UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN SIRSAK (Annona muricata L.) DENGAN METODE DPPH (1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazil)
Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN
OLEH : Raden Nabilla Ayesha Putri NIM : 109103000035
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 1433 H/2012 M
i
KATA PENGANTAR
Assalamu’alaikum Warahmatullahi Wabarakatuh… Segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT karena hanya atas rahmat dan karunia-Nya akhirnya penelitian ini dapat terwujud walaupun begitu banyak cobaan dan hambatan yang penulis hadapi. Shalawat serta salam tidak lupa penulis panjatkan kepada Nabi Muhammad SAW yang telah membawa manusia menuju jalan lurus dan diridhoi Allah SWT. Alhamdulillah penulis akhirnya dapat menyelesaikan Laporan Penelitian ini
yang
berjudul
“Uji
Aktivitas
Antioksidan
Ekstrak
Daun
Sirsak
(Annona muricata L.) dengan Metode DPPH”, sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Penulis menyadari bahwa selama proses penulisan laporan penelitian ini banyak menemui hambatan baik yang datang dari faktor luar penulis maupun dari dalam diri penulis. Mengatasi hambatan-hambatan tersebut, penulis banyak mendapat dukungan, pengarahan, petunjuk dan bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada : 1. Prof. Dr (hc). dr. M.K. Tadjudin Sp. And selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 2. DR. dr. Syarief Hasan Lutfie, Sp.KFR selaku Kepala Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. 3. dr. Alyya Siddiqa, Sp.FK dan bu Nurmeilis, M.Si, Apt sebagai dosen pembimbing penelitian penulis, yang telah banyak menyediakan waktu, tenaga dan pikiran untuk memberikan bimbingan, arahan, dan nasihat kepada penulis selama penelitian dan penyusunan laporan penelitian ini.
v
4. drg. Laifa Annisa Hendarmin, Ph.D selaku penanggung jawab riset Program Studi Pendidikan Dokter 2009. 5. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada keluarga besar penulis, terutama orang tua penulis Agus Rizkianto Gunadi dan Syarifah Fauziana yang telah memberikan motivasi serta bantuan dalam hal moril dan finansial selama penulis melakukan penelitian ini. Kakak Penulis, Rizki Ahmad Fauzi yang telah membantu penulis mempersiapkan sampel. 6. Bi Irah yang telah membantu penulis ketika awal mengerjakan riset, mulai dari mencuci dan menjemur daun sirsak sampai penghalusan sampel. 7. Sahabat dan teman-teman PSPD 2009 beserta seluruh staf pengajar dari Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 8. Muhammad Fahriza yang selalu memberikan support dan semangat pada penulis selama penulis melakukan penelitian ini. 9. Resti, Zuwwi, Ali dan Shadiq sebagai teman seperjuangan riset penulis selama kurang lebih 1 tahun ini, saling bantu membantu dan saling support selama pembuatan riset kami yang bertema sama, yaitu antioksidan. 10.Teman-teman GH, Adel, Dian, Dinda, Eka, Matul, Angel, Rere dan Amel yang selalu menemani dikala senang maupun susah, dan selalu memberikan dukungannya selama ini. 11. Bu Zeti, Bu Ismi, dan Bu Ayu yang telah memberikan izin untuk peminjaman alat dan penggunaan laboratorium. 12. Para laboran di kampus 3 FKIK UIN yaitu Mbak Suryani, Mbak Liken dan Mbak Rani yang telah membimbing penulis dan teman sekelompok agar lebih mengerti tentang cara kerja riset kami. 13. Kak Bima, Kak Jia dan Kak Ibel dari prodi Farmasi yang telah mengajarkan penulis dan rekan sekelompok dalam mengerjakan langkah-langkah penelitian ini terutama dalam hal penggunaan alat dan bahan penelitian.
vi
14. Arisya Zuhra Namira yang telah membantu menerjemahkan abstrak ke dalam bahasa inggris. 15. Serta pihak-pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu, yang telah memberikan dukungan hingga terselesaikannya laporan penelitian ini.
Semoga dengan selesainya Laporan Penelitian ini dapat menambah pengetahuan kita semua terutama mengenai salah satu manfaat daun sirsak yaitu sebagai antioksidan.
Wassalamu’alaikum Warahmatullahi Wabarakatuh.
Ciputat, 19 September 2012
Penulis
vii
ABSTRAK Raden Nabilla Ayesha Putri.Program Studi Pendidikan Dokter. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Sirsak (Annona muricata L.) dengan Metode DPPH. 2012. Antioksidan adalah senyawa yang bertugas untuk menetralisir peningkatan radikal bebas. Berdasarkan penelitian sebelumnya, tanaman sirsak merupakan salah satu jenis tanaman buah yang mengandung senyawa flavonoid yang berfungsi sebagai antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan pada daun sirsak (Annona muricata L.). Penelitian ini merupakan penelitian observasional. Ekstrak daun sirsak diperoleh dengan cara maserasi selama 3 hari menggunakan pelarut etanol 96%. Konsentrasi ekstrak daun sirsak dibuat berbeda yaitu 1 ppm, 10 ppm, 100 ppm dan 1000 ppm. Larutan kemudian ditambah 0,0004 gr radikal bebas DPPH yang telah dilarutkan dalam 500 µl etanol 96%. Semua larutan diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis dengan pada gelombang 517 nm. Vitamin C digunakan sebagai kontrol positif. Berdasarkan hasil penelitian, didapatkan nilai IC 50 ekstrak daun sirsak sebesar 18 ppm. Kesimpulan penelitian ini adalah bahwa ekstrak daun sirsak 18 ppm dapat menurunkan kadar radikal bebas hingga 50% sehingga ekstrak daun sirsak dikategorikan sebagai antioksidan sangat kuat. Kata Kunci: Daun Sirsak, Antioksidan, DPPH
ABSTRACT Raden Nabilla Ayesha Putri.Medicine Study Programe. Antioxidant Activity Assay of Soursop Leaf Extract by DPPH method. 2012. Antioxidant is a compound that have a function to neutralize the enhancement of free radicals. According to the previous research, soursop plant is one of the fruit plants that contains flavonoid compound that serves as an antioxidant. This study aims to determine the antioxidant axtivity of the soursop leaf (Annona muricata L.). This study is an observational study. Soursop leaf extracts obtained by maceration using 96% ethanol. The concentration of soursop leaf extracts were made with different concentrations from 1 ppm, 10 ppm, 100 ppm and 1000ppm. The extracts then added with 0.0004 gr of DPPH free radicals that have been dissolved in 500 ml of 96% ethanol. Those solutions were measured at wavelength 517 nm by an UV-Vis spectrophotometer. Vitamin C used as positive control. Based on these results, the IC 50 of soursop leaf extract was 18 ppm. It means that 18 ppm of soursop leaf extract can reduce levels of free radicals by 50% so that the soursop leaf extract is classified as very strong antioxidants. Keywords: Soursop Leaf (Annona muricata L.), Antioxidant, DPPH
viii
DAFTAR ISI
Lembar Judul ........................................................................................................... i Lembar Pernyataan Keaslian Karya ....................................................................... ii Lembar Persetujuan Pembimbing ......................................................................... iii Lembar Pernyataan & Pengesahan .........................................................................iv Kata Pengantar ....................................................................................................... v Abstrak ................................................................................................................ viii Kata Kunci .......................................................................................................... viii Daftar Isi ................................................................................................................ ix Daftar Tabel .......................................................................................................... xi Daftar Gambar ...................................................................................................... xii Daftar Grafik ....................................................................................................... xiii Daftar Singkatan ...................................................................................................xiv Daftar Lampiran .................................................................................................... xv BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ......................................................................................1 1.2 Rumusan Masalah .................................................................................2 1.3 Tujuan Penelitian .................................................................................2 1.3.1 Tujuan Umum ...................................................................................2 1.3.2 Tujuan Khusus ..................................................................................3 1.4 Manfaat Penelitian ................................................................................3 1.4.1 Untuk Masyarakat ..............................................................................3 1.4.2 Untuk Institusi ....................................................................................3 1.4.3 Untuk Peneliti .....................................................................................3 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Landasan Teori ......................................................................................4 2.1.1 Tanaman Sirsak ..................................................................................4 2.1.1.1 Daun Sirsak .....................................................................................5 2.1.2 Simplisia .............................................................................................6 2.1.3 Ekstrak ................................................................................................7 2.1.4 Ekstraksi .............................................................................................7 2.1.4.1 Cara Dingin .....................................................................................7 2.1.4.2 Cara Panas .......................................................................................8 2.1.5 Radikal Bebas .....................................................................................8 2.1.5.1 Pengertian Radikal Bebas ...............................................................8 2.1.5.2 Sifat-sifat Radikal Bebas .................................................................9 2.1.6 Antioksidan .........................................................................................9 2.1.7 Metode Uji Antioksidan ...................................................................11 2.1.8 Spektrofotometri UV-Vis .................................................................13 2.2 Kerangka Konsep ................................................................................14 2.3 Definisi Operasional ............................................................................15
ix
BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1 Desain Penelitian .................................................................................16 3.2 Waktu dan Tempat Penelitian .............................................................16 3.3 Sampel .................................................................................................16 3.4 Alat dan Bahan ....................................................................................16 3.4.1 Alat Penelitian ..................................................................................16 3.4.2 Bahan Penelitian ...............................................................................16 3.5 Cara Kerja Penelitian ......................................................................... 16 3.5.1 Penyiapan Sampel ............................................................................16 3.5.2 Pembuatan Ekstrak Daun Sirsak ......................................................17 3.5.3 Pembuatan Larutan ...........................................................................17 3.5.4 Pengukuran Absorbansi ...................................................................19 3.5.5 Managemen Data ............................................................................. 19 BAB 4 HASIL & PEMBAHASAN 4.1 Pengukuran Absorbansi ..................................................................... 20 4.2 Penetapan Nilai IC 50 .......................................................................... 21 4.3 Keterbatasan Penelitian ...................................................................... 23 BAB 5 KESIMPULAN & SARAN 5.1 Kesimpulan ......................................................................................... 24 5.2 Saran ................................................................................................... 24 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 25
x
DAFTAR TABEL
Tabel 2.1 Definisi Operasional ............................................................................. 15 Tabel 4.1 Panjang Gelombang Maksimum dan Absorbansi Blanko ................... 20 Tabel 4.2 Hasil Absorbansi Larutan 1, 10, 100 dan 1000 ppm ............................ 20 Tabel 4.3 Hasil Absorbansi Larutan Vitamin C ................................................... 20 Tabel 4.4 Data Ekstrak Daun Sirsak .................................................................... 21 Tabel 4.5 Data Vitamin C .................................................................................... 21 Tabel 4.6 Persamaan Linier .................................................................................. 21 Tabel 4.7 Nilai IC 50 .............................................................................................. 21
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1.1 Buah Kecombrang ............................................................................. 4 Gambar 1.2 Reaksi DPPH dengan Antioksidan................................................... 12
xii
DAFTAR GRAFIK
Grafik Perbandingan Konsentrasi dengan Absorbansi Ekstrak Daun Sirsak ....... 29 Grafik Perbandingan Log Konsentrasi & Probit Daun Sirsak ............................. 29 Grafik Perbandingan Konsentrasi dengan Absorbansi Vitamin C ....................... 30 Grafik Perbandingan Log Konsentrasi & Probit Vitamin C ................................ 30
xiii
DAFTAR SINGKATAN
ROS ........................................................................................................................ 1 SOD ........................................................................................................................ 1 CAT ........................................................................................................................ 1 GPx ......................................................................................................................... 1 GRx ........................................................................................................................ 1 DPPH ...................................................................................................................... 2 IC 50 ......................................................................................................................... 2 EC 50 ........................................................................................................................ 2 PUFA ...................................................................................................................... 9 BHA ..................................................................................................................... 10 BHT ...................................................................................................................... 10 TBHQ ................................................................................................................... 10 MDA .................................................................................................................... 13 TBA ...................................................................................................................... 13
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Penghitungan IC 50 ............................................................................ 28 Lampiran 2 Grafik Hasil Penghitungan Data ........................................................ 29 Lampiran 3 Gambar Alat, Bahan dan Hasil ......................................................... 31 Lampiran 4 Tabel Probit ...................................................................................... 33 Lampiran 5 Hasil Determinasi LIPI ..................................................................... 37 Lampiran 6 Riwayat Hidup .................................................................................. 38
xv
1
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Radikal bebas adalah atom atau kelompok atom yang mempunyai elektron yang tidak berpasangan di orbital luarnya.1,2 Radikal bebas sangat reaktif karena dapat mencetuskan reaksi yang berantai dengan mengekstraksi sebuah elektron dari molekul disekitarnya untuk melengkapi orbitalnya sendiri.2 Kecepatan pembentukan radikal bebas yang tidak terkendali dapat menimbulkan stres oksidatif.3 Tubuh manusia mempunyai mekanisme pertahanan untuk melawan stres oksidatif tersebut dengan memproduksi antioksidan.3 Antioksidan adalah senyawa yang bertugas untuk menetralisir peningkatan radikal bebas, melindungi sel dari efek toksik yang dihasilkan serta berkontribusi dalam pencegahan penyakit.3 Antioksidan dibagi menjadi 2 jenis yaitu antioksidan endogen dan antioksidan eksogen,yang termasuk antioksidan endogen adalah sistem enzim seperti superoxide dismutase (SOD), catalase(CAT), glutathione peroxidase (GPx) dan glutathione reductase (GRx). Sedangkan yang dimaksud antioksidan eksogen adalah antioksidan yang tidak dapat diproduksi oleh tubuh dan didapat melalui buah-buahan, sayur-sayuran, kacang-kacangan, biji-bijian dan beberapa daging, unggas dan ikan. Makanan-makanan tersebut mengandung vitamin E, Vitamin C, beta karoten dan flavonoid.3,4,5 Flavonoid adalah senyawa polifenol yang terdapat di berbagai tanaman, seperti teh hijau, anggur, apel, kakao, ginkgo biloba, kedelai, kunyit, bawang, brokoli, dll.5 Efek antioksidan yang terkandung dalam flavonoid dapat mencegah penyakit-penyakit kronis dan degeneratif seperti penyakit jantung, kanker, arthritis, stroke dan penyakit Alzheimer.3,6 Berdasarkan penelitian sebelumnya, tanaman sirsak merupakan salah satu jenis tanaman buah yang mengandung senyawa bioaktif seperti golongan tanin, fitosterol, flavonoid, saponin dan alkaloid.7,8 Menurut penelitian yang dilakukan Baskar dan Kumar berjudul In Vitro Antioxidant studies in leaves of Annona Species, didapatkan hasil bahwa daun
2
sirsak mengandung senyawa flavonoid dan memiliki aktivitas antioksidan yang kuat dengan nilai IC 50 70 ppm. 8 Khasiat lain dari daun sirsak adalah kandungan acetogenin yang mempunyai efek anti feedent (pestisida alami) sehingga hama tidak memiliki keinginan untuk melahap tanaman yang disukainya.7 Selain itu daun sirsak juga memiliki efek antihiperglikemik. Menurut hasil penelitian Adeyemi dan Komolafe, mencit galur wistar yang diinduksi hiperglikemia menggunakan streptozotosin mengalami penurunan kadar glukosa darah setelah diinjeksi ekstrak daun sirsak selama 15 hari.9 Berdasarkan hasil penelitian yang ada, perlu dilakukan penelitian mengenai aktivitas antioksidan ekstrak daun sirsak menggunakan konsentrasi larutan yang berbeda untuk menjadi perbandingan dengan penelitian sebelumnya. Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH (2,2-Diphenyl-1Picrylhidrazyl) karena metode DPPH merupakan metode yang mudah dan sederhana dibandingkan dengan metode pengukuran lainnya. Parameter yang dipakai untuk menunjukan aktivitas antioksidan adalah harga konsentrasi efisien atau efficient concentration (EC 50 ) atau Inhibition Contentration (IC 50 ) yaitu konsentrasi suatu zat antioksidan yang dapat menyebabkan 50% DPPH kehilangan karakter radikal bebas.
1.2 Rumusan Masalah Apakah ekstrak daun sirsak memiliki aktivitas antioksidan terhadap radikal bebas DPPH?
1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan Umum Mengukur aktivitas antioksidan ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) dengan metode DPPH
3
1.3.2
Tujuan Khusus • Mengetahui nilai IC 50 dari ekstrak daun apel yang diinduksi dengan radikal DPPH • Mengetahui ekstrak daun apel termasuk antioksidan sangat kuat, kuat, sedang, lemah atau tidak dapat diklasifikasikan
1.4 Manfaat Penelitian 1.4.1
Untuk masyarakat Menjadi sumber informasi bagi masyarakat tentang senyawa biokatif yang terkandung dalam ekstrak daun sirsakdan fungsinya sebagai antioksidan.
1.4.2
Untuk institusi Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi data dasar untuk mengetahui lebih lanjut tentang efek antioksidan dari ekstrak daun sirsak.
1.4.3
Untuk peneliti Sebagai prasyarat untuk mendapat gelar sarjana kedokteran dan menempuh jenjang pendidikan klinik Program Studi Pendidikan Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
4
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Landasan Teori 2.1.1 Tanaman Sirsak Sirsak (Annona muricata L.) merupakan salah satu jenis tanaman buah yang berasal dari amerika selatan yang beriklim tropis, kemudian menyebar luas ke daratan Asia Selatan dan Asia Tenggara, termasuk Indonesia. Pada awalnya, sirsak merupakan tanaman liar dan setelah dibudidayakan umumnya merupakan tanaman pekarangan.10 Sirsak merupakan tanaman tropis yang buahnya memiliki bau dan rasa yang khas. Buahnya berduri halus, daging buahnya berwarna putih susu, rasanya manis asam dan berbiji kecil berwarna hitam. 10 Menurut sistematika, tanaman sirsak termasuk dalam : Kingdom: Plantae (Tumbuhan) Subkingdom: Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) Super Divisi: Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisi: Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga) Kelas: Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil) Sub Kelas: Magnoliidae Ordo: Magnoliales Famili: Annonaceae Genus: Annona Spesies: Annona muricata L.
Gambar 1.1. Daun Sirsak (Annona muricata L.) Sumber :http://daunsirsak.net/
5
Sirsak merupakan jenis tanaman yang paling mudah untuk tumbuh di antara jenis-jenis Annona lainnya dan membutuhkan iklim tropik yang hangat dan lembab. Tanaman ini dapat tumbuh pada ketinggian sampai 1200 m dpl. Tanaman sirsak akan tumbuh dengan sangat baik pada keadaan iklim bersuhu 22 - 280 C, dengan kelembaban relatif 60 – 80 % dan curah hujan berkisar antara 1500 – 2500 mm per tahun.10 Keadaan yang terlalu esktrem seperti terlalu panas atau terlalu dingin akan mempengaruhi pertumbuhan tanaman sirsak. Pertumbuhannya sangat terhambat oleh cuaca yang dingin. Sedangkan di musim kemarau, tanaman sirsak akan menyesuaikan diri terhadap lingkungannya dengan merontokkan daunnya untuk meminimalkan penguapan. Tanaman sirsak dapat tumbuh dan berkembang dengan baik di tanah dengan aliran air yang baik sebab tanaman sirsak tidak tahan terhadap genangan air.10
2.1.1.1 Daun Sirsak Morfologi Daun sirsak berbentuk bulat panjang dengan ujung lancip pendek. Daun tuanya berwarna hijau tua dan daun mudanya berwarna hijau kekuningan. Daun sirsak tebal dan sedikit kaku dengan urat daun menyirip atau tegak pada urat daun utama. 10 Sirsak (Annona muricata L.) termasuk tanaman yang dapat tumbuh dan berbuah sepanjang tahun apabila air tanah mencukupi selama pertumbuhannya. Menurut beberapa literatur, tanaman sirsak berasal dari Amerika Tengah. Di Indonesia, tanaman sirsak menyebar dan tumbuh baik mulai dari daratan rendah beriklim kering sampai daerah basah dengan ketinggian 1.000 meter dari permukaan laut. Penyebaran hampir merata dibuktikan dengan adanya nama-nama daerah yang berbeda – beda untuk tanaman sirsak.10 Tanaman ini memiliki batang utama yang kecil dan pendek. Daunnya berbentuk bulat telur agak tebal dan pada
6
permukaan bagian atas yang halus berwarna hijau tua, sedangkan pada bagian bawah daun warnanya lebih tua. 10
Kandungan dan Manfaat Daun Sirsak Daun sirsak mengandung senyawa acetogenin, antara lain asimisin, bulatasin
dan
squamosin. Acetogenin adalah senyawa polyketides dengan
struktur 30–32 rantai karbon tidak bercabang yang terikat pada gugus 5-methyl-2furanone. Rantai furanone dalam gugus aktivitas sitotoksik, dan derivat
hydrofuranone pada C23 memiliki
acetogenin yang berfungsi sitotoksik adalah
asimisin, bulatasin, dan squamosinyang mampu menghalangi transport elektron pada sistem respirasi sel, sehingga menyebabkan gradien proton terhalang dan cadangan energi tidak dapat membentuk ATP. Bulatasin diketahui menghambat kerja enzim NADH-ubiquinone reduktase yang dibutuhkan dalam reaksi respirasi di mitokondria. 7
Aktivitas Antioksidan Daun Sirsak Menurut penelitian mengenai potensi antioksidan pada ekstrak daun sirsak telah diketahui bahwa ekstrak etanol daun sirsak (Annona muricata L.) memiliki aktivitas antioksidan. Ekstrak sebanyak 500 µg/ml menunjukkan aktivitas sebagai antioksidan dengan nilai persen penghambatan radikal bebas pada 1,1-diphenyl-2picrylhydrazil
sebesar
88,77%,
pada 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothizoline-6-
sulphonat esebesar 90.05%, pada radikal hidroksil sebesar 85.88% dan pada nitric oxide sebesar 72.60%. Hal ini merupakan aktivitas inhibisi dari peroksidase lipid.9
2.1.2 Simplisia Simplisia adalah bahan alam yang digunakan sebagai obat dan belum mengalami pengolahan apapun, dan kecuali dinyatakan lain, berupa bahan yang telah dikeringkan. Simplisia dibedakan menjadi dua golongan yaitu simplisia nabati, simplisia hewani. 11
7
2.1.3 Ekstrak Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan cara mengekstraksi zat aktif dari simplisisa nabati atau simplisia hewani serta menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan.11
2.1.4 Ekstraksi Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan bantuan pelarut. Pelarut yang digunakan harus dapat mengekstrak substansi yang diinginkan tanpa melarutkan material lainnya.Pelarut organik yang sangat sering digunakan dalam mengekstraksi zat aktif dari sel tanaman adalah metanol, etanol, kloroform, hexan, aseton, benzen dan etil asetat.11 Ekstraksi dengan menggunakan pelarut dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu : 2.1.4.1 Cara dingin a. Maserasi Maserasi
adalah
proses
penyarian
simplisia
dengan
cara
perendaman menggunakan pelarut dengan sesekali pengadukan pada temperatur kamar. Maserasi yang dilakukan pengadukan secara terusmenerus disebut
maserasi
kinetic
sedangkan
yang dilakukan
pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan terhadap maserat pertama dan seterusnya disebut remaserasi.11 b. Perkolasi Perkolasi adalah proses penyarian simplisia dengan pelarut yang selalu baru sampai terjadi penyarian sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur kamar. Proses perkolasi terdiri dari tahap pelembaman bahan, tahap perendaman antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan ekstrak) terus-menerus sampai diperoleh perkolat yang jumlahnya 1-5 kali bahan.11
8
2.1.4.2 Cara panas a. Refluks Refluks adalah proses penyarian simplisia dengan menggunakan alat pada temperatur tititk didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik.11 b. Digesti Digesti adalah proses penyarian dengan pengadukan kontinu pada temperature lebih tinggi daripada temperature ruangan, yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-50°C.11 c. Sokletasi Sokletasi adalah proses penyarian dengan menggunakan pelarut yang selalu baru, dilakukan dengan menggunakan alat soklet sehingga menjadi ektaraksi kontinu dengan pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.11 d. Infludasi Infludasi adalah proses penyarian dengan menggunakan pelarut air pada temperatur 90°C selama 30 menit.11 e. Dekoktasi Dekoktasi adalah proses penyarian dengan menggunakan pelarut air pada temperatur 90°C selama 30 menit.11
2.1.5 Radikal bebas 2.1.5.1 Pengertian radikal bebas Radikal bebas adalah atom atau kelompok atom yang mempunyai elektron yang tidak berpasangan di orbital luarnya.1,2 Radikal bebas ini sangat reaktif karena dapat mencetuskan reaksi yang berantai dengan mengekstraksi sebuah elektron dari molekul disekitarnya untuk melengkapi orbitalnya sendiri.2 Jika jumlahnya sedikit, radikal bebas dapat dinetralkan oleh sistem enzimatik tubuh, namun jika berlebih, memicu efek patologis. 12
9
2.1.5.2 Sifat-sifat Radikal Bebas Kerusakan membran sel yang diawali oleh radikal bebas menyebabkan kerusakan sel dengan rangkaian proses sebagai berikut : 1) Terjadi ikatan kovalen antara radikal bebas dengan komponen membran (enzim-enzim membran, komponen karbohidrat
membran plasma), sehingga
terjadi perubahan struktur dan fungsi reseptor. 2) Oksidasi gugus tiol pada komponen membran oleh radikal bebas yang menyebabkan proses transport lintas membran terganggu. 3) Reaksi peroksidasi lipid dan kolesterol membran yang mengandung asam lemak tak jenuh majemuk (PUFA = Poly Unsaturated Fatty Acid). Hasil peroksidasi lipid membran oleh radikal bebas berefek langsung terhadap kerusakan membran sel, antara lain dengan mengubah fluiditas, cross-linking, struktur dan fungsi membran serta menyebabkan kematian sel. Dalam keadaan normal tubuh kita mempunyai mekanisme pertahanan terhadap radikal bebas. Kerusakan sel akibat radikal bebas baru dapat terjadi apabila kemampuan mekanisme pertahanan tubuh menurun.13
2.1.6 Antioksidan Antioksidan adalah senyawa yang bertugas untuk menetralisir peningkatan radikal bebas, melindungi sel dari efek toksik yang dihasilkan serta berkontribusi dalam pencegahan penyakit.3 Antioksidan dibagi menjadi 2 jenis yaitu antioksidan endogen dan antioksidan eksogen,yang termasuk antioksidan endogen adalah sistem enzim seperti superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) dan glutathione reductase (GRx). Sedangkan yang dimaksud antioksidan eksogen adalah antioksidan yang tidak dapat diproduksi oleh tubuh dan didapat melalui buah-buahan, sayur-sayuran, kacang-kacangan, biji-bijian dan beberapa daging, unggas dan ikan. Makanan-makanan tersebut mengandung vitamin E, Vitamin C, beta karoten dan flavonoid.3,4,5 Mekanisme kerja antioksidan secara umum adalah menghambat oksidasi lemak. Oksidasi lemak terdiri dari 3 tahap yaitu inisiasi, propagasi, dan terminasi.14 Pada tahap inisiasi terjadi pembentukan radikal asam lemak, yaitu suatu senyawa turunan asam lemak yang bersifat tidak stabil dan sangat reaktif
10
akibat dari hilangnya satu atom hidrogen (reaksi 1). Pada tahap propagasi, radikal asam lemak akan bereaksi dengan oksigen membentuk radikal peroksi (reaksi 2). Radikal peroksi lebih lanjut akan menyerang asam lemak menghasilkan hidroperoksida dan radikal asam lemak baru (reaksi 3). Hidroperoksida yang terbentuk bersifat tidak stabil dan akan terdegradasi lebih lanjut menghasilkan senyawa-senyawa karbonil rantai pendek seperti aldehida dan keton yang berasal dari pemecahan makanan berlemak. Tanpa adanya antioksidan, reaksi oksidasi lemak akan mengalami terminasi melalui reaksi antar radikal bebas membentuk kompleks bukan radikal (reaksi 4).14 Inisiasi
: RH R* + H *
(1)
Propagasi
: R* + O 2 ROO*
(2)
Terminasi
ROO* + RH ROOH + R*
(3)
: ROO* + ROO* non radikal
(4)
R* + ROO non radikal R* + R* non radikal Berdasarkan sumbernya, antioksidan dapat digolongkan menjadi 2 yaitu antioksidan alami dan buatan. a. Antioksidan Alami Antioksidan alami berasal dari tumbuhan yang sering dikonsumsi dan telah diisolasi.Antioksidan yang terdapat dalam tumbuhan mengandung Vitamin C, vitamin E, polienol, karoten, bioflavonoid, katekin dan resveratol.15 b. Antioksidan Sintetik Antioksidan Sintetik diizinkan penggunaannya dalam makanan untuk menjaga mutu dan dari perubahan sifat kimia makanan akibat proses oksidasi yang terjadi terutama pada waktu penyimpanan. Contohnya BHA (Butylated Hidroxyanisol), BHT (Butylated Hydroxytoluene), TBHQ ( Tert-Butyl Hidroxy Quinon), propel galat dan lain-lain. 15
11
2.1.7 Metode Uji Antioksidan Metode uji antioksidan adalah metode yang digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidan yang terkandung dalam suatu sampel. Ada empat metode uji antioksidan yang sering digunakan yaitu :15 1. Metode DPPH 2. Metode Tiosianat 3. Metode Xanthin Oksidase 4. Metode Deoksiribosa a.Metode DPPH DPPH (1,1-Diphenyl-2-Picrylhidrazyl) merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu kamar dan sering digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan beberapa senyawa atau ekstrak bahan alam. DPPH menerima elektron atau radikal hidrogen sehingga membentuk molekul diagmentik yang stabil. Interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara transfer elektron atau radikal hidrogen pada DPPH, akan menetralkan karakter radikal bebas dari DPPH. Jika semua elektron pada radikal bebas DPPH menjadi berpasangan, maka warna larutan berubah dari ungu tua menjadi kuning terang dan absorbansi pada panjang gelombang 517 nm akan hilang. Perubahan ini dapat diukur secara stokiometri sesuai dengan jumlah elektron atau atom hidrogen yang ditangkap oleh molekul DPPH akibat adanya zat antioksidan .16,17 Prinsip dari uji antioksidan dengan metode DPPH adalah terjadinya perubahan warna larutan yaitu perubahan warna ungu menjadi ungu pudar dan kuning. Perubahan warna ungu menjadi ungu pudar dan kuning dikarenakan adanya penurunan absorptivitas molar dari molekul DPPH. Perubahan warna tersebut berdasarkan jumlah elektron yang tertangkap. Radikal bebas DPPH yang memiliki elektron tidak berpasangan memberikan warna ungu. Perubahan warna yang terjadi disebabkan adanya ikatan antara elektron DPPH dengan atom hidrogen yang mengindikasikan adanya peningkatan kemampuan antioksidan dalam menangkap radikal bebas. Jika semua elektron pada radikal bebas DPPH menjadi berpasangan, maka warna larutan berubah dari ungu tua menjadi kuning
12
terang dan absorbansi pada panjang gelombang 517 nm akan hilang. Dengan demikian, semakin besar konsentrasi larutan, maka semakin memudar warna larutan dan absorbansinya semakin kecil.17 Menurut metode Blois
18
kira-kira ekstrak metanol (4ml pada 0,5 mg/ml)
ditambahkan sampai 1 ml DPPH (1 mM dalam larutan metanol) di dalam 5 ml botol dengan penutup. Campuran diaduk rata dan disimpan dalam temperatur ruangan selama 10 menit. Lalu diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV/Vis.19 Parameter yang dipakai untuk menunjukan aktivitas antioksidan adalah nilai konsentrasi efisien atau efficient concentration (EC 50 ) atau Inhibition Contentration (IC 50 )
yaitu konsentrasi suatu zat antioksidan yang dapat
menyebabkan 50% DPPH kehilangan karakter radikal bebas atau konsentrasi suatu zat antioksidan tinggi akan mempunyai harga EC 50 atau IC 50 yang rendah.
Gambar 1.2. Reaksi DPPH dengan Antioksidan Sumber : Prakash 2001
b. Metode Tiosianat Metode ini didasarkan pada kemampuan senyawa antioksidan dalam menghambat terbentuknya radikal yang reaktif. Pembentukan radikal bebas oleh oksidasi asam linoleat. Oksidasi lipid sering disebut autooksidasi karena reaksi tetap berlangsung walaupun tidak ada zat pengoksidasi. Aktivitas antioksidan yang ditemukan dengan metode tiosianat membutuhkan suatu kontrol positif, pembanding ini biasanya merupakan senyawa yang telah diketahui sifat antioksidannya, seperti Vitamin C, butil hidroksi toluena (BHT) atau tokoferol (vitamin E). Oksidasi asam linoleat dalam kondisi buffer yang diinkubasi pada
13
suhu 370 C menggunakan FeCl 2 dan amonium tiosianat sebagai pereaksi oksidator dapat mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ sehingga menghasilkan warna merah darah yang menyerap sinar tampak pada panjang gelombang 500 nm. 4
c. Metode Xanthine Oxidase Suatu sistem uji evaluasi aktivitas penangkal untuk sampel melawan superoksida anion radikal bebas.4 Pada metode ini digunakan SOD (Superoksida Dismutase).Superoksida dismutase merupakan antioksidan endogen yang dapat mengkatalisis radikal superoksida (O 2 ) menjadi hidrogen peroksida (H 2 O 2 ), sehingga SOD disebut sebagai scavenger atau pembersih superoksida (O 2 ). Larutan ekstrak yang akan diuji dicampur dengan SOD dan Xhantine kemudian diukur absorbansinya.4
d. Metode Deoksiribosa Reaksi degradasi gula deoksiribosa akan menghasilkan suatu produk karbonil dan dikarbonil diantaranya malondialdehid (MDA). Adanya MDA dapat dideteksi dengan asam tiobarburat (TBA) dalam suasana asam membentuk suatu kromogen yang berwarna merah muda. Jumlah kromogen MDA – TBA yang terbentuk sangat tergantung dari jumlah deoksiribosa yang didegradasi. Semakin tinggi
konsentrasi
deoksiribosa
yang
ditambahkan
akan
menyebabkan
peningkatan absorbansi kromogen MDA – TBA. 4
2.1.8 Spektrofotometri UV-Vis Spektrofotometri UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur serapan yang dihasilkan dari interaksi kimia antara radiasi elektromagnetik dengan molekul atau atom dari suatu zat kimia pada daerah UV-Vis. 19 Prinsip dari spektrofotometri UV-Vis adalah mengukur jumlah cahaya yang diabsorbsi atau ditransmisikan oleh molekul-molekul dalam larutan. Ketika panjang gelombang cahaya ditransmisikan melalui larutan, sebagian energi cahaya tersebut akan diserap (diabsorpsi). Besarnya kemampuan molekul-molekul zat terlarut untuk mengabsorpsi cahaya pada panjang gelombang tertentu terkenal
14
dengan istilah absorbansi (A), yang setara dengan nilai konsentrasi larutan tersebut dan panjang berkas cahaya yang dilalui (biasanya 1 cm dalam spektrofotometri) ke suatu point dimana persentase jumlah cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi diukur dengan phototube.19
2.2
Kerangka Konsep EKSTRAK DAUN SIRSAK Radikal Bebas (Eksogen/Endogen)
Mempunyai Senyawa Bioaktif Senyawa Flavonoid dan Tanin (Berperan Sebagai Antioksidan)
Contoh: DPPH Radikal bebas menerima elektron dari antioksidan
Radikal bebas menjadi molekul stabil
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN
METODE DEOKSIRIBOSA
METODE TIOSIANAT
METODE XHANTINE OKSIDASE
METODE DPPH
Penambahan Larutan DPPH pada ekstrak dgn berbagai konsentrasi & diukur absorbansinya
• • •
Didapatkan Data Persentase Hambatan Nilai Probit, Log Konsentrasi
Persamaan Linier y=a+bx
NILAI IC50
15
2.3
Definisi Operasional
Tabel 2.1 Definisi Operasional No 1.
Variabel Konsentrasi ekstrak daun sirsak
Definisi konsentrasi larutan uji dalam ppm (1 μg/mL)
2.
Absorbansi sampel
3.
IC50
Nilai absorbansi sampel pada masingmasing konsentrasi Nilai yg menunjukan konsentrasi ekstrak (ppm) yg mampu menghambat proses oksidasi sebesar 50%.
Cara ukur V1M1=V2M2 (perbandingan μg ekstrak dengan mL etanol 96%) Diukur pada panjang gelombang maksimum
Alat ukur -
Skala ukur Numerik
Hasil ukur 1 ppm, 10 ppm, 100 ppm, 1000 ppm
Spektrof otometer
Numerik
Absorbansi
Persamaan regresi linier dengan analisa Probit.
-
Kategorik
< 50 ppm = sgt kuat 50-100 ppm = kuat 100-150 = sedang 151-200 ppm = lemah
16
BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1 Desain Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian observasional melalui metode DPPH untuk menguji aktivitas antioksidan dari ekstrak daun sirsak.
3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari 2012 sampai bulan Agustus 2012 di Laboratorium Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.3 Sampel Daun sirsak (Annona muricata L.) yang sudah dideterminasi di LIPI (Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia) kemudian diekstraksi dan dibuat larutan ekstraknya dengan 4 konsentrasi yaitu 1 ppm, 10 ppm, 100 ppm, dan 1000 ppm. Masing-masing konsentrasi dibuat secara triplo.20
3.4 Alat Dan Bahan Penelitian 3.4.1
Alat Penelitian Timbangan analitik; tabung reaksi; tabung erlenmeyer; cawan; gelas ukur;
gelas beaker; mikropipet 10, 100, dan 1000 μl; tip 10, 100, 1000 μl; shaker waterbath; kupet dan spektrofotometri UV-Vis HITACHI 2,2 solution
3.4.2
Bahan Penelitian Simplisia; Etanol 96%; DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 1 g; Asam
Askorbat (Vitamin C) dan Aquadest
3.5 Cara Kerja Penelitian 3.5.1 Penyiapan Sampel/Pembuatan simplisia nabati
17
Daun sirsak (Annona muricata L.) yang dipetik di kebun LIPI dicuci bersih kemudian dijemur dibawah sinar matahari langsung. Daun yang telah kering diblender hingga menjadi serbuk daun sirsak.11,21
3.5.2 Pembuatan ekstrak daun sirsak Pembuatan ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) menggunakan metode maserasi yaitu menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan / pengadukan pada temperatur ruangan.11
3.5.3 Pembuatan Larutan a. Pembuatan Larutan DPPH 0,004% (0,004 g/100 mL atau 0,0004 g/10 mL). DPPH yang ditimbang sebanyak 0,0004 g dilarutkan dalam 10 mL etanol 96%.20 Larutan dikocok hingga homogen dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis untuk memperoleh panjang gelombang maksimum. Panjang gelombang maksimum untuk larutan DPPH adalah 517 nm.20
b. Pembuatan Larutan Blanko 4500 μL etanol ditambah 500 μL larutan DPPH lalu dikocok hingga homogen.
c. Pembuatan Larutan Uji 1. Larutan Induk (10.000 ppm) 50 mg ekstrak dilarutkan dalam 5 mL etanol = 10 mg/mL = 10.000 μg/ml (ppm) 2. Larutan Seri (1, 10,100,1000 ppm).20 a) 1000 ppm 500 μL dari larutan induk ditambahkan etanol sampai volumenya 4500 μL. Tambahkan 500 μL larutan DPPH. b) 100 ppm
18
50 μL dari larutan induk ditambahkan etanol sampai volumenya 4500 μL. Tambahkan 500 μL larutan DPPH. c) 10 ppm 5 μL dari larutan induk ditambahkan etanol sampai volumenya 4500 μL. Tambahkan 500 μL larutan DPPH. d) 1 ppm 5 μL dari larutan 1000 ppm ditambahkan
etanol sampai
volumenya 4500 μL. Tambahkan 500 μL larutan DPPH. d. Pembuatan Larutan Kontrol Positif (Vitamin C)22 1. Larutan Induk (100 ppm) 1 mg Vitamin C murni dilarutkan dalam 5 mL etanol = 0,1 mg/mL = 100 μg/ml (ppm). 2. Larutan Seri (2,4,6,8 ppm)22 a) 2 ppm 100 μL dari larutan induk ditambahkan etanol sampai volumenya 4500 μL. Tambahkan 500 μL larutan DPPH. b) 4 ppm 200 μL dari larutan induk ditambahkan
etanol sampai
volumenya 4500 μL. Tambahkan 500 μL larutan DPPH. c) 6 ppm 300 μL dari larutan induk ditambahkan
etanol sampai
volumenya 4500 μL. Tambahkan 500 μL larutan DPPH. d) 8 ppm 400 μL dari larutan induk ditambahkan
etanol sampai
volumenya 4500 μL. Tambahkan 500 μL larutan DPPH. Semua larutan dikocok dengan alat shaker waterbath agar larutan menjadi homogen. Setelah dikocok kemudian didiamkan (diinkubasi). Kedua proses tersebut berlangsung selama 30 menit dalam suhu ruangan
19
agar tercapainya kondisi steady state (waktu dimana nilai absorbansi sudah konstan).20
3.5.4
Pengukuran Absorbansi Semua larutan blanko, larutan uji dan larutan kontrol positif diinkubasi
pada suhu 27oC selama 30 menit dalam keadaan gelap, kemudian
diukur
absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer.23 Setelah mendapatkan nilai absorbansinya, persen hambatan masing-masing larutan dihitung dengan menggunakan rumus24:
% Hambatan = (Abs blanko – Abs sampel) x 100% Abs Blanko Setelah mendapatkan % aktivitas hambatan, kemudian dicari nilai probitnya dengan cara melihat tabel probit. Setelah mendapatkan nilai probit, dicari nilai IC 50 melalui persamaan regresi linier.25 3.5.5 Manajemen Data Data persentase hambatan antioksidan penangkap radikal DPPH (%) ekstrak daun sirsak dianalisis dan dihitung nilai IC 50 nya melalui persamaan regresi linier dengan analisa probit.25 Persentase penghambatan yang diperoleh dikonversi ke persamaan regresi linier, yaitu hubungan konsentrasi terhadap persentase penghambatan. Persamaan regresi yang diperoleh digunakan untuk menentukan aktivitas sampel yang dinyatakan dengan nilai IC 50 atau median inhibitory concentration, yaitu konsentrasi sampel dalam ppm (µg/ml) yang dapat menghambat 50% aktivitas radikal bebas DPPH. Semakin kecil nilai IC 50 menandakan semakin tinggi aktivitas antioksidan senyawa tersebut.24 Nilai IC 50 diperoleh dari perpotongan garis antara 50% perendaman radikal bebas dengan sumbu konsentrasi, kemudian dimasukkan ke persamaan y = a + bx. Sampel dinyatakan sebagai antioksidan sangat kuat jika nilai IC 50 < 50 µg/ml, kuat jika nilai IC 50 50-100 µg/ml, sedang jika nilai IC 50 101-150 µg/ml dan lemah jika nilai IC 50 151-200 µg/ml dan dinyatakan tidak aktif jika mempunyai nilai IC 50 > 200 µg/ml. 24
20
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pengukuran Absorbansi Semua larutan (blanko, ekstrak daun sirsak, dan vitamin C) diukur absorbansinya dengan menggunakan panjang gelombang maksimum 517 nm.20 Dengan menggunakan panjang gelombang maksimum, akan menghasilkan nilai absorbansi yang maksimum juga. Nilai absorbansi pada ekstrak daun sirsak dapat dilihat pada tabel 4.1.
Tabel 4.1 Panjang Gelombang Maksimum dan Absorbansi dari Larutan Blanko No 1.
Bahan Blanko
Panjang Gelombang Maximum 517 nm
Absorbansi (nm) 0,657
Tabel 4.2 Hasil Absorbansi Larutan 1, 10, 100 dan 1000 ppm No 1 2 3 4
Konsentrasi (ppm) 1 10 100 1000
1 0.428 0.383 0.241 0.192
Absorbansi 2 0.421 0.325 0.260 0.202
3 0.471 0.346 0.241 0.196
Rata-rata Absorbansi 0.440 0.351 0.247 0.197
3 0,395 0,351 0,333 0,196
Rata-rata Absorbansi 0.393 0.352 0.334 0.196
Tabel 4.3 Hasil Absorbansi Larutan Vitamin C No 1 2 3 4
Konsentrasi (ppm) 2 4 6 8
1 0,392 0,356 0,334 0,196
Absorbansi 2 0,394 0,350 0,334 0,196
Setelah didapatkan nilai absorbansi pada tiap-tiap konsentrasi baik untuk sampel daun sirsak maupun vitamin c, dilanjutkan dengan penghitungan aktivitas hambatan (%). Untuk menganalisa apakah ekstrak daun sirsak mempunyai aktivitas antioksidan, digunakan persamaan regresi linier dengan analisa probit untuk mencari nilai IC 50 . Nilai probit didapatkan dengan menggunakan tabel probit dari nilai % aktivitas hambatan. (lampiran 4)
21
Tabel 4.4 Data Ekstrak daun sirsak Konsentrasi Absorbansi Aktivitas (ppm) (nm) Hambatan (%) 1 1 0,440 33,0 2 10 0,351 46,6 3 100 0,247 62,4 4 1000 0,197 70 *Nilai Absorbansi Larutan Blanko = 0,657 nm No
Log Konsentrasi 0 1 2 3
Nilai Probit 4,5601 4,9147 5,3160 5,5244
Tabel 4.5 Data Vitamin C Konsentrasi Absorbansi Aktivitas (ppm) (nm) Hambatan (%) 1 2 0,393 40,18 2 4 0,352 46,42 3 6 0,334 49,16 4 8 0,196 70,16 *Nilai Absorbansi Larutan Blanko = 0,657 nm No
Log Konsentrasi 0,3 0,6 0,7 0,9
Nilai Probit 4,7518 4,9996 4,9799 5,5302
Setelah mendapatkan data log konsentrasi dan nilai probit, maka dibuat grafik antara log konsentrasi (x) dan probit (y) dan didapatkan persamaan liniernya. (lampiran 2)
Tabel 4.6 Persamaan Linier No 1 2
Bahan Ekstrak daun sirsak Vitamin C
Nilai a 4,5846 4,3154
Nilai b 0,3294 1,1998
Nilai r 0,99 0,91
Persamaan Linier Y= 4,5846 + 0,3294 x Y= 4,3154 + 1,1998 x
4.2 Penetapan Nilai IC 50 Untuk menghitung nilai IC 50 dapat dilakukan dengan menggunakan persamaan regresi linier dengan analisa probit. Untuk memudahkan proses input dan penghitungan data, digunakan microsoft excel untuk mencari persamaan regresi linier dengan analisa probit.20 Dari hasil penghitungan didapatkan nilai IC 50 ekstrak daun sirsak sebesar 18 ppm dan vitamin C sebesar 3,72 ppm. (lampiran 1) Tabel 4.7 Nilai IC 50 No
Bahan
Nilai IC 50
1.
Ekstrak Daun Sirsak
18 ppm
2.
Vitamin C
3,72 ppm
22
Berdasarkan hasil di atas, ekstrak daun sirsak merupakan antioksidan yang sangat kuat dengan nilai IC 50 18 ppm. Sedangkan menurut hasil penelitian Baskar dan Kumar didapatkan nilai IC 50 esktrak daun sirsak 70 ppm. Perbedaan IC 50 ini dapat disebabkan oleh kadar DPPH yang berbeda, penelitian sebelumnya menggunakan 0,2 Mm DPPH yang merupakan 2 kali lipat kadar DPPH pada penelitian ini, sehingga kadar radikal bebas yang harus berikatan dengan antioksidan semakin besar. Pada Vitamin C didapatkan nilai IC 50 Vitamin C sebesar 3,72 ppm sehingga digolongkan sebagai antioksidan sangat kuat. Menurut hasil penelitian Joabe dkk, didapatkan hasil IC 50 ekstrak metanol daun sirsak (Annona muricata L.) 212 ppm dan diklasifikasikan tidak memiliki aktivitas antioksidan, hal ini dapat disebabkan oleh penggunaan konsentrasi yang terlalu kecil yaitu 10, 15, 20, 25, 50 dan 100 ppm. Kisaran konsentrasi daun sirsak yang kecil akan menyebabkan kadar antioksidan tidak dapat berikatan dengan radikal bebas secara optimal sehingga tidak didapatkan aktivitas antioksidan. Pelarut metanol yang digunakan pada penelitian tersebut merupakan pelarut polar yang baik untuk menarik senyawa bioaktif yang bersifat polar seperti flavonoid dan tannin.26 Uji aktivitas antioksidan pada buah sirsak dengan metode DPPH didapatkan nilai IC 50 28.05 ppm dan digolongkan sebagai antioksidan sangat kuat. Buah sirsak mengandung Vitamin C sebanyak 30.38 mg% dan karotenoid sebanyak 0.01 mg%. Karotenoid berfungsi melindungi tanaman dari sinar matahari yang dapat memicu kerusakan fotoksidatif sehingga sangat berpotensi memiliki efek antioksidan. Dikatakan bahwa peningkatan kadar karotenoid di tanaman berbanding lurus dengan aktivitas antioksidannya. 27 Aktivitas antioksidan juga dapat dilihat pada perubahan warna larutan dari ungu pekat menjadi ungu pudar dan kuning. Pada larutan uji ekstrak daun sirsak terlihat adanya perubahan warna dari ungu pekat menjadi ungu pudar dan kuning (lampiran 4). Pada penelitian ini, ekstrak daun sirsak yang digunakan berasal dari hasil ekstraksi dengan metode maserasi. Pada proses maserasi digunakan simplisia
23
daun sirsak dengan berat 400 g yang didapatkan dari 1 kg daun sirsak segar. Simplisia dibuat halus karena semakin halus simplisia maka ekstrak yang dihasilkan akan semakin efektif dan efisien.simplisia yang halus akan memudahkan proses penarikan senyawa bioaktif oleh pelarutnya.21 Metode maserasi dipilih karena metodenya relatif sederhana yaitu tidak memerlukan alat-alat yang relatif rumit, relatif mudah, murah dan dapat menghindari rusaknya komponen senyawa akibat panas.22 Pada penelitian ini dilakukan 3 kali pengadukan selama 3 hari berturut-turut menggunakan etanol 96%. Etanol 96% digunakan sebagai pelarut karena dapat menarik komponen baik yang bersifat polar maupun non polar. Pelarut etanol 96% memiliki beberapa keuntungan, diantaranya dapat menyebabkan senyawa yang terkandung di dalam sampel dapat terekstrak lebih banyak, karena dapat mengekstrak komponen kimia yang tahan panas dan tidak tahan panas.22 Selain itu etanol 96% memiliki kemampuan untuk mengisolasi sejumlah bahan bioaktif yang lebih optimal dibandingkan beberapa jenis pelarut lainnya.22 Hasil dari maserasi kemudian dievaporasi menggunakan rotatory evaporator sampai didapatkan ekstrak kental dengan berat 20 g. Proses ekstraksi dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya jenis pelarut yang digunakan, dan luas permukaan simplisia. Jenis pelarut yang digunakan tergantung pada polaritas senyawa yang akan diekstrak.22
4.3 Keterbatasan Penelitian Penelitian yang dilakukan kali ini mempunyai keterbatasan dan kekurangan yang dapat mempengaruhi hasil penelitian, yaitu : 1. Kurangnya pengalaman yang dimiliki oleh peneliti mengenai penelitian laboratorium secara in vitro yang mengakibatkan proses penelitian berlangsung lebih lama dan banyak melakukan pengulangan.
24
BAB 5 KESIMPULAN & SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang dilakukan, ekstrak daun sirsak memiliki aktivitas antioksidan. Ekstrak daun sirsak memiliki nilai IC 50 18 ppm dan diklasifikasikan sebagai antioksidan sangat kuat.
5.2 Saran
1. Perlu dilakukan penelitian selanjutnya mengenai aktivitas antioksidan dari bagian tanaman sirsak lainnya, seperti kulit sirsak, batang pohon sirsak, dll. 2. Perlu dilakukan penelitian selanjutnya mengenai aktivitas antioksidan ekstrak daun sirsak dengan metode dan pelarut yang berbeda.
25
DAFTAR PUSTAKA
1.Murray RK, Granner DK, Rodwell VW. Biokimia harper. Edisi 27. Jakarta: EGC; 2009. 2.Marks DB, Marks AD, Smith CM. Biokimia kedokteran dasar sebuah pendekatan klinis. Jakarta: EGC; 2000. 3.Pham-Huy LA, He H, Pham-Huy C. free radicals, anatioxidant in disease and health. International Journal of Biomedical Science 2008 June; 4(2): 89-96 4.Wahyuni, A Hardjono, P Hariyantiwasi. Ekstraksi Kurkumin Dari Kunyit. Prosiding Seminar Nasional Rekayasa Kimia dan Proses : 2004 ; Jogjakarta, Indonesia 5.Madha K, Munifatul I, Yulita N. Kandungan Klorofil, Karotenoid, dan Vitamin C pada Beberapa Spesies Tumbuhan Akuatik.Buletin Anatomi dan Fisiologi 2010; 18 (No.1): 28-40 6.Hanneken A, Lin FF, Johnson J, Maher P. Flavonoids protect humanretinal pigment epithelial cells from oxidative-stress-induced death.Invest Ophthalmol Vis Sci 2006;47:3164-77. 7.Septerina. N. J. Pengaruh Ekstrak Daun Sirsak sebagai Insektisida Rasional terhadap Pertumbuhan dan Hasil Tanaman Paprika Variestas Bell Boy. Dept of Agronomy[online]. http://digilib.itb.ac.id/gdl.php?mod=browse&op=read&id=jiptumm-gdl-s12002-niken-5526-ekstrak. Diakses tanggal 23 Maret 2012. 8.Baskar R, Rajeswari V, Kumar TS. In vitro antioxidants studies in leaves of annona species. Indian J Exp Biol. 2007 May; 45(5):480-5 9.Adeyemi DO, Komolafe OA, Adewole OS, Obuotor EM, Adenowo TK. Antihyperglycemic activities of Annona muricata (linn). Afr J Tradit Complement Altern Med. 2008 Oct 25;6(1):62-9
26
10.Ersi H. Khasiat dan Manfaat Daun Sirsak dalam Menumpas Kanker. Jakarta, Indonesia: Tim Elang Media. 2011. 11.Departemen Kesehatan RI. Parameter Standard Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. Jakarta : Depkes RI. 2000.hal. 1-12. 12.Elliot middleton, J.R., Chittan Kandaswani and Theorides, TC., 2000, The Effect of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implication for Inflamation, Heart Disease and Cancer The American Society for Pharmacology and experimental Theurapetics, Vol 52 No 4, 47/867/401, Printed in USA. Hal709,713. 13.Gitawati, R. 1995. Radikal Bebas- Sifat dan Perannya dalam Menimbulkan Kerusakan/Kematian Sel. Cermin Dunia Kedokteran No.102: 33-36. 14.Wong. D. Mechanism and Theory in food Chemitry. New York: Van Nostrad Reinhold. 1989. 15.Ardiansyah. 2007. Antioksidan dan Peranannya bagi Kesehatan. Artikel iptek.Akses 28 maret 2012. 16.Green RJ. Antioxydant Activity of Peanut plant tissues.thesis. North Caroline State University, Raleihgh: Department of food science. 2004. 17.Koleva I, van Beek T, Linnssen JPH, de Groot A, Evstarieva LN. Screening of plant extracts for antioxidant activity: a comparative study on three testing methods. Phytochemical Anal 2002;13: 494-500. 18.Blois, M.S., Antioxidant Determinations By The Use of a Stable Free Radical, Nature. 1958. p. 1199-1200. 19.Vimala, S., Adenan, MI, A.R. and Shahdan Rohana. Nature’s Choice to Wellness : Antioxidant vegetables/Ulam. Malaysia, Kuala Lumpur: Forest Research institute. 2003. 20.Lachumy SJT, Sasidharan S, Sumathy V, Zakarin Z. Pharmacological Activity, Phytochemical analysis and Toxicity of methanol extract of Etlingera elatior
27
(Torch Ginger) Flowers. Malaysia : Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2010. 769-774. 21.Harborne, JB. Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisa Tumbuhan. Terjemahan K. Padmawinata Edisi II. Bandung: ITB Press; 1987. Hal. 6,71,76,84-85, 94-97. 22.Nabavi SF, Nabavi SN, Ebrahimzadeh MA, Asgarirad H. The Antioxidant Activity of Wild Medlar (Mespilus germanical) Fruits, Stem Bark and Leaf. African Journal of Biotechnology 10 January 2011; Vol.10(2): pp. 283-289. Available from:URL: http://www.academicjournals.org/AJB 23.Kekuda TRP, Vinayaka KS, Kumar SUP, Sudharshan SJ. Antioxidant and Antibacterial Activity of Lichen Extracts, Honey and Their Combination. Journal of Pharmacy Research 2009 ;2(12):1875-1878. Available from:URL: http://www.jpronline.info 24.Molyneux P. The Use of The Stable Free Radical Dipenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating antioxidant activity. Songklanakarin: Science Technology. 2004. 26 (2) : 211-219. 25.Saputri FC, Jantan I. Effects of selected medicinal plants on human lowdensity lipoprotein oxidation, 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radicals and human platelet aggregation. Journal of Medicinal Plants Research 16 November
2011;Vol.5(26):
pp.
6182-6191.
Available
from;URL:
http://www.academicjournals.org 26.Joabe G, Thiago A, Valerium T, et al. Antiproliferative Activity, Antioxidant Capacity and Tannin Content in Plants of Semi-Arid Northeastern Brazil. Brazil : Moleculs Journal. 2010. 8534-8540. 27.Patricia D, Gabrielle G, Giovanna V, et al. Antioxidant, Mutagenic Activity of Frozen Fruits. Brazil.J Med Food. 2008. 11(1): 144-151
28
Lampiran 1 Penghitungan IC 50 1. Penghitungan Nilai IC 50 Ekstrak Daun Sirsak y = a + bx y = 4,5846 + 0,3294 x 5 = 4,5846 + 0,3294 x x = 5 - 4,5846 0,3284 x = 1,26 antilog x = 18 ppm IC 50 Ekstrak Daun Sirsak = 18 ppm 2. Perhitungan Nilai IC 50 Vitamin C y = a + bx y = 4,3154 + 1,1998 x 5 = 4,3154 + 1,1998 x x = 5- 4,3154 1,1998 x = 0,5705 antilog x = 3,72 ppm IC 50 Vitamin C = 3,72 ppm
29
Lampiran 2 Grafik Hasil Penghitungan Data
absorbansi
Grafik perbandingan konsentrasi dengan absorbansi ekstrak daun sirsak 0,450 0,400 0,350 0,300 0,250 0,200 0,150 0,100 0,050 0,000 1
10
100
1000
konsentrasi
Grafik Perbandingan Konsentrasi dengan Absorbansi Ekstrak Daun Sirsak
Grafik. Perbandingan Log Konsentrasi dengan Nilai Probit Ekstrak Daun Sirsak 6,0000
nilai probit
5,0000 4,0000
y = 0.3294x + 4.5846 R² = 0.985
3,0000
Series1
2,0000
Linear (Series1)
1,0000 0,0000 0
1
2
3
4
log konsentrasi
Grafik Perbandingan Log Konsentrasi (x) dengan nilai Probit (y) Ekstrak Daun Sirsak dan Persamaan Regresi Liniernya.
30
absorbansi
Grafik. Perbandingan Konsentrasi dengan Absorbansi Vitamin C 0,450 0,400 0,350 0,300 0,250 0,200 0,150 0,100 0,050 0,000
Series1
2
4
6
8
konsentrasi
Grafik Perbandingan Konsentrasi dengan Absorbansi Vitamin C
Probit
Grafik. Perbandingan Log Konsentrasi dengan Nilai Probit Vitamin C 5,6 5,5 5,4 5,3 5,2 5,1 5 4,9 4,8 4,7 4,6
y = 1.1998x + 4.3154 R² = 0.9099
Linear (Series1)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Log Konsentrasi
Grafik Perbandingan Log Konsentrasi (x) dengan Nilai Probit (y) Vitamin C dan Persamaan Regresi Liniernya.
31
Lampiran 3 Gambar Alat, Bahan & Hasil
Gambar 2.Simplisia diblender sampai halus
Proses maserasi menggunakan pelarut etanol 96%
Spektrofotometer UV-Vis HITACHI
Proses evaporasi untuk mendapatkan ekstrak kental dengan rotary evaporator
Ekstrak daun sirsak konsentrasi 1 ppm
32
Ekstrak daun sirsak konsentrasi 10 ppm
Ekstrak daun sirsak konsentrasi 100 ppm
Ekstrak daun sirsak konsentrasi 1000 ppm
Perbedaan Warna Pada Larutan Uji (kiri-kanan: 1000 ppm, 100 ppm, 10 ppm, dan 1 ppm
33
Lampiran 4 Tabel Probit
34
35
36
37
Lampiran 5 Hasil Determinasi Sampel Penelitian
38
Lampiran 6 Riwayat Penulis Identitas : Nama
: Raden Nabilla Ayesha Putri
Jenis Kelamin
: Perempuan
Tempat, Tanggal Lahir
: Jakarta, 29 Oktober 1992
Agama
: Islam
Alamat
: Komplek Permata Puri Laguna Jl. Danau Semayang blok C7 No. 3 Kec. Cimanggis Kel. Mekarsari Depok.
E-mail
:
[email protected]
Riwayat Pendidikan : •
1998 – 2004
: Sekolah Dasar Islam Sudirman Jakarta
•
2004 – 2006
: Sekolah Menengah Pertama Islam Sudirman Jakarta
•
2006 – 2009
: Sekolah Menengah Atas Negeri =28 Jakarta
•
2009– Sekarang
: Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran Dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
