Tools voor genetische analyse in polyploïde gewassen: een brug tussen aardappels, bloemen en groenten 12 mei 2014, Netwerkdag TKI Uitgangsmaterialen Chris Maliepaard, Wageningen UR Plant Breeding
Polyploïde gewassen
Tetraploïd (4N), bijv. aardappel, prei, roos Hexaploïd (6N), bijv. chrysant
Achtergrond project
Diploïden: genetische kartering met DNA-merkers inmiddels standaard
(Auto-)polyploïde kruisings-populatie (F1 van kruising) ● Veel complexere genetica ● Groot aantal merkers nodig ● Methoden en software nodig
Nú beter mogelijk dan voorheen Niet gewasafhankelijk: generiek voor veel polyploïde gewassen
Complexere genetica
Meer dan twee allelen mogelijk Alleldosis kan variëren van 0 tot 4 (tetraploid)
● nulliplex, simplex, duplex, triplex, quadruplex ● aaaa, aaab, aabb, abbb, bbbb ● Twee homozygoten, drie verschillende heterozygoten ● Bij kruising: alle paarsgewijze mogelijkheden ● Uitsplitsingen: 1:1 1:2:1 1:4:1 1:5:5:1 1:8:18:8:1 ● Paring chromosomen tijdens meiose ● Bivalenten of quadrivalenten in tetraploid ● Willekeurige of preferentiële paring ● Meer merkers nodig – voor elk homoloog chromosoom
bivalenten quadrivalent
Doelen van het project
Methoden voor genetische analyse in polyploïden Software voor toepassing Betere kennis over de genetica van polyploïden Kennisuitwisseling en overdracht –bijv. gebruik
methoden en software (workshops) naar bedrijfspartners
Voorgeschiedenis
Ideeën ± 2003: Plantum, preiveredelaars Daarna snelle ontwikkelingen in genetica/genomica:
Next-Generation sequencing, genotyperingsplatforms ● Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) ● Veel grotere aantallen merkers ● Goedkopere genotypering populaties ● SNP arrays
Betere software: fitTetra dosis-bepaling SNPs ● Voorrips et al. 2011
Totstandkoming TKI-project TTI-Groene Genetica project polyploïden 2010-2012
● Core project: geen financiering bedrijven ● Bedrijven wel betrokken: klankbord ● Succesvolle demonstratie mogelijkheden (aardappel, roos) ● Tetraploïde kaart individuele homologe chromosomen ● Validatie aan aardappel-sequentie
● Software-scripts – goed begin voor TKI-polyploïdenproject
Toenemende belangstelling sierteelt-sector
● Studiekring Plantenveredeling – polyploïden, Nov. 2011 ● Presentatie resultaten TTI-GG aan bedrijven, Juni 2012 ● 100 jaar Plantenveredeling - Sessie polyploïden, Nov. 2012
Totstandkoming TKI-project Andere lopende/geplande onderzoeksprojecten: ● ● ● ●
Ui/prei-TTI-project met Olga Scholten, Roeland Voorrips Roos: karteringsstudies snijroos/tuinroos met AIOs Aardappel associatie-studies Chrysant-AIO-project Geert v Geest met PBR (Paul Arens) WU Tuinbouwketens (Uulke v Meeteren)
Aardappel, prei, siergewassen
● vergelijkbare vragen mbt toepassing merkers, genetische kartering, QTL-analyse
Structuur van het project
Partners polyploïden-project
2 Aardappel-veredelingsbedrijven 2 Groenten-veredelingsbedrijven 5 Siergewassen-veredelingsbedrijven 1 Amerikaanse bedrijfspartner, akkerbouwgewas Plant Res. Intl. – Plant Breeding, Biometris Wageningen Universiteit - Plant Breeding, Biometris TKI-Uitgangsmaterialen
Meerwaarde kruisbestuiving typen bedrijven
Kennisuitwisseling merkers, genetica polyploïden Wat voor 1 gewas is ontwikkeld, bruikbaar voor andere Meer aspecten aan bod: ● Tri-, tetra- en hexaploïde F1-populaties ● Disome/tetrasome overerving ● Fysieke sequentie al dan niet beschikbaar ● Kwalitatieve/kwantitatieve eigenschappen ● Typen merkers, arrays, populaties ● Vergelijkingen tussen gewassen ● Bijv. chromosoomparing, quadrivalenten etc.
Toevoegen partners
Mogelijk en wenselijk, wel afspraken ● Veredelingsbedrijven die later instappen: toegang
tot zelfde kennis, methoden, software – ook zelfde verplichtingen
● Geen toegang tot vertrouwelijke kennis concurrent ● Instemming huidige partners vereist ● als werkt op zelfde gewas
Sinds start: nieuwe partner toegevoegd Ook: nieuw TKI-project toegevoegd ● Uitbreiding rol een van de huidige partners ● vrijwel rond
Aanpak
Stap 1: Sequencen, SNP detectie, SNP-array-ontwikkeling genotypering populatie met SNPs
Stap 2: Dosisbepaling met fitTetra, toewijzing uitsplitsings-type, selectie bruikbare merkers
Stap 3: Merkers indelen naar chromosoom en homoloog; kaart-constructie, validatie (fysieke kaart, verwante soorten, grootouders, etc.)
Stap 4: Kaart-integratie over alle uitsplitsings-types
Stap 5: Model, methode, software voor polyploïde QTLanalyse
Stap 1: Sequencen, SNPs, genotypering
Sequencen kruisingsouders Identificatie geschikte SNPs Grote aantallen: ● Aardappel: 20K SNP-array (Infinium) ● Roos: 68K array (Affymetrix Axiom) x 2 probes
Stap 2: Bepaling alleldosis en uitsplitsings-type, selectie bruikbare merkers
Bepaling allel-dosis in tetraploïden Vier kopieën van elk gen of merker-allel ● Vijf mogelijke genotypen per locus voor SNPs:
Genotype
Allelverhouding
Fractie b
aaaa = nulliplex (voor b)
4:0
0.00
aaab = simplex
3:1
0.25
aabb = duplex
2:2
0.50
abbb = triplex
1:3
0.75
bbbb = quadruplex
0:4
1.00
Signaal a-allel vs. signaal b-allel
nulliplex simplex duplex triplex
quadruplex
Software: fitTetra (vrij beschikbaar; R pakket)
Dosis toegekend als p > 0.99
0
1
2
3
4
Kansen v elke klasse P0
P1
0.00 0.00
P2
P3
P4
1.00 0.00
0.00
0.00
0.00
0.77 0.00
0.23
Signaalverhouding b/(a+b)
Voorrips et al. (2011)
Goed te scoren SNPs (aardappel) Type
#SNPs
%
remark
Op array
17987
100.0
fitTetra scores
15266
84.9
1 of 2 ouders goed te scoren
15227
84.7
F1-uitsplitsing ok
13842
80.0
F1-geen uitsplitsing (monomorf)
6588
0x0 of 4x4
6573
0x4 F1 goed te scoren en uitsplitsend
Rest: niet splitsend of onduidelijk, signaal te laag
Rest: geen goede fit, null-allelen, >3% niet te scoren
15 7254
40.3 Dosis ouders Simplex x nulliplex Simplex x quadruplex Triplex x nulliplex Triplex x quadruplex Duplex x nulliplex Duplex x quadruplex Simplex x simplex Simplex x triplex Triplex x triplex Duplex x simplex Duplex x triplex Duplex x duplex Totaal
Uitsplitsing #SNPs 1:1 3280
P1 1547
P2 1733
424
1:4:1
895
471
1:2:1
1403
Beide
Beide
1:5:5:1
1368
Beide
Beide
1:8:18:8:1
308 7254
Beide
Beide
Stap 3
Toekennen merkers aan chromosomen en homologen per chromosoom; maken merkerkaart
Eerst de 1:1 uitsplitsende merkers: simplex x nulliplex
Simplex x nulliplex toekennen Chromosoom volgens fysieke sequentie Locus Group Position solcap_snp_c2_49911 1 0 chr01 PotVar0124464 1 0.25 chr01 PotVar0124515 1 0.425 chr01 solcap_snp_c2_49917 1 0.425 chr01 PotVar0127038 1 2.58 chr01 PotVar0126769 1 3.004 chr01 PotVar0126587 1 3.855 chr01 PotVar0036149 1 3.855 chr01 PotVar0035378 1 7.35 chr01 PotVar0060667 1 12.221 chr01 PotVar0060753 1 12.221 chr01 PotVar0060678 1 12.221 chr01 solcap_snp_c2_13650 1 58.009 chr01 PotVar0032887 1 61.065 chr01 PotVar0049692 1 69.612 chr01 PotVar0018832 1 76.119 chr01 PotVar0122550 1 78.717 chr01 PotVar0122547 1 78.717 chr01 PotVar0014240 1 78.717 chr10 PotVar0100729 1 79.141 chr01 solcap_snp_c1_14649 1 80.858 chr01
Locus solcap_snp_c2_12526 PotVar0044087 PotVar0044411 solcap_snp_c1_12597 PotVar0044278 solcap_snp_c2_28186 solcap_snp_c2_28176 solcap_snp_c2_28167 PotVar0048012 solcap_snp_c1_8713 solcap_snp_c1_8709 solcap_snp_c2_28309 solcap_snp_c1_9918 PotVar0047829 PotVar0047976 solcap_snp_c2_50620 PotVar0047616 solcap_snp_c2_26040 PotVar0104502 solcap_snp_c2_4530 solcap_snp_c2_52104 solcap_snp_c1_8601 PotVar0132077
Group 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8
Position 0 3.076 3.933 3.933 3.933 9.272 9.272 9.272 9.272 9.272 9.272 9.272 9.695 11.851 11.851 12.702 13.984 13.984 23.737 44.315 47.494 47.946 53.73
chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr07 chr08 chr07
Toekennen aan chromosomen vrij eenvoudig: ● JoinMap: 12 Koppelingsgroepen =12 chromosomen ● Af en toe verschil genetische kartering /fysieke kaart (14x)
1
Vier homologen ouder 1, chrom 1 0.0 2.2 4.4 5.7 7.0 12.9 21.1 22.8 23.3 25.9 32.3 40.9 43.9
63.3 64.2 81.7 82.6 87.5 91.0 91.8 92.2 94.8 95.0 95.3 98.8 100.0 100.5
PotVar0072076 solcap_snp_c2_6683 solcap_snp_c2_6713 PotVar0044823 PotVar0045000 PotVar0045662 PotVar0045260 PotVar0102229 solcap_snp_c1_14649 PotVar0114353 PotVar0100717 PotVar0100762 PotVar0100729 PotVar0122547 PotVar0122550 PotVar0014240 PotVar0018832 PotVar0049692 PotVar0032887 PotVar0032906 solcap_snp_c2_13650
PotVar0006246 PotVar0006356 PotVar0061043 PotVar0060678 PotVar0060667 PotVar0060753 PotVar0035378 PotVar0126587 PotVar0036149 PotVar0126769 PotVar0127038 solcap_snp_c2_49911 PotVar0124464 PotVar0124515 solcap_snp_c2_49917 PotVar0099756 PotVar0099782 PotVar0122388 solcap_snp_c2_31041 PotVar0122353 PotVar0122386 PotVar0122414 PotVar0122423
homoloog 1
0.0 0.4 0.9
PotVar0120088 PotVar0119912 PotVar0119975
0.0
solcap_snp_c2_51800
0.0 0.4
9.8
solcap_snp_c2_49732
2.6 6.5 11.4 12.7 15.3 16.2 36.7 37.6 37.8 38.0
41.6 43.3 43.7 44.1 44.6 46.3 47.1 50.2 50.6 52.3 53.2 59.5 59.9 60.7 61.6 62.8 64.2 64.6
solcap_snp_c2_43970 PotVar0118576 solcap_snp_c1_14648 PotVar0028605 PotVar0122549 PotVar0037326 PotVar0071533 solcap_snp_c2_45621 PotVar0071575 PotVar0018968 PotVar0018985 PotVar0071624 PotVar0018687 solcap_snp_c2_35503 solcap_snp_c2_35537 solcap_snp_c2_35536 PotVar0049754 PotVar0049777 PotVar0049542 PotVar0049593 solcap_snp_c2_38404 solcap_snp_c2_32367 PotVar0049005 PotVar0126052 solcap_snp_c1_13686 solcap_snp_c2_40954 PotVar0126035 PotVar0032926 PotVar0032928 PotVar0032910 solcap_snp_c2_13751
homoloog 2
38.7 41.7 42.2 43.0 45.2 54.7 56.6 59.2 60.0 66.8 67.7 68.1 68.5
PotVar0098709 PotVar0098422 PotVar0098430 PotVar0098530 solcap_snp_c2_20521 PotVar0072139 PotVar0043665 PotVar0006198 solcap_snp_c1_3853 solcap_snp_c1_3854 solcap_snp_c2_12215 PotVar0006384 PotVar0041770 PotVar0041748 PotVar0041852 PotVar0041837 PotVar0042153 PotVar0049792 PotVar0049974 PotVar0050056 PotVar0050116 PotVar0050140 PotVar0050484 PotVar0050638
homoloog 3
43.3 44.6 45.5 46.3 47.2 47.6 48.0 48.4 48.9 53.7 55.0 55.9 56.7 57.2 63.9 64.8 65.6 67.3 68.2 70.8 76.6 84.3 89.7 93.2
1
PotVar0120126 PotVar0119973 PotVar0119913 PotVar0120075 PotVar0071852 PotVar0072072 solcap_snp_c2_6906 PotVar0044815 solcap_snp_c2_21099 solcap_snp_c1_6674 solcap_snp_c2_21234 solcap_snp_c2_686 PotVar0102233 PotVar0100708 solcap_snp_c2_2873 solcap_snp_c2_55618 PotVar0014900 solcap_snp_c2_54303 PotVar0071270 solcap_snp_c2_45395 PotVar0088430 solcap_snp_c2_53763 solcap_snp_c2_54306 solcap_snp_c1_5477 solcap_snp_c2_2653 solcap_snp_c2_35518 PotVar0124795 PotVar0006104 solcap_snp_c2_38406 PotVar0049628 PotVar0049426 PotVar0049273 PotVar0049427 PotVar0049351 PotVar0049291 PotVar0049174 solcap_snp_c1_12131 solcap_snp_c2_41339 solcap_snp_c1_4744 solcap_snp_c2_14580 solcap_snp_c2_14589 PotVar0129827 solcap_snp_c1_4763 PotVar0098497 solcap_snp_c2_20530 PotVar0098389 PotVar0072133 PotVar0072157 PotVar0043650 solcap_snp_c1_5653 PotVar0041677 PotVar0028699 PotVar0028811 solcap_snp_c2_7007
homoloog 4
Validatie met fysieke sequentie P1 Chr 1 Homoloog 1
P1 Chr 1 Homoloog 2 100
80
Gen. positie (cM)
Gen. positie (cM)
100
60 40 20
0 0,00E+00 2,00E+07 4,00E+07 6,00E+07 8,00E+07 1,00E+08
80 60 40 20 0 0,E+00
2,E+07
Fysieke Kaartpositie
8,E+07
P1 Chr 1 Homoloog 4
100
100
80
Gen. positie (cM)
Gen. positie (cM)
6,E+07
Fysieke Kaartpositie
P1 Chr 1 Homoloog 3
60 40 20 0 0,E+00
4,E+07
2,E+07
4,E+07
6,E+07
Fysieke Kaartpositie
8,E+07
1,E+08
80
Lange arm
60
Centromeer 40 20 0 0,E+00
Korte arm 2,E+07
4,E+07
6,E+07
Fysieke kaartpositie
8,E+07
1,E+08
Stap 4: integratie alle merkertypen
Nog in ontwikkeling, wel al eerste resultaten
Op weg naar kaart-integratie (snijroos) H1
Hier:
Simplex x nulliplex Simplex x simplex Duplex x nulliplex
H1_SxN
0.0 0.4 0.5 1.1 1.3 1.5 3.9 4.1 4.6 5.0 8.2 8.8 9.0 10.0
RhK5_3227_966R42 RhMC_10886_879R42 RhMC_7560_1265R42 RhK5_3734_1149R42 RhMC_17265_281R42 RhMC_5378_1008R42 K5_21865_126R33 RhK5_17663_793R42 K5_1100_2297R11 12GR_46627_260R11 RhK5_11182_1896R42 RhK5_2667_1364R42 RhK5_9135_266R42 RhMC_218_1049R42
25.4 25.9 26.2 26.6 26.7 27.0 28.3 29.0 30.3 30.9
Rh12_21601_1089R01 RhK5_1097_1427R43 K5_4439_976R33 K5_6720_562R33 RhK5_7593_828R01 RhK5_4334_1326R01 RhK5_7142_692R01 RhK5_2768_330R43 RhK5_632_306R43 Rh12_2505_1835R01
35.3 35.4 36.1 37.3 38.0 38.8
12GR_22536_456R33 K5_3974_589R33 K5_204_3377R11 RhK5_2359_1357R43 RhK5_4174_524R43 RhK5_3493_1545R01
43.6
RhK5_1586_435R43
49.6 51.1 51.2 51.3 51.5 52.4 52.8 53.2 54.0 54.7 54.8 54.9 55.1 55.3 55.5 57.0 57.6 58.6 59.0 59.3 59.6 60.5 61.8 62.6 64.3 66.3 68.2 69.2 71.7
K5_701_1858R33 K5_3028_1539R11 K5_9138_1486R33 MCRND_21021_1777R33 K5_17159_89R11 K5_2560_1635R33 RhK5_9919_1180R01 RhK5_7286_637R43 Rh12_18534_102R01 K5_8088_195R11 12GR_16710_1568R33 K5_13720_1505R11 K5_6079_747R11 K5_15594_833R33 Rh12_12405_153R43 RhK5_3568_558R01 RhK5_4018_818R43 RhK5_4690_1027R43 Rh12_91221_504R43 RhMC_511_2491R01 RhMC_24936_108R43 RhK5_16900_140R43 RhK5_5952_759R43 MCRND_16962_563R11 RhMC_3676_1294R43 RhK5_2131_946R01 RhK5_15967_513R01 RhK5_15967_884R02 RhK5_1345_877R43
0.0 0.5 0.8 1.3 1.5 2.7 3.4 3.5 4.1 4.7 5.4
Rh12_21601_1089R01 RhK5_2149_799R43 RhK5_1097_1427R43 RhK5_2198_544R43 RhK5_4334_1326R01 RhK5_7142_692R01 RhK5_13288_1030R01 RhK5_2768_330R43 Rh12_57182_457R43 RhK5_632_306R43 Rh12_2505_1835R01
12.0 12.7 13.4
RhK5_2359_1357R43 RhK5_4174_524R43 RhK5_3493_1545R01
18.4
RhK5_1586_435R43
29.2 30.7 32.0 32.1 32.7 34.1 34.2 34.3 34.7 35.6 36.9 39.4 41.4 41.5
RhK5_8088_287R43 Rh12_12405_153R43 Rh12_46438_208R01 RhK5_3568_558R01 RhK5_4018_1062R43 Rh12_91221_504R43 RhK5_8086_271R43 RhK5_4690_1027R43 RhMC_511_2491R01 Rh12_55740_342R01 RhK5_5952_759R43 RhMC_3676_1294R43 RhK5_2131_946R01 RhK5_7590_160R01
46.9
RhMC_4498_1181R43
Homologie roos met diploïde bosaardbei (Fragaria vesca) - gesequenced Chrom Fv1 Fv2 Fv3 Fv4 Fv5 Fv6 Fv7 Total
LG1 1 1 0 0 1 5 143 151
LG2 122 2 6 4 1 180 0 315
LG3 73 3 2 2 0 137 1 218
LG4 0 2 4 88 20 0 0 114
LG5 0 19 172 1 1 2 6 201
LG6 0 203 3 1 5 4 0 216
LG7 7 1 0 16 134 1 0 159
Total 203 231 187 112 162 329 150 1374
Roos vs. bosaardbei duidelijke sequentie-overeenkomsten
● Bijvoorbeeld: ● 143 merkers roos koppelingsgroep 1 hebben homologie met bosaardbei chromosoom 7
● Soms één rozengroep met twee aardbeigroepen (en andersom)
Nog te doen Stap 4: Efficiënte integratie alle merker-typen over alle homologe chromosomen van beide ouders samen 8 homologen tetraploïd, 12 hexaploïd
Stap 5: QTL-analyse-modellen ontwikkelen, testen, toepassen ● Nu nog: analyse per-merker ● toepassing complexere QTL-modellen
Verdere integratie software-modules Visualisatie resultaten
Met dank aan:
TKI-Uitgangsmaterialen Projectteam ‘Polyploids United’ ● Bedrijfspartners ● Promovendi en postdoc bij bedrijven Geert van Geest, Arwa Shahin, Mirjana Vukosavljev
● WUR Plant Breeding Paul Arens, Carole Koning-Boucoiran, Danny Esselink, Tiago Santos-Leonardo (Master-student), René Smulders, Roeland Voorrips
● WUR Biometris Gerrit Gort, Hans Jansen
Dank u
Vragen ?
