Typizace amyloidóz pomocí laserové mikrodisekce a hmotnostní spektrometrie Dušan Holub Laboratoř experimentální medicíny, Ústav molekulární a translační medicíny Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci, Hněvotínská 5, 775 15 Olomouc XIII. workshop mnohočetný myelom a Roční setkání České myelomové skupiny 10. - 11. 4.2015 Mikulov
Amyloidóza Amyloidóza zahrnuje skupinu vzácných onemocnění, pro kterou je typické ukládání amyloidu - amyloidogenních proteinů do tkání
Srdce
Ledviny renální amyloidóza
Jazyk
Nahromaděný amyloid poškozuje tkáňové mikroprostředí, což může vést až k orgánovému selhání Správné určení amyloidogenního proteinu je velmi důležité pro klinický management, aby se zabránilo chybné diagnóze a nevhodné léčbě
Amyloidóza • známo 31 amyloidogenních proteinů, které mohou způsobit amyloidózu Amyloidóza AL AH Aβ2M ATTR AA
Amyloidogenní protein Immunoglobulin light chain Immunoglobulin heavy chain β2-microglobulin, wild type β2-microglobulin, variant Transthyretin,wild type Transthyretin, variants (Apo) serum amyloid A
Systémová/lokalizovan á S, L S, L L S S, L S S
Získaná (A), nebo vrozená (H) A A A H A H A
Cílený orgán/onemocnění Všechny orgány mimo CNS Všechny orgány mimo CNS Muskuloskeletální systém Srdce Srdce Všechny orgány mimo CNS
AApoAI
Apolipoprotein A I, variants
S
H
Srdce, játra, ledviny, kůže
AApoAII AApoAIV ...
Apolipoprotein A II, variants Apolipoprotein A IV, wild type ... Aβ protein precursor, wild type Aβ protein precursor, variant ... Prion protein, wild type Prion protein variants ...
S S ... L L ... L L ...
H A ... A H ... A H ...
Ledviny Ledviny ... CNS CNS ... CJD CJD, GSS syndrom ...
Aβ ... APrP ...
Diagnostika Nepřímé metody: IHC, IFC Přímá metoda: LMD-LCMS
Cíl projektu Zavést proteomickou metodu pro typizaci amyloidóz z parafínových tkání pomocí LMD-LCMS
Typizace amyloidóz pomocí LMD-LCMS FFPE Congo Red Staining
Laser microdissection
Heat-mediated Antigen Retrieval
Trypsin digestion
LC-MSMS
Bioinformatics
Protein Identification report
Barvení (1h) Proteiny
~KADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC~
Trypsin (37°C)
Laser Laserová Microdissection [area: 0.3 x 0.2 mm] mikrodisekce [thick tissue: 10 μm] (30 min)
Seznam identifikovaných proteinů
Extrakce Heat-mediated proteinů Antigen Retrieval (2.5 (2.5 h) h)
Bioinformatika (30 min)
Štěpení trypsinem (18h)
Peptidy
ADYEK VYACEVTHQGLSSPVTK …
Kapalinová chromatografie + hmotnostní spektrometrie (1h)
FFPE Congo Red Staining
Heat-mediated Antigen Retrieval
Laser microdissection
Proces začíná barvením parafínového řezu Kongo červení = zviditelnění amyloidových depozit Obarvená plocha je vyříznuta pomocí laserového mikrodisektoru (LMD)
Trypsin digestion
LC-MSMS
Bioinformatics
Congo Red Staining
Protein Identification report
Extrakce a denaturace proteinů 98°C, 1.5 h
0,6 - 1 nl depozita pro LCMS analýzu
Laserový mikrodisektor (Olympus) Kongo červeň
Saturnova červeň
Ledvina glomerulus
Kongo červeň
100x
Polarizační světlo
100x
FFPE Congo Red Staining
Laser microdissection
Heat-mediated Antigen Retrieval
Trypsin digestion
LC-MSMS
Bioinformatics
Protein Identification report
Proteiny
~KADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC~
Proteiny jsou enzymaticky štěpeny na peptidy
Trypsin (37°C) Štěpení trypsinem (18h)
Peptidy
ADYEK VYACEVTHQGLSSPVTK …
Kapalinová chromatografie + hmotnostní spektrometrie (1h)
Peptidy jsou separovány na koloně
Peptidy jsou analyzovány
FFPE Congo Red Staining
Laser microdissection
Bioinformatika (30 min)
Heat-mediated Antigen Retrieval
Trypsin digestion
LC-MSMS
Bioinformatics
Protein Identification report
Naměřená spektra jsou porovnávána proti proteinové sekvenční databázi pomocí třech různých vyhledávacích nástrojů
Měření počtu MS/MS spekter pro daný protein lze považovat za semikvantitativní stanovení jeho abundance
Heat-mediated Antigen Retrieval
Trypsin digestion
LC-MSMS
7.
Případ č. 1 MS/MS Count Myokard Játra
47 37 21 8 4 3 3 5 1 0 3 2 0 1 3 ...
72 55 33 13 8 4 6 4 1 0 3 8 0 1 4 ...
67 55 30 9 8 4 6 5 0 0 1 8 0 1 3 ...
50 54 29 6 6 3 4 3 0 0 1 6 0 1 2 ...
9 1 3 2 3 3 30 24 17 40 44 37 13 9 11 24 29 26 14 8 10 6 15 14 9 9 10 10 14 11 4 2 3 4 4 4 33 27 26 29 30 31 2 2 1 3 3 2 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 9 1 4 0 0 0 1 0 0 1 0 0 3 1 2 0 0 0 1 0 0 0 0 0 11 2 2 12 4 5 ... ... ... ... ... ...
Vzorek_03
49 37 20 9 5 1 4 4 1 0 5 5 0 1 3 ...
Vzorek_02
Vzorek_01
53 29 16 11 5 5 3 3 3 3 2 2 1 1 1 ...
Vzorek_01
Vzorek_03
* * * * * * * * * * * * * * * *
Vzorek_03
Vzorek_02
Ig kappa chain C region Apolipoprotein E Serum amyloid P-component Apolipoprotein A-IV Apolipoprotein A-I Transthyretin Ig lambda-3 chain C regions Ig alpha-1 chain C region Ig gamma-2 chain C region Ig gamma-3 chain C region Gelsolin Ig mu chain C region Lactadherin Beta-2-microglobulin Fibrinogen alpha chain ...
Vzorek_02
Identifikovaný protein
Vzorek_01
#
Případ č. 8 MS/MS Count Myokard Játra
Vzorek_03
Interpretace naměřených výsledků
Bioinformatics
Vzorek_02
Seznam identifikovaných proteinů
Protein Identification report
Vzorek_01
Congo Red Staining
Laser microdissection
Amyloidogenni protein
FFPE
Typing of amyloidosis from FFPE tissue samples ~ 100 cases (CR+) ~ 150 FFPE tissue samples
IHC Ig κ
CR+
SAA
TTR
LMD-LC-MS
+
FFPE tissue
-> 11 cases subtyped by IHC and LMD-LC-MS (2014)
Ig λ
+
✔
-> 41 cases are currently being processed by LMD-LC-MS (March-June 2015) -> 48 cases will be processed by LMD-LC-MS (July-September 2015) => 100 cases x 3 replicates x LC-MS run (105 min) = 29 days -> 3 cases have amyloid mutation form -> 5 cases were subtyped by LMD-LC-MS (2014, Ostrava)
The clinical diagnosis and characteristics of the patients
The detailed results of the three cases from LMD-LC-MS analysis
Comparison of IHC and LMD-LC-MS/MS methods The typing of amyloidosis by IHC ✖ ✔ ✖ ✔ ✖ ✖
Výhody a nevýhody LMD-LCMS • LMD-LCMS + vysoce citlivá (22 z 22) + vysoce specifická (22 z 22) + levná -Vyžaduje vysokou vstupní investici do přístrojů (LMD, LC, MS) -vyškolený personál
Nabízíme možnost spolupráce
Požadujeme zaslání parafinované tkáně (FFPE) Kontakt: Mgr. Dušan Holub
[email protected] ÚMTM, Olomouc
Děkuji za pozornost.
