ÚJ LEHETŐSÉGEK A GYERMEKKORI AKUT LIMFOID LEUKÉMIA DIAGNOSZTIKÁJÁBAN ÉS TERÁPIÁJÁBAN

ÚJ LEHETŐSÉGEK A GYERMEKKORI AKUT LIMFOID LEUKÉMIA DIAGNOSZTIKÁJÁBAN ÉS TERÁPIÁJÁBAN

Doktori értekezés

SZERZŐ:

DR. CSÓKA MONIKA

TÉMAVEZETŐ: PROF. DR. SZENDE BÉLA PROF. DR SCHULER DEZSŐ

II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika és I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Semmelweis Egyetem, Budapest

2001

TARTALOMJEGYZÉK 1.

Összefoglalás

5

2.

Summary

6

3.

Bevezetés

7

4.

Célkitűzések 4.1.

5.

Az apoptotikus index prognosztikai szerepének vizsgálata prednizolon-kezelés alatt gyermekkori ALL-ben

11

4.2.

Bispecifikus antitestek előállítása, tisztítása és jellemzése

11

4.3.

cALL-es gyermekek leukémia sejtjeinek fenotipizálása

11

4.4.

A perifériás vér limfocitáinak aktiválása

12

4.5.

A CD3xCD19 bispecifikus antitest által mediált lízis in vitro vizsgálata allogén és autológ rendszerben

12

Irodalmi háttér

13

5.1.

Akut limfoid leukémia

13

5.2.

Apoptózis

13

5.2.1. Morfológiai változások

14

5.2.2. Biokémiai változások

15

5.2.3. Apoptózis és kemoterápia

17

5.2.4. A kaszpázrendszer aktivációja

17

5.2.5. Receptorhoz kötött apoptózis

18

5.2.6. DNS-károsodás indukálta apoptózis

18

Immunterápia malignus betegségekben

20

5.3.1. Konjugálatlan monoklonális antitestek

21

5.3.2. Immuntoxinok

24

5.3.3. Radioimmunkonjugátumok

25

5.3.4. Bispecifikus antitestek

26

5.3.

6.

11

Módszerek

5.3.4.1. Célsejt antigének: CD19 és CD20

29

5.3.4.2. Effektor sejt antigén: CD3

30 32

6.1.

6.2.

7.

32

6.1.1. A vérminták előkészítése apoptózis vizsgálatokhoz

32

6.1.2. Fénymikroszkópos vizsgálat

32

6.1.3. Flow citometria

32

6.1.4. Klinikai vizsgálatok

33

6.1.5. Statisztikai feldolgozás

33

Bispecifikus antitestek előállítása és in vitro kipróbálása

33

6.2.1. OKT3xHD37 (CD3xCD19) és OKT3xMEM97 (CD3xCD20) hibrid-hibridóma előállítása

33

6.2.2. CD3xCD19 és CD3xCD20 bispecifikus antitestek előállítása és tisztítása

34

6.2.3. Immunfluoreszcens jelölés

35

6.2.4. A target sejtek és a perifériás vér mononukleáris sejtjeinek izolálása

35

6.2.5. A nyugvó T sejtek aktiválása

36

6.2.6. Citotoxicitási esszé

36

Eredmények 7.1.

38

Az apoptotikus index, mint prognosztikai faktor prednizolonkezelés alatt gyermekkori ALL-ben

38

A CD3xCD19 és a CD3xCD20 bispecifikus antitest előállítása, tisztítása és jellemzése

46

7.3.

cALL-es gyermekek leukémia sejtjeinek fenotipizálása

47

7.4.

A perifériás vér limfocitáinak aktiválása

48

7.5.

A CD3xCD19 bispecifikus antitest által mediált lízis in vitro rendszerben

55

7.2.

8.

Limfoblasztok apoptózisának vizsgálata

Megbeszélés 8.1. 8.2.

59

Az apoptotikus index, mint korai prognosztikai faktor prednizolonkezelés alatt gyermekkori ALL-ben

59

A CD3xCD19 bispecifikus antitest által mediált lízis allogén és autológ in vitro rendszerekben

63

9.

Következtetések

68

10.

Köszönetnyilvánítás

70

11.

Az értekezés témájában megjelent saját közlemények bibliográfiai adatai

72

11.1. Cikkek

72

11.2. Idézhető absztraktok

73

11.3. Előadások és poszterek

74

12.

Rövidítések jegyzéke

76

13.

Irodalomjegyzék

77

1. ÖSSZEFOGLALÁS Az ALL a leggyakoribb malignus betegség gyermekkorban. Mivel hagyományos terápiával a betegek 20 - 30 %-ánál nem sikerül gyógyulást elérni, új diagnosztikus és terápiás eljárások kidolgozására van szükség. A blasztok szteroid-érzékenységének prognosztikai jelentősége jól ismert. A prednizolon a blasztok apoptózisát idézi elő. Ezt a tényt kihasználva olyan diagnosztikus módszert akartunk kidolgozni, amely már a kezelés első óráiban információt adhatna a leukémiás sejtek szteroid-érzékenységéről. Így rezisztencia esetén már a kezelés korai szakaszában nagyobb intenzitású és hatásosabb kemoterápiát kezdhetnénk. Vizsgálataink azt mutatták, hogy mind a morfológiai mind a flow citometriás apoptózisvizsgálatok jól korreláltak a klinikai prednizolon-válasszal. Azoknál a betegeknél, akiknek a szervezetében a kezelés végén leukémiás sejtek maradnak, alternatív megoldásként szóba jön az immunterápia. In vitro kísérleteinkben CD3 és CD19 monoklonális antitestet szecernáló hibridómák fúziójával általunk előállított bispecifikus antitestet alkalmaztunk, amely egy antitest-molekulán belül két különböző kötőhellyel rendelkezik. Az egyik kötőhely (CD3) a T sejteket aktiválja a T-sejt receptor komplexen keresztül, míg a másik kar (CD19) a citotoxikus T sejteket a malignus B sejtekhez kapcsolja. Mivel a CD19 antigén expressziója valamennyi vizsgált gyermekkori B-sejtes leukémia esetében állandó és erős volt, ideális célantigénnek tűnt vizsgálataink számára. A CD3xCD19 bispecifikus antitest aktiválta a perifériás vér mononukleáris sejtjeit mind egészséges donorok, mind remisszióban levő ALL-es betegek esetében. A CD28 molekulán keresztül történt kostimuláció az aktiváció szintjét kismértékben fokozta, de a citotoxikus aktivitás nem változott. Kísérleteinkben bebizonyítottuk, hogy a CD3xCD19 bispecifikus antitest kostimuláció nélkül is hatékonyan aktiválja a citotoxikus T sejteket, majd az így előaktivált sejteket a malignus B sejtekhez kapcsolva azok lízisét idézi elő. Ez a módszer hatékony lehet recidiváló és/vagy terápia-rezisztens gyermekkori B-sejtes ALL-ben.

5

2. SUMMARY ALL is the most common hematological malignancy of childhood. As conventional therapy fails to achieve complete recovery in 20-30 % of the patients, new diagnostic and therapeutic methods need to be worked out. One of the known prognostic factors is the glucocorticoid sensitivity of leukemic blast cells. Prednizolon treatment results in apoptosis of leukemic blasts. This observation suggested a new diagnostic method, which could give early – in the first hours of treatment – information about steroid-sensitivity of blast cells. In this way non-responders could start on a more intensive and effective chemotherapy in the early stage of their treatment. According to our findings, an increase in apoptotic ratio measured by morphological and/or flow cytometric methods correlates with the clinical prednizolon response. Immunotherapy is one of the promising new approaches that may be used in patients with a residual load of leukemia cells. Bispecific monoclonal antibodies were raised by cell fusion of two hybridoma cell lines secreting CD3 and CD19 antibodies. The resulting bispecific antibody contains two different specificities within a single antibody molecule. One binding site (CD3) activates the T cells via the T cell receptor complex, whereas the second binding site (CD19) targets the cytolytic T cells to malignant B cells. Leukemic blasts from children with B-lineage ALL showed stable and strong CD19 expression. CD3xCD19 bsAb was used to activate peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors or from patients with ALL during remission. Costimulation through CD28 increased T cell proliferation to some extent, but did not increase cytotoxic activity of PBMC against leukemic blasts. We present evidence for an effective and specific activation of resting human T lymphocytes by CD3xCD19 in vitro. Based on our in vitro studies, adjuvant immunotherapy using CD3xCD19 bsAb might be beneficial for children with relapsed and/or therapy-resistant common ALL.

6

3. BEVEZETÉS Az akut leukémia a leggyakoribb gyermekkori malignus betegség. Előfordulási gyakorisága évente kb. 4 beteg/100.000 gyermek. Ezek mintegy 80%-át az akut limfoid leukémiák (ALL) alkotják. Hagyományos terápiával - beleértve a kemoterápiát, a központi idegrendszeri besugárzást és a csontvelőátültetést is - a betegek több, mint 70 %-ánál teljes remissziót, ill. betegségmentes túlélést lehet elérni. De a kezelés súlyos mellékhatásokkal jár és a betegek 20-30%-át nem sikerül meggyógyítani. Ez vagy azt jelenti, hogy egyáltalán nem is sikerül teljes csontvelői remissziót elérni, vagy az elért remisszió átmeneti és betegségük később recidivál. A betegek egy részénél a leukémia gyógyítása során csak a minimális reziduális betegség (MRD) állapotát tudjuk elérni, a teljes gyógyulást nem. A betegek sikeres kezelésének egyik legfőbb akadálya a tumorsejtek rezisztenciája a kemoterápiával szemben, amely kialakulhat de novo vagy a kemoterápiás kezelés következtében. A másik nagy akadály a nagydózisú kemoterápia mellékhatásaként jelentkező toxicitás. Ezeknél a betegeknél - a jobb gyógyulási esély érdekében - új diagnosztikus és terápiás módszerekre van szükség. A szteroidérzékenység minél korábbi időpontban történő meghatározása a megfelelő kezelés korai bevezetését tehetné lehetővé. Az immunterápia pedig az egyik ígéretes új adjuváns terápiás lehetőség azon betegek számára, akiknél leukémiás sejtek maradnak a szervezetben a kemoterápiás kezelés végén. A glukokortikoidok rendkívül fontos szerepe a leukémiák és limfómák gyógyításában már régóta ismert tény (1). Kísérleti modellekből tudjuk, hogy ez a hormon apoptózist indukál a malignus limfoid sejtekben. Glukokortikoiddal kezelt timociták és limfoid sejtvonalak sejtjei in vitro az apoptózisra jellemző morfológiai változásokat mutatnak, amelyek fény- és elektronmikroszkóppal jól követhetők (2). Ezekben a sejtekben az endogén endonukleáz aktivációja és jellegzetes kromatinhasítás következik be, amelyet elektroforézissel vagy flow citometriás vizsgálattal lehet kimutatni (3,4). Glukokortikoid-rezisztens sejtvonalak esetében ezeket a jelenségeket nem lehet megfigyelni (5).

7

Az általunk vizsgált időszakban érvényben levő kezelési sémák (ALL-BFM-90 és ALL-BFM-95) szerint az ALL-es gyermekek a kezelés első hetében csak prednizolont kapnak. A protokoll előírásainak megfelelően a kezelés 8. napján a perifériás vérben mért abszolút blasztszám alapján állapítjuk meg, hogy a betegek jól reagáltak-e a szteroidterápiára. A

33. napon végzett csontvelővizsgálat alapján

határozható meg, hogy sikerült-e betegeinknél remissziót elérni. Az eredmények ismeretében dől el, hogy a betegek a jobb vagy a rosszabb prognózisú csoporthoz tartoznak, és ennek megfelelően a későbbiekben eltérő intenzitású kezelést kapnak. Mivel a leukémiás blasztok glukokortikoid-érzékenysége az egyik legfontosabb prognosztikai faktor a gyermekkori akut limfoid leukémiák esetében, ezt a tényt kihasználva olyan vizsgálati módszert akartunk felállítani, amely igen korán, már a kezelés megkezdése után néhány órával választ adna arra a kérdésre, hogy a leukémiás sejtek hogyan reagálnak a glukokortikoid kezelésre. Amennyiben a leukémiás blasztok szteroidrezisztensek, módszerünket alkalmazva már a kezelés első napjaiban lehetőség nyílhatna a terápia megváltoztatására. Vizsgálataink során a klinikai reakciót (perifériás blasztszám) hasonlítottuk össze a perifériás vérből származó tumorsejtek morfológiai változásaival (apoptotikus sejtek aránya). Ezzel párhuzamosan flow citométerrel a leukémiás sejtek DNStartalmának változását is mértük (apoptotikus index). Tapasztalataink alapján glukokortikoid-érzékenység esetén a sejtek apoptózisa a kezelés első néhány órájában bekövetkezik, s ez mind morfológiai, mind flow citometriás módszerrel jól követhető. Munkánkban azt vizsgáltuk, hogy használható-e a prednizolon-érzékenység korai markereként a limfoblasztok apoptotikus arányának változása a prednizolon monoterápia alatt. Annál a betegcsoportnál, akiket a hagyományos módszerekkel nem lehet teljesen tumormentessé tenni (MRD) alternatív terápiára van szükség. Az egyik ígéretes lehetőség az immunterápia. Először 1979-ben használtak monoklonális antitestet betegek kezelésére (6), és azóta folyamatosan fejlődött ez az alkalmazási mód. A hibridóma-technikával (7) előállított tumorellenes monoklonális antitestek gátolhatják a malignus hematopoietikus sejtek proliferációját és elpusztíthatják őket (8,9). Ez különböző mechanizmussal következhet be. Az egyik lehetőség olyan célantigének

8

kiválasztása, amelyek a sejtek túlélése és szaporodása szempontjából fontosak (pl. a növekedési faktor receptorok). A legtöbb alkalmazott antitest azonban nem funkcionálisan releváns molekulákkal reagál. Hatásukat más módon, a szervezet effektor mechanizmusainak aktiválásával fejtik ki: 1. Komplementfüggő citotoxicitás aktiválása 2. Antitestfüggő celluláris citotoxicitás (ADCC) 3. Makrofágok által közvetített citotoxicitás (citokinek) Az előbbi antitestek natív formában kerülnek felhasználásra, de citotoxikus molekulákat is lehet az antitestekhez kapcsolni, amelyek így célzottan eljuttathatók a tumorsejtekhez. Az így keletkező immuntoxinok vagy radioimmunkonjugátumok (10,11,12) külső effektor mechanizmusokat alkalmazva pusztítják el a tumorsejteket. Bispecifikus antitestek (13) alkalmazása során a szervezet saját citotoxikus T sejtjeit lehet aktiválni és a célsejtekhez kötni szolid tumorok, leukémiák és limfómák esetében (14). A hagyományos monoklonális antitestek monospecifikus, bivalens antigénkötő molekulák, ezzel szemben a bispecifikus antitestek két Fab karja két különböző antigént képes felismerni. Ezáltal lehetővé válik az effektor sejtek tumorsejtekhez kötése, miközben az effektor sejtek aktiválódnak. Bispecifikus antitestek előállítása történhet kémiai úton (15,16), két úgynevezett szülői antitest összekapcsolásával vagy a két monospecifikus antitestet szecernáló hibridóma sejtvonal fúziójával, ún. hibrid-hibridóma (13) létrehozásával. A legtöbb alkalmazott bispecifikus antitest egyik karjával a T sejtek felszínén levő TCR/CD3 komplexhez kapcsolódik, míg a másikkal a tumorsejt egyik sejtfelszíni antigénjét ismeri fel, ezáltal a citotoxikus T sejteket aktiválva elősegíti a tumorsejtek lízisét (17,18,19). A T sejt receptor (TCR) feladata a major hisztokompatibilitási komplex (MHC) molekulához kötötten prezentált antigénfehérjék felismerése. A T sejtek aktivációját a T sejt receptoron keresztül a CD3 komplex mediálja. Azok a bispecifikus antitestek, amelyek egyidejűleg kötődnek a T sejteken levő CD3 molekulához és a célsejt által expresszált antigénhez, képesek a T sejt mediálta citotoxicitást és a célsejtek lízisét MHC-től független módon indukálni (20,21). A TCR/CD3 komplexen keresztül történő T sejt aktiváció limfokin szekrécióhoz, sejtproliferációhoz és a lítikus program beindulásához vezet (22). Ahhoz, hogy a T

9

sejteket a bispecifikus antitestek a tumorsejtekhez tudják kötni, a tumorsejt felszínén olyan célmolekulára van szükség, amelyet valamennyi tumorsejt erősen expresszál. Eddigi ismereteink alapján a B-sejtvonalhoz tartozó malignus betegségek egy részénél a CD19 és a CD20 a legmegfelelőbb célantigén (23,24). Vizsgálataink során két bispecifikus antitest, a CD3xCD19 és a CD3xCD20 hatását és alkalmazhatóságát vizsgáltuk in vitro modellben gyermekkori common akut limfoid leukémia (cALL) esetében.

10

4. CÉLKITŰZÉSEK 4.1.

Az apoptotikus index szerepének vizsgálata prednizolon-kezelés alatt gyermekkori ALL-ben 4.1.1. Vizsgálataink célja a prednizolonnal kezelt ALL-es gyermekek perifériás vérében az apoptotikus index meghatározása morfológiai és flow citometriás vizsgálattal. 4.1.2. A mérés optimális időpontjának meghatározása. 4.1.3. A két vizsgálati módszer eredményeinek összehasonlítása egymással és a klinikai szteroid-válasszal ALL-es és ALL-recidívás betegek esetében. 4.1.4. A betegek hosszú távú követésének eredményei az apoptózis-index változásának függvényében. 4.1.5. ALL-recidívás betegek apoptózis indexének összehasonlítása a klinikai szteroid-válasszal.

4.2.

Bispecifikus antitestek előállítása, tisztítása és jellemzése 4.2.1. A hibrid-hibridóma technikával előállított és megfelelően tisztított bispecifikus antitestek (CD3xCD19 és CD3xCD20) funkcionális aktivitásának vizsgálata B- és T-sejtvonalakon.

4.3.

cALL-es gyermekek limfoblasztjainak fenotipizálása 4.3.1. Akut limfoid leukémiás gyermekek perifériás vérből vagy csontvelőből származó blasztsejtjei sejtfelszíni antigén expressziójának vizsgálata az ideális célantigének kiválasztása céljából.

11

4.4.

A perifériás vér limfocitáinak aktiválása 4.4.1. Egészséges donorok vagy remisszióban levő cALL-es betegek véréből izolált perifériás vér mononukleáris sejtek aktivációs szintjének mérése bispecifikus antitest jelenlétében kostimulációs faktor hozzáadásával, ill. anélkül. 4.4.2. Az aktiváció kinetikájának vizsgálata az optimális antitestmennyiség és az optimális aktivációs időtartam meghatározása céljából. 4.4.3. A T-limfociták aktivációja során az aktivációs és adhéziós molekulák, Tés B-sejt antigének expressziójának mérése a sejtek felszínén flow citometriával.

4.5.

A CD3xCD19 bispecifikus antitest által mediált lízis in vitro vizsgálata allogén és autológ rendszerben 4.5.1. A CD3xCD19 bispecifikus antitest jelenlétében előaktivált T-sejtek tumorellenes hatásának vizsgálata allogén rendszerben. 4.5.2. A remisszióban levő cALL-es betegektől vett, előaktivált T-sejtek autológ blasztsejtekkel szembeni lizáló képességének meghatározása. 4.5.3. Az in vitro körülmények között effektív minimális antitestmennyiség és az optimális effektor-target sejt arány meghatározása.

12

5. IRODALMI HÁTTÉR 5.1.

Akut limfoid leukémia A normál B és T sejtek differenciálódása során az antigénreceptorokat kódoló

génszekvenciák átrendeződnek. A limfopoietikus malignus betegségek a fejlődés egy stádiumában megrekedt sejtek klonális expanziója útján jönnek létre. A sejtek osztódnak, ugyanakkor nem képesek a további differenciálódásra (25,26). A limfoid prekurzorok malignus transzformációjának egyik lehetséges oka a normális „growth promoting” protoonkogén transzlokációja a vonalspecifikus antigén-receptor génekre. Ez a protoonkogén deregulációjához vezet, amely így már valódi onkogénként működik (27). Az onkogén-aktiváció klasszikus példája a Burkitt-limfóma, amelynél a 8-as kromoszóma hosszú karján (8q24) lokalizált c-myc gén transzlokálódik a 14q32 immunglobulin nehéz lánc lókuszra (28). Az elmúlt évtizedben több non-Hodgkin limfóma típusnál írtak le protoonkogén és tumorszuppresszor gén abnormalitásokat. A leggyakoribb humán limfóma, a follikuláris limfóma esetében a bcl-2 onkogén és a 14q32 közötti transzlokáció következtében termelődött fúziós fehérje hatására az apoptózis gátlása fokozódik, ezáltal nő a tumorsejtek élettartama (26,29-31). A t(14;18) transzlokáció a follikuláris limfómák több mint 80 %-ában kimutatható (32). A B sejtes akut limfoid leukémiák általában egyetlen B prekurzor-sejt malignus transzformációjával és ezt követő klonális expanziójával keletkeznek (33,34). Az a megfigyelés, hogy a B sejtek érése során az adott stádiumban megjelenő sejtfelszíni antigének jelen vannak a malignusan átalakult sejteken is - amelyek a fejlődés ezen stádiumában megragadtak - arra utal, hogy a limfoblasztok fenotípusa és immunogenitása normális társaikéhoz hasonló (23,35). 5.2.

Apoptózis Az apoptózis elnevezés és a jelenség első leírása (1972) két patológus, Kerr és

Wyllie nevéhez fűződik (36). Ők írták le először a két fő sejtpusztulási mód; a nekrózis és az apoptózis közötti különbségeket (37). A szervezet homeosztázisának fenntartásában kulcsszerepe van a sejtek szabályozott keletkezésének és pusztulásának (38,39). Az egyensúly felbomlása

13

okozhatja a sejtek túlzott pusztulását (pl. neurodegeneráció, AIDS, autóimmun betegségek) vagy éppen túlzott felszaporodását (karcinogenezis, tumorprogresszió). A sejtek halála lehet passzív (nekrózis) vagy aktív folyamat (apoptózis). A programozott sejthalál kifejezést az irodalomban gyakran az apoptózis szinonimájaként használják, bár programozott sejthalál bekövetkezhet hosszú idővel a kiváltó tényező hatása után anélkül, hogy az apoptózis morfológiai jellemzőit mutatná. Az apoptózis olyan fiziológiás jelenség, amely során egy specifikus program aktiválódásával a sejt aktív szerepet játszik saját pusztulásában. Előfordul fiziológiás körülmények (183,184) között (pl. morfogenezis), de fontos szerepet játszik patológiás folyamatokban (pl. karcinogenezis) is. Az apoptózis folyamatát befolyásolva új utakat találhatunk a daganatos betegségek terápiájában (40,41,42). 5.2.1. Morfológiai változások Az apoptózis során a sejtek jellegzetes morfológiai változásokon mennek át; lekerekednek, térfogatuk csökken, citoplazmájuk kondenzálódik. Ezzel egyidejűleg a sejtmagban is átalakulások mennek végbe.

sejtfelszín hólyagosodása citoplazmatikus szegmentumok elkülönülése

kondenzált kromatin

zsugorodás

kariopiknózis

apoptotikus test

1. ábra

Az apoptózis során bekövetkező morfológiai változások

14

A mag kondenzálódik, a kondenzált kromatin a maghártya alatt elhelyezkedő, ozmiummal erősen festődő szemcsés anyagból álló szaggatott sávnak, néhol félhold alakú sapkának tűnik. A mag ezt követően fragmentálódik és az apoptotikus sejtekben számos kondenzált kromatint tartalmazó, a magból származó vezikulum jelenik meg. A sejtek végül membránnal körülvett részekre esnek szét, amelyekben összetömörült citoplazmaorganellumok vagy kondenzált kromatinrészecskék különböztethetők meg. Végül az apoptotikus testekre széteső sejtet specifikusan felismerik és bekebelezik a makrofágok (43). Ezek a változások (1. ábra) mind fény-, mind elektronmikroszkóppal jól követhetők. 5.2.2. Biokémiai változások A morfológiai változások hátterében zajló biokémiai és molekuláris történések feltérképezése nagy előrelépést jelentett az apoptózis megismerésében (186). A folyamatot beindító különböző trigger mechanizmusok végül egy közös útba torkollnak. Az első biokémiai változások a plazmamembránban mennek végbe. Megváltozik a membrán foszfolipid-struktúrája. Ezt a változást ismerik fel a szomszédos sejtek és a makrofágok.

Ezzel

párhuzamosan

a

citoplazma

savas

kémhatású

lesz,

a

mitokondriumokból pedig citokróm-C és dATP szabadul fel, ami apoptoszómaképződéshez és a kaszpáz kaszkád aktivációjához vezet (44). A sejtmagban zajló változások hátterében az internukleoszomális kromatint hasító nukleáris endonukleáz aktivációja áll. Ez az enzim a DNS-t kb. 200 bázispár méretű fragmentumokra, „DNSlétrákra” bontja (45). Az így keletkező DNS-töredékek Northern-blottal és flow citometriás méréssel (46,47) egyaránt kimutathatók (2. ábra). Ez a jelenség minden apoptotizáló sejtben megfigyelhető. Azokban a sejtekben, amelyekben meghatározott inger váltotta ki az apoptózist mindig megfigyelhető egy látens periódus a korai morfológiai változások előtt. A látens szakasz - néhány perctől órákig tart - után a változások nagyon gyorsan lezajlanak: a sejtzsugorodás és fragmentáció ideje mindössze néhány perc (48).

15

SEJTSZÁM

Normál sejtek

Apoptotikus sejtek

DNS TARTALOM

2. ábra

A DNS-tartalom változásának flow citometriás mérése limfoblasztok glukokortikoid-kezelését követő apoptózis során

A sejtek apoptózisa előre meghatározott program szerint zajlik; endogén vagy exogén jelek indítják be a folyamatot, egy szenzor érzékeli a sejthalált indukáló jelet, a reakciók eljutnak addig a pontig, ahol a sejthalál véglegessé válik, a folyamat végbemegy, és a sejtmaradványok lebomlanak (49). A „végrehajtó rendszert” aktiváló szignálok mindegyikét bonyolult „regulátor rendszer” ellenőrzi (50,52). Emiatt ugyanaz a jel, amely egyik esetben apoptózist indukál, más esetben nem vált ki sejthalált. A kutatások fényt derítettek az apoptózis jelentőségére az organogenezisben (pl. testüregek, üreges szervek kialakulása), a sejtek, szövetek folyamatos működésében (elöregedett vagy felesleges sejtek eliminációja) és a génhibák kijavítására képtelen sejtek elpusztításában (183,184,187). Mivel a daganatok genetikai betegségek, amelyek keletkezésében a génhibák kialakulásának alapvető szerepe van, érthető az utóbbi funkció kulcsfontosságú szerepe a karcinogenezisben. A daganatok keletkezése során a sejtek korlátlan szaporodása által a szervezet számára „idegen”, új sejttömeg keletkezik. A sejtek folyamatos felhalmozódásában két tényező játszik alapvető szerepet; az apoptózist gátló tényezők erősödése és az apoptózist elősegítő tényezők gyengülése.

16

5.2.3. Apoptózis és kemoterápia Míg régen azt gondolták, hogy a daganatellenes kezelés a tumorsejtek alapvető biológiai funkcióit károsítja, mára ezt a hipotézist felváltotta a terápia által indukált programozott sejtválasz elmélete, amely szerint a daganatellenes terápia ugyancsak az apoptotikus program beindításával fejti ki hatását (51,185). Azok a mutációk, amelyek az apoptózis beindulását vagy lezajlását gátolják, a tumorsejtek gyógyszerrezisztenciájához vezethetnek. A jellegzetes morfológiai változások hátterében proliferációs és „survival” gének hálózata áll, amelyek különböző mértékben expresszálódnak egészséges és tumorsejtekben. Azok a mutációk, amelyek az apoptózis folyamatának beindítását vagy kivitelezését befolyásolják, nagy szerepet játszanak a tumorok keletkezésében is (53). A sejtek különböző módon reagálnak a citotoxikus és DNS károsodást okozó hatásokra a sejttípustól, a DNS károsodás formájától és mértékétől függően (58,188). A kemoterápiás szerek gátolhatják a DNS replikációt, membránkárosodást vagy szabadgyök-képződést okozhatnak. Bár ezek a gyógyszerek különböző módon fejtik ki hatásukat és különböző intracelluláris célpontjaik vannak, végül közös effektor mechanizmus útján indukálnak apoptózist. A citotoxikus gyógyszerek által indukált apoptózis morfológiai jelei megegyeznek a „fiziológiás” ingerek által okozott apoptózis során lezajló változásokkal. A sejthalál formája és kinetikája függ a sejtek típusától is. A hematopoietikus sejtvonal sejtjeinél rendkívül gyorsan, néhány óra alatt lezajlanak a változások. Ezzel szemben néhány szolid tumor sejtjeinél több, mint 24 óra szükséges ehhez. 5.2.4. A kaszpázrendszer aktivációja Az apoptózisra jellemző klasszikus morfológiai és biokémiai változások hátterében intracelluláris polipeptidek szelektív proteolitikus degradációja áll. Ezen polipeptidek hasítása egy intracelluláris cisztein proteáz család, a kaszpázok működésének következménye. A kaszpázok aktivációja két különböző módon történhet: a plazmamembránban elhelyezkedő halál-receptorok vagy a mitokondriumokból felszabaduló citokróm-C által. A legtöbb tumorellenes gyógyszer a kaszpázrendszeren

17

keresztül fejti ki hatását. A terápia indukálta apoptózis két úton jöhet létre: lehet receptor-függő vagy indukálhatja DNS károsodás (54,55). 5.2.5. Receptorhoz kötött apoptózis A halálreceptorok olyan sejtfelszíni receptorok, amelyek a specifikus halálligandok által kiváltott apoptózist közvetítik. Molekuláris szinten a legjobban ismert halálreceptorok a Fas/CD95 (56,57,189), a tumor nekrózis faktor 1-es típusú receptora (TNFR1), a DR1-6 család. A TNF TNFR1-hez való kötődése például a szignálközvetítő molekulák - TRADD (TNFR1-associated death domain protein) és FADD (Fasassociating protein with death domain) - koncentrációját fokozza. Ez a komplex azután első lépésben a prokaszpáz-8 nevű sejthalál-proteázt aktiválja, beindítva ezzel egy proteáz kaszkádot, amely sejthalálhoz vezet. 5.2.6. DNS-károsodás indukálta apoptózis Ebben a folyamatban a p53 molekula játszik központi szerepet, bár léteznek p53tól független utak is (188). Jelen tudásunk szerint a DNS-lánc sérülése kinázokat aktivál (pl. DNS-függő proteinkináz) és ez a p53 foszforilációjához és aktivációjához vezet. A p53 bonyolult rendszeren keresztül viszi tovább az apoptózis szignálját, amely végül a célgének - Bax, p53 által indukált gének (PIGs) - transzaktivációját eredményezi. A következő lépésről keveset tudunk. Ide tartozhat a mitokondriális membrán potenciálváltozása és a citokróm-C felszabadulása. Ez több lépésen keresztül végül a prokaszpáz-9 aktiválásához vezet, amely egy hasonló proteáz kaszkádot indít el. Ennek a folyamatnak a legfontosabb modulátora a bcl-2. A két iniciátor kaszpáz (kaszpáz 8 és kaszpáz 9) bármelyike képes hasítani és aktiválni az úgynevezett effektor kaszpázokat (kaszpáz 3, kaszpáz 6 és kaszpáz 7). Az a tény, hogy különböző ingerek végeredményben ugyanazt a kaszpáz kaszkádot aktiválják, megmagyarázza a különböző ingerek által kiváltott apoptotikus folyamat azonosságát. Számos regulátor mechanizmus mindkét utat egyszerre képes szabályozni. Az apoptózis folyamata igen bonyolult, teljes feltárásához további kutatások szükségesek. Ugyanakkor az elmúlt években az egészséges sejtek vizsgálatával a sejthalál folyamatáról szerzett információk lehetővé tették annak pontosabb megértését, 18

hogy a malignus sejtek hogyan tudják elkerülni az apoptózist. A tumorsejtekben számos antiapoptotikus változást írtak le; a halálreceptorok downregulációját, a prokaszpáz-8 downregulációját, stb. A mitokondriális apoptózis válasz megszakítása is a tumorsejtek szaporodását eredményezi. Az egyik ilyen lehetőség az antiapoptotikus bcl-2 fokozott expressziója, amely egyértelműen rossz prognózist jelent számos malignitás esetében. A bcl-2 úgy fejti ki antiapoptotikus hatását, hogy gátolja a mitokondriális citokróm-C felszabadulását. Ugyanez a hatása a bcl-2 család proapoptotikus tagjainak (mint pl. a Bax) vagy a kaszpáz-9 gén deléciójának. Az apoptózis hiánya daganatnövekedéshez vezet, ugyanakkor a tumorellenes gyógyszerek egy része az apoptózis fokozásával hat. Ez a gyógyszerek támadáspontjától függően mind receptorfüggő, mind mitokondriális hatásmechanizmussal történhet (182). A szövetek homeosztázisa mindig a sejtek szaporodása, differenciálódása és pusztulása közötti egyensúly függvénye. A szomatikus sejtek proliferációját pozitív és negatív szignálok hálózata szabályozza. Az apoptózis olyan magas szinten szabályozott folyamat, amely során a szervezet a számára felesleges sejteket eliminálja anélkül, hogy gyulladásos reakció alakulna ki. Az apoptózist és a proliferációt egyaránt a sejtciklust szabályozó molekulák irányítják. Az apoptózist kiváltó ingerek egyidejűleg hatnak a sejtproliferációra és a sejthalálra. A glukokortikoidok a sejtciklus G1 fázisában okoznak blokkot és apoptózist indukálnak a transzformált limfoid sejtekben. Bizonyos sejtciklus szabályozók - c-myc, ciklin D3 - csökkent expressziója alapvető fontosságú az apoptózis indukálásában, de más G1-regulátorok szerepéről is vannak adatok; pl. p53, pRb, E2F. Többféle apoptózist kiváltó tényezőt ismerünk, amelyek egy része sejttípusspecifikus; növekedési faktorok elvonása, ionizáló sugárzás, TNF, vírusfertőzés, glukokortikoidok. Ezekre a hatásokra a sejtek programozott jelenségek sorozatát indítják el, amelyek végül a sejt pusztulásához vezetnek. Számos katalitikus folyamat indul be az apoptózis folyamán, beleértve a proteáz aktivációt, amely a sejtfehérjék lebontásához vezet és a nukleáz aktivációt, amely a DNS fragmentációját és az RNS degradációját eredményezi. A kaszpáz elnevezés egy olyan cisztein proteáz családot takar, amely az emlősök sejtjeinek pusztulásában effektor funkciót tölt be. Aktivációjuk következtében jönnek létre a jellegzetes morfológiai változások.

19

A tumorképződés hátterében a sejtproliferáció és -pusztulás egyensúlyának megbomlása áll. Tumor létrejöhet a sejthalál csökkenése vagy a sejtproliferáció fokozódása következtében. Például, ha a bcl-2 gén expressziója fokozódik, azért alakul ki tumor, mert a csökkent apoptózist nem ellensúlyozza a sejtproliferáció csökkenése. 5.3.

Immunterápia malignus betegségekben Az irodalomból ismertek olyan esetek, amikor malignus tumorok spontán

visszafejlődnek. Ha ennek a jelenségnek a magyarázatát ismernénk, sikerülhetne olyan immunterápiát találni, amely lehetővé tenné a malignus betegségek hatásos kezelését. Az immunológiai „őrjárat” (surveillance) elmélete (Thomas, 1959; Burnet, 1970) az immunrendszernek azon a funkcióján alapul, hogy a számára „idegent” felismeri és eliminálja. Valamennyire a malignus sejtek is idegenek a szervezet számára, az immunrendszer mégsem képes őket elpusztítani. Ha a természetes immunválasz mellett a tumorsejtek túlélnek, akkor az nem képes megakadályozni a tumornövekedést. Olyan terápiás beavatkozásokra van szükség, amelyek a tumorsejtek elleni immunválasz hatékonyságát fokozzák (62). Már a múlt században próbáltak olyan immunstimuláns szereket találni, amelyek az immunválaszt fokozva elősegítik a daganatos betegségek gyógyítását. Amikor a XIX. század végén észrevették, hogy egyes daganatos betegekben zajló bakteriális fertőzéssel párhuzamosan a tumor regrediál, két kutató - F. Fehleisen (Németország) és W. B. Coley (USA) - megpróbált végstádiumban levő daganatos betegeknél infekciót indukálni. Bár a tumorellenes válasz kialakult, nagy problémát jelentett, hogy a fertőzés súlyosságát nem tudták kontrollálni. Emiatt Coley 1893-tól kezdve elölt baktériumokat használt a daganatos betegségek kezelésére. Ezt a „Coley-toxint” 1934-ben az Amerikai Orvosi Társaság a daganatok szisztémás terápiájaként ismerte el. A szer klinikai alkalmazhatóságát toxikus mellékhatása és a kis hatékonyság korlátozta. Hosszú idő telt el jelentősebb eredmény nélkül, míg az 1970-es években le nem írták a TNFa szisztémás tumorellenes hatását (63). Súlyos toxikus mellékhatása sajnos korlátozta immunterápiás jelentőségét (64). A humorális és celluláris immunválasz megismerése kapcsán ismét felmerült az effektív immunterápia kidolgozásának lehetősége. A kutatásban fontos mérföldköveket

20

jelentett a szövetkilökődés mechanizmusának, a limfokinek immunregulációban betöltött szerepének, az MHC-függő és ettől független lízisnek a megismerése. A technika fejlődésével lehetővé vált a folyamatokban résztvevő molekulák izolálása, tisztítása, genetikai módosítása, ami segített megérteni a szervezet immunreakcióit. Bár az elmúlt évtizedekben a sebészet, a kemoterápia és a sugárterápia egyaránt rohamosan fejlődött, mégsem sikerül valamennyi daganatos beteget meggyógyítani. Újra és újra felmerül a további terápiás lehetőségek szükségessége (65,66). Az immunterápiás próbálkozások két csoportba oszthatók. Az egyikben a gazdaszervezet tumorellenes immunitását fokozzák, a másikban tumorellenes hatású biológiailag aktív anyagokat juttatnak be a szervezetbe (67). A legtöbb tumor gyenge immunogén, mert nem expresszál rejekciós antigéneket. A humorális immunterápiában alkalmazott citokinek - beleértve az interferonok, interleukinek, tumor nekrózis faktor és a hematopoietikus növekedési faktorok különböző fajtáit - vagy a szervezet immunitását fokozzák, vagy közvetlen tumorellenes hatással rendelkeznek (64). Bár alkalmazásukkal néhány esetben sikerült tartós, teljes remissziót elérni, toxikus mellékhatásaik sokszor már a minimális hatásos dózisban is az életet veszélyeztették (63-65,68,69). Celluláris immunterápia esetében tumorellenes effektor sejteket; in vitro aktivált T sejteket (limfokin aktiválta killer sejtek [LAK], tumorinfiltráló limfociták [TIL]) vagy monocitákat juttattak a szervezetbe. Nehézséget jelentett ugyanakkor, hogy a LAK sejtek nem tudtak a nagyobb tumorokba penetrálni (70-72), ill. tumorellenes aktivitásukhoz IL-2 adására volt szükség (73). A TIL sejtek ezzel szemben könnyen eljutottak ugyan a tumorsejtekhez, de szeparálásuk rendkívül nehézkes volt (65,74,75). A tumorok sejtfelszíni antigénjeinek megismerésével lehetővé vált az ellenük termelt monoklonális antitestek alkalmazása a malignus betegségek immunterápiájában (65,8,76). 5.3.1. Konjugálatlan antitestek A kemoterápia fejlődésével párhuzamosan jelent meg Köhler és Milstein közleménye (1975) a monoklonális antitesteket termelő hibridómákról (7). Ezzel a technikával normális, antitesteket szecernáló sejteket lehet mielóma sejtekkel fuzionáltatni és ezáltal a sejtvonalat halhatatlanná tenni. Mivel a monoklonális

21

antitestek a malignus hematopoietikus sejtek felszínén levő antigénekhez kötődnek, kezdetben rendkívüli optimizmussal tekintettek a szeroterápia felé, amely specifikusan célba veszi és elpusztítja ezeket a sejteket. 1979-ben került sor az első klinikai kipróbálásra (6), s azóta több száz, malignus hematológiai betegségben szenvedő beteget kezeltek monoklonális antitestekkel. Bár sok hasznos, új információt sikerült szerezni az antigénekről és antitestekről, az általános klinikai tapasztalatok (a kevés sikeres próbálkozást leszámítva) inkább csalódást keltettek. A monoklonális antitest-terápia elve egyszerű, klinikai megvalósítása mégis bonyolult (9,77). Az elmúlt évtized során számos probléma vetődött fel a szeroterápiával kapcsolatban, mint például a tumorsejtek elérhetősége, a kezelés során jelentkező toxicitás és az a tény, hogy a beadott antitestek nem tudnak minden tumorsejtet elpusztítani. A problémák felismerése effektívebb terápia kidolgozásához járult hozzá (78-80). Nehézkes volt a monoklonális antitestek eljuttatása a célsejtekhez, mivel molekulasúlyuk mintegy 180 kD, tehát lényegesen nagyobb molekulák, mint a kemoterápiás szerek. Emiatt nehezebben diffundálnak a nagyobb kiterjedésű tumorokba. Emellett - például leukémiában - a nagyobb keringő tumorsejtmennyiség megköti a beadott antitesteket és ezzel elősegíti gyors eliminációjukat a keringésből. Az antiidiotípus antitestek, amelyek a malignus B sejtek felszínén levő egyedi idiotípusdeterminánsok ellen irányulnak, kötődnek a szérumban keringő, szabad idiotípushoz is (81). Olyan célantigénre van tehát szükség, amely nincs jelen szabad formában a keringésben. Az ideális célantigén nem megy át moduláción sem (ennek során az antigén az antitesttel való kötődést követően nem expresszálódik a sejt felszínén), mivel eltűnése a sejt felszínéről csökkentené a terápia hatékonyságát. Ideális esetben az antitest csak a tumorsejtekhez kötődik, nincs keresztreakció az egészséges szövetekkel. A nemspecifikus kötődés csökkenti a tumorellenes hatást. Amennyiben a keresztreakció mégsem küszöbölhető ki teljesen, ez nem érintheti az életfontosságú szerveket. A hematopoietikus sejtvonal daganatos betegségei esetén a célantigén nem lehet jelen a csontvelői őssejteken, hiszen ekkor a kezelés irreverzibilis csontvelő-károsodást idézne elő.

22

Az antitest a célsejtet elérve fejti ki citotoxikus hatását. Az antigén-antitest kötődés önmagában rendszerint nem elég a sejt elpusztításához, hacsak a célmolekula (pl. növekedési faktor) (193) nem létfontosságú a sejt túlélése és proliferációja szempontjából. Malignus B sejtek esetében az anti-idiotípus antitestek kötődése közvetlenül csökkenti a tumornövekedést (81,82). A konjugálatlan antitestek effektivitása az antitest természetétől és endogén citotoxikus mechanizmusokat aktiváló képességétől függ. A klinikai próbák többsége monoklonális egér antitesttel történt. Azt tapasztalták, hogy a különböző antitesttípusok és izotípusok különböző hatékonysággal aktiválják a komplement-rendszert és a humán effektor sejteket (83-85). A maximális citotoxicitás eléréséhez csökkenteni kell az antigénexpresszió heterogenitását. Ha a célantigén a malignus sejtpopuláció egy részéről hiányzik, reziduális malignus sejtekkel kell számolni. Ennek a problémának a megoldására az egyik lehetőség az antitest-koktél alkalmazása, amely többféle sejtfelszíni antigént ismer fel. Ha az antigén az antitest kötődése után megváltozik, az effektor sejtek hatásossága csökken. Az antigén-antitest komplex fixálása a sejt felszínén a komplement mediálta citotoxicitás

effektivitását

növelheti.

A

terápia

hatékonyságát

a

sejtfelszíni

antigénsűrűség is erősen befolyásolja. Ez abban az esetben okoz problémát, ha a maximális citotoxicitás eléréséhez bizonyos számú antigén megkötése szükséges, de túl kicsi az antigénsűrűség a sejt felszínén. Az antitest-antigén affinitásnak is döntő szerepe van. Nem szabad megfeledkezni a monoklonális antitest-terápia mellékhatásairól sem. Az eddigi tapasztalatok szerint a betegek egyharmadánál léptek fel kisebb mellékhatások; láz, hiperszenzitivitási reakciók, kiütések, viszketés, bronchospazmus. Anafilaxiás reakció alig fordult elő. A betegek többsége mellékhatások nélkül tolerálta az ismételt infúziókat. A nem specifikus kötődés akár azonnali, letális szervkárosodást okozhatna, de az eddig használt antitestek többségénél ez nem fordult elő (6,86-97). Annak ellenére, hogy a betegek immunszupprimáltak voltak, a kezelést követően humán anti-egér antitestek jelentek meg a betegek mintegy negyedében - a krónikus limfoid leukémiát (CLL) kivéve - valamennyi malignus kórkép esetében. Bár emiatt nem léptek fel mellékhatások, de az anti-egér antitestek kivonták a keringésből a hatásos egérantitesteket, így semlegesítették hatásukat. Ez a jelenség humanizált antitestek

23

alkalmazásával küszöbölhető ki. A humanizált antitestek előállítása során az egér immunglobulin (Ig) gén variábilis és hipervariábilis régióit humán Ig génnel kombinálják, így csökkentve az antigén-determinánsok számát (179-181). Alternatív megoldásként a betegek immunszuppresszív kezelése is szóba jöhet ciklosporinnal vagy ciklofoszfamiddal, de ilyenkor a mellékhatásokkal is számolni kell. A több, mint 100 beteg részvételével végzett I. fázisú vizsgálatok és „pilot study”-k eredményei többnyire csalódást okoztak, de a terápia korlátainak megértéséhez is

hozzájárultak

(195-198,202).

A

felvázolt

problémák

megkérdőjelezték

a

konjugálatlan antitestek hatékonyságát a tumorterápiában. A technológia fejlődésével sikerült monoklonális antitest-toxin (immuntoxinok), ill. monoklonális antitest-radionuklid konjugátumokat (radioimmunkonjugátumok) létrehozni, amelyek új perspektívákat nyitottak a szeroterápia előtt. 5.3.2. Immuntoxinok A konjugálatlan antitestek többsége gyenge citotoxikus hatással rendelkezett, ezért az antitestekhez olyan fehérjetermészetű toxinokat kötöttek, amelyek hatásosan el tudják pusztítani a daganatsejteket (10,11,98). Az így létrehozott immuntoxinok (199) citotoxikus hatása független a humán effektor rendszer aktivációjától. Az immuntoxinok in vitro és in vivo már nanomólos koncentrációban képesek elpusztítani a malignus sejteket. Míg a konjugálatlan antitestekből gyakran 1 grammos dózisra volt szükség, addig immuntoxinokból milligrammos mennyiségek már hatásosak voltak a kezelés során. A célantigén kiválasztásánál többnyire ugyanazok a szempontok érvényesülnek, mint konjugálatlan antitestek alkalmazásakor, de ebben az esetben lényeges, hogy a célantigénnek internalizálódnia kell az antitest kötődése után, hogy a toxin-komponens bekerüljön a citoplazmába (192,194). Szintén kritikus pont a toxin kiválasztása. Olyan toxinra van szükség, amely alacsony koncentrációban is kifejti hatását. A klinikai gyakorlatban a ricin, a diftériatoxin (DT), a Pseudomonas exotoxin (PE) és származékaik bizonyultak a leghatásosabbnak.

24

Fontos szerepe van a toxin és az antitest közötti kötődés stabilitásának. A toxin nem szabadulhat fel a keringésben, de föl kell szabadulnia a citoplazmában. Az elmúlt 10 évben az immuntoxinokat több alkalommal is kipróbálták a leukémiák és limfómák terápiájában. Az immuntoxinok alkalmazásának hasonló problémák szabnak határt, mint a konjugálatlan antitestek esetében. A terápiás dózis a toxikus mellékhatások miatt még kevésbé emelhető. A leggyakoribb és legsúlyosabb mellékhatás a „capillary leak” szindróma,

amely

a

nem

specifikus

endotélkárosodás

következménye.

Az

immuntoxinok is immunogén molekulák. Esetükben nemcsak az antitest, hanem a toxin ellen is antitestek képződhetnek a betegek szervezetében. Ugyanúgy, mint a hagyományos kemoterápiás szerek esetében, az immuntoxinokkal szemben is kialakulhat rezisztencia. Ezt immunotoxin-koktélok alkalmazásával lehet kiküszöbölni. Az eddigi in vitro és in vivo eredmények alapján az immuntoxinok kemoterápiával és sugárkezeléssel kombinálva vehetnének részt a kezelésben (99,100). 5.3.3. Radioimmunkonjugátumok A radioaktívan jelölt antitumor antitestek számos előnyt jelenthetnek a konjugálatlan antitestek, ill. immuntoxinok alkalmazásával szemben. Klinikailag leginkább a b-sugárzó részecskék hasznosak, mint pl. a 131Jód [131I] és a 90Ittrium [90Y]. A radioimmunkonjugátumok (12,101) nemcsak a célantigénnel rendelkező sejteket pusztítják el, hanem képesek a körülöttük bizonyos távolságban elhelyezkedő többi sejtet is megölni (191). Ezáltal sikerülhet kiküszöbölni a célantigén negatív sejtek problémáját. Ahhoz, hogy kifejtsék citotoxikus hatásukat, nincs szükség endocitózisra sem. A kezelés hatásosságának feltétele azonban a célsejtek radioszenzitivitása. Radioszenzitivitásuk

miatt

a

leukémiák

és

limfómák

ideálisak

a

radioimmunterápia számára. Az első „radioimmunglobulin-terápiás” kísérletekben látványos eredménnyel kezeltek ferritinben gazdag tumorokat (Hodgkin-kór, hepatoma) konjugált poliklonális anti-ferritin antitestekkel (102,103). De használtak limfoid és mieloid differenciációs célantigéneket is. Ez a terápia meglehetősen eredményesnek bizonyult, és a néhány esetben megfigyelt mieloszuppresszión és trombocitopénián

25

kívül csak enyhe, átmeneti mellékhatásokat észleltek (láz, hányinger, viszketés és

131

I

alkalmazása esetén pajzsmirigy-diszfunkció). A radioimmunterápia hatásossága leginkább a tumor nagyságától, a keringésben jelenlevő célantigének mennyiségétől, és az antigénmoduláció gyakoriságától függ. A szplenomegália is csökkenti a kezelés eredményességét, mivel a hiperfunkciós lép kivonja az antitesteket a keringésből. Fontos, hogy olyan antitestet válasszunk, amely az antigénhez való kötődés után nem internalizálódik és nem bomlik le, mielőtt a megfelelő hatást kifejtette volna. Új radiojodinációs technikák bevezetése vagy radiometál izotópok alkalmazása (111In,

90

Y) vezethet a megoldáshoz. Ugyanakkor a

stabilabb konjugátumok létrehozásával megnövelt biológiai felezési idő az aspecifikus teljestest-besugárzást is növeli (104). A keringésben jelenlevő nagyszámú szolubilis célantigén a beadott antitestek egy részét megkötheti, ezáltal a terápia effektivitása csökken. Ennek kiküszöbölésére próbálkoztak már plazmaferezissel vagy jelöletlen antitestek „preinfúziójával” a radioimmunterápia előtt (105). A nagy antigénsűrűség a célsejtek felszínén feltétlenül előnyös a terápia szempontjából, ugyanakkor az antitestek specificitásával, aviditásával, izotípusával, formájával, eredetével kapcsolatban megoszlanak a vélemények. Az eddigi kísérletek és klinikai vizsgálatok bíztatóak voltak (191,200,201). Úgy tűnik, közvetlenül a tumorhoz juttatva nagyobb sugárdózist tolerál a szervezet, mint külső sugárforrás esetén. A hatás növelése érdekében azonban további változtatások lehetségesek. Meg kell határozni a radioimmunkonjugátumok maximális tolerálható dózisát önmagában és hematopoietikus növekedési faktorok adásával vagy csontvelőátültetéssel kombinálva. A további fejlődés útja lehet új konjugációs eljárások (stabilabb kelátok) kialakítása, az immunkonjugátumok penetrációjának fokozása és a kombinált alkalmazás. 5.3.4. Bispecifikus antitestek A tumorsejtek elleni immunválasz elsősorban celluláris természetű. Ezt a tényt kihasználva a bispecifikus antitestek alkalmazásával előaktivált T sejteket lehet a tumorsejtekhez kötni, amelyek azután a daganatos sejteket lizálják.

26

A hagyományos monoklonális antitestek monospecifikus bivalens antitestek, ami azt jelenti, két Fab-karjuk azonos célantigént képes felismerni. Ezzel szemben a bispecifikus antitestek (3. ábra) két különböző Fab-résszel rendelkeznek, ami lehetővé teszi, hogy egyik karjukkal egy T sejt markert, míg másik kötőhelyükkel egy tumorsejt antigént ismerjenek fel (106-108,203). Előállításuk többféle módon történhet: kémiai úton (15,16) (két intakt monoklonális antitest vagy Fab’-részek összekapcsolásával), hibridóma sejtvonalak fúziójával (13) (hibrid-hibridóma technika), ill. molekuláris genetikai módszerekkel (rekombináns géntechnika) (109-111).

CÉLSEJT

Bifunkcionális heteroantitest Bispecifikus antitest

Citotoxikus T SEJT

3. ábra

Kémiai úton és hibridóma technikával előállított bispecifikus antitestek felépítése és működési elve

A hibrid-hibridómákat Milstein és Cuello írta le először 1984-ben (13). A hibridhibridómák által termelt bispecifikus antitestek mennyisége elvileg a homológ nehéz és könnyű (H-L) láncok párképzésétől függ. Ez a kapcsolódás teljesen véletlenszerűen történik és viszonylag kis mennyiségű bispecifikus antitestet eredményez (4. ábra). A hibrid-hibridómák által termelt antitestek bonyolult szerkezete megnehezíti az antitestek tisztítását,

pedig

a

tiszta,

jól

definiálható

elengedhetetlen feltétele.

27

összetétel

terápiás

alkalmazásuk

4. ábra Hibrid-hibridóma által termelt különféle antitestek A bispecifikus antitestek egyidejűleg kapcsolódnak a célsejthez és az effektor sejt citotoxikus reakciót aktiváló molekuláihoz (TCR/CD3 vagy Fcg receptor), ezáltal a citotoxikus

aktivitást

a

tumorsejtekre

összpontosítják.

Az

effektor

sejtek

specificitásuktól függetlenül elpusztítják a célsejtet. 1985-ben jelentek meg az első publikációk a bispecifikus antitestek in vitro hatásosságáról (20,21), azóta egyre ígéretesebb eredményekről számoltak be klinikai tanulmányokban is (112-118). Ahhoz, hogy a terápia eredményes legyen, számos feltételnek kell teljesülni: 1. Megfelelően aktivált effektor sejtekre van szükség. 2. A monovalens kötődés (minimálisra csökkenti az antigénmodulációt) miatt nagy antigén-affinitás szükséges ahhoz, hogy stabil kapcsolat jöjjön létre az effektor és target sejtek között (119,120). 3. A célsejteket minél nagyobb százalékban kell az effektor sejteknek specifikusan lizálniuk, ugyanakkor nem szabad bekövetkeznie az effektor sejtek reciprok lízisének. A kísérletek igazolták, hogy a bispecifikus antitestek közvetlen lítikus (a target és effektor sejtek közvetlen kapcsolata miatt) és tumornövekedést gátló (a limfociták által termelt citokinek miatt) hatást is kifejtenek (121).

28

In vitro számos különböző tumornál - karcinóma (122), glióma (123), limfóma (124-126), mieloid leukémia (127) - vizsgálták a bispecifikus antitestek tumorellenes hatását (204-209). Más tanulmányokban bispecifikus antitestekhez kapcsolt vírussal fertőzték meg specifikusan a sejteket azáltal, hogy a célsejtek felszínén fixálták a vírust (109,128). További felhasználási lehetőség a toxinok és radioizotópok jobb célbajuttatása (129-131), a sejtreceptorok szerepének és hatásmechanizmusainak kutatása (132), alvadásgátló gyógyszerek vörösvérsejtekhez kapcsolása (133). Az antitestek in vivo hatékonyságát először egér modellben (134-137) igazolták, de azóta számos klinikai kipróbálásról is beszámoltak már (112,127,138-140). Megjelent néhány közlemény a CD3xCD19 bispecifikus antitest alkalmazásáról B sejtes malignus tumorban szenvedő felnőtt betegeknél (113,118,141). 5.3.4.1. A célsejt antigénje: CD19 és CD20 CD19 A B limfociták érése többlépcsős folyamat, amely során számos különböző szignál szükséges a sejtek proliferációjához és éréséhez (142-144). A különböző érési alakok egyre több sejtfelszíni antigénjét jellemezték már és ellenük egyre több antitestet írnak le (8,145), ami az immunterápia esélyeit nagymértékben növeli (157-159). A CD19 B-sejt specifikus antigén, amely a plazmasejtek kivételével gyakorlatilag minden humán B sejtvonalhoz tartozó sejten jelen van. A CD19 antigén a CD22 és CD80 (B7) antigénnel együtt az immunglobulin szupergén család tagja (146,147). A CD19 egy komplex része, amely legalább 2 másik membránfehérjét; a komplement receptor 2-es típusát (CD21/CR2) és a TAPA-1 (CD81) molekulát is magába foglalja (148). A B sejt ontogenezis során a CD19 antigén rendkívül korán, még az immunglobulin nehézlánc génátrendeződését megelőzve expresszálódik. A CD19 antigén azután a B sejt-érés minden stádiumában jelen van, csak a B sejtek plazmasejtekké való differenciálódása során tűnik el (149). A CD19, mint szignál-transzdukciós molekula részt vesz a B sejtek proliferációjának és végső differenciációjának szabályozásában. A CD19 a B sejtek differenciálódásának mértékétől és a B-sejt aktiváció módjától függően pozitív és negatív szignált is közvetíthet (148,150-152).

29

A CD19 antigén specifikusan csak a B limfoid progenitor sejteken expresszálódik, a mieloid, eritroid, megakariocita alakok és a csontvelői őssejtek felszínéről hiányzik. A CD19 ellenes antitest ezért nem reagál a T sejtekkel, granulocitákkal, vörösvérsejtekkel, a trombocitákkal és a normál (nem limfohematopoietikus) szövetekkel sem (142,153,154). A leírt tulajdonságok vezettek az anti-CD19 monoklonális antitest önálló (155,156,160) vagy immuntoxin (152,161) formájában történő immunterápiás felhasználásához. Konjugálatlan anti-CD19 monoklonális antitesttel 6 előrehaladott non-Hodgkin limfómában szenvedő beteg kezelését írták le és 2 esetben tapasztaltak átmeneti tumorregressziót (160). A betegek szérumában a kezelés alatt nem lehetett szabad CD19 antigént detektálni. Bár az in vitro kísérletekben az anti-CD19 monoklonális antitest antigén-modulációt idézett elő (162,163), in vivo nem fordult elő teljes CD19 moduláció a tumorsejtek felszínén. A betegeknél nem jelentkeztek toxikus mellékhatások és nem termelődtek egér immunglobulin ellenes antitestek sem (65,156,160). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy B sejtvonalhoz tartozó tumorok esetében a CD19 antigént jó eséllyel lehet felhasználni a bispecifikus antitestek által közvetített tumorsejt-lízisben is. CD20 A CD20 antigén a pre-B sejtek differenciálódása során expresszálódik, feltételezhetően közvetlenül az intracitoplazmatikus m-láncok megjelenése előtt. Az intracitoplazmatikus m-láncokra negatív, sejtfelszíni CD19 és citoplazmatikus CD22 pozitív, progenitor B sejtes leukémiák 50%-a CD20 antigén negatív. A különböző antiCD20 antitestekkel végzett vizsgálatok (157-159) arra utalnak, hogy a CD20 molekula fontos szerepet játszik a B sejt-aktiváció szabályozásában. A CD20 jelen van nyugvó és aktivált B sejteken, de eltűnik plazmasejtekké érésük során. A B sejteken kívül más sejtek

(kivéve

talán

a

follikuláris

dendritikus

retikulumsejteket,

amelyekről

megoszlanak a vélemények) nem reagálnak az anti-CD20 antitestekkel. Specificitása és elterjedtsége miatt ez a molekula is alkalmas célpont lehet a B sejtvonalhoz tartozó malignitások bispecifikus antitest-terápiájában.

30

5.3.4.2. Az effektor sejt antigénje: CD3 A tumorok celluláris immunterápiájában különböző citolitikus effektor sejtek használhatók; T sejtek, NK sejtek, monociták és makrofágok. Több, a T sejtek lítikus aktivációjához szükséges sejtfelszíni molekulát írtak már le(157-159); TCR/CD3, CD2 és CD28. A T sejtek aktivációjához leggyakrabban a CD3 ellenes monoklonális antitestet használják. A monociták, makrofágok és limfociták stimulációját egy vagy több Fc-receptoruk lekötése idézi elő (164). Az Fcg-receptor három fajtája - monociták FcgRIa/CD64 és FcgRIIa/CD32 valamint a NK sejtek FcgRIII/CD16 receptora - közül mindegyik alkalmas a sejt mediált lízis előidézésére. NK sejtek esetében nemcsak az FcgRIII elleni monoklonális antitest, hanem a CD2 elleni antitest is aktivációt idéz elő (165). A T sejt receptor (TCR) olyan, több alegységből álló komplex, amely az antigénprezentáló sejtek MHC molekulájához kapcsolt antigént ismeri fel. A TCR antigénspecifikus kötőhelye heterodimer, amely a négy különböző proteinmolekulából álló CD3 antigénhez nem kovalensen kötődik. A CD3 egység szignáltranszdukciós kapacitását a receptor intracitoplazmatikus darabja határozza meg, amely az egyes fehérjékre jellemző (166). In vivo rendszerben a T sejtek aktiválásához az antigénspecifikus szignálon kívül még egy kostimulációs szignálra is szükség van. Ezt a kostimulációt a T sejtek egyéb receptorainak az antigénprezentáló sejtek megfelelő ligandjaival való kapcsolódása biztosítja. A fent leírt aktivációs folyamat in vitro beindítható a CD3 ellenes monoklonális antitesttel. Ez a szignál olyan intracelluláris folyamatokat indít el, amelyek végül az interleukin-2 receptor expressziójához, limfokin-termelődéshez és a sejtek aktiválódásához vezetnek. Ha a perifériás vér limfocitáit IL-2 hozzáadása mellett CD3 ellenes monoklonális antitesttel vagy PHA-val stimuláljuk, megfelelően aktivált T sejtekhez juthatunk (167,168). A bispecifikus antitestek által a tumorsejtekhez kapcsolt, előaktivált T sejtek citotoxikus hatását már leírták (138). A bispecifikus antitestek TCR/CD3 komplexen keresztül kifejtett lítikus hatása az MHC-től független és mind a CD4+, mind a CD8+ sejteket érinti.

31

Tanulmányomban olyan bispecifikus antitest készítését és vizsgálatát írom le, amelyet az eddigi eredmények alapján effektíven lehetne alkalmazni a gyermekkori akut limfoid leukémia adjuváns kezelésében.

32

6. MÓDSZEREK 6.1.

Limfoblasztok apoptózisának vizsgálata

6.1.1. Vérminták előkészítése apoptózis vizsgálatokhoz ALL-es

gyermekek

perifériás

vérmintáiból

fehérvérsejteket

izoláltunk

morfológiai és flow citometriás vizsgálatok elvégzéséhez. A vérvétel közvetlenül a prednizolon-kezelés megkezdése előtt, ill. 6, 24 és 48 órával a terápia megkezdése után történt. Kezdetben a vérvétel optimális időpontjának megállapítása érdekében a gyógyszer beadását követően 2, 4, 6, 24, 48 és 72 óra múlva is mértük az apoptotikus sejtek arányát. A heparinnal (50 mg/ml) kezelt vérmintát a vételtől számított 30 percen belül előkészítettük morfológiai és flow citometriás vizsgálatokra. 6.1.2. Fénymikroszkópos vizsgálat A vörösvérsejtek eltávolítása lizálással történt. 0,1 ml heparinos vért adtunk a 0,2 ml Becton-Dickinson Immunocytometry Systems FACS Lysing Solution 23-175001 és 1,8 ml víz keverékéből készített lizáló oldathoz. A keveréket centrifugáltuk (200 rpm, 5 perc), 2 ml PBS-ben mostuk (phosphate buffered saline, pH 7,2), majd újra centrifugáltuk (200 rpm, 5 perc). Az üledéket felrázva 30 ml-t tárgylemezre cseppentettük, majd a belőle készített kenetet 3 percig abszolút alkoholban fixáltuk. A keneteket Giemsa-festéssel megfestve fénymikroszkóp alatt vizsgáltuk. Minden kenet esetében 100 fehérvérsejtet számoltunk meg és az apoptotikus sejtek arányát a következő képlet szerint számoltuk ki: apoptózis index = apoptotikus sejtek / 100 sejt. 6.1.3. Flow citometria A perifériás vérből a vörösvérsejtek lízisével a fent leírt módon fehérvérsejteket szeparáltunk. A felrázott üledéket 4 oC-on 1 órán át 2 ml 70 %-os alkoholban fixáltuk. Centrifugálás után az üledéket 37 oC-on, 30 percig 0,5 mg/ml Rnase A-val (Sigma, St Louis, Missouri, USA) kiegészített PBS-ben (0,5 ml) inkubáltuk. Ezt követően szobahőmérsékleten 15 percig 50 mg/ml propídium-jodiddal (PI) festettük.

33

A

mérést

FACStar

flow

citométerrel

végeztük

(Becton-Dickinson

Immunocytometry Systems, Mountain View, California, USA). Az adatok kiértékelése Hewlett-Packard 300 számítógéppel a Consort 30 szoftver felhasználásával történt. Mintánként 1-1,5 x 104 számú sejtet mértünk. 6.1.4. Klinikai vizsgálatok A blasztsejtek vizsgálata (morfológia, citokémia, immunológia) a diagnózis felállításakor történt. A kezelés megkezdése előtt, ill. a prednizolon-terápia 8. napján meghatároztuk perifériás vérből készített, Giemsa festett kenetekben az abszolút blasztszámot. A kezelés 33. napján vizsgáltuk a hematológiai remissziót a csontvelőben. A csontvelői remisszió teljes volt, ha a normális vagy enyhén csökkent cellularitású csontvelőben 5% alatti blasztszámot találtunk. Ezen vizsgálatok időzítése az ALL-BFM90, ill. ALL-BFM-95-ös protokollban előírtak szerint történt. A betegek hosszú távú követését fizikális és képalkotó vizsgálattal, ill. a perifériás vér és a csontvelő vizsgálatával a fenti protokolloknak megfelelően végeztük el. 6.1.5. Statisztikai feldolgozás A perifériás vérminták elemzésével kapott adatok és a klinikai kórlefolyás összefüggéseit korrelációs analízissel vizsgáltuk. A korrelációs együttható kiszámítása:

r = kedvező esetek (++ és --) – kedvezőtlen esetek (+- és -+) összes eset 6.2.

Bispecifikus antitestek előállítása és in vitro kipróbálása

6.2.1. OKT3xHD37 hibrid-hibridóma előállítása Az OKT3 hibridóma sejtvonalat az American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) készítette. Ez a hibridóma CD3-specifikus IgG2a, k monoklonális antitestet termel, amely a CD3/TCR komplex e-láncát ismeri fel. A HD37 sejtvonal által termelt monoklonális antitest (IgG1, k) a CD19 molekulával reagál. A hibridóma sejtvonalaknál kizártuk a mikoplazma infekció jelenlétét (Mycoplasma Tissue Culture, DNA-Sonden-Test (H-3), GEN-PROBE, Hermann Biermann GmbH, Bad Nauheim, Germany) és ezt követően higítási sor készítésével kiválasztottuk azokat 34

a klónokat, amelyek a legnagyobb mennyiségű immunglobulint termelték. Az OKT3 hibridómasejteket 10 napig 5 mg/ml 6-thioguanine-t tartalmazó médiumban (Sigma Fine Chemicals,

Munich,

Germany)

inkubáltuk

és

ezáltal

hypoxanthine-guanine

phosphoribosyl transpherase (HGPRT) deficiensé tettük. A másik fúziós partnert, a HD37 hibridóma sejtvonalat letális dózisú iodoacetamide-dal (5mM, 30 perc, 4 oC) kezeltük a fúzió előtt. A sejtfúzióhoz mindkét szülői hibridómából 3x107 hibridómasejtet kevertünk össze és polyethylene glycol 4000 (Merck, Darmstadt, Germany) segítségével fuzionáltattuk (5. ábra). A hibrid-hibridómákat a fúziós keverék HAT-médiumban történő 14 napos inkubációjával választottuk ki.

HGPRT-

OKT3 hibridóma

JÓDACETAMID HAT T

HD37 hibridóma

OKT3xHD37 hibrid-hibridóma

5. ábra

Az OKT3xHD37 hibrid-hibridóma előállítása

A növekvő sejtkultúrák felülúszójában a két szülői immunglobulin termelődését „double isotype ELISA” segítségével vizsgáltuk. Több alkalommal történt szubklónozás és a biizotípusos antitestek jelenlétének igazolása megmutatta, hogy sikerült stabil OKT3xHD37 kvadróma sejtvonalat létrehozni. 6.2.2. OKT3xHD37 bispecifikus antitestek előállítása és tisztítása A kvadróma sejteket hollowfiber bioreaktorban (Tecnomara, Fernwald, Germany) tenyésztettük. A hollowfiber cartridge-ból nyert antitest-keveréket először az IgG1 szülői antitestektől affinitáskromatográfiával Protein-A Sepharose CL-4B oszlopon (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) választottuk el. Ezt követően az eluátumot HPLC-vel tovább tisztítottuk. Ehhez Bakerbond Abx oszlopot használtunk

35

(JT Baker Inc, Philipsburg, NJ, USA), amely lehetővé tette a bispecifikus antitestek szeparálását „morpholinoethane sulfonic acid/sodium acetate”-grádiens használatával. Az eluált anyag tisztaságát SDS-polyacrylamide gélelektroforézissel ellenőriztük redukáló körülmények között. 6.2.3. Immunfluoreszcens jelölés A sejtek fenotípusát indirekt immunfluoreszcens jelöléssel határoztuk meg. 1x106 sejtet inkubáltunk különböző elsődleges, majd GAM-IgG-FITC (Gibco BRL, Eggenstein, Germany) másodlagos antitesttel. A sejtek mérése FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA) használatával, a Lysis II szoftver segítségével történt. Az elpusztult sejtek kizárására propídium-jodid (PI) jelölést használtunk. A következő primer antitesteket használtuk munkánk során: ·

B sejtvonal markerek: HD37 (CD19), MEM97 (CD20), HD239 (CD22), J5 (CD10)

·

T sejt markerek: OKT3 (CD3), OKT11 (CD2), HP2/6 (CD4), HK231 (CD5), 15E8 (CD28), OKT8 (CD8)

·

Aktivációs markerek: anti-Tac (CD25), FN50 (CD69), PA-1 (CD71), FUN-1 (CD86), anti-APO-1 (CD95) antitestet

·

Adhéziós molekulák: anti-CD11a (CD11a), anti-CD18 (CD18), K20 (CD29), anti-CD49a (CD49A), 84H10 (CD54)

·

Bispecifikus

antitestek:

OKT3xHD37

(CD3xCD19),

OKT3xMEM97

(CD3xCD20) Az antitestek a IV. és V. Leucocyte Typing Workshop-ról származtak. A negatív kontroll a HD20 (anti-humán IgG idiotípus), a pozitív kontroll pedig a W6/32 (monomorf anti-MHC-I) monoklonális antitest volt. 6.2.4. A targetsejtek és a perifériás vér mononukleáris sejtjeinek (PBMC) izolálása Heparinizált vért vagy csontvelő-mintát vettünk egészséges donoroktól és ALLes betegektől a diagnózis felállításakor és remisszióban. A mononukleáris sejteket Ficoll-Pacque (Pharmacia) sűrűséggrádiens centrifugálással izoláltuk. A sejteket frissen

36

használtuk vagy felhasználásig folyékony nitrogénben tároltuk. A sejtek viabilitása (tripánkék festékkizárással vizsgálva) minden esetben 90 % felett volt. 6.2.5. A nyugvó T sejtek aktiválása Az izolált perifériás vér mononukleáris sejtekből először a monocitákat távolítottuk el plasztik-adhézióval (2 óra, 37 oC). A monocitákat a plasztik-felületről feloldva jégen tároltuk. A nonadherens sejtek közül a T-sejteket birka vörösvérsejtekkel való rozettaképzéssel izoláltuk. A rozettákat Ficoll-Pacque sűrűségcentrifugálással különítettük el a rozettákat nem alkotó sejtektől. Ezt követően a monocitákat visszaadtuk a T limfocitákhoz. A sejteket 2x106 sejt/ml koncentrációban RPMI 1640 médiumban tenyésztettük, amelyet 2%, hővel inaktivált FCS-mal, 10 mM Hepes-szel, 50 mM 2-ME-lal, 1 mM pyruvate-tal, 2 mM glutamine-nal és gentamicinnel (4 mg/ml) egészítettünk ki. A T-sejteket 100 ng/ml CD3xCD19 bispecifikus antitesttel aktiváltuk 37 oC-on, 5 % CO2 mellett 3 napig. Pozitív kontrollként 10 mg/ml phytohemagglutininnel (PHA; Wellcome, Hannover, Germany) inkubált, maximálisan stimulált T sejteket használtunk. A proliferációs kapacitás meghatározására a sejtkultúrához az inkubáció utolsó 18 órájára 1 mCi/lyuk 3H-thymidine-t adtunk. A 4. napon a sejtek által inkorporált radioaktivitást mértük. A kísérletet triplikátumok formájában végeztük. A stimuláció előtt (0. nap) és után (4. nap) is vizsgáltuk a sejtfelszíni markerek változását. Ebben a kísérletben a mononukleáris sejteket 3 napig inkubáltuk CD3xCD19 bispecifikus antitesttel monoklonális CD28 elleni antitest jelenlétében, ill. anélkül. Ezután háromszori mosást követően egy éjszakára médiumban inkubáltuk a sejteket. A jelölés és a FACS-analízis a korábban leírtak szerint történt. 6.2.6. Citotoxicitási esszé A citotoxicitást „standard chromium release assay”-ben mértük 96 lyukú kerekaljú mikrotiter lemezekben (Greiner, Frickenhausen, Germany). RPMI 1640 médiumot használtunk 10 % FCS (GIBCO), 10 mM Hepes, 50 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM pyruvate és 2 mM glutamine hozzáadásával. Az effektor sejteket 3 napos aktiválás után mostuk és egy éjszakán át 2x106 sejt/ml koncentrációban inkubáltuk. 100 ml médiumban különböző számú effektor 37

sejthez óvatosan 50 ml CD3xCD19 bispecifikus antitestet (1 mg/ml) kevertünk. A kontroll mintához 50 ml CD3 és CD19 szülői antitestet (1 mg/ml) vagy 50 ml médiumot adtunk. 30 perc múlva 1x104 51Cr-mal jelölt targetsejtet adtunk mindegyik lyukban levő mintához. A lemezeket 100 g-n 3 percig centrifugáltuk és 37 oC-on, 5 % CO 2- dal 3,5 órán át inkubáltuk. A lemezeket 4 percig centrifugáltuk és a 100 ml felülúszóban a felszabaduló

51

Cr-ot gammaszámlálóval (Cobra Auto-Gamma; Canberra-Packard,

Dreieich, Germany) mértük. Pozitív kontrollként (maximális release) 10 % SDS-ben, negatív kontrollként (spontán release) pedig médiumban inkubáltuk a target sejteket. A vizsgálatot triplikátumok formájában végeztük el. A specifikus

51

Cr-release százalékos

értékét a következőképpen határoztuk meg:

specifikus release % = (kísérleti release

-

spontán release) x 100.

(maximális release - spontán release)

38

7. EREDMÉNYEK 7.1.

Az apoptotikus index prognosztikai szerepe prednizolon-kezelés alatt A leukémia diagnózisát a perifériás vér és/vagy csontvelő morfológiai (FAB

klasszifikáció), citokémiai, immunológiai, cito- és molekuláris genetikai vizsgálatai alapján állítottuk fel. A vizsgálatunkban résztvevő betegek különböző morfológiai (Giemsa-festett kenet) és immunfenotípusú (flow citometria) leukémiatípusban szenvedtek (1. táblázat). FAB

Esetek száma

Immunológia

Esetek száma

L1

33/42

cALL

23/42

L1-2

2/42

Pre-pre B

3/42

L2

6/42

B-sejtes

2/42

L2-3

1/42

T-sejtes

8/42

Bifenotípusos

4/42

sikertelen vizsgálat

2/42

1. táblázat

Akut limfoid leukémiás gyermekek blasztjainak morfológiai és immunológiai vizsgálata

A legtöbb leukémia (33/42) az L1 típushoz tartozott. Az immunológiai vizsgálat során 23 gyermeknél találtunk CD10+, ún. common ALL-t. Ugyanakkor a bifenotípusos leukémiák (4/42) száma sem elhanyagolható. Ennél a leukémiafajtánál a sejtek felszínén mind a limfoid, mind a mieloid sejtvonalra jellemző antigének expresszálódnak. Emiatt rendkívül nehéz a diagnózis felállítása. Vizsgálatunkban a morfológiai és flow citometriai vizsgálattal meghatározott apoptózis-indexet hasonlítottuk össze a klinikai prednizolon-válasszal. A klinikai prednizolon-választ két adat alapján határoztuk meg; ezek a kezelés 8. napján a perifériás vérben az abszolút blasztszám, ill. a 33. napi csontvelővizsgálat eredménye. Ha a 8. napon az abszolút blasztszám kisebb volt, mint 1 G/l és a 33. napon végzett csontvelővizsgálat is remissziót (< 5 % blaszt) mutatott, akkor a klinikai választ pozitívnak tekintettük (2. és 3. táblázat). 39

40

Morfológia Apoptózis-index (%)

Flow citometria Apoptózis-index (%)

Perifériás blasztok száma (G/l)

0 óra

0. nap

8. nap

1,66

<1

o

Név

Kor (év) /nem

1.

C.Z.

15/f

0

8

+

2,5

2,9

+

2.

C.H.

6/n

3

3

-

4,8

7,0

+

1,85

<1

3.

N.I.

4/n

1

5

+

1,7

2,5

+

6,21

<1

4.

S.D.

17/f

1

8

+

5,0

6,1

+

37,4

<1

5.

K.S.

6/f

0

3

+

2,9

5,5

+

150,4

<1

6.

N.A.

15/f

1

6

+

4,7

8,7

+

19,39

<1

7.

M.R.

4/f

0

2

+

4,6

5,0

+

2,2

<1

8.

H.O.

11/n

1

3

+

6,9

17,8

+

100,2

<1

9.

S.Z.

7/n

0

20

+

3,5

6,0

+

4,92

<1

10.

K.E.

14/n

0

1

-

5,6

4,5

-

16,4

=1

11.

B.I.

2/n

2

15

+

5,0

16,0

+

2,38

<1

12.

B.P.

4/f

1

3

+

2,3

6,9

+

34,6

<1

13.

R.J.

4/n

1

1

-

3,4

0,2

-

24,7

<1

14.

M.P.

4/f

1

1

-

1,1

0,8

-

0,58

<1

15.

D.F.

9/f

2

6

+

4,5

1,5

-

8,83

<1

16.

N.K.

8/n

2

6

+

5,7

4,9

-

142,5

>1

17.

N.K.

4/n

1

6

+

4,4

17,5

+

3,59

<1

18.

K.G.

11/f

-

1

-

2,6

3,8

+

16,65

<1

19.

R.J.

6/n

1

1

-

1,6

1,5

-

2,24

<1

20.

K.D.

6/f

3

8

+

1,72

2,92

+

544

<1

21.

K.I.

8/f

3

6

+

3,71

5,35

+

3,06

<1

22.

H.K.

3/n

3

3

-

0,6

0,3

-

13,4

<1

23.

N.F.

5/f

0

5

+

1,9

2,5

+

2,3

<1

24.

J.J.

4/n

-

1,9

>1

4/n

Æ +

1,8

H.F.

Æ 3

2,5

25.

Æ 1

3,8

4,5

+

2,4

<1

26.

P.B.

2/n

0

0

-

2,0

2,2

-

21,2

>1

27.

V.A.

2/f

1

1

-

1,5

8,7

+

2,9

<1

28.

H.T.

3/f

4

8

+

1,7

7,1

+

11,7

<1

29.

B.B.

6/f

2

6

+

3,6

10,9

+

50,2

<1

30.

M.C.

2/n

2

6

+

3,1

9,3

+

1,9

<1

31.

M.Zs.

1/n

2

6

+

1

6,2

+

12,0

<1

32.

G.R.

2/n

1

2

-

2,2

2,8

+

3,1

<1

33.

B.D.

6/f

0

2

+

0,45

1,33

+

212

<1

34.

K.D.

7/n

2

5

+

2,6

4,8

+

144,1

>1

35.

M.A.

7/n

1

3

+

1,6

3,9

+

13,7

<1

36.

B.Á.

13/f

1

2

-

1,8

1,7

-

279,7

>1

37.

M.D.

2/f

1

4

+

1,2

4,0

+

7

38.

N.N.

15/n

1

4

+

2,4

4,5

+

36,7

<1 <1

39.

O.J.

11/f

2

4

+

5,2

7,4

+

54,1

<1

40.

M.R.

6/f

1

4

+

9,42

7,08

-

0,3

41.

Sz.Gy.

13/n

1

3

+

6,82

6,05

-

0,21

<1 <1

42.

V.V.

7/n

1

1

-

1,97

3,11

+

7,26

<1

N

0 óra

2. táblázat

6 óra

6 óra

ALL-es gyermekek klinikai szteroid-válaszának összehasonlítása a morfológiai és flow citometriás mérések eredményeivel 41

Beteg

Morfológia (6 óra)

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42.

+ + + + + + + + + + + + + + + + Æ + + + + + + + + + + + + + -

3. táblázat

Flow citometria (6 óra) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Abszolút blasztszám a 8. napon (G/l) <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 =1 <1 <1 <1 <1 <1 >1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 >1 <1 >1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 >1 <1 >1 <1 <1 <1 <1 <1 <1

Remisszió a 33. napon + + + + + + + + + Æ + + + + + + + + + + + + + + Æ + + + + + + + + Æ + + + + Æ Æ

Jelenleg (átlagos követési idő 64 hó)

remisszió remisszió remisszió korai relapszus, meghalt meghalt (szepszis), túlélés 6 hónap korai relapszus, meghalt meghalt (szepszis), túlélés 4 hónap korai relapszus, meghalt remisszió meghalt (szepszis) a 33. nap előtt remisszió remisszió korai relapszus, meghalt remisszió korai relapszus, meghalt korai relapszus, meghalt remisszió remisszió remisszió meghalt (szepszis), túlélés 2 hónap remisszió remisszió remisszió remisszió, csv-ben sok éretlen remisszió remisszió remisszió remisszió remisszió remisszió remisszió korai relapszus, meghalt remisszió korai relapszus, meghalt remisszió meghalt (szepszis) a 33. nap előtt remisszió remisszió remisszió remisszió meghalt (szepszis) a 33. nap előtt meghalt (szepszis) a 33. nap előtt

A morfológiai és flow citometriai vizsgálatok eredménye a 8. napi abszolút blasztszám, a 33. napi csontvelővizsgálat és a hosszútávú követés függvényében.

42

Vizsgálataink során a klinikai prednizolon-válasz 7 betegnél nem volt kielégítő. A hét beteg immunfenotípusa különböző volt; három betegnél cALL-t, egy betegünknél bifenotípusos ALL-t, egynél B-ALL-t ill. kettőnél T-ALL-t diagnosztizáltunk. Az apoptózis arányának szteroid-indukálta változását mind flow citometriai, mind morfológiai vizsgálattal korán ki tudtuk mutatni. Kezdetben a 0 és 6 órás minta mellett a kezelés 24., 48., ill. 72. órájában is történt mintavétel, méréseink eredménye alapján azonban elegendő a kiindulási apoptózis-index után a 6 órás érték meghatározása, mivel a betegek vérmintáiban pozitív eredmény esetén ebben az időpontban már szignifikáns emelkedést találtunk. Az apoptózis-index értéke a későbbi időpontokban csökkent a 6 órás minta értékéhez képest (6. ábra). Az apoptózis-negatív eseteknél a flow citometriai méréssel 72 óra elteltével sem észleltünk emelkedést.

apoptózis-index (%)

20

H.T. N.K. J.J. H.K.

15 10 5 0 0

6

24

48

72

mérés időpontja (óra)

6. ábra

Az apoptózis-index változása az idő függvényében. Négy kiválasztott beteg flow citometriás vizsgálatának eredményei.

A 7. és 8. ábrán egy típusos, jó klinikai prednizolon-választ mutató beteg morfológiai és flow citometriai vizsgálatát mutatjuk be. A Giemsa-festett kenetben jól látszanak a 6 órás mintában nagy számban megjelenő apoptotikus sejtek. Ezt az eredményt támasztja alá a beteg fehérvérsejtjeinek flow citometriai vizsgálata is, ahol a 6 órás mintában megjelenik az apoptotikus sejtekre jellemző DNS-változás.

43

0 óra

6 óra

7. ábra

Apoptózisra jellemző fénymikroszkópos változások ALL-es beteg limfoblasztjaiban Giemsa-festett kenetben (0 órás és 6 órás minta).

8. ábra

Apoptózisra jellemző DNS-változás ALL-es beteg limfoblasztjaiban (flow citometriai mérés).

44

Az apoptózis-index meghatározása során a kétféle módszerrel kapott eredmények között csak kevés eltérést találtunk. A 42 vizsgált betegből 25-nél mindkét vizsgálattal pozitív eredmény kaptunk, 7 betegnél pedig sem a morfológia, sem a flow citometria nem tudott lényeges emelkedést kimutatni az apoptózis-indexben. A többi beteg közül (9/42) vagy az egyik (4/9 morfológia), vagy a másik (5/9 flow citometria) módszerrel találtunk pozitív változást, illetve egy esetben a flow citometria eredménye negatív volt, de morfológiai vizsgálat technikai okokból nem történt. Abból a 41 esetből tehát, ahol mindkét módszerrel vizsgáltuk az apoptózis-index változását, 32 esetben mutatott a két vizsgálat egyező eredményt. A mérések eredményeit a klinikai szteroidválasszal (a terápia megkezdése utáni 8. és 33. napon) és a hosszútávú túléléssel hasonlítottuk össze. 25 gyermeknél mutatta mindkét módszer az apoptózis-index emelkedését (2. táblázat). Közülük 24 beteg a kezelés kezdetén alkalmazott prednizolon-terápiára is jól reagált, azaz a kezelés 8. napján abszolút blasztszámuk a vérben 1 G/l alatt, a 33. napon pedig a blasztok aránya a csontvelőben 5% alatt volt. Csupán 1 beteg reagált kevéssé a szteroid-kezelésre - a 8. napi abszolút blasztszám > 1 G/l volt és a csontvelő sem mutatott remissziós képet -, holott apoptózis vizsgálatunk eredménye alapján jó szteroid-választ vártunk volna. Betegünk további sorsa a klinikai vizsgálatok eredményét támasztotta alá, mivel alapbetegsége korán, már a fenntartó kezelés alatt recidivált. A 24, jó klinikai választ mutató beteg közül háromnál jelentkezett korai leukémia-recidíva, a többi beteg jelenleg is remisszióban van. Azon 7 beteg közül, akiknél mind a morfológiai, mind a flow citometriás vizsgálat eredménye negatív volt, 3 betegnél a szteroid-válasz sem volt megfelelő a 8. napon. Sajnos őket a 33. nap előtt elveszítettük a leukémia, ill. az ehhez társultan kialakult szepszis következtében. Négy betegünknél ugyan az abszolút blasztszám < 1 G/l volt a 8. napon, de a 33. napon csak háromnál tudtunk csontvelői remissziót kimutatni. A negyedik betegnél a csontvelői kép alapján intenzívebb kemoterápiás kezelést kezdtünk, amelynek eredményeként a beteg jelenleg – 6,5 évvel a kezelés befejezése után - is jól van. A másik három betegnél a korai terápiás válasz ugyan jó volt, de egyikük betegsége a fenntartó kezelés alatt recidivált, míg a másik két beteg évekkel (7, ill. 3,5 év) a terápia befejezése után remisszióban van.

45

Annál az 5 betegnél, akiknél csak a flow citometriás vizsgálat volt pozitív, míg a morfológia negatív, a klinikai szteroid-válasz jó volt. A 8. napi abszolút blasztszám mindegyiküknél < 1 G/l volt. Közülük négynél remissziós volt a 33. napi csontvelővizsgálat eredménye is, míg egy betegnél a klinikai választ csak a 8. napi blasztszám értékével tudtuk alátámasztani, mivel betegünk szepszis miatt exitált a 33. napi csontvelővizsgálat előtt. Ebből a betegcsoportból egyikük leukémiája korán recidivált, de hárman évekkel a kezelés befejezése után is remisszióban vannak. Végül azon 4 beteg közül, akiknél csak a morfológiai vizsgálat volt pozitív, háromnál észleltünk jó klinikai választ mind a 8., mind a 33. napon, de egyikük betegsége korán recidivált. A negyedik beteg abszolút blasztszáma a kezelés 8. napján nagyobb volt, mint 1 G/l és bár a 33. napi csontvelővizsgálat remissziót mutatott, a betegnél korai relapszus jelentkezett.

klinikai válasz

r=0,66

+

p<0,05

klinikai válasz

r=0,51

-

+

p<0,05

35 beteg 6 beteg flow

+ 30 beteg

citometria

11 beteg

35 beteg 6 beteg

+

29

1

morfológia 29 beteg

6

5

12 beteg

-

klinikai válasz

r=0,76

+

p<0,05

-

(többi) 34 beteg

citom. vagy morfológia

--

4. táblázat

7 beteg

27

2

8

4

klinikai válasz

r=0,75

+

p<0,05

35 beteg 6 beteg flow

-

-

27 beteg 5 beteg

++

32

2

flow

25 beteg

3

4

citom. = morfológia

-7 beteg

24

1

3

4

A citológiai és klinikai vizsgálatok összefüggései (r: korrelációs együttható, p: szignifikanciaszint)

46

Vizsgálataink során szignifikáns pozitív korrelációt találtunk a klinikai válasz és az apoptózis-vizsgálatok között mind a flow citometria (r=0,66), mind a morfológia (r=0,51) esetében. Mind a pozitív, mind a negatív prediktív érték magas. Abban az esetben, ha legalább az egyik apoptózis-vizsgálat eredménye pozitív (VAGY), akkor igen jó egyezést találunk a klinikai adatokkal (r=0,76). Ha csak a mindkét apoptózisvizsgálattal egyező eseteket tekintjük, akkor is hasonlóan magas korreláció figyelhető meg. (4. táblázat) Kilenc ALL-recidívás beteget is vizsgáltunk (5. táblázat). Közülük hatnál az apoptotikus sejtek száma egyik módszerrel sem mutatott emelkedést. Egy betegnél (T.N.) csak a morfológiai, egynél (D.F.) csak a citometriai vizsgálat jelzett fokozott apoptózist. Egy betegnél (H.F.) mindkét apoptózis-vizsgálat eredménye pozitív volt. A betegek hosszútávú követése során valamennyi beteg rossz prognózisúnak bizonyult függetlenül az apoptózis vizsgálatok eredményétől.

Morfológia

Flow citometria

Név

apoptózis-index (%)

apoptózis-index (%)

1. 2. 3. 4. 5. 6.

K.Z. F.G. S.D. D.F. T.N. H.F.

0 óra 4 0 0 2 2 2

6 óra 2 1 0 3 4 6

7. 8. 9.

F.B. G.B. Gy.B.

-

1

No

5. táblázat

<1

+ + -

0 óra 3,7 4,8 1,5 4,2 4,1 4,4

6 óra 4,0 2,7 1,7 4,8 3,3 9,7

3,5 6,0 1,5

1,7 2,4 1,4

ALL-recidívás betegek apoptózis-vizsgálatának eredménye

47

+ + -

7.2.

A CD3xCD19 és a CD3xCD20 bispecifikus antitest előállítása, tisztítása és

jellemzése Hibrid-hibridóma technikával készítettük az OKT3xHD37 (CD3xCD19) antitestet, amely a HGPRT-deficiens OKT3 hibridóma (CD3, IgG2a) és a jódacetamiddal kezelt HD37 hibridóma (CD19, IgG1) fúziójával jött létre. Az OKT3xMEM97 (CD3xCD20) antitest esetében a második fúziós partner a jódacetamiddal kezelt MEM97 hibridóma (CD20, IgG1). Először double isotype ELISAval kiválasztottuk azokat a hibridómákat, amelyek mindkét szülői immunglobulint termelték.

Nagy

mennyiségű

bispecifikus

antitestet

termeltünk

hollowfiber-

technológiával és 2 lépésben tisztítottuk affinitáskromatográfiával Protein-A CL-4B oszlopon, majd HPLC-vel Bakerbond Abx-oszlopon. Az eluált csúcsfrakció tisztaságát SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel ellenőriztük. JOK-1 (CD19+, CD3-) GAM IgG1-PE OKT3 (G2A)

HD37 (G1)

OKT3xHD37

HD37

OKT3xHD37

GAM IgG2a-PE OKT3

Jurkat (CD3+, CD19-) GAM IgG1-PE OKT3xHD37 OKT3 (G2A)

HD37 (G1)

GAM IgG2a-PE OKT3xHD37 OKT3

HD37

Fluoreszcens intenzitás

9. ábra

A

CD3xCD19

bispecifikus

antitest

és

a

szülői

antitestek

immunreaktivitásának vizsgálata (Az x tengely a fluoreszcens intenzitást, az y tengely a relatív sejtszámot mutatja)

48

A CD3xCD19 bispecifikus antitest immunreaktivitását (9. ábra) a két különböző antigénkötőhely szelektív kötésével ellenőriztük két sejtvonal; a JOK-1 B limfoblasztos (CD19+, CD3-) és a JURKAT T limfoblasztos (CD3+, CD19-) sejtvonal segítségével. A flow citometriás mérés során PE-jelölt izotípus-specifikus másodlagos antitestet (GAM IgG1-PE és GAM IgG2a-PE) használtunk. A bispecifikus antitest CD19-es karjának kötődését a JOK-1 sejtekhez GAM IgG2a antitesttel, a CD3 kar kötődését a JURKAT sejtekhez GAM IgG1 antitesttel igazoltuk. Ez a kísérlet bizonyította, hogy a bispecifikus antitest mindkét karja intakt és aktív. Hasonlóan történt a CD3xCD20 bispecifikus antitest tisztítása és antigénkötő képességének vizsgálata is. 7.3.

A cALL-es gyermekek limfoblasztjainak fenotipizálása Leukémiás blasztokat izoláltunk Ficoll sűrűség centrifugálással ALL-es gyerekek

perifériás véréből vagy csontvelőjéből. Flow citometriás méréssel vizsgáltuk a sejtfelszíni antigének expresszióját a frissen izolált vagy folyékony nitrogénben tárolt és kiolvasztott sejteken (6. táblázat). A vizsgálatban 16 gyermek vett részt. Valamennyien CD10 pozitív, sejtfelszíni immunglobulint nem expresszáló, B sejtvonalhoz tartozó, common ALL-ben szenvedtek (cALL).

6. táblázat

Monoklonális antitest

Antigén

HD37

CD19

16/16

OKT3xHD37

CD3xCD19

16/16

MEM97

CD20

6/16

OKT3xMEM97

CD3xCD20

6/16

OKT3

CD3

0/16

J5

CD10

16/16

W6/32

MHC I

16/16

HD20

neg. kontroll

Pozitív esetek száma / Betegek száma

cALL-es betegek immunfenotípusa 49

0/16

Mindegyik mintában (16/16) erős CD19 pozitivitást találtunk, míg a CD20 antigén csak 6 esetben volt pozitív. Emiatt a két lehetséges célantigén közül a CD19-et választottuk és a CD3xCD19 bispecifikus antitesttel dolgoztunk tovább. A CD3xCD19 antitest kötési intenzitása megfelelt a két szülői antitest; a CD3 és a CD19 kötődésének. Két reprezentatív beteg sejtfelszíni markereinek flow citometriai vizsgálatát mutatja be a 10. ábra. A sejteket a megfelelő antitesttel jelöltük, majd GAM IgG FITC másodlagos antitesttel inkubáltuk. Negatív kontrollként a HD20 (humán Ig idiotípus), pozitív kontrollként pedig a W6/32 (MHC I) antitestet használtuk. B.G.

A.S.

Fluoreszcens intenzitás

10. ábra

Két reprezentatív cALL-es beteg sejtfelszíni markereinek flow citometriai vizsgálata

7.4.

A perifériás vér limfocitáinak (PBL) aktiválása A CD3xCD19 bispecifikus antitest T sejt aktiváló hatását egészséges donorok

véréből izolált mononukleáris sejteken (PBMC) vizsgáltuk. Különböző stimulusok alkalmazását követően a sejtek proliferációját mértük 3H-timidin inkorporációs teszttel. Meghatároztuk

az

optimális

dózist,

kinetikát

és

vizsgáltuk

a

kostimuláció

szükségességét is. Az optimális aktivációs időtartam in vitro meghatározására a

50

perifériás vér mononukleáris sejtjeit (4x105 sejt/lyuk) CD3xCD19 bispecifikus antitesttel (100 ng/ml); CD3xCD19 bispecifikus antitesttel + CD28 monoklonális antitesttel (mindegyik 100 ng/ml); ill. fitohemagglutininnel inkubáltuk 5 napig. Negatív kontrollként a sejteket médiumban inkubáltuk. A sejtkultúrákhoz az inkubáció utolsó 18 órájára 3H-timidint adtunk, majd az ábrán jelzett időpontokban az inkorporált radioaktivitást mértük. 40

médium PHA CD3xD19 CD3xCD19+CD28

proliferáció (cpm x 10-3)

35 30 25 20 15 10 5 0 18

24

48

72

96

120

idő (óra)

11. ábra

A perifériás vér limfocitáinak aktivációs kinetikája

Mint a 11. ábrán látható, legkorábban a 2. napon figyelhető meg a sejtek proliferációja, amely maximális értékét a 3. napon éri el. Ettől az időponttól kezdve a sejtek proliferációja csökkenő tendenciát mutat. Az egészséges donorok sejtjeinél a CD3xCD19 bispecifikus antitest 72 órával a stimuláció kezdete után éri el a maximális proliferációs hatást, amelynek mértéke a PHA hatásához hasonlítható. Ezzel megegyező kinetikát mutat a bispecifikus antitest 1 ng/ml és 10 ng/ml koncentrációban is. A T sejtek aktiválásához szükséges optimális dózis meghatározásához (12. ábra) a sejteket változó koncentrációjú CD3xCD19 bispecifikus antitesttel inkubáltuk CD28 antitest jelenlétében, ill. anélkül. Már 0,01 ng/ml antitest koncentrációnál jelentős

51

proliferáció volt megfigyelhető CD3xCD19 jelenlétében, az aktiváció 1 ng/ml-nél érte el a platót. 50

médium

proliferáció (cpm x 10-3)

45 40

PHA

35

CD28

30

CD3xCD19

25 20

CD3xCD19+CD28

15 10 5 0 0,001 0,01 0,1 1 10 antitestkoncentráció (ng/ml)

12. ábra

100

A perifériás vér limfocitáinak proliferációja különböző stimulusok hatására

Több mint 20 egészséges donortól vett PBMC mintát aktiváltunk ilyen módon. Vizsgálataink alapján bebizonyosodott, hogy a CD3xCD19 bispecifikus antitest már viszonylag kis koncentrációban is képes aktiválni a nyugvó T limfocitákat. A CD28 monoklonális antitest, mint kostimulációs faktor jelenléte a sejtek proliferációs szintjét tovább fokozta (13. ábra).

60 proliferáció (cpm x 10-3)

médium 50

PHA

40

CD28 (0 ng/ml) CD28 (100 ng/ml)

30

CD28 (1000 ng/ml) 20 10 0 0,001 0.01

0.1

1

10

100

CD3xCD19 bispecifikus antitest koncentráció (ng/ml)

52

13. ábra

A CD3xCD19 bispecifikus antitest + különböző koncentrációjú CD28 antitest aktiváló hatása

A CD3xCD19 bispecifikus antitest mellett a szülői antitestek (CD3 és CD19) T limfocita aktiváló képességét is vizsgáltuk (14. ábra). Legnagyobb meglepetésünkre, a szülői antitestek alkalmazásával - azonos koncentrációban adva - a bispecifikus antitesttel azonos aktivációs szintet sikerült elérni. Ezt tapasztaltuk kostimuláció (CD28) jelenlétében is.

40

médium PHA CD3xCD19

proliferáció (cpm x 10-3)

35 30

CD3 CD19

25 20 15 10 5 0 0

0,001 0,01

0,1

1

10

100

antitest-koncentráció (ng/ml)

14. ábra

A CD3xCD19 bispecifikus antitest és a szülői antitestek; CD3 és CD19 limfocita aktiváló képessége

Ezen tény hátterének vizsgálatára az OKT3 (CD3) antitest, ill. az OKT3 antitest F(ab’)2 fragmensének jelenlétében próbáltuk aktiválni az effektor sejteket. Kísérletünk eredménye (15. ábra) azt mutatta, hogy míg az OKT3 antitest önmagában is képes volt aktiválni a T limfocitákat, addig az OKT3 F(ab’)2 fragmense nem okozott aktivációt.

53

50

CD3

proliferáció (cpm x 10-3)

45

CD3 Fab'2

40 35 30 25 20 15 10 5 0 0

0,001 0,01

0,1

1

10

100 1000

antitest koncentráció (ng/ml)

15. ábra

T limfociták aktiválása OKT3 (CD3) antitest és F(ab’)2 fragmensének jelenlétében

Az aktivált mononukleáris sejtek fenotípusa Flow citométerrel vizsgáltuk a sejtfelszíni antigének expressziójának változását a mononukleáris sejtek aktiválása előtt, ill. a bispecifikus antitesttel (kostimulációval és anélkül) történt aktiválás után. Az izolált sejtekhez 100 ng/ml CD3xCD19 bispecifikus antitestet vagy 100 ng/ml CD3xCD19 + CD28 antitestet adtunk. 3 napos inkubáció után a sejtek mosásával eltávolítottuk a maradék antitesteket és egy éjszakára médiumban inkubáltuk őket. Kísérletünkben aktivációs antigének, adhéziós molekulák, T- és B-sejt antigének expressziójának változását vizsgáltuk.

54

AKTIVÁCIÓ ELŐTT

CD3xCD19 AKTIVÁLT

CD3xCD19 + CD28 AKTIVÁLT

Fluoreszcens intenzitás 16. ábra

Aktivációs antigének sejtfelszíni expressziója CD3xCD19 bispecifikus antitesttel és CD3xCD19 bispecifikus antitest + CD28 monoklonális antitesttel történt aktiváció után

AKTIVÁCIÓ ELŐTT

CD3xCD19 AKTIVÁLT

CD3xCD19 + CD28 AKTIVÁLT

Fluoreszcens intenzitás 17. ábra

Adhéziós molekulák sejtfelszíni expressziója CD3xCD19 bispecifikus antitesttel és CD3xCD19 bispecifikus antitest + CD28 monoklonális antitesttel történt aktiváció után

55

AKTIVÁCIÓ ELŐTT

CD3xCD19 AKTIVÁLT

CD3xCD19 + CD28 AKTIVÁLT

Fluoreszcens intenzitás 18. ábra

T-sejt markerek sejtfelszíni expressziója CD3xCD19 bispecifikus antitesttel és CD3xCD19 bispecifikus antitest + CD28 monoklonális antitesttel történt aktiváció után AKTIVÁCIÓ ELŐTT

CD3xCD19 AKTIVÁLT

CD3xCD19 + CD28 AKTIVÁLT

Fluoreszcens intenzitás 19. ábra

B-sejt markerek sejtfelszíni expressziója CD3xCD19 bispecifikus antitesttel és CD3xCD19 bispecifikus antitest + CD28 monoklonális antitesttel történt aktiváció után 56

A különböző aktivációs antigének (16. ábra): az IL-2 receptor a lánc (CD25), az aktivációt indukáló molekula (CD69), a transzferrin receptor (CD71), a B7-2 antigén (CD86) és az APO-1/Fas antigén (CD95) indukcióját figyeltük meg, ha a sejteket 72 órán át 100 ng/ml CD3xCD19 bispecifikus antitesttel inkubáltuk. A bispecifikus antitestet CD28 antitesttel kombinálva az aktivációs markerek expresszióját még kis mértékben fokozni lehetett. Ugyanezt lehetett megfigyelni az adhéziós molekulák (17. ábra); az LFA-1 (CD11a), az ICAM-1R (CD18), a VLA-b lánc (CD29), a VLA-a1 lánc (CD49a) és az ICAM-1 (CD54) vizsgálatánál. A T-sejt markerek (18. ábra) - a CD3/TCR

komplex

(CD3),

a

CD72

ligand

(CD5),

az

MHC

II-függő

antigénfelismerésben résztvevő CD4, az MHC I-függő antigénfelismerésben résztvevő CD8 és a B7/BB1 receptor (CD28) - hasonlóképpen indukálhatók voltak, ugyanakkor a B-sejt markerek (19. ábra) - CD19, CD20 és CD22 - expressziója az aktiváció teljes időtartama alatt a kezdeti értékhez képest változatlan maradt. Az ábrákon az egyik donor izolált sejtjeivel történt vizsgálatok eredménye látható. Kísérleteink során 8 egészséges donortól és 5 cALL után remisszióban levő betegtől vett sejtek aktiválhatóságát is vizsgáltuk és a két csoport sejtjeinek proliferációs szintje között nem találtunk szignifikáns eltérést. 7.5.

CD3xCD19 bispecifikus antitest által mediált in vitro lízis allogén és autológ

rendszerben A CD3xCD19 bispecifikus antitest által aktivált T sejtek citotoxikus kapacitását először allogén rendszerben vizsgáltuk B-sejtes leukémia sejtvonalakat (20. ábra) és cALL-es betegek blasztjait felhasználva (21. ábra). Egészséges donorok perifériás véréből származó mononukleáris sejteket aktiváltunk 100 ng/ml CD3xCD19 bispecifikus antitest jelenlétében. 3 napig tartó inkubálás után az effektor sejteket mostuk, majd egy éjszakán át médiumban tároltuk, hogy eltávolítsuk a maradék bispecifikus antitesteket. A 3. napon egy, a kultúrából kivett mintában 3H-timidin inkorporációs teszttel ellenőriztük az effektor sejtek aktivációját. A kultúrában levő leukémia sejtvonalak sejtjeit leszüreteltük. A folyékony nitrogénben tárolt célsejteket (cALL-es betegek leukémiasejtjei) felolvasztottuk, majd viabilitásuk ellenőrzése után 51

Cr-izotóppal jelöltük. A citotoxicitási esszé során azonos mennyiségű célsejthez

57

csökkenő mennyiségű effektor sejtet adtunk, hogy megtudjuk melyik az a legkisebb effektor:target sejtarány, amely még hatásosan elpusztítja a tumorsejteket. A citotoxikus esszéhez a sejtkeveréket 3,5 órán át 50 ml CD3xCD19 antitesttel (1 mg/ml) inkubáltuk. Kontrollként az effektor-célsejt keveréket azonos koncentrációjú szülői (CD3 és CD19) antitestkeverékkel („background killing”) vagy médiumban inkubáltuk.

% specifikus 51Cr-release

70

médium

60

CD3xCD19 CD3+CD19

50 40 30 20 10 0 25:1

12,5:1

6,25:1

3,1:1

1,6:1

effektor:target sejt arány

20. ábra

JOK-1 sejtek specifikus lízise CD3xCD19 bispecifikus antitestek jelenlétében

% specifikus 51Cr-release

25

médium CD3xCD19

20

CD3+CD19

15 10 5 0 50:1

25:1

12,5:1

6,25:1

3,1:1

1,6:1

0,8:1

effektor:target sejt arány

21. ábra

Egy cALL-es beteg (P.S.) limfoblasztjainak specifikus lízise CD3xCD19 bispecifikus antitest jelenlétében allogén rendszerben

58

Miután bebizonyosodott, hogy a CD3xCD19 bispecifikus antitest jelenlétében előaktivált effektor sejtek képesek elpusztítani a tumorsejteket, autológ körülmények között - cALL-es betegek autológ tumorsejtjei ellen - is kipróbáltuk őket (22. ábra).

% specifikus 51Cr-release

25

médium CD3xCD19 CD3+CD19

20 15 10 5 0 50:1

25:1

12,5:1

6,25:1

3,1:1

1,6:1

0,8:1

effektor-target sejt arány

22. ábra

Egy cALL-es beteg (P.S.) limfoblasztjainak specifikus lízise CD3xCD19 bispecifikus antitest jelenlétében autológ rendszerben. (Ugyanezen beteg limfoblasztjainak allogén körülmények közötti lízisét a 21. ábrán mutattuk be.)

Az előaktiváláshoz a remisszióban levő betegektől vett PBMC-frakciót 100 ng/ml CD3xCD19 bispecifikus antitesttel inkubáltuk 3 napig CD28 monoklonális antitest hozzáadása nélkül. A sejtek aktivációját a fent leírtak szerint ellenőriztük. A folyékony nitrogénben tárolt célsejteket (az effektor sejtet adó beteg cALL sejtjei) felolvasztottuk, majd viabilitásuk ellenőrzése után

51

Cr-mal jelöltük. Az

51

Cr-release

esszé kivitelezése a fentiek szerint történt. A 23. ábrán egy másik, autológ rendszerben végzett citotoxicitási esszé eredményét mutatjuk be. Ennél a betegnél 50:1 effektor:target aránynál a specifikus citotoxicitás elérte a 40 %-ot, de még 0,8:1 E:T aránynál is mérhető volt a citotoxikus aktivitás. A kontroll mintákban (CD3 és CD19 keveréke, ill. médium) a lízis értéke 6 % alatt maradt.

59

% specifikus 51Cr-release

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

médium CD3xCD19 CD3+CD19

50:1

25:1 12,5: 6,25: 3,1:1 1,6:1 0,8:1 1 1 effektor:target sejt arány

23. ábra

Egy cALL-es beteg (A.S.) limfoblasztjainak specifikus lízise CD3xCD19 bispecifikus antitest jelenlétében autológ rendszerben

A fenti vizsgálatot kilenc cALL-es beteg limfoblasztjaival végeztük el autológ rendszerben. Ennek eredményei a 7. táblázatban láthatók.

Beteg

1 2 3 4 5 6 7 8 9 7. táblázat

specifikus lízis (%) CD3+CD19 (1 mg/ml)

CD3xCD19 (1 mg/ml)

6a 17 5 11 4 15 7 3 4

40 56 26 18 20 47 30 15 18

Leukémiás blasztok lízise bispecifikus antitestek jelenlétében autológ körülmények között (aAdataink triplikátumok átlagai 50:1 effektor:target aránynál.)

60

8. MEGBESZÉLÉS 8.1.

Az apoptotikus index, mint korai prognosztikai faktor prednizolon-kezelés alatt gyermekkori ALL-ben Az apoptózis olyan szabályozott folyamat, melynek során az egyes sejtek

környezetüktől elkülönülve pusztulnak el (187). Megfigyelhető egészséges szövetekben, pl. a fejlődés során (183, 184). De patológiás folyamatokban, így a karcinogenezisben is fontos szerepet játszik. Az apoptózis során lezajló morfológiai és biokémiai változásokat különböző módszerekkel lehet detektálni (186). Az apoptózis korai jelei közé tartozó morfológiai változásokat - kondenzáció, fragmentáció, majd a sejtek fagocitózisa - a perifériás vérből készült, Giemsa-festett kenetekben vizsgáltuk. A biokémiai változások hátterében álló nukleáris endonukleáz aktiváció következtében keletkező kb. 200 bázispár nagyságú DNS-darabokat gélelektroforézissel, ill. flow citometriai vizsgálattal lehet kimutatni. Mi az utóbbi módszert választottuk. Különböző fiziológiás és farmakológiai ingerek indukálhatnak apoptózist (185,188,189). Ezek egyike a glukokortikoid-kezelés (190), amelyet gyermekkori akut limfoid leukémiában kiterjedten alkalmazunk. Mintegy 50 évvel ezelőtt ismerték fel a glukokortikoidok limfocitolitikus hatását, majd röviddel ezután kezdték a limfómás és limfoid leukémiás betegeket széles körben glukokortikoidokkal kezelni. Ma már tudjuk, hogy a differenciálódás bizonyos stádiumaiban levő, a limfoid sejtvonalhoz tartozó sejtekben a glukokortikoidok apoptózist indukálnak. Sajnos sem a glukokortikoid indukálta apoptózisnak, sem pedig a számos betegnél kialakuló glukokortikoid rezisztenciának nem ismerjük a pontos molekuláris hátterét. Az első lépés a programozott sejthalál kiváltásában mindenképpen a glukokortikoid hormon kapcsolódása receptorához (59) (24. ábra). A glukokortikoidreceptorokat először a timocitákban sikerült kimutatni, de azóta kiderült, hogy mind a normál, mind a malignus limfocitákban megtalálható. A glukokortikoid indukálta sejtpusztulás kiváltásához feltétlenül szükséges a normális receptorfunkció (60,61). Ez azt jelenti, hogy a receptor hiánya, sérülése vagy funkciókárosodása megakadályozza a glukokortikoid indukálta apoptózis létrejöttét. A glukokortikoid-receptor két fő feladata

59

a gén transzkripció és a gén represszió. Hogy az apoptózis folyamatának kiváltásában a transzkripció vagy a represszió játszik nagyobb szerepet, a receptor különböző régióinak molekuláris szintű vizsgálatával lehet megválaszolni.

24. ábra

A glukokortikoid indukálta apoptózis kiváltásában szerepet játszó molekulák

A glukokortikoidok sejtekre kifejtett hatásának két fő szakasza van: a citosztatikus fázis, majd ezt követően a citolitikus fázis. Az első szakaszban drámai biokémiai és élettani változások mennek végbe. A glukokortikoid kezelés gátolja a sejtek glukóz-, aminósav- és nukleozid-felvételét és a makromolekulák (DNS, RNS, fehérje) szintézisét. Ezenkívül csökken a limfociták ATP termelése, zsírsav oxidációja, lipid-, foszfolipid- és poliaminszintézise. Ezen anyagcsere-változásoknak a jelentősége ma még nem ismert. Elképzelhető, hogy a glukokortikoidok nem direkt indukálnak

60

apoptózist, hanem azok a sejtek apoptotizálnak, amelyek nem tudnak alkalmazkodni az előbb leírt anyagcsere-változásokhoz. A szövetek homeosztázisa mindig a sejtek szaporodása, differenciálódása és pusztulása közötti egyensúly függvénye. A szomatikus sejtek proliferációját pozitív és negatív szignálok hálózata szabályozza. Az apoptózis olyan magas szinten szabályozott folyamat, amely során a szervezet a számára felesleges sejteket eliminálja anélkül, hogy gyulladásos reakció alakulna ki. Az apoptózist és a proliferációt egyaránt a sejtciklust szabályozó molekulák irányítják. Az apoptózist kiváltó ingerek egyidejűleg hatnak a sejtproliferációra és a sejthalálra. A glukokortikoidok a sejtciklus G1 fázisában okoznak blokkot és apoptózist indukálnak a transzformált limfoid sejtekben. Bizonyos sejtciklus szabályozók - c-myc, cyclin D3 - csökkent expressziója alapvető fontosságú az apoptózis indukálásában. De más G1-regulátorok szerepéről is vannak adatok; pl. p53, pRb, E2F. Mivel a különböző prognosztikai csoportba tartozó betegek eltérő intenzitású kezelést igényelnek, már a terápia kezdetén nagyon fontos megállapítani a betegség várható prognózisát. A BFM-csoport által kidolgozott és Európában általánosan használt prognosztikai faktorok egyike a prednizolon-válasz. Ezt a klinikai szteroid-érzékenység meghatározásával állapítjuk meg a betegeknél a kezelés első szakaszában. A klinikai szteroid-válasz értékeléséhez felhasznált két legfontosabb adat a perifériás vérben mért abszolút blasztszám a kezelés 8. napján (addig a leukémiás gyerekek csak prednizolont kapnak), ill. a csontvelő vizsgálata a kezelés 33. napján. Jó prednizolon-válaszról akkor beszélhetünk, ha a 8. napon az abszolút blasztszám < 1 G/l, ill. ha a 33. napon végzett csontvelőpunkció során nyert mintában morfológiai, kórszövettani, immunológiai és genetikai vizsgálatokkal is igazolni tudjuk a remissziós állapotot. Az ALL-BFM 90, 95 protokollok alapján komplett remissziónak tekinthető, ha az alábbi feltételek teljesülnek: 1) a csontvelőben < 5% a blasztok száma, ill. a cellularitás normális vagy enyhén csökkent 2) nincsenek lokális leukémiás infiltrátumok 3) a 29. napon végzett lumbálpunkció során nyert liquorban nem lehet leukémiasejteket kimutatni.

61

Vizsgálataink során a klinikai szteroid-választ hasonlítottuk össze a morfológiai és flow citometriás vizsgálattal meghatározott apoptotikus index változásaival. Azt találtuk, hogy az apoptotikus sejtek számának emelkedése rendkívül korán, már a kezelés első óráiban bekövetkezik. Emiatt méréseinket a terápia megkezdésekor (0 óra), ill. 6 órával a szteroid-kezelés kezdete után végeztük el. Vizsgálataink során pozitív korrelációt találtunk a klinikai válasz és az apoptózis-vizsgálatok között mind morfológiai, mind flow citometriás módszerrel. Mindkét apoptózis-vizsgálat együttes pozitivitása esetén, 96 %-os valószínűséggel lesz pozitív a klinikai válasz. Eredményeink jelentősége a következőkben foglalható össze: 1.

Korán, 6 órával a prednizolon-terápia megkezdése után következtetni tudunk a szteroid-válaszra, amely adott esetben az intenzívebb kemoterápiás kezelés korábbi időpontban történő bevezetését teszi lehetővé.

2.

Bifenotípusos ALL-es betegek esetében nem mindig könnyű a terápia kiválasztása. Mivel a sejtek felszínén mind a limfoid, mind a mieloid markerek expresszálódnak, limfoid vagy mieloid csoportba való besorolásuk nehéz feladat. Amennyiben a kezdeti szteroid-terápia hatására nem jön létre megfelelő

emelkedés

az

apoptózis-indexben,

mieloid

leukémiának

megfelelő protokoll szerint kezelhetnénk tovább ezeket a betegeket. 3.

Az ALL-es betegek hosszútávú követése során észlelt klinikai válasz nem korrelált teljesen sem a korai klinikai prednizolon-válasszal, sem az apoptózis-vizsgálatok eredményével. Ennek az oka feltehetően abban kereshető, hogy a további klinikai eredmények már sok egyéb külső tényezőtől is függnek. Más a leukémiás sejtek érzékenysége a különböző citosztatikumokkal szemben és a betegek különbözőképpen tolerálják a kemo- ill. sugárterápiás kezelést. Betegenként változó a citopéniás időszakok

hossza,

néhány

esetben

pedig

allergiás

vagy

toxikus

mellékhatások miatt kellett eltérnünk a protokollban előírt kezelési sémától. 4.

ALL recidívás betegeink közül mindössze egynél mutatott mindkét vizsgálattal szignifikáns emelkedést az apoptózis-index. Eredményeink megfelelnek annak a klinikai tapasztalatnak, hogy ALL recidíva esetén

62

intenzívebb kemoterápiás kezelésre van szükség a remisszió eléréséhez. Ugyanakkor a pontosabb következtetések levonásához magasabb esetszám szükséges. 5.

Az ALL-recidívás betegek hosszútávú követése rendkívül rossz eredményt mutatott, mivel valamennyi, vizsgálatunkban részt vett beteget elveszítettük vagy az első, vagy a további leukémia-recidívák során. Sajnos az egyetlen pozitív apoptózis-választ mutató betegünk is - annak ellenére, hogy az első recidíva során sikerült komplett hematológiai remissziót elérnünk nála meghalt a második recidíva után.

Vizsgálatunk eredményei alapján az ALL-es betegek esetében az apoptózis-index változása a prednizolon-kezelés első 6 órájában jól tükrözi a korai klinikai szteroidválaszt, ezáltal a klinikai gyakorlatban korai markerként alkalmazható. 8.2.

A CD3xCD19 bispecifikus antitest által mediált lízis allogén és autológ in vitro rendszerekben Mintegy két évtizeddel az után, hogy Köhler és Milstein kifejlesztette a

hibridóma-technikát (7), a klinikai onkológiai terápiás gyakorlatban megjelentek az első monoklonális antitestek. Az

antitestek vagy direkt tumorsejtellenes hatással

rendelkeztek vagy indirekt módon a humorális vagy celluláris immunmechanizmusok stimulálásával fejtették ki hatásukat. A monoklonális antitestekkel végzett kezelés a daganatos betegek egy részénél új, klinikailag jól tolerálható terápiás lehetőséget jelentett és jelent ma is (200-209). Az eddigi eredmények alapján úgy tűnik, hogy a monoklonális antitestekkel végzett immunterápia nem nagykiterjedésű tumorok, hanem inkább kisméretű reziduális tumor (MRD) esetében hatásos. A hagyományos terápiát (sebészi kezelés, kemoterápia, besugárzás és csontvelő-transzplantáció) kiváltani valószínűleg nem képes, de adjuváns kezelésként, ill. csontvelő-transzplantáció előtt az autológ csontvelő megtisztítására alkalmas lehet. A bispecifikus antitestek szerkezetüknél fogva – egyik kötőhelyükkel a tumorsejt célantigénjét kötik meg, a másik kötőhellyel valamilyen, a tumorsejtek líziséhez vezető folyamatot indítanak be – lehetőséget nyújtanak az antitestek terápiás hatékonyságának fokozására. Így a második karhoz lehet toxinokat, citosztatikumokat, enzimeket vagy

63

radioaktív molekulákat lehet kötni (203,208). A legtöbb esetben a második kötőhely mégis valamilyen immuneffektor-sejt citotoxikus trigger-molekuláját képes megkötni. Az alkalmazott célantigéntől függően különböző effektor sejtek vehetnek részt a tumorsejtek lízisében; CD3 esetén citotoxikus T sejtek, CD16 esetén NK sejtek, CD64 (monociták) és CD89 (granulociták) kiválasztásakor mieloid sejtek (205). A bispecifikus antitestek előállítása több különböző módon történhet. Készülhetnek kémiai úton (15,16) két különböző antitest összekapcsolásával, ill. két hibridóma fúziójával (hibrid-hibridóma technikával) (13). Ezek a módszerek rendkívül idő- és költségigényesek, ugyanakkor kismennyiségű bispecifikus antitestet képesek produkálni. A rekombináns géntechnológia alkalmazásával nagyobb mennyiségben lehet antitesteket előállítani és az így létrehozott „single-chain”-bispecifikus antitesteknek vagy az ún. „diabody”-knak még immunológiai előnye is van a klinikai alkalmazás során (109-111, 179-181). A gyermekkori common akut limfoid leukémiában alkalmazható bispecifikus monoklonális antitestekkel végzett vizsgálataink során azokat a tényezőket vizsgáltuk, amelyek allogén és autológ rendszerben elengedhetetlenül szükségesek a nyugvó T sejtek aktiválásához és fókuszálásához. Mi írtunk le az irodalomban először olyan CD3xCD19 (OKT3xHD37) hibrid-hibridóma által termelt bispecifikus antitestet, amely kostimuláció nélkül képes aktiválni a nyugvó T sejteket. Ugyanez a bispecifikus antitest az előaktivált T sejteket az autológ leukémiás sejtekhez kapcsolva a blasztok lízisét idézi elő.

64

BISPECIFIKUS ANTITEST

CITOTOXIKUS T SEJT

25. ábra

Citotoxikus T sejtek fókuszálása malignus B sejtekhez CD3xCD19 bispecifikus antitest segítségével

Munkánk első fázisában cALL-es gyermekek limfoblasztjainak sejtfelszíni antigén expresszióját vizsgáltuk. Olyan célantigént kerestünk további vizsgálataink számára, amelyet a beteg valamennyi tumorsejtje expresszál, ugyanakkor a szervezet más, egészséges sejtjeinek felszínén nem jelenik meg. Flow citometriás méréseink eredményei alapján elmondhatjuk, hogy a leukémiasejtek felszínén erős és állandó volt a CD19 expresszió, míg a CD20 antigén expressziója csak néhány esetben mutatott pozitivitást. Emiatt a továbbiakban a CD19 molekulát használtuk célantigénként. A CD3xCD19 quadróma az OKT3 (CD3) és a HD37 (CD19) hibridóma fúziójával jött létre. A tisztított bispecifikus antitest immunreaktivitását izotípus specifikus másodlagos antitest használatával, flow citometriás vizsgálattal igazoltuk. A bispecifikus antitest viszonylag kis mennyisége (1 ng/ml) elegendő volt egészséges donorok vagy remisszióban levő cALL-es betegek véréből izolált mononukleáris sejtek proliferációjának indukálásához. Bivalens CD28 monoklonális antitest hozzáadása fokozta ugyan a sejtek aktivációs szintjét, de jelenléte nem volt feltétlenül szükséges a T sejtek aktiválásához kísérleti körülményeink mellett. Az aktiváció 3 nap után érte el maximumát, amit 3H-thymidine inkorporációs teszttel és a limfociták sejtfelszíni aktivációs markereinek flow citometriás vizsgálatával egyaránt igazoltunk. A remisszióban levő cALL-es betegektől vett mononukleáris sejtek aktivációs szintje a 65

bispecifikus antitestek hozzáadása után az egészséges donoroktól nyert sejtekéhez nagyon hasonló volt. A cALL-es betegek előaktivált T sejtjeinek citotoxikus kapacitását standard 51

Cr-release esszében vizsgáltuk saját leukémiás blasztjaik ellen. A citotoxicitás mértéke

56%-tól 15%-ig változott, míg a háttér lízis értéke (a két szülői antitest jelenlétében) csupán 17%-3% volt. Az allogén rendszerben elért citotoxicitás mértéke hasonló volt az autológ rendszerben mért értékhez. Számos kutatócsoport felvetette a bispecifikus antitestek hasznosíthatóságát humán B sejtes limfóma/leukémia kezelésében (118,125, 169-173). Ezek a tanulmányok különböző módszereket alkalmaztak a hatásosabb effektorsejt aktiváció eléréséhez. Anderson és munkatársai (125) két antitest-molekula kémiai összekötésével létrehozott bispecifikus antitest heterokonjugátumot alkalmaztak t(4;11) ALL-es sejtek líziséhez. Bohlen és munkatársai (169-170) ezzel szemben a hibrid-hibridóma technikával előállított CD3xCD19 bispecifikus antitestet CD28xCD22 bispecifikus antitesttel vagy bivalens CD28 antitesttel együtt alkalmaztak. A specifikus citotoxicitást follikuláris Bsejtes limfóma és CLL esetében autológ körülmények között is mérték. Haagen és munkatársai (118) in vitro PHA és interleukin-2 (IL-2) vagy CD3 monoklonális antitest és IL-2 jelenlétében aktiválták ALL-es vagy B sejtes non-Hodgkin limfómás betegek mononukleáris sejtjeit remisszióban vagy recidíva során. Az autológ malignus sejtek ellen kifejtett citotoxikus hatást CD3xCD19 bispecifikus antitest jelenlétében vizsgálták. Ugyanez a kutatócsoport egy másik vizsgálatban egészséges donoroktól vagy remisszióban levő betegektől izolált T sejteket aktivált CD3xCD19 bispecifikus antitesttel autológ monociták jelenlétében (22). ALL-es blasztok esetében nemcsak a CD19, hanem a CD10 molekulát is használták targetként. A CD10+ leukémiasejtek lízisét írták le kémiailag konjugált CD3xCD10 F(ab’)2 heteroantitesttel IL-2 által aktivált PBMC vagy CTL klónok jelenlétében (171). Hattori és munkatársai (172) olyan F(ab’)2 CD3xCD10 heterobifunkcionális antitestet írtak le, amely allogén csontvelőátültetésen átesett leukémiás betegekből származó CD4+ és CD8+ aktivált T sejtek citotoxicitását mediálta. Általánosan elfogadott tény, hogy a T sejtek aktiválásához a TCR/CD3 komplex kötésén kívül kostimulációs jelre is szükség van (174-176). Ha a második szignál 66

hiányzik, a T-sejt receptor aktiválása a T-sejtek anergiájához vezet (177). Kostimulációt biztosíthatnak pl. az antigénprezentáló sejtek. Számos, az antigénprezentáló sejtek felszínén jelenlevő molekuláról igazolódott már a T-sejt aktivációban betöltött kostimulációs szerepe. A legfőbb kostimulációs útnak az antigénprezentáló sejteken levő B7-1 (CD80) és B7-2 (CD86) interakciója tűnik a T sejtek CD28/CTLA4 antigénjével (178). Egy másik kostimulációs lehetőség a - pl. monociták által termelt citokinek jelenléte. Bohlen és munkatársai (169-170) tapasztalataival ellentétben az általunk előállított CD3xCD19 bispecifikus antitest in vitro körülmények között önmagában

is

elegendő

volt

nyugvó

mononukleáris

sejtek

aktiválásához.

Feltételezhetően a bispecifikus antitest intakt Fc része nagy affinitású IgG receptort hordozó sejtekhez (monociták, makrofágok) kötődik, és ezáltal citokinek termelését váltja ki. Erre utal a CD3 antitest T-sejt aktiváló hatásának mechanizmusát vizsgáló kísérletünk is, amely igazolta, hogy a kostimuláció nélküli aktiváció elengedhetetlen feltétele az Fc fragmentum jelenléte az antitest molekulában. Összefoglalva, a CD3xCD19 bispecifikus antitest alkalmazásával végzett preklinikai vizsgálat gyermekkori cALL esetében eredményesnek bizonyult. A bispecifikus antitest jelenlétében nyugvó T limfocitákat sikerült kostimuláció nélkül aktiválni. Az ily módon előaktivált T limfociták a CD3xCD19 bispecifikus antitest jelenlétében lizálták az autológ cALL-es blasztokat, de ez nem következett be a szülői antitestek (CD3 és CD19) jelenlétében. In vitro kísérleteink alapján elmondható, hogy a CD3xCD19 bispecifikus antitest alkalmazásával végzett adjuváns immunterápia hatásos lehet recidiváló és/vagy terápiarezisztens ALL esetében. Eredményeink alapján az I-II fázisú klinikai kipróbálás kezdeményezése megalapozottnak tűnik. Ezt segíti elő az is, hogy felnőttkori B-sejtes malignus betegségekben ezek a vizsgálatok már folyamatban vannak a CD3xCD19 bispecifikus antitesttel. Az eddigi eredmények alapján ez az antitest már néhány mg-os mennyiségben is hatásosnak tűnik (néhány esetben komplett remissziót sikerült elérni), ugyanakkor a mellékhatások elhanyagolhatóak voltak. További előnyt jelent, hogy munkacsoportunknak (179) sikerült a rekombináns géntechnológia alkalmazásával nagyobb mennyiségben előállítani CD3xCD19 „diabody”-kat, amelyek az irodalmi

67

adatok alapján (179-181) a hagyományos bispecifikus antitestekkel szemben biológiai és immunológiai előnyökkel bírnak.

68

9. KÖVETKEZTETÉSEK 1.

Gyermekkori akut limfoid leukémia prednizolon kezelése alatt a perifériás vérben mind morfológiai, mind flow citometriás vizsgálattal jól követhető az apoptózis-index változása.

2.

A vizsgálat optimális időpontja a prednizolon terápia megkezdése után 6 órával van.

3.

A két vizsgálat eredménye jól korrelál egymással és a klinikai szteroidválasszal.

4.

A hosszútávú túlélés kevésbé korrelál a kezdeti apoptózis-vizsgálatok eredményével, mint a korai klinikai szteroid-válasz. Ennek oka számos külső és belső tényező hatásában keresendő.

5.

ALL recidívás betegeink többségénél nem találtunk szignifikáns emelkedést az apoptózis-index értékében egyik vizsgálattal sem, ez megfelel a rosszabb klinikai szteroid-válasznak. Következetésünk értékét az alacsony esetszám korlátozza.

6.

A hibrid-hibridóma technikával előállított és megfelelően tisztított CD3xCD19 és CD3xCD20 bispecifikus antitestek immunreaktivitása a szülői antitestekkel megegyezik.

7.

cALL-es gyermekek limfoblasztjainak felszínén a CD19 expresszió állandó és erős, míg a CD20 antigén csak néhány esetben mutat pozitivitást. Emiatt a CD19 az ideális célantigén a bispecifikus antitest-terápia számára.

8.

A CD3xCD19 bispecifikus antitest viszonylag kis mennyisége (1 ng/ml) elegendő egészséges donorok vagy remisszióban levő cALL-es betegek

69

véréből izolált mononukleáris sejtek proliferációjának indukálásához. Az aktiváció 3 nap után éri el maximumát. 9.

Bivalens CD28 monoklonális antitest - mint kostimulációs faktor - hozzáadása fokozza ugyan a sejtek aktivációs szintjét, de jelenléte nem feltétlenül szükséges a T sejtek aktiválásához kísérleti körülmények között.

10.

A CD3xCD19 bispecifikus antitest jelenlétében előaktivált effektor sejtek képesek elpusztítani a tumorsejteket mind allogén, mind autológ körülmények között. A leukémiás blasztok autológ lízise bispecifikus antitestek jelenlétében nagyon ingadozó. Kísérletünkben a specifikus lízis 56%-tól 15%-ig változott 50:1 effektor:target aránynál. A citotoxikus aktivitás még 0,8:1 E:T aránynál is mérhető volt.

70

10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Mindenekelőtt végtelen hálával és köszönettel tartozom témavezetőimnek, dr. Szende Béla és dr. Schuler Dezső professzor uraknak, akik befogadtak munkacsoportjukba és mindvégig időt és fáradságot nem kímélve segítették szakmai tanácsaikkal kutatómunkámat. Rendkívüli hálával tartozom Klaus-Michael Debatin professzor úrnak és Gerd Moldenhauer laboratóriumvezetőnek, hogy a Heidelbergi Egyetem Gyermekklinikája és a Német Rákkutató Központ (DKFZ) együttműködése során lehetőséget biztosítottak számomra a magas színvonalú kutatómunkára. Külön köszönetet szeretnék mondani dr. Fekete György egyetemi tanár úrnak, a Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika intézetvezető professzorának, hogy lehetővé tette kutatásaimat, külföldi tanulmányútjaimat és hasznos tanácsaival végig segítette munkámat. Ezúton szeretném megköszönni dr. Lapis Károly akadémikus úrnak, hogy orvostanhallgatóként meghívott a Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetének metasztázis munkacsoportjába és kutatómunkámat végig támogatta. Külön köszönettel tartozom dr. Rásó Erzsébetnek, aki tudományos diákkörösként témavezetőm volt, s aki a tudományos munka iránti határtalan lelkesedésével egy életre megszerettette velem a laboratóriumi kutatómunkát. Köszönettel tartozom a technikai segítségért dr. Bocsi Józsefnek, aki az apoptózisvizsgálatok során a flow citometriai méréseket végezte és Elvira Hallauernak, aki Német Rákkutató Központban asszisztensi segítséget nyújtott kutatómunkám során. Szeretném megköszönni a II. sz. Gyermekklinikán dolgozó valamennyi kollégámnak, hogy hazai és külföldi kutatómunkám és tanulmányútjaim során a klinikai munkában helyettesítettek, s a disszertáció megírása során végig lelkesen támogattak. Végül, de nem utolsó sorban óriási köszönettel tartozom családomnak, akik mindvégig mellettem álltak, lelkesen bíztattak. Végtelen hálával tartozom szüleimnek, akik az egyetemi évek alatt a kutatómunkára bíztattak, s akik időt, fáradságot nem kímélve biztosították számomra a kutatómunkához és a dolgozat megírásához a nyugodt

71

körülményeket. Rendkívül hálás vagyok, hogy sohasem engedték, hogy feladjam az általam kitűzött célt. Külön köszönettel tartozom férjemnek a türelemért és a rengeteg technikai segítségért. Végül köszönöm gyermekeimnek, Ritának és Csabának, hogy türelmesek és megértők voltak, amikor a közös játékidőből „lecsípve” „fontos dolgokat” írtam a számítógépnél. Határtalan szeretetük óriási erőforrást biztosított munkám során.

A kutatásokat az OTKA F20518, T 6335, 17849, 17722, DAAD, Tumorzentrum Heidelberg/Mannheim támogatta.

72

11. AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ SAJÁT KÖZLEMÉNYEK

11.1. Cikkek I. Schuler D., Szende B., Borsi J.D., Marton T., Bocsi J., Magyarossy E., Koós R., Csóka M.: Apoptosis as a possible way of destruction of lymphoblasts after glucocorticoid treatment of children with acute lymphoblastic leukemia. Pediatric Hematology and Oncology, 11:641-649,1994. II. Csóka M., Strauss G., Debatin K.-M., Moldenhauer G.: Activation of T cell cytotoxicity against autologous common acute lymphoblastic leukemia (cALL) blasts by CD3xCD19 bispecific antibody. Leukemia, 10(11):1765-1772,1996. III.Csóka M., Bocsi J., Falus A., Szalai Cs., Klujber V., Szende B. and Schuler D.: Glucocorticoid induced apoptosis and treatment sensitivity in acute lymphoblastic leukemia of children. Pediatric Hematology and Oncology, 14:433-442,1997. IV.Csóka M., Bocsi J., Koós R., Szende B., Schuler D.: Glukokortikoid indukálta apoptózis vizsgálata gyermekkori akut limfoid leukémiában. Gyermekgyógyászat, 1998/4:337-342,1998. V. Csóka M.: Monoklonális antitestek alkalmazása limfoid leukémia és malignus limfóma terápiájában. Magyar Onkológia 43:149-152,1999.

73

11.2. Idézhető absztraktok I.

M. Csoka, G. Moldenhauer, K-M. Debatin: Preclinical Evaluation of an Adjuvant Immunotherapy of Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia Using CD3xCD19 and CD3xCD20 Bispecific Monoclonal Antibodies. Absztrakt. Medical and Pediatric Oncology 25:225-230,1995.

II.

Csóka M., Moldenhauer G., Debatin K-M.: CD3xCD19 és CD3xCD20 bispecifikus monoklonális antitestek alkalmazásának preklinikai kipróbálása gyermekkori acut lymphoid leukemiák adjuváns immuntherápiájához. Absztrakt. Magyar Belorvosi Archivum 48 (suppl 1):1-63,1995.

III. M. Csóka, J. Bocsi, E. Magyarossy, T. Marton, J. Borsi, R. Koós, B. Szende, D. Schuler: Apoptosis of Lymphoblasts Induced by Glucocorticoid Treatment of Children with Acute Lymphoblastic Leukemia. Absztrakt. Pädiatrie und Pädologie (Paediatrica-Paedologica) 30:41-47, 1995. IV. M. Csoka, G. Moldenhauer, K-M. Debatin: Preclinical Evaluation of an Adjuvant Immuno-Therapy of Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia Using CD3xCD19 and CD3xCD20 Bispecific Monoclonal Antibodies. Absztrakt. Onkologie 18 (suppl 2):I-XXVI+1-204,1995. V.

Csóka M., Bocsi J., Marosi A., Marton T., Borsi J., Szende B., Schuler D.: Glucocorticoid indukálta apoptosis gyermekkori acut lymphoid leukemiában. Absztrakt. Magyar Onkológia (suppl):1-201,1995.

VI. C.F. Classen, M. Csóka, G. Moldenhauer, K.-M. Debatin: Role of apoptosis pathways in CD3xCD19 bispecific antibody-induced T cell cytotoxicity against ALL cells. Absztrakt. Blood 88 (10): 213,1996. VII. Csóka M., Bocsi J., Szende B., Schuler D.: Apoptosis gyermekkori acut lymphoid leukemiában. Absztrakt. Magyar Onkológia 41(4),1997. VIII. Garami M., Bocsi J., Kovács G., Csóka M., Schuler D., Szende B.: Apoptotic ratio as an early prognostic factor in acute lymphoblastic leukemia in children. Abstract. Medical Pediatric Oncology 33, 44, 1999.

74

11.3. Előadások és poszterek I.

M. Csóka, E. Rásó, K. Lapis: The role of the host in the experimental metastatic capacity of human tumors. Poszter. 6th International Medical Sciences Student Congress, Törökország, Isztanbul, 1990. május 16-18.

II.

Rásó E. Müzes Gy., Csóka M., Szende B., Gergely P., Lapis K.: A TNF-alfa és IL1 szerepének vizsgálata humán xenograft tumorok apoptotikus indexének növekedésében. Előadás. Magyar Onkológusok Társasága, XX. Nemzeti Kongresszusa, Budapest, 1993. november 03-05.

III. M. Csóka, G. Moldenhauer, K-M. Debatin: Preclinical Evaluation of an Adjuvant Immunotherapy of Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia Using CD3xCD19 and CD3xCD20 Bispecific Monoclonal Antibodies. Előadás. Workshop "Ans(tze zur molekularen Biotherapie in der P(diatrischen Onkologie" (First Workshop on Molecular Biotherapy and Pediatric Oncology), Németország, Düsseldorf, 1995. február IV. Csóka M., Moldenhauer G., Debatin K-M.: CD3xCD19 és CD3xCD20 bispecifikus monoklonális antitestek alkalmazásának preklinikai kipróbálása gyermekkori akut lymphoid leukemiák adjuváns immuntherápiájához. Előadás. XV. Magyar Hematológiai Kongresszus, Budapest, 1995. május 21-24. V.

M. Csóka, J. Bocsi, E. Magyarossy, T. Marton, J. Borsi, R. Koós, B. Szende, D. Schuler: Apoptosis of Lymphoblasts Induced by Glucocorticoid Treatment of Children with Acute Lymphoblastic Leukemia. Előadás. Pädiatrische Forschung mitteleuropäischer Länder, 4. Tagung (Central European Pediatric Research Meeting), Ausztria, Bécs, 1995. június 9.

VI. M. Csóka, G. Moldenhauer, K-M. Debatin: Preclinical Evaluation of an Adjuvant Immuno-Therapy of Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia Using CD3xCD19 and CD3xCD20 Bispecific Monoclonal Antibodies. Előadás. XIIIth Meeting of the International Society of Haematology, Törökország, Isztanbul, 1995. szeptember 38. VII. M. Csóka, G. Moldenhauer, K-M. Debatin: Preclinical Evaluation of an Adjuvant Immuno-Therapy of Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia Using CD3xCD19 and CD3xCD20 Bispecific Monoclonal Antibodies. Poszter. Gemeinsame Jahrestagung der Deutschen und der Österreichischen Gesellschaft für Hämatologie und Onkologie, Németország, Hamburg, 1995. október 8-11. VIII. Csóka M., Bocsi J., Marosi A., Marton T., Borsi J., Szende B., Schuler D.: Glucocorticoid indukálta apoptosis gyermekkori acut lymphoid leukemiában. Előadás. Magyar Onkológusok Társasága XXI. Nemzeti Kongresszusa, Pécs, 1995. november 9-11. IX. F. Classen, M. Csóka, G. Moldenhauer, K.-M. Debatin: Role of apoptosis pathways in CD3xCD19 bispecific antibody-induced T cell cytotoxicity against ALL cells. Poszter. 38th Annual Meeting of the American Society of Hematology, Egyesült Államok, Orlando, 1996. december 6-10.

75

X.

M. Csóka, J. Bocsi, B. Szende, D. Schuler: Apoptosis and prognosis in acute lymphoblastic leukemia of children. Poszter. VI. Semmelweis Tudományos Fórum, Budapest, 1997. november 6-7.

XI. Csóka M., Bocsi J., Szende B., Schuler D.: Apoptosis gyermekkori acut lymphoid leukemiában. Poszter. Magyar Onkológusok Társasága XXII. Nemzeti Kongresszusa, Budapest, 1997. november 10-12. XII. Csóka M.: Bispecifikus antitestek szerepe a gyermekkori ALL terápiájában. Előadás A Magyar Gyermekorvosok Társasága Közép-Magyarországi Területi Szervezetének Tudományos Ülése, Budapest, 1998. október 9-10. XIII. Bocsi J., Garami M., Kovács G., Csóka M., Schuler D., Szende B.: Apoptosis index változás, mint prediktív factor akut lymphoid leukémia kezelése során. Előadás. A Magyar Gyermekorvosok Társasága 75. évi Jubileumi Kongresszusa, Budapest, 1999. XIV. Garami M., Bocsi J., Kovács G., Csóka M., Schuler D., Szende B.: Apoptotic ratio as an early prognostic factor in acute lymphoblastic leukemia in children. Poszter. 31st Meeting of International Society of Pediatric Surgical Oncology, Montreal, Kanada, 1999. szeptember 13-14. XV. Csóka M. Bocsi J., Kovács G., Schuler D. és Szende B.: Apoptózis-index, mint a glukokortikoid-érzékenység korai markere gyermekkori akut limfoid leukémiában. Előadás. II. Gyulai Haematológiai Napok, Gyula, 2000. szeptember 13-16. XVI. Csóka M., Moldenhauer G., Debatin K.-M.: In vitro study of bispecific monoclonal antibodies in B-lineage acute lymphoblastic leukemia of childhood. Poszter. II. Semmelweis Symposium. Budapest, 2000. november 9-10. XVII.Csóka M., Moldenhauer G., Debatin K.-M.: Lysis of malignant B cells of children with acute lymphoblastic leukemia by autologous T cells activated with CD3xCD19 bispecific monoclonal antibodies. Előadás. 10. Tagung mitteleuropäischer Länder „Pädiatrische Forschung” Wien, 2001. június 22.

76

12. RÖVIDíTÉSEK JEGYZÉKE ADCC

antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity

ALL

akut limfoid leukémia

AML

akut mieloid leukémia

BFM-95

Berlin-Frankfurt-Münster-95

cALL

common akut limfoid leukémia

CD

cluster of differentiation

CLL

krónikus limfoid leukémia

FADD

Fas-associating protein with death domain

FCS

fetal calb’s serum

FITC

fluorscein-iso-thio-cyanat

GAM

goat anti-mouse

HAT

hipoxantin-aminopterin-timidin

HGPRT Ig

hipoxantin-guanin-foszforiboziltranszferáz immunglobulin

IL

interleukin

LAK

limfokin aktiválta killer sejtek

MHC

major hisztokompatibilitási komplex

MRD

minimal residual disease

PBL

peripheral blood lymphocytes

PBMC

peripheral blood mononuclear cells

PBS

phosphate buffered saline

PE

phycoerythrin

PHA

phytohemagglutinine

PI

propidium iodide

PIG

P53 által indukált gén

77

TCR

T cell receptor

TIL

tumorinfiltráló limfociták

TNF

tumor nekrózis faktor

TRADD

TNFR1-associated death domain protein

SDS

sodium-dodecyl-sulfate

78

13. IRODALOMJEGYZÉK I.

Robertson A.M., Bird C.C., Waddell A.W. and Currie A.R. Morphological Aspects of Glucocorticoid-induced Cell Death in Human Lymphoblastoid Cells. J Pathol, 1978;126:181-187.

II.

Wyllie A.H. and Morris R.G. Hormone-Induced Cell Death. Purification and Properties of Thymocytes Undergoing Apoptosis After Glucocorticoid Treatment. Am J Pathol, 1982;109:78-87.

III.

Ucker DS. Cytotoxic T Lymphocytes and Glucorticoids Activate an Endogenous Suicide Process in Target Cells. Nature 1987; 327: 62-64.

IV.

Wyllie A.H. Glucocorticoid-Induced Thymocyte Apoptosis is Associated with Endogenous Endonuclease Activation. Nature 1980; 284: 555-556.

V.

Baxter G.D., Collins R.J., Harmon B.V., Kumar S., Prentice R.L., Smith P.J. and Lavin M.F. Cell Death by Apotosis in Acute Leukaemia. J Pathol, 1989;158:123-129.

VI.

Nadler L.M., Stashenko P., Hardy R., Kaplan W.D., Button L.N., Kufe D.W., Antman K.H., Schlossman S.F. Serotherapy of a patient with monoclonal antibody directed against a human lymphoma-associated antigen. Cancer Res, 1980;40:3147-3154.

VII.

Köhler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 1975; 256: 495-497.

VIII.

Grossbard ML, Press OW, Appelbaum FR, Bernstein ID, Nadler LM. Monoclonal antibody-based therapies of leunkemia and lymphoma. Blood 1992; 80: 863-878.

79

IX.

Riethmüller G, Schneider-Gadicke E, Johnson JP. Monoclonal antibodies in cancer therapy. Curr Opin Immunol 1993; 5: 732-739.

X.

Cobb PW, LeMaistre CF. Therapeutic use of immunotoxins. Semin Hematol 1992; 29: 6-13.

XI.

Grossbard ML, Nadler LM. Immunotoxin therapy of malignancy. Important Adv Oncol 1992; 111-135

XII.

Rosen ST, Zimmer AM, Goldman-Leikin R, Gordon LI, Kazikiewicz JM, Variakoijs D, Marder RJ, Dykewicz MS, Piergies A, Silverstein EA, Roenigk HH, Spies SM. Radioimmunodetection and radioimmunotherapy of cutaneous T cell lymphomas using an 131I-labeled monoclonal antibody: an Illionois Cancer Council Study. J Clin Oncol 1987; 5: 562-573.

XIII.

Milstein C, Cuello AC. Hybrid hybridomas and the production of bi-specific monoclonal antibodies. Immunol Today 1984; 5: 299-304.

XIV.

Bolhuis R.L.H., Sturm E., Braakman E. T cell targeting in cancer therapy. Cancer Immunol Immunother 1991; 34: 1-8.

XV.

Cook AG, Wood PJ. Chemical synthesis of bispecific monoclonal antibodies: potential advantages in immunoassay systems. J Immunological Methods 1994; 171: 227-237.

XVI. Nolan O, O’Kennedy R. Chemical production of bifunctional antibodies. Biochem Soc Trans 1992; 20: 60S. XVII. Weidmann E, Trucco M, Whiteside TL. Relevance of the T cell receptor for immunotherapy of cancer. Cancer Immunol Immunother 1994; 39: 1-14.

80

XVIII. Wolf H, Freimann U, Jung G. Target cell induced T cell activation with bispecific antibodies: a new concept for tumor immunotherapy. Recent results Cancer Res 1994; 135: 185-195. XIX.

Weiner GJ, Kostelny SA, Hillstrom JR, Cole MS, Link BK, Wang SL, Tso JY. The role of T cell activation in anti-CD3xantitumor bispecific antibody therapy. J Immunol 1994; 152: 2385-2392.

XX.

Perez P., Hoffman R.W., Shaw S., Bluestone J.A., Segal D.M. Specific targeting of cytotoxic T cells by anti-T3 linked to anti-target cell antibody. Nature 1985; 316: 354-356.

XXI. Staerz U.D., Kanagawa O., Bevan M.J. Hybrid antibodies can target sites for attack by T cells. Nature 1985; 314: 628-630. XXII. Haagen IA, de Lau WBM, Bast BJEG, Geerars AJG, Clark MR, de Gast BC. Unprimed CD4+ and CD8+ T cells can be rapidly activated by a CD3xCD19 bispecific antibody to proliferate and become cytotoxic. Cancer Immunol Immunother 1994; 39: 391-396. XXIII. Pui C.H., Behm F.G., Crist W.M. Clinical and biological relevance of immunologic marker studies in childhood acute lymphobalstic leukemia. Blood 1993; 82: 343-362. XXIV. Uckun F.M. Regulation of human B-cell ontogeny. Blood 1990; 76: 19081923. XXV. Klein G. Dysregulation of lymphocyte proliferation by chromosomal translocations and sequential genetiv changes. BioEssays 2000; 22: 414-422.

81

XXVI. Karp J.E., Broder S. Aquired immunodeficiency syndrome and Non-Hodgkin’s lymphomas. Cancer Res 1991; 51: 4743-4756. XXVII.Hill R.P. Tumor progression: potential role of unstable genomic changes. Cancer Met Reviews 1990; 9: 137-147. XXVIII.Gauwerky C.E., Croce C.M. Chromosomal translocations in leukemia. Cancer Biol 1993; 4: 333-340 XXIX. Korsmeyer S.J. Bcl-2 initiates a new category of oncogenes: regulators of death. Blood 1992; 80: 879-886. XXX. Korsmeyer S.J., Shutter J.R., Veis D.J., Merry D.E. Oltvai Z.N. Bcl-2/Bax: a rheostat that regulates an anti-oxidant pathway and cell death. Cancer Biol 1993; 4: 327-332. XXXI. McDonnell T.J., Korsmeyer S.J. Progression from lymphoid hyperplasia to high-grade malignant lymphoma in mice transgenic for the t(14;18). Nature 1991; 349: 254-256. XXXII.Juneja S., Lukeis R., Tan L., Cooper I., Szelag G., Parkin J.D., Ironside P., Garson O.M. Cytogenic analysis of 147 cases of non-Hodgkin’s lymphoma: non-random chromosomal abnormalities and histological correlations. Br J Haemat 1990; 76: 231-237. XXXIII.LeBien T.W. Fates of human B-cell precursors. 2000; 96: 9-23. XXXIV.Steenberg E.J., Verhagen O.J.H.M., van Leeuwen E.F., Behrendt H., Merle P.A., Wester M.R., von dem Borne A.E.G.Kr., van der Schoot C.E., B precursor acute lymphoblastic leukemia third complementarity-determining regions

82

predominantly represent an unbiased recombination repertoire: leukemic transformation frequently occurs in fetal life. Eur J Immunol 1994; 24: 900-908. XXXV.Jaffe E.S. The role of immunophenotypic markers in the classification of nonHodgkin’s lymphomas. Semin Oncol 1990; 17: 11-19. XXXVI.Kerr JFR, Wyllie AH and Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972; 26: 239-257. XXXVII.Wyllie AH. The biology of cell death in tumours. Anticancer Res 1985; 5: 131-136. XXXVIII.Miele L., Osborne B. Arbiter of differentiation and death: notch signaling meets apoptosis. J Cell Physiol 1999; 181: 393-409. XXXIX.Carson D.A., Ribeiro J.M. Apoptosis and disease. Lancet 1993; 341: 12511254. XL.

Kaufmann S.H., Gores G.J. Apoptosis in cancer: cause and cure. BioEssays 2000; 22: 1007-1017.

XLI.

Schmitt C.A., Lowe S.W. Apoptosis and therapy. J Pathol 1999; 187: 127-137.

XLII. Kerr J.F.R., Winterford C.M., Harmon B.V. Apoptosis. Its significance in cancer and cancer therapy Cancer 1994; 73: 2013-2026. XLIII. Fadok V.A., Voelker D.R., Campbell P.A., Cohen J.J., Bratton D.L., Henson P.M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J Immunol. 1992; 148: 2207-2216.

83

XLIV. Jacotot E, Costantini P, Laboureau E, Zamzami N, Susin SA, Kroemer G. Mitochondrial membrane permeabilization during the apoptotic process. Ann NY Acad Sci 1999; 887: 18-30. XLV. McConkey D.J., Aguilar-Santelises M., Hartzell P et al. Induction of DNA Fragmentation in Chronic B-Lymphocyte Leukemia Cells. J Immunol, 1991;146:1072-1076. XLVI. Darzynkiewitz Z., Bruno S., Del Bino G., et al. Features of apoptotic Cells Measured by Flow Cytometry. Cytometry, 1992;13:795-808. XLVII. Jennings C.D., Foon K.A. Recent advances in flow cytometry: application to the diagnosis of hematological malignancy. Blood 1997; 90: 2863-2892. XLVIII.Matsubara K., Kubota M., Adachi S. et al. Induction of Apoptosis in Childhood Acute Leukemia by Chemotherapeutic Agents: Failure to Detect Evidence of Apoptosis in vivo. Eur J Haematol, 1994;52:47-52. XLIX. Ashkenazi A., Dixit V.M. Death receptors: Signaling and modulation. Science 1998; 281: 1305-1308. L.

Bentley D.P., Pepper C.J. The apoptotic pathway: a target for therapy in chronic lymphocytic leukemia. Hematol Oncol 2000; 18: 87-98.

LI.

King K.L., Cidlowski J.A. Cell cycle regulation and apoptosis. Annu Rev Physiol 1998; 60: 601-617.

LII.

Ashkenazi A., Dixit V.M. Apoptosis control by death and decoy receptors. Curr Opin Cell Biol 1999; 11: 255-260.

84

LIII.

Frankfurt O.S., Byrnes J.J., Seckinger D., Sugarbaker E.V. Apoptosis (programmed cell death) and the evaluation of chemosensitivity in chronic lymphocytic leukemia and lymphoma. Oncol Res 1993; 5: 37-42.

LIV.

Kumar S. Mechanisms mediating caspase activation in cell death. Cell Death and Diff 1999; 6: 1060-1066.

LV.

Nicholson D.W. Caspase structure, proteolytic substrates and function during apoptotic cell death. Cell Death and Diff 1999; 6: 1028-1042.

LVI.

Debatin K.M., Suss D., Krammer P.H. Differential expression of APO-1 on human thymocytes implications for negative selection? Eur J Immunol 1994; 24: 753-758.

LVII. Trauth B.l., Klas C., Peters A.M., Matzku S., Moller P., Falk W., Debatin K.M. and Krammer P.M. Monoclonal antibody mediated tumor regression by induction of apoptosis. Science 1989; 245: 301-305. LVIII. Blewitt R.W., Abbott A.C., Bird C.C. Mode of cell death induced in human lymphoid cells by high and low doses of glucocorticoid. Br J Cancer 1983; 47: 477-486. LIX.

Distelhorst C.W. Steroid Hormone Receptors. J Lab Clin Med 1993; 122: 241244.

LX.

Chandra J., Gilbreath J., Freireich E.J., Kliche K.O., Andreeff M., Keating M., McConkey D.J. Protease activation is required for glucocorticoid-induced apoptosis in chronic lmphocytic leukemic lymphocytes. Blood 1997; 90: 36733681.

85

LXI.

Kofler R. The molecular basis of glucocorticoid-induced apoptosis of lymphoblastic leukemia cells. Histochem Cell Biol 2000; 114: 1-7.

LXII. Uchida A. Biological significance of autologous tumor-killing activity and its induction therapy. Cancer Immunol Immunother 1993; 37: 75-83. LXIII. Old L.J. Tumor necrosis factor (TNF). Science 1985; 230: 630-632. LXIV. Heaton K.M., Grimm E.A. Cytokine combinations in immunotherapy for solid tumors: a review. Cancer Immunol Immunother 1993; 37: 213-219. LXV. Foon KA. Biological response modifiers: The new immunotherapy. Cancer Res 1989; 49: 1621-1639. LXVI. Lotze M.T., Finn O.J. Recent advances in cellular immunology: implications for immunity to cancer. Immunol Today 1990; 11: 190-193. LXVII. Chapman PB, Houghton AN. Non-antibody immunotherapy of cancer. Curr Opin Immunol 1993; 5: 726-731. LXVIII.Maas R.A., Dullens H.F.J., den Otter W. Interleukin-2 in cancer treatment: disappointing or (still) promising? A review. Cancer Immunol Immunother 1993; 36: 141-148. LXIX. Smith K.A.Lowest dose Interleukin-2 immunotherapy. Blood 1993; 81: 14141423. LXX. Lotze M.T.,Line B.R., Mathisen D.J., Rosenberg S.A. The in vivo distribution of autologous human and murine lynphoid cells grown in T cell growth factor (TCGF): implications for the adoptive immunotherapy of tumors. J Immunol 1980; 125: 1487-1493.

86

LXXI. Takai N., Tanaka R., Yoshida S., Hara N., Saito T. In vivo and in vitro effect of adoptive immunotherapy of experimental murine brain tumors using lymphokine-activated killer cells. Cancer Res 1988; 48: 2047-2052. LXXII. Hamann A. Mechanisms of lymphocyte traffic and cell targeting. Int J Cancer 1992; 7: 19-23. LXXIII.Rosenberg S.A. Immunotherapy of cancer using interleukin-2: current status and future prospects. Immunol Today 1988; 9: 58-62. LXXIV.Whiteside T.L., Miescher S., Hurlimann J., Moretta L., von Fliedner V. Separation, phenotyping and limiting dilution analysis of T-lymphocytes infiltrating human solid tumors. Int J Cancer 1986; 37: 803-811. LXXV.Rosenberg S.A., Packard B.S., Aebersold P.M., Solomon D., Topalian S.L., Toy S.T., Simon P., Lotze M.T., Yang J.G., Seipp C.A., Simpson C., Carter C., Bock S., Schwartzentruber D., Wei J.P., White D.E. Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 inthe immunotherapy of patients with metastatic melanoma. N Engl J Med 1988; 319: 1676-1680. LXXVI.Mellstedt H. Monocolonal antibodies in cancer therapy. Curr Opin Immunol 1990; 2: 708-713. LXXVII.Grossbard ML, Press OW, Appelbaum FR, Bernstein ID, Nadler LM: Monoclonal antibody-based therapies of leukemia and lymphoma. Blood 1992; 80: 863-878. LXXVIII.Ortaldo JR, Woodhouse C, Morgan AC, Herberman RB, Cheresh DA, Reisfeld R. Analysis of effector cells in human antibody-dependent cellular

87

cytotoxicity with murine monoclonal antibodies. J Immunol 1987; 138: 35663572. LXXIX.Hellstrom I, Garrigues U, Lavie E, Hellstrom KE. Antibody-mediated killing of human tumor cells by attached effector cells. Cancer Res 1988; 48: 624-627. LXXX.Herlyn DM, Koprowski H. Monoclonal anticolon carcinoma antibodies in complement-dependent cytotoxicity. Int J Cancer 1981; 27: 769-774. LXXXI.Stevenson G.T., Elliot E.V., Stevenson F.K. Idiotypic determinants on the surface immunoglobulin of neoplastic lymphocytes: a therapeutic target. Fed Proc 1977: 36: 2268-2271. LXXXII.Brown S.L., Miller R.A., Horning S.J., Czerwinski D., Hart S.M., McElderry R., Basham T., Warnke R.A., Merigan R.C., Levy R. Treatment of B-cell lymphomas with anti-idiotype antibodies alone and in combination with alpha interferon. Blood 1989; 73: 651-661. LXXXIII.Herlyn D.M., Koprowski H. Monoclonal anticolon carcinoma antibodies in complement-dependent cytotoxicity. Int J Cancer 1981; 27: 769-774. LXXXIV.Ortaldo J.R., Woodhouse C., Morgan A.C., Herberman R.B., Cheresh D.A., Reisfeld R. Anaslysis of effector cells in human antibody-dependent cellular cytotoxicity wth murine monoclonal antibodies. Immunol 1987; 138: 35663572. LXXXV.Hellstrom I., Garrigues U., Lavie E., Hellstrom K.E. Antibody-mediated killing of human tumor cells by attached effector cells. Cancer Res 1988; 48: 624-627.

88

LXXXVI.Ritz J., Pesando J.M., Sallan S.E., Clawell L.A., Notis-McConarty J., Rosenthal P., Schlossman S.F. Serotherapy of acute lymphoblastic leukemia with monoclonal antibody. Blood 1981; 58: 141-152. LXXXVII.Meeker T.C., Lowder J., Maloney D.G., Miller R., Thielemans K., Warnke R., Levy R. A clinical trial of anti-idiotype therapy for B-cell malignancy. Blood 1985; 65: 1349-1363. LXXXVIII.Hale G., Dyer M.J.S., Clark M.R., Phillips J.M., Marcus R., Riechmann L., Winter G., Waldmann H. Remission induction in non-Hodgkin lymphoma with reshaped human monoclonal antibody CAMPATH-1H. Lancet 1988; 2: 1394-1399. LXXXIX.Foon K.A., Schroff R.W., Bunn P.A., Mayer D., Abrams P.G., Fer M., Ochs J., Bottino G.C., Sherwin S.A., Carlo D.J., Herberman R.B., Oldham R.K. Effects of monoclonal antibody therapy in patients with chronic lymphocytic leukemia. Blood 1984; 64: 1085-1093. XC.

Dillman R.O., Beauregard J., Shawler D.L., Halpern S.E., Markman M., Ryan K.P., Baird S.M., Clutter M. Continuous infusion of T101 monoclonal antibody in chronic lymphocytic leukemia and cutaneous T-cell lymphoma. J Biol Resp Modif 1986; 5: 394-410.

XCI.

Press O.W., Appelbaum F., Ledbetter J.A., Martin P.J., Zarling J., Kidd P., Thomas E.D. Monoclonal antibody IF5 (anti-CD20) serotherapy of human B cell lymphomas. Blood 1987; 69: 584-591.

XCII. Dyer M.J.S., Hale G., Hayhoe F.G.J., Waldman H. Effects of CAMPATH-1 antibodies in vivo in patients with lymphoid malignancies: Influence of antibody isotype. Blood 1989; 73: 1431-1439.

89

XCIII. Scheinberg D.A., Straus D.J., Yeh S.D>, Digvi C., Garin-Chesa P., Graham M., Pentlow K., Coit D., Oettgen H.F., Old L.J. A phase I toxicity, pharmacology and dosimetry trial of monoclonal antibody OKB7 in patients with non-Hodgkin’s lymphoma: effects of tumor burden and antigen expression. J Clin Oncol 1990; 8: 792-803. XCIV. Miller R., Oseroff A.R., Stratte P.T., Levy R. Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma. Blood 1983; 62: 988-995. XCV. Waldmann T.A., Goldman C.K., Bongiovanni K.F., Sharrow S.O., Davey M.P., Cease K.B., Greenberg S.J., Longo D.L. Therapy of patients with human T-cell lymphotropic virus I-induced adult T-cell leukemia with anti-Tac, a monoclonal antibody to the receptor for interleukin-2. Blood 1988; 72: 18051816. XCVI. Knox S.J., Levy R., Hodgkinson S., Bell R., Brown S., Wood G.S., Hoppe R., Abel E.A., Steinman L., Berger R.G., Gaiser C., Young G., Bindl J., Hanham A., Reichert T. Observations on the effect of chimeric anti-CD4 monoclonal antibody in patients with mycosis fungoides. Blood 1991; 77: 20-30. XCVII.Ball E.D., Bernier G.M., Cornwell G.G. III, McIntyre O.R., O’Donnell J.F., Fanger M.W. Monoclonal antibodies to myeloid differentiation antigen: in vivo studies of three patients with acute myelogenous leukemia. Blood 1983; 62:1203-1210. XCVIII.FitzGerald D., Pastan I. Targeted toxin therapy for the treatment of cancer. J Natl Cancer Inst 1989; 81: 1455-1463. XCIX. Yokota S., Hara H., Luo Y., Seon B.K. Synergistic potentiation of in vivo antitumor activity of anti-human T-leukemia immunotoxins by recombinant ainterferon and daunorubicin. Cancer Res 1990; 50: 32-37.

90

C.

Weil-Hillman G., Uckun F.M., Manske J.M., Vallera D.A. Combined immunochemotherapy of human solid tumors in nude mice. Cancer Res 1987; 47: 579-585.

CI.

Vriesendorp HM, Herpst JM, Germack MA, Klein JL, Leichner PK, Loudenslager DM, Order SE. Phase I-II studies of Yttrium-labeled antiferrin treatment for end-stage Hodgkin’s disease, including radiation therapy oncology group 87-01. J Clin Oncol 1991; 9: 918-928.

CII.

Lenhard R.E., Order S.E., Spunberg J.J., Asbell S.A., Leibel S.A. Isotopic immunoglobulin: a new systemic therapy for advanced Hodgkin’s disease. J Clin Oncol 1985; 3: 1296-1300.

CIII.

Vriesendorp H.M., Herpst J.M., Germack M.A., Klein J.L., Leichner P.K., Loudenslager D.M., Order S.E. Phase I-II studies of Yttrium-labeled antiferritin treatment for end-stage Hodgkin’s disease, including Radiation Therapy Oncology Group 87-01. J Clin Oncol 1991; 9: 918-928.

CIV.

Naruki Y., Carrasquillo J.A., Reynolds J.C., Maloney P.J., Frincke J.M., Neumann R.D., Larson S.M. Differential cellular catabolism of 111In, 90Y and 125

I radiolabeled T101 anti-CD5 monoclonal antibody. Int J Rad Appl Instrum

B 1990; 17: 201-207. CV.

Parker B.A., Vassos A.B., Halpern S.E., Miller R.A., Hupf H., Amox D.G., Simoni J.L., Starr R.J., Green M.R., Royston I.: Radioimmunotherapy of human B-cell lymphoma with 90Y-conjugated antiidiotype monoclonal antibody. Cancer Res 1990; 50: 1022-1028.

CVI.

Jung G, Müller Eberhard HJ. An in-vitro model for tumor immunotherapy with antibody heteroconjugates. Immunol Today 1988; 9: 257-260.

91

CVII. Nolan O, O’Kennedy R. Bifunctional antibodies and their potentional clinical applications. Int J Clin Lab Res 1992; 22: 21-27. CVIII. Link BK, Weiner GJ. Production and characterisation of a bispecific IgG capable of inducing T-cell-mediated lysis of malignant B cells. Blood 1993; 81: 3343-3349. CIX.

Traunecker A., Lanzavecchia A., Karjalainen K. Janusin: new molecular design for bispecific reagents. Int J Cancer 1992; 7: 51-52.

CX.

Hayden M.S., Linsley P.S., Gayle M.A., Bajorath J., Brady W.A., Norris N.A., Fell H.P., Ledbetter J.A., Gilliland L.K. Single-chain mono- and bispecific antibody derivates with novel biological properties and antitumor activity from a COS cell transient expression system. Therapeutic Immunology 1994; 1: 3-15.

CXI.

Hudson P.J. Recombinant antibody constructs in cancer therapy. Curr Opin Immunol 1999; 11: 548-557.

CXII. Nitta T, Sato K, Yagita H, Okumura K, Ishii S. Preliminary trial of specific targeting therapy against malignant glioma. Lancet 1990; 335: 368-371. CXIII. Bohlen H, Hopff T, Manzke O, Engert A, Kube D, Wickramanayake PD, Diehl V, Tesch H. Lysis of Malignant B Cells from Patients with B-Chronic Lymphocytic Leukemia by Autologous T Cells Activated with CD3xCD19 Bispecific Antibodies in Combination with Bivalent CD28 Antibodies. Blood 1993; 82: 1803-1812. CXIV. Manzke O., Tesch H., Borchmann P., Wolf J., Lackner K., Gossmann A., Diehl V., Bohlen H. Locoregional treatment of low-grade B-cell lymphoma with CD3xCD19 bispecific antibodies and CD28 costimulation: I. Clinical phase I evaluation. Int J Cancer 2001; 91: 508-515.

92

CXV. Manzke O., Tesch H., Lorenzen J., Diehl V., Bohlen H. Locoregional treatment of low-grade B-cell lymphoma with CD3xCD19 bispecific antibodies and CD28 costimulation: II. Assessment of cellular immune responses. Int J Cancer 2001; 91: 516-522. CXVI. Vlasveld LT, Hekman A, Vyth-Dreese FA, Melief CJM, Sein JJ, Voordouw AC, Dellemijn TAM. Rankin EM. Treatment of Low-Grade NonHodgkin’sLymphoma with Continuous Infusion of Lowe-Dose Recombinant Interleukin-2 in Combination with the B-Cell-Specific Monoclonal Antibody CLB-CD19. Cancer Immunol Immunother 1995; 40: 37-47. CXVII.Repp R., Valerius T., Bargou R. Bispezifische Antikörper in der Hämatologie und Onkologie. Internist 2001; 42: 854-859. CXVIII.Haagen I-A, Geerars AJ, de Lau WB, Clark MR, van de Griend RJ, Bast BJ, de Gast BC. Killing of autologous B-lineage malignancy using CD3xCD19 bispecific monoclonal antibody in end stage leukemia and lymphoma. Blood 1994; 84: 556-563. CXIX. Glennie M.J., Stevenson G.T. Univalent antibodies kill tumour cells in vitro and in vivo. Nature 1982; 295: 712-713. CXX. Roosnek E., Lanzavecchia A. Triggering T cells by otherwise inert hybrid antiCD3/antitumor antibodies requires encounter with the specific target cell. J Exp Med 1989; 170: 297-302. CXXI. Segal D.M., Qian J.H., Mezzanzanica D., Garrido M.A., Titus J.A., George A.J.T., Jost C.R., Perez P., Wunderlich J.R. Targeting of anti-tumor responses with bispecific antibodies. Immunobiol 1992; 185: 390-402.

93

CXXII.Canevari S., Mezzanzanica D., Menard S., Ferrini S., Moretta L., Colnaghi M.I. Possible targets on carcinoma for BmAb retargeting of lymphocyte or drug cytotoxicity. Int J Cancer 1992; 7: 42-44. CXXIII.Nitta T., sato K., Okumura K., Ishii S. Induction of cytotoxicity in human T cells coated with anti-glioma x anti-CD3 bispecific antibody against human glioma cells. J Neurosurg 1990; 72: 476-481. CXXIV.Haagen I.A., van de Griend R., Clark M., Geerars A., Bast B., de Gast B. Killing of human leukemia/lymphoma B cells by activated cytotoxic T lymphocytes

in

the

presence

of

a

bispecific

monoclonal

antibody

(aCD3/aCD19). Clin Exp Immunol 1992; 90: 368-375. CXXV.Anderson P.M., Crist W., Hasz D., Carroll A.J., Myers D.E., Uckun F.M. G19.4(aCD3)xB43(aCD19) monoclonal antibody heteroconjugate triggers CD19 antigen-specific lysis of t(4;11) acute lymphoblastic leukemia cells by activated CD3 antigen-positive cytotoxic T cells. Blood 1992; 80: 2826-2834. CXXVI.Malygin A.M., Somersalo K., Timonen T. Promotion of natural killer cell growth in vitro by bispecific (anti-CD3 x anti-CD16) antibodies. Immunology 1994; 81: 92-95. CXXVII.Ball E.D., Guyre P.M., Mills L., Fisher J., Dinces N.B., Fanger M.W. Initial trial of bispecific antibody-mediated immunotherapy of CD15-bearing tumors: cytotoxicity of human tumor cells using a bispecific antibody comprised of antiCD15 (MoAb PM81) and anti-CD64/FcgRI (MoAb 32). J Hematotherapy 1992; 1: 85-94. CXXVIII.Erbe D.V., Kurane I., Mady B.J., Ennis F.A., Fanger M.W. Use of bispecifics to determine the role of antibody-FcgR interactions in mediating enhancement of dengue virus infections. In: Bispecific antibodies and targetd

94

cellular cytotoxicity, edited by Romet-Lemonne J.L., Fanger M.W., Segal D.M. Les Ulis, France: Lienhart, 1991. P. 37-40. CXXIX.Glennie M.J., Brennand D.M., Bryden F., McBride H.M., Stirpe F., Worth A.T., Stevenson G.T. Bispecific F(ab’g)2 antibody for the delivery of saporin in the treatment of lymphoma. J Immunol 1988; 141: 3662-3670. CXXX.Stickney D.R., Anderson L.D., Slater J.B., Ahlem C.N., Kirk G.A., Schweighardt

S.A.,

Frinke

J.M.

Bifunctional

antibody:

a

binary

radiopharmaceutical delivery system for imaging colorectal carcinoma. Cancer Res 1991; 51: 6650-6655. CXXXI.Le Doussal J.M., Barbet J., Delaage M. Bispecific-antibody-mediated targeting of radiolabeled bivalent haptens: theoretical, experimental and clinical results. Int J Cancer 1992; 7: 58-62. CXXXII.Morganelli P.M., Kitzmiller T.J., Hemmer R., Fanger M.W. Redirected targeting of LDL to human monocyte Fcg-receptors with bispecific antibodies. Arterioscler Thromb 1992; 12: 1131-1138. CXXXIII.Bos R., Nieuwenhuizen W. The potential improvement of thrombolytic therapy by targeting with bispecific monoclonal antibodies; why they are used and how they are made. Biotherapy 1992; 5: 187-199. CXXXIV.Segal D.M., Weiner G.J., Weiner L.M. Bispecific antibodies in cancer therapy. Curr Opin Immunol 1999; 11: 558-562. CXXXV.Brissinck J., Demanet C., Moser M., Leo O., Thielemans K. Treatment of mice bearing BCL1 lymphoma with bispecific antibodies. J Immunol 1991; 147: 4019-4026.

95

CXXXVI.Demanet C., Brissinck J., Mechelen Mv., Leo O., Thielemans K. Treatment of murine B cell lymphoma with bispecific monoclonal antibodies (antiidiotype x anti-CD3). J Immunol 1991; 147: 1091-1097. CXXXVII.Weiner G.J., Hillstrom J.R. Bispecific anti-idiotype/anti-CD3 antibody therapy of murine B cell lymphoma. J Immunol 1991; 147: 4035-4044. CXXXVIII.Beun G.D.M., van de Velde C.J.H., Fleuren G.J. T-cell based cancer immunotherapy: direct or redirect tumor-cell recognition? Immunol Today 1994; 15: 11-15. CXXXIX.Bolhuis R.L.H., Lamers C.H.J., Goey S.H., Eggermont A.M>M., Trimbos J.B.M.Z., Stoter G., Lanzavecchia A., de Re E., Miotti S., Raspagliesi F., Rivoltini L., Colnaghi M.I. Adpotive immunotherapy of ovarian carcinoma with Bs-Mab-targeted lymphocytes: a multicenter study. Int J Cancer 1992; 7: 78-81. CXL. de Leji L., de Jonge M., ter Haar A. et al. Intrapleural and intraperitoneal application of bispecific antibody retargeted lymphocytes to cancer patients. In: Bispecific antibodies and targeted cellular cytotoxicity, edited by RometLemonne J.L., Fanger M.W., Segal D.M. Les Ulis, France: Lienhart, 1991, p. 249-253. CXLI. Clark M., Bolt S., Tunnacliffe A., Waldmann H. Use of bispecific monoclonal antibodies to treat hematological malignancies: a model system using CD3 transgenic mice. In: Bispecific antibodies and targeted cellular cytotoxicity, edited by Romet-Lemonne J.L., Fanger M.W., Segal D.M. Les Ulis, France: Lienhart, 1991, p. 243-247. CXLII. Uckun F.M. Regulation of human B-cell ontogeny. Blood 1990; 76: 19081923.

96

CXLIII.Foon KA, Todd RF. Immunologic classification of leukemia and lymphoma. Blood 1986; 68: 1-31. CXLIV.Ludwig WD, Schwartz S, Martin M, Schott G, Sperling C. Immunologic diagnosis and classification of acute leukemias. Lab Med 1993; 17: 465-472. CXLV. Friend P.J. Immunosuppression with monoclonal antibodies. Curr Opin Immunol 1990; 2: 859-863. CXLVI.Stamenkovic I., Seed B. CD19, the earliest differentiation antigen of the B cell lineage, bears three extracellular immunoglobulin-like domains and an EpsteinBarr virus-related cytoplasmic tail. J Exp Med 1988; 168: 1205-1210. CXLVII.Zhou L.J., Ord D.C., Hughes A.L., Tedder T.F. Structure and domain organization of the CD19 antigen of human, mouse and guinea pig B lymphocytes. Conservation of the extensive cytoplasmic domain. J Immunol 1991; 147: 1424-1432. CXLVIII.Bradbury L.E., Kansas G.S., Levy S., Evans R.L., Tedder T.F. The CD19/CD21 signal transducing complex of human B lymphocytes includes the target of antiproliferative antibody-1 and Leu-13 molecules. J Immunol 1992; 149: 2841-2850. CXLIX.de Rie M.A., Schumacher T.N.M., van Schijndel G.M.W., van Lier R.A.W., Miedema F. Regulatory role of CD19 molecules in B-cell activation and differentiation. Cell Immunol 1989; 118: 368-381. CL.

Rigley K.P., Callard R.E., Inhibition of B cell proliferation with anti-CD19 monoclonal antibodies: anti-CD19 antibodies do not interfere with early signaling events triggered by anti-IgM or interleukin. Eur J Immunol 1991; 21: 535-540.

97

CLI.

Carter R.H., Fearon D.T. CD19: lowering the treshold for antigen receptor stimulation of B lymphocytes. Science 1992; 256: 105-107.

CLII. Ghetie M.A., Picker L.J., Richardson J.A., Tucker K., Uhr J.W., Vitetta ES. Anti-CD19 Inhibits the Growth of Human B-Cell Tumor Lines In Vitro and of Daudi Cells in SCID Mice by Inducing Cell Cycle Arrest. Blood 1994; 83: 1329-1336. CLIII. Ghetie M.A., Tucker K., Richardson J., Uhr J.W., Vitetta E.S. The antitumor activity of an anti-CD22 immunotoxin in SCID mice with disseminated Daudi lymphoma is enhanced by either an anti-CD19 antibody or an anti-CD19 immunotoxin. Blood 1992; 80: 2315-2320. CLIV. Uckun F.M., Ledbetter J.A. Immunobiologic differences between normal and leukemic human B-cell precursors. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85: 86038607. CLV. Pezzutto A, Dörken B, Rabinovitch PS, Ledbetter JA, Moldenhauer G, Clark EA. CD19 Monoclonal antibody HD37 inhibits anti-immunoglobulin-induced B cell activation and proliferation. J Immunol 1987; 138: 2793-2799. CLVI. Hekman A., Honselaar A., Sein J.J., Rodenhuis S., de Rie M., Vuist W., Melief C.J.M., Rumke Ph. Treatment of human B-cell lymphoma with antiCD19 monoclonal antibody and with a combination of anti-CD19 and IL-2. Mechanisms of Action and Therapeutic Applications of Biologicals in Cancer 1989; 293-303. CLVII. Knapp W et al. Leucocyte Typing IV. White Cell Differentiation Antigens. I ed, Oxford University Press, Oxford, 1989.

98

CLVIII.Schlossman SF et al. Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. I ed., Oxford University Press, Oxford, 1995. CLIX. McMichael AJ, Beverly PCL, Cobbold S, Crumpton MJ, Gilks W, Gotch FM, Hogg N, Horton M, Ling N, MacLennan ICM, Mason DY, Milstein C, Spiegelhalter D, Waldmann H. (eds). Leukocyte Typing III. White Cell Differentiation Antigens. Oxford, UK, Oxford University, 1987 CLX. Hekman A., Honselaar A., Vuist W.M.J., Sein J.J., Rodenhuis S., ten Bokkel Huinink W.W., Somers R., Rumke Ph., Melief C.J.M. Initial experience with treatment of human B cell lymphoma with anti-CD19 monoclonal antibody. Cancer Immunol Immunother 1991; 32: 364-372. CLXI. Uckun F.M., Manivel C., Arthur D., Chelstrom L.M., Finnegan D., TuelAhlgren L., Irvin J.D., Myers D.E., Gunther R. In vivo efficacy of B43(antiCD19)-pokeweedantiviral protein immunotoxin against human pre-B cell acute lymphoblastic leukemia in mice with severe combined immunodeficiency. Blood 1992; 79: 2201-2214. CLXII. Pulczynski S., Boesen A.M., Jensen O.M. Antibody-induced modulation and intracellular transport of CD10 and CD19 antigens in human B-cell lines: An immunofluorescence and immunoelectron microscopy study. Blood 1993; 81: 1549-1557. CLXIII.de Rie M.A., Zeijlemaker W.P., van de Borne A.E.G.K. Inhibition, by vinca alkaloids and colchicine, of antigenic modulation induced by anti-CD19 monoclonal antibodies. Leukemia Res 1988; 12: 135-141. CLXIV.Greenman J., Hogg N., Nikoletti S., Slade C., Stevenson G., Glennie M. Comparitive efficiences of bispecific F(ab’g)2 and chimeric mouse/human IgG

99

antibodies in recruiting cellular effector for cytotoxicity via Fcg receptprs. Cancer Immunol Immunother 1992; 34: 361-369. CLXV. Ferrine S., Cambiaggi A., Cantoni C., Canevari S., Mezzanzanica D., Colnaghi M.I., Moretta L. Targeting of T or NK lymphocytes against tumor cells by bispecific monoclonal antibodies: role of different triggering molecules. Int J Cancer 1992; 7: 15-18. CLXVI.Clayton L.K., Lemer A., Diener A.C., Hussey R.E., Koyasu S., Reinherz E.L. T-cell-receptor isoforms. Int J Cancer 1992; 7: 1-5. CLXVII.Lamers C.H.J., van de Griend R.J., Braakman E., Ronteltap C.P.M., Benard J., Stoter G., Gratama J.W., Bolhuis R.L.H. Optimization of culture conditions for activation and large-scale expansion of human T lymphocytes for bispecific antibody-directed cellular immunotherapy. Int J Cancer 1992; 51: 973-979. CLXVIII.Uberti J.P., Joshi I., Ueda M., Martilotti F., Sensenbrenner L.L., Lum L.G. Preclinical studies using immobilized OKT3 to activate human T cells for adoptive immunotherapy: optimal conditions for the proliferation and induction of non-MHC-restricted cytotoxicity. Cancer Immunol Immunopathol 1994; 70: 234-240. CLXIX.Bohlen H., Manzke O., Patel B., Moldenhauer G., Dörken B., von Fliedner V, Diehl V., Tesch H. Cytolysis of leukemic B-cells by T-cells activated via two bispecific antibodies. Cancer Res 1993; 53: 4310-4314. CLXX. Bohlen H., Hopff T., Manzke O., Engert A., Kube A., Wickramanayake P.D., Diehl V., Tesch H. Lysis of malignant B cells from patients with B-chronic lymphocytic leukemia by autologous T cells activated with CD3xCD19 bispecific antibodies in combination with bivalent CD28 antibodies. Blood 1993; 82: 1803-1812.

100

CLXXI.Oshimi K., Seto T., Oshimi Y., Masuda M., Okumura K., Mizoguchi H. Increased lysis of patient CD10-positive leukemic cells by T cells coated with anti-CD3 Fab’ antibody cross-linked to anti-CD10 Fab’ antibody. Blood 1991; 77: 1044-1049. CLXXII.Hattori K., Tsukamoto H., Ohta S., Yabe M., Kato S., Takakura I., Ueda R., Habu S., Nishimura T. Bispecific antibody-mediated cytotoxicity by CD4+ and CD8+-activated T cells generated from leukemia patients after allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant 1995; 15: 193-198. CLXXIII.Fanger MW, Morganelli PM, Guyre PM. Bispecific Antibodies. Crit Rev Immunol 1992; 12: 101-124. CLXXIV.Leung H.T., Linsley P.S. The CD28 costimulatory pathway. Ther Immunol 1994; 1: 217-228. CLXXV.Jenkins MK, Johnson JG. Molecules involved in T-cell costimulation. Curr Opin Immunol 1993; 5: 361-367. CLXXVI.Smans KA, Hoylaerts MF, De Broe ME. Requirement of Monocytes and THelper Cells During Development of Tumor Cell Cytotoxicity in Targeted T cells. Cancer Immunol Immunother 1994; 38: 43-52. CLXXVII.Daniel PT, Kroidl A, Kopp J, Sturm I, Moldenhauer G, D0rken B, Pezzutto A. Immunotherapy of B-cell lymphoma with CD3xCD19 bispecific antibodies: costimulation via CD28 prevents „veto” apoptosis of antibody-targeted cytotoxic T cells Blood 1998; 92: 4750-4757

101

CLXXVIII.Guerder S., Carding S.R., Flavell R.A. B7 costimulation is necessary for the activation of the lytic function in cytotoxic T lymphocyte precursors. J Immunol 1995; 155: 5167-5174. CLXXIX.Arndt M.A.E., Krauss J., Kipriyanov S.M., Pfreundschuh M., Little M. A bispecific diabody that mediates natural killer cell cytotoxicity against xenotransplanted human Hodgkin’s tumors. Blood 1999; 94: 2562-2568. CLXXX.Löffler A., Kufer P., Lutterbüse R., Zettl F., Daniel P.T., Schwenkenbecher J.M., Riethmüller G., Dörken B., Bargou R.C. A recombinant bispecific singlechain antibody, CD19xCD3, induces rapid and high lymphoma-directed cytotoxicity by unstimulated T lymphocytes. Blood 2000; 95: 2098-2103. CLXXXI.Hudson P.J. Recombinant antibody constructs in cancer therapy. Curr Opin Immunol 1999; 11: 548-557. CLXXXII.Kroemer G., Ried J.C. Mitochondrial control of cell death. Nature Medicine 2000; 6: 513-519. CLXXXIII.Meier P., Finch A., Evan G. Apoptosis in development. Nature 2000; 407: 796-801. CLXXXIV.Yuan J., Yankner B.A. Apoptosis in the nervous system. Nature 2000; 407: 802-809. CLXXXV.Nicholson D.W. From bench to clinic with apoptosis-based therapeutic agents. Nature 2000; 407: 810-816. CLXXXVI.Hengartner M.O. The biochemistry of apoptosis. Nature 2000; 407: 770776.

102

CLXXXVII.Savill J., Fadok V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature 2000; 407: 784-788. CLXXXVIII.Rich T., Allen R.L., Wyllie A.H. Defying death after DNA damage. Nature 2000; 407: 777-783. CLXXXIX.Krammer P.H. CD95’s deadly mission in the immune system. Nature 2000; 407: 789-795. CXC. Planey S.L., Litwack G. Glucocorticoid-induced apoptosis in lymphocytes. Biochem Biophys Res Commun 2000; 279: 307-312. CXCI. Witzig T.E. Radioimmunotherapy for patients with relapsed B-cell nonHodgkin lymphoma. Cancer Chemother Pharmacol 2001; 48: S91-S95. CXCII. Foss F.M. Interleukin-2 fusion toxin: targeted therapy for cutaneous T cell lymphoma. Ann Ny Acad Sci 2001; 941: 166-176. CXCIII.Barton J., Blackledge G., Wakeling A. Growth factors and their receptors: new targets for prostate cancer therapy. Urology 2001; 58: 114-122. CXCIV.Larson R.A. Current use and future development of gemtuzumab ozogamicin. Semin Hematol 2001; 38: 24-31. CXCV.McCune S.L., Gockerman J.P., Rizzieri D.A. Monoclonal antibody therapy in the treatment of non-Hodgkin lymphoma. JAMA 2001; 286: 1149-1152. CXCVI.Torchilin V.P. Drug targeting. Eur J Pharm Sci 2000; 11: S81-S91. CXCVII.Foon K.A. Monoclonal antibody therapies for lymphomas. Cancer J. 2000; 6: 273-278.

103

CXCVIII.Koon H.B., Junghans R.P. Anti-CD30 antibody-based therapy. Curr Opin Oncol 2000; 12: 588-593. CXCIX.Kreitman R.J. Immunotoxins. Expert Opin Pharmacother 2000; 1: 1117-1129. CC.

Sievers E.L. Targeted therapy of acute myeloid leukemia with monoclonal antibodies and immunoconjugates. Cancer Chemother Pharmacol 2000; 46: S18-S22.

CCI.

Griesinger F., Trümper L., Becker W. Radioimmunkonjugate: Therapie von Non-Hodgkin-Lymphomen und kolorektalen Karzinomen. Internist 2001; 42: 860-873.

CCII. Tesch H., Engert A., Manzke O., Diehl V., Bohlen H. Treatment of patients with malignant lymphomas with monoclonal antibodies. Bone Marrow Transplant 2000; 25: S50-S53. CCIII. Koelemij R., Kuppen P.J., van de Velde C.J., Fleuren G.J., Hagenaars M., Eggermont A.M. Bispecific antibodies in cancer therapy, from the laboratory to the clinic. J Immunother 1999; 22: 514-524. CCIV. Fanger MW, Morganelli PM, Guyre PM. Use of Bispecific Antibodies in the Therapy of Tumors. Cancer Treat Res 1993; 68: 181-194. CCV. Fanger MW, Segal DM, Romet-Lemonne JL. Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity. Immunol Today 1991; 12: 51-54. CCVI. Renner C, Jung W, Sahin U, Denfeld R, Pohl C, Trümper L, Hartmann F, Diehl V, van Lier R, Pfeundschuh. Cure of Xenografted Human Tumors by

104

Bispecific Monoclonal Antibodies and Human T Cells. Science 1994; 264: 833835. CCVII. Honeychurch J., Tutt A.L., Valerius T., Heijnen I.A.F.M., Van de Winkel J.G.J., Glennie M.J. Therapeutic efficiacy of FcgRI/CD64-directed bispecific antibodies in B-cell lymphoma. Blood 2000; 96: 3544-3552. CCVIII.Repp R., Valerius T., Bargou R. Bispezifische Antikörper in der Hämatologie und Onkologie. Internist 2001; 42: 854-859. CCIX. Borchmann P., Riethmüller G., Engert A. Monoklonale Antikörper: Entwicklung und klinische Perspektiven. Internist 2001; 42: 803-814.

105