TINJAUAN PUSTAKA Senyawa UK-3A Selama tahun 1993 sampai 1997 telah berhasil dilakukan isolasi senyawa baru, yaitu benzokazol sitotoksik UK-1 dan antifungal UK-2A, B, C, dan D, dari Streptomyces sp.517-02 (Hanafi et al. 1996). Senyawa aktif juga diperoleh pada ekstrak aseton dari miselium Streptomyces sp.517-02. Senyawa aktif ini disebut UK-3A yang mempunyai aktivitas sebagai antifungal dan antibiotik. Senyawa UK-3A merupakan kristal tidak berwarna dan berbentuk jarum. Senyawa UK-3A juga menunjukkan aktivitas sebagai antibakteri dan antikanker (Ueki et al. 1996). UK-3A mempunyai sruktur yang hampir sama dengan struktur UK-2A (Gambar 1). Struktur UK-2A dan UK-3A hanya berbeda pada gugus metoksi yang terikat pada cincin pikolinat sehingga UK-3A dielusidasi sebagai demetoksi UK2A (Ueki et al. 1997a). Struktur senyawa UK-3A juga mempunyai kemiripan dengan struktur senyawa antibiotik yang sudah ditemukan sebelumnya, yaitu Antimisin A3 yang diisolasi dari Streptomyces sp. K01-0031 (Shiomi et al. 2005). Antimisin A3 diketahui sebagai antibiotik dan berperan dalam apoptosis melalui jalur intrinsik pada sel kanker. Antimisin A3 dapat menginduksi apoptosis sel leukemia HL-60.
N H N
O
R
H N
O OH
O O
O
NH
O OH
O H
O
O O
O
O
O
O
UK-2A : R = OMe UK-3A : R = H
O
Antimisin A3
Gambar 1 Struktur UK-2A, UK-3A, dan Antimisin A 3
Sintesis senyawa analog UK-3A dilakukan dengan mempelajari korelasi antara struktur dan aktivitas hayatinya, yang dapat diperoleh dari data metilasi dan hidrolisis senyawa UK-2A yang mempunyai struktur dan aktivitas hampir sama dengan senyawa UK-3A. Kajian mengenai hubungan struktur dan aktivitas hayati senyawa UK-2A, UK-3A, dan turunannya bertujuan mendapatkan informasi mengenai gugus-gugus yang berperan dalam aktivitas hayati (Hanafi 1997a). Hasil yang diperoleh diharapkan dapat disintesis senyawa analog dengan struktur yang lebih sederhana dan mempunyai aktivitas lebih tinggi jika dibandingkan dengan senyawa UK-3A induk. Metilasi senyawa UK-2A dengan diazometana menghasilkan senyawa UK-2(OMe) dan UK-2(NMe) yang mengakibatkan hilangnya aktivitas hayati. Hal ini menunjukkan bahwa gugus hidroksil pada cincin pikolinat dan NH pada gugus amida merupakan gugus yang aktif. Senyawa UK-3A tidak mempunyai gugus metoksi, tetapi tidak mengakibatkan hilangnya aktivitas antibakteri, bahkan meningkatkan kemampuan menghambat pertumbuhan sel kanker. Hidrolisis senyawa UK-2A menggunakan HCl kering dan metanol menghasilkan senyawa yang tidak menunjukkan aktivitas hayati. Hal ini membuktikan bahwa dilakton cincin sembilan merupakan gugus aktif yang bersifat lipofilik (Hanafi 1997a). Struktur senyawa UK-3A memiliki gugus hidroksil (OH) dan amida (CONH) yang merupakan gugus aktif yang mempunyai aktivitas yang cukup tinggi sebagai antibakteri dan antikanker. Aktivitas yang tinggi juga ditunjukkan oleh gugus dilakton atau ester yang merupakan gugus yang bersifat lipofilik (Hanafi 1997a). Berdasarkan hal tersebut, khususnya hubungan antara struktur kimia dan aktivitas hayati, maka dirancang strategi untuk mensintesis senyawasenyawa analog UK-3A dengan cara meragamkan posisi dan jenis gugus hidroksi pada cincin aromatik dan gugus dilakton pada senyawa UK-3A, dengan harapan akan diperoleh senyawa baru dengan bahan dasar yang cukup murah, tetapi memiliki aktivitas yang lebih tinggi (Hanafi & Thelma 1998).
Sintesis Senyawa Anolog UK-3A Telah dilaporkan bahwa senyawa UK-3A mempunyai aktivitas sebagai antimikrob, antifungal, dan sitotoksik terhadap beberapa sel kanker (Ueki et al. 1997a), seperti aktivitas yang ditunjukkan oleh senyawa Antimisin A3 (Liu et al. 2003). Aktivitas sitotoksik yang ditunjukkan oleh senyawa UK-3A masih dipandang kurang sehingga perlu dilakukan sintesis senyawa analog UK-3A yang diharapkan memiliki aktivitas yang lebih tinggi. Sintesis senyawa analog UK-3A dilakukan dengan memodifikasi atau memanipulasi struktur molekul senyawa UK-3A. Modifikasi struktur molekul ini bertujuan mendapatkan senyawa baru yang mempunyai aktivitas lebih tinggi, masa kerja lebih panjang, tingkat kenyamanan lebih besar, efek samping rendah, selektif, dan lebih stabil (Siswandono & Soekardjo 1995). Topliss telah mengembangkan petunjuk nonmatematis, nonstatistik, dan nonkomputer (Widodo 1998), yaitu dengan menggunakan prinsip pendekatan hubungan struktur dalam modifikasi struktur induk suatu molekul yang sudah diketahui aktivitasnya. Hal ini dilakukan sebagai upaya untuk mengoptimumkan aktivitas zat dengan efisien. Modifikasi molekul menurut pendekatan Topliss adalah dengan memasukkan gugus-gugus yang bersifat lipofilik dan sterik pada posisi tertentu pada suatu molekul induk, dengan ramalan akan menghasilkan senyawa yang memberikan aktivitas yang lebih tinggi, sama, atau lebih rendah dibanding aktivitas senyawa induk, kemudian dicari jalur sintesis yang paling menguntungkan. Sintesis senyawa analog UK-3A dicoba dilakukan dengan mengubah gugus dilakton rantai tertutup menjadi rantai terbuka dengan gugus yang mengandung rantai yang memiliki panjang yang berbeda-beda. Peragaman tersebut diharapkan akan memberikan informasi mengenai gugus yang berperan dalam meningkatkan aktivitas senyawa analog UK-3A. Perbedaan sifat lipofilik senyawa diharapkan dapat berpengaruh pada aktivitas hayatinya (Hanafi et al. 1999). Pembukaan cincin dilakton diharapkan dapat mempertinggi aktivitas senyawa ini. Reaksi pembukaan cincin pada UK-2A telah menghasilkan senyawa dengan aktivitas yang cukup tinggi (Usuki et al. 2006). Tahapan reaksi sintesis senyawa analog UK-3A dapat dilihat pada Gambar 2.
O N
N
OCH3
H N
DMAP
HCl.H2N
OH
+
OH
o
DCC/piridin,55 C, 24 jam
OH OH
OH
O
O
3-hidroksipikolinat
L-serin metil ester hidroklorida
O OCH3
3-hidroksipikolinil serin metil ester
N
O H N
RCOOH
O
R
o
DMAP, DCC/kloroform 37 C, 4 jam
OH
O O a : R = C4H9 b : R = C5H 11 c : R = C6H 13
OCH3 DCC = disikloheksilcarbodiimida DMAP = dmetil amino piridin
Gambar 2 Reaksi sintesis senyawa analog UK-3A (Shimano et al. 1998)
Reaksi yang terjadi dalam sintesis senyawa analog UK-3A adalah reaksi esterifikasi dan amidasi. Metode umum untuk sintesis ester adalah dengan mereaksikan alkohol dengan suatu asam karboksilat. Reaksi ini merupakan reaksi reversibel dan berlangsung lambat. Agar reaksi berjalan satu arah dan lebih cepat digunakan katalis asam. RCOOH
+
R'OH
R-COOR'
+
H2O
Agar reaksi menjadi sempurna, dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan menggunakan alkohol berlebih dan cara yang kedua dengan memisahkan air yang terbentuk agar tidak terjadi reaksi sebaliknya. Katalis yang biasa digunakan dalam reaksi esterifikasi adalah asam sulfonat dan asam klorida. Selain itu juga dapat digunakan asam p-toluena sulfonat (pTsOH), karbonil diimidazol (CDI), dan dimetil amino piridin (DMAP) (Carey & Sunberg 1990). Disikloheksilkarbodiimida (DCC) adalah suatu aktivator dalam reaksi pembentukan ester yang dapat mengubah asam karboksilat menjadi senyawa pengalkilasi yang reaktif. Bagian terpenting dari DCC adalah gugus imida yang memiliki atom karbon pusat yang kekurangan elektron setelah bereaksi dengan proton dari asam karboksilat sehingga dapat diserang oleh suatu agen nukleofilik dan membentuk spesies asilisourea. Gugus asilisourea ini sangat reaktif karena ikatan antara asil dan oksigen dapat mengubah ikatan rangkap karbon dan nitrogen dari isourea menjadi suatu gugus karbonil yang lebih stabil. Oleh karena itu pada akhir reaksi akan terbentuk ester dan disikloheksilurea (DCU) sebagai
hasil samping penggunaan DCC (March 1992). DCC secara luas juga dikenal berperan dalam pembentukan amida dan sintesis polipeptida dari asam amino (Kurzer & Zadeh 1967). Aktivator DCC umumnya digunakan untuk menggabungkan asam karboksilat dengan amina yang menghasilkan amida. DMAP (4-N,N-dimetilaminopiridin) merupakan suatu katalis nukleofil yang memiliki efek yang cukup kuat. Gugus dimetilamino berfungsi sebagai suatu substituen donor elektron yang meningkatkan sifat basa dari nitrogen piridin (Carey & Sunberg 1990). Katalis DMAP dapat dikombinasikan dengan aktivator DCC menghasilkan metode yang berguna untuk meragamkan asam karboksilat agar dapat bereaksi dengan alkohol untuk menghasilkan ester.
Perkembangan Sintesis Senyawa Analog UK-3A Modifikasi struktur yang telah banyak digunakan dalam sintesis senyawa analog UK-3A dan UK-2A adalah dengan cara mengubah gugus dilakton cincin beranggota sembilan menjadi rantai terbuka dan meragamkan panjang rantai alifatik (Usuki et al. 2006). Perbedaan gugus aktif akan mempengaruhi aktivitas yang ada pada suatu senyawa. Hal ini telah diteliti, yaitu dengan mempelajari perbedaan aktivitas pada senyawa UK-2A dan UK-3A (Ueki et al. 1997b). Senyawa analog UK-3A yang berhasil disintesis pada tahun 1997 adalah senyawa 1-9. Asetilasi senyawa 1 (3-hidroksipikolinil metil serin ester) dengan anhidrida asetat menghasilkan senyawa 2. Sementara itu, esterifikasi senyawa 1, masing-masing dengan asam 3-fenil propionat, asam heksanoat, dan asam oktanoat menghasilkan senyawa 3, 4, dan 5 (Hanafi et al. 1997b). Senyawa 7, 8, dan 9 diperoleh dengan mereaksikan senyawa 6 (3-hidroksipikolinil etil serin ester) masing-masing dengan asam 3-fenilpropionat, asam heksanoat, dan asam oktanoat (Hanafi et al. 1997c). Reaksi pembentukan senyawa 1-5 dan 6-9 dapat dilihat pada Gambar 3 dan 4.
HCl.H 2N
N OH
H N
DCC/DMAP
+ O
OH
N
OH
OH
o
piridin, 55 C 24 jam
OCH 3
O
OH
O O
OCH 3
1 N
RCOOH DCC/DMAP
1
H N
CH 2Cl2, 25 oC, 2 jam *
OR OH
Ac2O, piridin, DMAP
O O
OCH 3
2 * : R = CH 3CO3 : R = PhCH2CH2CO4 : R = C5H11CO5 : R = C7H15CO-
Gambar 3 Reaksi sintesis senyawa 1-5 (Hanafi et al. 1997b)
HCl.H 2N
N OH
H N
DCC/DMAP
+ O
OH
N
OH
OH
o
piridin, 55 C 24 jam
O
O
OH
O O
O
6
6
N
RCOOH DCC/DMAP
H N OR
o
CH 2Cl 2, 25 C, 2 jam OH
O O
O
7 : R = PhCH2CH2CO8 : R = C5H11CO9 : R = C7H15CO-
Gambar 4 Reaksi sintesis senyawa 6-9 (Hanafi et al. 1997c)
Uji aktivitas antibiotika senyawa 1-5 terhadap pertumbuhan beberapa jenis spesies bakteri dan jamur dilakukan pada berbagai konsentrasi antara 100 sampai 2000 ppm dengan Antimisin A3 sebagai kontrol positif. Hasil uji aktivitas senyawa 1 menunjukkan aktivitas
dalam menghambat pertumbuhan bakteri
Bacillus cereus, Arthrobacter simplex, dan Acetobacter aceti sampai konsentrasi 1000 ppm. Senyawa 2 aktif menghambat pertumbuhan bakteri A. simplex sampai konsentrasi 100 ppm. Senyawa 3 sampai dengan konsentrasi ≥ 500 ppm aktif terhadap Escherichia coli, Staphylococcus aureus, B. substilis, B. licheriformis, dan Mycobacterium
phlei. Uji aktivitas senyawa 6-9 menunjukkan bahwa
semakin panjang rantai alifatik pada gugus ester kemampuan dalam menghambat
pertumbuhan bakteri juga meningkat sampai dengan konsentrasi 100 ppm untuk senyawa 7, yaitu terhadap B. steorothermophillus. Agar pembentukan senyawa analog UK-3A menghasilkan rendemen yang tinggi, maka dilakukan optimasi. Optimasi dilakukan dengan cara meragamkan penggunaan katalis dan aktivator. Selain itu juga dilakukan ragam kondisi reaksi, yaitu suhu dan waktu reaksi (Hanafi et al. 1997d). Penelitian mengenai sintesis senyawa analog UK-3A oleh Sherley (1998), menghasilkan senyawa 10, 11, dan 12 (Gambar 5). Hasil uji aktivitas menyatakan bahwa senyawa 10 aktif menghambat pertumbuhan B. substilis, S. aereus, dan C. albicans pada konsentrasi 1000 ppmb sedangkan pada E. coli dapat dihambat pada 500 ppm. Senyawa 11 menghambat E. coli pada 250 ppm, B. substilis sampai 2000 ppm dan 1000 ppm aktif terhadap S. aereus dan C. albicans. Senyawa 12 aktif menghambat pertumbuhan E. coli dan C. albicans dengan konsentrasi 75 ppm dan 250 ppm terhadap B. substilis.
N
N
O
O H N
H N
O
O OH
OH
O O
O
10
R
O O
O
11 : R = C 6H5C 2H4 12 : R = C 7H15
Gambar 5 Senyawa 10, 11, dan 12 (Sherley 1998)
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dicoba untuk mensintesis senyawa analog UK-3A dengan memodifikasi panjang rantai alifatik pada gugus ester, yaitu dengan rantai pentil, heksil, dan heptil
kemudian melakukan uji
aktivitas senyawa hasil sintesis terhadap sel kanker Murine leukemia P-388.
Aktivitas Hayati Senyawa UK-3A Senyawa UK-3A telah diuji aktivitasnya sebagai antimikrob dan telah terbukti menghambat pertumbuhan khamir dan filamen fungi. Selain itu, sitotoksisitas senyawa UK-3A dan Antimisin A3 telah diuji secara in vitro terhadap sel murnine leukemia (P-388), mouse melanoma (B-16), human oral
epidermoid carcinomai (KB), human colon adenocarcinoma (COLO201), dan mouse fibroblast (3T3). Data hasil yang diperoleh, Antimisin A3 terbukti dapat menghambat pertumbuhan sel kanker dengan IC 50 0,015-0,063 µg/mL, kecuali pada sel 3T3. Senyawa UK-2A dan UK-3A memperlihatkan hasil efek sitotoksisitas yang tidak signifikan dengan IC50 masing-masing 18-100 dan 17100 µg/mL (Ueki et al. 1997a). Uji aktivitas senyawa UK-3A sebagai antimikrob telah dilakukan oleh Ueki et al. (1997a). Hasil penelitian ini adalah senyawa UK-3A tidak memperlihatkan aktivitas penghambatan pertumbuhan bakteri Gram positif dan Gram negatif sampai konsentrasi 100 µg/mL. Akan tetapi senyawa UK-3A dapat menghambat pertumbuhan beberapa jenis khamir dan filamen fungi. Data yang diperoleh merupakan perbandingan aktivitas senyawa UK-3A, UK-2A, dan Antimisin A 3, yaitu spektrum antimikrob dari senyawa ini hampir mirip. Penelitian lain mengenai uji aktivitas senyawa UK-2A, UK-3A, dan analognya sebagai antifungal telah dilakukan oleh Shimano et al. (1998). Senyawa ini tidak begitu memperlihatkan aktivitas antifungal yang tinggi karena baru memperlihatkan aktivitas sebagai antifungal pada konsentrasi > 100 µg/mL. Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A juga telah diuji terhadap beberapa sel kanker, di antaranya oleh Ueki et al. (1997a) mengenai fermentasi, isolasi, elusidasi struktur, dan uji aktivitas antibiotik senyawa UK-3A dari Streptomyces sp. 517-02. Hasil uji sitotoksisitas senyawa UK-3A dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A, UK-2A, dan Antimisin A3 (Ueki et al. 1997a) IC50 (µg/mL) Senyawa
P-388
UK-3A 38 UK-2A 100 Antimisin A 3 0,015 IC50 = Inhibition Concentration
B-16
KB
18 100 0,02
20 17 0,063
COLO201
3T3
45 35 0,018
100 100 15
Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A juga telah dilaporkan oleh Shimano et al. (1998). Senyawa ini diujikan terhadap 3 macam sel kanker, yaitu sel human embrionic lung fibroblast (HEL), sel murine laukemia (P-388), dan sel mouse lymphoma (EL-4). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa senyawa UK-3A mempunyai aktivitas sitotoksik yang mirip dengan UK-2A, tetapi lebih rendah dari Antimisin A 3. Data hasil uji aktivitas sitotoksik dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2 Aktivitas sitotoksik (Shimano et al. 1998) ED50 (µg/mL) Organisme uji
UK-2A (7R)-UK-2A
HEL 74 P-388 37 EL-4 23 ED50 = Effective Dose
57 80 76
UK-3A (7R)-UK-3A Antimisin A3 38 14 7,6
51 74 > 100
12 < 0,05 < 0,05
Leukemia Leukemia merupakan salah satu jenis kanker yang terbentuk pada jaringan darah. Leukemia berasal dari bahasa Yunani, yang berarti darah putih. Leukemia pertama kali ditemukan pada tahun 1847 oleh Rudolf Virchow, seorang ahli patologi dari Jerman. Penemuan ini diawali dari adanya ketidaknormalan jaringan pada sumsum tulang belakang. Kelainan ini disebabkan oleh mutasi DNA (Princeton University 2001). Sel leukemia dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6 Sel kanker leukemia (Princeton University 2001)
Sel sumsum tulang belakang berfungsi untuk memproduksi sel darah merah dan sel darah putih, yang masing-masing sebagai pembawa oksigen dan melawan penyakit yang menyerang tubuh. Adanya kelainan pada sumsum tulang
belakang akan menyebabkan produksi sel darah merah dan sel darah putih mengalami kelainan Leukemia dapat dikelompokkan berdasarkan banyaknya sel yang tidak normal yang terdapat dalam darah. Pengelompokan ini terdiri atas 4, yaitu acute lymphocytic leukemia (ALL), acute myelogenous leukemia (AML), chronic lymphocytic leukemia (CLL), dan chronic myelogenous leukemia (CML). Ciri leukemia akut dapat dilihat dari laju pertumbuhan sel darah yang belum matang dan akan lebih cepat mati, yaitu antara 1 sampai 5 bulan. Leukemia kronis dapat dibedakan berdasarkan adanya kelebihan jumlah sel darah yang telah matang, tetapi tidak normal. Sel ini akan hidup lebih lama dan jumlah sel darah putih yang terbentuk dalam darah sangat banyak (ICON Group International, 2004).
