AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK ETIL ASETAT KAPANG ENDOFIT DAUN SIRSAK (Annona muricata L.)
MINARNI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Aktivitas Antikanker Ekstrak Etil Asetat Kapang Endofit Daun Sirsak (Annona muricata L.) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Februari 2016 Minarni NRP G851140181
RINGKASAN MINARNI. Aktivitas Antikanker Ekstrak Etil Asetat Kapang Endofit Daun Sirsak (Annona Muricata L.) Dibimbing oleh I MADE ARTIKA, AKHMAD ENDANG ZAINAL HASAN dan HEDDY JULISTIONO. Kanker merupakan salah satu penyakit mematikan di dunia. Salah satu jenis kanker yang sering diderita oleh penduduk dunia adalah kanker payudara. Pengobatan biasanya dilakukan dengan menggabungkan beberapa perlakuan seperti kemoterapi, operasi, radioterapi, imunoterapi dan terapi fotodinamik. Namun, risiko munculnya efek samping yang berbahaya terjadi apabila perlakuanperlakuan di dalam terapi kanker mempengaruhi metabolisme sel normal. Oleh karena itu, pemanfaatan tanaman herbal telah dijadikan sebagai salah satu pengobatan alternatif yang tidak menimbulkan efek samping dan menghambat jalur anti apoptosis dengan dosis yang relatif rendah. Salah satu bahan alami yang berpotensi sebagai antikanker adalah sirsak, terutama bagian daunnya. Tanaman tingkat tinggi seperti sirsak diduga memiliki mikroba endofit yang berpotensi sebagai obat. Mikroba endofit bersimbiosis secara mutualisme dengan jaringanjaringan tanaman. Tujuan penelitian ini adalah menguji secara in-vitro aktivitas antikanker ekstrak etil asetat dari kapang endofit daun sirsak (Annona muricata L.) sebagai bahan antikanker payudara. Penelitian ini terdiri atas empat langkah: (1) ekstraksi metabolit kapang endofit, (2) uji aktivitas sitotoksik ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak terhadap sel kanker payudara Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7) dengan metode Methyl Thiazol Tetrazolium (MTT), (3) identifikasi kualitatif senyawa kimia ekstrak daun sirsak menggunakan instrument Gas Chromatography–Mass Spectrometry (GC-MS) pirolisis, dan (4) identifikasi kapang endofit berbasis amplifikasi sekuen nukleotida gen Internal Transcribed Spacer (ITS). Hasil penelitian menunjukkan bahwa dua belas ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak memiliki aktivitas sitotoksik yang berbeda-beda. Hasil pengujian sitotoksik beberapa ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak terhadap sel kanker MCF-7 menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak nomor 5 asal Garut merupakan ekstrak teraktif dengan nilai IC50 sebesar 19.20 µg/mL, sedangkan pada sel normal (sel Chang) tidak menunjukkan efek sitotoksik ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak nomor 5 asal Garut dengan nilai IC50 sebesar 1258.92 µg/mL. Analisis GC-MS menunjukkan adanya senyawasenyawa alkaloid (piperidinone, piperidine, hexadecanenitrile) yang dilaporkan berperan sebagai antikanker. Kesimpulan penelitian ini adalah ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara dengan menghambat proliferasi sel kanker payudara secara in-vitro. Sedangkan identifikasi molekuler berbasis daerah gen ITS menunjukkan bahwa kapang endofit daun sirsak memiliki kemiripan dengan genus Phomopsis sp. dengan nilai homolog mencapai 99,998%. Kata kunci: Annona muricata L., Antikanker MCF-7, daun sirsak, kapang endofit.
SUMMARY MINARNI. Anticancer Activity of Ethyl Acetate Extract of Endophytic Fungi Isolated from Soursop Leaves (Annona muricata L.). Supersived by I MADE ARTIKA, AKHMAD ENDANG ZAINAL HASAN and HEDDY JULISTIONO. Cancer is a leading cause of death in the world. One of the most frequent cancer incident in the world is breast cancer. Common medicines come from combining some treatments such as chemotherapy, operation, radiotherapy, immunotherapy and photodynamics therapy. However, the cancer treatment could induce dangerous side effects which affect normal cell metabolism. Therefore, herbal plant use has existed as one of the alternative medicine without impacting side effects and it inhibits anti apoptotic pathway by low doses. Plant that has been used as anticancer agent is soursop (Annona muricata L.), especially its leaves. High level plant like soursop is predicted to have endophytic microbes with potency as sources of medicine. Endophytic microbe usually creates symbiosis interaction with plant tissues. The purpose of this study was to test in vitro anticancer activity of ethyl acetate extracts of endophytic fungi of the soursop leaves as an anti-breast cancer agent. This study consisted of four steps: (1) extracting metabolites from endophytic fungi, (2) testing cytotoxic activity of ethyl acetate extracts of endophyte fungi against Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7) breast cancer cell line with Methyl Thiazole Tetrazolium (MTT) assay, (3) Identifying chemical compounds of endophytic fungi extracts using Gas Chromatography–Mass Spectrometry (GC-MS) pyrolysis instrument, and (4) Identifying endophytic fungi species by amplifying nucleotide sequences of Internal transcribed spacer (ITS) gene. Results showed that the twelve ethyl acetate extracts of endophytic fungi have different cytotoxic activity on MCF-7 cancer cells. The cytotoxic test indicated that extract of endophytic fungi of soursop leaves (Garut number 5) is the most active to inhibit the proliferation of MCF-7 cancer cells with IC50 value of 19.20 mg/mL. In the other hand, the extract did not show inhibitory activity on normal cell (Chang cell) with the IC50 value of 1258.92 mg/mL. GC-MS analysis showed that piperidinone, piperidine, hexadecanenitrile (alkaloid compound) acts as an anticancer agent. The conclusion of this study is ethyl acetate extracts have cytotoxic effect against breast cancer cells by inhibiting the proliferation of breast cancer cells based on in vitro test. In addition, molecular identification based on ITS gene showed that the endophytic fungi of soursop leaves have similarities to Phomopsis sp. with the homology value of 99.998%. Keywords: Annona muricata L., anticancer MCF-7, endophytic fungi, soursop leaves.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK ETIL ASETAT KAPANG ENDOFIT DAUN SIRSAK (Annona muricata L.)
MINARNI
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof drh Dr Maria Bintang, MS
PRAKATA Bismillahirrahmanirrahim Puji dan syukur kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul “Aktivitas Antikanker Ekstrak Etil Asetat dari Kapang Endofit Daun Sirsak (Annona muricata L.)”. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan April hingga Oktober 2015, di Laboratorium Mikrobiologi Proses Pusat Penelitian Biologi, Bidang Mikrobiologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong-Bogor, Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Pusat Studi Satwa dan Primata IPB, dan Badan Penelitian dan Pengembangan Kehutanan Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada Bapak Dr Ir I Made Artika MAppSc sebagai pembimbing utama, Bapak Dr Ir Akhmad Endang Zainal Hasan, MSi sebagai pembimbing kedua dan Bapak Dr Heddy Julistiono, DEA sebagai pembimbing ketiga yang telah banyak memberikan bimbingan, pengarahan, saran, motivasi, semangat serta waktunya sejak penyusunan usulan penelitian hingga selesai penelitian. Penghargaan penulis sampaikan kepada Lembaga Pengelolaan Dana Pendidikan Kementerian Keuangan RI (LPDP) atas beasiswa yang telah diberikan. Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, dan seluruh keluarga atas segala do’a, dukungan dan kasih sayang yang telah diberikan. Terimakasih kepada pengelola pascasarjana, seluruh dosen dan staf akademik Departemen Biokimia Institut Pertanian Bogor, teman-teman angkatan 51 dan seluruh teman-teman Laboratorium LIPI sebagai teman berdiskusi penulis selama penelitian ini. Penulis menyadari masih banyak terdapat kekurangan dalam penyusunan tesis ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk perbaikan dalam penulisan selanjutnya. Semoga penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi penulis maupun pembaca. Bogor, Februari 2016
Minarni
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
vii
DAFTAR GAMBAR
vii
DAFTAR LAMPIRAN
vii
1 PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian Ruang Lingkup Penelitian
1 1 2 2 2 2
2 TINJAUAN PUSTAKA Kanker Kanker Payudara Daun Sirsak Kapang Endofit Sel Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7) Polymerase Chain Reaction (PCR) Gas Chromatography-Mass Spectrometer (GC-MS) Identifikasi Kapang Berdasarkan Daerah Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA Ribosom
2 2 5 6 7 7 8 9 10
2 METODE Waktu dan Tempat Penelitian Bahan Alat Prosedur Penelitian Analisis Data
11 11 11 11 11 14
4 HASIL Kapang Endofit Daun Sirsak Hasil Kultivasi Ekstrak Kapang Endofit Daun Sirsak Aktivitas Sitotoksik Senyawa Aktif Kapang Endofit Kandungan Senyawa Aktif dengan GC-MS pyrolysis Identitas Kapang Endofit Daun Sirsak berbasis Amplikasi ITS
14 14 16 17 19 19
5 PEMBAHASAN Kultivasi Kapang Endofit Daun Sirsak Ekstraksi Senyawa Aktif Kapang Endofit Daun Sirsak Aktivitas Sitotoksik Senyawa Aktif Kapang Endofit Identifikasi Kandungan Senyawa Aktif dengan GC-MS pyrolysis Identifikasi Kapang Endofit Daun Sirsak berbasis Amplikasi ITS
20 20 21 21 24 26
6 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran
28 28 28
DAFTAR PUSTAKA
28
LAMPIRAN
37
RIWAYAT HIDUP
65
DAFTAR TABEL 1 2 3
Hasil ekstrak yang diperoleh dari kapang endofit daun sirsak Nilai IC50 ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak pada sel MCF-7 Nilai IC50 ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak pada sel Chang
17 18 18
DAFTAR GAMBAR 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.
Struktur kimia doksorubisin Struktur ACGs Karakteristik sel kanker Anatomi payudara Daun sirsak (Annona muricata L.) Tahapan-tahapan dalam PCR Sebagian kapang endofit dari daun sirsak dalam media YMA pada cawan petri Kapang endofit daun sirsak dalam media YMB Hasil ekstrak kapang endofit daun sirsak Aktivitas antikanker ekstrak kapang endofit dari daun sirsak melalui sel MCF-7 pada konsentrasi 100 µg/mL Sel kanker payudara MCF-7 hasil perlakuan ekstrak kapang endofit daun sirsak (Garut nomor 5) Sel normal Chang hasil perlakuan ekstrak kapang endofit daun sirsak (Garut nomor 5) Kromatogram ekstrak etil asetat Hasil PCR kapang endofit daun sirsak Pohon filogenetik kapang endofit daun sirsak dengan K2+G (kimura 2parameter + gamma distributed)
3 4 4 5 6 8 15 16 16 17 18 18 19 19 20
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5
6
7
8
Bagan alir penelitian Contoh perhitungan nilai IC50 ekstrak etil asetat dari kapang endofit daun sirsak dengan menggunakan sel kanker (MCF-7) Contoh perhitungan nilai IC50 ekstrak etil asetat dari kapang endofit daun sirsak dengan menggunakan sel normal (Chang) Analisis metabolit kapang endofit daun sirsak dengan GC-MS Pyrolisis Foto mikroskopis sel kanker payudara yang diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak dengan konsentrasi 100 µg/ml pada perbesaran 10x Foto mikroskopis sel kanker payudara yang tidak diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol) dengan perbesaran 10x Foto mikroskopis sel kanker payudara yang diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak dengan konsentrasi 400 µg/mL, 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL dan 25 µg/mL pada perbesaran 10x Foto mikroskopis sel kanker payudara yang tidak diberi perlakuan
37 38 39 40
41
42
42
9
10
11
12
13 14 15 16 17 18 19 20 21
dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol) dengan perbesaran 10x Foto mikroskopis sel kanker payudara yang tidak diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol positif) dengan perbesaran 10x Foto mikroskopis sel normal Chang yang diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak dengan konsentrasi 400 µg/mL, 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL dan 25 µg/mL pada perbesaran 10x Foto mikroskopis sel normal Chang yang tidak diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol) dengan perbesaran 10x Foto mikroskopis sel normal Chang yang tidak diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol positif) dengan perbesaran 10x Pohon filogenetik Hasil BLAST Sequences producing significant alignments Urutan nukleotida hasil sekuen yang sudah dipilih Pensejajaran sequence hasil BLAST Keterangan kromatogram Gambar 13 Klasifikasi senyawa metabolit sekunder Data spektra massa senyawa-senyawa yang dilaporkan bersifat antikanker Analisis statistik
44
44
45
45
46 46 47 47 48 48 51 53 57 63
1 PENDAHULUAN Latar Belakang Kanker merupakan salah satu penyakit mematikan di dunia. Menurut IARC (2013) jumlah kematian penduduk dunia yang disebabkan oleh kanker mencapai 7.6 juta jiwa, 70% penderita mengalami kematian, sedangkan 30% penderita lainnya dapat disembuhkan. Jumlah tersebut diperkirakan mengalami peningkatan hingga 13.1 juta jiwa pada tahun 2030 (WHO 2013). Salah satu jenis kanker yang sering diderita oleh penduduk dunia adalah kanker payudara (WHO 2013). Kanker payudara merupakan kanker yang berasal dari kelenjar susu, saluran kelenjar dan jaringan penunjang payudara (Purwatiningsih et al. 2008) Berdasarkan data dari Hospital Information System (HIS) di tahun 2010 (KemenKes 2013), kanker payudara merupakan peringkat pertama dalam jumlah pasien yang dirawat di seluruh Indonesia (28%), diikuti oleh kanker serviks (12%). Selain itu, kanker payudara berada pada urutan kedua dari sejumlah kanker yang diderita wanita pada umumnya (Veta et al. 2014). Pengobatan yang biasa dilakukan adalah dengan menggabungkan beberapa perlakuan seperti kemoterapi, operasi, radioterapi, imunoterapi dan terapi fotodinamik (Adamson & Longo 2005). Namun, risiko munculnya efek samping yang berbahaya terjadi apabila perlakuan-perlakuan di dalam terapi kanker mempengaruhi metabolisme sel normal (Uzuner 2012). Selain itu, resistensi terhadap obat antikanker bisa terjadi sebagai akibat dari peningkatan jalur anti apoptosis terhadap obat-obatan yang digunakan dalam terapi (Creixell & Peppas 2012). Oleh karena itu, pemanfaatan tanaman herbal telah dijadikan sebagai salah satu pengobatan alternatif yang tidak menimbulkan efek samping dan tidak menghambat jalur anti apoptosis dengan dosis yang relatif rendah (Debbie et al. 2012). Salah satu bahan alami yang memiliki potensi sebagai antikanker adalah sirsak, terutama bagian daunnya. Zat aktif dalam tanaman sirsak yang mampu berperan sebagai antikanker adalah Annonaceous acetogenins (ACGs) (Retnani 2011). Senyawa ACGs yang terdapat dalam daun sirsak berperan sebagai inhibitor sumber energi untuk pertumbuhan sel kanker. Kekurangan energi menyebabkan sel tidak bisa membelah dengan baik. ACGs akan menganggu aktivitas reseptor pada sel dan menghambat metabolisme energi pada sel tersebut. Akibatnya produksi energi didalam sel kanker terhenti dan akhirnya sel kanker akan mati (Nursafitri et al. 2013). Hasil penelitian Rishika dan Sharma (2012) menunjukkan bahwa daun sirsak sangat berpotensi sebagai antikanker karena mampu mencegah ataupun menghambat pertumbuhan sel kanker. Selain itu, pengobatan penyakit kanker menggunakan daun sirsak lebih baik dan tidak memberikan efek samping dibandingkan dengan kemoterapi atau radiasi (Itharat & Ooraikul 2007). Daun sirsak juga dapat digunakan dalam perawatan pengidap kanker dan dapat mencegah pertumbuhan kanker pada pengujian tikus yang diinduksi bahan karsinogen yang berasal dari tumbuhan Cycas (Rodriguez et al. 2010). Tanaman tingkat tinggi seperti sirsak diduga memiliki mikroba endofit yang berpotensi sebagai tanaman obat. Mikroba endofit bersimbiosis secara mutualisme
2
dengan jaringan-jaringan tanaman. Ekstrak daun sirsak pada penelitian Riswanto et al. (2011), menunjukkan aktivitas antikanker, tetapi belum ada informasi tentang isolat mikroba endofit dari daun sirsak yang menghasilkan metabolit sekunder sebagai antikanker. Mikroba endofit pada penelitian ini merupakan kapang endofit dilihat dari bentuk morfologinya. Penelitian lebih lanjut mengenai aktivitas antikanker yang berasal dari ekstrak etil asetat dari kapang endofit daun sirsak (Annona muricata L.) ini perlu dilakukan. Perumusan Masalah Pemanfaatan daun sirsak sebagai agen antikanker dapat mengakibatkan kompetisi fungsi sirsak sebagai flora penghasil buah. Eksplorasi kapang endofit pada daun sirsak sebagai agen baru antikanker masih terbatas dan diharapkan dapat berjalan tanpa mengurangi kuantitas buah sirsak sebagai pangan konsumtif. Tujuan Penelitian ini bertujuan menguji aktivitas antikanker ekstrak etil asetat dari kapang endofit daun sirsak (Annona muricata L.) yang aktif sebagai bahan antikanker payudara secara in-vitro. Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang bahan aktif dari kapang endofit yang berada di dalam daun sirsak sebagai bahan obat penyakit kanker. Ruang Lingkup Penelitian Lingkup kegiatan penelitian ini mencakup ekstraksi etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (Annona muricata L.), pengujian Methly Thyazol Tetrazolium (MTT) sel kanker payudara Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7), identifikasi menggunakan Gas Chromatography-Mass Spectrometer (GC-MS) pirolisis dan identifikasi kapang endofit berbasis amplifikasi Internal Transcribed Spacer (ITS).
2 TINJAUAN PUSTAKA
Kanker Kanker merupakan penyakit tidak menular yang terjadi akibat adanya pertumbuhan sel-sel jaringan tubuh secara tidak normal. Sel ini dapat menyerang jaringan tubuh lain dari penderita, sehingga bila tidak segera ditangani dapat menyebabkan kematian (Raymond 2007). Ada tiga ciri utama keberadaan kanker, yakni kontrol pertumbuhan yang menurun, invasi pada jaringan setempat dan
3
penyebaran ke bagian tubuh lain (Murray et al. 2009). Penyebaran sel kanker dapat dilakukan melalui aliran darah dan kelenjar getah bening (Winarto 2007). Kanker dapat menimbulkan gejala berbeda, bergantung pada lokasi, keganasan dan ada atau tidaknya metastasis. Metastasis merupakan penyebab utama kematian akibat kanker (WHO 2010). Diagnosis kanker biasanya dilakukan melalui pemeriksaan makroskopik jaringan yang diperoleh dengan biopsi. Setelah didiagnosis penderita kanker biasanya mendapatkan perawatan seperti operasi, kemoterapi, atau radiasi (Winarto 2007). Pengobatan kanker dapat dibagi menjadi tiga, yakni terapi radiasi, operasi, dan terapi adjuvant (pendamping). Terapi adjuvant dapat dibagi menjadi terapi hormonal, kemoterapi dan imunoterapi (Hahn & Payne 2003). Efek samping yang ditimbulkan akibat pengobatan kanker beragam, mulai dari kerontokan rambut, pusing, mual, penurunan daya tahan tubuh, hingga kematian. Pengobatan kemoterapi bertujuan menghancurkan sel kanker agar ukuran sel kanker mengecil dan mencegah pertumbuhan kembali setelah pengobatan. Obat kemoterapi yang umum digunakan untuk menangani berbagai jenis kanker adalah doksorubisin (Gambar 1). Doksorubisin merupakan antitumor sitotoksik yang paling banyak digunakan dalam praktik klinis. Obat lain yang digunakan untuk mengobati kanker adalah herceptin (trastuzumab). Herceptin merupakan obat imunoterapi yang umum digunakan dengan target spesifik, yakni memblokade protein Her2/neu. Protein Her2/neu merupakan reseptor yang berfungsi mendorong pembelahan sel (ER+) (Katzung et al. 2013).
Gambar 1 Struktur kimia doksorubisin (Agudelo et al. 2014) Mekanisme penghambatan ataupun penyembuhan kanker sangat kompleks. Akhir-akhir ini, telah banyak penelitian yang mengungkap mekanisme penghambatan terjadinya tumor ataupun penyembuhannya, salah satunya melalui mekanisme antikanker (Rahayu et al. 2012) Proses karsinogen merupakan proses terjadinya kanker yang diawali dengan adanya kerusakan DNA atau mutasi pada gen-gen pengatur pertumbuhan, seperti gen p53 dan ras (Hanahan & Weinberg 2000). Proses menuju terjadinya kanker yang progresif umumnya berjalan lama dan melibatkan perubahan-perubahan genetik lanjut serta perubahan ekspresi gen yang dapat mempengaruhi sifat pertumbuhan sel. Secara keseluruhan proses karsinogen tersebut dapat dibagi menjadi dua fase, yaitu fase inisiasi, yakni fase aktivasi senyawa karsinogen hingga terjadinya mutasi awal dan fase post inisiasi yang meliputi tahap promosi dan progresi (Hanahan & Weinberg 2000). Metabolit sekunder yang dijadikan bahan antikanker adalah senyawa golongan fenol, salah satunya adalah ACGs (Champy et al. 2005; Pomper 2009). McLaughlin (2008) melaporkan bahwa tanaman famili Annonaceae mengandung
4
banyak senyawa ACGs, di antaranya ditunjukkan pada Gambar 2. Asetogenin merupakan senyawa metabolit sekunder yang secara alami terbentuk dalam tumbuhan, yang secara spesifik menyerang sel kanker tanpa mempengaruhi sel normal pada makhluk hidup.
Gambar 2 Struktur ACGs (Souza et al. 2008) Menurut Zeng et al. (1996) terdapat lima bentuk monotetrahidrofuran dalam ACGs yang berperan sebagai komponen aktif antikanker. Selain itu Consolacion et al. (2012) menemukan bahwa senyawa ACGs dalam daun sirsak dapat berfungsi sebagai antikanker. Menurut Hanahan dan Weinberg (2011), sel kanker mempunyai enam karakter khusus yang ditunjukkan oleh Gambar 3.
Gambar 3 Karakteristik sel kanker (Hanahan & Wemberg 2011) Karakter pertama dari sel kanker adalah mampu menjaga sinyal untuk melakukan proliferasi terus menerus dimana sel normal memerlukan sinyal eksternal untuk pertumbuhan dan pembelahannya, sedangkan sel kanker mampu memproduksi growth factors dan growth factor receptor sendiri. Kedua, sel kanker mampu menghindari faktor inhibisi pertumbuhan (growth factor inhibition), sedangkan sel normal merespon sinyal penghambatan pertumbuhan untuk mencapai homeostasis. Sehingga ada waktu tertentu bagi sel normal untuk proliferasi dan istirahat. Sel kanker tidak mengenal dan tidak merespon sinyal penghambatan pertumbuhan. Keadaan ini banyak disebabkan adanya mutasi pada beberapa gen (proto-onkogen) pada sel kanker. Ketiga, sel normal memiliki kepatuhan untuk tidak berpindah ke lokasi lain di dalam tubuh. Perpindahan sel kanker dari lokasi primernya ke lokasi sekunder atau tertiernya merupakan faktor utama adanya kematian yang disebabkan karena kanker. Mutasi memungkinkan peningkatan aktivitas enzim-enzim yang terlibat invasi sel kanker Matrix metalloproteinases (MMPs). Mutasi juga memungkinkan berkurangnya atau
5
hilang adhesi sehingga akan meningkatkan attachment, degradasi, migrasi dan invasi sel kanker ke sel normal (Hanahan & Weinberg 2011). Keempat, sel kanker memiliki mekanisme tertentu untuk tetap menjaga telomer tetap panjang, hingga memungkinkan untuk tetap membelah diri. Apabila terjadi kecacatan dalam regulasi pemendekan telomer memungkinkan sel kanker memiliki potensi replikasi yang tidak terbatas. Kelima, sel kanker mampu menginduksi angiogenesis, yaitu pertumbuhan pembuluh darah baru ini disekitar jaringan kanker. Pembentukan pembuluh darah baru ini diperlukan untuk survival sel kanker dan ekspansi ke bagian lain dari tubuh. Keenam, sel kanker tidak peka terhadap sinyal apoptosis. Kegagalan sel kanker dalam merespon sinyal apoptosis lebih disebabkan karena mutasinya gen-gen regulator apoptosis dan gen-gen sinyal apoptosis (Hanahan & Weinberg 2011). Kanker Payudara Kanker payudara adalah pertumbuhan sel yang abnormal pada jaringan payudara seseorang. Payudara wanita terdiri atas lobulus (kelenjar susu), duktus (saluran susu), jaringan lemak dan jaringan ikat, pembuluh darah dan limfe (Novianti & Purnami 2012). Anatomi payudara seperti Gambar 4. Pada tahap awal, kanker payudara hanya membentuk benjolan pada jaringan mamae dan kemudian pada tahap berikutnya akan terjadi luka pada jaringan mamae tersebut. Cara mengobati kanker ini dilakukan dengan pembuangan bagian jaringan yang terkena kanker, terapi radiasi dan kemoterapi. Terapi radiasi dan kemoterapi bertujuan menghancurkan sel kanker dan mengendalikan pertumbuhan tumor pada jaringan mamae yang terkena kanker utama dan mengendalikan pertumbuhan tumor pada jaringan lain yang awalnya tidak terkena kanker. Terapi radiasi adalah pengobatan yang menggunakan gelombang elektromagnetik dan partikel yang berenergi tinggi (Woodward & Cox 2008). Terapi radiasi sampai saat ini masih digunakan sebagai salah satu modalitas untuk pengobatan penyakit kanker payudara (Polgar & Major 2009). Salah satu mekanisme terapi radiasi pada kanker adalah merusak sel secara tidak langsung sehingga terjadi apoptosis, melalui pembentukan radikal bebas. Radikal bebas selain merusak sel kanker, juga merusak sel normal yang dikenal sebagai efek samping terapi radiasi (Eriksson & Stigbrand 2010). Adanya efek samping radiasi yang berat dapat mengakibatkan tertunda atau gagalnya terapi radiasi (Kentjono 2001). Oleh karena itu, perlu dipikirkan upaya untuk mengurangi efek samping terapi radiasi tersebut.
Gambar 4 Anatomi payudara (Tim CancerHelps 2010)
6
Proses terbentuknya tumor payudara dapat terjadi karena kerusakan (mutasi) pada gen yang meregulasi proliferasi sel. Kerusakan ini menyebabkan proliferasi sel tidak dapat dikontrol. Pada beberapa kasus kerusakan lebih lanjut dapat menyebabkan sel tumor menjalar pada bagian tubuh lainnya. Estrogen dan progesteron merupakan hormon yang sering melekat pada reseptor beberapa sel kanker payudara sebagai bahan bakar pertumbuhan sel tersebut. Sekitar satu dari lima kasus kanker payudara disebabkan peningkatan protein HER-2 yang menyebabkan sel tumor tumbuh dan menyebar lebih cepat (Tim CancerHelps 2010). Faktor resiko kanker payudara diklasifikasikan dalam beberapa kategori yaitu: (1) Faktor histori keluarga atau genetik, rata-rata 15% dari semua kasus kanker payudara (2) Efek berbahaya dari hormon (3) Kategori densitas tinggi payudara yang dikenal sebagai satu dari banyak penanda signifikan dari resiko kanker payudara (4) Sejarah penyakit proliferatif payudara (Al-amri et al. 2015). (5) Faktor lingkungan dan gaya hidup, pengaruh lingkungan diduga karena faktor antara lain: alkohol, diet tinggi lemak, dan infeksi virus. Hal tersebut mempengaruhi onkogen dan gen supresi dari kanker payudara (Wunderlich & Restifo 2006). Daun Sirsak (Annona muricata L.) Sirsak (Annona muricata L.) merupakan salah satu tanaman buah yang berasal dari Karibia, Amerika Tengah dan Amerika Selatan (Hermawan & Laksono 2013). Daun sirsak (Gambar 5) banyak digunakan sebagai obat herbal untuk mengobati berbagai penyakit. Seperti Andes Peru Radang selaput lendir karena penyakit asma, Amazonia Peru mengobati diabetes serta penenang dan antikejang (Zuhud 2011).
Gambar 5 Daun sirsak
Sistematika Tanaman Sirsak: Kingdom : Plantae Subkingdom : Tracheobionta Super Divis : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Sub Kelas : Magnoliidae Ordo : Magnoliales Famili : Annonaceae Genus : Annona Spesies : Annona muricata L.
Daun sirsak mengandung flavonoid, tanin, alkaloid, saponin, kalsium, fosfor, karbohidrat, vitamin (A, B dan C), fitosterol, kalsium oksalat dan beberapa kandungan kimia lainnya termasuk ACGs (Mangan 2009). Daun tanaman ini secara tradisional digunakan untuk mencegah dan mengobati abses, artritis, asma, bronkitis, gangguan empedu, diabetes, jantung, hipertensi, cacingan, gangguan hati, malaria, rematik, obat penenang, tumor dan kanker (Wicaksono 2011).
7
Kapang Endofit Endofit secara bahasa berasal dari kata endon yang berarti di dalam dan phyton yang berarti tanaman (Schulz & Boyle 2005). Secara umum, endofit adalah makhluk hidup yang berada di dalam tanaman dapat bersifat parasitik atau simbiotik. Kapang endofit adalah fungi yang menginfeksi jaringan tanaman yang sehat tanpa menyebabkan sakit (Clay 2004). Kapang endofit merupakan mikroorganisme yang terdapat di dalam suatu sistem jaringan tumbuhan seperti biji, daun, bunga, ranting, batang, dan akar. Berbagai senyawa fungsional dapat dihasilkan oleh kapang endofit. Senyawa yang dihasilkan oleh kapang endofit tersebut dapat berupa senyawa antikanker, antivirus, antibakteri, antifungi, hormon pertumbuhan tanaman, insektisida dan lain-lain (Strobel 2004). Kapang endofit merupakan salah satu golongan mikrob endofit yang paling banyak ditemukan di alam (Strobel 2003) dan sumber yang kaya akan metabolit sekunder bioaktif (Tan & Zou 2001). Kapang ini hidup berasosiasi secara simbiosis mutualisme dengan tumbuhan inangnya. Kapang endofit menginfeksi tumbuhan sehat pada jaringan tertentu tanpa menimbulkan tanda-tanda adanya infeksi (Bacon & White 2000). Kapang endofit berperan penting dalam industri farmasi karena kemampuannya dalam memproduksi senyawa metabolit yang bervariasi, baik dari struktur maupun fungsinya. Berbagai golongan senyawa metabolit sekunder seperti alkaloid, flavonoid, kuinon, terpenoid, antrakuinon, fenil propanoid, turunan isokumarin, peptida, dan senyawa alifatik, telah diisolasi dan dicirikan dari kultur kapang endofit (Agusta 2009). Pemanfaatan kapang endofit bisa menjadi cara inovatif untuk mengefisienkan sumber senyawa bioaktif. Kapang endofit yang diisolasi dari tumbuhan obat akan memiliki aktivitas senyawa bioaktif yang sama atau bahkan lebih baik dibandingkan dengan tumbuhan inangnya, karena mekanisme perubahan kimia oleh mikroorganisme sangat mirip dengan yang terjadi pada organisme tingkat tinggi. Hal ini menguntungkan karena siklus hidup kapang endofit lebih singkat daripada tumbuhan inangnya dan dapat diproduksi dalam skala besar dengan menggunakan proses fermentasi (Setyowati & Wardah 2007). Sel Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7) Sel MCF-7 merupakan salah satu model sel kanker payudara yang banyak digunakan dalam penelitian. Sel kanker payudara MCF-7 pertama kali dibiakkan dan dikulturkan di Michigan Cancer Foundation pada tahun 1973 (Holliday & Speirs 2011). Sel ini pertama kali diperoleh dari jaringan epitel payudara dengan titik metastasis pleural effusion breast adenocarcinoma seorang wanita kaukasian berumur 69 tahun bergolongan darah O dengan RH positif. Karakteristik sel ini antara lain resisten terhadap agen kemoterapi, mengekspresikan reseptor estrogen (ER+), ekspresi BCl-2, dan tidak mengekspresikan caspase-3. Sel MCF-7 merupakan cell line adherent, yang tumbuh melekat. Sel ini dapat ditumbuhkan pada media yang mengandung RPMI (Roswell Park Memorial Institute) atau DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), FBS (Fetal Bovine Serum) dan antibiotik antimikotik (Dwitarhayani 2012).
8
Popularitas MCF-7 ini terutama disebabkan sensitivitas hormon yang sangat indah melalui ekspresi reseptor estrogen (ER), sehingga model yang ideal untuk mempelajari respon hormon (Holliday & Speirs 2011). Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode amplifikasi atau penggandaan DNA menggunakan oligonukleotida (primer) yang diarahkan secara enzimatik berdasarkan urutan sekuen DNA spesifik. Teknik ini mampu memperbanyak sekuen DNA hingga mencapai 105-106 kali sekuen DNA cetakan (template). Tahapan awal (pre-treatment) yang perlu dilakukan sebelum proses PCR adalah mencari informasi sekuen DNA yang diamplifikasi, dilanjutkan dengan desain primer. Tahapan PCR dapat dilakukan setelah diperoleh primer yang ideal. Produk PCR diamplifikasi dari DNA template menggunakan enzim DNA polimerase yang termostabil dari Thermus aquaticus (Taq polimerase) dan menggunakan pengatur siklus termal otomatis (Perkin-Elmer/Cetus) untuk menempatkan reaksi sampai 30 atau lebih siklus denaturasi (pemisahan), annealing (penempelan) dan extension (pemanjangan). Setelah amplifikasi dengan PCR, produk ini dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida dan secara langsung divisualisasikan setelah pewarnaan dengan etidium bromida (Ali 2009).
Gambar 6 Tahapan-tahapan dalam PCR (Bacon & White 2000) PCR merupakan suatu teknik amplifikasi (perbanyakan) potongan DNA secara in-vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in-vivo yang bersifat semi konservatif (Bacon & White 2000). PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, di dalam tabung reaksi. Proses PCR
9
membutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleotida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang ditambahkan, sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat (Boyer 2010). PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri atas tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan rantai DNA templat, penempelan pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA polimerase (Bintang 2010). Tujuan PCR adalah untuk mempercepat isolasi DNA spesifik tanpa membuat dan melakukan pustaka genom. Contoh penggunaan PCR dilakukan pada pengidentifikasian hasil forensik, pengidentifikasi orang tua anak dan perbanyakan molekul DNA dalam jumlah yang banyak dan waktu yang singkat. Gas Chromatography - Mass Spectrometer (GC-MS) Gas Chromatography - Mass Spectrometer (GC-MS) adalah metode yang mengkombinasikan kromatografi gas dan spektrometri massa untuk mengidentifikasi senyawa yang berbeda dalam analisis sampel. GC-MS terdiri dari dua blok bangunan utama: kromatografi gas dan kromatografi massa. Kromatografi gas menggunakan kolom kapiler yang tergantung pada dimensi kolom itu (panjang, diameter, ketebalan film) serta sifat fase (misalnya 5% fenil polisiloksan). Perbedaan sifat kimia antara molekul-molekul yang berbeda dalam suatu campuran dipisahkan dari molekul dengan melewatkan sampel sepanjang kolom. Molekulmolekul memerlukan jumlah waktu yang berbeda yang disebut waktu retensi untuk keluar dari kromatografi gas dan ini memungkinkan spektrometer massa untuk menangkap, ionisasi, mempercepat, membelokkan dan mendeteksi molekul terionisasi secara terpisah. Spektrometer massa melakukan hal ini dengan memecah masing-masing molekul menjadi terionisasi mendeteksi fragmen menggunakan massa untuk mengisi rasio (Skoog et al. 1996). GC-MS mempunyai bagian-bagian yang berperan penting dalam proses analisis sampel. Dapat ditinjau dari instrumennya, kromatografi gas dan spektroskopi massa mempunyai bagian-bagian yang berbeda. Kromatografi gas terdiri atas beberapa bagian, yaitu: kolom pengisi sampel, bagian microwave dan detektor (Hajslova & Cajka 2007). Kolom pengisi merupakan tempat yang disediakan untuk sampel yang dianalisis. Selanjutnya, proses separasi berlangsung selama sampel berinteraksi dengan komponen yang berperan sebagai fase diam. Fraksi-fraksi yang terbentuk kemudian dipanaskan pada titik didih analat untuk
10
mengubah analat ke fase gas. Analat tersebut kemudian membawa sinyal kimia menjadi sinyal listrik dengan kekuatan intensitas berdasarkan konsentrasi analat. Detektor kemudian menunjukkan hasil analisis berupa kromatogram. Berbeda dengan kormatografi gas, perangkat spektroskopi massa terdiri atas tiga bagian penting, yaitu tempat pengionan sampel, pemisahan ion, dan deteksi ion yang terbentuk (Hajslova & Cajka 2007). Spektroskopi massa bekerja dengan mengubah senyawa analat menjadi ion-ion yang ditempatkan pada medan magnet, kemudian dideteksi oleh detektor dan dilanjutkan dengan transmisi emisi elektron untuk menentukan ukuran molekul. Prinsip kerja GC-MS adalah pemisahan senyawa berdasarkan perbedaan berat molekul (massa) setelah terionisasi menjadi ion yang lebih kecil (Harvey 2000). GC-MS telah diaplikasikan dalam banyak bidang, seperti industri obatobatan, kedokteran, penelitian obat-obatan dan penelitian lingkungan. GC-MS banyak digunakan karena akurasi dan presisinya sebagai alat analisis cukup tinggi. Selain itu, GC-MS mampu menganalisis sampel dengan waktu yang lebih singkat dibandingkan analisis unsur secara tepisah (yang dilakukan secara konvensional) (Hajslova & Cajka 2007). Identifikasi Kapang Berdasarkan Daerah Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA Ribosom Identifikasi secara morfologi mungkin hanya dapat menentukan genus dari isolat-isolat kapang. Untuk penentuan hingga sampai pada tingkat spesies, diperlukan identifikasi molekuler. Salah satu cara identifikasi spesies kapang secara molekuler adalah menggunakan sekuens DNA ribosomal (rDNA) pada daerah ITS (Internal Transcribed Spacer region). ITS adalah suatu urutan RNA dari proses transkripsi utama yang berada antar prekusor ribosomal subunit dan dihilangkan pada proses splicing ketika RNA precursor tanda molekul yang struktural diproses ke dalam suatu ribosom (Mulyatni et al. 2011). Daerah ITS rDNA yang baik untuk diagnostik identifikasi spesies dan analisis filogenetik adalah daerah ITS1 dan ITS2 yang bersama-sama mengapit daerah 5.8S rDNA fungi. Keberhasilan isolasi dan amplifikasi DNA dengan PCR bergantung pada konsentrasi isolat DNA templat yang cukup, primer, dan temperatur annealing. Terdapat beberapa primer untuk ITS rDNA, diantaranya yaitu 2 pasang yang mencakup keseluruhan daerah ITS1, ITS2 dan 5,8S rDNA, dan masing masing satu pasang primer yang mencakup hanya daerah ITS1 atau ITS2 (Seifert et al. 2007). Keberhasilan identifikasi secara molekuler menggunakan sekuens ITS rDNA, diperlukan hasil amplifikasi yang setidaknya memungkinkan sekuensing ITS1 dan ITS2 dari rDNA. Pemilihan pasangan primer yang tepat dengan kondisi temperatur annealing akan sangat mempengaruhi keberhasilan PCR (Nugroho et al. 2013). Isolasi DNA dan amplifikasi PCR pada daerah ITS rDNA merupakan tahap awal yang perlu dilakukan dalam identifikasi molekuler. Sekuens DNA pada daerah ITS rDNA berevolusi lebih cepat dibandingkan daerah gen lainnya sehingga akan bervariasi pada setiap spesies (White et al. 1990). Hal ini akan mempermudah dalam identifikasi spesies dengan membandingkan tingkat kemiripan (homologi) sekuens DNA daerah ITS yang dimiliki suatu fungi dengan fungi lainnya. Daerah ITS rDNA ini bersifat ubikuitus dengan fungsi yang identik pada seluruh organisme. Daerah ITS rRNA memiliki beberapa daerah yang memiliki
11
urutan basa yang relatif konservatif dan beberapa daerah urutan basanya variatif. Perbandingan urutan basa yang konservatif berguna untuk mengkonstruksi pohon filogenetik universal karena mengalami perubahan relatif lambat dan mencerminkan kronologi evolusi bumi. Sebaliknya, urutan basa yang bersifat variatif dapat digunakan untuk melacak keragaman dan menempatkan galur-galur dalam satu spesies (Pangastuti 2006).
3 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Proses Pusat Penelitian Biologi, Bidang Mikrobiologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong-Bogor, Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Pusat Studi Satwa dan Primata IPB, dan Badan Penelitian dan Pengembangan Kehutanan Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan April hingga Oktober 2015. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan meliputi 12 isolat kapang endofit daun sirsak dari Rahman (2015), yaitu 3 isolat berasal dari Sukabumi (Sir-SM1, Sir-SM2, Sir-SM3), 3 isolat berasal dari Cianjur (Sir-CA1, Sir-CA2, Sir-CA3) dan 6 isolat berasal dari Garut (Sir-G1, Sir-G2, Sir-G3, Sir-G4, Sir-G5, Sir-G6), glukosa, Yeast Malt Agar (YMA), pepton, Yeast Malt Broth (YMB), etil asetat, pelarut DMSO (dimetil sulfoksida), media pertumbuhan sel kanker RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute), FBS (Fetal Bovine Serum), PBS (Phosphat Bufferd Saline), tripan blue, tripsin, 100 µl sel kanker MCF-7, 100 µl sel normal Chang, doksorubisin, antibiotik, larutan kloroform-fenol, alkohol absolut, etanol 70%, bubuk agarosa, etidium bromide (EtBr), loading dye, marker 1 kb plus DNA ladder dan 2 primer yaitu ITS 4 dan ITS 5. Alat yang digunakan adalah Erlenmeyer 100 mL, bunsen, laminar, inkubator, pipet mikro, autoklaf, lemari es dan freezer, rotary evaporator, Shaker, pemanas gelombang mikro, flask, plate 96 well, sentrifus, mikroskop, inkubator, pipette tips (200 µl dan 1000 µl), hemasitometer, tabung sentrifus 15 ml, GC-MS pyrolysis, spektrofotometer, ELISA reader, waterbath, vortex mixer, elektroforesis, KIT bioner, tube eppendorf, mesin PCR (Esco), perangkat elektroforesis (Bio-Rad), sarung tangan, kertas saring, alumunium foil dan stopwatch. Prosedur Penelitian Pembuatan Media 1. Yeast Malt Agar (YMA) Media yang digunakan adalah media YMA (3 g Yeast extract, 3 g Malt extract, 10 g glukosa, 5 g pepton dan 5.5 g agar dilarutkan dalam 1 liter akuades), ditambahkan antibiotik. Semua bahan dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer
12
dengan masing-masing labu Erlenmeyer berisi 100 mL dan ditutup menggunakan kapas yang telah dimodifikasi untuk selanjutnya disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit dan tekanan 1 atm pada suhu 121oC. 2. Yeast Malt Broth (YMB) Sebanyak 3 g Yeast extract, 3 g Malt extract, 10 g glukosa dan 5 g pepton dilarutkan dalam 1 liter akuades kemudian ditambahkan antibiotik. Semua bahan dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dengan masing-masing labu Erlenmeyer berisi 100 mL dan ditutup menggunakan kapas yang telah dimodifikasi untuk selanjutnya disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit dan tekanan 1 atm pada suhu 121oC. Peremajaan Kapang Endofit Daun Sirsak (Pelczar & Chan 1996). Inokulasi isolat kapang endofit dilakukan secara aseptis di dalam laminar. Laminar terlebih dahulu disterilkan dengan penyinaran sinar ultraviolet selama 1 jam, dan kemudian seluruh bagian dalam laminar dan bagian luar kaca disemprot dengan etanol 70%. Isolat kapang endofit dari agar miring diinokulasi ke dalam media PDA kemudian diinkubasi selama dua hari pada suhu kamar. Kultivasi Isolat (Agusta 2013) Pada proses ini masing-masing isolat kapang endofit diambil menggunakan jarum ose. Masing-masing isolat kemudian diinokulasikan ke dalam 200 mL media YMB dan media agar miring untuk digunakan sebagai cadangan atau simpanan isolat kapang endofit. Kultur dibuat dalam Erlenmeyer yang berukuran 500 mL dan proses inokulasi dilakukan pada laminar air flow khusus kapang. Total isolat kapang endofit ada 12 maka kultivasi juga dilakukan pada YMB dalam Erlenmeyer sebanyak 12 buah, kemudian diinkubasi pada suhu 27oC, digoyang dengan kecepatan 120 rpm selama 21 hari. Ekstraksi Senyawa Aktif Kapang Endofit Daun Sirsak (Yeo et al. 2014) Isolat kapang endofit daun sirsak setelah dikultivasi selama 21 hari kemudian diekstraksi untuk mendapatkan senyawa utama kapang endofit. Isolat kapang endofit yang tumbuh dalam media YMB 200 mL ditambahkan pelarut etil asetat yang sudah didestilasi 300 mL, kemudian dikocok manual selama 15 menit. Larutan atas fraksi dituangkan dalam labu didih, lapisan kedua fraksi tidak boleh sampai ikut masuk dalam labu didih. Lapisan atas fraksi dievaporasi menggunakan rotary vacum evaporator pada suhu 40°C kemudian dikeringkan dengan pengaliran nitrogen. Berat ekstrak didapatkan dari berat bobot wadah dan ekstrak dikurangi berat bobot kosong. Aktivitas Sitotoksik terhadap Sel Kanker Payudara MCF-7 dengan Indikator MTT (Methly Thyazol Tetrazolium) (Li et al. 2013; Hasan et al. 2014). Persiapan sampel. Pada pengujian aktivitas dua belas ekstrak kapang endofit daun sirsak terhadap sel kanker MCF-7 ekstrak dilarutkan dengan media RPMI-1640 dengan konsentrasi 100 µg/mL. Empat ekstrak dengan aktivitas terbaik menurut %inhibisinya kemudian diuji kembali aktivitasnya terhadap sel MCF-7 pada rangkaian konsentrasi uji dengan tingkatan konsentrasi mulai 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL dan 400 µg/mL. Selanjutnya diambil satu ekstrak
13
terbaik dan diuji kembali dengan menggunakan sel normal Chang pada konsentrasi yang sama untuk mengetahui kemampuan ekstrak dalam menghambat pertumbuhan sel kanker payudara MCF-7. DMSO digunakan sebagai kontrol negatif dan doksorubisin sebagai kontrol positif. Sel MCF-7 yang telah ditumbuhkan pada flask T25 dilakukan subkultur ke 96 wells tissue culture plate selama 24 jam pada kondisi 5% CO2 dan suhu 37oC dengan jumlah 5000 sel/well. Ekstrak dimasukkan sebanyak 100 µL/well dan diinkubasi selama 48 jam. Kemudian ditambahkan dengan MTT (3-(4,5Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) sebanyak 100 µL/well dan diinkubasi kembali selama 4 jam pada pada kondisi 5% CO2 dan suhu 37oC. Supernatan dibuang dan ditambahkan etanol-HCl. HCl berfungsi untuk memecah sel, karena formazan merupakan produk intraseluler dari reaksi enzimatik MTT, sedangkan etanol berfungsi untuk melarutkan formazan (kristal garam). Selanjutnya dilakukan pembacaan Optical Density (OD) menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Data absorbansi dari hasil pembacaan ELISA dikonversikan dalam persen inhibisi sel menurut persamaan rumus: % inhibisi = (
𝐴𝑏𝑠. 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 −𝐴𝑏𝑠. 𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝐴𝑏𝑠. 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
) × 100 %
Hubungan kematian sel dan konsentrasi selanjutnya dianalisis dengan menggunakan uji regresi linier. Kemudian dihitung konsentrasi ekstrak yang diperlukan untuk menghambat 50% pertumbuhan sel kanker (IC50). Identifikasi Kandungan Senyawa Kimia dengan menggunakan GC-MS pyrolysis (Collin et al. 2009; Mutunzi et al. 2013; Abubacker & Deeplakshmi 2013) Identifikasi senyawa aktif yang berperan sebagai antikanker dilakukan dengan menggunakan GC-MS pirolisis (py-GC-MS). Jumlah senyawa yang terdapat dalam ekstrak ditunjukkan oleh jumlah puncak (peak) pada kromatogram, sedangkan nama/jenis senyawa yang ada diinterpretasikan berdasarkan data spektra dari setiap puncak tersebut dengan menggunakan metode pendekatan pustaka pada database py-GC-MS dan data spektra massa. Sampel yang diidentifikasi senyawa kimianya adalah sampel yang mempunyai aktivitas antikanker. Sebanyak 2 µl sampel dimasukan kedalam pirolisis, lalu diidentifikasi dengan py-GC-MS. py-GC-MS yang digunakan dalam analisis ini adalah GCMS-QP2010S Shimadzu, jenis kolom Rtx-5MS, panjang kolom 60 m, diameter kolom 0.25 mmID, temperature limit dari 80oC – 300oC dengan kenaikan suhu 10oC/menit, laju alir 1 mL/menit, suhu oven 70oC – 290oC, suhu interface 280oC, Split Ratio sebesar 50.0, ion source 200 oC dan gas pembawa Helium. Data yang dihasilkan dicocokkan dengan senyawa yang terdapat pada database py-GC-MS. Prosedur penggunaan py-GC-MS dapat dilihat pada lampiran 3. Identifikasi Kapang Endofit Daun Sirsak Berbasis Amplifikasi Internal Transcribed Spacer (ITS) (Muzuni et al. 2014) Identifikasi isolat kapang dilakukan secara molekuler berdasarkan analisis genetika secara parsial pada lokus Internal Transcribed Spacer (ITS) ribosomal DNA kapang. Isolasi DNA diawali dengan menumbuhkan isolat kapang dalam
14
media cair Potato Dextrose Broth (PDB) dan diinkubasi selama 72 jam. Biomassa berupa miselia kapang dipanen untuk proses ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA kapang dilakukan dengan menggunakan reagen nucleon PHYTOpure (Amersham LIFE SCIENCE). Amplifikasi PCR pada ITS menggunakan Primer ITS 4 (reverse): 5`--TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC–3` dan Primer ITS 5 (forward): 5`--GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G–3` (White et al. 1990; O`Donnell 1996). Purifikasi produk PCR dilakukan dengan PEG precipitation method (Hiraishi et al. 1995) dan dilanjutkan dengan siklus sekuensing. Produk PCR dan produk restriksi disekuensing di Macrogen, Inc., Korea Selatan dengan penggunaan metode Sanger. Sekuensing produk PCR dilakukan dengan primer yang sama pada saat amplifikasinya. Hasil siklus sekuensing dipurifikasi kembali dengan Ethanol purification method. Analisis pembacaan urutan basa nitrogen menggunakan automated DNA sequencer (ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer) (Applied Biosystems). Sekuensing dalam bentuk format AB1 diolah dengan software BioEdit 7.2.0, kemudian disimpan dalam format fasta dan diidentifikasi menggunakan program BLAST pada situs NCBI (National Center for Biotechnology Information) melalui http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast. Setelah itu, dipilih beberapa organisme untuk disertakan dalam pembuatan pohon filogenetik menggunakan software MEGA 5. Persen homologi juga ditentukan dengan menggunakan MEGA 5. DNA hasil dianalisis PCR menggunakan teknik elektroforesis menurut Sambrook dan Russel (2001). Sebanyak 1 g agarosa dicampurkan dengan 100 mL TAE kemudian dipanaskan dengan microwave selama 2 menit. Gel agarosa didiamkan hingga hangat lalu dituangkan ke dalam cetakan elektroforesis hingga mengeras. Gel agarosa diletakkan pada alat elektroforesis yang telah diberi buffer TAE. Sebanyak 1 µL loading dye dicampurkan dengan 1 µL sampel DNA lalu dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa. Setelah semua sampel dimasukkan dalam sumur-sumur gel, ladder 1 kb sebagai marker sebanyak 2 µL dimasukkan ke dalam sumur. Sampel dielektroforesis dengan tegangan 100 V selama 30 menit. Gel direndam dalam larutan EtBr selama 30 menit kemudian dicuci dengan akuades selama 5 menit. Visualisasi hasil elektroforesis dilakukan dengan UV transluminator untuk melihat pita DNA yang terbentuk. Analisis Data (Matjik & Sumertajaya 2013) Rancangan percobaan yang digunakan dalam menganalisis hasil penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap Faktorial (RAL Faktorial). Faktor yang digunakan adalah jenis ekstrak (Sir-G5, Sir-SM2, Sir-G6 dan Sir-G2) dan konsentrasi ekstrak yang berbeda. Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan analisis ragam (two-way ANOVA). Jika terdapat perbedaan yang nyata, maka analisis dilanjutkan dengan uji Duncan dengan tingkat kepercayaan 95%. Uji statistik menggunakan perangkat lunak komputer MS Excel 2013, SAS 1.9.3 dan Minitab 15.
15
4 HASIL PENELITIAN
Kapang Endofit Daun Sirsak Hasil Kultivasi Hasil kultivasi kapang endofit pada media YMA disajikan pada Gambar 7, yang menunjukkan adanya variasi bentuk koloni kapang endofit. Koloni tersebut tumbuh pada media YMA yang merupakan media padat. a
b
Sir-CA1
c
Sir-CA2 f
e
Sir-G4
Sir-G1
Sir-CA3 h
g
Sir-G3 j
i
d
Sir-SM1
Sir-SM3 l
k
Sir-G2 Sir-SM2 Sir-G5 Sir-G6 Gambar 7 Sebagian kapang endofit dari daun sirsak dalam media YMA pada cawan petri. (a) Sirsak Cianjur 1, (b) Sirsak Cianjur 2, (c) Sirsak Garut 1, (d) Sirsak Cianjur 3, (e) Sirsak Garut 4, (f) Sirsak Garut 3, (g) Sirsak Sukabumi 1, (h) Sirsak Sukabumi 3, (i) Sirsak Garut 2, (j) Sirsak Sukabumi 2, (k) Sirsak Garut 5, (l) Sirsak Garut 6. Media YMB (Gambar 8) cukup umum digunakan untuk kultivasi kapang, jamur, dan khamir. Media ini mengandung sumber nutrisi kaya gizi yang mendorong sporulasi dan pertumbuhan jamur secara subur. c b a d e f
Sir-CA1
Sir-CA2
Sir-CA3
Sir-G1
Sir-G2
Sir-G3
16
g
l
k
j
i
h
Sir-G4 Sir-G5 Sir-G6 Sir-SM1 Sir-SM2 Sir-SM3 Gambar 8 Kapang endofit daun sirsak dalam media YMB. (a) Sirsak Cianjur 1, (b) Sirsak Cianjur 2, (c) Sirsak Cianjur 3, (d) Sirsak Garut 1, (e) Sirsak Garut 2, (f) Sirsak Garut 3, (g) Sirsak Garut 4, (h) Sirsak Garut 5, (i) Sirsak Garut 6, (j) Sirsak Sukabumi 1, (k) Sirsak Sukabumi 2, (l) Sirsak Sukabumi 3. Dalam penelitian ini, media produksi dipertahankan pada suhu kamar, fase pertumbuhan dari kapang endofit pertama dilakukan pada media YMA, kapang mulai tumbuh pada hari kedua setelah inokulasi. Kemudian dipindahkan pada media YMB selama 21 hari seluruh isolatnya diinkubasi pada suhu 27oC, digoyang dengan kecepatan 120 rpm selama 21 hari. Ekstrak Kapang Endofit Daun Sirsak Ekstrak yang diperoleh berwarna kuning pekat kemudian diuapkan dengan menggunakan vacum rotary evaporator untuk mendapatkan ekstrak kental. Ekstrak kental yang diperoleh menyerupai serbuk kuning kemudian dibekukan dengan gas nitrogen (Gambar 9) sebanyak 2 mL-4 mL. 1
2
Sir-SM2 7
Sir-G5 Gambar 9
Sir-G3 8
3
Sir-CA1 9 1
4
5
Sir-G6 10
6
Sir-SM1 11
Sir-G2 12
Sir-CA2 Sir-G4 Sir-G1 Sir-SM3 Sir-CA3 Hasil ekstrak kapang endofit daun sirsak. (1) Sirsak Sukabumi 2, (2) Sirsak Garut 3, (3) Sirsak Cianjur 1, (4) Sirsak Garut 6, (5) Sirsak Sukabumi 1, (6) Sirsak Garut 2, (7) Sirsak Garut 5, (8) Sirsak Cianjur 2, (9) Sirsak Garut 4, (10) Sirsak Garut 1, (11) Sirsak Sukabumi 3, (l2) Sirsak Cianjur 3.
17
Ekstrak yang diperoleh (Tabel 1) menunjukkan bahwa terdapat variasi bobot yang menandakan ada variasi rendemen, ekstrak kemudian disimpan dalam lemari pendingin untuk kemudian digunakan pada pengujian berikutnya. Tabel 1 Hasil ekstrak yang diperoleh dari kapang endofit daun sirsak No
Sampel
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Sir-SM2 Sir-G3 Sir-CA1 Sir-G6 Sir-SM1 Sir-G2 Sir-G5 Sir-CA2 Sir-G4 Sir-G1 Sir-SM3 Sir-CA3
Bobot Ekstrak Etil Asetat yang diperoleh (mg) 30 10 20 30 30 40 20 20 30 20 20 20
Aktivitas Sitotoksik Senyawa Aktif Kapang Endofit Hasil penelitian menunjukkan bahwa secara umum, 12 ekstrak kapang endofit daun sirsak mampu menghambat pertumbuhan sel kanker MCF-7 (Gambar 10) dan diperoleh empat ekstrak dengan aktivitas terbaik, yaitu Sirsak Sukabumi 2 (Sir-SM2), Sirsak Garut 6 (Sir-G6), Sirsak Garut 2 (Sir-G2) dan Sirsak Garut 5 (SirG5). 100
Penghambatan (%)
80 60 40 20 0 -20
Sampel Gambar 10 Aktivitas antikanker ekstrak kapang endofit dari daun sirsak terhadap sel MCF-7 pada konsentrasi 100 µg/mL.
18
Keempat ekstrak tersebut kemudian diuji kembali untuk memperoleh aktivitas terbaik, hasil pengujian aktivitas antikanker keempat ekstrak tersebut disajikan pada Tabel 2. Tabel 2 Nilai IC50 ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak pada sel MCF-7 Sampel
IC50 (µg/mL)
Ekstrak Sir-G5 Ekstrak Sir-SM2 Ekstrak Sir-G6 Ekstrak Sir-G2
19.20 ± 7.71b 262.00 ± 116.99a 397.44 ± 11.62a 411.54 ±176.48a
a
rata-rata ± SD; Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji selang berganda Duncan).
Tabel 3 Nilai IC50 ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak pada sel Chang Sampel
Sampel 7 (Sir-G5)
Konsentrasi µg/mL
‘
Gambar 11
a
Gambar 12
Rata2 ODI
ODII
%inhibisi
ODIII
400
0.359
0.326
0.313
0.333
40.382
200
0.344
0.378
0.351
0.358
35.902
100
0.37
0.374
0.372
0.372
33.333
50
0.366
0.418
0.398
0.394
29.391
25
0.396
0.367
0.418
0.394
29.450
0.558
0.559
0.557
0.558
0
Kontrol
a
Ulangan
b
c
IC50 (µg/mL)
1258.925
d
Sel kanker payudara MCF-7 hasil perlakuan ekstrak kapang endofit daun sirsak (Garut nomor 5). Deskripsi: a=kontrol tanpa perlakuan, b= konsentrasi 400 µg/mL, c=konsentrasi 25 µg/mL, dan d=doksorubisin 0.5 µg/mL (mikroskop canon inferted, camera Dino Eye Ukuran 1280 x 1024 unit: inch) pada pembesaran 10x. b
c
d
Sel normal Chang hasil perlakuan ekstrak kapang endofit daun sirsak (Garut nomor 5). Deskripsi: a=kontrol tanpa perlakuan, b=konsentrasi 400 µg/mL, c=konsentrasi 25 µg/mL, dan d=doksorubisin 0.5 µg/mL (mikroskop canon inferted, camera Dino Eye Ukuran 1280 x 1024 unit: inch) pada pembesaran 10x.
19
Kandungan Senyawa Aktif Ekstrak Kapang Endofit
Intensitas puncak dasar
Hasil identifikasi senyawa dengan menggunakan Py-GC-MS, satu persatu semua senyawa dibandingkan dengan pustaka di beberapa website untuk mencari senyawa apa yang aktif sebagai antikanker. Hasil analisis dari GC dapat dilihat pada Gambar 13.
Waktu (menit) Gambar 13 Kromatogram ekstrak etil asetat Keterangan rinci Gambar 13 disajikan pada Lampiran 18 sedangkan klasifikasi senyawa metabolit sekunder disajikan pada Lampiran 19. Identitas Kapang Endofit Daun Sirsak berbasis Amplikasi ITS DNA hasil isolasi Annona muricata L. yang diperoleh memiliki jumlah yang cukup baik, hal ini terlihat dari hasil PCR pada Gambar 14 pada elektroforesis gel agarosa 1 %. Hasil elektroforesis horizontal dengan gel agarosa 1 % memperlihatkan gambaran pita yang jelas pada daerah 550 pasang basa.
Gambar 14 Hasil PCR kapang endofit daun sirsak Sir-G5
20
Selanjutnya dilakukan analisis melalui konstruksi pohon filogenetik (Gambar 15) untuk melihat kekerabatan kapang endofit dari daun sirsak. Dari hasil perhitungan matriks jarak berdasarkan kimura-2 parameter, terlihat bahwa jarak kapang endofit dari daun sirsak memiliki kekerabatan yang cukup dekat dengan Phomopsis sp. gb|AF001021.2|_Diaporthe_phaseolorum_strain_473-4 gb|HQ533143.1| Diaporthe eres strain Phk2 gb|HQ533144.1| Diaporthe eres strain Phk1 gb|HQ832815.1|_Phomopsis_sp._LH157 gb|KC357558.1|_Diaporthe_sp._FH-2013b gb|JQ954648.1|_Phomopsis_sp._FH-2012b gb|FJ375142.1|_Ascomycota_sp._H-12 gb|GQ139521.1| Alternaria mali strain PF0905 gb|HQ832826.1|_Phomopsis_sp._LH243 Kapang Endofit Daun sirsak (Annona muricata L.) dbj|LC056934.1|_Diaporthe_sp._CLS-33 dbj|LC056935.1|_Diaporthe_sp._CLS-44 gb|EU571102.1|_Phomopsis_sp._VAAT-PZ15 gb|KC145847.1|_Diaporthe_sp._3_PRJ-2013 gb|FJ176469.1| Phomopsis sp. ML15 gb|KC145869.1| Diaporthe sp. 3 PRJ-2013 gb|HQ185335.1| Scedosporium apiospermum strain CBS 117407
Gambar 15 Pohon filogenetik kapang endofit daun sirsak dengan model K2+G (kimura 2-parameter+ gamma distributed)
5 PEMBAHASAN
Kultivasi Kapang Endofit Daun Sirsak Kultivasi isolat kapang endofit dari daun sirsak dilakukan untuk meremajakan isolat. Stok isolat kapang endofit dari daun sirsak ditumbuhkan pada media Yeast Malt Agar (YMA) miring kemudian isolat dipindahkan ke media Yeast Malt Broth (YMB). Media YMA merupakan media umum yang digunakan untuk menumbuhkan kapang dan sebagai media isolasi (Kumala et al. 2006). Media ini digunakan sebagai media kultivasi karena media tersebut merupakan media umum kaya nutrisi, yang mudah dicernakan sehingga memudahkan kapang endofit yang berhasil diisolasi untuk tumbuh. Peremajaan kapang endofit perlu dilakukan secara teratur untuk menjamin kapang endofit tidak berada pada fase kematian dipercepat dimana lebih banyak sel-sel yang mati daripada sel yang masih hidup (Gandjar et al. 2006). Pertumbuhan kapang pada media YMA dapat dilihat dari munculnya benang-benang putih (miselium) yang mengelilingi keping inokulan. Miselium
21
akan bertambah banyak dan mengikat keping-keping tersebut menjadi suatu bentuk yang padat dan terjalin kuat (Gandjar et al. 2006). Media YMA digunakan sebagai media pertumbuhan untuk identifikasi morfologi kapang sedangkan media YMB digunakan sebagai media ekstraksi senyawa aktif pada kapang. Kondisi lingkungan sangat dibutuhkan untuk menjadi faktor penentu terbentuknya metabolit sekunder. Media YMA dan YMB mengandung komponen yang sama, namun di media YMA ada penambahan agar setelah selesai disterilisasi. Pepton mengandung campuran asam amino bebas, peptida dan protease merupakan sumber utama nitrogen bagi mikroorganisme. Dari dua belas kapang endofit yang di kultivasi masing-masing mempunyai bentuk dan tekstur penampakan kultur kapang yang berbeda, hal ini menunjukkan bahwa dua belas kapang endofit yang didapatkan masing-masing berbeda. Selain itu pada hasil kultivasi hanya ada satu kultur yang terbentuk dalam setiap media, hal ini juga menunjukkan bahwa isolat kapang yang dikultivasi sudah monokultur (Rahman 2015). Ekstraksi Senyawa Aktif Kapang Endofit Daun Sirsak Proses ekstraksi senyawa aktif kapang endofit diawali dengan proses evaporasi menggunakan etil asetat. Ekstraksi diperlukan untuk mendapatkan senyawa yang diinginkan dalam endofit daun sirsak, pemilihan pelarut yang tepat dapat meningkatkan efisiensi ekstraksi. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pemilihan pelarut diantaranya adalah selektivitas, toksisitas, kepolaran, kemudahan untuk diuapkan dan harga pelarut (Akbar & Hendra 2010). Etil asetat merupakan pelarut dengan toksisitas rendah yang bersifat semi polar sehingga diharapkan dapat menarik senyawa yang bersifat polar maupun nonpolar dari endofit daun sirsak tersebut (Putri et al. 2013). Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah etil asetat. Etil asetat merupakan pelarut yang baik digunakan untuk ekstraksi karena dapat dengan mudah diuapkan, tidak higroskopis dan memiliki toksisitas rendah (Rowe et al. 2009; Wardhani & Sulistyani 2012). Etil asetat bersifat semi polar sehingga mampu menarik senyawa aktif yang terdapat dalam endofit daun sirsak (Tensiska & Yudiastuti. 2007). Adapun metode ekstraksi yang digunakan pada penelitian ini adalah metode maserasi dengan cara merendamkan bahan alam yang dikeringkan (simplisia) dalam suatu pelarut. Metode ini dapat menghasilkan ekstrak dalam jumlah banyak, serta terhindar dari perubahan kimia senyawa-senyawa tertentu karena pemanasan (Pratiwi & Sylvia 2008). Maserasi dilakukan berulang kali, masing-masing selama 15 menit pada suhu kamar, sampai filtrat dari kultur jamur endofit tidak berwarna lagi, yang menandakan semua senyawa yang berbobot molekul rendah sudah terekstraksi (Harborne 2006). Aktivitas Sitotoksik Senyawa Aktif Kapang Endofit Aktivitas sitotoksik ekstrak kapang endofit daun sirsak dilakukan dengan Uji MTT (uji 3-(4-5 dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium bromide). Prinsip kerja metoda ini adalah dengan mengukur aktivitas dehidrogenase mitokondria pada sel-sel hidup yang memiliki kemampuan untuk mengkonversi MTT menjadi formazan. Konsentrasi formazan yang berwarna biru dapat ditentukan secara
22
spektrofotometri visibel dan berbanding lurus dengan jumlah sel hidup karena reduksi hanya terjadi ketika enzim reduktase yang terdapat di dalam jalur respirasi sel pada mitokondria aktif (Chapdelaine 2001). Pengujian dilakukan untuk menentukan aktivitas sitotoksik ekstrak senyawa aktif kapang endofit daun sirsak dengan dosis efektifnya (IC50) pada sel kanker payudara (Rajbhandari et al. 2001). Pengujian sitotoksisitas secara in-vitro dilakukan sebagai langkah awal dalam penapisan senyawa-senyawa yang berpotensi sebagai antikanker. Metode uji sitotoksik yang dipilih adalah metode MTT. Metoda MTT memberikan hasil pengujian yang akurat karena dapat memberikan hubungan antara jumlah sel yang aktif dengan absorban yang diperoleh dari pengukuran yang digunakan untuk menentukan nilai IC50 (Inhibitory Concentration 50). IC50 merupakan konsentrasi yang dibutuhkan suatu senyawa untuk menginhibisi sebesar 50% (Behera et al. 2003). Metode MTT dilakukan pada microplate (96 sumur) dengan mengukur viabilitas sel berdasarkan prinsip kolorimetri dengan menggunakan microplate reader. Kontrol positif yang digunakan pada penelitian ini yaitu doksorubisin. Doksorubisin merupakan obat yang digunakan untuk kemoterapi. Kemoterapi merupakan terapi sistemik yang dapat digunakan untuk menghambat pertumbuhan kanker atau untuk membunuh sel kanker dengan obat-obat antikanker yang disebut sitostatika (Sukardja 2000). Untuk mengetahui kepadatan sel dilakukan perhitungan menggunakan haemocytometer dibawah mikroskop inverted pembesaran 10x. Sel yang dihitung adalah sel yang hidup, dimana sebelumnya telah dilakukan pewarnaan dengan tripan blue untuk membedakan antara sel yang hidup dan sel yang mati. Sel hidup berbentuk bulat dan bening dengan inti berbentuk bulat utuh ditengahnya, sedangkan sel mati memiliki bentuk yang tidak beraturan dan berwarna biru serta tidak memiliki inti. Pada preparasi sampel, ekstrak kapang endofit daun sirsak dilarutkan dalam DMSO. Pengenceran larutan induk sampel dalam DMSO dilakukan menggunakan medium (CCRC 2008). Pada pengujian pertama dilakukan dengan menggunakan satu konsentrasi yaitu 100 µg/mL dari 12 isolat setelah mendapat hasil %inhibisinya. Berdasarkan hasil yang ditunjukkan pada Gambar 10 terlihat bahwa 12 ekstrak kapang endofit daun sirsak yang diuji dengan menggunakan satu konsentrasi yang sama yaitu 100 µg/mL memiliki potensi yang baik untuk menghambat sel kanker MCF-7. Diantara dua belas ekstrak, di ambil empat ekstrak yang terbaik berdasarkan %inhibisinya yaitu: Sir-SM2, Sir-G6, Sir-G2 dan Sir-G5. Kemudian empat ekstrak yang terbaik tersebut di uji kembali menggunakan lima variasi konsentrasi yaitu dimulai 400 µg/mL, 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL dan 25 µg/mL. Hasil uji pada penghambatan aktivitas etil asetat kapang endofit daun sirsak tersebut kemudian dilakukan perhitungan untuk mencari nilai IC50. Foto mikroskopis sel kanker payudara yang diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak pada perbesaran 10x dapat di lihat pada Lampiran 7, kontrol sel MCF-7 (Lampiran 8) sedangkan kontrol positif menggunakan doksorubisin 0,5 dan 1 (Lampiran 9). Hasil uji statistika (Lampiran 18) memperlihatkan bahwa semua sampel memiliki aktivitas antikanker yang berbeda nyata (p<0.05) (Tabel 2). Aktivitas antikanker semakin baik apabila nilai IC50 semakin rendah. Sampel dari dua belas lokasi menunjukkan hasil yang baik untuk setiap pengujian. Ekstrak yang berasal dari Garut nomor 5 menjadi ekstrak dengan rata-rata hasil pengujian lebih baik
23
dibandingkan dengan ekstrak dari lokasi lainnya sebagai antikanker. Hal ini diduga karena pengaruh perbedaan habitat dan tempat tumbuh yang menyebabkan kandungan metabolit sekunder berbeda. Menurut Bourgaud et al. (2001) metabolit sekunder tiap tanaman akan berbeda menurut tempat hidupnya. Penelitian ini menggunakan jumlah sel kanker hidup dalam suspensi kultur adalah 7.75 x 106 sel/mL. Suspensi sel untuk setiap sumuran adalah 1.55 x 106/mL. Pada jumlah sel tersebut diharapkan sel kanker dapat bertahan hidup melewati siklus hidupnya dengan baik dalam waktu inkubasi 24-48 jam. Penentuan waktu inkubasi 24-48 jam adalah untuk mencegah berkurangnya ketersediaan nutrisi yang dikonsumsi oleh sel. Pada preparasi sampel, ekstrak kapang endofit daun sirsak dilarutkan dalam DMSO. Pengenceran larutan induk sampel dalam DMSO dilakukan menggunakan medium (CCRC 2008). Medium RPMI-1640 akan berfungsi maksimal dalam mengkultur sel kanker selama dua hari (Zarisman 2006). Sel yang digunakan adalah sel hidup yang dihitung dengan menggunakan hemasitometer dan untuk membedakan antara sel yang hidup dan sel yang mati digunakan pewarnaan dengan tripan blue. Sel hidup berbentuk bulat dan bening dengan inti berbentuk bulat utuh ditengahnya, sedangkan sel mati memiliki bentuk yang tidak beraturan dan berwarna biru serta tidak memiliki inti. Kontrol sel memperlihatkan keadaan morfologi sel yang masih normal. Perlakuan ekstrak kapang endofit daun sirsak dengan berbagai konsentrasi terhadap sel kanker payudara MCF-7 menunjukkan adanya pengaruh terhadap sel kanker MCF-7 dibandingkan dengan kontrol negatif secara morfologi. Perubahan morfologi (Gambar 11) seluler bisa disebabkan oleh apoptosis yang terjadi pada sel. Mekanisme apoptosis ini sering digunakan untuk menjelaskan mekanisme antikanker yang ditimbulkan oleh berbagai senyawa obat. Sel MCF-7 yang mengalami inhibisi karena diinduksi oleh ekstrak kapang endofit daun sirsak ini mungkin mengalami mekanisme apoptosis yang mengakibatkan terjadinya perubahan pada morfologi selnya. Perubahan morfologi seluler akibat mekanisme apoptosis ini dapat terjadi dalam beberapa tahapan, yaitu penyusutan densitas sel, kondensasi dan fragmentasi kromatin sel, serta fragmentasi inti sel (Wyllie 2010). Ekstrak kapang endofit daun sirsak melindungi sel-sel normal dari sel kanker dengan mengikat protein pada mitokondria sel kanker untuk memicu apoptosis tanpa merusak sel-sel disekitarnya (Selvendiran et al. 2003). Kontrol sel memperlihatkan keadaan morfologi sel yang masih normal dan pada konsentrasi 25 µg/mL terlihat morfologi sel sudah mengalami perubahan. Sel yang mengalami perubahan morfologi sel pada uji MTT tetap di hitung sebagai sel hidup. Pada konsentrasi 400 µg/mL terlihat morfologi sel sudah rusak, sehingga tidak dapat di hitung sebagai sel hidup karena sel sudah mati. Morfologi sel yang berbeda antara sel yang diberi perlakuan dengan ekstrak uji dengan konsentrasi 400 μg/mL dan 25 μg/mL dibandingkan dengan sel kontrol. Sebagian besar ekstrak daun sirsak memiliki kemampuan menghambat sel MCF-7 yang hampir sama dengan konsentrasi doksorubisin 0.5 µg/mL. Kondisi sel kanker MCF-7 pada konsentrasi ekstrak 25 µg/mL menunjukkan penghambatan nyata sel karena destruksi sel kanker yang banyak. Penghambatan sel kanker dari ekstrak sesuai dengan (Moghadamtousi et al. 2015) yang menggunakan ekstrak daun sirsak sebagai antikanker sehingga tidak menyebabkan efek samping yang buruk. Penelitian lainnya juga menguatkan pendapat jika ekstrak daun sirsak memiliki nilai IC50 sangat aktif (Fidianingsih & Handayani 2014).
24
Ekstrak terbaik (Garut nomor 5) diuji kembali dengan sel normal Chang. Antikanker diharapkan mempunyai toksisitas selektif artinya dapat menghancurkan sel kanker tanpa merusak jaringan normal (Nafrialdi 1995). Terbukti bahwa kapang endofit daun sirsak tidak memiliki toksisitas terhadap sel normal Chang dengan nilai IC50 sebesar 1258.925 µg/mL. Terlihat pada morfologi (Gambar 12) dimana sel normal Chang pertumbuhannya sangat baik, morfologi tidak berubah dan menempati seluruh permukaan well. Foto mikroskopis sel normal Chang yang diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak pada perbesaran 10x dapat di lihat pada Lampiran 10, kontrol sel MCF-7 (Lampiran 11) sedangkan kontrol positif menggunakan doksorubisin 0,5 dan 1 (Lampiran 12). Penelitian Harun et al. (2010) menyebutkan ekstrak etil asetat memiliki potensi sitotoksisitas terhadap sel MCF-7 melalui peningkatkan ekspresi protein LC3-A yang mengindikasikan kematian sel. The American National Cancer Institute menyatakan bahwa suatu ekstrak dikatakan memiliki aktivitas sitotoksik yang kuat sebagai agen antikanker jika nilai IC50 < 30 µg/mL (Itharat & Ooraikul 2007). Dari hasil uji MTT, diketahui bahwa ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak yang berasal dari Garut nomor 5 memiliki nilai IC50 sebesar 19.20 µg/mL. Dengan demikian, ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak dikatakan memiliki aktivitas sitotoksik dibandingkan dengan ekstrak dari isolat yang lain. Aktivitas sitotoksik pada sel MCF-7 kemungkinan disebabkan oleh kemampuan induksi apoptosis pada sel tersebut. Apoptosis merupakan kematian sel secara terprogram pada kondisi fisiologis maupun patologis (Xue et al. 2014). Kemampuan induksi apoptosis diduga berasal metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit. Pengamatan viabilitas sel dan pengujian MTT menunjukkan bahwa ekstrak kapang endofit daun sirsak mampu menginduksi apoptosis yang diindikasikan oleh penurunan viabilitas dan proliferasi sel. Mekanisme apoptosis pada sel MCF-7 kemungkinan berlangsung melalui jalur intrinsik yang berikatan dengan migrasi sitokrom C ke sitosol dan menghilangnya membran mitokondria (Xue et al. 2014 & Gogvadze et al. 2006). Apoptosis jalur intrinsik diawali dengan ekspresi gen penyandi protein Bax. Protein ini akan berinteraksi dengan mitokondria untuk melepas sitokrom C ke sitosol yang juga berhubungan dengan peningkatan migrasi ion Ca2+ ke sitoplasma (Gogvadze et al. 2006). Pada tahapan ini, fosfolipid anionik (Cardiolipin) terdisosiasi dari sitokrom C akibat pengikatan protein Bax (Gogvadze et al. 2006). Pada saat sitokrom C dilepas, aktivitas caspase3 berlangsung oleh caspase-9, yang diawali dengan fermentasi poli-ADP-ribose polymerase (PARP) (Gogvadze et al. 2006). Identifikasi Kandungan Senyawa Aktif dengan GC-MS pyrolysis Gass chromatography Mass Spectroscopy Pyrolisis (Py-GC-MS) merupakan perpaduan kromatografi gas dan spektroskopi massa. Py-GC-MS adalah alat yang digunakan untuk mengindentifikasi sampel secara kualitatif, sehingga hanya dapat diketahui senyawa-senyawa aktif yang terkandung di dalamnya dan dapat ditentukan strukturnya, belum dapat ditentukan dengan pasti konsentrasi masing-masing senyawa. Prinsip kerja Py-GC-MS adalah pemisahan senyawa berdasarkan perbedaan berat molekul (massa) setelah terionisasi menjadi ion yang lebih kecil (Harvey 2000).
25
Menurut Tri-Panji (2012) Py-GC-MS adalah suatu alat untuk penentuan struktur molekul senyawa organik, khususnya untuk senyawa organik yang cukup volatile. Perangkat Py-GC-MS dilengkapi dengan vakum hingga 10-6 torr yang sangat membantu dalam proses penguapan cuplikan dibandingkan dengan GC. PyGC-MS tidak memerlukan senyawa standar pembanding sudah ada didalam memory bank (basis data computer). Dengan demikian analisis dengan Py-GC-MS menjadi lebih murah. Analisis Py-GC-MS dilakukan pada ekstrak terbaik yang mampu menghambat sel MCF-7 yaitu ekstrak etil asetat. Analisis Py-GC-MS dalam penelitian ini spesifikasinya adalah GC-MS pirolisis QP2010 Shimadzu. Kolom yang digunakan Rtx-5MS (Fused Silica) dengan menggunakan gas pembawa Helium, pengaturan temperatur pada alat GC-MS pirolisis (colom, injection, ion source dan interface) agar diperoleh pemisahan yang baik sehingga senyawa yang terdapat dalam isolat nomor 5 asal Garut kapang endofit daun sirsak dapat diindentifikasi dengan MS dan hasil spektra massanya dibandingkan dengan database National Institute Standar and Tecnology (NIST) yaitu NIST 27 dan NIST 147 selain itu dibandingkan juga dengan database WILEY 7. Py-GC-MS digunakan untuk menganalisis kandungan kimia metabolit sekunder Sir-G5 kapang endofit daun sirsak (Tabel 4). Kapang endofit menghasilkan metabolit yang berbeda dengan kapang endofit lainnya. Metabolit kapang endofit umumnya tidak hanya mengandung satu jenis komponen kimia tetapi bisa lebih yang dapat bersifat sebagai antioksidan, antikanker, antidiabetes, antibakteri, antijamur dan antisepsis. Py-GC-MS mempunyai kelebihan yaitu sampel bisa dalam bentuk padatan atau cairan, sampel padatan tidak perlu diencerkan terlebih dahulu tapi langsung diinjeksikan saja pada kolom sampel. Hasil analisis terdeteksi tiga puluh puncak pada kromatogram yang keluar pada waktu retensi 7.178 sampai 21.542 menit dengan konsentrasi relatif (kemiripan) yang berbeda-beda. Namun, diantara senyawa-senyawa tersebut terdapat senyawa kimia yang teridentifikasi dengan konsentrasi tertinggi sehingga diduga senyawa tersebut merupakan senyawa aktif yang terkandung pada ekstrak. Hasil analisis dapat dilihat pada Lampiran 18 dan Lampiran 19. Komponen kimia yang terkandung pada metabolit sangat menentukan sifat antikanker metabolit kapang endofit. Beberapa komponen kimia tersebut telah dilaporkan memiliki peran sebagai antidiabetes, antikanker dan antimikrobal. Senyawa yang teridentifikasi (Lampiran 18) dapat di golongan menjadi beberapa kelompok senyawa, diantaranya: 1) alkaloid yaitu 2-Piperidinone (CAS) 2Piperidone, 5H-1-Pyrindine, 1H-Azepin-1-amine, N-ethylidenehexahydro- (CAS) Hexamethylenehydrazonen, Aziridine, 2-(1,1-dimethylethyl)-1-ethyl-3-methyl-, trans- (CAS) Trans-1-Ethyl-2,Methyl-3, Piperidine, 1-(cyanoacetyl)- (CAS) 1Cyanoacetylpiperidine, 2-Imidazolidinone, 1,3-Diethenyl-, 1,4-diaza-2,5dioxobicyclo[4.3.0]nonane, 1,4-diaza-2,5-dioxo-3-isobutyl bicyclo[4.3.0]nonane, Hexadecanenitrile (CAS) Palmitonitrile, 1,4-diaza-2,5-dioxo-3-isobutyl bicyclo[4.3.0]nonane, 9-Octadecenamide, (Z)- (CAS) Oleoamide, Pyridinium, 1hexadecyl-, chloride, monohydrate (CAS) Cetylpyridinium chlori, 2) Fenolik yaitu Phenol (CAS) Izal (Benzen), Phenol, 4-methyl- (CAS) p-Cresol (Benzen), Benzeneacetonitrile (Cas) Benzyl Cyanide (Benzen), 3,5-Heptadien-2-Ol, 2,6Dimethyl (Benzen), Benzenepropanenitrile (CAS) 3-Phenylpropionitrile (Benzen),
26
1,4-Cyclohexanedione (CAS) Tetrahydroquinone, 3) golongan asam lemak seperti Decanal (CAS) n-Decanal dan 9-Octadecenal (CAS) Octadecenyl aldehyde. Fenol adalah kandungan kimia yang ditemukan pada metabolit sir-G5 yang diduga berfungsi sebagai senyawa antidiabetes (Devi & Singh 2013). Alkaloid merupakan senyawa yang mengandung nitrogen yang bersifat basa dan mempunyai aktifitas farmakologis (Lumbanraja 2009). Bagi tumbuhan, alkaloid berfungsi sebagai senyawa racun yang melindungi tumbuhan dari serangga atau herbivore (hama dan penyakit), pengatur tumbuh atau sebagai basa mineral untuk mempertahankan keseimbanagan ion (Rohyani et al. 2015). Alkaloid bereaksi dengan asam membentuk kristal garam tanpa menghasilkan air. Mayoritas alkaloid ada dalam bentuk padat seperti atropin, beberapa dalam bentuk cairan yang mengandung karbon, hidrogen, dan nitrogen (Firn dalam Doughari 2012). Senyawa antrakuinon mempunyai beberapa macam fungsi yaitu antiseptik, antibakteri, antikanker (Gunawan & Mulyani 2004; Samuelsson 1999). Antrakuinon terhidroksilasi tidak sering terdapat dalam tumbuhan secara bebas tetapi sebagai glikosida. Banyak antrakuinon yang terdapat sebagai glikosida dengan bagian gula terikat dengan salah satu gugus hidroksil fenolik (Robinson 1995). Semua antrakuinon berupa senyawa kristal bertitik leleh tinggi, larut dalam pelarut organik basa. Antrakuinon bersifat lexsan, pada penggunaan yang berlebih dapat menimbulkan iritasi pada dinding intestinal. Antrakuinon dapat mempermudah buang air besar. Golongan senyawa alkaloid yang diduga dapat menghambat sel kanker yaitu piperidinone, piperidine, hexadecanenitrile. Menurut Bezerra et al. (2006) & Nishiumi et al. (2014) Senyawa aktif piperidinone, piperidine, hexadecanenitrile merupakan komponen aktif dalam penghambatan kanker yang terkandung pada ekstrak daun sirsak yang diduga memiliki efek sitotoksik yang baik terhadap sel kanker payudara MCF-7 dengan melihat nilai IC50 pada ekstrak. Penghambatan sel kanker ini diduga dipengaruhi oleh kerusakan DNA dan efek sitotoksik. Identifikasi Kapang Endofit Daun Sirsak Berbasis Amplifikasi ITS Ekstraksi DNA Sir-G5 kapang endofit daun sirsak menggunakan reagen nucleon PHYTOpure (Amersham LIFE SCIENCE) menghasilkan fragmen tunggal genom. Hal ini menunjukkan bahwa metode ekstraksi DNA yang telah dikembangkan untuk kapang atau tanaman dapat diaplikasikan, pita genom DNA yang bersih tanpa latar belakang mengindikasikan tingkat kemurnian DNA yang baik (DNA tidak terdegradasi dan terkontaminasi). RNAse digunakan untuk menghilangkan komponen RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh (Rozi 2012). Penentuan ukuran DNA total dilakukan dengan membandingkan pita sampel DNA total dan marker yang digunakan. Penentuan diperoleh dari hubungan yang linier antara jarak migrasi DNA dan ukuran logaritmik dari bobot molekul DNA (Perceka et al. 2014). Ukuran DNA berada pada ukuran diatas 10000 bp karena DNA memiliki bobot lebih besar daripada bobot marker terbesar. Adanya pita pada bagian awal proses migrasi menunjukkan bahwa DNA yang dihasilkan termasuk DNA total (Meryalita 2012) Data urutan DNA Internal Transcribed Spacer disejajarkan dengan program Clustal X (Hidayat et al. 2008). Konstruksi pohon filogenetik dengan metode neighbour-joining menggunakan program Phydit pohon
27
pilogenik (Sembiring et al. 2008). Analisis situs restriksi menggunakan program NEBcutter 2.0 (Muzuni et al. 2010). PCR merupakan suatu reaksi in-vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA cetakan dengan bantuan enzim DNA polymerase dan primer dalam suatu thermocycler. Ada empat komponen utama yang dibutuhkan untuk melakukan proses PCR yaitu DNA template (cetakan), primer, DNA polymerase dan dNTPs. Proses PCR memiliki tiga tahapan utama, yaitu pemisahan (denaturasi), penempelan primer (annealing), dan pemanjangan sekuen (extension) (Zulfahmi 2013). Gambar 14 menunjukkan bahwa ukuran gen ITS kapang endofit daun sirsak telah berhasil diamplifikasi menggunakan primer ITS 4 dan ITS 5 sebesar 550 pb. Ukuran basa tersebut juga didapatkan pada penelitian Yunianto et al. (2012) yang mengisolasi DNA kapang endofit dari tanaman genus Annona. Berdasarkan pohon filogenetik (Gambar 15) dapat diketahui bahwa isolat kapang endofit dari daun sirsak memiliki kekerabatan dekat dengan genus Phomopsis sp. Jarak kekerabatan antara kapang endofit dengan Phomopsis sp. sangat dekat. Phomopsis sp. merupakan kapang endofit yang biasanya berada pada tubuh tumbuhan (Slaninova et al. 2001). Secara identifikasi morfologi, ternyata kapang endofit dari daun sirsak memiliki kesamaan dengan Phomopsis sp. Adanya kesamaan tersebut memungkinkan kedua kapang tersebut memiliki perjalanan evolusi yang sama sehingga secara molekuler daerah gen ITS kedua kapang tersebut banyak memiliki kesamaan. Dengan demikian hasil identifikasi molekuler berbasis daerah gen ITS pada kapang endofit daun sirsak mengindikasikan genus Phomopsis sp. Hasil sekuensing gen ITS produk PCR menunjukkan kekerabatan yang tinggi dengan Phomopsis sp. LH243 dengan nilai bootstrap dari keduanya mencapai 97%, dan memiliki persen homologi sebesar 99,998% dan nilai indeks similaritas 99%. Hal ini sesuai karena gen ITS yang digunakan untuk sekuensing berasal dari kapang endofit daun sirsak. Daerah ITS dapat digunakan sebagai penanda keragaman genetika kapang yang dapat membedakan individu-individu dalam spesies yang sama (Purnamasari et al. 2012). Amplifikasi daerah ITS menggunakan primer umum yaitu ITS4/ITS5. Menurut Schoch et al. (2012) primer ITS4/ITS5 merupakan primer yang sering digunakan untuk mengidentifikasi fungi atau kapang yang telah teruji sebelumnya, ITS4/ITS5 spesifik untuk fungi dan basidiomycetes open reading frame dari rRNA yang merupakan sekuen yang siap untuk diekspresikan. ITS4/ITS5 juga bisa mengamplifikasi daerah ITS jamur karena bersifat komplemen satu sama lain. Selain itu ITS4/ITS5, mempunyai susunan basa untuk primer yang ideal serta variasi yang beragam.
28
6 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan Ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara dengan menghambat proliferasi sel kanker payudara secara in-vitro. Perolehan 12 kapang endofit menunjukkan aktivitas teraktif terhadap sel kanker MCF-7 yang berasal dari isolat Garut nomor 5 dengan nilai IC50 sebesar 19.20 µg/mL. Adapun pengujian pada sel normal (sel Chang) tidak menunjukkan efek sitotoksik dengan nilai IC50 sebesar 1258.92 µg/mL. Hasil uji analisis GC-MS pyrolysis pada ekstrak etil asetat kapang endofit teraktif (Garut nomor 5) mengandung senyawa-senyawa yang dilaporkan bersifat antikanker, diantaranya piperidinone, piperidine, hexadecanenitrile. Kapang endofit asal Garut nomor 5 tersebut berdasarkan identifikasi molekuler berbasis daerah gen ITS memiliki kemiripan dengan genus Phomopsis sp. dengan nilai homolog mencapai 99,998%. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pengaruh pemberian ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak terhadap sel kanker secara in-vivo dan uji klinik agar dapat digunakan sebagai landasan penggunaan endofit daun sirsak sebagai antikanker. Pada penelitian ini digunakan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak yang mengandung berbagai senyawa aktif. Oleh karena itu perlu dilakukan isolasi senyawa aktif yang berperan sebagai antikanker.
DAFTAR PUSTAKA Abubacker MN, Deepalakshmi T. 2013. In-vitro antifungal potentials of bioactive compound methyl ester of hexadecanoic acid isolated from Annona muricata Linn. (Annonaceae) leaves. Biosci Biotech Res Asia. 10(2):879884.doi:10.13005/bbra/1211. Adamson JW, Longo DL. 2005. Anemia and Polycethemia. Harisson’s Prin of Int th Med. 16 ed. New York (USA): McGraw-Hill Companies. Agudelo D, Philippe B, Gervais B, Heidar ATR. 2014. Intercalation of antitumor drug doxorubicin and its analogue by DNA duplex: structural features and biological implications. IJBioMac. 66:144150.doi:10.1016/j.ijbiomac.2014.02.028. Agusta A. 2009. Biologi dan Kimia Kapang Endofit. Bandung (ID): ITB Pr. Agusta A. 2013. Nerolidol, komponen kimia aromatik tanaman teh yang juga diproduksi oleh jamur endofit Schizophyllum sp. D. J Ber Biol. 12 (2):77181. Akbar, Hendra R. 2010. Isolasi dan identifikasi golongan flavonoid daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) berpotensi sebagai antioksidan [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
29
Alam M, Alandis Nm, Shaik Mr, Khan S, Alomar Sy. 2014. Synthesis, spectroscopic and biological activities of aromatic Schiff base. AJCHEM. 26(21):7377-7380.doi:10.14233/Ajchem.2014.17036. Al-Amri FA, Saeedi MY, Al-Tahan FM, Ali AM, Alomary SA, Arafa M, Ibrahim AK, Kassim KA. 2015. Breast cancer correlates in a cohort of breast screening program participants inriyadh, KSA. JNCI. 27:7782.doi:10.1016/j.jnci.2015.04.002. Ali SH. 2009. The world of β-glucan: a review of biological roles, applications and potential areas of research [tesis]. TromsØ: Institute of Medical Biology, Faculty of Medicine: University of Tromsø, Norway. Amudha M, Rani S. 2014. GC-MS Analysis of bioactive components of Cordia retusa (Boraginaceae). Hygeia J D Med. 6(1):1219.doi:10.15254/H.J.D.Med.6.2014.117. Aourahoun A, Fazouane F, Benayad T, Bettache Z, Denni N. 2014. The synthetic antioxidant butylated hydroxytoluene, a naturally occurring constituent of the broom Cytisus triflorus L’Hérit. J Nat Prod.7:58-64. Bacon CW, White JF. 2000. Microbial Endophytes. New York (US): Marcel Dekker. Beena, Kumar D, Kumbukgolla W, Jayaweera S, Bailey M, Alling T, Ollinger J, Parishc T, Rawat DS. 2014. Antibacterial activity of adamantyl substituted cyclohexane diamine derivatives against methicillin resistant Staphylococcus aureus and Mycobacterium tuberculosis. RSC Adv. 4:11962-11966.doi:10.1039/c4ra00224e. Behera BC, Adawadkar B, Makhija U. 2003. Inhibitory activity of xanthine oxidase and superoxide-scavenging activity in some taxa of the lichen family Graphidaceae. Phytomed. 10:536-543.doi:10.1078/094471103322331511. Bezerra DP, Castro FO, Alves AP, Pessoa C, Moraes MO, Silveira ER, Lima MA, Elmiro FJ, Costa-Lotufo LV. 2006. In vivo growth-inhibition of Sarcoma 180 by piplartine and piperine, two alkaloid amides from Piper. Braz J Med Biol Res. 39(6):801-806.doi:10.1590/S0100-879X2006000600014. Bharat N, Irshad Md, Rizki MA, Fatma T. 2013. Antimicrobial and Cytotoxic Activities of Cyanobacteria. IJIRSET. (2)9:1-16. Bintang M. 2010. Biokimia: Teknik Penelitian. Jakarta (ID): Erlangga. Bintang M, Purwanto UMS, Kusumawati DE, Yang JJ. 2015. Study of endophytic bacteria as novel source of antioxidant agent based on GC-MS analysis. IJCEBS. (3)5:368-369. Bourgaud F, Gravol A, Milesi S, Gontier E. 2001. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant sci. 161:839851.doi:10.1016/S0168-9452(01)00490-3. Boyer R. 2010. Modern Experimental Biochemistry. San Francisco (US): Benjamin-Cummings. [CCRC] Cancer Chemoprevention Research Center. 2008. Protokol in-vitro CCRC. Yogyakarta (ID): Fakultas Farmasi UGM. Champy P, Melot A, Guérineau V, Gleye C, Fall D, Gunter U, Höglinger MD, Ruberg M, Lannuzel A, Laprévote O et al. 2005. Quantification of acetogenins in Annona muricata linked to atypical Parkinsonism in Guadeloupe. MDS. 20(12):1629–1633.doi:10.1002/mds.20632.
30
Chapdelaine JM. 2001. MTT Reduction-A Tetrazolium-Based Colorimetric Assay for Cell Survival and Proliferation, Aplication Note 5, MAXlineTm Microplate Readers. Clay K. 2004. Fungi and the food of the gods. Nature. 427:401-402. Collin OL, Zimmermann CM, Jackson GP. 2009. Fast gas chromatography negative chemical ionization tandem mass spectrometry of explosive compounds using dynamic collision-induced dissociation. IJMS. 279(23):93–99. doi:10.1016/j.ijms.2008.10.009. Consolacion R, Geneveve S, Oscar T, Ming-Jaw D, Chien-Chang S. 2012. Acetogenesis from Annona muricata. J PHCOG. 4(32):3237.doi:10.5530/pj.2012.32.7. Creixell M, Peppas NA. 2012. Co-delivery of siRNA dan Therapeutic Agents Using Nanocarriers to Overcome Cancer Resistance. J nanotoday. 7:367379.doi:10.1016/j.nantod.2012.06.013. Debbie S, Graeme L, Pierre D, Elizabeth W, Kelvin C. 2012. Pharmacovigilance of herbal medicine. JJEP. 140:513-518.doi:10.1016/j.jep.2012.01.051. Devi NN, Singh MS. 2013. GC-MS analysis of metabolites from endophytic fungus colletotrichum gloeosporioides isolated from phlogacanthus thyrsiflorus nees. Int J Pharm Sci Rev Res. 23(2):392-395. Doughari JH. 2012. Phytochemicals: Extraction Methods, Basic Structures and Mode of Action as Potential Chemotherapeutic Agents. Nigeria: Departement of Microbiology, School of Pure and Applied Science, Federal University of Technology, Yola. Dwitarhayani M. 2012. Nanopropolis sebagai penghambat proliferasi sel kanker payudara MCF-7 [skripsi]. Bogor: Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor Emling RC. 2011. Evidence of the Efficacy of an Alcohol-Free Mouthwash Containing Cetylpyridinium Chloride. J ClinDent. 22(6):179-204. Eriksson D, Stigbrand T. 2010. Radiation-induced cell death mechanisms. Tumor Biol. 31(4):363-372.doi:10.1007/s13277-010-0042-8. Fidianingsih I, Handayani ES. 2014. Annona muricata aqueous extract suppresses T47D breast cancer cell proliferation. Univ Med. 33(1):19-26. Firn R. 2010. Nature’s Chemicals. Oxford: Oxford University Press. Gandjar I, Syamsuridzal W, Oetari A. 2006. Mikologi Dasar dan Terapan. Jakarta (ID): Yayasan Obor Indonesia. Gangadhara S, Prasad C, Venkateswarlu P. 2015. Synthesis, antimicrobial and antioxidant activity of piperidine analog containing trans cinnamamides. IAJPR. 5(3):1280-1287. Gogvadze V, Orrenius S, Zhivotovsky B. 2006. Multiple pathways of cytochrome C release from mitochondria in apoptosis. BBA. 1757:639647.doi:10.1016/j.bbabio.2006.03.016. Gunawan D, Mulyani S. 2004. Ilmu Obat Alam (Farmakognosi). Jakarta (ID): Penebar Swadaya. Hahn DB, Payne WA. 2003. Focus on Health. New York: Mc-Graww Hill. Hajslova J, Cajka T. 2007. Gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS). Prague: Institute of Chemical Technology, Inc Hanahan, D, Weinberg RA. 2000. The hallmarks of cancer review. Cell. 100(1):57– 70.doi:10.1016/S0092-8674(00)81683-9.
31
_________________________. 2011. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell.doi:10.1016/j.cell.2011.02.013. Harborne. 2006. Metode Fitokimia. Ed ke-2. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah; Bandung (ID): ITB Pr. Terjemahan dari: phytochemical Methods. Harun F, Jamalullail SM, Yin KB, Othman Z, Tilwari A, Balaram P. 2010. Autophagic cell death is induced by acetone and ethyl acetate extracts from eupatorium odoratum in-vitro: effects on MCF-7 and vero cell lines. kelantan: institute for research in molecular medicine (INFORMM). Scientific World J.doi:10.1100/2012/439479. Harvey D. 2000. Modern analytical chemistry. The McGraw-Hill Companies, Inc. Columbus, OH Hasan AEZ, Mangunwidjaja D, Sunarti TC, Suparno O, Setiyono A. 2014. Investigating the antioxidant and anticytotoxic activities of propolis collected from five regions of Indonesia and their abilities to induce apoptosis. EJFA. 26(5):390-398.doi:10.9755/ejfa.v26i5.16549. Hermawan GP, Laksono H. 2013. Ekstraksi daun sirsak (Annona muricata L.) menggunakan pelarut etanol. JTKI. 2(2):111-115. Hidayat T, Kusumawaty D, Yati D D, Muchtar A, Mariana D. 2008. Analisis filogenetik molekuler pada phyllanthus niruri l. (euphorbiaceae) menggunakan urutan basa DNA Internal Transcribed Spacer (ITS). Bandung: Jurusan Biologi Fakultas Matemateka dan Ilmu Pengetahuan (ITB). Hiraishi A, Kamagata Y, Nakamura K. 1995. Polymerase chain reaction amplification and restriction fragment length polymorphism analysis of 16S rRNA genes from methanogens. J Ferment Bioeng. 79(6):523529.doi:10.1016/0922-338X(95)94742-A. Holliday D, Speirs V. 2011. Choosing the right cell line for breast cancer research. Leeds Institute of Molecular Medicine, University of Leeds. UK [IARC] International Agency for Research on Cancer. 2013. Latest World Cancer Statistics. Lyon (FRA): International Agency for Research on Cancer. Itharat A, Ooraikul B. 2007. Research on thai medicinal plants for cancer treatment. Med Plant Res. 1(2):287-317. Jasim H, Hussein AO, Hameed IH, Kareem MA. 2015. Characterization of alkaloid constitution and evaluation of antimicrobial activity of Solanum nigrum using gas chromatography mass spectrometry (GC-MS). J Pharma Phytother. 7(4):57-73.doi:10.5897/JPP2015.0346. Kankeaw U, Masong E. 2015. The antioxidant activity from hydroquinone derivatives by the synthesis of cinnamomium verum j.presl bark’s extracted. IJCEA. 6(2):1-4.doi:10.7763/IJCEA.2015.V6.458. Katzung BG, Susan BM, Anthony JT. 2013. Farmakologi dasar dan klinik. Jakarta (ID): Electrocardiogram (EGC). Keerthiga M, Anand SP. 2015. Bioactive compound evaluation of ethanol extract from geodorum densiflorum (lam.) schltr. by GC-MS analysis. IJPR. 5(6).doi:10.7439/ijpr. [KEMENKES] Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. 2013. Seminar sehari dalam rangka memperingati hari kanker sedunia 2013. http://www.depkes.go.id/index.php/berita/press-release/2233-seminar-
32
sehari-dalam-rangka-memperingati-hari-kanker-sedunia-2013.htmL [14 Juni 2013]. Kentjono AW. 2001. Pengaruh vaksinasi BCG dalam meningkatkan respon Th1 dan respon terhadap radiasi pada karsinoma nasofaring [disertasi]. Surabaya: Universitas Airlangga. Kumala S, Syarmalina, Handayani AR. 2006. Isolasi dan uji antimikroba substansi bioaktif mikroba endofit ranting tanaman johar (Cassia siamea Lamk). JIKI. 4(1):8-14. Kumar V, Bhatnagar AK, Srivastava JN. 2011. Antibacterial activity of crude extracts of Spirulina platensis and its structural elucidation of bioactive compound. J Med Plants Res. 5(32):7043-7048. Kuppuswamy KM, Jonnalagadda B, Arockiasamy S. 2013. GC-MS Analysis of Chloroform Extract of Croton Bonplandianum. Int J Pharm Bio Sci. 4(4):613–617. Li N, Hua QH, Gen SZ, Wei C. 2013. Effect of 5- AZn-2 '-deoxycytidine on proliferation of human lung adenocarcinoma cell line A549 in-vitro. APJTM.982-985. [LLC] Gaylord Chemical Company. Technical Bulletin Reaction Solvent Dimethyl Sulfoxide (DMSO), pp 649-5464. Lumbanraja LB. 2009. Skrining fitokimia dan uji efek antiinflamasi ekstak etanol daun tempuyang (Sonchus arvenis L.) terhadap radang pada tikus. Medan: Universitas Sumatera Utara. Mahboubi M, Feizabadi MM. 2009. Antimicrobial activity of ducrosia anethifolia essential oil and main component, decanal against methicillin resistant and methicillin-susceptible staphylococcus aureus. JEOBP. 12(5):574579.doi:10.1080/0972060X.2009.10643760. Mangan Y. 2009. Solusi Sehat Mencegah dan Mengatasi Kanker. Jakarta (ID): Agromedia Pustaka. Mathur M, Kamal R. 2011. Studies on trigonelline from Moringa oleifera and ITS in-vitro regulation by feeding precursor in cell cultures. Rev Bras Farmacogn/Braz J Pharmacogn.1-8. Matjik A, Sumertajaya IM. 2013 Research Design. Bogor (ID): IPB Pr. McLaughlin JL. 2008. Paw paw and cancer: Annonaceous acetogenins from discovery to commercial products. J Nat Prod. (71):1311-1321. Meryalita R. 2012. Analisis keragaman genetik kunyit (Curcuma longa Linn) dan temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.) budidaya tanah jawa berdasarkan penanda molekuler RAPD [tesis]. Bogor (ID): Insitut Pertanian Bogor. Moghadamtousi SZ, Rouhollahi E, Karimian H, Fadaeinasab M, Firoozinia M, Abdulla MA, Kadir HA. 2015. The chemopotential effect of Annona muricata leaves against azoxymethane-induced colonic aberrant crypt foci in rats dan the apoptotic effect of acetogenin annomuricin e in ht-29 cells: a bioassay-guided approach. J Pone.doi:10.1371/journal.pone.0122288. Mulyatni AS, Priyatmojo A, Purwantara A. 2011. Sekuen Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA ribosomal Oncobasidium theobromae dan jamur sekerabat pembanding. Menara Perkebunan. 79(1):1-5. Murray RK, Daryl KG, Victor WR. 2009. Biokimia Harper Edisi 27. Jakarta: GC. Mutunzi F, Dikio D, Makhwaje A, SipamLa, Modise SJ. 2013. GC-MS analysis of hexane extract of bolusanthus speciosus stem bark. Asian Plant. 3(2):27-30.
33
Muzuni SD, Suharsono UW, Suharsono. 2010. Isolasi dan pengklonan fragmen cdna gen penydani h+-atpase membran plasma dari Melastoma malabathricum L. J Agro Indo. 38(1):67-74. Muzuni, Adi DA, Syari S. 2014. Karakterisasi fragmen gen 18S rRNA pokea (batissa violacea celebensis martens, 1897) di sungai pohara kecamatan sampara kabupaten konawe. Biowallacea. 1(1):25-38. Nafrialdi GS. 1995. Pharmacology and therapy. Ed ke-4. Medical Faculty of Indonesian University: Jakarta. Nishiumi S, Suzuki M, Kobayashi T, Matsubara A, Azuma T, Yoshida M. 2014. Metabolomics for biomarker discovery in gastroenterological cancer review. J Metabolites. 4:547-571.doi:10.3390/metabo4030547. Novianti FA, Purnami SW. 2012. Analisis diagnosis pasien kanker payudara menggunakan regresi logistik dan support vector machine (svm) berdasarkan hasil mamografi. J Sains dan Seni ITS. 1(1):147-152. Nugroho TT, Rambae E, Dewi A, Fitri RM, Sepriyani H, Restuhadi F, Haryani Y. 2013. Optimasi isolasi dan amplifikasi ITS DNA ribosomal fungi karbolitik isolat zona inti cagar biosfer giam siak kecil-bukit batu. Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung: Universitas Lampung. Nursafitri K, Sari I, Sari R, Winda AK, Harti A. 2013. Kegunaan daun sirsak (Annona muricata L.) untuk membunuh sel kanker dan pengganti kemoterapi. J Kesmadaska. Keperawatan STIKes Kusuma Husada Surakarta: Surakarta.100-115. O`Donnell K. 1996. Progress towards a phylogenetic classification of Fusarium. Sydowia. 48 (1):57-70. Pangastuti A. 2006. Definisi Spesies prokaryota berdasarkan urutan basa gen penyandi 16s rRNA dan gen penyandi protein. Bio. 7(3):292-296. Pelczar JR, Chan ES. 1996. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta (ID): UI Pr. Perceka, ML, Nurhayati T, Nurilmala M. 2014. Karakterisasi ekstrak kasar polifenoloksidase dari udang vaname (characterization of crude polyphenoloxidase from white shrimp). Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Polgar C, Major T. 2009. Current status and perspectives of brachytherapy forbreast cancer. Int J Clin Oncol. 14(1):7–24.doi:10.1007/s10147-008-0867-y. Pomper KW. 2009. Acetogenin Update. www.pawpaw.kysu.edu/PDF/AcetoUp date3.pdf (Januari 2013). Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta (ID): Penerbit Erlangga. Priya V, Jananie RK, Vijayalaksmi K. 2011. GC/MS determination of bioactive components of Trigonella foenum grecum. J Chem Pharm Res. 3(5):35-40. Purnamasari MI, Prihatna C, Gunawan AW, Suwanto A. 2012. Isolation and molecular identification of Ganoderma spp. associated with basal stem rot disease in oil palm. JFI. 8(1):9-15.doi:10.14692/jfi.8.1.9. Purwatiningsih T, Alamudin A, Noorwati S. 2008. Deskripsi data rekam medis penyakit kanker payudara rumah sakit kanker dharmais pada bulan oktober tahun 1993 sampai dengan bulan maren tahun 2003 [tesis]. Bogor (ID): Insitut Pertanian Bogor. Putri WS, Warditiani NK, Larasanty LPF. 2013. Skrining fitokimia ekstrak etil asetat kulit buah manggiS (Garcinia mangostana L.). Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam: Universitas Udayana.
34
Rahman F. 2015. Uji aktivitas ekstrak jamur endofit dari daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap viabilitas khamir Saccharomyces cerevisiae dan Candida tropicalis [skripsi]. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam: Institut Pertanian Bogor. Rajbhdanari M, Wegner U, Julich M, Schopke T, Mentel R. 2001. Screening of nepalese medicinal plants for antiviral activity. JETHPHARM. 74:251255.doi:10.1016/S0378-8741(00)00374-3. Raymond WR. 2007. Cancer Biology. Edisi ke-4. Michigan (US): Oxford University Pr. Retnani V. 2011. Pengaruh suplementasi ekstrak daun Annona muricata terhadap kejadi dan isplasia epitel kelenjar payudara tikus sprague dawley yang diinduksi 7,12-dimetilbenz(a)antrasena (DMBA [skripsi]. Semarang: Universitas Diponegoro. Rishika D, Sharma R. 2012. An update of Pharmacological Activity of Psidium guajava in the management of various disorder. Int J Pharm Sci Res. 3(10):3577-3584. Riswanto K, Julian AR, Megawati S. 2011. Pengembangan dessert lezat pembunuh sel kanker: sherbet sirsak. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Robinson T. 1995. Kandungan organik tumbuhan tinggi. Terjemahan: Koensoemardiyah. IKIP Semarang Press, Semarang. Rodriguez FJM, Pinedo DM, Nodarse M. 2010. Assessment of scientific evidence recommending Annona muricata L. (soursop tree) for cancer prevention or treatment. Rev Cu Plant Med. 15(3):169-181. Rohyani IS, Aryanti E, Suripto. 2015. Kandungan fitokimia beberapa jenis tumbuhan lokal yang sering dimanfaatkan sebagai bahan baku obat di Pulau Lombok. PSNMBI. 1(2):388-391.doi:10.13057/psnmbi/m010237. Rowe RC, Sheskey PJ, Quinn ME. 2009. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Lexi-Comp: American Pharmaceutical Association. Rozi. 2012. Manfaat Kacang Hijau bagi Kesehatan. [Online]. [diunduh 2012 okt 18]. Tersedia pada: http//rozi.wordpress.Com/2011/08/15/manfaatkacanghijau-bagi-kesehatan/. Sambrook J, Russel DW. 2001. MoIecular Cloning – A Laboratory Manual 3th edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Samuelsson G. 1999. Drugs of natural or igin. 4th ed. Apotekar Societeten: Stockholm. Schoch CL, Seifertb KA, Huhndorfc S, Robertd V, Spougea JL, Levesqueb CA, Chenb W, Consortiuma FB. 2012. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. PNAS. 109(16):6241-6246.doi:10.1073/pnas.1117018109. Schulz B, Boyle C. 2005. The endophytic continuum. Mycol Res. 109(6):661-686. doi:10.1017/S095375620500273X. Seifert KA, Samson RA, Dewaard JR, Houbraken J, Levesque CA, Moncalvo JM, Louis-Seize G, Hebert PDN. 2007. Prospects for fungus identification using CO1 DNA barcodes, with Penicillium as a test case. Proc Natl Acad Sci. 104(10):3901-3906.doi:10.1073/pnas.0611691104. Selvendiren KJP, Sigh KB, Krishnan D, Sakthisekaran. 2003. Cytoprotective effect of piperine against benzo[a]pyrene induced lung cancer with reference to
35
lipid peroxidation and antioxidant system in swiss albino mice. J Fitote. (74):109-115.doi:10.1016/S0367-326X(02)00304-0. Sembiring L, Susilawati L, Suhartanti D. 2008. Seleksi, karakterisasi dan identifikasi bakteri Ppndegradasi 2-(thiocyanomethylthio) benzothiazole (TCMTB). Biota. 13(3):126-131. Setyowati FM, Wardah. 2007. Keanekaragaman tumbuhan obat masyarakat Talang mamak di sekitar taman nasional bukit tigapuluh, Riau. Biodiversitas. 8:228-232. Sivagurunathan A, Innocent XB. 2014. GC-MS Evaluation of bioactive compounds of Marsilea quadrifolia Linn (Aquatic Fern). IJPRS. (3):I-1. Skoog, Douglas AW, Donald M, Holler FJ. 1996. Analytical Chemistry. Saunders College Publishing: Amerika. Slaninova I, Taborska E, Bochorakova H, Slanina J. 2001. Interaction of benzo[c]phenanthridine and protoberberine alkaloids with animal and yeast cells. Cell Biol Toxicol. 17(1):51-63.doi:10.1023/A:1010907231602. Souza M, Bevilaqua C, Morais S, Costa C, Silva A, Braz-Filho R. 2008. Anthelmintic acetogenin from Annona squamosa L. seeds. An Acad Bras Cienc. 80(2):271-277.doi:10.1590/S0001-37652008000200005. Strobel GA. 2004. Natural product from endophytic microorganisme. J Nat Prod. 67(2):257-268.doi:10.1021/np030397v. Strobel GD. 2003. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural product. Microbiol Mol Biol Rev. 67(4):491502.doi:10.1128/MMBR.67.4.491-502.2003. Sukardja IDG. 2000. Onkologi Klinik. Surabaya (ID): Airlangga Universitas Press. Tan RX, Zou WX. 2001. Endophytes: a rich source of functional metabolites. Nat Prod Rep. 18(4): 448-459. Tensiska M, Yudiastuti. SON 2007. Pengaruh Jenis Pelarut Terhadap Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kasar Isoflavon dari Ampas Tahu. Laporan Penelitian. Tim CancerHelps 2010. Stop Kanker (Kanker Bukan Lagi Vonis Mati) Panduan Deteksi Dini dan Pengobatan Menyeluruh berbagai jenis kanker. Jakarta (ID): Agro Media Pustaka. Toyosi D, Olu M, Alamu EA. 2013. Preliminary antibacterial and phytochemical screening of three medicinal plants used in the folkloric treatment of skin infection. Int J Res Ayurveda Pharm. 4(4):547-550.doi:10.789/22774343.04419. Tri-Panji. 2012. Teknik Spektroskopi untuk Elusidasi Struktur Molekul. Yogyakarta (ID): Graha Ilmu Uzuner H. 2012. Traditional chinese medicine research in the post-genomic era: good practice, priorities, challenges and opportunities. JETHPHARM. 140:458-468.doi:10.1016/j.jep.2012.02.028. Veta M, Van DPJ, Willems SM, Wang H, Madabhushi A, Cruz-Roa A, Gonzalez F, Larsen ABL, Vestergaard JS, Dahl AB et al. 2014. Assessment of algorithms for mitosis detection in breast cancer histopathology images. Med Ima Anal.doi:10.1016/j.media.2014.11.010. Wardhani LK, Sulistyani N. 2012. Uji aktivitas antibakteri ekstrak etil asetat daun binahong (Anredera scandens (L.) Moq.) terhadap Shigella Flexneri beserta profil kromatografi lapis tipis. J Ilmiah Kefarmasian. 2(1):1-16.
36
White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. 1990. Amplification and Direct Sequencing of Fungal Ribosomal RNA Genes for Phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. [WHO] World Health Organization. 2013. World Cancer Day 2013. [terhubung berkala]. http://www.who.int/cancer/en/index.htmL. [15 April 2013]. Wicaksono. 2011. Anticancer and antimicrobial potential of plantderived natural products.In: Rasooli I, editor. Phy bio. Croatia: InTech.doi:10.5772/26077. Winarto WP. 2007. Pengobatan Herbal untuk Kanker Payudara. Jakarta (ID): Karyasari Herbal Media. Woodward WA, Cox JD. 2008. Molecular basis of radiation therapy. In: Mendelsohn J (Ed). The Molecular Basis of cancer. Philadelphia. Saunders Elsevier. Pp 593-604. Rahayu WP, Achmad A, Ekowati H. 2012. Aktivitas antiproliferatif jintan hitam (Nigell Sativa) pada sel paru tikus yang diinduksi 7,12-Dimetilbenz[a]Antrasena (Dmba). Mekara Kesehatan. 16(2):51-56. Wunderlich JR, Restifo NP. 2006. Cancer: principles and practice of oncology, fifth edition vincent T. Philadelphia. 3:47-75. Wyllie AH. 2010. Apoptosis, Cell Death, and Cell Proliferation. 3rd Ed. Roche Applied Science. Xue X, Yu JL, Sun DQ, Kong F, Qu XJ, Zou W, Wu J, Wang RM. 2014. Curcumin induces apoptosis in SGC-7901 gastric adenocarcinoma cells via regulation of mitochondrial signaling pathways. APJCP. 15(9):39873992.doi:10.7314/APJCP.2014.15.9.3987. Yeo YL, Chia YY, Lee CH, Sow HS, Yap WS. 2014. Effectiveness of maceration periods with different extraction solvents on in-vitro antimicrobial activity from fruit of Momordica charantia L. JAPS. 4(10):016023.doi:10.7324/JAPS.2014.40104. Yunianto P, Rosmalawati S, Rachmawati I, Suwarso WP, Sumaryono W. 2012. Isolation and identification of endophytic fungi from Srikaya plants (Annona squamosa) having potential secondary metabolites as anti-breast cancer activity. J Microbiol Indones. 6(1):23-29. Zairisman SZ. 2006. Potensi ilmu nomodulator bubuk kakao bebas lemak sebagai produk substdanard secara in-vitro pada sel limfosit manusia [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Zeng L, Wu FE, Oberlies NH, Mc Laughlin JL, Sastrodihardjo S. 1996. Five new monotetrahydrofuran ring acetogenins from the leaves of Annona muricata. J Nat Prod. 59(11):1035-1042. Zuhud E. 2011. Bukti Kedahsyatan Sirsak Menumpas Kanker. Jakarta (ID): Agromedia Pustaka. Zulfahmi. 2013. Penanda DNA untuk analisis genetic tanaman. J Agrotek. (3)2:4152.
37
Lampiran 1 Bagan Alir Penelitian Peremajaan Isolat Kultivasi Isolat Skrining Antikanker MCF-7
Ekstrak si Skrining Antikanker MCF-7 Data
4 isolat terpilih (Sir-G5, Sir-SM2, Sir-G6, Sir-G2) berdasarkan %inhibisi
Isolat terpilih (Sir-G5)
Sel Normal Chang
Identifikasi Molekuler (ITS) PCR
Uji Aktivitas (Uji IC50)
Identifikasi Molekul (GC-MS) pirolisis
Data
Data
Sequencing
Genebank
Jenis Kapang
38
Lampiran 2 Contoh perhitungan nilai IC50 ekstrak etil asetat dari kapang endofit daun sirsak dengan menggunakan sel kanker (MCF-7)
Persentase penghambatan pada konsentrasi 100 µg/mL Absorbansi kontrol – Absorbansi sampel % Inhibisi
=
x 100% Absorbansi kontrol 0.454 - 0.097
% Inhibisi
=
x 100% 0.454
% Inhibisi
=
78.634 %
Ekstrak Sir-G5 Ulangan 1
Ekstrak Sir-G5 Ulangan 2
Y = 27.56 + 1.010 X - 0.004735 X**2 + 0.000007 X**3
Y = 46.51 + 0.3399 X - 0.000529 X**2
100
100
Persen Inhibisi
90
80 70
80 70
60 S R-Sq R-Sq(adj)
50
S R-Sq R-Sq(adj)
60
5.21660 98.2% 93.0%
1.29663 99.8% 99.5%
50
0
100 200 300 Konsentrasi Ekstrak µg/mL
400
0
100 200 300 Konsentrasi Ekstrak µg/mL
Ekstrak Sir-G5 Ulangan 3 Y = 42.14 + 0.3678 X - 0.000576 X**2
100 90 Persen Inhibisi
Persen Inhibisi
90
80 70 60
S R-Sq R-Sq(adj)
5.32127 96.6% 93.3%
50 0
100 200 300 Konsentrasi Ekstrak µg/mL
400
400
39
Kurva hubungan konsentrasi ekstrak etil asetat dari kapang endofit daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap persentase penghambatan sel MCF-7 dari masing-masing ulangan dapat dilihat pada table dibawah ini: Sampel
1 2 3
Ekstrak Sir-G5
IC50
Konsentrasi
Ulangan 400
200
100
50
25
95.154 97.783 96.930
104.392 104.126 104.421
105.463 96.053 94.342
82.145 71.754 64.070
58.797 66.432 66.263
perulangan
25.000 10.450 22.150
IC50 keseluru han 19.20
µg/mL
Lampiran 3 Contoh perhitungan nilai IC50 ekstrak etil asetat dari kapang endofit daun sirsak dengan menggunakan sel normal (Chang)
Persentase penghambatan pada konsentrasi 100 µg/mL Absorbansi kontrol – Absorbansi sampel % Inhibisi
=
x 100% Absorbansi kontrol 0.558 - 0.372
% Inhibisi
=
x 100% 0.558
% Inhibisi
=
33.333 %
45
y = 15.26x + 2.6436 R² = 0.9564
40 35
Inhibisi (%)
30 25
20 15 10 5 0 0
0.5
1
1.5
2
Log Konsentrasi ekstrak µg/mL
2.5
3
40
Kurva hubungan konsentrasi ekstrak etil asetat dari kapang endofit daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap persentase penghambatan sel normal (Chang). IC50 = x saat y = 50 Rumus persamaan garis: y = ax + b y = 15.26x + 2.6436 50 = 15.26x + 2.6436 x = 50 - 2.6436 15.26 x = 3.10 IC50 = 103.10 IC50 = 1258.925412 µg/mL
Lampiran 4 Analisis metabolit kapang endofit daun sirsak GC-MS Pyrolisis Prosedur penggunaan GC-MS sebagai berikut: 1. Buka tabung gas helium ke kiri setengah putaran 2. Sambungkan colokan dari stabilizer ke listrik dan on-kan stabilizer 3. On-kan instrument (GC, MS dan pyrolisis), kemudian PC dan printer 4. Pada display PC pilih icon GC-MS Real Time Analysis 5. Klik TOP - pilih icon vacuum control - klik auto startup sampai ada tulisan complete – close. 6. Klik icon tuning – klik icon detail - atur suhu sesuai kondisi analysis - OK, tunggu sampai GC, MS ready. 7. Untuk mengaktifkan pyrolizer pada display PC klik icon PY-2020iS control – atur suhu furnace dan interface - v, upper temp 2800C dan pyrolisis 6000C. enter 8. Kembali ke menu GC-MS klik icon peak monitor view - lihat kondisi low vacuum harus <15 pascal dan high vacuum <1.5 x 10-3 pascal (minimal ± 2 jam). Min 0.20 9. Klik icon start auto tuning - file-save tuning file as – beri nama – save 10. Klik TOP - pilih icon data acquisition - atur parameter analysis, klik menu GC atur suhu kolom dan programnya, suhu injector, pressure, split ratio-klik menu MS atur suhu ion source dan intreface, solvent cut time. 11. Klik file - save method file as - beri nama method – save 12. Untuk memulai injeksi klik icon sample login - isis sample name, sample ID, dan data file – OK 13. Klik icon standby tunggu sampai icon start aktif jadi hijau 14. Masukkan sampel pada pyrolizer – klik start – tekan tombol sampel pyrolizer – enter 15. Tunggu sampai analisis selesai.
41
Lampiran 5 Foto mikroskopis sel kanker payudara yang diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak dengan konsentrasi 100 µg/mL pada perbesaran 10x. (a) Sirsak Sukabumi 2, (b) Sirsak Garut 3, (c) Sirsak Cianjur 1, (d) Sirsak Garut 6, (e) Sirsak Sukabumi 1, (f) Sirsak Garut 3, (g) Sirsak Garut 5, (h) Sirsak Cianjur 2, (i) Sirsak Garut 4, (j) Sirsak Garut 1, (k) Sirsak Sukabumi 3, (l) Sirsak Cianjur 3.
a Sampel 1 (Sir-SM2)
Sampel 2 (Sir-G3)
Sampel 3 (Sir-CA1)
d Sampel 4 (Sir-G6)
Sampel 7 (Sir-G5)
f Sampel 6 (Sir-G3)
h Sampel 8 (Sir-CA2)
j Sampel 10 (Sir-G1)
e Sampel 5 (Sir-SM1)
g
c
b
i Sampel 9 (Sir-G4)
k Sampel 11 (Sir-SM3)
l Sampel 12 (Sir-CA3)
42
Lampian 6
Foto mikroskopis sel kanker payudara yang tidak diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol) dengan perbesaran 10x
Kontrol sel MCF-7
Lampiran 7
Foto mikroskopis sel kanker payudara yang diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak dengan konsentrasi 400 µg/mL, 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL dan 25 µg/mL pada perbesaran 10x
1-400 Sampel 1-400
1-200 Sampel 1-200
1-50 Sampel 1-50
1-100 Sampel 1-100
1-25 Sampel 1-25
4-400 Sampel 4-400
43
4-200 Sampel 4-200
4-100 Sampel 4-100
4-25 Sampel 4-25
Sampel 4-50
Sampel 7-400
Sampel 6-200
6-50
6-100
7-400
6-200
6-400 Sampel 6-400
Sampel 6-100
4-50
Sampel 6-50
6-25 Sampel 6-25
7-200 Sampel 7-200
6-100 Sampel 7-100
44
7-25
7-50 Sampel 7-50
Lampiran 8
Sampel 7-25
Foto mikroskopis sel kanker payudara yang tidak diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol) dengan perbesaran 10x
Kontrol sel MCF-7
Lampiran 9
Foto mikroskopis sel kanker payudara yang tidak diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol positif) dengan perbesaran 10x
Doksorubisin 0.5
Doksorubisin 1
45
Lampiran 10
Foto mikroskopis sel normal Chang yang diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak dengan konsentrasi 400 µg/mL, 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL dan 25µg/mL pada perbesaran 10x
Konsentrasi 25 µg/mL
Konsentrasi 50 µg/mL
Konsentrasi 200 µg/mL
Konsentrasi 400 µg/mL
Konsentrasi 100 µg/mL
Lampiran 11 Foto mikroskopis sel normal Chang yang tidak diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol) dengan perbesaran 10x
Kontrol sel Normal Chang
46
Lampiran 12
Foto mikroskopis sel normal Chang yang tidak diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol positif) dengan perbesaran 10x
Doksorubisin 0.5
Doksorubisin 1
Lampiran 13 Pohon filogenetik gb|AF001021.2|_Diaporthe_phaseolorum_strain_473-4 gb|HQ533143.1| Diaporthe eres strain Phk2 gb|HQ533144.1| Diaporthe eres strain Phk1 gb|HQ832815.1|_Phomopsis_sp._LH157 gb|KC357558.1|_Diaporthe_sp._FH-2013b gb|JQ954648.1|_Phomopsis_sp._FH-2012b gb|FJ375142.1|_Ascomycota_sp._H-12 gb|GQ139521.1| Alternaria mali strain PF0905 gb|HQ832826.1|_Phomopsis_sp._LH243 Kapang Endofit Daun sirsak (Annona muricata L.) dbj|LC056934.1|_Diaporthe_sp._CLS-33 dbj|LC056935.1|_Diaporthe_sp._CLS-44 gb|EU571102.1|_Phomopsis_sp._VAAT-PZ15 gb|KC145847.1|_Diaporthe_sp._3_PRJ-2013 gb|FJ176469.1| Phomopsis sp. ML15 gb|KC145869.1| Diaporthe sp. 3 PRJ-2013 gb|HQ185335.1| Scedosporium apiospermum strain CBS 117407
47
Lampiran 14 Hasil BLAST
Lampiran 15 Sequences producing significant alignments
48
Lampiran 16 Urutan nukleotida hasil sekuen yang sudah dipilih >Kapang_endofit_daun_sirsak_Garut_Nomor_5 AGTTGGGGGTTTAACGGCAGGGCACCGCCAGGGCCTTCCAAAGC GAGGGTTTAACTACTGCGCTCGGGGTCCTGGCGAGCTCGCCACTATAT TTCAGGGCCTGCCCTTTTACAGGCAGTGCCCCATCACCAAGCCAGGCT TGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCTCCGGAATACCAG AGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAA TTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACC AAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTATGTTTTATTCTCAGA GTTTCAGTGTAAAAACAAGAGTTAGGTTGGCCGCCGGCGTGCTCTCTC AACACCCGCAGGCGGGTGAGGGGCCCCGGAGGACCAGCTGGCGCCGA GGCAACAGTAAGGTATAAGTTCACAAAGGGTTTCTGGGTGCGCCTGGG GCGCGT
Lampiran 17 Pensejajaran sequence hasil BLAST
49
50
51
Lampiran 18 Keterangan kromatogram Gambar 13 Waktu Retensi Senyawa Yang Konsentrasi Kemiripan Puncak Area (Menit) Teridentifikasi (%) (%) 1 7.178 1787943 Methane, 31.61 81 073 Sulfinylbis-(CAS) Dimethyl Sulfoxide 2 9.817 6477479 Phenol (CAS) Izal 1.15 97 5 3 11.067 1024228 Phenol, 4-Methyl1.81 91 83 (CAS) P-Cresol 4 11.576 4840899 2-Butanol (CAS) 0.86 74 8 Sec-Butanol 5 11.767 3868173 Benzeneacetonitril 0.68 86 2 e (CAS) Benzyl Cyanide 6 12.166 5073537 3,5-Heptadien-20.90 77 4 Ol, 2,6-Dimethyl 7 12.467 3466737 2-Piperidinone 0.61 80 7 (CAS) 2Piperidone 8 12.867 6516697 Benzenepropaneni 1.15 93 0 trile (CAS) 3Phenylpropionitril e 9 13.087 1231961 2,2-Dimethyl-32.18 72 76 VinylBicyclo[2.2.1]Hep tane 10 13.492 8835451 5h-1-Pyrindine 1.56 86 8 11 14.069 1853217 1,43.28 84 86 Cyclohexanedione (CAS) Tetrahydroquinon e 12 14.407 6515084 1h-Azepin-11.15 81 2 Amine, NEthylidenehexahy dro-(CAS) Hexamethylenehy drazonen 13 14.747 6652350 Aziridine, 2-(1,11.18 73 7 Dimethylethyl)-1Ethyl-3-Methyl-, Trans- (CAS) Trans-1-Ethyl2,Methyl-3
52
14
14.965
15
15.036
16
15.666
17
15.914
18
16.164
19
16.406
20
16.848
21
17.142
22
17.472
23
17.792
24
18.038
25
18.524
26
19.216
27
19.850
1036251 Dodecane (CAS) 32 N-Dodecane 1306550 Piperidine, 139 (Cyanoacetyl)(CAS) 1Cyanoacetylpiperi dine 1972289 1-Tetradecene 84 (CAS) NTetradec-1-Ene 1085338 5-(3'-Methyliden59 2'-Oxa-Butyliden)3,3-DimethylCyclohexanone 6643948 5-(3'-Methyliden3 2'-Oxa-Butyliden)3,3-DimethylCyclohexanone $$ Cyclohexanone , 3,3-Dimethyl 1704431 1-Pentadecene 30 (CAS) Pentadec-1Ene 1438277 2-Imidazolidinone, 12 1,3-Diethenyl1505675 Decanal (CAS) N21 Decanal 9528082 1,4-Diaza-2,53 Dioxobicyclo[4.3. 0]Nonane 6131649 1,4-Diaza-2,54 Dioxo-3-Isobutyl Bicyclo[4.3.0]Non ane 2476372 Hexadecanenitrile 59 (CAS) Palmitonitrile 2108918 1,4-Diaza-2,575 Dioxo-3-Isobutyl Bicyclo[4.3.0]Non ane 4322127 9-Octadecenal 48 (CAS) Octadecenyl Aldehyde 2845193 912 Octadecenamide,
1.83
93
2.31
66
3.49
83
1.92
72
1.17
59
3.01
87
2.54
74
2.66
72
1.68
87
1.08
83
4.38
96
3.73
92
7.64
87
5.03
84
53
28
20.418
29
20.934
30
21.542
(Z)- (CAS) Oleoamide 1323543 Octadecane, 126 (Ethenyloxy)(CAS) Octadecyl Vinyl Ether 3352880 969 Octadecenamide, (Z)- (CAS) Oleoamide 6338372 Pyridinium, 13 Hexadecyl-, Chloride, Monohydrate (CAS) Cetylpyridinium Chlori 5655553 520
2.34
82
5.93
93
1.12
76
100.00
Lampiran 19 Klasifikasi senyawa metabolit sekunder Klasifikasi Senyawa yang Struktur senyawa Aktivitas teridentifikasi metabolit O Methane, Alkana (berasal dari sulfinylbisPelarut S (CAS) Dimethyl DMSO) sulfoxide Methane, sulfinylbis-
Gaylord Chemical Company, L.L.C.
Phenol Izal
(CAS)
Sumber
Fenol
Antibakteri
Toyosi et al. 2013
Fenol
Antimikroba dan Antioksidan
Aourahoun et al. 2014 Mathur & Kamal 2011 belum ada aktivitas dilaporkan belum ada aktivitas dilaporkan belum ada aktivitas dilaporkan
HO
Phenol (CAS) Izal
Phenol, 4methyl- (CAS) p-Cresol
HO
Phenol, 4-methyl-
2-Butanol (CAS) secButanol Benzeneacetonit rile (CAS) Benzyl cyanide 3,5-Heptadien2-Ol, 2,6Dimethyl
OH
Alkohol
-
Benzen (Fenolik)
-
Benzen (Fenolik)
-
2-Butanol (CAS) sec-Butanol
N
Benzeneacetonitrile (CAS) Benzyl cyanide OH
3,5-HEPTADIEN-2-OL, 2,6-DIMETHYL
54
2-Piperidinone (CAS) 2Piperidone
Alkaloid O HN
Antimikroba, Antioksidan, Antiinflamasi, Antikanker.
2-Piperidinone (CAS) 2-Piperidone
Benzenepropan enitrile (CAS) 3Phenylpropionit rile 2,2-Dimethyl-3VinylBicyclo[2.2.1]H eptane 5H-1PYRINDINE
Benzen (Fenolik)
-
N
Benzenepropanenitrile (CAS) 3-Phenylpropionitrile
Alkana
belum ada aktivitas dilaporkan
2,2-DIMETHYL-3-VINYL-BICYCLO[2.2.1]HEPTANE
Alkaloid C
-
N
PYRIDINE,3-(1,2-PROPADIENYL)-
1,4Cyclohexanedio ne (CAS) Tetrahydroquin one 1H-Azepin-1amine, Nethylidenehexah ydro(CAS) Hexamethylene hydrazonen Aziridine, 2(1,1dimethylethyl)1-ethyl-3methyl-, trans(CAS) Trans-1Ethyl-2,Methyl3 Dodecane (CAS) nDodecane Piperidine, 1(cyanoacetyl)(CAS) 1Cyanoacetylpip eridine
Sivagurunat han & Innocent 2014 Keerthiga & Anand 2015 Bezerra et al. 2006 belum ada aktivitas dilaporkan
O
belum ada aktivitas dilaporkan Kankeaw & Masong 2015
Hidrokuino n (Fenolik)
Antioksidan
Alkaloid
-
belum ada aktivitas dilaporkan
Alkaloid
Antimikroba
Priya et al. 2011
Alkana
-
Alkaloid
Antimikroba, Antioksidan, Antijamur, Antikanker.
belum ada aktivitas dilaporkan Gangadhara et al. 2015 Bezerra et al. 2006
O
1,4-Cyclohexanedione (CAS) Tetrahydroquinone
N N
1H-Azepin-1-amine, N-ethylidenehexahydro- (CAS) Hexamethylenehydrazonen
N
Aziridine, 2-(1,1-dimethylethyl)-1-ethyl-3-methyl-, trans-
Dodecane (CAS) n-Dodecane N
N C O
1-Cyanoacetylpiperidine Caution: Valence appears to be exceeded
55
1-Tetradecene (CAS) nTetradec-1-ene
1-Tetradecene (CAS) n-Tetradec-1-ene
5-(3'Methyliden-2'oxa-butyliden)3,3-dimethylcyclohexanone 5-(3'Methyliden-2'oxa-butyliden)3,3-dimethylcyclohexanone $$ Cyclohexano ne, 3,3-dimethyl 1-Pentadecene (CAS) Pentadec-1-ene 2IMIDAZOLIDI NONE, 1,3DIETHENYLDecanal (CAS) n-Decanal
AntiTuberculosis (Anti TBC)
Kuppuswa my et al. 2013
Antibakteri dan Antijamur
Alam et al. 2014
Antibakteri
Beena et al. 2014
Asam lemak
Antibakteri
Kumar et al. 2011
Alkaloid
-
belum ada aktivitas dilaporkan
Aldehid
Antimikroba
Alkaloid
Antioksidan
Mahboubi & Feizabadi 2009 Bintang et al. 2015
Alkaloid
Antioksidan
Bintang et al. 2015
Nishiumi et al. 2014
Alkaloid
Antikanker (kanker lambung) Antioksidan
Aldehid
Antibakteri
Bharat et al. 2013
O O
5-(3'-Methyliden-2'-oxa-butyliden)-3,3-dimethyl-cyclohexanone
Keton
O O
5-(3'-Methyliden-2'-oxa-butyliden)-3,3-dimethyl-cyclohexanone
1-Pentadecene (CAS) Pentadec-1-ene O
N
N
2-IMIDAZOLIDINONE, 1,3-DIETHENYL-
O
Decanal (CAS) n-Decanal
1,4-diaza-2,5dioxobicyclo[4. 3.0]nonane 1,4-diaza-2,5dioxo-3-isobutyl bicyclo[4.3.0]n onane Hexadecanenitr ile (CAS) Palmitonitrile 1,4-diaza-2,5dioxo-3-isobutyl bicyclo[4.3.0]n onane 9-Octadecenal (CAS) Octadecenyl aldehyde
Asam lemak rantai panjang (Hidrokarbo n) Keton
Cyclopentane, 1,1,3,4-tetramethyl-, trans-
N
Alkaloid
Hexadecanenitrile (CAS) Palmitonitrile
O
9-Octadecenal (CAS) Octadecenyl aldehyde
Bintang et al. 2015
56
9Octadecenamid e, (Z)- (CAS) OLEOAMIDE Octadecane, 1(ethenyloxy)(CAS) Octadecyl vinyl ether 9Octadecenamid e, (Z)- (CAS) OLEOAMIDE Pyridinium, 1hexadecyl-, chloride, monohydrate (CAS) Cetylpyridinium chlori
NH2
Alkaloid
O
Antioksidan dan Antibakteri
Jasim et al. 2015
Antisepsis
Amudha & Rani 2014
9-Octadecenamide, (Z)- (CAS) OLEOAMIDE
Eter O
Octadecane, 1-(ethenyloxy)- (CAS) Octadecyl vinyl ether NH2 O
Alkaloid
Antioksidan dan Antibakteri
Jasim et al. 2015
Alkaloid
Antibakteri
Emling 2011
9-Octadecenamide, (Z)- (CAS) OLEOAMIDE
H N+ O H -
Cl
Pyridinium, 1-hexadecyl-, chloride, monohydrate (CAS) Cetylpyridinium chlori
57
Lampiran 20 Data spektra massa senyawa-senyawa yang dilaporkan bersifat antikanker
58
59
60
61
62
63
Lampiran 21 Analisis statistik
Class Sampel
Class Level Information Levels Values 4 G2 G5 G6 SM2
Source
DF
Model Error Corrected Total
R-Square
Source
3
Sampel
Level of Sampel G2 G5 G6 SM2
297634.7044 90054.7552
11
387689.4596
DF
106.0983
Type I SS
Mean Square
297634.7044
F Value
99211.5681 11256.8444
Root MSE
38.92908
DF
Mean Square
3 8
Coeff Var
0.767714
Source Sampel
Sum of Squares
8.81
297634.7044
272.5425
F Value
99211.5681
N
99211.5681
IC50 Mean Std Dev 3 3 3 3
411.536667 19.200000 397.436667 261.996667
176.483045 7.710545 11.624114 116.989487
0.0065
IC50 Mean
8.81
Type III SS Mean Square F Value Pr > F
3
Pr > F
8.81
0.0065
Pr > F 0.0065
64
Duncan's Multiple Range Test for IC50 0.05 Alpha 8 Error Degrees of Freedom 11256.84 Error Mean Square
Number of Means Critical Range
2 199.8
3 208.2
4 212.9
Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N Sampel A
411.54
3
G2
A
397.44
3
G6
A
262.00
3
SM2
B
19.20
3
G5
65
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bernai, Jambi pada tanggal 14 Oktober 1992 sebagai anak ketiga dari lima bersaudara dari Bapak M.Yunus (Alm) dan Ibu Hasnah. Penulis menyelesaikan sekolah dasar di SDN 40 Sarolangun, Jambi pada tahun 2004 dan melanjutkan sekolah menengah pertama di MTSN Sarolangun, Jambi sejak tahun 2004-2007. Sekolah menengah atas penulis selesaikan pada tahun 2010 di SMAN 7 Sarolangun, Jambi. Pendidikan Strata 1 ditempuh di Program Studi Pendidikan Kimia, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Jambi, lulus pada tahun 2014. Penulis pernah aktif di organisasi kemahasiswaan seperti Himpunan Mahasiswa Pendidikan Kimia (HIMAPEMIA) Universitas Jambi sebagai Ketua Umum dan Mapala Siginjai sebagai Bendahara Umum, Himpunan Mahasisawa Jurusan (HMJ) koordinator Danus, Ikatan mahasiswa kimia Indonesia (IKAHIMKI) sebagai bendahara Umum dan Badan Eksekutif Mahasiswa (BEM) Universitas Jambi tahun 2011/2013. Selain itu juga penulis aktif sebagai asisten dosen Kimia Organik, Kimia Fisik, Dasar-Dasar Kimia Analitik dan Dasar-Dasar Pemisahan Analitik di Universitas Jambi dan pada tiga bulan terakhir sebelum kuliah penulis sebagai guru Kimia SMA dan IPA terpadu Al-Azhar Jambi. Pada tahun yang sama penulis diterima di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor pada Program Studi Biokimia dengan sponsor beasiswa Lembaga Pengelola Dana Pendidikan Kementrian Keuangan RI (LPDP Kemenkeu RI). Penulis juga aktif berorganisasi menjadi salah satu anggota divisi PSDM Forum Wacana tahun 2014-2015. Penulis juga pernah aktif di BSC, serta terlibat dalam komunitas kongkrit. Aktivitas Antikanker Ekstrak Etil Asetat Kapang Endofit Daun Sirsak (Annona muricata L.) merupakan judul tesis penulis dengan judul jurnal yang sama dipublikasikan di International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences (Int J Pharm Pharm Sci).
