Transformasi Plasmid Dengan Sel Bakteri Escherichia coli Menggunakan Metode Heat Shock
ISSN:2089-3205
Transformasi Plasmid Dengan Sel Bakteri Escherichia coli Menggunakan Metode Heat Shock Maya Ekaningtias
Abstrak: Transformasi merupakan proses memperkenalkan DNA asing ke dalam sel-sel hidup. Umumnya, transformasi bertujuan mengekspresikan suatu gen tertentu berupa fragmen DNA di dalam sel inang. Agar gen tersebut dapat masuk ke dalam sel inang, gen tersebut harus dibuat menjadi DNA plasmid dengan menyisipkannya pada suatu DNA vektor. Salah satu metode transformasi yaitu dengan heat shock (kejutan panas). Tujuan penelitian ini adalah mempelajari proses transformasi plasmid ke dalam bakteri Escherichia coli menggunakan metode heat shock. Bakteri E. coli strain DH5α dibuat menjadi sel kompeten dengan ditumbuhkan pada 5 ml medium LB, suhu 37o C selama 24 jam pada shaker. Setelah diperoleh pellet yang dibutuhkan kemudian ditambahkan TSS 2x sebanyak 1 ml, kemudian disuspensikan. Selanjutnya, suspensi bakteri E. coli dicampur dengan DNA plasmid (pUC19) kemudian ditransformasi menggunakan metode heat shock pada suhu 42oC selama 90 detik. Setelah itu, inokulasi 100 µl campuran tersebut pada media seleksi (medium LB yang diberi antibiotik ampisilin), Diinkubasi semalam pada suhu 37oC dan keesokan harinya dilakukan pengecekan hasil transformasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transformasi plasmid DNA ke dalam E. coli menggunakan TSS dan metode heat shock berhasil dilakukan. Hal ini diindikasikan dengan adanya E. coli yang mampu tumbuh pada medium LB yang mengandung antibiotik ampisilin. Dengan adanya ampisilin sebagai marka seleksi, maka sel E. coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang telah memasukkan plasmid. Kata Kunci: Transformasi, pUC19, E. coli strain DH5α, Heat shock.
dengan segera pada suhu sekitar 42oC. Adapun
PENDAHULUAN Transformasi
merupakan
proses
memasukkan DNA plasmid hasil konstruksi yang telah mengandung materi asing ke dalam sel target. Dalam proses ini, untuk sementara dinding sel dibuat permeabel dan dapat dilalui oleh molekul DNA kecil. Transformasi dapat dilakukan dengan beberapa cara, antara lain dengan heat shock dan dengan elektroporasi. Pada metode heat shock, campuran sel dan DNA plasmid rekombinan didinginkan dalam
metode elektroporasi menggunakan suatu alat yang dialiri arus listrik. Transformasi genetik merupakan salah satu metode yang dapat dimanfaatkan untuk mempelajari regulasi gen, identifikasi fungsi gen, pengujian metabolisme, serta mempelajari fisiologi dan perkembangan sebagai akibat dari ekspresi gen tersebut. Agar gen yang berupa fragmen DNA tersebut dapat masuk, diperlukan
suatu
vektor
DNA
untuk
waktu yang lama, kemudian dipanaskan 7 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi
Volume 5 Nomor 2 November 2016
Transformasi Plasmid Dengan Sel Bakteri Escherichia coli Menggunakan Metode Heat Shock
ISSN:2089-3205
menyisipkan gen, misalnya vektor plasmid
Supercoiling ini terjadi karena sebagian heliks
(Brown, 2006).
ganda DNA plasmid terbuka oleh kerja enzim
Vektor adalah sekuen nukleotida DNA
topoisomerase
selama
replikasi.
Bentuk
yang berperan sebagai perantara yang akan
berpilin ini hanya dapat dipertahankan jika
membawa fragmen DNA masuk ke dalam sel
kedua untai polinukleotida dalam keadaan
host dan memungkinkan terjadinya replikasi
utuh, sehingga disebut DNA sirkular yang
dan ekspresi fragmen DNA asing tersebut
tertutup secara kovalen (covalently-closed-
(Lodge et.al., 2007; Wiley et.al., 2011).
circular
Beberapa jenis vektor yang dapat digunakan
polinukleotida terputus, maka heliks ganda
antara lain plasmid, phage, cosmid, Yeast
akan
Artificial Chromosomes (YAC), Bacterial
normalnya, ke bentuk alternatif plasmid yang
Artificial
disebut sirkular terbuka (open circular) (Hogg,
Chromosomes
(BAC),
dan
sebagainya. Karena perannya yang sangat
DNA).
Jika
berelaksasi
salah
kembali
satu
ke
untai
keadaan
2005).
penting dalam transformasi, vektor memiliki
Plasmid hampir selalu membawa gen
beberapa persyaratan, antara lain: memiliki
tertentu (satu atau lebih gen) dan umumnya
titik origin of replication (ORI) sebagai titik
gen tersebut mengkode sifat-sifat penting yang
awal
ditunjukkan
replikasi,
sehingga
vektor
dapat
oleh
bakteri
asal.
Plasmid
bereplikasi sendiri; mengandung gen resistensi
membawa tipe gen yang sangat bervariasi
antibiotik
fungsinya,
tertentu
sehingga
memudahkan
seperti
resistensi
endonuklease restriksi atau multicloning site
mutagen, sensitif atau resistensi bakteriofag,
(MCS) yang dapat dipotong dengan enzim
produksi enzim restriksi, produksi asam
restriksi tertentu sebagai tempat penyisipan
amino, produksi toksin, penentu virulensi,
informasi genetik (Willey et.al., 2011).
katabolisme kemampuan
berat,
antibiotik,
proses seleksi; memiliki situs pengenalan
Plasmid merupakan DNA sirkular untai
logam
resistensi
molekul
sensitif
organik
pembentukan
terhadap
kompleks, hubungan
ganda ekstrakromosomal pada bakteri dengan
simbiosis, dan transfer DNA antar spesies
panjang kurang dari 20 kb yang dapat
(Hogg, 2005; Brown, 2006).
bereplikasi sendiri, sehingga memungkinkan
Untuk
terdapatnya banyak kopi dalam satu sel
transformasi
(Willey et.al., 2011). Sebagian besar plasmid
plasmid, plasmid dilengkapi dengan gen
dalam sel tersusun dalam struktur molekul
penanda molekular (marker gene) tertentu saat
yang
konstruksinya.
sangat
berpilin
(supercoiled).
8 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi
mengetahui dengan
keberhasilan
penggunaan
Penanda
vektor
molekular
Volume 5 Nomor 2 November 2016
Transformasi Plasmid Dengan Sel Bakteri Escherichia coli Menggunakan Metode Heat Shock
ISSN:2089-3205
menggunakan gen yang mudah dianalisis
transformasi
ekspresinya.
Escherichia coli menggunakan metode heat
Dalam
skala
laboratorium,
penanda resistensi antibiotik sering digunakan
plasmid
ke
dalam
bakteri
shock.
sebagai suatu selectable marker (Brown, 2006; METODE
Harisha, 2007). Selain menggunakan antibiotik, penanda molekuler lain yang biasa digunakan adalah gen lac Z. Gen lac Z adalah gen yang mengkode
enzim
menghidrolisis
β-galaktosidase
senyawa
x-gal
yang dengan
membentuk warna biru. Bila gen lac Z disisipi oleh gen lain, maka gen lacZ akan rusak sehingga tidak lagi menghasilkan enzim βgalaktosidase dan tidak dapat menghidrolisis senyawa
5-bromo-4chloro-3indolyl-β-D-
galactosidase (x-gal). Dalam hal ini, gen lacZ merupakan lokasi untuk menyisipkan gen yang akan ditransfer, atau sering disebut sebagai multiple cloning site (MCS). Bakteri yang telah berhasil ditransfer dengan plasmid (gen lacZnya telah tersisipi) akan membentuk koloni warna putih. Sebaliknya, bila gen lacZnya belum tersisipi, maka koloninya akan berwarna biru. Koloni yang berwarna putih adalah koloni bakteri transforman, sedangkan koloni
berwarna
transforman
atau
biru
bukan
bakteri
tidak
bertransformasi.
Seleksi dengan metode ini dikenal dengan nama blue white colony selection (Sun et al.,
Bakteri Escherichia coli (E. coli) strain DH5α dibuat menjadi sel kompeten dengan ditumbuhkan pada 5 ml medium LB, suhu 37o C selama 24 jam pada shaker. Selanjutnya sebanyak 500 µl bakteri tersebut dikultur kembali pada 10 ml medium LB, suhu 37o C selama 2-3 jam pada shaker hingga mencapai OD 0,5-0,6. Bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm, suhu 4oC selama 10 menit. Cairan dibuang dan pellet yang tersisa ditambahkan 1 ml 2 x TSS lalu disuspensikan. Pengambilan sebanyak 100 µl bakteri dan ditambahkan DNA plasmid (pUC19) 2 – 3 µl lalu dicampur dengan cara suspensi. Selanjutnya, diinkubasi ke dalam es dengan suhu sekitar 4oC selama 45 menit. Dilakukan heat shock pada suhu 42oC selama 90 detik. Ditambahkan TSS 1x yang dingin sebanyak 500 µl. Inkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam pada shaker. Inokulasi 100 µl pada media seleksi (LB medium yang diberi antibiotik ampicilin), diinkubasi semalam pada suhu 37o C dan keesokan harinya dilakukan pengecekan hasil transformasi.
2006; Harisha, 2007). Berdasarkan hal di atas, maka tujuan penelitian ini adalah mempelajari proses 9 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi
Volume 5 Nomor 2 November 2016
Transformasi Plasmid Dengan Sel Bakteri Escherichia coli Menggunakan Metode Heat Shock
(gen resistensi ampisilin), dan sebuah fragmen
HASIL DAN PEMBAHASAN Transformasi
ISSN:2089-3205
merupakan
salah
satu
N-terminal gen β-galaktosidase (lac Z) dari E.
langkah dalam teknologi DNA rekombinan,
coli.
yaitu rekayasa genetika untuk menghasilkan
mengeksploitasi
sifat baru dengan cara merekombinasikan gen
plasma sel bakteri inang. Enzim tersebut
tertentu dengan DNA genom. Teknik DNA
mengkatalisa hidrolisis cincin betalaktam,
rekombinan meliputi isolasi DNA, teknik
sehinggga
memotong
DNA, teknik menggbung DNA
transformasi dengan pUC19 menjadi resisten
dan teknik untuk memasukan DNA ke dalam
terhadap ampisilin. Pemilihan vektor yang
sel
akan digunakan dalam transformasi perlu
hidup.
Pada
memanfaatkan
dasarnya
penanda enzim
tersebut beta-laktamase
menyebabkan
bakteri
akan ke
hasil
bakteri
yang
memperhatikan karakter vektor dengan jelas,
asing
dari
terutama sistem ekspresi dan jenis gen
Dalam
ketahanan terhadap antibiotik yang dimilikinya
transformasi gen ke dalam sel bakteri, perlu
sehingga akan memudahkan dalam proses
memperhatikan
seleksi transforman.
mampu
kemampuan
transformasi
Gen
mengambil
lingkungan
di
DNA
sekelilingnya.
beberapa
faktor,
yaitu
persiapan sel kompeten, pemilihan vektor
Hasil penelitian menunjukkan, bahwa
plasmid, metode transformasi yang digunakan,
proses transformasi yang dilakukan berhasil
serta seleksi koloni bakteri yang berhasil
memperkenalkan DNA asing dalam bentuk
ditransformasi.
plasmid pUC19 ke dalam sel inang, yaitu
Pada penelitian ini sel kompeten yang
E.coli DH5α. Hal ini dapat dilihat dari
digunakan adalah bakteri E. coli DH5α yang
terbentuknya koloni bakteri pada medium
merupakan bakteri yang sering digunakan
seleksi menggunakan ampisilin, seperti yang
dalam proses transformasi. Pemilihan E. coli
terlihat pada gambar dibawah. Bakteri yang
DH5α
kompeten
tidak tersisipi oleh plasmid pUC19 akan mati
mempertimbangkan beberapa karakter yang
dengan adanya antibiotik yang digunakan
dapat meningkatkan efisiensi transformasi.
dalam medium seleksi, sedangkan bakteri yang
Sedangkan vektor yang digunakan adalah
berhasil ditransformasi dapat bertahan hidup
pUC19. Plasmid ini mempunyai ukuran genom
dalam medium tersebut yang disebabkan
sebesar 2,69 kb, jumlah kopi sekitar 500-7000
adanya gen ampR pada plasmid pUC19 yang
dan mempunyai situs pemotongan dengan
terekspresi pada bakteri transforman.
sebagai
sel
enzim restriksi. Selain itu, plasmid pUC19 mempunyai gen penanda, yaitu satu gen ampR 10 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi
Volume 5 Nomor 2 November 2016
Transformasi Plasmid Dengan Sel Bakteri Escherichia coli Menggunakan Metode Heat Shock
ISSN:2089-3205
Koloni bakteri yang terbentuk
Gambar 1. Hasil seleksi transforman pada medium seleksi yang mengandung antibiotik ampisilin.
Proses
transformasi
diawali
dengan
pembuatan sel kompeten. Sel Kompeten
adalah sel yang dapat menyerap DNA karena telah mendapat perlakuan fisik maupun kimia.
merupakan sel bakteri yang telah mengalami
Proses pembuatan sel kompeten dalam
perubahan dalam hal tingkat permeabilitasnya,
penelitian ini menggunakan larutan TSS yang
sehingga bakteri tersebut dapat menyerap
mengandung ion dari MgCl. Ion tersebut akan
DNA asing dari luar sel. Tidak semua sel
menetralisir aksi tolak-menolak antara muatan
secara alami memiliki kemampuan untuk
negatif dan bagian kepala fosfolipid dengan
menyerap DNA asing. Setiap sel memiliki
muatan negatif gugus fosfat DNA (Szostkova
efisiensi
and Horakova, 1998).
yang
berbeda
dalam
menyerap
Zhang et al. (2007)
molekul DNA. Beberapa spesies yang dapat
melakukan pengujian pengaruh Mg2+ terhadap
menyerap
membran lipid
DNA
secara
efisien
adalah
bilayer Mg2+
dan
Bacillus dan Streptococcus. Sel yang tergolong
menemukan
tidak
DNA
kerapatan membran. Berdasarkan kedua hasil
memiliki
tersebut dapat diketahui bahwa ion-ion dari
kemampuan alami menyerap DNA asing yang
MgCl2 berperan dalam mengganggu kestabilan
rendah (Tsen et al., 2002). Kemampuan sel
membran sel E.coli. selain itu TSS dingin
dalam menyerap DNA dapat ditingkatkan
dapat menyebabkan terganggunya struktur
dengan
sel
membran sel sehingga membentuk pori-pori
tersebut menjadi kompeten. Sel kompeten
yang memungkinkan membran sel dapat
efisien
dalam
adalah Escherichia
perlakuan
menyerap
coli. Sel
khusus,
ini
sehingga
bahwa
buatan,
menurunkan
dimasuki oleh DNA sirkuler. 11 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi
Volume 5 Nomor 2 November 2016
Transformasi Plasmid Dengan Sel Bakteri Escherichia coli Menggunakan Metode Heat Shock
ISSN:2089-3205
yang telah
pada suhu 42o C menimbulkan gradien panas
kompeten diberi perlakuan kejut panas (heat
yang menyebabkan aliran yang mengalir ke
shock) untuk membuka pori pada dinding sel
dalam sel yang memungkinkan DNA masuk
bakteri.
ke dalam sel.
Selanjutnya, sel E. coli
Inkubasi
dengan
plasmid
akan
menyebabkan masuknya plasmid ke dalam sel. Proses ini dilakukan dengan memindahkan secara cepat sel yang tadinya diinkubasi dalam es ke dalam suhu hangat ±42° C selama 90 detik,
jika
terlalu
lama
menyebabkan
kerusakan membran sel sehingga bakteri akan mati. Proses ini harus dilakukan secara cepat dan tepat waktu sehingga sel benar-benar dalam kondisi
"terkejut". Brown (2006)
mengatakan bahwa pemanasan yang cepat
DAFTAR PUSTAKA Brown, T.A. 2006. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. Fifth edition. Wiley Blackwell. Harisha, S. 2007. Biotechnology procedures and experiments handbook (An introduction to biotechnology). Infinity Science Press LLC. Hingham, MA. Canada. Hogg, S. 2005. Essential Microbiology. John Wiley & Sons Ltd. England. Lodge, J., P. Lund and S. Minchin. 2007. Gene Cloning: Principles and Applications. Taylor & Francis Group. Birmingham. Sun, D., Y. Zhang, Y. Mei, H. Jiang, Z. Xie, H. Liu, X. Chen, and P. Shen. 2006. Escherichia coli is Naturally Transformable In A Novel Transformation System. FEMS Microbiology Letters. 265 (2) : 249-255. Szostkova, M. and D. Horakova. 1998. The Effect of Plasmid DNA Size and other Factors on Electrotransformation of 12 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi
KESIMPULAN Berdasarkan dilakukan
dapat
penelitian
yang
disimpulkan
telah bahwa
transformasi plasmid DNA ke dalam E. coli menggunakan TSS dan metode heat shock. berhasil dilakukan yang diindikasikan dengan adanya E. coli yang mampu tumbuh pada medium LB yang mengandung antibiotik ampisilin.
Escherichia coli JM109. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 47: 319–323. Tsen et al. 2002. Natural Plasmid Transformation in Escherichia coli. Journal of Biomedical Science. 9:246252. Willey, J.M., L.M. Sherwood and C.J. Woolverton. 2011. Prescott’s Microbiology. 8ed. McGraw-Hill. Zhang et al. 2007. Effects of Mg2+ on Supported Bilayer Membrane on A Glassy Carbon Electrode During Membrane Formation. International Journal of Electrochemical Science. 2:788-796.
Volume 5 Nomor 2 November 2016
