UJI A KT K IVITAS A NTIPL P ASMODIUM S ECARA IN VITRO

SKRIPSI

UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS (Garcinia Garcinia parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN W2

Oleh :

SUCI FITRIYANI NPM: 2005210210 Dibuat untuk memperoleh Gelar Sarjana Farmasi pada Universitas Pancasila

UNIVERSITAS PANCASILA FAKULTAS FARMASI JAKARTA 2010

PERNYATAAN SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI

Saya yang bertandatangan di bawah ini menyatakan skripsi dengan judul ’UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS (Garcinia parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN W2’ adalah karya saya sendiri dan belum diajukan untuk publikasi dalam bentuk apapun kepada pihak manapun. Informasi yang berasal atau dikutip adalah karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah dicantumkan dalam daftar rujukan di bagian akhir skripsi ini.

Jakarta, Juli 2010

Suci Fitriyani NPM : 2005210210

UNIVERSITAS PANCASILA FAKULTAS FARMASI JAKARTA

PERSETUJUAN SKRIPSI

NAMA

: Suci Fitriyani

NPM

: 2005210210

PEMINATAN

: FARMASI KLINIK DAN KOMUNITAS

JUDUL

: UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS (Garcinia parfivolia(Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN W2

Disetujui oleh :

Pembimbing

(Dr. Syamsudin, M.Biomed., Apt.)

UNIVERSITAS PANCASILA FAKULTAS FARMASI JAKARTA

PENGESAHAN SKRIPSI Judul

UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS (Garcinia parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN W2 OLEH: SUCI FITRIYANI NPM : 2005210210 Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Pancasila Pada tanggal 02 Agustus 2010

Universitas Pancasila Fakultas Farmasi Dekan

(Drs. I Wayan Redja, M.Chem., Apt.) Pembimbing : 1. Dr. Syamsudin, M.Biomed, Apt Penguji: 1. Dra. Syarmalina., M.Si., Apt 2. Dr. Ros Sumarny, M.S., Apt 3. Prof. ris. Drh. Darmono, M.Sc.

1.........................

1......................... 2......................... 3........................

KATA PENGANTAR Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan taufik, serta hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO TERHADAP EKSTRAK

DAUN

ASAM

KANDIS

(Garcinia

parvifolia

(Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN W2” diajukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Universitas Pancasila, Jakarta. Dalam penulisan dan penyusunan skripsi ini, penulis telah banyak menerima bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu penulis menyampaikan rasa hormat dan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Syamsudin, M. BIOMED, Apt, selaku dosen pembimbing skripsi yang dengan sabar, tulus dan ikhlas telah memberikan waktu, tenaga serta pikirannya dalam mengarahkan dan membimbing penulis dalam penyusunan skripsi. Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya juga disampaikan kepada: 1. Bapak Drs. I Wayan Redja, M.Chem, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Pancasila 2. Ibu Dr. Shirly Kumala, M.Biomed., Apt., selaku Pembantu Dekan I Fakultas Farmasi Universitas Pancasila, 3. Ibu Dra. Erlindha gangga, Msi., Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik. 4. Ayah, ibu dan adikku tersayang, yang telah memberikan dukungan moral, doa, kasih dan sayangnya selama penulis melakukan penelitian. 5. Seluruh pihak yang telah membantu, yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu. Akhir kata, penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi penelitian dan pengembangan ilmu pengetahuan. Jakarta, Juli 2010

Penulis

DAFTAR ISI Halaman KATA PENGANTAR .........................................................................................

iv

DAFTAR ISI ......................................................................................................

v

DAFTAR TABEL..............................................................................................

viii

DAFTAR GAMBAR .........................................................................................

ix

DAFTAR SINGKATAN....................................................................................

xi

DAFTAR LAMPIRAN .....................................................................................

xii

ABSTRAK .........................................................................................................

xiii

BAB I

PENDAHULUAN A. Latar Belakang ........................................................................... 1 B. Perumusan Masalah ................................................................... 2 C. Tujuan Penelitian ........................................................................ 2 D. Manfaat Penelitian ...................................................................... 3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA A. Asam Kandis ............................................................................... 4 1. Klasifikasi Tanaman.............................................................. 4 2. Sinonim ................................................................................. 4 3. Nama Daerah ......................................................................... 4 4. Deskripsi ............................................................................... 4 B. Xanton ......................................................................................... 5 C. Kromatografi................................................................................ 6 D. Ekstraksi ...................................................................................... 7 E. Malaria ........................................................................................ 8 1. Epidemiologi malaria............................................................... 8 2. Spesies parasit malaria............................................................. 9 3. Strain D6 dan strain W2 .......................................................... 14

F. Landasan teori ............................................................................. 14

BAB III

RANCANGAN PENELITIAN A. Prinsip Penelitian ........................................................................ 16 B. Bahan penelitian .......................................................................... 16 C. Tempat penelitian ........................................................................ 16 D. Prosedur penelitian ...................................................................... 16 E. Analisis data ............................................................................... 17

BAB IV

BAHAN, ALAT DAN METODE PENELITIAN A. Bahan........................................................................................... 18 B. Alat .............................................................................................. 19 C. Metode Penelitian........................................................................ 19 1.Identifikasi ekstrak.................................................................... 19 2.Pembuatan kultur P. falcifarum................................................ 22 3. Preparasi bahan uji .................................................................. 23 4. Sinkronisasi ............................................................................. 23 5. Uji aktivitas plasmodium ........................................................ 24

BAB V

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 1. Identifikasi ekstrak ........................................................................ 26 a. Penapisan fitokimia ................................................................. 26 b. Analisis dengan KLT .............................................................. 26 2. Pengujian aktivitas antiplasmodium ............................................. 36 a. Metode Mikroskopik .............................................................. 36 b. Metode SYBR Green I ........................................................... 45

BAB VI

SIMPULAN DAN SARAN A. Simpulan .................................................................................... 50 B. Saran ........................................................................................... 50

DAFTAR RUJUKAN ....................................................................................... 51 LAMPIRAN.......................................................................................................

53

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel V.1

Senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis ............................................ 26

Tabel V.2 Hambatan pertumbuhan P. falcifarum strain D6 (%) dari ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis pada berbagai konsentrasi ..............................................................

36

Tabel V.3 Hambatan pertumbuhan P. falcifarum strain W2 (%) dari ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis pada berbagai konsentrasi .............................................................. Tabel V.4

Hambatan pertumbuhan P. falcifarum strain D6 dan strain W2 (%) dari klorokuin pada berbagai konsentrasi .........................

Tabel V.5

44

Nilai linieritas fluoresensi pada P. falcifarum dari ekstrak kloroform daun asam kandis pada berbagai konsentrasi ................

Tabel V.6

40

45

Nilai linearitas fluoresensi pada P. falcifarum dari ekstrak metanol daun asam kandis pada berbagai konsentrasi ...................

45

Tabel V.7 Nilai linieritas fluoresensi pada P. falcifarum dari klorokuin

Tabel V.8

pada berbagai konsentrasi ..............................................................

46

Nilai IC50 dari tiap ekstrak daun asam kandis .................................

46

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar II.1 Garcinia parvifolia (Miq)Miq ..................................................... ...

5

Gambar II.2 Rumus umum xanton ................................................................... ...

5

Gambar II.3 Daerah geografi penyebaran malaria didunia .............................. ...

9

Gambar II.4 Stadium-stadium perkembangan P. falcifarum .......................... ...

10

Gambar II.5 Siklus perkembangan P. falcifarum ............................................ ...

14

Gambar IV.1 Gambaran lempeng sumur mikro uji aktivitas antiplasmodium......

25

Gambar V.1 Profil bercak KLT ekstrak kloroform………………….................. 27 Gambar V.2 Profil bercak KLT ekstrak kloroform diuapi dengan uap amoniak. 28 Gambar V.3 Profil bercak KLT ekstrak kloroform disemprot denganpereaksi Liebermann Burchard…………………………………………....... 29 Gambar V.4 Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi serium sulfat.30 Gambar V.5 Profil bercak KLT ekstrak metanol………………...……………... 32 Gambar V.6 Profil bercak KLT ekstrak metanol diuapi dengan uap amoniak…. 33 Gambar V.7 Profil bercak KLT ekstrak metanol dengan pereaksi LiebermannBurchard………………………………………………………...... 34 Gambar V.8 Profil bercak KLT ekstrak metanol dengan pereaksi serium sulfat... 35 Gambar V.9 Kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan probit.................................................................................................. 37 Gambar V.10 P. falcifarum strain D6 ekstrak kloroform daun asam kandis dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi……………………….... 38 Gambar V.11 P. falcifarum strain D6 ekstrak metanol daun asam kandis dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi……………………….. 39 Gambar V.12 Kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan probit................................................................................................ 41 Gambar V.13 P. falcifarum strain W2 ekstrak kloroform daun asam kandis dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi……………………….. 42

Gambar V.14 P. falcifarum strain W2 ekstrak metanol daun asam kandis dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi……………………….. 43 Gambar V.15 Kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan probit................................................................................................ 44

DAFTAR SINGKATAN

1. CCM

: Complete Culture Medium

2. DNA

: Deoxyribonucleatid Acid

3. HEPES

: N-(2-hydoroxyethyl) piperazine-N’-(2-ethaneculfonic acid)

4. IC50

: 50

5. LAF

: Laminary Air Flow

6. RPMI

: Roswell Park Memorial Institute

7. WHO

: World Health Organization

% inhibitory Concentration

DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Hasil determinasi daun asam kandis................................................. 53 Lampiran 2. Skema pembuatan ekstrak daun asam kandis…………...………… 54 Lampiran 3. Skema kerja pembuatan kultur P. falcifarum……………………… 55 Lampiran 4. Skema pengujian aktivitas antiplamodium (metode mikroskopi)….. 56 Lampiran 5. Skema pengujian aktivitas antiplamodium (metode SYBR Green I) 57 Lampiran 6. Foto bahan uji antiplasmodium…………………………………….. 58 Lampiran 7. Foto alat uji antiplasmodium……………………………………….. 59 Lampiran 8. Gambar grafik dari metode SYBR Green I......................................... 61 Lampiran 9. Jumlah skizon hidup dalam seluruh jumlah sel dalam area pandang Mikroskop…………………………………………………………… 63 Lampiran 10. Tabel probit…………………………………………………………. 65

ABSTRAK

(A) SUCI FITRIYANI (2005210210) (B) UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS (Garcinia parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN W2 (C)

xiv + 65 Halaman; 8 tabel; 21 gambar; 7 singkatan; 10 lampiran

(D) Kata Kunci : Antiplasmodium, daun asam kandis, kultur P. falcifarum Resistensi antiplasmodium terhadap obat malaria mendorong untuk dilakukan pengembangan terhadap obat baru. Salah satunya adalah daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) yang digunakan sebagai obat alternatif karena mengandung senyawa xanton. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui aktivitas antiplasmodium dari ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan menggunakan metode mikroskopik dan SYBR Green I yang ditunjukkan dengan nilai IC50. Daun asam kandis diekstraksi secara berkesinambungan kemudian di uji aktivitas antiplasmodium secara in vitro dengan metode mikroskopik dan SYBR Green I. Pada metode mikroskopik, diperoleh nilai IC50 dari ekstrak kloroform 33,17 µg/mL pada strain D6 dan 0,55 µg/mL pada strain W2. Nilai IC50 dari ekstrak metanol 32,44 µg/mL pada strain D6 dan 41,23 µg/mL. Pada metode SYBR Green I diperoleh nilai IC50 dari ekstrak kloroform 14,29 µg/mL pada strain D6 dan 0,214 µg/mL pada strain W2. Nilai IC50 dari ekstrak metanol 48,00 µg/mL pada strain D6 dan 56,37 µg/mL pada strain W2. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) mempunyai aktivitas antiplasmodium terhadap kultur P. falcifarum strain D6 dan strain W2 pada metode mikroskopik dan metode SYBR Green I. Ekstrak kloroform mempunyai aktivitas antiplasmodium lebih kuat dari ekstrak metanol.

(E) Daftar Rujukan : 22 buah (1983-2009) (F) Dr. Syamsudin, M.Biomed.,Apt. (G) 2010

ABSTRACT

(A)

SUCI FITRIYANI (2005210210)

(B)

IN VITRO ANTI-PLASMODIUM ACTIVITY TEST ON LEAVES OF Garcinia parvifolia Miq ON CULTURE OF Plasmodium falcifarum strain D6 AND strain W2.

(C)

xiv + 65 Pages; 13 tables; 12 figures; 6 abbreviations; 10 appendices

(D)

Key words: Anti-plasmodium, leaves of Garcinia parvifolia Miq, culture of P.falcifarum Malaria is the issue of world health either for developing or developed countries. Much P. falcifarum resistant to malaria medicine encourages people to improve new medicines. One of the medicines is leaves of G. parvifolio Miq that are used as alternative medicine because of containing xanton compound. The objective of this research is to know anti-plasmodium activity of G. parvifolio Miq leaves by means of microscopic and SYBR Green I methods shown by the value of IC50. Leaves of G. parvifolio Miq are extracted by means of chloroform and methanol solvent then the antiplasmodium activity is tested in in vitro by means of microscopic and SYBY Green I method. In microscopic method, the value of IC50 from chloroform extract 33,17 µg/mL in strain D6 and 0,55 µg/mL in strain W2 is obtained. In SYBR Green I, the value of IC50 from methanol extract 48,00 µg/mL in strain D6 and 56,37 in strain W2 is obtained. From this research, it can be inferred that chloroform and methanol extracts of G. parvifolia Miq leaves have antiplasmodium activity on culture of P. falcifarum strain D6 and strain W2 on microscopic and SYBR Green I methods in which chloroform extract has stronger anti-plasmodium than methanol extract does.

(E)

List of references: 22 references (1983-2009)

(F)

Dr. Syamsudin, M.Biomed.,Apt.

(G)

2010

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar belakang Malaria merupakan masalah kesehatan di dunia, baik pada negara berkembang maupun negara yang sudah maju. Penyakit malaria terjadi pada 105 negara dengan 300- 500 juta kasus malaria dan lebih dari satu juta jiwa kematian pada tiap tahunnya, sehingga kebutuhan obat malaria sangat diharapkan. Spesies yang banyak di jumpai di daerah tropis adalah P. falcifarum dan P. vivax yang mengakibatkan terdiagnosisnya infeksi malaria sampai 95 persen, P. vivax terdistribusi lebih luas dari pada P. falcifarum tetapi lebih sedikit kemungkinan terjadi kematian. Sedangkan P. malariae ditemukan di beberapa daerah namun prevalensinya sangat rendah. Di Indonesia, P. ovale hanya ditemukan didaerah Papua (1). Malaria merupakan penyakit yang disebabkan oleh parasit yang ditularkan kepada manusia dan hewan. Vektor yang berperan pada penyakit ini adalah nyamuk Anopheles. Salah satu faktor utama penyebab kegagalan pemberantasan malaria adalah adanya nyamuk Anopheles yang resisten terhadap parasit malaria yakni Plasmodium yang resisten terhadap antimalaria yang tersedia. Masalah resistensi terhadap Plasmodium terutama pada Plasmodium falcifarum telah menjadi masalah serius. Hal ini telah mendorong para peneliti untuk berusaha menemukan antimalaria baru untuk menggantikan antimalaria yang sudah tidak sensitif lagi . Salah satu usaha untuk menemukan antimalaria baru tersebut adalah melalui eksplorasi senyawa aktif dari bahan obat alam utamanya tanaman obat yang secara tradisional digunakan masyarakat untuk mengobati malaria di berbagai daerah endemik di dunia (2). Senyawa xanton diketahui memiliki aktivitas farmakologi yang luas antara lain : antimikroba, anti kanker, antioksidan, dan antimalaria. Beberapa penelitian senyawa turunan xanton dari tanaman genus Garcinia telah berhasil di uji

aktivitasnya antara lain : garciniaxanton dan cowaxanton dari tanaman G. dulcis dan G. cowa yang mempunyai aktivitas antiplasmodium paling kuat dengan IC50 berturut-turut sekitar 0,96 µg/ml dan 1,5µg/ml (3). Pada penelitian sebelumnya menunjukkan ekstrak kulit batang asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) mempunyai aktivitas antiplasmodium yang kuat (4). Ektraksi bertingkat dari serbuk kulit batang asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan menggunakan pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda yaitu n-heksana, etil asetat, dan ekstrak n-butanol. Pada uji anti plasmodium baik secara in vitro pada kultur P. falcifarum strain FCR-3 dan 3D7 maupun uji in vivo yang diinfeksi dengan P. berghei menggunakan ekstrak n-heksana kulit batang asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) pada mencit menggunakan ekstrak n-heksana kulit batang asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) lebih efektif dibanding ekstrak etil asetat dan ekstrak n-butanol (5). Pada penelitian ini dilakukan uji antiplasmodium secara invitro terhadap daun asam kandis pada kultur P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan W2 (resisten klorokuin), diharapkan dapat diketahui aktivitas antiplasmodium ekstrak tersebut terhadap P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan W2 ( resisten klorokuin).

B. Perumusan masalah Apakah pada ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) memiliki efek antiplasmodium terhadap kultur P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan strain W2 (resisten klorokuin) dengan menggunakan metode mikroskopik dan metode SYBR Green I?

C. Tujuan Penelitian Untuk mengetahui aktivitas antiplasmodium dari ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan menggunakan metode mikroskopik dan metode SYBR Green I yang ditunjukkan dengan nilai IC50.

D. Manfaat Penelitian Diharapkan dapat mendorong penemuan anti malaria yang berasal dari tumbuhan, khususnya dari tumbuhan keluarga Guttiferae.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

A. Asam Kandis (Garcinia parvifolia (Miq)Miq) (6) 1. Klasifikasi Tanaman Divisi

: Spermatophyta

Sub Divisi

: Angiospermae

Kelas

: Dicotyledoneae

Bangsa

: Parietales

Suku

: Guttiferae

Marga

: Garcinia

Jenis

: Garcinia Parvifolia (Miq)Miq

Nama Umum

: Asam Kandis

2. Sinonim Garcinia dioica blume Garcinia globulosa ridley Garcinia motletana pierre 3. Nama Daerah Kandis, Kandis Burung, Sempat Tebu 4. Deskripsi Habitus

: Pohon tinggi, tinggi 12-15 m dan besar batangnya 45 cm, tumbuh di dataran Sumatra.

Kayu

: Kayu berwarna kekuning-kuningan, agak keras dan awet, tetapi mudah rapuh dan hanya dapat diperoleh dalam ukuran kecil-kecil jika ditoreh akan keluar eksudat yang berwarna kuning buram.

Kulit Kayu

: Kulit kayu berwarna coklat tua, tebal 1-2 mm.

Getah

: Getah kayunya mengandung getah kuning yang sangat banyak, yang mengeras menjadi gumpalan-gumpalan gumpalan kecil pada batang.

Buah

: Buahnya yang berwarna kuning jingga sebesar buah tempuyung, agak bulat atau panjang.

Daun

: Permukaan daun kasar dan dari dasar daun hingga ujung daun meruncing.

Bunga

: Bunga jantan, panjang tangkai 4-10 10 mm, luas lingkar tangkai 7-10 mm.

Gambar II.1 Garcinia parvifolia (Miq)Miq (7)

B. Xanton Xanton adalah pigmen fenol kuning yang reaksi warnanya dan hasil kromatografinya sama dengan flavonoid (8). Golongan xanton mempunyai rumus umum dibenzogamapiron.

Gambar II.2 Rumus Umum Xanton ( 9)

Beberapa senyawa turunan xanton telah berhasil diisolasi dari tanaman genus Garcinia dan dibuktikan aktivitas antiplasmodiumnya. Likhitwitayawuid et al. berhasil menguji aktivitas beberapa turunan xanton dari tanaman G. dulcis dan G. cowa. Diantara turunan xanton yang diuji, garciniaxanton dan cowaxanton mempunyai aktivitas antiplasmodium paling kuat dengan nilai IC50 (konsentrasi hambatan

maksimal

yang

dapat

menghambat

pertumbuhan

50%

dari

plasmodium) berturut-turut sekitar 0,96µg/ml dan 1,5 µg/ml (3).

C. Kromatografi Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah cara pemisahan campuran zat menggunakan sebuah lapisan tipis bahan penyerap, karena menggunakan lapisan tipis maka prosedurnya disebut Kromatografi Lapis Tipis. Campuran zat ditempatkan pada satu ujung lapisan bahan penyerap, kemudian dengan bantuan cairan rambat digerakkan ke ujung lainnya sampai batas tertentu, batas ini disebut batas rambat. Selama perjalanan dari satu ujung ke ujung yang lain terjadi pemisahan dari campuran zat, yang disebabkan oleh perbedaan sifat antara zatzat tersebut. Ada zat yang tetap tinggal dititik permulaan, ada zat yang merambat sampai setengah perjalanan dan ada pula yang bergerak terus sampai mencapai batas rambat. Pemisahan dianggap berhasil bila zat-zat dapat terpisah satu sama lain sepanjang lapisan bahan penyerap. Bahan penyerap disebut juga fase diam, fase stasioner atau fase tidak bergerak, sebab bahan ini memang tetap tinggal diam selama proses kromatografi. Sebaliknya cairan rambat disebut sebagai fase bergerak karena merambat perlahan-lahan dari ujung lempeng ke ujung yang lain. Dan pada umumnya silika gel biasa digunakan sebagai bahan penyerap. Fase gerak (cairan rambat, cairan eluasi atau cairan pengembang) ialah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Fase gerak bergerak di dalam fase diam, yaitu suatu lapisan berpori, karena ada gaya kapiler. Fase gerak biasanya berupa zat organik mudah menguap, komposisinya sangat beragam, ada yang terdiri dari satu zat organik, ada yang berupa campuran dua zat organik atau lebih, semuanya tergantung pada keperluan sifat dari campuran zat yang akan

dipisahkan. Cairan pengembang yang banyak digunakan: n-heksana, heptana, sikloheksana, karbontertraklorida, benzena kloroform, eter, etil asetat, piridina, aseton, etanol, metanol, air (10).

D. Ekstraksi Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein, dan lain-lain. Senyawa aktif yag terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan ke dalam golongan flavonoid, minyak atsiri, dan lain-lain. Dengan diketahuinya senyawa aktif yang dikandung simplisia akan mempermudah pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat. Simplisia yang lunak seperti daun dan rimpang mudah diserap oleh pelarut, karena itu pada proses ekstraksi tidak perlu diserbuk sampai halus (8). Metode Ekstraksi, antara lain : 1) Cara Dingin a. Maserasi Maserasi adalah proses pengekstraksian simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa

kali pengocokan atau pengadukan pada

temperatur ruangan (kamar). Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan prinsip metode pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi kinetik berarti dilakukan pengadukan yang kontinu (terus menerus). Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya. b. Perkolasi Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna (exhaustive extraction) yang umumnnya dilakukan pada temperatur ruangan. Proses terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan / penampungan ekstrak), terus menerus sampai diperoleh ekstrak (perkolat) yang jumlahnya 1-5 kali bahannya.

2) Cara Panas a. Refluks Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu pertama sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi sempurna b. Soxhletasi Soxhletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. c. Digesti Digest adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-50o C. d. Infus Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air (bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 96-98o C) selama waktu tertentu (15-20 menit) e. Dekok Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama (≥30 menit) dan temperatur sampai titik didih air (8,11).

E. Malaria 1. Epidemiologi Malaria Di negara tropis maupun subtropis, hingga saat ini malaria masih menjadi masalah kesehatan lebih dari 40 % atau 2,1 miliyar penduduk dunia di perkirakan tinggal di daerah yang mempunyai resiko tinggi terkena malaria. Tercatat 273 juta kasus penderita malaria di diagnosis secara klinis setiap tahunnya. Kematian yang ditimbulkan akibat malaria mencapai 2 juta

pertahun yang terjadi terutama pada anak-anak dan ibu hamil (12). Di Indonesia, di perkirakan sebanyak 2 orang dari 100.000 populasi mengalami kematian akibat penyakit malaria. Hampir semua propinsi di Indonesia mempunyai daerah endemis malaria, walaupun tingkat endemisitinya berbeda-beda (13).

Gambar II.3 Daerah geografi penyebaran malaria di dunia (14)

2. Spesies Parasit Malaria Penyebab malaria di indonesia sampai saat ini ada empat macam plasmodium, yaitu : P. falciparum, P. vivax, P. malariae dan P. ovale. Seorang penderita dapat ditulari oleh lebih dari satu jenis plasmodium yang disebut infeksi campuran (mixed infection) misalnya infeksi oleh P. falcifarum dengan P. vivax atau P. malariae. Infeksi campuran tiga jenis parasit jarang terjadi. Dari keempat parasit tersebut, P. falciparum yang sering menyebabkan malaria dengan gejala klinis berat sampai dapat menimbulkan kematian (15). Pada P. falciparum ukuran eritrosit terinfeksi normal, dan sering terdapat lebih dari satu bentuk cincin didalam eritrosit. Bentuk tropozoit awal sering terlihat di darah tepi, sedang skizon banyak terdapat di organ-organ dan otot,

jarang atau hanya sedikit dapat di temukan di darah tepi dan bentuknya seperti topi dengan ukuran lebih kecil dari skizon P. vivax, dan mengandung banyak merozoit. Didalam eritrosit kadang ada endapan sitoplasma yang dinamakan titik-titik maurers merupakan bercak-bercak merah dengan distribusi ireguler atau berbentuk celah-celah, ciri khas lain adalah pada sitoplasma terdapat pseudopodia yang tampak pada lapisan darah. Parasit malaria P. falciparum mengalami tiga perubahan morfologik yang berbeda selama siklus 24 dan 72 jam dalam eritrosit manusia. Setelah invasi kedalam eritrosit, parasit menjadi matur kedalam stadium cincin. Pertumbuhan berikutnya kedalam stadium tropozoit yang di tandai oleh perubahan morfologi dan biokimia pada membran plasma inang. Selanjutnya terjadi maturasi parasit tropozoit kestadium skizon.

Gambar II.4 Stadium-stadium perkembangan P. falcifarum (16)

Daur hidup Plasmodium terdiri dari fase seksual eksogen (sporogoni) dalam badan nyamuk Anopheles dan fase aseksual (skizogoni) dalam badan hospes vertebrata. a. Parasit dalam hospes vertebrata 1) Fase jaringan Bila nyamuk Anopheles betina yang mengandung parasit malaria dalam kelenjar liurnya menusuk hospes, sporozoit yang berada dalam air liurnya masuk melalui probosis yang ditusukkan kedalam kulit. Sporozoit segera masuk dalam peredaran darah dan setelah ½ jam sampai 1 jam masuk kedalam sel hati. Sebagian sporozoid masuk ke sel hati dan berkembang biak proses ini disebut skizogoni pra-eritrosit. Inti parasit membelah diri berulang-ulang disertai oleh pembelahan sitoplasma yang mengelilingi setiap inti sehingga terbentuk beribu-ribu merozoit berinti satu. Pada akhir fase pra-eritrosit, skizon pecah, merozoit keluar dan masuk di peredaran darah, sebagian besar menyerang eritrosit yang berada di sinusoid hati tetapi beberapa difagositosit. Pada P. vivax dan P. ovale sebagian sporozoit yang menjadi hipnozoit setelah beberapa waktu (beberapa bulan sampai 5 tahun)

menjadi

aktif

kembali

dan

mulai

dengan

skizogoni

eksoeritrositik sekunder. 2) Fase aseksual dalam darah Waktu antara permulaan infeksi sampai parasit malaria ditemukan dalam darah pertama kalinya karena jumlah parasit telah melewati ambang mikroskopik disebut masa pra-paten, masa ini dapat dibedakan dengan masa tunas atau masa inkubasi yang berhubungan dengan timbulnya gejala klinis penyakit malaria. Masa tunas terbagi menjadi dua yaitu masa tunas intrinsik dan masa tunas ekstrinsik. Masa tunas intrinsik pada malaria adalah waktu antara sporozoit masuk dalam tubuh hospes sampai timbul gejala demam biasanya berlangsung 8-37 hari. Masa tunas ekstrinsik adalah waktu antara nyamuk menghisap

darah yang mengandung gametosit sampai mengandung sporozoit dalam kelenjar liurnya. Merozoid yang dilepaskan oleh skizon jaringan mulai menyerang eritrosit. Stadium termuda dalam darah berbentuk bulat, kecil; beberapa diantaranya mengandung vakuola. Stadium muda ini disebut tropozoid. Kemudian parasit berkembang biak secara aseksual melalui proses pembelahan yang disebut skizogoni. Inti parasit membelah diri menjadi sejumlah inti yang lebih kecil, kemudian dilanjutkan dengan pembelahan sitoplasma untuk membentuk skizon skizon matang mengandung bentuk-bentuk bulat kecil, terdiri dari inti dan sitoplasma yang disebut merozoid. Setelah skizogoni selesai, eritrosit dan merozoid dilepaskan dalam aliran darah (sporulasi), kemudian merozoid memasuki eritrosit baru dan generasi lain dibentuk dengan cara yang sama. Pada daur eritrosit, skizogoni berlangsung secara berulang-ulang selama infeksi dan menimbulkan parasitemia yang meningkat dengan cepat sampai proses dihambat oleh imun hospes. 3) Fase seksual dalam darah Setelah 2 atau 3 generasi (3-15 hari) merozoid dibentuk, sebagian merozoit tumbuh menjadi bentuk seksual. Proses ini disebut gametogoni (gametogenesis). Bentuk seksual tumbuh tetapi intinya tidak membelah. Gametosit mempunyai bentuk yang berbeda pada berbagai spesies: pada P. falcifarum bentuknya seperti sabit atau pisang, pada spesies lain bentuknya bulat.

b. Parasit dalam hospes invertebrata 1) Eksflagetasi Bila nyamuk Anopheles betina menghisap darah hospes manusia yang mengandung parasit malaria, parasit aseksual dicerna bersama dengan eritrosit, tetapi gametosit dapat tumbuh terus. Inti pada mikrogametosit membelah menjadi 4 sampai 8 yang masing-masing menjadi bentuk panjang seperti benang (flagel) dengan ukuran 20-25 mikron, menonjol

keluar dari sel induk, bergerak-gerak sebentar dan kemudian melepaskan diri. Flagel atau gamet jantan disebut mikrogamet; makrogametosit mengalami proses pematangan (maturasi) dan menjadi gamet betina atau makrogamet. Dalam lambung nyamuk mikrogamet tertarik oleh makrogamet yang membentuk tonjolan kecil tempat masuk mikrogamet sehingga pembuahan dapat berlangsung. Hasil pembuahan disebut zigot. 2) Sporogoni Pada permulaan, zigot merupakan bentuk bulat tidak bergerak, tetapi dalam waktu 18-24 jam menjadi bentuk panjang dan dapat bergerak; stadium seperti cacing ini berukuran panjang 8-24 mikron dan disebut ookinet. Ookinet kemudian menembus dinding lambung melalui sel epitel ke permukaan luar lambung dan menjadi bentuk bulat, disebut ookista. Ookista makin lama makin besar dan kemudian pecah, ribuan sporozoit dilepaskan dan bergerak dalam rongga badan nyamuk untuk mencapai kelenjar liur, nyamuk betina sekarang menjadi infektif. Bila nyamuk ini menghisap darah setelah menusuk kulit manusia, sporozoit dimasukkan ke luka tusuk dan mencapai aliran darah hospes perantara. Sporogoni yang dimulai dari pematangan gametoist sampai menjadi sporozoit infektif, berlangsung selama 8 sampai 35 hari, bergantung pada suhu luar dan spesies parasit (19).

Gambar II.5 siklus perkembangang P. falcifarum (18)

3. Strain D6 dan strain W2 Berdasarkan prosedur standar protokol dari WHO untuk menguji obat antimalaria tehadap parasit malaria secara in vitro digunakan klon Sierra Leone/D6 yang merupakan strain dari parasit malaria yang sensitif terhadap klorokuin dan klon Indochina/W2 yang merupakan strain dari parasit malaria yang resisten terhadap klorokuin. Selanjutnya kedua klon ini dikultur dalam medium kultur jaringan dan digunakan secara teratur pada pengujian di laboratorium malaria untuk penelitian antimalaria dengan menggunakan berbagai metode (19). F. Landasan Teori 1. Serbuk daun asam kandis diekstraksi secara berkesinambungan dengan pelarut yang berbeda kepolarannya yaitu kloroform dan metanol dengan tujuan untuk prefraksinasi awal. 2. Pada penelitian sebelumnya, ekstrak n-heksana, etil asetat dan n-butanol dari kulit batang asam kandis mempunyai aktivitas antiplasmodium terhadap strain FCR-3 dan 3D7.

3. Untuk menguji aktivitas antiplasmodium secara in vitro digunakan P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan strain W2 (resisten klorokuin) dengan metode mikroskopik dan metode SYBR Green I. 4. Ekstrak daun asam kandis mengandung senyawa xanton yang dapat berfungsi sebagai anti malaria.

BAB III RENCANA PENELITIAN

A. Prinsip Penelitian Penelitian merupakan penelitian eksperimental secara in vitro, efek dari ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dilihat berdasarkan aktivitas hambatan pertumbuhan dari P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan strain W2 (resisten klorokuin) pada kultur.

B. Bahan Penelitian Bahan Penelitian adalah daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) yang diperoleh dari Desa Nangkalis Kab. Kapuas Hulu, Kalimantan Barat di determinasi di Herbarium Bogoriensis Botani, LIPI Bogor.

C. Tempat Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Pancasila dan di Laboratorium NAMRU-2 bagian Parasitic Diseases, Program, Badan Litbang Kesehatan, Jakarta.

D. Prosedur Penelitian 1. Pengumpulan bahan 2. Pembuatan simplisa 3. Pembuatan ekstrak 4. Identifikasi ekstrak 5. Pembuatan kultur 6. Preparasi bahan uji 7. Uji aktivitas antiplasmodium

E. Analisis Data Hasil yang diperoleh dalam penelitian dianalisis sebagai berikut : 1. Metode mikroskopik Data ditampilkan dalam bentuk tabel % hambat pertumbuhan. Konsentrasi penghambatan 50 % (IC50) ditetapkan dengan analisa probit berdasarkan hubungan log konsentrasi dan nilai probit.

Angka parasitemia = Jumlah eritrosit yang terinfeksi parasit x 100% Jumlah eritrosit yang diamati % Hambat = Kontrol – Angka parasitemia x 100% Kontrol

2. Metode SYBR Green I Data ditampilkan dalam bentuk tabel log konsentrasi dan linieritas fluoresensi. Konsentrasi penghambatan 50 % (IC50) didapatkan dengan memasukkan data antara log konsentrasi dan linieritas fluoresensi ke dalam program Microsoft Excel. Selanjutnya data dianalisis dengan regresi non linier menggunakan Software Graphad Prism (San Diego, CA)

BAB IV BAHAN, ALAT DAN METODE PENELITIAN

A. Bahan 1. Bahan utama penelitian Ekstrak kloroform dan ekstrak metanol dari daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq, biakan parasit P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan strain W2 (resisten klorokuin). 2. Bahan pereaksi a. CCM RPMI 1640 (Gibco BRL, Cat.No:31800-014), HEPES (Sigma, Cat. No:H-3375), Natrium bicarbonat, Gentamicin Sulphate Solution 50 mg/mL (Sigma, G-1522). b. Uji aktivitas antiplasmodium CCM, Natrium klorida 3,5 %, sorbitol 500 g (Sigma, Cat.No:5-3889), Giemsa 10 % (merk, Cat.No:1.09204.0500), Methanol pro analysis (Merk,Cat.No:1.06009.2500),Microscopy

immersion

oil

(Merk,

Cat.No:1.04699.0500), Hypoxanthine (Sigma, Cat.No:H9377), Lysis buffer, SYBR Green I stock solution (Molecular Probes Inc, Cat.No:S7563), sel darah manusia golongan O+, serum darah manusia golongan O+. c. Identifikasi ekstrak Ammoniak 30 %, kloroform, asam klorida pekat, serbuk magnesium, amil alkohol, natrium hidroksida 1 N, besi (III) klorida 1%, natrium asetat, eter, asam asetat anhidrat, asam sulfat pekat, petroleum eter, pereaksi Dragendorff, pereaksi Mayer, pereaksi stiassny, pereaksi LiebermannBurchard, pereaksi semprot serium sulfat.

B. Alat Saringan milipore 0,2µm (Nalgene disposable filterware, Cat.No:120-0020), Water-bath (Fisher scientific, Cat.No:15-458-106), Candle jar (Pyrex), Inkubator (NAPCO, Cat.No:G101FC1), Laminary Air Flow (Biogard Hood The Baker Company, model:315, Type:A2,Class:II, Cat.No:BM18502) Cultur Flask / Lempeng kultur (Corning Flask. Cat.No:430168), 96 Well cell Cultur Cluster / mikroplate dengan 96 sumuran (Costar, Cat.No:3596), Screw capped conical tubes 15 mL (Labcon, Cat.No:3131-345008), Mikro pipet (P20, P50,P100 µL) (Gilson), yellow tip dan blue tip 20 µL, 50 µL, 100 µL (Hydrologix pipet tips, Cat.No:3920), mikroskop (NICON Eclipse E400 dan NICON Eclipse E600), gelas obyek (Diagger 4591, Cat.No:615978A), fluorescence plate reader (infinite 200), tissue culture disk, ukuran:60x15mm polystrene 20/slave (Corning, Cat.No:steril 25010), disposable serological pipet 1mL, 2mL, 5mL, 10mL non pyrogenic polystrene individually wrapped steril (Costar, Cat.No:4051), pipet tetes (Brand, Cat.No:747720), tabung sterilisasi pipet tetes (Bellco, Cat.No:B38), tabung effendorf, Lab count denominator, bejana kromatografi, lempeng KLT.

C. Metode penelitian 1. Identifikasi Ekstrak a. Penapisan fitokimia terhadap ekstrak 1) Identifikasi golongan alkaloid Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak dilembabkan dengan 5 mL ammonia 30 % dan digerus dalam mortir. Setelah itu ditambahkan 20 mL kloroform, gerus kembali dengan kuat, campuran tersebut disaring dengan kertas saring. Filtrat berupa larutan organik diambil (sebagai Larutan A). Sebagian larutan A (10 mL) diekstraksi dengan asam klorida (1:10) dengan pengocokan dalam tabung reaksi, kemudian ambil fase asam (larutan B). sebagian larutan A diteteskan beberapa tetes pada kertas saring atau diteteskan dengan pereaksi Dragendorff, terbentuk warna merah atau jingga menunjukkan adanya alkaloid. Ke dalam dua tabung reaksi yang berisi 5 mL larutan B

ditambahkan beberapa tetes pereaksi Dragendorff terbentuk warna jingga atau endapan putih dengan pereaksi Mayer, membuktikan adanya alkaloid. 2) Identifikasi golongan flavonoid Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak ditambahkan dengan 100 mL air panas, didihkan selama 5 menit, kemudian saring dengan kertas saring, filtrat yang diperoleh akan digunakan sebagai larutan percobaan. Sebanyak 5 mL larutan percobaan dimasukkan kedalam tabung

reaksi,

kemudian

ditambahkan

serbuk

atau

lempeng

magnesium secukupnya dan 1 mL amil alkohol dikocok dengan kuat, dibiarkan hingga memisah, akan terbentuk warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya senyawa golongan flavonoid. 3) Identifikasi golongan saponin Sejumlah lebih kurang 10 mL yang diperoleh dari percobaan (b) diatas, dimasukkan kedalam tabung reaksi dan dikocok secara vertikal selama 10 detik, jika dibiarkan selama 10 menit terbentuk busa yang stabil dalam tabung reaksi menunjukkan adanya golongan saponin, bila diteteskan 1 tetes asam klorida 1 % (encer) busa tetap stabil. 4) Identifikasi golongan tanin Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak ditmabahkan dengan 100 mL air panas, di didihkan selama 1 menit, didinginkan dan disaring dengan kertas saring dan filtrat dibagi menjadi dua bagian. Ke dalam filtrat yang pertama ditambahkan larutan besi (III) klorida 1 %, terbentuk warna biru tua atau hijau kehitaman menunjukkan adanya senyawa golongan tannin. Ke dalam filtrat yang kedua jika ditambahkan 15 mL peraksi stiassny (formaldehid 30 % - asam klorida pekat = 2 : 1), dipanaskan diatas penangas air, terbentuk endapan warna merah muda menunjukkan adanya tannin katekuat. Selanjutnya endapan disaring, filtrate dijenuhkan dengan natrium asetat, ditambahkan beberapa tetes

larutan besi (III) klorida 1 % terbentuk warna biru tinta menunjukkan adanya tannin galat. 5) Identifikasi golongan kuinon Sejumlah lebih kurang 10 mL larutan percobaan yang diperoleh dari percobaan (b), dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan beberapa tetes larutan natrium hidroksida 1 N, terbentuk warna merah menunjukkan adanya senyawa golongan kuinon. 6) Identifikasi golongan steroid dan triterpenoid Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak dimaserasi dengan 20 mL eter selama 2 jam (dalam wadah tertutup rapat), disaring dan diambil filtratnya, 5 mL dari filtrat tersebut diuapkan dalam cawan penguap hingga diperoleh residu atau sisa, ke dalam residu ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat (pereaksi Liebermann-Burchard), terbentuk warna hijau menunjukkan adanya senyawa steroid dan warna merah menunjukkan adanya triterpenoid. 7) Identifikasi golongan minyak atsiri Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 mL pelarut petroleum eter dan dipasangkan corong gelas (yang diberi lapisan kapas yang telah dibasahi dengan air) pada mulut tabung, dipanaskan selama 20 menit diatas penangas air didinginkan, disaring dengan kertas saring, filtrat diuapkan pada cawan penguap, residu berbau aromatis atau menyenangkan, menunjukkan adanya senyawa golongan minyak atsiri. 8) Identifikasi golongan kumarin Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan 10 mL pelarut kloroform yang dipasang corong (diberi lapisan kapas yang tekah dibasahi air) pada mulut tabung, selanjutnya dilakukan pemanasan selama 10

menit diatas penangas air dan

didinginkan disaring dengan kertas saring, filtrat diuapkan pada cawan penguap sampai kering, sisa ditambah air panas. Sebanyak 10 mL filtrat didinginkan,larutan dimasukkan ke dalam tabung reaksi,

ditambahkan 0,5 mL larutan ammonia 10 %, diamati di bawah sinar lampu ultraviolet pada panjang gelombang 366 nm, maka tejadi fluoresensi warna biru atau hijau menunjukkan adanya golongan kumarin. b. Analisa dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Ekstrak yang diperoleh dianalisa menggunakan kromatografi lapis tipis, dengan menotolkan 10 µL sampel pada lempeng silika gel GF254 kemudian dieluasi. Cairan eluasi untuk ekstrak kloroform adalah nheksana : etil asetat = 3 : 2 dan untuk ekstrak metanol adalah kloroform : etil asetat = 2 : 3. Bercak yang didapat diamati pada sinar biasa, UV 254 nm, dan 366 nm. Kemudian disemprot dengan pereaksi semprot serium sulfat, Liebermann-Burchardatt, dan uap amoniak. Bercak diamati pada sinar biasa, UV 254 nm, dan 366 nm.

2. Pembuatan kultur P. falcifarum Prosedur penelitian berdasarkan Standard Operating Procedure Cultivation Of Plasmodium falciparum In Vitro (22) dan Malaria SYBR Green I-Based Fluorescence (MSF) Assay Protocol dari U.S. NAMRU-2 (23). a. Thawing P. falcifarum Ampul yang mengandung strain P. falcifarum diambil dari tabung nitrogen, dicairkan pada water bath 37o C selama beberapa menit. Isi ampul dipindahkan ke conical tube, ditambahkan larutan natrium klorida 3,5 %. Larutan dipindahkan ke dalam tabung sentrifugasi dan disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rotasi per menit selama 7 menit. Supernatan di buang. Ditambahkan 0,15 mL CCM dan disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rotasi per menit selama 7 menit, dihilangkan supernatan. Kemudian tambahkan CCM dan sel darah merah yang tidak terinfeksi. Tiap 1 mL suspensi di tambah 5 mL CCM dan dipindahkan 2 mL larutan suspensi kedalam lempeng kultur.

b. Pembuatan kultur P. falcifarum P. falcifarum dibiakan dengan metode candle jar (Trager dan Jensen, 1976). Sel darah merah yang terinfeksi parasit dibiakan dalam lempeng kultur yang mengandung 4 mL CCM. Kultur tersebut dilakukan di dalam LAF dalam kondisi steril, kemudian di inkubasi di dalam inkubator pada temperatur 37o C. c. Mempertahankan kultur Pergantian medium untuk mempertahankan kultur dilakukan tiap 24 jam dan dilakukan di dalam LAF dalam kondisi steril. Lempeng kultur di ambil dari dalam inkubator dan dimasukkan kedalam LAF. Medium lama dibuang dengan menggunakan pipet tetes steril tanpa mengambil sel darah merah yang terinfeksi. Kemudian dengan menggunakan pipet steril tambahkan 3,5 mL – 4 mL medium baru kedalam tiap-tiap lempeng kultur, kemudian homogenkan. Lempeng kultur dimasukkan ke dalam candle jar kemudian dimasukkan ke dalam inkubator suhu 37o C. Apabila angka parasitemia mencapai 6 - 8% maka kultur siap untuk di panen, selanjutnya mengikuti prosedur 4. 3. Preparasi bahan uji Bahan uji (ekstrak daun asam kandis) sebanyak 5 mg dilarutkan dengan etanol sebanyak 3 mL sebagai larutan stock. Larutan stock ini kemudian di encerkan dengan RPMI 1640 sehingga didapatkan satu seri konsentrasi larutan uji 4, 20, 100, 200, dan 400 µg/mL. 4. Sinkronisasi Untuk uji aktivitas antiplasmodium, parasit yang dipakai adalah stadium ring. Untuk proses sikronisasi, dipindahkan sel darah merah yang terinfeksi kedalam tabung sentrifugasi dan di sentrifugasi dengan kecepatan 1500-2000 putaran per menit selama 10 menit, supernatant dibuang. Larutan sorbitol 5 % ditambahkan ke dalam endapan parasit, dihomogenkan dan didiamkan selama 5 menit. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1500-2000 putaran per menit selama 10 menit, supernatan dibuang. Kemudian CCM ditambahkan untuk membuat suspensi parasit sehingga endapan parasit yang hanya terdiri

dari stadium ring akan di peroleh. Parasit dikembalikan kedalam lempeng kultur dan di inkubasi pada suhu 37o C selama 48 jam. 5. Uji aktivitas antiplasmodium Mikrokultur yang digunakan mempunyai 96 sumuran. Pada kolom pertama dimasukkan RPMI 1640 sebanyak 12,5 µL, pada kolom dua sampai enam dimasukkan 12,5 µL ekstrak kloroform dan kolom tujuh sampai sebelas dimasukkan 12,5 µL ekstrak metanol dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi. Masing- masing sumuran diisi dengan 100 µL kultur. Mikrokultur kemudian diletakkan candle jar. Agar terdapat konsentrasi gas optimal, candle jar ditutup rapat pada sewaktu nyala lilin di dalamnya akan mati, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada temperatur 37o C selama 48 jam. Lempeng sumur mikro dikeluarkan, untuk metode mikroskop, suspensi bagian atas dibuang. Suspensi yang pekat dibuat sediaan apusan darah tebal dengan cara suspensi pekat dipipet kemudian diteteskan pada objek glass, apusan yang terbentuk dikeringkan selama 5-10 menit. Setelah kering ditambahkan pewarna giemsa 10 % pada apusan darah dan dibiarkan 15 - 20 menit, selanjutnya giemsa dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Apusan yang terbentuk dapat dilihat pada mikroskop (perbesaran 100 kali) dengan menambahkan minyak emersi kemudian dihitung sel darah merah yang terinfeksi P. falcifarum setiap 200 sel darah merah dan dihitung angka % parasitemia. Untuk metode SYBR Green I, 100 µL lisis buffer yang berisi SYBR Green I dimasukkan pada tiap-tiap sumuran. Lempeng sumur mikro diinkubasi dalam kondisi gelap selama 1 jam dan dibaca pada alat fluoresence plate reader.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

A B C D E F G H Gambar IV.1. gambaran lempeng sumur mikro uji aktivitas antiplasmodium Keterangan : = RPMI 1640 = diisi dengan berbagai konsentrasi (fase kloroform) = diisi dengan berbagai konsentrasi (fase metanol) A-B

= Strain D6

C-D

= Strain W2

12

BAB V HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 1. Identifikasi Ekstrak a. Penapisan fitokimia Tabel V.1 senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis. Senyawa kimia Ekstrak klorofom Ekstrak metanol Alkaloid Flavonoid + + Saponin + Tanin Kuinon + Steroid/triterpenoid + + Minyak atsiri Kumarin + + Keterangan : + : terdapat senyawa dalam ekstrak - : tidak terdapat senyawa dalam ekstrak

Tabel V.1 menunjukkan hasil penapisan fitokimia. Pada ekstrak kloroform diperoleh senyawa flavonoid, steroid/triterpenoid, dan kumarin. Sedangkan pada ekstrak metanol diperoleh senyawa flavonoid, saponin, kuinon, steroid/triterpenoid dan kumarin.

b. Analisis dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Hasil analisis dengan KLT pada ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq)

1) Ekstrak kloroform

(A)

(D)

(B)

(C)

(E)

(F)

Gambar V.1 Profil bercak KLT pada ekstrak kloroform Keterangan : fase diam : silika gel fase gerak : n-heksana : etil asetat = 3 : 2 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm (D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm

Pada Gambar V.1 dapat dilihat terdapat 5 bercak pada ekstrak kloroform jika dilihat dari sinar biasa. Pada sinar UV 245 nm terdapat 6 bercak, sedangkan pada UV 366 nm terdapat 6 bercak.

(A)

(D)

(B)

(E)

(C)

(F)

Gambar V.2 Profil Profil bercak KLT ekstrak kloroform diuapi dengan uap amoniak Keterangan : fase diam : silika gel fase gerak : n-heksana : etil asetat = 3 : 2 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm (D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) :Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm

Pada gambar V.2 dapat dilihat terdapat 5 bercak berwarna kuning kecokelatan dilihat dari sinar biasa, pada sinar UV 254 terdapat 6 bercak berwarna kuning sedangkan pada sinar UV 366 nm terdapat

6 bercak, bercak dimana bercak kuning kehijauan ( ditunjukkan oleh panah) yang merupakan senyawa flavonoid.

(A)

(D)

(B)

(E)

(C)

(F)

Gambar V.3. Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi Liebermann-Burchard. Keterangan : fase diam : silika gel fase gerak : n-heksana : etil asetat = 3 : 2 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm (D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 36 nm

Pada gambar V.3 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi Liebermann burchard dan dipanaskan di oven suhu 100oC selama Liebermann-burchard

10 menit membuat 4 bercak menjadi warna coklat pada sinar biasa, pada sinar UV 254 nm bercak tidak dapat terlihat dengan jelas dimana

titik titik titik-titik

ungu

merupakan

warna

dari

pereaksi

semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm terdapat 5 bercak, adanya bercak warna biru muda (ditunjukkan oleh panah) merupakan senyawa steroid-triterpenoid. ste

(A)

(D)

(B)

(E)

(C)

(F)

Gambar V.4 Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi serium sulfat Keterangan : fase diam : silika gel fase gerak : n-heksana : etil asetat = 3 : 2 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm (D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm

Pada gambar V.4 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi serium sulfat dan dipanaskan di oven suhu 100oC selama 10 menit terlihat 4 bercak berwarna abu-abu pada sinar biasa(ditunjukkan oleh panah), pada sinar UV 254 nm bercak tidak dapat terlihat dengan jelas dimana titik-titik ungu merupakan warna dari pereaksi semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm terdapat 1 bercak yang berwarna kuning kehijauan (ditunjukkan oleh panah) merupakan senyawa flavonoid.

2) Ekstrak metanol

(A)

(D)

(B)

(E)

(C)

(F)

Gambar V.5 profil bercak KLT ekstrak metanol Keterangan : fase diam : silika gel fase gerak : kloroform : etil asetat = 2 : 3 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm (D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm

Dari gambar V.5 tidak terlihatnya bercak pada sinar biasa dan sinar UV 254 nm, sedangkan terdapat 1 bercak tipis berwarna kuning kehijauan (ditunjukkan oleh panah) terlihat pada sinar UV 366 nm.

(A)

(B)

(C)

(D) (E) (F) Gambar V.6 profil bercak KLT ekstrak metanol diuapi dengan uap amoniak Keterangan : fase diam : silika gel fase gerak : kloroform : etil asetat = 2 : 3 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm (D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm

Dari gambar V.6 tidak didapatkan bercak jika dilihat dari sinar biasa dan sinar UV 254 nm, sedangkan terlihat 1 bercak tipis berwarna kuning kehijauan (ditunjukkan oleh panah) yang merupakan senyawa flavonoid.

(A)

(D)

(B)

(E)

(C)

(F)

Gambar V.7 Profil bercak KLT ekstrak metanol dengan pereaksi LiebermannBurchard. Keterangan : fase diam : silika gel fase gerak : kloroform : etil asetat = 2 : 3 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm (D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT sinar UV 366 nm

Dari gambar V.7 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi Liebermann-burchard dan dipanaskan di oven suhu 100oC selama 10 menit tidak terdapat bercak pada sinar biasa. Pada sinar UV 254 nm tidak terlihatnya bercak dan titik-titik ungu merupakan warna

dari pereaksi semprotnya. Pada sinar UV 366 nm terdapat 1 bercak tipis berwarna biru (ditunjukkan oleh panah) yang merupakan senyawa steroid/triterpenoid.

(A)

(D)

(B)

(E)

(C)

(F)

Gambar V.8 profil bercak KLT ekstrak metanol dengan pereaksi serium sulfat Keterangan : fase diam : silika gel fase gerak : kloroform : etil asetat = 2 : 3 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm (D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm

Dari gambar V.8 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi serium sulfat dan dipanaskan di oven suhu 100oC selama 10 menit

tidak terdapat bercak pada sinar biasa. Pada sinar UV 254 nm tidak terlihatnya bercak dan titik-titik ungu merupakan warna dari pereaksi semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm adanya 1 bercak tipis warna kuning kehijauan (ditunjukkan oleh panah) merupakan senyawa flavonoid. 2. Pengujian aktivitas antiplasmodium Hasil pengamatan terhadap aktivitas penghambatan pertumbuhan parasit P. falcifarum strain D6 dan strain W2 secara in vitro dari berbagai ekstrak daun asam kandis dengan metode mikroskopik dan metode SYBR Green I. a.

Metode Mikroskopik 1) Ekstrak kloroform dan ekstrak metanol strain D6 ( Sensitif Klorokuin) Tabel V.2 Hambatan pertumbuhan P. falcifarum strain D6 (%) dari ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq pada berbagai konsentrasi. Konsentrasi ekstrak % hambat pertumbuhan (µg/mL) Ekstrak kloroform Ekstrak metanol 4 -42,93 14,04 20 36,48 10,49 100 73,55 85,45 200 88,95 93,37 400 96,50 97,88

Pada tabel V.2 dihitung % hambat pertumbuhan P. falcifarum strain D6 dari berbagai konsentrasi ekstrak kloroform dan ekstrak metanol, terlihat pada ekstrak kloroform semakin tinggi konsentrasi maka semakin tinggi nilai % hambat pertumbuhan P. falcifarum. Sedangkan pada ekstrak metanol terlihat terjadi penurunan % hambat pertumbuhan pada konsentrasi 20 µg/mL dan kemudian pada konsentrasi berikutnya akan mengalami peningkatan.

Nilai negatif pada ekstrak kloroform pada

konsentrasi 4 µg/mL menunjukkan bahwa tidak terjadi hambatan pertumbuhan P. falcifarum.

probit

10 8 6 4 2 0 -2 0 -4 -6

y = 2,2119 + 1,8333 x

ekstrak kloroform ekstrak metanol

1

2

3

log konsentrasi

Gambar V.9 Kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan probit

Untuk memperoleh nilai IC50 dibuat terlebih dahulu kurva persamaan garis regresi linier (Gambar V.9). Berdasarkan persamaan garis linier tersebut didapat nilai IC50 dari ekstrak kloroform daun asam kandis

sebesar 33,17 µg/mL dan dari

ekstrak metanol sebesar 32,44 µg/mL.

(RPMI 1640)

(konsentrasi 4 µg/mL)

(konsentrasi 20 µg/mL)

(konsentrasi 100 µg/mL)

(konsentrasi 200 µg/mL)

(konsentrasi 400 µg/mL)

Gambar V.10 P. falcifarum Strain D6 (sensitif) ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq) dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi

Pada gambar V.10. menunjukkan perkembangan P. falcifarum strain D6 dibandingan dengan kontrol negatif (RPMI 1640), terlihat semakin tinggi konsentrasi dari ekstrak kloroform maka perkembangan hidup P. falcifarum semakin berkurang. Daerah yang ditunjukkan oleh tanda panah merupakan sel darah merah yang terinfeksi oleh P. falcifarum.

(RPMI 1640)

(konsentrasi 4 µg/mL)

(konsentrasi 20µg/mL)

(konsentrasi 100 µg/mL)

(konsentrasi 200 µg/mL) (konsentrasi 400 µg/mL) Gambar V.11 P. falcifarum strain D6 (sensitif) ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi

Dari gambar V.11 menunjukkan perkembangan P. falcifarum strain D6 dan dibandingan dengan kontrol negatif (RPMI 1640), terlihat semakin tinggi konsentrasi dari ekstrak metanol maka perkembangan hidup P. falcifarum semakin berkurang. Daerah yang ditunjukan oleh panah merupakan sel darah merah yang terinfeksi P.falcifarum.

2) Ekstrak kloroform dan ekstrak metanol Strain W2 ( Resistensi Klorokuin) Tabel V.3 Hambatan pertumbuhan P. falciparum strain W2 (%) dari ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq) pada berbagai konsentrasi. Konsentrasi ekstrak % hambat pertumbuhan (µg/mL) Ekstrak kloroform Ekstrak metanol 4 -27,98 7,97 20 69,32 -8,84 100 82,87 60,66 200 83,50 90,34 400 92,66 91,28

Pada tabel V.3 dihitung % hambat pertumbuhan P. falcifarum strain W2 dari berbagai konsentrasi ekstrak kloroform dan ekstrak metanol,

terlihat

pada

ekstrak

kloroform

semakin

tinggi

konsentrasi maka semakin tinggi nilai % hambat pertumbuhan P. falcifarum. Sedangkan pada ekstrak metanol terlihat terjadi penurunan % hambat pertumbuhan pada konsentrasi 20 µg/mL dan kemudian

pada

peningkatan.

Nilai

konsentrasi negatif

berikutnya pada

ekstrak

akan

mengalami

kloroform

pada

konsentrasi 4 µg/mL dan ekstrak metanol pada konsentrasi 20 µg/mL menunjukkan bahwa tidak terjadi hambatan pertumbuhan P. falcifarum.

10

probit

8 6 4 2 0 -2 0 -4

ekstrak kloroform

1

2

3

ekstrak metanol

-6 log konsentrasi

Gambar V.12 kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan probit

Untuk dapat memperoleh nilai IC50 dibuat terlebih dahulu kurva persamaan garis regresi linier (gambar V.12). Berdasarkan persamaan garis linier tersebut didapat nilai IC50 dari ekstrak kloroform daun asam kandis sebesar 0,55 µg/mL dan dari ekstrak metanol sebesar 41,23 µg/mL.

(RPMI 1640)

(konsentrasi 20 µg/mL)

(konsentrasi 4 µg/mL)

(konsentrasi 100 µg/mL)

(konsentrasi 200 µg/mL) (konsentrasi 400 µg/mL) Gambar V.13 P. falcifarum Strain W2 (resisten) ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dalam sel daram merah pada berbagai konsentrasi

Dari gambar V.13 menunjukkan perkembangan P. falcifarum strain W2 pada berbagai konsentrasi dan dibandingan dengan kontrol negatif (RPMI 1640), terlihat semakin tinggi konsentrasi dari ekstrak kloroform maka perkembangan hidup P. falcifarum semakin berkurang. Daerah yang ditunjukan oleh panah merupakan sel darah merah yang terinfeksi P. falcifarum.

(RPMI 1640)

(konsentrasi 20 µg/mL)

(konsentrasi 4 µg/mL)

(konsentrasi 100 µg/mL)

(konsentrasi 200 µg/mL) (konsentrasi 400 µg/mL) Gambar V.14 .P. falcifarum strain W2 (resisten) ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq) dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi Dari gambar V.14 menunjukkan perkembangan P. falcifarum strain W2 pada berbagai konsentrasi dan dibandingan dengan kontrol negatif (RPMI 1640), terlihat semakin tinggi konsentrasi dari ekstrak metanol maka perkembangan hidup P. falcifarum semakin berkurang. Daerah yang ditunjukan oleh panah merupakan sel darah merah yang terinfeksi P.falcifarum.

3) Kontrol Positif ( Klorokuin) Tabel V.4 Hambatan pertumbuhan P. falciparum strain D6 dan strain W2 (%) dari klorokuin pada berbagai konsentrasi Konsentrasi % hambat pertumbuhan (ng/mL) strain D6 strain W2 6,25 19,19 -5,78 12,5 32,57 25,91 25 68,04 -49,68 50 88,63 37,04 100 98,19 23,55 200 98,19 40,26 400 96,34 -8,56 800 93,29 38,33 1600 99,04 64,45

Pada tabel V.4 dihitung nilai % hambat pertumbuhan P. falcifarum strain D6 dari berbagai konsentrasi klorokuin, terlihat pada konsentrasi 400 ng/mL dan 800 ng/mL mengalami penurunan % hambat, pada konsentrasi berikutnya akan mengalami peningkatan. Pada strain W2 terlihat pada konsentrasi 25 ng/mL, 100 ng/mL, 400 ng/mL mengalami penurunan % hambat. Nilai negatif pada strain W2 menunjukkan bahwa tidak terjadi hambatan pertumbuhan P. falcifarum.

10 8

probit

6 4 2 0 -2 0 -4

1

2

3

4

strain D6 strain W2

-6 log konsentrasi

Gambar V.15 Kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan probit

Terlihat kurva hubungan antara log konsentrasi dan nilai probit dari klorokuin. Pada strain D6 terlihat kurva nilai probit menunjukkan

peningkatan

aktivitas

dengan

meningkatnya

konsentrasi, sedangkan pada strain W2 terlihat kurva nilai probit mengalami penurunan aktivitas dengan meningkatnya konsentrasi. b. Metode SYBR Green I 1) Ekstrak kloroform Tabel V.5 Nilai linieritas fluoresensi pada P. falcifarum dari ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) pada berbagai konsentrasi Konsentrasi Log Linearitas fluoresensi (µg/mL) konsentrasi D6 (I) D6 (II) W2 (I) W2 (II) 4

0,6020

23265

21880

29580

29722

20 100 200 400

1,3010 2 2,3010 2,6020

14450 9636 9091 8379

12848 9531 9099 9790

7313 6750 5868 5124

7343 6653 5754 5286

Pada tabel V.5 menunjukkan semakin meningkat konsentrasi ekstrak kloroform daun asam kandis maka semakin rendah nilai linieritas fluoresensi. 2) Ekstrak metanol Tabel V.6. Nilai linearitas fluoresensi pada P. falcifarum dari ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq) pada berbagai konsentrasi Konsentrasi Log Linearitas fluoresensi (µg/mL) konsentrasi D6 (I) D6 (II) W2 (I) W2 (II) 4 20 100 200 400

0,6020 1,3010 2 2,3010 2,6020

32822 26422 12504 10208 9593

31574 26079 11556 9954 8895

34271 32396 7992 6481 5933

33555 29937 7401 6234 6270

Pada tabel V.6 menunjukkan semakin meningkat konsentrasi ekstrak metanol daun asam kandis maka semakin rendah nilai linieritas fluoresensi.

c. Kontrol positif (Klorokuin) Tabel V.7 Nilai fluoresensi pada P falcifarum dari klorokuin pada berbagai konsentrasi Konsentrasi Log konsentrasi Linearitas fluoresensi (µg/mL) D6 (I) D6 (II) W2 (I) W2 (II) 6,25 12,5 25 50 100 200 400 800 1600

0,7958 1,0969 1,3979 1,6989 2 2,3010 2,6020 2,9030 3,2041

38189 37309 30834 11501 11279 10806 10782 10804 11759

36948 39701 33016 11486 11229 11337 11309 11339 11424

35634 34410 34509 35111 34625 30933 10009 8599 8886

35206 34904 33883 34337 33464 28716 10714 8534 8842

Pada tabel V.7 menunjukkan semakin meningkat konsentrasi klorokuin maka semakin rendah nilai linieritas fluoresensi.

Tabel V.8 Nilai IC50 dari tiap ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq) Ekstrak Nilai IC50 pada Metode Nilai IC50 pada metode SYBR mikroskopik Green strain D6

strain W2

strain D6

strain W2

Ekstrak Kloroform

33,17 µg/mL

0,55 µg/mL

14,29 µg/mL

0,214 µg/mL

Ekstrak Metanol

32,44 µg/mL

41,23 µg/mL

48,00 µg/mL

56,37 µg/mL

Klorokuin

12,48 ng/mL

1083,9 ng/mL

25,62 ng/mL

227,60 ng/mL

Uji efek antiplasmodium secara in vitro dengan menggunakan kultur P. falcifarum dapat digunakan sebagai uji pendahuluan untuk mengevaluasi

bahan

alam

hayati

yang

prospektif

sebagai

antiplasmodium. Penelitian dilakukan pada ekstrak kloroform dan ekstrak metanol dari daun asam kandis dimana ekstrak kloroform bersifat semi polar sehingga dapat menarik senyawa-senyawa semi polar, ekstrak metanol bersifat polar yang dapat menarik senyawa polar. Penelitian dilakukan terhadap P. falcifarum strain D6 (sensitif

klorokuin) dan strain W2 (resisten klorokuin) dimana kedua strain ini telah ditetapkan oleh W.H.O sebagai standar strain P. falcifarum yang digunakan untuk menguji kesensitifan suatu obat atau bahan alam sebagai

antimalaria.

Pengujian

aktivitas

antiplasmodium

menggunakan 2 metode yaitu metode mikroskopik dan metode SYBR Green I. Penggunaan 2 metode ini bertujuan untuk mengetahui nilai IC50 dimana metode mikroskopik merupakan metode utama dalam mendiagnosa malaria dan metode SYBR Green I merupakan metode alternatif untuk menentukan perkembangan parasit secara in vitro. Selanjutnya aktivitas antiplasmodium dinyatakan dalam dengan IC50 yaitu yaitu kadar senyawa uji yang mampu menghambat pertumbuhan parasit sampai 50 %. Berdasarkan penggolongan menurut Gessler et al,(1994), penggolongan senyawa bahan alam berdasarkan aktivitas antiplasmodium dikelompokan menjadi 3 kategori antara lain sangat kuat yaitu tanaman dengan nilai IC50 < 10 µg/mL, kuat yaitu tanaman dengan nilai IC50 10-50 µg/mL, lemah yaitu tanaman dengan nilai IC50 > 50 µg/mL. Sebelum melakukan uji aktivitas antiplasmodium, dilakukan identifikasi ekstrak daun asam kandis dengan penapisan fitokimia dan KLT untuk mengetahui senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis. Profil kromatogram KLT dari ekstrak kloroform menunjukkan adanya senyawa flavonoid dan steroid/triterpenoid, sedangkan dari ekstrak metanol

menunjukkan

adanya

senyawa

flavonoid

dan

steroid/triterpenoid. Hal ini didukung dengan identifikasi KLT menggunakan uap amoniak yang menyebabkan adanya bercak berwarna kuning kehijauan yang merupakan senyawa flavonoid, dengan menggunakan pereaksi semprot Liebermann–burchard yang menyebabkan adanya bercak berwarna biru muda yang merupakan senyawa steroid/triterpenoid dan menggunakan pereaksi semprot serium sulfat yang menyebabkan adanya bercak berwarna kuning

kehijauan yang merupakan senyawa polifenol. Profil KLT ini juga didukung dengan hasil penapisan fitokimia berdasarkan metode Fransworth yang diperoleh senyawa flavonoid, steroid/triterpenoid pada

ekstrak

kloroform

dan

diperoleh

senyawa

flavonoid,

steroid/triterpenoid, saponin, kumarin, dan kuinon pada ekstrak metanol. Pengujian aktivitas antiplasmodium daun asam kandis dengan metode mikroskopik didapatkan nilai IC50 dari ekstrak kloroform strain D6 adalah 33,17 µg/mL dan strain W2 adalah 0,55 µg/mL. Sedangkan nilai IC50 dari ekstrak metanol strain D6 adalah 32,44 µg/mL

dan

strain

W2

adalah

41,23

µg/mL.

Berdasarkan

penggolongan menurut Gessler et al, (1994), menunjukkan bahwa ekstrak kloroform strain D6 menunjukkan aktivitas antiplasmodium kuat dan strain W2 menunjukkan aktivitas antiplasmodium sangat kuat. Sedangkan ekstrak metanol strain D6 dan strain W2 menunjukkan aktivitas antiplasmodium kuat. Nilai IC50 pada ekstrak kloroform strain W2 menunjukkan aktivitas antiplasmodium lebih baik dibandingkan dengan strain D6, hal ini menunjukkan ekstrak kloroform mempunyai mekanisme kerja yang berbeda yang menyebabkan ekstrak kloroform lebih sensitif pada strain W2. Tetapi apabila dibandingkan dengan kontrol positif (klorokuin), ekstrak kloroform dan ekstrak metanol mempunyai aktivitas antiplasmodium yang lebih lemah. Hal ini di sebabkan kandungan senyawa dari klorokuin sudah merupakan bentuk senyawa murni, sedangkan pada ekstrak kloroform dan ekstrak metanol masih banyak terdapat campuran senyawa kimia. Hasil pengujian dari metode SYBR Green I diperoleh nilai linearitas fluoresensi dari ekstrak kloroform dan ekstrak metanol yang menunjukkan nilai linieritas fluoresensi dari ke dua ekstrak tersebut mengalami penurunan dengan semakin meningkatnya konsentrasi. Hal ini disebabkan karena pada konsentrasi yang tinggi, jumlah

parasit hidup semakin sedikit, dimana prinsip kerja dari metode SYBR Green I ini adalah berikatan dengan DNA parasit yang masih hidup dan memberikan fluoresensi berwarna hijau pada DNA parasit. Pada tabel V.8 terlihat bahwa metode mikroskopik memberikan hasil IC50 yang berbeda dibandingkan dengan nilai IC50 pada metode SYBR Green I. meskipun metode SYBR Green I memiliki banyak keuntungan seperi praktis, memberikan hasil yang cepat,analisa nya otomatis dan tidak berbahaya tetapi tetapi apabila sampel kurang homogen maka nilai fluoresensi tidak dapat terbaca dan apabila kepadatan plasmodium terlalu padat dapat menyebabkan SYBR Green I tidak dapat mengikat sempurna dengan DNA parasit. Sedangkan metode mikroskopik merupakan metode utama dalam mendiagnosa malaria, metode ini sensitif dan spesifik. Mikroskopik dapat menghitung jumlah parasit dan juga dapat menentukan jenis Plasmodium malarianya. Cara ini memerlukan keahlian teknik, kemampuan

yang

terlatih

memerlukan

mikroskop

dalam

yang

membaca

berfungsi

sediaan

dengan

baik

malaria, tetapi

membutuhkan waktu yang lebih lama dibandingkan dengan metode SYBR Green I.

BAB VI SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan Ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) memiliki aktivitas antiplasmodium terhadap P. falcifarum pada strain D6 (sensitif klorokuin) dan strain W2 (resisten klorokuin) dengan menggunakan metode mikroskopik dan metode SYBR Green I. Ekstrak kloroform daun asam kandis memiliki aktivitas antiplasmodium lebih kuat dibandingkan dengan ekstrak metanol. Nilai IC50 dengan metode mikroskopik dari ekstrak kloroform pada strain D6 adalah 33,17 µg/mL dan strain W2 adalah 0,55 µg/mL sedangkan nilai IC50 ekstrak metanol strain D6 adalah 32,44 µg/mL dan strain W2 adalah 41,23 µg/mL. Nilai IC50 dengan metode SYBR Green I ekstrak kloroform strain D6 adalah 14,29 µg/mL dan strain W2 adalah 0,214 µg/mL sedangkan nilai IC50 ekstrak metanol strain D6 adalah 48,00 µg/mL dan strain W2 adalah 56,37 µg/mL.

B. Saran 1. Dilakukan penelitian lanjutan yaitu isolasi dan fraksinasi ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq). 2. Dilakukan penelitian uji aktivitas antiplasmodium terhadap daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) secara in vivo.

DAFTAR RUJUKAN

1. Sejarah penyakit malaria. Diambil dari : http://www.searo.who.int/en/Section10/ Section21/Section334.htm, Diakses pada tanggal 31 Juli 2009 2. Syamsudin, Soesanto Tjokrosonto, Subagus Wahyuono, Mustofa. Aktivitas antiplasmodium dari dua fraksi ekstrak n-heksana kulit batang asam kandis (Garcinia parvifolia Miq). Majalah Farmasi Indonesia, 18 (4). 2007. h. 210. 3. Litkhitwitayawuid, K., Chanmahasathein, W., Ruangrungsi, N., Krungkai,J. Xanthones with antimalarial activity from Garcinia dulcis. Planta Med., 64. 1998. h. 281-282. 4. Syamsudin, Shirly Kumala, Broto Sutaryo. Screening of some extracts from Garcinia parvifolia Miq (Guttiferae) for antiplasmodial, antioxidant, cytotoxic and antibacterial activities. Asian Journal of Plant Science. 2007. h. 973. 5. Syamsudin, Soesanto Tjokrosonto, Subagus Wahyuono, Mustofa. Invitro and invivo Antiplasmodial activity of stem bark extract of Garcinia parvifolia Miq (Guttiferae), Internasional Journal of Tropical Medicine. Ed. 22. 2007. h. 41-44. 6. Heyne, K. Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid III. Terjemahan Badan Litbang Kehutanan. Yayasan Sarana Wana Jaya; 1987. h. 1386 7. Daun asam kandis. Diambil dari : http://www.rimbundahan.org/environment/ plant_lists/guttiferae/Garcinia-parvifolia.jpg, Diakses pada 31 Juli 2009 8. Harbone, J.B.,Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisa Tumbuhan, terjemahan Padmawinata, K., Soediro, I., Penerbit ITB, Bandung, 1987. h. 99 9. Winholz, M., Budavari, S, R.f., Otterben, E.S. The merck index an encyclopedia of chemicals, drugs and biological. 14th ed. Merck and CO, inc. Rahway-USA. 1983. h. 10064 10. Sutrisno B., Reverse approach. Edisi I. Jakarta: Fakultas Farmasi Universitas Pancasila; 1986. h. 13-15. 11. Agoes, Goeswin. Teknologi Bahan Alam. Bandung: Institut Teknologi Bandung; 2007. h. 12-5,24-5 12. Sunkar, S & Pribadi, W., 1992. Resistensi Plasmodium Falcifarum terhadap obat- obat malaria. Majalah Kedokteran Indonesia 42 (3). h. 155-162

13. Data kematian akibat malaria. Diambil dari ghodata/?vid=450. Diakses pada tanggal 6 Agustus 2009.

:http://apps.who.int/

14. Malaria-Endemic Areas in the World. Diambil dari : http://globalucf.org/ Diakses pada tanggal 5 Agustus 2009

.

15. Anonim, 1993, Malaria Pengobatan, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, Buku 3. 16. Plasmodium falcifarum. Diambil dari :http://www.rph.wa.gov.av/malaria/ diagnostic.html. Diakses pada tanggal 5 Agustus 2009 17. Gandahusada, S., Ilahude, D.H.D., Pribadi, W. (ed), 198. Parasitologi kedokteran ed. III, Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 2002. h. 173-176. 18. Siklus hidup malaria. Diambil dari : http://www.uni-tuebingen.de/modeling/ malaria_LifeCycle.gif. Diakses pada tanggal 5 Agustus 2009 19. Basco Leonardo K. Field application of in vitro assays for the sensitivity of human malaria parasites to antimalarial drugs. Geneva: World Helath Organization; 2007. p. 16,22. 20. Budi Leksana, Ika Susanti, J. Kevin Baird. Standard operating procedure cultivation of plasmodium falcifarum in vitro. Jakarta: US NAMRU-2;1995. p. 17 21. Johnson Jacob D. Malaria SYBR Green I-based fluorescence (MSF) assay protocol. Maryland : Departemen of Parasitology Division of Experimental Therapeutic Walter Reed Army Institute of Research; 2006. p.2-7. 22. Finney DJ. Probit analysis; A statistical treatment of the sigmoid response curve. Cambridge; 1964 dikutip dari Syamsudin, Budi Prasetyo, Antonius. Efek antiplasmodium dari ekstrak etilasetat kulit batang asam kandis (Garcinia parvifolia) secara in vitro. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 2007;5(2).

LAMPIRAN

Lampiran 1. Hasil determinasi daun asam kandis

Lampiran 2. Skema pembuatan ekstrak daun asam kandis Serbuk daun asam kandis (G. parfivolia. (Miq)Miq) ± 300 g Dimaserasi selama ± 24 jam Dengan kloroform ± 2 liter, Saring, evaporasi

Ampas serbuk

ekstrak kloroform kental ( 5, 95 g)

Dimaserasi selama ± 24 jam Dengan metanol ± 2 liter, Saring, evaporasi

Ampas serbuk

ekstrak metanol Kental (7,02 g)

Lampiran 3. skema kerja pembuatan kultur P. falcifarum

Sel darah merah yang telah terinfeksi parasit

Dibiakkan dalam kultur plate yang mengandung 4ml CCM

Kultur dilakukan didalam LAF dalam kondisi steril

Medium diganti dengan yang baru setiap 24 jam masa inkubasi didalam inkubator pada temperatur 37°C

Kultur P. falciparum

Lampiran 4. skema pengujian aktivitas antiplasmodium (metode mikroskopik)

12,5 µL ekstrak 12,5 µL RPMI 1640+ 100 µL kultur

Masukkan dalam sumuran mikrokultur Masing-masing dengan konsentrasi 4; 20; 100; 200; 400 µg/mL Inkubasi 48 jam

Dipindahkan ke dalam tabung effendorf Sentrifugasi 10 menit

Endapan

Buat hapusan pada objek glass pewarna giemsa biarkan 15 menit

siram dengan air keringkan dan tambahkan imersi

dilihat dibawah mikroskop

supernatan

Lampiran 5. skema pengujian aktivitas antiplasmodium (metode SYBR Green I)

12,5 µL ekstrak 12,5 µL RPMI 1640 + 100 µL kultur

Masukkan dalam sumuran mikrokultur Masing-masing dengan konsentrasi 4; 20; 100; 200; 400 µg/mL Inkubasi 48 jam

Dipindahkan ke dalam tabung effendorf Sentrifugasi 10 menit

Endapan

tambahkan 100 µL lysis buffer berisi SYBR Green

inkubasi lempeng sumur mikro dalam kondisi gelap selama 1 jam

baca pada alat fluorescence plate reader

supernatan

Lampiran 6. Foto bahan uji antiplasmodium

Larutan uji ekstrak daun asam kandis dengan berbagai konsentrasi

Sediaan darah tebal pada objek glass strain D6

Sediaan darah tebal pada objek glass Strain W2

Lampiran 7. Foto alat uji antiplasmodium

Lab count denominator

Mikro pipet

Candle jar

Inkubator

Laminary Flow Cabinet

Mikroskop NICON Eclipse 600

Tabung Nitrogen

Water-bath

Lampiran 8. Gambar grafik dari metode SYBR Green I T ransform of AK 2 (D6) 25000 20000 15000 10000 5000 0 0

1

2

3

D6 (IC50 :14,29) Grafik hubungan konsentrasi dari ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan linieritas fluoresensi pada strain D6 T ransform of AK 2 (W2) 40000 30000 20000 10000 0 0

1

2

3

W2 (IC50 :0,214) Grafik hubungan konsentrasi dari ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan linieritas fluoresensi pada strain W2 T ransform of AK 1 (D6) 40000 30000 20000 10000 0 0

1

2

3

D6 (IC50 : 48,0) Grafik hubungan konsentrasi dari ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan linieritas fluoresensi pada strain D6

T ransform of AK 1 (W2) 40000 30000 20000 10000 0 0

1

2

3

W2 (IC50 : 56,37) Grafik hubungan konsentrasi dari ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan linieritas fluoresensi pada strain W2 T ransform of D ata 1 50000 40000 30000 20000 10000 0 0

1

2

3

4

D6 (IC50 : 25,62) Grafik hubungan konsentrasi dari klorokuin dengan linearitas fluoresensi pada strain D6 T ransform of Data 2 40000 30000 20000 10000 0 0

1 4 W2 (IC50:2 227,6) 3 Grafik hubungan konsentrasi dari klorokuin dengan linieritas fluoresensi pada strain W2

Lampiran 9. Jumlah skizon hidup dalam seluruh jumlah stadium parasit dalam sel darah merah pada area pandang mikroskop Ekstrak kloroform Konsentrasi strain D6 (sensitif) Strain W2 (resisten) (µg/mL) I II I II 4 20 100 200 400

72 229 31,44 20 215 9,30 12 204 5,88 5 216 2,32 2 220 0,91

Ekstrak Metanol Konsentrasi (µg/mL) 4 20 100 200 400

65 269 24,16 51 331 15,41 9 204 4,41 4 202 0,44 1 219 0,45

strain D6 (sensitif)

71 383 18,54 16 230 6,96 8 223 3,59 5 248 2,02 2 230 0,86

71 7 4 7 3

319 22,26 249 2,81 214 1,87 216 3,24 204 1,47

strain W2 (resisten)

I

II

I

37 329 11,25 34 314 10,83 9 280 3,21 3 279 1,08 1 278 0,36

63 284 22,18 89 371 23,99 7 287 2,44 3 202 1,49 1 242 0,41

47 350 13,43 59 343 17,20 30 342 8,77 4 265 1,51 4 238 1,68

II 59

371 15,90 49 280 17,50 10 265 3,77 4 254 1,57 3 271 1,11

Contoh perhitungan: Jumlah skizon hidup dalam seluruh sel darah merah dalam area pandang mikroskopik pada ekstrak kloroform strain D6 konsentrasi 4 µg/mL : 72 x 100 % = 31,44 % 229 72 : jumlah skizon 229 : jumlah ring, tropozoit dan skizon Contoh perhitungan diatas sama dengan perhitungan ekstrak kloroform dan ekstrak metanol pada tiap-tiap konsentrasi dan tiap strain.

Kontrol positif Klorokuin Konsentrasi strain D6 (sensitif) (ng/mL) I II 6,25

25

68 374 18,18 91 449 20,27 18 264

50

11

100

1

200

0

400

2

800

1

1600

0

12,5

6,82 222 4,95 212 0,47 206 0 201 0,99 201 0,49 222 0

109 443 23,74 55 374 14,71 29 297 2 1 2 2 7 1

9,76 213 0,94 218 0,46 213 0,94 222 0,90 235 2,98 203 0,49

Strain W2 (resisten) I 12

386 3,11 16 489 3,27 50 640

7,81 678 3,25 21 728 2,88 23 696 3,30 19 231 8,22 6 211 2,84 4 220 1,81 23

II 42

621 6,76 25 687 3,64 40 647 18

27 15 4 6 3

6,18 685 2,63 639 4,26 656 2,28 208 1,92 206 2,91 200 1,50

Contoh perhitungan: Jumlah skizon hidup dalam seluruh sel darah merah dalam area pandang mikroskopik pada klorokuin strain D6 konsentrasi 6,25 ng/mL : 68 x 100 % = 18,18 % 374 68 : jumlah skizon 374 : jumlah ring, tropozoit dan skizon. Contoh perhitungan diatas sama dengan perhitungan klorokuin pada tiap-tiap konsentrasi dan tiap strain.

Lampiran 10. Tabel Probit (23)

Probit Persentase

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0

-

2,67

2,95

3,12

3,25

3,36

3,45

3,52

3,59

3,66

10

3,72

3,77

3,82

3,87

3,92

3,96

4,01

4,05

4,08

4,12

20

4.16

4,19

4,23

4,26

4,29

4,33

4,38

4,39

4,42

4,45

30

4,48

4,50

4,53

4,56

4,59

4,61

4,64

4,67

4,69

4,72

40

4,75

4,77

4,80

4,82

4,85

4,87

4,90

4,92

4,95

4,97

50

5,00

5,03

5,05

5,08

5,10

5,13

5,15

5,18

5,20

5,23

60

5,25

5,28

5,31

5,33

5,36

5,39

5,41

5,44

5,47

5,50

70

5,52

5,55

5’58

5,61

5,64

5,67

5,71

5,74

5,77

5,81

80

5,84

5,88

5,92

5,95

5,99

6,04

6,06

6,13

6,18

6,23

90

6,28

6,34

6,41

6,48

6,55

6,64

6,75

6,88

7,05

7,33

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

7,33

7,37

7,41

7,48

7,51

7,58

7,66

7,75

7,88

8,09

99