4
TINJAUAN PUSTAKA Kelapa Sawit (Elaeis guineensis) Kelapa sawit berbentuk pohon. Tingginya dapat mencapai 24 meter. Akar serabut tanaman kelapa sawit mengarah ke bawah dan samping. Selain itu juga terdapat beberapa akar napas yang tumbuh mengarah ke samping atas.
Gambar 1. Kelapa sawit Afrika (Elaeis guineensis)
Seperti jenis palma lainnya, daunnya tersusun majemuk menyirip. Daun berwarna hijau tua dan pelepah berwarna sedikit lebih muda. Penampilannya agak mirip dengan tanaman salak, hanya saja dengan duri yang tidak terlalu keras dan tajam. Batang tanaman diselimuti bekas pelepah hingga umur 12 tahun. Setelah umur 12 tahun pelapah yang mengering akan terlepas sehingga penampilan menjadi mirip dengan kelapa. Tanaman Kelapa Sawit (Elaeis gunensis) termasuk kedalam Family Arecaceae, Ordo Arecales, dan Genus Elaeis. Bunga jantan dan betina terpisah namun berada pada satu pohon (monoecious diclin) dan memiliki waktu pematangan berbeda sehingga sangat
5
jarang terjadi penyerbukan sendiri. Bunga jantan memiliki bentuk lancip dan panjang sementara bunga betina terlihat lebih besar dan mekar. Buah sawit mempunyai warna bervariasi dari hitam, ungu, hingga merah tergantung bibit yang digunakan. Buah bergerombol dalam tandan yang muncul dari tiap pelapah. Minyak dihasilkan oleh buah. Kandungan minyak bertambah sesuai kematangan buah. Setelah melewati fase matang, kandungan asam lemak bebas (FFA, free fatty acid) akan meningkat dan buah akan rontok dengan sendirinya. Buah terdiri dari tiga lapisan:
Eksoskarp, bagian kulit buah berwarna kemerahan dan licin.
Mesoskarp, serabut buah
Endoskarp, cangkang pelindung inti
Inti sawit (kernel, yang sebetulnya adalah biji) merupakan endosperma dan embrio dengan kandungan minyak inti berkualitas tinggi. Kelapa sawit berkembang biak dengan cara generatif. Buah sawit matang pada kondisi tertentu embrionya akan berkecambah menghasilkan tunas (plumula) dan bakal akar (radikula). Syarat hidup Kelapa Sawit Habitat aslinya adalah daerah semak belukar. Sawit dapat tumbuh dengan baik di daerah tropis (15° LU - 15° LS). Tanaman ini tumbuh sempurna di ketinggian 0-500 meter dari permukaan laut dengan kelembaban 80-90%. Sawit membutuhkan iklim dengan curah hujan stabil, 2000-2500 mM setahun, yaitu daerah yang tidak tergenang air saat hujan dan tidak kekeringan saat kemarau. Pola curah hujan tahunan memperngaruhi perilaku pembungaan dan produksi buah sawit. Tipe kelapa sawit Kelapa sawit yang dibudidayakan terdiri dari dua jenis: E. guineensis dan E. oleifera. Jenis pertama adalah yang pertama kali dan terluas dibudidayakan orang. E. oleifera sekarang mulai dibudidayakan pula untuk menambah keanekaragaman sumber daya genetik.
6
Penangkar seringkali melihat tipe kelapa sawit berdasarkan ketebalan cangkang, yang terdiri dari :
Dura,
Pisifera, dan
Tenera.
Dura merupakan sawit yang buahnya memiliki cangkang tebal sehingga dianggap memperpendek umur mesin pengolah namun biasanya tandan buahnya besar-besar dan kandungan minyak per tandannya berkisar 18%. Pisifera buahnya tidak memiliki cangkang namun bunga betinanya steril sehingga sangat jarang menghasilkan buah. Tenera adalah persilangan antara induk Dura dan jantan Pisifera. Jenis ini dianggap bibit unggul sebab melengkapi kekurangan masingmasing induk dengan sifat cangkang buah tipis namun bunga betinanya tetap fertil. Beberapa tenera unggul memiliki persentase daging per buahnya mencapai 90% dan kandungan minyak per tandannya dapat mencapai 28%. Untuk pembibitan massal, sekarang digunakan teknik kultur jaringan. Hasil tanaman Minyak sawit digunakan sebagai bahan baku minyak makan, margarin, sabun, kosmetika, dan industri farmasi. Minyak sawit dapat digunakan untuk beragam peruntukan karena keunggulan sifat yang dimilikinya yaitu tahan oksidasi dengan tekanan tinggi, mampu melarutkan bahan kimia yang tidak larut oleh bahan pelarut lainnya, mempunyai daya melapisi yang tinggi dan tidak menimbulkan iritasi pada tubuh dalam bidang kosmetik. Bagian yang paling populer untuk diolah dari kelapa sawit adalah buah. Bagian daging buah menghasilkan minyak kelapa sawit mentah yang diolah menjadi bahan baku minyak goreng dan berbagai jenis turunannya. Kelebihan minyak nabati dari sawit adalah harga yang murah, rendah kolesterol, dan memiliki kandungan karoten tinggi. Minyak sawit juga diolah menjadi bahan baku margarin.
7
Minyak inti menjadi bahan baku minyak alkohol dan industri kosmetika. Bunga dan buahnya berupa tandan, bercabang banyak. Buahnya kecil, bila masak berwarna merah kehitaman. Daging buahnya padat. Daging dan kulit buahnya mengandung minyak. Minyaknya itu digunakan sebagai bahan minyak goreng, sabun, dan lilin. Ampasnya dimanfaatkan untuk makanan ternak. Ampas yang disebut bungkil inti sawit itu digunakan sebagai salah satu bahan pembuatan makanan ayam. Tempurungnya digunakan sebagai bahan bakar dan arang. Buah diproses dengan membuat lunak bagian daging buah dengan temperatur 90 °C. Daging yang telah melunak dipaksa untuk berpisah dengan bagian inti dan cangkang dengan pressing pada mesin silinder berlubang. Daging inti dan cangkang dipisahkan dengan pemanasan dan teknik pressing. Setelah itu dialirkan ke dalam lumpur sehingga sisa cangkang akan turun ke bagian bawah lumpur. Sisa pengolahan buah sawit sangat potensial menjadi bahan campuran makanan ternak dan difermentasikan menjadi kompos. Penyakit Busuk Pangkal Batang Kelapa Sawit Gejala dini penyakit ini sukar dideteksi karena perkembangannya sangat lambat. Gejala mudah dilihat apabila sudah membentuk tubuh buah, akibatnya tindakan pengendalian sudah sulit untuk dilakukan. Pada tanaman yang belum menghasilkan gejala yang muncul adalah daun kuning kemudian mengering dan nekrosis (kematian sel) dari pelepah bawah terus ke pelepah atas dan akhirnya semua bagian tanaman mengering dan mati. Gejala pada tanaman menghasilkan lebih mudah ditemukan yaitu daun menguning pucat. Pada gejala labih lanjut ditandai dengan patahnya pelepah bagian bawah dan menggantung. Pada pangkal batang atau bagian tengah tanaman kelapa sawit mengalami pembusukan yang kadang-kadang diikuti tumbuhnya tubuh buah Ganoderma. Tetapi tidak semua tanaman bergejala menghasilkan tubuh buah, bahkan tidak ada gejala sedikitpun. Secara tiba-tiba pohon kelapa sawit tumbang dan bagian dalam batang telah mengalami pembusukan. Selain itu juga ada gejala internal yaitu terjadinya pembusukan di pangkal batang. Pada jaringan batang yang busuk, lesio (jaringan abnormal) tampak sebagai daerah berwarna coklat muda disertai adanya daerah gelap berbentuk pita tak beraturan. Pita ini sering disebut sebagai zona reaksi yang
8
mengandung getah. Secara mikroskopis gejala internal akar yang terserang Ganoderma mirip pada batang yang terinfeksi. Jaringan korteks akar yang sakit berubah warna dari putih menjadi coklat. Pada serangan yang sudah lanjut, jaringan korteks rapuh dan mudah hancur. Penyebab penyakit busuk pangkal batang kelapa sawit di Indonesia adalah jamur Ganoderma boninense. Penularan penyakit ini sebagian besar melalui mekanisme kontak akar sawit sakit dan sangat kecil melalui basidiospora.
Gambar 2. Mekanisme dan penyebaran Ganoderma boninense Di dalam tanah Ganoderma tumbuh menjadi berukuran besar melalui perantaraan akar tanaman sawit. Semula satu tanaman terinfeksi di bagian perakarannya. Karena akar tanaman sawit yang sudah dewasa saling bertemu dan membentuk bantalan perakaran seluas perkebunan itu sendiri, maka Ganoderma yang semula berukuran 4 m x 4 m x 1 m dengan mudah tumbuh membesar pada bantalan perakaran sawit di bawah permukaan tanah. Apalagi bahan tanaman kelapa sawit yang dikembangkan di Indonesia diketahui peka terhadap serangan Ganoderma. Ketika pangkal batang terserang, cepat atau lambat tanaman akan mati. Pada pangkal batang yang terserang sering terbentuk tubuh Ganoderma umumnya berbentuk cakram dan bertekstur menyerupai kayu, bagian atas licin berwarna cokelat muda sampai cokelat gelap sedangkan bagian permukaan bawahnya kasar berwarna krem, tempat di mana jutaan spora diproduksi (Paterson, 2007).
9
Gambar 3. Ganoderma boninense Para pekebun sering salah persepsi bahwa ukuran Ganoderma hanya sebesar tubuh buah yang terbentuk, kurang lebih sebesar cawan. Padahal kalau dibandingkan dengan ukuran sebenarnya, tubuh buah Ganoderma dapat diibaratkan hanya merupakan rambut-rambut kecil monster raksasa. Dengan demikian ketika tubuh buah dimatikan, Ganoderma yang ukurannya sebesar kapal selam tidak akan mati. Tunggul-tunggul tanaman yang terserang merupakan urat nadi Ganoderma, karena merupakan tempat di mana Ganoderma bertahan hidup ketika tanaman sudah mati. Serangan monster Ganoderma cenderung meningkat dari tahun ke tahun dan dari generasi ke generasi. Satu generasi tanaman kelapa sawit adalah 25 tahun. Dari hasil pengamatan kondisi serangan pada beberapa lokasi perkebunan kelapa sawit diduga tingkat serangan rata-rata Ganoderma mencapai 5%. Penyakit busuk pangkal batang kelapa sawit, khususnya untuk daerah Sumatra Utara mencapai 80% pada tanaman tua generasi 3. Diperkirakan secara nasional jumlah tanaman kelapa sawit yang mati berkisar 50%.
10
Tabel 1. Data dari kejadian busuk pangkal batang kelapa sawit di Sumatra Utara yang berkorelasi dengan generasi kebun kelapa sawit (TBM : tanaman belum menghasilkan; TM : Tanaman Menghasilkan; T : Tanaman Tua)
Desain Primer untuk Gateway Pemilihan primer oligonukletida berguna untuk polymerase chain reaction (PCR), hibridisasi oligo dan sekuensing DNA. Desain primer yang tepat merupakan salah satu faktor penting dalam keberhasilan isolasi gen dan sekuensing DNA. Syarat oligonukleotida dapat digunakan sebagai primer untuk PCR bergantung pada beberapa faktor yakni, pergerakan asosiasi dan disosiasi template primer ganda pada suhu penempelan primer dan pemanjangan primer, kestabilan ganda nukleotida mismatched dan lokasinya, efisiensi polimerase yang dapat mengenali dan memperpanjang mismatched duplex (Abd-Elsalam 2003). Desain yang benar dari primer attB untuk amplifikasi, pengklonan, dan ekspresi gen dalam Gateway membutuhkan pertimbangan penempatan yang tepat dari unsur ekspresi protein (pengenalan sekuens ribosom, start kodon, stop kodon, reading frame consideration) ke situs rekombinasi. Posisi yang tepat dari unsur ekspresi ditentukan oleh bentuk dari protein (native, N-terminal fusion, Cterminal fusion). Informasi penurunan attB1 atau peningkatan attB2 harus termasuk dalam amplikasi sekuens primer. Desain primer attB1 dan attB2 perlu memperhatikan poin utama, yakni bentuk protein yang akan diekspresikan (native, N-terminal fusion, C-terminal fusion). Hal ini akan menentukan posisi start kodon
11
yang berkonstribusi dengan destination vector untuk N-terminal fusion atau termasuk dalam penurunan hasil PCR dari attB1 untuk native atau C-terminal fusion, stop kodon yang berkontribusi dengan destination vector untuk C-terminal fusion atau termasuk dalam peningkatan hasil PCR dari attB2 untuk native atau Nterminal fusion. Metode Teknologi Gateway Teknologi Gateway merupakan metode kloning secara universal yang berdasarkan pada rekombinasi bagian site-specific dari bacteriophage lamda (Landy 1989). Teknologi Gateway menyediakan teknik yang cepat dan begitu efisien untuk memindahkan sekuen DNA ke berbagai sistem vektor untuk dilakukannya analisis fungsional dan ekspresi protein (Hartley et al,2000). Restrction Endonuclease Digestion and Ligation
PCR
cDNA Library
Gambar 4. Transfer DNA teknologi Gateway ke berbagai sistem vektor Keuntungan dengan menggunakan teknologi Gateway :
Dapat diperoleh hasil dengan cepat dan begitu efisien dalam transfer sekuen DNA kedalam berbagai sistem vektor untuk ekspresi protein dan analisis fungsional disaat yang sama bisa mempertahankan orientasi dan reading frame.
12
Memungkinkan penggunaan dan ekspresi dari berbagai tipe sekuen DNA (misalnya dari hasil PCR, clone cDNA, atau dari fragment restriksi).
Memudahkan pemindahan sejumlah besar sekuen DNA ke berbagai destination vector (lihat tabel 4).
Sangat cocok untuk adaptasi pada high-throughput (HTP) format.
Memungkinkan pengkorversian dari vektor yang kita miliki kedalam destination vector (lihat tabel 4).
Teknologi Gateway yang berdasarkan pada rekombinasi bacteriophage lambda site-specific ini difasilitasi dengan integrasi lambda ke dalam kromosom E. Coli dan di switch diantara jalur lytic dan lysolitic (Ptashne 1992). Pada teknologi Gateway, komponen dari sistem rekombinasi lamda telah dimodifikasi untuk meningkatkan spesifitas dan efisiensi pada sistem (Bushman et al, 1985). Rekombinasi berbasiskan lambda ini melibatkan dua komponen penting :
Sekuen DNA rekombinan (att sites) dan
Protein perantara pada reaksi rekombinasi ini (misalnya Clonase enzyme mix).
Interegasi lambda kedalam kromosom E. coli terjadi dengan melalui rekombinasi DNA intermolekular yang ditengahi oleh suatu campuran dari lambda dan rekombinasi protein E.coli-encoded. Berikut ini garis besar rekombinasi lambda :
Rekombinasi terjadi diantara bagian spesifik attachment (att) pada molekul DNA yang berinteraksi.
Rekombinasi berlangsung secara konservatif (misalnya tidak terjadi penambahan atau pengurangan dari nukleotida) dan tidak dibutuhkan sintesis DNA. Segment DNA mengapit bagian rekombinasi yang di swicth, setelah itu bagian att menjadi sekuen hybrid yang terdiri dari sekuen yang diberikan oleh masing-masing
parental vector.
Contohnya, attL sites terdiri dari sekuen yang berasal dari attB dan attP sites.
Pertukaran untai terjadi pada suatu wilayah inti pada semua att sites.
13
Rekombinasi dapat terjadi antara DNA dari topologi apa saja (misalnya supercoiled, linear, atau relaxed) dengan efisiensi yang bervariasi.
Rekombinasi lambda terjadi diantara bagian site-specific attachment (att) : attB pada kromosom E.coli dan attP pada kromosom lambda. Bagian att berfungsi sebagai binding site untuk rekombinasi protein yang berguna pada protein rekombinasi dan telah dikarakterisasi dengan baik (Weiberg & Landy 1983). Pada saat integrasi lambda, rekombinasi terjadi diantara bagian attB dan attP untuk menghasilkan bagian attL dan attR. Crossover sebenarnya terjadi diantara 15 bp homolog core regions pada kedua bagian, tetapi bagaimanapun juga daerah disekitar core regions sangat diperlukan karena mempunyai bagian binding sites untuk keperluan protein rekombinasi (Landy 1989). Protein Rekombinasi Rekombinasi lambda dikatalisis oleh sejenis campuran enzim yang dapat mengikat pada sekuen spesifik (daerah att), yang menyatukan daerah target, membelah mereka, dan secara kovalen melekatkan DNA. Rekombinasi terjadi setelah dua pasang untai bertukar dan DNA ligasi membentuk bentuk baru. Jalur lysogenic dikatalisis oleh protein bacteriophage λ Integrase (Int) dan E.coli Integration Host Factor (IHF)(Enzim BP Clonase Mix) semantara pada jalur lytic dikatalis oleh protein bacteriophage λ int dan Excisionase (Xis), dan protein E.coli Integration Host Factor (IHF)(LR Clonase enzyme mix). Tabel 2. Jalur lysogenic dan lytic
Reaksi Rekombinasi Gateway Teknologi gateway menggunakan sistem rekombinasi lambda untuk menfasilitasi pemindahan sekuen heterologous DNA (yang diapit oleh att site yang termodifikasi) diantara vektor (Harley et al, 2000). Ada dua reaksi rekombinasi yang merupakan basis dari teknologi Gateway :
Reaksi BP : menfasilitasi rekombinasi dari subtrat attB (produk attB PCR atau suatu clone attB expression) dengan subtrat attP (donor vector) untuk
14
menghasilkan attL yang mempunyai entry clone (lihat diagram di bawah). Reaksi ini dikatalisis oleh BP Clonase enzyme mix.
Gambar 5. Reaksi BP
Reaksi LR : menfasilitasi rekombinasi dari subtrat attL (entry clone) dengan subtrat
attR (destination vector) untuk menghasilkan attB
yang mempunyai expression clone (lihat diagram di bawah). Rekasi ini dikatalisis oleh LR Clonase enzyme mix.
Gambar 6. Reaksi LR Daerah rekombinasi wild-type λ att telah dimodifikasi untuk meningkatkan efisiensi dan spesifikasi dari reaksi rekombinasi gateway BP dan LR. Bagian berikut ini akan menggambarkan modifikasi dan
contoh bagaimana reaksi
rekombinasi Gateway antara bagian attB x attp dan attL x attR. Tabel 3. Dareah modifikasi pada att
Modifikasi pada daerah att
15
Dalam sistem Gateway,daerah rekombinasi wild-type λ att telah di modifikasi seperti dibawah ini untuk meningkatkan efisiensi dan spesifitas dari reaksi rekombinasi Gateway BP dan LR:
Telah dilakukan mutasi pada core regions dari daerah att untuk menhapus kodon stop dan memastikan speksifitas dari reaksi rekombinasi untuk mempertahankan orientasi dan reading frame.
Mutasi telah di ketahui pada daerah pendek (5 bp) yang mengapit 15bp core region dari daerah attB untuk memperkecil formasi struktur secondary pada bentuk untai tunggal dari plasmid attB (misalnya phagemid ss(single strand)DNA atau m(messenger)RNA)
Bagian 43 bp dari daerah att telah dihilangkan untuk in vitro reaksi attL x attR irreversible dan lebih efektif (Bushman et al, 1985).
Sebagai tambahan penjelasan modifikasi diatas, titik mutasi site-specific telah dibuat dengan beberapa daerah att
untuk meningkatkan efisiensi
rekombinasi. Sebagai hasilnya, variasi sekuen bisa ada hampir diseluruh daerah att. Contohnya, pDONR 201 attP1 sedikit bervariasi sekuennya dari pDONR 221 attP1. Variasi sekuen ini tidak memberikan efek spesifik dari reaksi rekombinasi atau fungsionalitas vektor. Modifikasi daerah att mengikuti karakterisasi dan spesifitas. Diagram (Gambar 7) di bawah menggambarkan reaksi rekombinasi BP antara produk attB-PCR dan vektor pDONR221 atau pDONR/Zeo untuk menghasilkan entry clone dan produk sampingannya. Fitur-fitur dari daerah rekombinasi :
Pada daerah yang terasir berhubangan dengan transfer sekuens dari produk attbB-PCR kedalam entry clone selama rekombinasi. Sebagai catatan bahwa daerah attL tersusun dari sekuen attB dan attP.
Daerah yang dikota berhubungan denga transfer sekuen dari pDONR221 atau pDONR/ZEO kedalam produk samping selama rekombinasi.
16
Gambar 7. Reaksi BP menghasilkan entry clone
Tabel 4. Perbedaan tiga tipe dari vektor yang di adopsi Gateway : Vektor Gateway Vector Donor
Entry vector
Destination vector
Karakteristik Mempunyai daerah attP Digunakan pada klon produk PCR yang diapit attB Mempunyai daerah attL Digunakan pada klon produk PCR atau fragmen restriction yang tidak mempunyai daerah att untuk menghasilkan entry clone Mempunyai daerah attR Direkombinasikan dengan entry clone pada reaksi LR untuk menghasilkan suatu expression clone Mempunyai elemen yang diperlukan untuk mengekspresi gen yang kita inginkan dari sistem yang sesuai (misalnya E.coli, mamalia, serangga, ragi).
17
Untuk memungkinkan kloning secara rekombinasi ini dan efisiensi pemilihan dari entry dan expression clone, kebanyakan vektor gateway mempunyai dua daerah att yang diapit suatu pita yang berisi : Gen ccdB untuk kontrol negatif ( ada pada donor, destination, dan supercoiled entry vector) Gen tahan terhadap Cloramphenicol (CmR) counterselection (ada pada donor dan destination vectors ) Setelah reaksi rekombinasi BP dan LR, pita ini digantikan dengan gen yang kita miliki untuk menghasilkan entry clone dan expression clone, berlaku untuk masing-masing. Kehadiran gen ccdB memungkinkan kontrol negatif pada donor dan destination (beberapa pada entry) vectors dalam E.coli bersamaan dengan tahap rekombinasi dan transformasinya. Protein ccdB terganggu dengan adanya DNA gyrase E.coli (Bernard & Couturier 1992), dengan demikian menghambat pertumbuhan hampir semua strain E.coli (misalnya DH5α™, TOP10). Pada saat rekombinasi (misalnya antara destination vector dan entry clone atau donor vector dan produk attB-PCR), gen ccdB digantikan dengan gen milik kita. Sel yang mengambil vektor tak beraksi dar
i
gen
ccdB
atau molekul produk sampingan yang mempunyai gen ccdB akan gagal untuk bertumbuh. Hal ini memungkinkan efisiensi yang tinggi untuk mendapatkan klone yang kita inginkan. Karena efek yang mematikan dari protein ccdB, semua vektor Gateway mempunyai gen ccdB yang harus disebarkan pada stain E.coli yang tahan terhadap efek dari ccdB. Di rekomendasikan menggunakan strain E.coli DB3.1 yang mempunyai suatu mutasi pada gyrase-nya (gyrA463) yang membuatnya tahan terhadap efek dari ccdB (Bernard & Couturier 1992; Bernard et al 1993; Miki et al, 1992).
18
Tabel 5. Tatanama vektor dan klone dari Gateway bisa dilihat dari tabel di bawah ini. Tipe Plasmid
Keterangan
Penamaan vektor atau klone
attL Vector
Entry clone
pENTR1, 2,...
attL Subclone
Entry clone
pENTR3-gus,...;pENTR221-gus
Angka 3 menunjukan entry vector
221 menunjukan donor vector yang digunakan untuk membuat entry clone
Gus merupakan subclone gene attR Vector
Destination Vector
pDEST1, 2, 3,...;p...-DEST
attB Vector
Expression Vector
pEXP501, 502, ...
Vektor ini digunakan untuk mempersiapkan ekspresi cDNA libraries attB Subclone
Expression Clone
pEXP14-cat,...;pcDNA/GW-47/cat
14 dan 47 menunjukan destination vector (yaitu pDEST14, dan pcDNA-DEST47) yang digunakan untuk membuat expression clone
Cat adalah subclone gen attP Vector
Donor Vector
pDONR201, 221, . . .
1. pENTR201-tet x pDEST14 pEXP14-tet 2. pENTR221-cat x pcDNA-DEST47 pcDNA/GW-47/cat 1. PCR produk attB-p53 x pDONR221 pENTR221-p53 2. pEXP14-lacZ x pDONR201 pENTR201-lacZ
19
Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik. Secara alami, A tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotiledon melalui bagian tanaman yang terluka sehingga menyebabkan tumor mahkota empedu (crown gall tumor). Bakteri yang tergolong ke dalam gram negatif ini memiliki sebuah plasmid besar yang disebut plasmid-Ti yang berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi bakteri ini pada tanaman (Gustavo 1998). Untuk memulai pembentukan tumor, A tumefaciens harus menempel terlebih dahulu pada permukaan sel inang dengan memanfaatkan polisakarida asam yang akan digunakan untuk mengkoloniasi/menguasai sel tanaman (Madigan 2000). Selain tanaman dikotil, tanaman monokotil seperti jagung, gandum, dan tebu telah digunakan untuk memasukkan sel asing ke dalam genom tanaman. A tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik. Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme (Sambrook et al, 2001). Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.
20
Gambar 8. Alat pengatur suhu reaksi yang biasanya digunakan pada teknik PCR Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30 kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus: Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, 94–96 °C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi template (patokan) bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA template yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45– 60°C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan primer di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polimerase (ditunjukkan oleh P pada gambar) yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 °C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit. Setelah tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi template bagi
21
primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial.
Gambar 9. Skematik siklus PCR. Garis biru menandakan template DNA dan garis merah merupakan primer.
Teknik ini juga didukung oleh beberapa komponen pereaksi yang memiliki
fungsi
khusus,
yaitu
Taq
DNA
polimerase,
cetakan
DNA,
oligonukleotida primer, deoxynucleotide triphosphate (dNTP), dan larutan bufer. Taq DNA polimerase merupakan enzim tahan panas yang diisolasi dari bakteri termofilik Thermus aquaticus, enzim ini akan mengkatalisis proses PCR. Primer merupakan oligonukleotida yang menempel pada daerah spesifik yang diinginkan. Oligonukleotida yang digunakan sebagai primer paling sedikit merupakan gabungan dari 16 pasang basa, disarankan menggunakan 20-24 pasang basa. Primer yang terlalu pendek tidak menempel secara spesifik sehingga akan terjadi penggandaan pada daerah yang tidak spesifik pula sedangkan primer yang terlalu panjang akan sulit untuk menempel pada cetakan DNA sehingga amplifikasi tidak terjadi. Keberadaan dNTP dan konsentrasi larutan bufer dalam reaksi PCR, dapat mempengaruhi spesifitas amplikon. Reaksi PCR membutuhkan suatu bufer yang
22
mengandung MgCl2 karena aktivitas enzim polimerase dipengaruhi oleh konsentrasi ion Mg2+. Ion Mg2+ akan menyetimulasi aktivitas enzim secara maksimal pada konsentrasi 2 mM jika konsentrasinya lebih tinggi, maka dapat bersifat inhibitor (Sambrook & Russell 2001). Salah satu kegunaan PCR adalah untuk identifikasi suatu gen atau DNA yang spesifik. Identifikasi keberadaan suatu gen dapat dilakukan dengan mudah bila daerah pengapit (flanking region) telah diketahui. Daerah pengapit yang spesifik ini digunakan sebagai primer. Penggunaan PCR untuk identifikasi adanya suatu patogen penyebab suatu penyakit telah banyak dilakukan, seperti hepatitis B, TBC, AIDS, atau kelainan lainnya. Perbanyakan gen untuk berbagai keperluan, pengurutan DNA, ataupun kajian keragaman molekuler dapat pula dilakukan dengan PCR (Suharsono 2000).
