deionized water; C=Kontrol positif BSA; D=Bromelain)


E. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kadar Bromelain 1. Penentuan operating time (OT) Penentuan OT bertujuan untuk mengetahui waktu yang dibutuhkan untuk tepat habis bereaksi. Pengukuran pada saat OT ditujukan untuk meminimalkan kesalahan dalam hal pengukuran BSA dan bromelain. Penentuan OT dilakukan dengan cara mengukur absorbansi larutan baku BSA dengan tiga tingkat konsentrasi yaitu rendah, sedang, dan tinggi menggunakan spektrofotometer uv pada panjang gelombang serapan maksimum teoritis sesuai dengan metode yang digunakan (absorbsi ultraviolet) yaitu 280 nm (Layne, 1957). OT ditentukan berdasarkan waktu ketika nilai absorbansi mulai stabil atau selisih nilai absorbansi tiap selang waktu mulai kecil. Pengukuran absorbansi untuk penentuan OT ini dilakukan tiap selang 5 menit selama 30 menit. Hasil pengukuran OT ditunjukan pada grafik di bawah ini. 1

Absorbansi

0,8 0,6 0,4 0,2 0 5

10

15

20

25

Waktu (Menit) 400 µg/ml

700 µg/ml

1000 µg/ml

Gambar 6. Grafik penentuan OT BSA

30


Dari penentuan OT pada larutan baku BSA pada tiga tingkat konsentrasi yang tertera pada gambar 5, terlihat bahwa absorbansi stabil pada menit ke-5 hingga menit ke-30. Dengan demikian, secara teoritis dapat disimpulkan bahwa pada menit ke-5 senyawa BSA sudah bereaksi dengan pelarutnya secara sempurna sehingga OT untuk reaksi BSA dengan pelarutnya adalah 5 menit. Secara praktis, dapat disimpulkan bahwa pengukuran larutan BSA akan memberikan hasil yang reprodusibel bila diukur antara menit ke-5 hingga menit ke-30. 2. Penentuan panjang gelombang maksimum Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ini bertujuan untuk menentukan panjang gelombang pada saat senyawa yang ingin diukur memberikan absorbansi yang paling optimum. Pada saat senyawa memberikan absorbansi yang paling optimum, maka pengukuran akan memiliki sensitifitas yang tinggi dan linear sehingga adanya sedikit perubahan pada konsentrasi senyawa akan memberikan perubahan yang besar pada absorbansi yang dihasilkan, dan perubahan konsentrasi senyawa sebanding dengan perubahan absorbansi senyawa yang dihasilkan. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ini menggunakan senyawa BSA karena BSA memiliki cincin aromatik dengan jumlah yang cukup untuk menghasilkan pengukuran yang sensitif dan linear pada metode yang digunakan. Panjang gelombang serapan maksimum ditentukan menggunakan larutan kontrol yaitu larutan baku BSA yang dilarutkan dalam deionized water dengan tujuan untuk mendapatkan serapan BSA tanpa gangguan serapan dari senyawasenyawa lain dalam sampel. Pengukuran ditentukan melalui tiga konsentrasi


larutan baku BSA, yaitu konsentrasi 400, 700, dan 1000 µg/mL. Penggunaan tiga konsentrasi tersebut diharapkan dapat merepresentasikan panjang gelombang serapan maksimum dari konsentrasi yang berbeda. Scanning panjang gelombang serapan maksimum larutan baku BSA dilakukan pada panjang gelombang ultraviolet, yaitu rentang antara 200-400 nm.Hasil penentuan panjang gelombang serapan maksimum ditunjukan pada tabel di bawah ini. Tabel I. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum BSA Konsentrasi larutan BSA 400 µg/mL 700 µg/mL 1000 µg/mL

λ maksimum hasil scanning 278,0 nm 278,0 nm 278,0 nm

λ maksimum rata-rata

λ maksimum teoritis

278,0 nm

280,0 nm

Hasil scanning tiga konsentrasi larutan baku BSA yang tertera pada tabel I didapatkan hasil panjang gelombang serapan maksimum rata-rata adalah 278,0 nm. Panjang gelombang ini berbeda dengan panjang gelombang teoritis metode ini, yaitu 280 nm. Hal ini diperbolehkan sesuai dengan ketentuan yang tercantum dalam Farmakope Indonesia edisi IV (1995), yaitu batas pergeseran yang diperkenankan adalah maksimum sebesar 2 nm. Oleh karena itu, panjang gelombang maksimum yang digunakan pada penelitian ini adalah 278,0 nm.

F. Hasil Penetapan Kadar Bromelain Penetapan kadar bromelain bertujuan untuk mengetahui kadar enzim bromelain dalam ekstrak bromelain daging buah nanas yang diperkirakan memiliki

aktivitas

antioksidan.

Penetapan

kadar

bromelain

dilakukan

menggunakan metode spektrofotometri uv. Prinsip metode spektrofotometri uv


dalam penelitian ini adalah pengukuran absorbansi dari cincin aromatik yaitu tryptophan, tyrosine, phenylamine, dan histidine yang dimiliki oleh protein dan enzim yang absorbansinya diukur menggunakan spektrofotometer uv pada OT dan panjang gelombang serapan maksimum yang telah ditetapkan sebelumnya (Walker, 2002). Prinsip reaksi yang terjadi pada penetapan kadar bromelain ini yaitu, protein memiliki dua panjang gelombang maksimum, yaitu 280 nm dan 200 nm. Elektron yang tereksitasi pada panjang gelombang 280 nm menyerap energi yang lebih rendah dibandingkan pada panjang gelombang 200 nm karena cincin aromatik yang dimiliki oleh protein dan enzim menstabilkan elektron yang tereksitasi dengan cara resonansi (Stoscheck, 1990). Metode ini memiliki kelemahan yaitu pengukuran yang sensitif dan linear tergantung pada jumlah cincin aromatik yang dimiliki protein dan enzim. Selain itu, metode ini membutuhkan konsentrasi sampel yang cukup besar, yaitu 0,2-2 mg/ml sehingga tidak bisa digunakan pada sampel protein dengan konsentrasi kecil. Kelebihan dari metode ini yaitu, bisa langsung diaplikasikan pada sampel tanpa memerlukan penambahan senyawa atau pereaksi lainnya, bisa dikerjakan dengan sangat cepat karena tidak memerlukan OT yang lama, bersifat non-destruktif sehingga senyawa yang akan kita ukur masih bisa disimpan dan digunakan kembali, dan yang terakhir adalah memiliki hubungan yang linear antara konsentrasi protein dan absorbansi yang dihasilkannya (Owusu-Apanten, 2002). Kadar enzim bromelain dalam ekstrak bromelain daging buah nanas ditetapkan berdasarkan regresi linear dari kurva baku BSA. Nilai absorbansi


larutan uji dimasukan ke dalam persamaan regresi linier kurva baku BSA dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan baku, sedangkan sumbu y adalah absorbansi sehingga diperoleh konsentrasi enzim bromelain yang kemudian dikonversi menjadi persentase kadar enzim dalam ekstrak bromelain daging buah nanas. Hasil pengukuran seri baku BSA bisa dicermati pada tabel di bawah ini. Tabel II. Hasil pengukuran seri baku BSA Replikasi

1

2

3

Konsentrasi (µg/mL) 400 550 700 850 1000 400 550 700 850 1000 400 550 700 850 1000

Absorbansi 0,273 0,375 0,478 0,580 0,683 0,251 0,358 0,455 0,561 0,662 0,274 0,371 0,477 0,585 0,684

Persamaan regresi linear y = 0,0006833x – 0,000533 r = 0,9999

y = 0,0006833x – 0,020933 r = 0,9999

y = 0,0006893x – 0,004333 r = 0,9998

Pengukuran seri baku BSA dilakukan dengan tiga kali replikasi. Hasil pengukuran absorbansi pada pembuatan kurva baku BSA menunjukan bahwa dengan adanya kenaikan konsentrasi BSA, nilai absorbansi yang dihasilkan pun semakin meningkat. Dari hasil tiga replikasi tersebut, dipilih salah satu persamaan regresi linear yang memiliki koefisien korelasi yang paling baik yaitu mendekati 1. Persamaan yang memiliki koefisien korelasi yang paling baik adalah replikasi pertama. Persamaan yang diperoleh pada replikasi pertama, yaitu y = 0,0006833x – 0,000533 dengan r = 0,9999.


0,8 y = 0,0006833x - 0,000533 r = 0,9999

0,7

Absorbansi

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

200

400

600

800

1000

1200

Konsentrasi (µg/ml) Kurva Baku BSA

Linear (Kurva Baku BSA)

Gambar 7. Kurva baku BSA untuk penetapan kadar bromelain ekstrak bromelain daging buah nanas

Kadar bromelain dalam ekstrak bromelain daging buah nanas dihitung berdasarkan persamaan regresi linear yang telah diperoleh. Hasil perhitungan dari ketiga replikasi ekstrak bromelain daging buah nanas menunjukan bahwa kadar bromelain rata-ratanya adalah 8,4967 % b/b(SD = 0,0289). Hal ini ditunjukan dalam tabel di bawah ini. Tabel III. Kadar bromelain ekstrak bromelain daging buah nanas Replikasi

Kadar Enzim (% b/b)

1

8,52

2

8,47

3

8,47

X ± SD 8,4967 ± 0,0289

Hasil penetapan kadar bromelain tersebut menunjukan bahwa hasil isolasi ekstrak bromelain daging buah nanas hanya mengandung 8,4967 % b/b


enzim bromelain atau dari 100 mg ekstrak bromelain daging buah nanas hanya mengandung 8,4967 mg enzim bromelain. Hal ini bisa diartikan bahwa ekstrak bromelain daging buah nanas yang dihasilkan tidak murni dan mengandung berbagai senyawa lainnya selain enzim bromelain. Senyawa-senyawa lain tersebut perlu diidentifikasi lebih lanjut dalam penelitian lainnya untuk mengetahui lebih dalam tentang kandungan ekstrak bromelain daging buah nanas yang dihasilkan dari metode isolasi penelitian ini.

G. Hasil Optimasi Uji Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH 1. Penentuan operating time (OT) Penentuan OT bertujuan untuk mengetahui waktu yang dibutuhkan baku pembanding yaitu rutin dan radikal DPPH untuk tepat habis bereaksi. Pengukuran pada saat OT ditujukan untuk meminimalkan kesalahan dalam hal pengukuran aktivitas antioksidan dari rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas. Penentuan OT dilakukan dengan cara mengukur absorbansi larutan DPPH yang sudah direaksikan dengan larutan pembanding yaitu rutin pada tiga tingkat konsentrasi yaitu rendah, sedang, dan tinggi menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang serapan maksimum teoritis yaitu 517 nm (Kedare dan Singh, 2011). OT ditentukan berdasarkan waktu ketika nilai absorbansi mulai stabil atau selisih nilai absorbansi tiap selang waktu mulai kecil. Pengukuran absorbansi untuk penentuan OT ini dilakukan tiap selang 5 menit selama 60 menit. Hasil pengukuran OT ditunjukan pada grafik di bawah ini.


1 0,9 0,8 Absorbansi

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Waktu (Menit) 5 µg/ml

15 µg/ml

25 µg/ml

Gambar 8. Grafik penentuan OT Rutin

Dari penentuan OT pada larutan pembanding rutin pada tiga tingkat konsentrasi yang tertera pada gambar 8, terlihat bahwa absorbansi stabil sejak menit ke-30 hingga menit ke-60. Hal ini sesuai dengan teori dari Blois (1958) dan penelitian Luis, Marcela, Salette, dan Lima (2006). Dengan demikian, secara teoritis dapat disimpulkan bahwa pada menit ke-30 seluruh senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan pada larutan pembanding dan larutan uji sudah bereaksi dengan radikal DPPH secara sempurna sehingga OT untuk reaksi radikal DPPH dengan larutan pembanding dan uji adalah 30 menit. Secara praktis, dapat disimpulkan bahwa pengukuran larutan akan memberikan hasil yang reprodusibel bila diukur antara menit ke-30 hingga menit ke-60.


2. Penentuan panjang gelombang maksimum Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ini bertujuan untuk menentukan panjang gelombang pada saat senyawa yang ingin diukur memberikan absorbansi yang paling optimum. Pada saat senyawa memberikan absorbansi yang paling optimum, maka pengukuran akan memiliki sensitifitas yang tinggi dan linear sehingga adanya sedikit perubahan pada konsentrasi senyawa akan memberikan perubahan yang besar pada absorbansi yang dihasilkan, dan perubahan konsentrasi senyawa sebanding dengan perubahan absorbansi senyawa yang dihasilkan. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ini menggunakan senyawa DPPH. DPPH memiliki panjang gelombang serapan maksimum yaitu 517 nm dan memberikan warna violet. Warna ini muncul karena DPPH memiliki gugus kromofor dan auksokrom.

Gambar 9. Gugus kromofor dan auksokrom radikal DPPH

Gugus kromofor dan auksokrom dari radikal DPPH ditunjukan pada gambar di atas. Kromofor merupakan semua gugus atau atom yang dapat menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak, dimana merupakan gugus tak jenuh


yang dapat menjalani transisi π→π* dan n→π* dan auksokrom adalah gugus yang tidak dapat menjalani transisi π→π* tetapi dapat menjalani transisi elektron n→π* (Gandjar dan Rohman, 2007). Panjang gelombang serapan maksimum ditentukan menggunakan larutan kontrol yaitu larutan DPPH yang dilarutkan dalam metanol dengan tujuan untuk mendapatkan serapan DPPH tanpa gangguan serapan dari senyawa-senyawa lain dalam sampel. Pengukuran ditentukan melalui tiga konsentrasi larutan DPPH, yaitu konsentrasi 0,020; 0,040; dan 0,0600 mM. Penggunaan tiga konsentrasi tersebut diharapkan dapat merepresentasikan panjang gelombang serapan maksimum dari konsentrasi yang berbeda. Scanning panjang gelombang serapan maksimum larutan DPPH dilakukan pada panjang gelombang visibel, yaitu rentang antara 600-800 nm. Hasil penentuan panjang gelombang serapan maksimum ditunjukan pada tabel di bawah ini. Tabel IV. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum DPPH Konsentrasi larutan DPPH 0,020 mM 0,040 mM 0,060 mM

λ maksimum hasil scanning 515,5 nm 515,0 nm 515,5 nm

λ maksimum rata-rata

λ maksimum teoritis

515,3 nm

517,0 nm

Hasil scanning tiga konsentrasi larutan dpph yang tertera pada tabel IV didapatkan hasil panjang gelombang serapan maksimum rata-rata adalah 515,3 nm. Panjang gelombang ini berbeda dengan panjang gelombang teoritis, yaitu 517 nm. Hal ini diperbolehkan sesuai dengan ketentuan yang tercantum dalam Farmakope Indonesia edisi IV (1995), yaitu batas pergeseran yang diperkenankan


adalah maksimum sebesar 2 nm. Oleh karena itu, panjang gelombang maksimum yang digunakan pada penelitian ini adalah 515,3 nm.

H. Hasil Uji Pendahuluan Aktivitas Antioksidan Uji pendahuluan aktivitas antioksidan bertujuan untuk mengetahui secara kualitatif keberadaan senyawa yang berperan sebagai senyawa antioksidan dalam ekstrak bromelain daging buah nanas. Uji pendahuluan sebagai pengujian secara kualitatif ini penting dilakukan sebagai dasar sebelum melakukan pengujian secara kuantitatif. Uji pendahuluan dilakukan dengan prinsip reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan di dalam ekstrak bromelain daging buah nanas. Senyawa antioksidan akan mengubah warna radikal DPPH dari violet menjadi kuning karena karena kemampuannya untuk mengikat elektron bebas yang tidak berpasangan dari senyawa radikal. Uji pendahuluan dilakukan menggunakan kontrol positif dan kontrol negatif. Kontrol positif yang digunakan yaitu larutan rutin yang dicampurkan dengan larutan DPPH untuk menunjukan perubahan warna saat hasil uji positif. Rutin digunakan sebagai senyawa pembanding karena rutin telah terbukti memiliki aktivitas antioksidan terhadap radikal DPPH dan biasa digunakan untuk determinasi aktivitas antioksidan secara kualitatif dan kuantitatif (Kedare dan Singh, 2011). Kontrol negatif yang digunakan yaitu pelarut deionized water yang dicampurkan dengan larutan DPPH untuk menunjukan warna saat hasilnya negatif dan memastikan tidak ada intervensi dari pelarut yang digunakan. Pengujian yang dilakukan menunjukan hasil yang positif untuk sampel dan kontrol positif yaitu


terjadi perubahan warna dari violet menjadi kuning. Hal ini menunjukan bahwa sampel ekstrak bromelain dari daging buah nanas mengandung senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan. Hasil uji pendahuluan dan perubahan warnanya bisa dilihat pada gambar di bawah ini.

Gambar 10. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A=Kontrol negatif deionized water; B=Kontrol positif rutin; C=Ekstrak bromelain)

I. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH Estimasi aktivitas antioksidan dengan radikal DPPH bertujuan untuk mengetahui kemampuan ekstrak bromelain daging buah nanas dalam menangkap senyawa radikal atau kemampuan sebagai senyawa antioksidan. Estimasi aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan metode DPPH. DPPH adalah radikal bebas yang stabil dan digunakan untuk mengevaluasi peredaman radikal bebas pada bahan alam. Prinsip reaksi metode ini adalah DPPH akan tereduksi oleh proses donasi hidrogen atau elektron sehingga warnanya akan berubah dari violet ke kuning dengan perubahan intensitas warna yang sebanding dengan jumlah donasi elektron yang diikuti dengan penurunan absorbansi DPPH (Dris dan Jain, 2004).


Senyawa yang dapat menyebabkan hal tersebut dapat dipertimbangkan sebagai antioksidan atau penangkap radikal. Semakin besar penurunan absorbansi DPPH maka semakin kuat pula aktivitas antioksidan. Proses perubahan warna larutan DPPH akibat reaksi dengan antioksidan dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

Gambar 11. Perubahan warna larutan DPPH akibat reaksi dengan antioksidan (Morales-Gonzalez, 2013)

Prinsip metode DPPH dalam penelitian ini adalah pengukuran absorbansi dari radikal DPPH yang mengalami penurunan akibat adanya senyawa antioksidan dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada OT dan panjang gelombang serapan maksimum yang telah ditetapkan sebelumnya (Thangaraj, 2016). Metode ini dipilih karena memiliki beberapa kelebihan, yaitu bisa langsung diaplikasikan pada sampel tanpa memerlukan penambahan senyawa atau pereaksi tambahan lainnya, bisa dikerjakan dengan sangat cepat karena tidak memerlukan OT yang lama, biasa dilakukan untuk menguji aktivitas antioksidan dari sayuran, tanaman, buah, dan makanan yang menggunakan pelarut etanol, metanol, dan air, metode dilaksanakan pada temperatur yang tidak tinggi sehingga cocok untuk


sampel yang tidak tahan dengan panas, metode dilaksanakan dalam waktu yang cukup untuk mengukur reaksi dari radikal DPPH dengan senyawa antioksidan yang lemah, dan yang terakhir adalah memiliki hubungan yang linear antara konsentrasi antioksidan dan penurunan absorbansi yang dihasilkannya. Metode ini memiliki kelemahan yaitu radikal DPPH dapat bereaksi dengan senyawa radikal lainnya, radikal DPPH hanya bisa larut dalam pelarut organik sehingga tidak bisa direaksikan dengan senyawa yang tidak menggunakan pelarut organik, radikal DPPH sensitif terhadap senyawa yang mengandung basa Lewis, dan absorbansi DPPH dalam metanol dan aseton dapat berkurang apabila terkena cahaya (Kedare dan Singh, 2011). Namun kelemahan metode DPPH yang dialami dalam penelitian ini yaitu terkait dengan cahaya dapat diatasi dengan melakukan pengukuran absorbansi DPPH dalam ru angan yang gelap. Pada penelitian ini digunakan rutin sebagai pembanding dalam estimasi aktivitas antioksidan ekstrak bromelain daging buah nanas. Rutin digunakan sebagai pembanding karena rutin termasuk senyawa yang telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan. Rutin dilarutkan ke dalam metanol karena metanol tidak mengganggu reaksi DPPH dan pengukuran absorbansi (Molyneux, 2004). Selain rutin, senyawa lain seperti katekol, karvakol, estagol, eugenol, pirokatekin, dan kuersetin juga dektahui memiliki aktivitas antioksidan karena memiliki gugus –OH fenolat dalam strukturnya yang bertanggung jawab terhadap aktivitas antioksidan karena mampu menjadi donor hidrogen atau elektron. Struktur kimia yang dimiliki oleh rutin menunjukan bahwa rutin mempunyai aktivitas


antioksidan karena adanya gugus fenolik dalam strukturnya. Struktur dari rutin dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

Gambar 12. Struktur rutin (Macikova, Halouzka, Hrbac, Bartak, dan Skopalova, 2012)

Parameter yang digunakan untuk mengetahui besarnya kemampuan senyawa sebagai antioksidan yaitu IC50. Nilai IC50 merupakan konsentrasi senyawa antioksidan yang dibutuhkan untuk mengurangi radikal DPPH sebesar 50%. Nilai IC50 diperoleh dari persamaan regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi ekstrak atau fraksi uji sebagai sumbu x dan % penangkapan radikal sebagai sumbu y. Makin kecil nilai IC50 maka semakin aktif ekstrak atau fraksi uji tersebut sebagai senyawa penangkap radikal DPPH atau senyawa antioksidan. Nilai IC50 ekstrak bromelain daging buah nanas akan dibandingkan dengan nilai IC50 pembanding rutin (Morales-Gonzalez, 2013). Hasil pengukuran aktivitas antioksidan larutan pembanding rutin dan larutan uji ekstrak bromelain daging buah nanas bisa dicermati pada tabel di bawah ini.


Tabel V. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH

Replikasi

1

2

3

Konsentrasi (µg/mL) 10 15 20 25 30 10 15 20 25 30 9,8 14,7 19,6 24,5 29,4

Absorbansi kontrol DPPH

0,805

0,810

0,798

Absorbansi larutan pembanding 0,716 0,635 0,554 0,468 0,384 0,710 0,631 0,538 0,450 0,368 0,705 0,630 0,541 0,451 0,365

%IC 11,0559 21,1180 31,1801 41,8633 52,2981 12,4221 22,2360 33,7888 44,4444 54,5679 11,6541 21,0526 32,2055 43,4837 54,2606

Persamaan regresi linear y = 2,0646x – 9,7888 r = 0,9999

y = 2,13x – 9,1082 r = 0,9997

y = 2,1529x – 10,5263 r = 0,9995

Tabel VI. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak bromelain daging buah nanas dengan metode DPPH Replikasi

1

2

3

Konsentrasi (mg/mL) 3,0024 3,5028 4,0032 4,5036 5,0040 3,006 3,507 4,008 4,509 5,010 2,9976 3,4972 3,9968 4,4964 4,9960

Absorbansi kontrol DPPH

0,868

0,861

0,874

Absorbansi larutan pembanding 0,584 0,543 0,501 0,452 0,406 0,588 0,545 0,499 0,457 0,410 0,594 0,547 0,504 0,453 0,411

%IC 32,7189 37,4424 42,2811 47,9263 53,2258 34,0301 39,0243 44,3670 49,2451 54,7038 32,0366 37,4141 42,3341 48,1693 52,9748

Persamaan regresi linear

y = 10,2995x + 1,5207 r = 0,9994

y = 10,3136x + 0,9567 r = 0,9998

y = 10,5263x + 0,4805 r = 0,9996


Pengukuran aktivitas antioksidan larutan pembanding rutin dan larutan uji ekstrak bromelain daging buah nanas dengan metode DPPH dilakukan dengan tiga kali replikasi. Hasil pengukuran menunjukan bahwa dengan adanya peningkatan konsentrasi larutan, nilai absorbansi yang dihasilkan pun semakin menurun. Semakin besar konsentrasi larutan maka akan semakin banyak senyawa antioksidan yang menjadi donor hidrogen atau elektron pada radikal DPPH sehingga terjadi perubahan warna DPPH yang menyebabkan absorbansi yang dihasilkan semakin kecil. Semakin besar konsentrasi larutan maka nilai %IC yang dihasilkan akan semakin besar. Hal ini menunjukan adanya hubungan yang proporsional antara peningkatan konsentrasi dengan nilai %IC yang dihasilkan. Dari hasil tiga replikasi larutan pembanding rutin dan larutan uji ekstrak bromelain daging buah nanas tersebut, persamaan regresi linear yang dihasilkan memiliki koefisien korelasi yang baik yaitu mendekati 1. Persamaan regresi linear yang digunakan untuk perhitungan nilai IC50 adalah persamaan yang memiliki koefisien korelasi paling baik yaitu y = 2,0646x – 9,7888 dengan r = 0,9999 untuk rutin dan y = 10,3136x + 0,9567 dengan r = 0,9998 untuk ekstrak bromelain. Tabel VII. Hasil IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas Rutin Replikasi 1 2 3 Replikasi 1 2 3

IC50 (µg/mL)

SD

X (µg/mL) 28,9591 27,7503 0,6202 28,2744 28,1138 Ekstrak bromelain daging buah nanas IC50 (mg/mL) SD X (mg/mL) 4,7069 4,7552 4,7043

0,0287

4,7221

X ± SD 28,2744 ± 0,6202

X ± SD 4,7221 ± 0,0287


Hasil rata-rata nilai IC50 rutin adalah 28,2744 µg/mL dengan SD = 0,6202. Rata-rata nilai IC50 ekstrak bromelain daging buah nanas adalah 4,7221 mg/mL dengan SD = 0,0287. Semakin kecil nilai IC50 suatu senyawa maka semakin kuat pula aktivitas antioksidan senyawa tersebut karena dengan konsentrasi yang kecil mampu menimbulkan efek. Penelitian ini menunjukan bahwa perbedaan nilai IC50 antara rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas cukup besar dan rutin memiliki aktivitas antioksidan yang lebih kuat dibandingkan dengan

ekstrak

bromelain daging buah nanas. Hal ini diperkuat dengan perolehan nilai IC50 ekstrak bromelain daging buah nanas dalam penelitian Manosroi, Chankhampan, Pattamapun, Manosroi, dan Manosroi (2014) yaitu sebesar 684, 27 mg/mL. Penyebab perbedaan nilai IC50 yang besar tersebut belum mampu ditemukan dan dipahami oleh peneliti. Nilai IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas menunjukan adanya perbedaan yang besar di antara keduanya, namun untuk memastikan adanya perbedaan tersebut dilakukan uji statistik dengan menggunakan software R 3.2.5. Pengujian statistik yang pertama kali dilakukan adalah uji normalitas data. Uji normalitas dilakukan untuk mengetahui apakah data IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas terdistribusi secara normal atau tidak. Uji normalitas yang digunakan adalah uji Shapiro-Wilk. Hipotesis null-nya (H0) adalah data terdistribusi normal, sedangkan hipotesis alternatifnya (H1) adalah data tidak terdistribusi normal. Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0 ditolak dan H1 diterima dan jika p-value tidak kurang dari 0,05 maka H1 ditolak dan H0 diterima. Hasil pengujiannya adalah data IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging


buah nanas terdistribusi normal karena p-value rutin = 0,568 dan p-value ekstrak bromelain daging buah nanas = 0,08664. Jadi, H1 ditolak dan H0 diterima sehingga kesimpulannya adalah data terdistribusi normal (Lampiran 13). Pengujian statistik yang kedua adalah uji varian data. Uji varian dilakukan untuk mengetahui homogenitas data nilai IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas. Uji varian yang digunakan adalah uji F. Hipotesis null-nya (H0) adalah varian data tidak berbeda signifikan (homogen), sedangkan hipotesis alternatifnya (H1) adalah varian data berbeda signifikan (tidak homogen). Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0 ditolak dan H1 diterima dan jika p-value tidak kurang dari 0,05 maka H1 ditolak dan H0 diterima. Hasil pengujiannya adalah varian data IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas tidak homogen, karena p-value = 0,0009357. Jadi, H0 ditolak dan H1 diterima sehingga kesimpulannya adalah varian data berbeda signifikan atau tidak homogen (Lampiran 13). Pengujian statistik yang ketiga setelah diketahui bahwa data terdistribusi normal tetapi tidak homogen adalah uji T-Independent unequal variances (Welch’s T-test). Uji T-Independent unequal variances digunakan untuk membandingkan dua kelompok data yang diperoleh dari dua obyek yang berbeda dan ketika data tersebut terdistribusi normal tetapi tidak homogen. Hipotesis nullnya (H0) adalah data tidak berbeda signifikan, sedangkan hipotesis alternatifnya (H1) adalah data berbeda signifikan. Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0 ditolak dan H1 diterima dan jika p-value tidak kurang dari 0,05 maka H1 ditolak dan H0 diterima. Hasil pengujiannya adalah Data IC50 rutin dan ekstrak bromelain


daging buah nanas berbeda secara signifikan, karena p-value = 1,232x10-5. Jadi, H0 ditolak dan H1 diterima sehingga kesimpulannya adalah data berbeda signifikan (Lampiran 13).


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1. Nilai aktivitas antioksidan ekstrak bromelain daging buah nanas yang dinyatakan dengan IC50 sebesar 4,7221±0,0287 mg/mL. 2. Kadar enzim ekstrak bromelain daging buah nanas yang dinyatakan dengan persen (% b/b) sebesar 8,4967±0,0289 % b/b.

B. Saran 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui senyawa lain dalam ekstrak bromelain daging buah nanas yang dihasilkan dari metode isolasi penelitian ini. 2. Perlu dilakukan dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan enzim bromelain dari bagian batang nanas yang memiliki struktur bromelain yang berbeda.

56


DAFTAR PUSTAKA Ahmed, H., 2005, Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and Characterization, CRC Press, Florida, pp. 35-42. Ali, A.A., Milala, M.A., and Gulani, I.A., 2015, Antimicrobial Effect of Crude Bromelain Extracted from Pineapple Fruit (Ananas comosus (Linn.) Merr.), Advances in Biochemistry, 3, 1-4. Backer, C.A. and Bakhuizen van Den Brink, Jr.R.C., 1963, Flora of Java, N.V.P.Noordhoff-Gromingen, Netherland, pp. 3-56. Barhe, T.A. and Tchouya, G.R., 2014, Comparative Study of the Anti-oxidant Activity of the Total Polyphenols Extracted from Hibiscus Sabdariffa L., Glycine max L. Merr., Yellow Tea and Red Wine through Reaction with DPPH Free Radical, Arabian Journal of Chemistry, 9, 1-8. Bartholomew, D.P., Paull, R.E., and Rohrbach, K.G., 2002, The Pineapple: Botany, Production and Uses, CABI Publishing, Wallingford, p. 113. Bettelheim, F.A. and Landesberg, J.M., 2009, Laboratory Experiment for Introduction to General, Organic and Biochemistry, Brooks Cole, New York, pp. 256-257. Bhattacharyya, B.K., 2008, Bromelain: An Overview, Natural Product Radiance, 7(4), 359-363. Blois, M.S., 1958, Antioxidant Determinations by the Use of a Stable Free Radical, Nature, 181, 1199-1200. Bolton, S. and Bon, C., 2010, Pharmaceutical Statistics: Practical and Clinical Applications, Informa Healthcare, New York, pp. 82-106. Bottom, C.B., Hanna, S.S., and Siehr, D.J., 1978, Mechanism of the Ninhydrin Reaction, Biochemical Education, 6(1), 4-5. Boyer, R.F., 2011, Biochemistry Laboratory: Modern Theory and Techniques, Prentice Hall, New Jersey, p. 112. Chaurasiya, R.S. and Hebbar, H.U., 2013, Extraction of Bromelain from Pineapple Core and Purfication by RME and Precipitation Methods, Separation and Purification Technology, 111, 90-97. Cutler, P., 2004, Protein Purification Protocols, Humana Press, New York, pp. 47-52. Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S., and Mohammad, N.S., 2009, Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula Assafoetida and Its Essential Oil Composition, Grasas Aceites, 60(4), 405-412. Dennison, C., 2003, A Guide to Protein Isolation, Springer International Publishing, New York, pp. 84-88. Depkes RI, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp, 7, 1036, 1061. Devakate, R.V., Patil, V.V., Waje, S.S., and Thorat, B.N., 2008, Purification and Drying of Bromelain, Separation and Purification Technology, 64(2009), 259-264.


Dris, R. and Jain, S.M., 2004, Production Practices and Quality Assessment of Food Crops: Quality Handling and Evaluation, Kluwer Academic Publisher, New York, pp. 58-60. Gandjar, I.G. and Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 229-234. Halliwell, B., 2012, Free Radicals and Antioxidant: Updating a Personal View, Nutrition Review, 70, 257-265. Halliwell, B. and Gutteridge, J.M.C., 2000, Free Radical in Biology and Medicine, Oxford University Press, New York, p. 34. Harrach, T., Schulze, F.K., Nuck, R., Grunow, D., and Maurer, H.R., 1995, Isolation and Partial Characterization of Basic Proteinases from Stem Bromelain, J Protein Chem, 14, 41-52. Hatti-Kaul, R. and Mattiasson, B., 2003, Isolation and Purification od Proteins, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 231-235. Isfahlan, Ahmad, Abdollah, Reza, and Rashid, 2010, Antioxidant and Antiradical Activities of Phenolic Extracts from Iranian Almond (Prunus amygdalus L.) Hulls and Shells, Turk J Biol, 34, 165-173. Kedare, S.B. and Singh, R.P., 2011, Genesis and Development of DPPH Method of Antioxidant Assay, Journal of Food, Science, and Technology, 48(4), 412-422. Ketnawa, S., Rawdkuen, S., and Chaiwut, P., 2010, Two Phase Partitioning and Collagen Hydrolysis of Bromelain from Pineapple Peel Nang Lae Cultivar, Biochemical Engineering Journal, 52(2010), 205-211. Layne, E., 1957, Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins, Methods Enzymol., 3, 447-455. Liochev, S.I., 2013, Reactive Oxygen Species and the Free Radical Theory of Aging, Free Radical Biology and Medicine, 60, 1-4. Luis, M.M., Marcela, A.S., Sallete, R., and Lima, J.L.F.C., 2006, Automatic Method for Determination of Total Antioxidant Capacity Using 2,2diphenyl-1-picrylhydrazyl Assay, Anal Chim Acta, 558(3), 310-318. Macikova, P., Halouzka, V., Hrbac, J., Bartak, P., and Skopalova, J., 2012, Electrochemical Behaviour and Determination of Rutin on Modified Carbon Paste Electrodes, The Scientific World Journal, 2012, 1-9. Manosroi, A., Chankhampan, C., Pattamapun, K., Manosroi, W., and Manosroi, J., 2014, Antioxidant and Gelatinolytic Activities of Papain from Papaya Latex and Bromelain from Pineapple Fruits, Chiang Mai J. Sci., 41(3), 635-648. Maurer, H.R., 2001, Bromelain: Biochemistry, Pharmacology, and Medical Use, Cellular and Molecular Life Sciences, 58, 1234-1245. Morales-Gonzalez, J.A., 2013, Oxidative Stress and Chronic Degenerative Diseases: a Role for Antioxidants, Intech Publisher, Croatia, pp. 39-41. Morello, M.J., Shahidi, F., and Ho, C.T., 2002, Free Radicals in Food: Chemistry, Nutrition, and Health Effects, American Chemical Society, Washington D.C., pp. 66-67. Moss, J.N., Frazier, C.V., and Martin, G.J., 1963, Bromelain: The Pharmacology of the Enzymes, Arch Int Pharmacodyn, 145, 166-189.


Murachi, T., 1970, Bromelain Enzymes, Methods in Enzymology, 19(18), 273284. Nadzirah, K.Z., Zainal, S., Noriham, A., and Normah, I., 2013, Efficacy of Selected Purification Techniques for Bromelain, International Food Research Journal, 20(1), 43-46. Ou, B., Huang, D.J., Woodill, M.H., Flanagan, J.A., and Deemer, E.K., 2002, Analysis of Antioxidant Activities of Common Vegetables Employing Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) and Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) Assays: A Comparative Study, J. Agric. Food Chem., 50, 3122-3128. Owusu-Apenten, R.K., 2002, Food Protein Analysis: Quantitative Effects on Processing, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 169-171. Panda, H., 2000, Herbal Cosmetics Hand Book, Asia Pasific Business Press, New Delhi, pp. 525-526 Pavan, R., Jain, S., Shraddha, and Kumar, A., 2012, Properties and Therapeutic Applicattion of Bromelain: A Review, Biotechnology Research International, 2012, 1-6. Pendzhiev, A.M., 2002, Proteolytic Enzymes of Papaya: Medicinal Applications, Pharmaceut. Chem. J., 36, 315-317. Prakash, A., Rigelhof, F., and Miller, E., 2001, Antioxidant Activity: Medallion Laboratories, Analithycal Progress, 19(2), 1-4. Pullaiah, T., 1998, Taxonomy of Angiosperms, Regency Publications, New Delhi, pp. 243-245. Rukmana, 1996, Nanas Budidaya dan Paskapanen, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, pp. 75-76. Saleh, M.A., Clark, S., Woodard, B., and Deolu, S.A., 2010, Antioxidant and Free Radical Scavenging Activities of Essential Oils, Ethnicity & Disease, 20, 78-82. Soares, P.A.G., Vaz, A.F.M, Correia, M.T.S., Pessoa, A., and Carneiro-da-Cunha, M.G., 2012, Purification of Bromelain from Pineapple Wastes by Ethanol Precipitation, Separation and Purification Technology, 98, 389-395. Stoscheck, C.M., 1990, General Methods for Handling Proteins and Enzymes, Methods in Enzymology, 182(6), pp. 50-56. Sunardi, K.I., 2007, Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Belimbing Wuluh (Averrhoa blimbi, L.) terhadap 1,1-Diphenyl-2-Picrylhidrazyl (DPPH), Seminar Nasional Teknologi, 1-9. Thangaraj, P., 2016, Pharmacological Assays of Plant-Based Natural Products, Springer International Publishing, Switzerland, pp. 58-61. Toldra, F. and Nollet, L.M.L., 2013, Proteomics in Food: Principles and Applications, Springer International Publishing, New York, pp. 23-35. Uppu, R.M., Murthy, S.N., Pryor, W.A., and Parinandi, N.L., 2010, Free Radicals and Antioxidant Protocols, Humana Press, New York, pp. 51-53.


Walker, J.M., 2002, The Protein Protocols Handbook, Humana Press, New York, pp. 3-6. Yahia, M.E., 2011, Postharvest Biology and Technology of Tropical and Subtropical Fruits, Woodhead Publishing Limited, Cambridge, 194-218. Zou, Y., Lu, Y., and Wei, D., 2004, Antioxidant Activity of a Flavonoid-Rich Extract of Hypericum perforatum L. in Vitro, J. Agric. Food Chem., 52, 5032-5039.


LAMPIRAN Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman nanas (Ananas comosus (L.) Merr.)

61


Lampiran 2. Gambar buah nanas


Lampiran 3. Perhitungan rendemen Bobot masing-masing daging buah nanas yang digunakan adalah 70 gram, sehingga total bobot daging buah nanas yang digunakan adalah 210 gram. Cawan 1 (g)

Cawan 2 (g)

Cawan 3 (g)

Berat cawan

54,0656

29,1806

34,6945

Berat cawan + ekstrak

55,2464

30,4336

35,8174

Berat ekstrak

1,1808

1,2530

1,1229

Total berat ekstrak bromelain

= 1,1808 g + 1,2530 g + 1,1229 g = 3,5567 g

Rendemen ekstrak bromelain


Lampiran 4. Penimbangan analisis kualitatif bromelain a. Data penimbangan ekstrak bromelain daging buah nanas Replikasi 1 (g)

Replikasi 2 (g)

Replikasi 3 (g)

Berat wadah

13,5735

13,5821

14,2743

Berat wadah + sampel

13,8300

13,8470

14,5295

Berat wadah + sisa

13,5820

13,5945

14,2881

Berat sampel

0,2480

0,2525

0,2414

b. Data penimbangan ninhidrin Ninhidrin Berat wadah

13,5739


13,9238

Berat wadah + sisa

13,5744

Berat sampel

0,3494

Lampiran 5. Penimbangan penetapan kadar enzim bromelain a. Data penimbangan ekstrak bromelain daging buah nanas Replikasi 1 (g)

Replikasi 2 (g)

Replikasi 3 (g)

Berat wadah

25,8160

14,2743

13,7527


26,1016

14,5528

14,0335

Berat wadah + sisa

25,8511

14,3028

13,7835

Berat sampel

0,2505

0,2500

0,2500


Lampiran 6. Optimasi penetapan kadar enzim bromelain a. Penentuan operating time (OT) bovine serum albumine pada λ = 280 nm

Waktu (Menit) 5 10 15 20 25 30

Replikasi 1 0,271 0,272 0,271 0,271 0,272 0,271

Absorbansi konsentrasi 400 µg/mL Replikasi 2 Replikasi 3 0,268 0,270 0,268 0,271 0,268 0,271 0,269 0,271 0,268 0,272 0,268 0,271

OT yang diperoleh 5 menit

Waktu (Menit) 5 10 15 20 25 30

Replikasi 1 0,475 0,475 0,475 0,475 0,476 0,475



Waktu (Menit) 5 10 15 20 25 30

Replikasi 1 0,680 0,681 0,680 0,680 0,680 0,681




b. Penentuan λ maksimum bovine serum albumine 1. Spektra bovine serum albumine 400 µg/mL

2. Spektra bovine serum albumine 700 µg/mL


3. Spektra bovine serum albumine 1000 µg/mL


Lampiran 7. Penetapan kadar enzim bromelain a. Konsentrasi bovine serum albumine 1. Konsentrasi larutan induk bovine serum albumine Replikasi 1 2 3

V1 (mL) 0,5 0,5 0,5

C1 (mg/mL) 50 50 50

V2 (mL) 25 25 25

C2 (mg/mL) 1 1 1

2. Konsentrasi seri larutan bovine serum albumine Replikasi

1

2

3

V1

C1

V2

C2

(mL)

(µg/mL)

(mL)

(µg/mL)

4

1000

10

400

5,5

1000

10

550

7

1000

10

700

8,5

1000

10

850

10

1000

10

1000

4

1000

10

400

5,5

1000

10

550

7

1000

10

700

8,5

1000

10

850

10

1000

10

1000

4

1000

10

400

5,5

1000

10

550

7

1000

10

700

8,5

1000

10

850

10

1000

10

1000


b. Kurva baku bovine serum albumine Replikasi

Konsentrasi (µg/mL)

Absorbansi

400

0,273

550

0,375

y = 0,0006833x –

700

0,478

0,000533

850

0,580

r = 0,9999

1000

0,683

400

0,251

550

0,358

y = 0,0006833x –

700

0,455

0,020933

850

0,561

r = 0,9999

1000

0,662

400

0,274

550

0,371

y = 0,0006893x –

700

0,477

0,004333

850

0,585

r = 0,9998

1000

0,684

1

2

3


Persamaan regresi linear yang digunakan adalah y = 0,0006833x – 0,000533

c. Penetapan kadar enzim bromelain larutan uji 1. Absorbansi ekstrak bromelain daging buah nanas Replikasi

Absorbansi

1

0,583

2

0,578

3

0,578


2. Konsentrasi dan bobot enzim ekstrak bromelain daging buah nanas Replikasi 1 Persamaan regresi linear y = 0,0006833x – 0,000533 0,583 = 0,0006833x – 0,000533 x = 853,992 µg/mL

massa

Replikasi 2 Persamaan regresi linear y = 0,0006833x – 0,000533 0,578 = 0,0006833x – 0,000533 x = 846,674 µg/mL

massa

Replikasi 3 Persamaan regresi linear y = 0,0006833x – 0,000533 0,578 = 0,0006833x – 0,000533 x = 846,674 µg/mL


massa

3. Kadar enzim ekstrak bromelain daging buah nanas Persen enzim

=

Replikasi 1 Persen enzim

= = 8,52 % b/b


= = 8,47 % b/b


= = 8,47 % b/b

Kadar

Bobot enzim

Bobot ekstrak

(mg)

(mg)

1

21,35

250,5

8,52

2

21,17

250

8,47

3

21,17

250

8,47

Replikasi

Enzim

x ± SD

(% b/b)

8,4967 ± 0,0289


Lampiran 8. Penimbangan pengujian aktivitas antioksidan a. Data penimbangan DPPH Replikasi 1 (g)

Replikasi 2 (g)

Replikasi 3 (g)

Berat wadah

14,2743

13,5727

13,5835


14,2902

13,5885

13,5996

Berat wadah + sisa

14,2744

13,5727

13,5837

Berat sampel

0,0158

0,0158

0,0159

Replikasi 1 (g)

Replikasi 2 (g)

Replikasi 3 (g)

Berat wadah

14,2743

13,5727

13,5835


14,2793

13,5779

13,5885

Berat wadah + sisa

14,2743

13,5729

13,5836

Berat sampel

0,0050

0,0050

0,0049

b. Data penimbangan rutin

c. Data penimbangan ekstrak bromelain daging buah nanas Replikasi 1 (g)

Replikasi 2 (g)

Replikasi 3 (g)

Berat wadah

14,2743

25,8160

19,6945


14,5313

26,0914

19,9632

Berat wadah + sisa

14,2811

25,8409

19,7134

Berat sampel

0,2502

0,2505

0,2498


Lampiran 9. Perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding, dan larutan uji a. Konsentrasi DPPH 1. Replikasi 1 BM = 394,33 Mol

0,0401 mmol

M

0,4010 mM

2. Replikasi 2 BM = 394,33 Mol

0,0401 mmol

M

0,4010 mM

3. Replikasi 3 BM = 394,33 Mol

0,0403 mmol

M

0,4030 mM

b. Konsentrasi rutin 1. Konsentrasi larutan induk Replikasi 1 50 µg/mL


Replikasi 2 50 µg/mL Replikasi 3 49 µg/mL

2. Konsentrasi seri larutan baku rutin Replikasi

1

2

3

V1

C1

V2

C2

(mL)

(µg/mL)

(mL)

(µg/mL)

2

50

10

10

3

50

10

15

4

50

10

20

5

50

10

25

6

50

10

30

2

50

10

10

3

50

10

15

4

50

10

20

5

50

10

25

6

50

10

30

2

49

10

9,8

3

49

10

14,7

4

49

10

19,6

5

49

10

24,5

6

49

10

29,4

c. Konsentrasi ekstrak bromelain daging buah nanas 1. Konsentrasi larutan induk Replikasi 1 10,008 mg/mL


Replikasi 2 10,02 mg/mL Replikasi 3 9,992 mg/mL 2. Konsentrasi seri larutan uji Replikasi

1

2

3

V1

C1

V2

C2

(mL)

(mg/mL)

(mL)

(mg/mL)

3

10,008

10

3,0024

3,5

10,008

10

3,5028

4

10,008

10

4,0032

4,5

10,008

10

4,5036

5

10,008

10

5,0040

3

10,02

10

3,006

3,5

10,02

10

3,507

4

10,02

10

4,008

4,5

10,02

10

4,509

5

10,02

10

5,010

3

9,992

10

2,9976

3,5

9,992

10

3,4972

4

9,992

10

3,9968

4,5

9,992

10

4,4964

5

9,992

10

4,9960


Lampiran 10. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a. Penentuan operating time (OT) rutin pada λ = 517 nm

Waktu (Menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Replikasi 1 0,812 0,793 0,787 0,782 0,780 0,780 0,780 0,781 0,781 0,782 0,783 0,785

Absorbansi konsentrasi 5 µg/mL Replikasi 2 0,811 0,903 0,796 0,791 0,787 0,783 0,783 0,782 0,782 0,783 0,785 0,788

Replikasi 3 0,816 0,797 0,790 0,785 0,783 0,781 0,781 0,779 0,780 0,781 0,782 0,785


Replikasi 3 0,680 0,651 0,628 0,609 0,596 0,584 0,584 0,581 0,574 0,570 0,568 0,568


Waktu (Menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Replikasi 1 0,681 0,641 0,619 0,607 0,599 0,593 0,593 0,590 0,585 0,581 0,579 0,578



Waktu (Menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Replikasi 1 0,518 0,501 0,493 0,453 0,429 0,398 0,397 0,397 0,393 0,389 0,386 0,380


OT yang diperoleh 30 menit b. Penentuan λ maksimum 1. Spektra DPPH 0,020 mM

Replikasi 3 0,510 0,499 0,463 0,438 0,409 0,410 0,399 0,394 0,389 0,386 0,382 0,375


2. Spektra DPPH 0,040 Mm


3. Spektra DPPH 0,060 mM


Lampiran 11. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH

%IC

a. Rutin

Replikasi

1

2

3

Konsentrasi (µg/mL)

Absorbansi

Absorbansi

kontrol

larutan

DPPH

pembanding

%IC


10

0,716

11,0559

15

0,635

21,1180

y = 2,0646x –

0,554

31,1801

9,7888

25

0,468

41,8633

r = 0,9999

30

0,384

52,2981

10

0,710

12,4221

15

0,631

22,2360

y = 2,13x –

0,538

33,7888

9,1082

25

0,450

44,4444

r = 0,9997

30

0,368

54,5679

9,8

0,705

11,6541

14,7

0,630

21,0526

y = 2,1529x –

0,541

32,2055

10,5263

24,5

0,451

43,4837

r = 0,9995

29,4

0,365

54,2606

20

20

19,6

0,805

0,810

0,798


b. Ekstrak bromelain daging buah nanas

Replikasi

1

2

3

Konsentrasi (mg/mL)

Absorbansi

Absorbansi

kontrol

larutan

DPPH

pembanding

%IC


3,0024

0,584

32,7189

3,5028

0,543

37,4424

y = 10,2995x

0,501

42,2811

+ 1,5207

4,5036

0,452

47,9263

r = 0,9994

5,0040

0,406

53,2258

3,006

0,588

34,0301

3,507

0,545

39,0243

y = 10,3136x

0,499

44,3670

+ 0,9567

4,509

0,457

49,2451

r = 0,9998

5,010

0,410

54,7038

2,9976

0,594

32,0366

3,4972

0,547

37,4141

y = 10,5263x

0,504

42,3341

+ 0,4805

4,4964

0,453

48,1693

r = 0,9996

4,9960

0,411

52,9748

4,0032

4,008

3,9968

0,868

0,861

0,874


Lampiran 12. Perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas a. Rutin Replikasi 1 Persamaan regresi linear y

= 2,0646x – 9,7888

50 = 2,0646x – 9,7888 x

= 28,9591 µg/mL

Replikasi 2 Persamaan regresi linear y

= 2,13x – 9,1082

50 = 2,13x – 9,1082 x

= 27,7503 µg/mL


= 2,1529x – 10,5263

50 = 2,1529x – 10,5263 x

= 28,1138 µg/mL

Replikasi


y IC50

X (nilai IC50) µg/mL

1

y = 2,0646x – 9,7888

50

28,9591

2

y = 2,13x – 9,1082

50

27,7503

3

y = 2,1529x – 10,5263

50

28,1138


Replikasi

IC50

1

28,9591

2

27,7503

3

28,1138

SD

X (µg/mL)

X ± SD

0,6202

28,2744

28,2744 ± 0,6202

b. Ekstrak bromelain daging buah nanas Replikasi 1 Persamaan regresi linear y

= 10,2995x + 1,5207

50 = 10,2995x + 1,5207 x

= 4,7069 mg/mL


= 10,3136x + 0,9567

50 = 10,3136x + 0,9567 x

= 4,7552 mg/mL


= 10,5263x + 0,4805

50 = 10,5263x + 0,4805 x

= 4,7043 mg/mL


Replikasi


y IC50

X (nilai IC50) mg/mL

1

y = 10,2995x + 1,5207

50

4,7069

2

y = 10,3136x + 0,9567

50

4,7552

3

y = 10,5263x + 0,4805

50

4,7043

Replikasi

IC50

1

4,7069

2

4,7552

3

4,7043

SD

X (mg/mL)

X ± SD

0,0287

4,7221

4,7221 ± 0,0287


Lampiran 13. Uji statistik


a. Uji normalitas (Uji Shapiro-Wilk) Hipotesis null (H0)

= data terdistribusi normal

Hipotesis alternatif (H1)

= data tidak terdistribusi normal

Taraf kepercayaan 95% Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0 ditolak dan H1 diterima Jika p-value tidak kurang dari 0,05 maka H1 ditolak dan H0 diterima Data IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas terdistribusi normal karena p-value rutin = 0,568 dan p-value ekstrak bromelain daging buah nanas = 0,08664. Jadi, H1 ditolak dan H0 diterima sehingga kesimpulannya adalah data terdistribusi normal.


b. Uji varian data Hipotesis null (H0)

= varian data tidak berbeda signifikan (homogen)


= varian data berbeda signifikan (tidak homogen)

Taraf kepercayaan 95% Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0 ditolak dan H1 diterima Jika p-value tidak kurang dari 0,05 maka H1 ditolak dan H0 diterima Varian data IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas tidak homogen, karena p-value = 0,0009357. Jadi, H0 ditolak dan H1 diterima sehingga kesimpulannya adalah varian data berbeda signifikan atau tidak homogen.

c. Uji t two-sample independent unequal variances (Welch’s t-test) Hipotesis null (H0)

= data tidak berbeda signifikan


= data berbeda signifikan

Taraf kepercayaan 95% Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0 ditolak dan H1 diterima Jika p-value tidak kurang dari 0,05 maka H1 ditolak dan H0 diterima Data IC50 rutin dan ekstrak bromelain daging buah nanas berbeda secara signifikan, karena p-value = 1,232x10-5. Jadi, H0 ditolak dan H1 diterima sehingga kesimpulannya adalah data berbeda signifikan.


BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) Ekstrak Bromelain Buah Nanas (Ananas comosus (L.) Merr.)” memiliki nama lengkap Richard Andrison Sadeli. Dilahirkan di kota Yogyakarta, 28 Desember 1994 dari pasangan Wilson Budijanto Sadeli dan Yenty Widyastuti. Penulis mengawali pendidikan di TK Sokanegara Purwokerto (1998-2000), SD Santo Yosef Purwokerto (2000-2006), SMP Negeri 1 Purwokerto (2006-2009), dan SMA Kolese De Britto (2009-2012). Penulis kemudian melanjutkan pendidikan Sarjana di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tahun 2012 hingga 2016. Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten Praktikum Kimia Dasar (2013, 2014, 2015) dan Praktikum Kimia Organik (2015). Penulis juga juga cukup aktif dalam kegiatan kemahasiswaan dan kepanitian yang terdapat di dalam maupun di luar Universitas Sanata Dharma antara lain panitia Pharmacy Performance and Event Cup (2012), ketua panitia Kampanye Informasi Obat (2014), dan koordinator Early Exposure (2015). Penulis juga memiliki beberapa prestasi dari kejuaraan tingkat nasional antara lain juara 2 Pharmaceutical Industry Case Study di Institut Teknologi Bandung (2015), peringkat 5 bidang farmasi klinis Olimpiade Farmasi Indonesia di Palembang (2015), dan juara 1 Olimpiade Farmasi Klinis Indonesia di Batam (2015).

88

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl) EKSTRAK BROMELAIN BUAH NANAS (Ananas comosus (L.) Merr

Recommend Documents