TINGKAT KONSENTRASI PROTEIN PADA PLATELET RICH PLASMA 2 (PRP2) YANG DIINDUKSI OLEH KALSIUM KLORIDA Laporan penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN
Oleh : Muthiah Miftahul Husnayain 1112103000055
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 1436 H/2015 M
TINGKAT KONSENTRASI PROTEIN PADA PLATELET RICH PLASMA 2 (PRP2) YANG DIINDUKSI OLEH KALSIUM KLORIDA Laporan penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN
Oleh : Muthiah Miftahul Husnayain 1112103000055
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 1436 H/2015 M
KATA PENGANTAR
Assalamualaikum warahmatullahi wabarakatuh,
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat Nya sehingga saya dapat menyelesaikan penelitian dengan judul “Tingkat Konsentrasi Protein pada Platelet Rich Plasma 2 (PRP2) yang Diinduksi oleh Kalsium Klorida” ini dengan baik. Shalawat serta salam tidak lupa saya curahkan kepada Rasulullah, Nabi Muhammad SAW. Alhamdulillahi rabbil „alamin, dalam pelaksanaan penelitian ini, saya memperoleh banyak bantuan baik berupa dukungan maupun masukan, sehingga penelitian ini mampu diselesaikan dengan baik. Maka dari itu saya ingin mengucapkan terima kasih kepada pihak-pihak tersebut, diantaranya :
1. Dr. H. Arif Sumantri, SKM., M.Kes.selaku Dekan Fakultas Ilmu Kesehatan dan Kedokteran UIN 2. dr. Achmad Zaki, M.Epid, Sp.OT selaku Ketua Program Studi Pendidikan Dokter dan seluruh dosen Program Studi Pendidikan Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah membagikan ilmu dan pengalaman yang dimilikinya kepada saya selama menjalani masa pendidikan. 3. dr. Achmad Zaki, M.Epid, Sp.OT selaku pembimbing saya yang selalu membimbing, memberikan saran, serta selalu mendukung, memfasilitasi, dan menyemangati sayadisepanjang penelitian ini berjalan. 4. dr. Ahmad Azwar Habibi, M.Biomed selaku pembimbing kedua saya yang telah membimbing, mengkoreksi, dan menilai tehnik penulisan laporan ini sehingga menjadi laporan penelitian yang objektif. 5. Bapak Chris Adhiyanto,M.Biomed,P.hD dan dr. Flori Ratna Sari, P.hD selaku dosen penguji sidang penelitian saya
v
6. Kedua orang tua saya yang tercinta, Djaka Kusmartata, S.E, MM dan Sumiati,S.ST yang selalu mengarahkan dan membimbing saya dalam hidup serta selalu memberikan kasih sayang, doa, semangat, sehingga memotivasi saya selama penelitian ini dilakukan. 7. Ketiga adik saya, Hamzah, Tazkia dan Hafidz yang selalu saling membantu dalam kesulitan dan menjadi semangat bagi saya. 8. Ibu Endah Wulandari, M.Biomed selaku PJ laboratorium Biokimiadan Ibu Zeti Haryati, M.Biomed selaku PJ laboratorium Biologiyang telah memberikan izin atas penggunaan laboratorium pada penelitian ini serta Ibu Nurlaely Mida R, M.Biomed, Ph.D, Mba Ai dan Mba Sur yang telah banyak membantu dan membimbing dalam melakukan penelitian di laboratorium. 9. Teman sekelompok dan seperjuangan penelitian, Sarah Attauhidah atas segala dukungan dan perjuangan bersama dari awal hingga penelitian berakhir. 10. Sahabat UNO, Fitria Nur Anisa, Putri Auliya Hilfa Lubis, Arvionita Utami, Rizza Mawaddatar dan Galang Prahanarendra yang selalu mendengar keluh kesah, menyemangati dan berada di samping saya. 11. Seluruh mahasiswa PSPD 2012 dan seluruh teman, serta pihak lain yang tidak dapat saya sebutkan satu per satu.
Saya menyadari dalam penyusunan laporan penelitian initerdapat banyak kekurangan. Kritik dan saran yang membangun dari semua pihak akan saya terima dengan baik demi menyempurnakan laporan ini agar menjadi lebih baik lagi. Demikian laporan penelitian ini saya tulis, semoga laporan penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi penulis maupun bagi para pembaca, institusi dan masyarakat. Wassalamualaikum warahmatullahi wabarakatuh. Jakarta, 28 Mei 2015
vi
ABSTRACT Muthiah Miftahul Husnayain. Medical Education Study Program. Protein Concentration Levels In Platelet Rich Plasma 2 Activated By Calcium Chloride. 2015. Platelet Rich Plasma (PRP) is One of future therapy’s agent of medical education. PRP is plasma autologous product that has been enriched with platelets. Platelet Rich Plasma 2 (PRP2) obtained from the result of second centrifugation. For its function in hemostatis process, platelet can be activated by endogenous and exogenous agent. The One of exogenous agent is calcium chloride. Calcium chloride can activate growth factor in platelets, so it widely used in the process of wound healing. This research use biuret test to know the difference between the growth factor in the activation and not. The main component of growth factor is protein. Biuret test results are read by spectophotometric as protein absorbance levels and turn into protein concentration levels. Both do normality test and correlate’s significancy test with SPSS 21.0 version. The results are the one which activated by calcium chloride statistically had significant difference (p<0.05) than control. So, the conclusion is PRP2 which activated by calcium chloride have much growth factor than control group. Keywords : PRP, PRP2, Calcium Chloride, growth factor, protein concentration, biuret test. ABSTRAK Muthiah Miftahul Husnayain. Program Studi Pendidikan Dokter. Tingkat Konsentrasi Protein Pada Platelet Rich Plasma 2 Yang Diinduksi Oleh Kalsium Klorida. 2015. Platelet Rich Plasma (PRP) merupakan salah satu agen terapi masa depan ilmu kedokteran. PRP adalah produk autologous plasma yang kaya akan platelet. Platelet Rich Plasma 2 (PRP2) didapatkan sebagai hasil sentrifugasi ke-2. Untuk menjalankan fungsinya dalam proses hemostatis, platelet dapat diinduksi secara endogen maupun eksogen (invitro). Penginduksi eksogen PRP2 adalah kalsium klorida. Kalsium klorida dapat menginduksi growth factor sehingga banyak digunakan untuk mempercepat proses penyembuhan luka. Dalam penelitian ini, untuk mengetahui perbedaan banyak growth factor antara yang diinduksi kalsium klorida dan tidak digunakan uji biuret. Komponen utama growth factor adalah protein. Uji biuret dibaca dalam spektrofotometri dan didapati kadar absorbansi protein dan tingkat konsentrasinya. Keduanya dilakukan uji normalitas dan uji signifikansi korelasi dengan SPSS versi 21.0. Hasilnya terdapat perbedaan yang signifikan secara statistik (p<0.05) pada PRP2 yang diinduksi kalsium klorida dibandingkan kelompok kontrol sehingga disimpulkan PRP2 yang diinduksi kalsium klorida memiliki growth factor yang lebih banyak dibandingkan kelompok kontrol. Kata kunci : PRP, PRP2, kalsium klorida, growth factor, konsentrasi protein, uji biuret.
vii
DAFTAR ISI LEMBAR JUDUL ...................................................................................................i LEMBAR PERNYATAAN .................................................................................. ii LEMBAR PERSETUJUAN ................................................................................ iii LEMBAR PENGESAHAN ..................................................................................iv KATA PENGANTAR ............................................................................................ v ABSTRAK ........................................................................................................... vii DAFTAR ISI....................................................................................................... viii DAFTAR TABEL .................................................................................................xi DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xii DAFTAR SINGKATAN .................................................................................... xiii DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................xiv BAB I PENDAHULUAN .................................................................................... 1 1.1 LatarBelakang....................................................................................... 1 1.2 RumusanMasalah ................................................................................. 2 1.3 Hipotesis ............................................................................................... 3 1.4 Tujuan ................................................................................................... 3 1.4.1 Tujuan Umum ............................................................................ 3 1.4.2 Tujuan Khusus ........................................................................... 3 1.5 ManfaatPenelitian ................................................................................. 3 1.5.1 Bagi Peneliti............................................................................... 3 1.5.2 Bagi Institusi Akademis ............................................................. 4 1.5.3 Bagi Masyarakat ........................................................................ 4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... 5 2.1 LandasanTeori ...................................................................................... 5 2.1.1 Protein................................................................................................ 5 2.1.1.1 Uji Biuret ........................................................................................ 7 2.1.1.2 Kadar Absorbansi dan Tingkat Konsentrasi Protein ..................... 7 2.1.2 Whole Blood ...................................................................................... 8 2.1.2.1 Plasma............................................................................................. 9 2.1.2.2 Sel Darah ................................................................................. 9
viii
2.1.2.3 Platelet................................................................................ 10 2.1.2.4 Growth Factor ................................................................... 13 2.1.3 Platelet Rich Plasma................................................................. 14 2.1.4 Kalsium Klorida .............................................................................. 18 2.2 KerangkaTeori .................................................................................... 19 2.3 Kerangka Konsep ............................................................................... 19 2.4 DefinisiOperasional ............................................................................ 20 BAB III METODOLOGI PENELITIAN .......................................................... 21 3.1 DesainPenelitian ................................................................................. 21 3.2 Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................ 21 3.3 Alat dan Bahan Penelitian .................................................................. 21 3.3.1 Alat Penelitian........................................................................... 21 3.3.2 Bahan Penelitian ....................................................................... 21 3.4 PopulasidanSampel............................................................................. 21 3.4.1 Besar dan Cara Pengambilan Sampel .............................................. 21 3.4.2Kriteria Inklusi.................................................................................. 22 3.4.3Kriteria Eksklusi ............................................................................... 22 3.5 Cara KerjaPenelitian ........................................................................... 23 3.5.1Persiapan Awal Responden .............................................................. 23 3.5.2 Pembuatan Standar Protein (Albumin) ............................................ 23 3.5.3 Pembuatan Sediaan NaOH 10% dan CuSO4 0,1%.......................... 23 3.5.4 Pembuatan Platelet Rich Plasma 2 .................................................. 23 3.5.5 Uji Biuret ......................................................................................... 25 3.6Alur Penelitian ..................................................................................... 25 3.7 PengolahandanAnalisis Data .............................................................. 26 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 27 4.1 Karakteristik Sampel .......................................................................... 27 4.2 Standar Protein (Albumin) ................................................................. 27 4.3 Kadar Absorbansi Protein PRP2 ........................................................ 29 4.3.1 Uji Korelasi Kadar Absorbansi PRP2....................................... 32 4.4 Tingkat Konsentrasi Protein PRP2 ..................................................... 33
ix
4.4.1 Uji Korelasi Tingkat Konsentrasi PRP2 ................................... 34 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 35 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 36 LAMPIRAN .......................................................................................................... 38
x
DAFTAR TABEL Tabel 4.1. Karakteristik Responden Penelitian ..................................................... 27 Tabel 4.2. Konsentrasi dan Absorbansi Standar Protein (Albumin) ..................... 28 Tabel 4.3 Uji Normalitas dan Uji Korelasi Kadar Absorbansi PRP2 .................... 32 Tabel 4.4. Uji Normalitas dan Uji Korelasi Tingkat Konsentrasi PRP2 ............... 34
xi
DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1 Struktur asam amino ............................................................................ 5 Gambar 2.2 Struktur primer dan struktur sekunder protein ..................................... 6 Gambar 2.3 Komponen WholeBlood ...................................................................... 8 Gambar 2.4 Ultrastruktur platelet yang belum teraktivasi dan sudah teraktivasi .. 11 Gambar 2.5 Fungsi platelet dalam hemostasis ....................................................... 12 Gambar 2.6 Kaskade koagulasi penyembuhan luka .............................................. 13 Gambar 2.7 PRP PAW Classification System ...................................................... 16 Gambar 4.1 Kurva Standar Protein (Albumin) ...................................................... 29 Gambar 4.2 Grafik Kadar Absorbansi Protein Sampel PRP 1............................... 30 Gambar 4.3 Grafik Kadar Absorbansi Protein Sampel PRP 2............................... 30 Gambar 4.4 Grafik Penghitungan Tingkat Konsentrasi Protein Sampel PRP 2 ... 33 Gambar 6.1 Alat dan Bahan Penelitian .................................................................. 44 Gambar 6.2 Proses Penelitian ................................................................................ 45 Gambar 6.2.1 Pembuatan Standar Protein (Albumin) .......................................... 45 Gambar 6.2.2 Pembuatan reaktan Biuret (NaOH 10% & CuSO4 0,1%) .............. 46 Gambar 6.2.3 Pembuatan PRP2 ............................................................................. 46 Gambar 6.2.4 Uji Biuret ........................................................................................ 47 Gambar 6.3 Hasil Penelitian .................................................................................. 47
xii
DAFTAR SINGKATAN
PRP
Platelet Rich Plasma
PPP
Platelet Poor Plasma
GP
Glikoprotein
ACD
Anticoagulant Citrate Dextrose
BSA
Bovine Serum Albumin
PDGF
Platelet Derivied Growth Factor
TGF-β
Transforming Growth Factor Betha
IGF
Insulin-like Growth Factor
EGF
Epidermal Growth Factor
xiii
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1 Surat Persetujuan Responden ............................................................. 38 Lampiran 2 Lolos Etik Pengambilan Sampel Darah ............................................. 39 Lampiran 3 Tabel Data dan Hasil Uji Statistik ...................................................... 40 Lampiran 4 Gambaran Proses Penelitian ............................................................... 44 Lampiran 5 Riwayat Penulis .................................................................................. 48
xiv
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Dunia kedokteran semakin berkembang dengan pesat. Para dokter tidak lagi sekedar mengobati pasien menggunakan obat atau alat tertentu tetapi juga berusaha mencari cara agar sel dapat menyembuhkan dirinya sendiri. Kini telah banyak dikenal mengenai regenerative medicine. Regenerative medicine sering disebut sebagai masa depan dari ilmu kedokteran karena terapi ini sangat menjanjikan dalam jangka panjang. 1 Regenerative medicine sendiri merupakan salah satu cabang penelitian yang mempelajari tentang cara penyembuhan dengan meregenerasi jaringan biologis yang diperoleh dari penggunaan sel, dengan bantuan struktur pendukung biomolekul seperti growth factor.1 Pada tahun 2006, the US National Institutes of Health mendifinisikan Regenerative Medicine sebagai proses menciptakan hidup, jaringan fungsional untuk memperbaiki atau mengganti jaringan atau hilangnya fungsi organ akibat pertambahan usia, penyakit, kerusakan ataupun kelainan kongenital.2 Salah satu fokus dari regenerative medicine adalah Platelet Rich Plasma. Platelet Rich plasma (PRP) merupakan produk autologous plasma yang kaya akan platelet atau memiliki konsentrasi platelet diatas normal. Hitung jumlah platelet normal tubuh adalah 150.000 - 450.000.3 Pada PRP didapatkan hitung jumlah platelet >450.000. Seperti telah diketahui bahwa dalam platelet terdapat berbagai growth factor yang berfungsi meregenerasi sel. Oleh karena itu PRP merupakan salah satu agen terapi masa depan ilmu kedokteran. Platelet Rich Plasma pertama kali dikenalkan oleh M.Ferrari pada tahun 1987 sebagai komponen transfusi autolog setelah operasi bedah jantung untuk menghindari homolog tranfusi produk darah. Selanjutnya PRP diketahui secara klinis dapat mempercepat penyembuhan baik jaringan lunak dan keras. PRP menjadi terkenal dan digunakan oleh berbagai aspek ilmu kedokteran, seperti ortopedi, ophtalmologi, dan dermatology sebagai salah satu terapi.4,5
1
2
Platelet Rich Plasma 2 didapatkan dari dua kali proses sentrifugasi darah. Hasil sentrifugasi pertama disebut sebagai PRP1 dan hasil sentrifugasi kedua disebut PRP2. PRP2 kemudian dapat diaktifkan atau diinduksi secara endogen maupun eksogen. Induksi secara endogen terjadi ketika adanya paparan antara platelet dan kolagen akibat jejas pada jaringan. Induksi secara endogen biasa digunakan sebagai bahan penelitian atau pengobatan kasus klinis. Penginduksi eksogen yang biasa digunakan adalah kalsium klorida dan thrombin. Kalsium klorida sebenarnya merupakan salah satu senyawa dalam tubuh yang menginisiasi proses kaskade penyembuhan luka, tetapi dalam proses klinis Ia dapat digunakan sebagai agen untuk degranulasi platelet. Menurut Bruce Hamilton dalam jurnalnya pada tahun 2013, kalsium klorida memiliki efek yang signifikan dalam penginduksian platelet. Selain kalsium klorida, trauma mekanikal juga dapat digunakan sebagai induksi eksogen. 4 Aktivasi PRP2 berfungsi untuk memanggil growth factor yang berguna dalam perbaikan jaringan yang rusak. Growth factor sendiri terdiri dari kumpulan asam amino, yang merupakan salah satu jenis protein. Dua growth factor yang paling berperan dalam PRP adalah Platelet Derived Growth Factor (PDGF) dan Transforming Growth Factor-β (TGF-β).1 Meski growth factor memiliki andil yang besar dalam berbagai aspek klinis penyembuhan luka, tetapi masih belum diketahui secara pasti bagaimana cara induksi PRP terbaik untuk memproduksi growth factor secara optimal sehingga hendak dilakukan penelitian penginduksian PRP2 dengan kalsium klorida untuk mengetahui seberapa banyak growth factor yang mungkin terbentuk. Protein merupakan penyusun utama growth factor sehingga dapat menjadi tolak ukur.6 1.2 Rumusan Masalah 1. PRP sebagai focus regenerative medicine. 2. PRP2 didapatkan dari sentrifugasi PRP1. 3. Kalsium klorida dapat menginduksi PRP2 sehingga platelet akan mensekresi growth factor yang struktur utamanya merupakan protein.
3
Adapun pertanyaan penelitian ini, Apakah terdapat peningkatan tingkat konsentrasi protein pada Platelet Rich Plasma 2 (PRP2) yang diinduksi oleh kalsium klorida? 1.3 Hipotesis Adapun hipotesis untuk pertanyaan penelitian diatas berupa : H0 : Tidak Terdapat peningkatan tingkat konsentrasi protein pada Platelet Rich Plasma yang diinduksi oleh kalsium klorida. Ha : Terdapat peningkatan tingkat konsentrasi protein pada Platelet Rich Plasma 2 (PRP2) yang diinduksi oleh kalsium klorida. 1.4 Tujuan 1.4.1 Tujuan Umum : Mengetahui hasil induksi kalsium klorida terhadap tingkat konsentrasi protein pada Platelet Rich Plasma 2. 1.4.2 Tujuan Khusus : 1. Mengetahui tingkat konsentrasi protein pada Platelet Rich Plasma 2 yang diinduksi oleh kalsium klorida. 2. Mengetahui perbedaan kadar absorbansi protein pada Platelet Rich Plasma 1 dan 2 yang diinduksi oleh kalsium klorida. 1.5 Manfaat Penelitian 1.5.1 Bagi Penulis 1. Sebagai persyaratan kelulusan akhir pendidikan preklinik program studi
pendidikan
dokter
Universitas
Islam
Negeri
Syarif
Hidayatullah. 2. Mendapatkan pengalaman dalam hal meneliti di bidang biomedik.
4
1.5.2 Bagi Institusi Akademis Sebagai referensi penelitian di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta
mengenai
bagaimana kadar absorbansi dan tingkat konsentrasi protein pada Platelet Rich Plasma 2 (PRP2) yang diinduksi oleh kalsium klorida dan sebagai gagasan tambahan dalam pembuatan standart ekstraksi PRP. 1.5.3 Bagi Masyarakat Sebagai suatu acuan tambahan dalam penanganan berbagai penyakit dan pengetahuan tambahan yang diharapkan dapat membantu proses terapi pada pasien, serta dapat menjadi pasien.
masukan dalam penatalaksanaan
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Landasan Teori 2.1.1 Protein Protein merupakan makromolekul terbanyak penyusun tubuh. Ia memiliki beragam peran penting dalam tubuh. Hampir setiap fungsi dinamik bergantung pada protein. Protein sendiri berasal dari kata ‘proteios’ yang berarti tempat pertama. Secara harfiah, diketahui bahwa protein merupakan penyusun awal berbagai reaksi bikimiawi tubuh. Protein dapat berfungsi sebagai katalisator reaksi kimia, penyokong struktural, penyimpanan energi, transpor, komunikasi selular, pergerakan hingga pertahanan melawan zat asing.3,6
Gambar 2.1. Struktur Asam Amino. Sumber : Campbell, Neil A.,dkk. Biologi Ed.ke-8 Jilid 1. Jakarta: Erlangga, 2010, hal:84 Asam amino sebagai monomer atau unit berulang protein yang berperan sebagai blok pembangun polimer protein terdiri dari gugus karboksil, gugus amino dan atom karbon asimetrik ditengahnya yang disebut karbon α. Karbon α juga mengikat atom H dan gugus bervariasi, yang dilambangkan sebagai R atau rantai samping. Gugus R, berbeda-beda untuk setiap asam amino. Berdasarkan sifat rantai sampingnya, asam amino dibagi menjadi tiga sifat besar, yaitu nonpolar, polar dan bermuatan listrik
5
7
Kedua, struktur sekunder yang berupa kumparan atau lipatan sebagai akibat dari ikatan hidrogen berulang. Ketiga, struktur tersier yang menumpuk diatas struktur sekunder. Struktur tersier ini terbentuk akibat interaksi antar gugus R. Stuktur terakhir adalah stuktur kuaterner yang merupakan struktur keseluruhan protein. Struktur ini terbentuk dari agregasi subunit polipeptida dan membentuk suatu makromolekul fungsional. 6 2.1.1.1 Uji Biuret Protein bersifat amfoter, yang artinya dapat bereaksi dalam larutan asam atau basa. Uji Biuret merupakan suatu uji kualitatif protein. Pada uji ini protein dikondisikan dalam lingkungan basa dengan menggunakan NaOH. Tujuan dilakukannya uji biuret adalah dengan mendeteksi adanya ikatan peptide. Cu2+ dari CuSO4 membentuk kompleks dengan gugus karboksil ( CO) dan gugus amin (NH) dari rantai peptide protein.6 Prosedur umum pengerjaan uji biuret adalah dengan mencampurkan sampel dan NaOH 1 ml serta 1-10 tetes CuSO4. Hasil dari reaksi tersebut akan menghasilkan warna lembayung yang menandakan adanya ikatan polipeptida.6 2.1.1.2 Kadar Absorbansi dan Tingkat Konsentrasi Protein Kadar absorbansi protein didapatkan sebagai hasil uji biuret menggunakan spektrofotometer. Spektometer adalah alat untuk mendispersikan dan menghasilkan cahaya dengan menghasilkan range panjang gelombang cahaya. Spektofotometer secara umum mengandung dua komponen, yaitu spektrometer dan fotometer. Spektometer berfungsi untuk mendispersikan dan menghasilkan cahaya
dengan
menghasilkan
panjang
gelombang
cahaya,
sedangkan fotometer berfungsi sebagai fotoelektrik detektor yang mengukur intensitas cahaya. Intesitas cahaya tersebut digambarkan sebagai kadar absorbansi protein.2
8
Absorbansi merupakan ukuran kuantitatif rasio logaritmik jumlah cahaya (photons) yang dapat diabsorpsi. Dengan nilai absorbansi dari persamaan tersebut, konsentrasi sampel yang tidak diketahui dapat ditentukan dengan menggunakan prinsip BeerLambert Law. 2 Hukum tersebut menjalaskan bahwa terdapat hubungan linear antara kadar absorbansi dan tingkat konsentrasi dari suatu sampel sehingga dengan didapatnya kadar absorbansi, maka akan diketahui pula tingkat konsentrasi sampel. Adapun, rumus linear yang digunakan adalah y=ax+b. 2 2.1.2 Whole Blood Darah merupakan cairan tubuh yang spesial. Hampir sebagian besar transportasi oksigen dan nutrisi untuk jaringan menggunakan darah. Sekitar tujuh hingga delapan persen total berat tubuh adalah darah. Pada umumnya seorang pria memiliki 12 liter darah pada tubuhnya dan wanita sekitar 9 liter.3 Darah yang mengalir melalui vena, arteri dan kapiler dikenal sebagai whole blood. Whole blood sendiri terdiri dari campuran 55 % plasma dan 45 % sel darah. 7
Gambar 2.3. Komponen WholeBlood Sumber : Sherwood, Lauralee. Human Physiology : from cell to system., 2012, hal:392
9
2.1.2.1 Plasma Cairan yang terdapat di darah disebut sebagai plasma. Fungsi utama dari plasma adalah mentransport sel darah ke seluruh tubuh bersama dengan nutrien, produk hasil metabolisme, antibodi, hormon dan protein yang mempertahankan keseimbangan cairan tubuh. Sembilan puluh persen kandungan plasma adalah air. Oleh karena itu, dengan kemampuan air yang dapat menahan panas, plasma dapat mengabsorbsi dan mendistribusi panas secara metabolik ke seluruh jaringan tubuh. 3 Protein dalam plasma berkisar 6-8 % dan biasa disebut dengan protein plasma. Protein plasma inilah yang berlaku sebagai media transportasi berbagai bahan organik, seperti hormon. Albumin merupakan protein utama yang berfungsi dalam pengangkutan berbagai bahan organik yang tidak dapat larut air. Selain berfungsi sebagai transport, protein plasma juga berfungsi sebagai dispense koloid yang membentuk gradien tekanan osmotik antara darah dan cairan interstitial.3 Hal ini menyebabkan adanya pencegahan terhadap hilangnya plasma secara berlebihan dari darah dan membantu
kestabilan
cairan
tubuh.
Protein
plasma
juga
berhubungan dengan kapasitas plasma sebagai buffer dalam perubahan pH. Bahan inorganik dalam berkisar 1 % dalam plasma. Elektrolit yang dominan adalah Na+ dan Cl-. Selain itu juga terdapat beberapa elektrolit lainnya, diantaranya HCO3-, K+ dan Ca2+.8 Ion –ion ini berfungsi sebagai buffer saat terjadi pergantian pH dan memiliki peran dalam eksitabilitas cairan antara cairan ekstrasel dan sel. 2.1.2.2 Sel Darah Sel Darah terdiri dari 3 macam, yaitu eritrosit, leukosit dan platelet. Sel darah berasal dari sel induk pluripoten yang kemudian akan mengalami diferensiasi dan bermitosis dalam jumlah besar.
10
Sel ini akan membelah menjadi 2 sel progenitor yaitu common myeloid progenitor dan common lymphoid progenitor. Common myeloid progenitor kemudian akan berdiferensiasi menjadi sel eritrosit, leukosit dan platelet.3,9 2.1.2.3 Platelet Salah satu jenis sel darah adalah platelet. Platelet Manusia berbentuk keping darah yang kecil dan tidak berinti dengan diameter 2-4 μm. Platelet dikenal juga sebagai trombosit. Platelet merupakan sel darah terbanyak kedua setelah eritrosit dengan jumlah sekitar 150-400 X 109/ liter dalam darah.. Platelet berasal dari megakariosit, Secara esensial platelet merupakan potongan atau kepingan sitoplasma megakariosit yang diselubungi oleh membran plasma. Platelet bersirkulasi selama 10 hari dan secara otomatis akan disingkirkan dari sirkulasi oleh makrofag, terutama yang terdapat di limpa dan hepar. Hepar akan menghasilkan hormon thrombopoietin yang meningkatkan jumlah megakariosit di
sumsum
tulang
dan
menstimulasi
megakariosit
untuk
memproduksi platelet yang lebih banyak.3,9 Setiap struktur platelet memiliki peran penting. Selubung permukaan mukopolisakarida berfungsi dalam reaksi adhesi dan agregasi platelet. Proses adhesi ini kemudian difasilitasi oleh Glikoprotein Ia (GPIa) yang ada di membran plasma. Selain itu, membran
plasma
juga
memiliki
glikoprotein
lain,
yaitu
Glikoprotein Ib (GPIb), Glikoprotein IIb (GPIIb), dan Glikoprotein IIIa (GPIIIa). Pada proses adhesi, GPIa dapat melakukan adhesi langsung pada kolagen di tempat yang terluka, tetapi GPIb tidak. Ia harus berikatan dengan faktor von willebrand yang disekresikan oleh endotel terlebih dahulu sehingga dapat terjadi proses adhesi di subendotel. Agregasi platelet kemudian terjadi akibat pajanan faktor von willebrand dengan GPIIb atau GPIIIa.7,9
11
Pada membran plasma terdapat invaginasi membentuk suatu sistem kanalikular terbuka yang berfungsi sebagai tempat absorpsi selektif protein koagulasi plasma. Sistem kanalikular terbuka dan membran plasma dikenal dengan nama fosfolipid membran. Platelet memiliki protein kontraktil yaitu trombastenin atau filamen submembran.7 Bagian dalam platelet berisi organel-organel, diantaranya granula padat electron yang
mengandung nukleotida (ADP),
adenosine triphospat (ATP), Ca2+ dan serotonin, granula α spesifik yang mengandung fibrinogen, faktor V, faktor von willebrand, fibronektin, β-tromboglobulin, platelet derivied growth factor (PDGF), transforming growth factor β (TGFβ), antagonis heparin (PF4) dan trombospondin. Isi dari granula ini akan disekresikan melalui sistem kanalikular terbuka. 7
Gambar 2.4. Ultrastruktur platelet yang belum teraktivasi dan sudah teraktivasi Sumber : Tortora, Gerald J. Principles of Anatomy and Physiology.13th ed, 2012 Pada gambar diatas diperlihatkan gambaran ultrastruktur platelet. Normalnya, platelet berada dalam keadaan istirahat atau tidak aktif dalam darah. Saat terjadi aktivasi atau induksi, platelet akan mengalami perubahan bentuk. Akan terjadi perkembangan
12
pseudopodia yang mempermudah proses agregasi dan pengeluaran kandungan granula melalui sistem kanalikuli terbuka.8
Gambar 2.5. Fungsi platelet dalam hemostasis Sumber : : Silbernagl, Steffman. Color Atlas of Physiology 6thEd. NewYork : Thieme, 2009 Fungsi utama platelet adalah mencegah kehilangan darah secara akut dan memperbaiki dinding vascular dengan membentuk platelet plug.8 Proses pembentukannya meliputi tiga hal, yaitu adhesi, agregasi dan pengeluaran secret granul platelet. Proses ini sering disebut sebagai proses hemostatis. 10 Proses Hemostatis terjadi karena terbentuknya jejas vaskular. Proses ini dimulai saat platelet terpapar oleh kolagen dan mengalami perubahan bentuk untuk mempermudah proses adhesi. Platelet kemudian mengsekresikan granul yang berisi berbagai mediator kimiawi, diantaranya serotonin yang menyebabkan vasokontriksi pembuluh darah, tromboxanA2 dan ADP yang menarik platelet lain untuk melakukan agregasi sehingga terbentuk plug hemostatik primer. Plug hemostatik primer bersifat tidak stabil dan mudah lepas sehingga dibutuhkan fibrin untuk menstabilkannya. 10
13
Gambar 2.6 . Kaskade koagulasi penyembuhan luka Sumber : Silbernagl, Steffman. Color Atlas of Physiology 6thEd. NewYork : Thieme, 2009 Fibrin terbentuk kemudian dengan bantuan berbagai faktor pembekuan darah. Proses ini difasilitasi oleh dua jalur, yaitu jalur intrinsik dan jalur ekstrinsik. Pada tiap-tiap jalurnya terdapat berbagai faktor pembekuan darah yang berperan hingga terbentuk suatu kaskade pembekuan darah.3 2.1.2.4 Growth Factor Proses penyembuhan luka merupakan suatu proses yang telah terorganisir secara baik dan terdiri dari kumpulan kejadian kompleks yang meliputi interaksi sel antar sel dan sel dengan matriks serta growth factor sebagai sinyal yang meregulasi proses tersebut. Growth factor merupakan suatu senyawa yang berfungsi menstimulasi
pertumbuhan,
proliferasi,
penyembuhan
dan
diferensiasi sel. Peran growth factor bukanlah sebagai sel baru yang menggantikan sel sebelumnya, melainkan sebagai molekul sinyal antar sel sehingga sel terangsang untuk melakukan pertumbuhan, proliferasi, penyembuhan dan diferensiasi.10,11
14
Terdapat puluhan growth factor yang telah berhasil dideteksi. Setiap growth factor berada pada tempat yang berbeda ditubuh dan secara umum memiliki fungsi yang sama namun bekerja secara berbeda tergantung letaknya. Pada granula α spesifik spesifik platelet didapati beberapa growth factor, yaitu PDGF, IGF-1, EGF dan TGF-β tetapi terdapat dua growth factor utama yaitu PDGF dan TGF-β.7,12 Struktur growth
factor
umumnya terdiri
dari protein.
Contohnya PDGF terdiri dari dua rantai peptide. Tiap rantai mengandung ikatan disulfida yang kuat dengan total enam belas residu sistein. TGF-β mengandung 390-412 asam amino dan memiliki terminal N-peptida yang terdiri dari 20-30 asam amino. Asam-asam amino terminal tersebut berguna untuk mengatur sekresi sel pada sel target. Ia juga memiliki terminal C yang terdiri dari 112-114 asam amino yang berperan sebagai sinyal pembentukan TGF-β itu sendiri. 13 2.1.3 Platelet Rich Plasma Pada proses penyembuhan luka dibutuhkan tiga hal yang utama, yaitu sel progenitor yang akan berdiferensiasi menjadi sel matur, molekul sinyal yang menjadi sinyal dalam proses agregasi dan diferensiasi sel serta sel matur. Ilmu kedokteran kemudian menjadikan tiga hal tersebut sebagai basis dalam upaya melakukan regenerative medicine. Platelet Rich Plasma sendiri memegang andil melalui jalur molekul sinyal yaitu growth factor.10 Platelet Rich Plasma (PRP) merupakan plasma yang kaya akan platelet. Manusia memiliki 150.000 – 400.000 platelet dalam tiap 1 μl darahnya.8 Pada PRP didapatkan jumlah yang lebih. Banyak ilmuwan masih meneliti berapa jumlah pasti PRP yang dibutuhkan untuk mempercepat proses penyembuhan luka dan regenerasi jaringan. Untuk mendapatkan platelet yang lebih banyak, dilakukan proses sentrifugasi. Belum ada protocol pasti dalam melakukan sentrifugasi. Namun, terdapat tiga aspek penting yang harus dipenuhi dalam melakukan sentrifugasi, yaitu kecepatan, suhu dan
15
waktu. Ketiga aspek inilah yang akan mempengaruhi jumlah recovery platelet dalam plasma dan fungsinya. 14 Protokol persiapan PRP telah banyak dikeluarkan oleh berbagai peneliti. Namun, belum ada satu protocol resmi yang digunakan secara standart di Indonesia. Meskipun begitu terdapat kesamaan prinsip dalam melakukan PRP. Darah diambil dari pasien yang akan disuntikkan PRP. Darah disimpan pada tabung darah yang telah mengandung anti koagulan natrium sitrat dan siap untuk dilakukan sentrifugasi. Sentrifugasi dilakukan dengan menggunakan tabung. Sentrifugasi dilakukan dalam putaran (rpm), waktu (m) dan suhu (⁰C) tertentu. Supernatan hasil sentrifugasi pertama diberi nama PRP1. Supernatan tersebut kemudian disentrifugasi kembali dan pellet hasil sentrifugasi kedua adalah PRP2,
sedangkan supernatannya
adalah PPP. PRP 2 akan diiduksi oleh aktivator eksogen sehingga menghasilkan growth factor yang akan membantu perbaikan luka.15 Platelet Rich Plasma pertama kali dikenalkan oleh M.Ferrari pada tahun 1987 sebagai komponen transfusi autolog dalam operasi bedah jantung untuk menghindari homolog tranfusi produk darah.5 Kemudian Balk melaporkan adanya kandungan growth factor dalam platelet pada tahun 1971.15 Platelet Rich Plasma merupakan produk darah yang bersifat autolog atau berasal dari diri sendiri. Ketika sampel darah disentrifugasi, darah akan terbagi menjadi sel darah dan plasma yang mengandung platelet, sitokin dan growth factor, diantaranya platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor (TGF-α, TGF-β), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), insulin-like growth factor (IGF), platelet-derived epidermal growth factor (PDEGF), dan platelet –derived angiogenesis factor (PDAF).15 Growth factor yang paling sering diteliti adalah PDGF dan TGF-β.16 Konsentrasi platelet sebanding dengan jumlah growth factor. Semakin tinggi konsentrasi platelet, maka akan semakin banyak growth factor.17
16
Gambar 2.7. PRP PAW Classification System. Sumber : Delong, Jeffrey M, et.al. Platelet-Rich Plasma: The PAW System. USA,2012 Menurut konsentrasi platelet dalam plasma dan fungsinya, DeLong, memperkenalkan sebuah sistem yang dikenal sebagai The PAW System. Ia membagi PRP menjadi empat, yaitu platelet konsentrasi rendah, platelet konsentrasi sedang,
platelet konsentrasi tinggi dan platelet konsentrasi
super. Platelet konsentrasi rendah mengandung kadar kurang dari standar jumlah konsentrasi platelet dalam plasma. Sering dikenal dengan nama Platelet Poor Plasma (PPP) dan biasa digunakan sebagai kontrol.18 Platelet Rich Plasma dengan konsentrasi lebih dari standar hingga tiga kali lipat dikenal dengan platelet konsentrasi sedang. Pada metode ini, didapati jumlah platelet yang diproduksi sekitar 450.000 hingga 750.000 platelet/μL.18 Konsentrasi ini dianggap paling efisien dalam proses penyembuhan luka. Sanchez,dkk mendapati efek yang signifikan pada pasien yang membutuhkan penyembuhan tendon archilles setelah operasi saat ia menyuntikkan platelet dengan konsentrasi platelet 3x standar jika
17
dibandingkan kontrol. Begitu juga saat ia menyuntikkannya pada pasien aseptic nonunion. Semua subjek mendapati tulangnya kembali union. Graziani,dkk tahun 2006, dalam journalnya menyimpulkan bahwa konsentrasi optimal PRP adalah 2,5x standar.19 Platelet konsentrasi tinggi adalah PRP dengan konsentrasi platelet >750.000 -1.800.000 platelet/μL atau sekitar 4x – 6x standar. Banyak literatur merekomendasikan konsentrasi ini.18 Konsentrasi ini didapati mempercepat penyembuhan luka dan regenerasi tulang. Giusti,dkk menyatakan bahwa konsentrasi optimal untuk proliferasi sel endotel adalah 1.500.000 platelet/μL.14 Platelet dengan konsentrasi >6x standart disebut platelet konsentrasi super. Masih terdapat banyak perdebatan menganai batas toksik konsentrasi PRP. Jumlah yang terlalu berlebihan atau lebih dari 1.800.000 platelet/μL di dapat bersifat merusak. Ia dapat merangsang terjadinya apoptosis sel , menurunkan regulasi growth factor dan desensitasi reseptor. Hal ini dapat menyebabkan efek inhibitor paradoks.18 Weibrich, dkk memperlihatkan adanya efek inhibitor terhadap aktivitas osteoblast dengan konsentrasi platelet 1.845.000 – 3.200.000.20 Platelet telah banyak dimanfaatkan pada berbagai aspek klinis, seperti osteoarthritis, osteonekrosis, tendinopati, fraktur nonunion, bahkan ruptur ligamen .Menurut American Academy of Orthopaedic Surgeons tahun 2010, terdapat beberapa hal yang harus diperhatikan oleh praktisi sebelum mengambil sampel darah untuk PRP : 1. Pasien tidak mengkonsumsi Kortikosteroid dalam 3 minggu terakhir. 2. Pasien tidak mengkonsumsi NSAIDs (Non Steroidal Inflammatory Drugs) dalam 1 minggu terakhir. 3. Pasien tidak mengkonsumsi anti koagulan dalam 5 hari terakhir. 4. Pasien diberi intake cairan tambahan 1 hari sebelum pengambilan darah dilakukan. 5. Pengobatan anti anxietas mungkin dibutuhkan bagi beberapa pasien (21)
18
Terdapat beberapa hal yang dikontraindikasikan untuk penggunaan PRP, yaitu platelet dysfunction syndrome, trombositopenia berat, septicemia, demam, infeksi lokal, anemia (Hb< 10gr/dl), gangguan hemodinamik dan bila pasien tidak mau menerima resiko. Adapun resiko yang mungkin terjadi, yaitu tidak ada hasil, infeksi, perdarahan, kerusakan saraf, nyeri dan meskipun sangat jarang tetapi mungkin terjadi, kematian.4,21 2.1.4 Kalsium Klorida Terdapat berbagai induksi eksogen PRP, diantaranya dengan menggunakan thrombin bovine dan kalsium klorida. Kalsium klorida sebenarnya merupakan salah satu senyawa dalam tubuh yang menginisiasi proses kaskade pembekuan darah, Namun dalam proses klinis Ia dapat digunakan sebagai agen untuk degranulasi platelet. Menurut Bruce Hamilton dalam jurnalnya pada tahun 2013, Kalsium klorida memiliki efek yang signifikan dalam penginduksian platelet tetapi tidak dijelaskan secara pasti growth factor apa yang mengalami induksi terbaik.22 Amable, dkk tahun 2013 dalam jurnalnya menjelaskan bahwa aktivasi growth factor, terutama PDGF dan TGF-β terbaik adalah dengan menggunakan kalsium klorida. Ia mendapati konsentrasi yang cukup tinggi pada PRP yang diaktifkan dengan kalsium klorida jika dibandingkan dengan thrombin bovine.16
19
2.2 Kerangka Teori
2.3 Kerangka Konsep
20
2.4 Definisi Operasional No
Variabel
Definisi
Penguk
Alat Ukur
Cara Ukur
ur 1.
Tingkat
Ukuran yang
Konsentra
Peneliti
Skala Ukur
Spektrofoto-
Mengukur
menggambar
meter
kadar
si Protein
kan
(λ=540nm)
absorbansi
PRP2
banyaknya
sampel
bagian
kemudian
protein
dibandingk
dalam
an dengan
larutan
kurva
Numerik
standar 2.
CaCl2
Senyawa
Spektrofoto-
Menambah Numerik
penginduksi
meter
kan 30μl
eksogen
(λ=540nm)
CaCl2
platelet
Peneliti
kemudian uji biuret
BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Desain Penelitian Penelitian ini dilakukan secara eksperimental untuk mengetahui pengaruh induksi kalsium klorida terhadap tingkat konsentrasi protein pada Platelet Rich Plasma 2 (PRP2). 3.2 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini mulai dilaksanakan pada bulan Januari 2015 sampai bulan Mei 2015 dan bertempat di laboratorium biologi dan biokimia Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK) Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 3.3 Alat dan Bahan Penelitian 3.3.1
Alat Penelitian Alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain, 6 tabung darah yang berisi 0,5 ml natrium sitrat 3,2% , 6 spuit, torniqutte, alkohol swab 1 box, handscoon 1 box, mikropipet 2 - 20 μl dan 100 – 1000 μl, tip biru dan tip kuning 1 box, 120 tabung eppendorf , tabung reaksi, gelas ukur, rak tabung, neraca analitik, Quincy Lab Model 10-140 incubator, Heidolph REAX control, sentrifugator merek Eppendorf 5417R dan spektrofotometer merek Genesys 20 beserta kuvetnya.
3.3.2
Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain, 6 sampel darah vena 3 ml, Bovine serum albumin (BSA), kalsium klorida, bubuk NaOH, bubuk CuSO4 dan akuades.
3.4 Populasi dan Sampel Penelitian 3.4.1 Besar dan Cara Pengambilan Sampel Besar responden berjumlah 8 orang mahasiswa wanita atau pria PSPD UIN Syarif Hidayatullah yang memenuhi criteria inklusi.
21
22
Responden ditentukan dengan rumus Mead’s Resource Equation,29 yaitu .
E=N–B–T
E = Error Component (E= 10 hingga 20) N = Jumlah sampel -1 B = Blocking Component -1 (B = 0) T = Jumlah kelompok yang diberi perlakuan -1 E=N–B–T ≥ 10= (N – 1) – 0 – (2 – 1) N = ≥ 12 E=N–B–T ≤ 20= (N – 1) – 0 – (2 – 1) N = ≤ 22 N = 12 – 22 , Kemudian total sampel dibagi kedalam
dua
kelompok sehingga jumlah sampel masing-masing kelompok berkisar 6 – 11 sampel. Responden yang bersedia diambil darahnya akan mengisi lembar persetujuan informed consent. 3.4.2 Kriteria inklusi Sampel darah berasal dari responden berusia >16 tahun
dengan
karakteristik: 1.
tidak mengkonsumsi kortikosteroid dalam 3 minggu terakhir.
2. tidak mengkonsumsi NSAIDs (Non Steroidal Inflammatory Drugs) dalam 1 minggu terakhir. 3. tidak mengkonsumsi anti koagulan dalam 5 hari terakhir 3.4.3
Kriteria Eklusi Sampel darah berasal dari responden dengan karakteristik : 1. Mengalami infeksi dalam 1 bulan terakhir
23
3.5 Cara Kerja Penelitian 3.5.1 Persiapan Awal Responden 1. Responden yang memenuhi kriteria inklusi dan telah mengisi formulir informed consent berkumpul untuk pengambilan darah. 2. Ambil sampel darah vena 3 ml menggunakan spuit 3cc dan masukkan pada tabung darah yang telah berisi antikoagulan 3,2% natrium sitrat. 3. Letakkan pada rak tabung pada suhu ruangan. 3.5.2 Pembuatan Standar Protein (Albumin) 1. Siapkan Bovine Serum Albumin (BSA), Aquades, tabung reaksi, gelas ukur, sendok, tip biru, mikropippet dan neraca analitik. 2. Ukur BSA dengan neraca analitik sejumlah 0,2 gram. 3. Larutkan dengan 10 ml Aquades. Beri label sebagai stok. 4. Ambil 2 ml stok. Beri label Std 1. 5. Lakukan
dilusi
standart
sebanyak
empat
kali
sehingga
konsentrasi standar menjadi 0,125% dengan cara mengambil 1 ml stok dan 1 ml aquades,dst. 6. Setiap hasil dilusi diberikan label Std 2 hingga Std 5. 3.5.3 Pembuatan Sediaan NaOH 10% dan CuSO4 0,1% 1. Ukur 5 gram NaOH dengan neraca analitik. 2. Tambahkan 50 ml aquades. Tunggu hingga larut kemudian pindahkan ke botol kosong dan labeli NaOH 10%. 3. Ukur 17 gram CuSO4 dengan neraca analitik. 4. Tambahkan 100 ml aquades. 5. Ukur suhu CuSO4 dengan thermometer ruangan. 6. Tambahkan 4 ml aquades sesuai tabel hasil suhu thermometer CuSO4. 7. Pindahkan ke botol kosong dan Labeli CuSO4 stok. 8. Ambil 0,1 ml CuSO4 stock dan tambahkan 100 ml Aquades. 9. Pindahkan ke botol kosong dan Labeli CuSO4 0,1%. 3.5.4
Pembuatan Platelet Rich Plasma 2 1. Siapkan alat dan bahan yang diperlukan.
24
2. Bagi dua, 150μl darah sebagai kadar sel darah inisial dengan mikropipet. Lakukan dua kali sebagai diplo dan diletakkan pada tabung appendorf kosong. Beri label A dan B. 3. Ambil 7μl darah dengan mikropippet dan dimasukkan ke dalam tabung appendrof 1. Lakukan dua kali. Masukkan 7μl darah kedua ke dalam tabung appendorf 2. 4. Sentrifugasi darah yang ada pada tabung appendorf A dan B dengan kecepatan (300 xg) 1800 rpm, waktu 5 menit dan suhu 18⁰C. 5. Ambil supernatan 1,2 ml dari tabung appendorf A dan B tanpa mengambil buffy coatnya. 6. Ambil 600μl pertama pindahkan ke tabung appendorf yang telah dilabeli PRP1 A dan PRP1 B. 7. Bagi dua PRP1 A dan PRP1 B menjadi 300μl dan pindahkan ke tabung appendorf baru dengan label PRP1A, PRP1B – Control dan PRP1A, PRP1B – Induksi. 8. Keluarkan 30 μl PRP 1 dari Tabung appendorf PRP1A, PRP1B – Induksi dan tambahkan 30μl CaCl2 pada kedua tabung. 9. Inkubasi semua tabung appendorf PRP1 selama 1 jam pada suhu 37⁰C di inkubator. 10. Sisa 600μl yang ada pada tabung appendorf A dan B dilakukan sentrifugasi kedua dengan kecepatan (700 xg) 2700 rpm, waktu 17 menit dan suhu 18⁰C. 11. Lakukan vortex dengan Heidolph REAX control. 12. Bagi dua tabung appendorf A dan B menjadi 300μl dan pindahkan ke tabung appendorf baru dengan
label PRP2A,
PRP2B – Control dan PRP2A, PRP2B – Induksi. 13. Inkubasi semua tabung appendorf PRP2 selama 1 jam dalam 37⁰C. 14. Sentrifugasi kembali tabung appendorf PRP1 dan PRP2 dengan kecepatan (3000 xg) 5688 rpm, waktu 20 menit dan suhu 18⁰C.
25
15. Lakukan Uji Biuret dan baca pada spektrofotometer dengan λ = 540 nm. 3.5.5 Uji Biuret 1. Siapkan tabung reaksi, rak tabung, pipet tetes, mikropipet, NaOH 10% dan CuSO4 0,1%. 2. Ambil 50μl sampel hasil sentrifugasi ketiga dan tambahkan 950 μl aquades pada tabung reaksi. 3. Labeli sesuai sampel. PRP1A, PRP1B – Control = A1(-), B1(-); PRP1A,PRP1B – Induksi = A1Ca, B1Ca; PRP2A, PRP2B – Control =
A2(-), B2(-); PRP2A,PRP2B – Induksi = A2Ca,
B2Ca . 4. Tambahkan 1 ml NaOH dan teteskan tujuh tetes CuSO4 pada masing-masing tabung. 5. Baca absorbansi dengan spektrofotometer dengan λ = 540 nm. 3.6 Alur Penelitian
26
3.7 Pengolahan Data dan Analisis Data Pengambilan data untuk penelitian ini dilakukan dengan mengambil darah responden sebanyak 3ml dan melakukan dua kali sentrifugasi sehingga menghasilkan PRP2 yang kemudian diinduksi dengan kalsium klorida.dan diuji dengan uji biuret. Penelitian ini memiliki dasar dari penelitian-penelitian sebelumnya berupa panduan cara mendapatkan PRP2, cara induksi PRP2 dengan kalsium klorida dan cara uji biuret. Data yang diamati adalah kadar absorbansi protein sampel hasil spektrofotometer dan tingkat konsentrasi protein pada PRP2 yang diinduksi oleh kalsium klorida (dibandingkan juga dengan kontrol negatifnya). Pengolahan data dalam bentuk tabel dan kurva dilakukan dengan menggunakan Microsoft Excel 2010. Analisis data secara statistic menggunakan SPSS 21.0. Uji yang digunakan adalah uji normalitas sampel dan uji korelasi. Uji korelasi dapat digunakan apabila distribusi sampel normal sehingga untuk melakukan uji korelasi, uji normalitas harus didapati p>0,05 yang menyatakan bahwa distribusi sampel adalah normal. Jenis data penelitian ini adalah numerik numerik yang membandingkan antar skala pengukuran numerik dengan skala pengukuran numerik pada dua kelompok yang tidak berpasangan.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Karakteristik Sampel Penelitian ini menggunakan dua kelompok uji, yaitu kelompok PRP2 yang tidak diinduksi oleh kalsium klorida dan kelompok PRP2 yang diinduksi oleh kalsium klorida. Seluruh sampel darah diambil dari 8 orang responden yang ditentukan secara acak di FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Terdapat 2 sampel yang dieksklusi karena pengambilan sampel tidak sempurna sehingga total sampel yang digunakan berjumlah 6 sampel.
Tabel 4.1. Tabel Karakteristik Sampel Total Sampel
6
Jumlah Perempuan : Laki-laki
4:2
Rata-rata usia
21 tahun
Pekerjaan
Mahasiswa PSPD UIN
Responden telah memenuhi kriteria inklusi dan telah menyetujui lembar inform consent. Terpenuhinya kriteria inklusi didapatkan berdasarkan hasil wawancara dengan seluruh responden sebelum diisinya inform consent. 4.2 Standar Protein (Albumin) Standat protein yang digunakan dalam penelitian ini adalah BSA yang merupakan acuan konsentasi standar protein. BSA didapat dari serum albumin pada sapi. BSA mengandung kurang lebih 607 asam amino dengan berat molekul 66,5 kDa. Peneliti melakukan titrasi pada BSA stok sebanyak lima kali sehingga didapatkan lima tingkat konsentrasi yang berbeda. Masingmasing konsentrasi diukur absorbansinya dengan spektrofotometer. Pengukuran standar protein ini untuk menentukan standar awal atau batas awal dari absorbansi protein. Pengukuran ini berfungsi untuk memudahkan peneliti dalam menentukan hasil penelitian mengenai konsentrasi protein dalam PRP1 dan PRP2. Untuk mengetahui kadar konsentrasi protein sampel
27
28
berdasarkan hasil absorbansi standar, perlu diketahui mengenai rumus persamaan linier, yaitu
Y = ax + b A adalah konstanta yang menggambarkan gradien garis, sedangkan b merupakan titik potong garis dengan sumbu –y. Persamaan ini digunakan untuk mencari sumbu –y. Persamaan linier ini berhubungan dengan Lambert -Beer Law yang menyatakan hubungan linearitas antara absorban dan konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan. Larutan analit merupakan larutan yang akan ditentukan konsentrasinya, sedangkan transmitan adalah perbandingan antara intensitas cahaya yang keluar setelah berinteraksi dengan zat uji dengan intensitas cahaya awal.
Konsentrasi larutan analit dilambangkan sebagai x dan absorbansinya dilambangkan sebagai y. Menurut persamaan linear diatas diperlukan adanya a dan b. A merupakan slope dari kurva baku dan b merupakan interslopenya. Kurva baku dibuat dengan cara mengukur absorbansi beberapa seri larutan standar. Berikut adalah data larutan standar setelah dibaca dengan spektrofotometer λ = 540nm Tabel 4.2. Konsentrasi dan Absorbansi Standar Protein (Albumin) No. Konsetrasi (m) Absorbansi 1
0.125
0.112
2
0.25
0.111
3
0.5
0.119
4
1
0.13
5
2
0.153
Berdasarkan data diatas dibuatlah kurva baku beserta konstanta a dan b. Dari kurva tersebut akan didapatkan nilai korelasi antara konsentrasi standar dan absorbansi, yaitu R.
29
0,18 0,16
Absorbansi
0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0
0,5
1 1,5 Konsentrasi (m)
2
2,5
Gambar 4.1 . Kurva Standar Protein (Albumin) Pada kurva standar protein peneliti, didapatkan adanya peningkatan antara nilai konsentrasi standar dengan absorbansi dilihat dari garis trendline yang meninggi. Standar protein menurut kurva diatas yaitu, y= 0,022x + 0,107. Adapun nilai R2 = 0,993 , yang menjelaskan bahwa terdapat nilai korelasi antara konsentrasi standard dan absorbansi sebesar 99%. Oleh karena itu, kurva standart ini dapat diaplikasikan dalam Beer’s law untuk mencari tingkat konsentrasi protein PRP2. 4.3 Kadar Absorbansi Protein PRP2 Pengukuran kadar absorbansi protein sampel dilakukan setelah semua data standar selesai diukur dengan spektrofotometri.
30
0,16 0,14
Absorbansi
0,12 ABSORBANSI Ca
0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 S1
S2
S3 S4 Sampel PRP1
S5
S6
Gambar 4.2 . Grafik kadar Absorbansi Protein Sampel PRP 1 Peneliti menyertakan grafik kadar absorbansi protein sampel PRP1 sebagai bahan pembanding kadar absorbansi protein antara PRP1 dan PRP2 yang akan dijelaskan kemudian. Berdasarkan
grafik diatas dapat terlihat
adanya peningkatan absorbansi protein antara PRP1 yang diinduksi kalsium dan tidak. Hasil absorbansi didapatkan dari proses dispersi yang menghasilkan range panjang gelombang kemudian ditangkap dalam bentuk intensitas cahaya oleh fotoelektric detector. Hasil absorbansi ini kemudian akan digunakan sebagai bahan acuan hitung untuk mencari konsentrasi protein.23 0,18 0,16
ABSORBANSI Ca
Absorbansi
0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 S1
S2
S3 S4 Sampel PRP2
S5
S6
Gambar 4.3. Grafik kadar Absorbansi Protein Sampel PRP 2
31
Berdasarkan grafik diatas dapat terlihat adanya peningkatan absorbansi protein antara PRP2 yang diinduksi kalsium dan tidak. Berdasarkan hasil didapatkan rata-rata kadar absorbansi protein sampel PRP2 yang diinduksi kalsium klorida adalah 0,116 dan rata-rata kadar absorbansi protein sampel PRP2 yang tidak diinduksi adalah 0,099. Kadar absorbansi tertinggi pada sampel yang diinduksi kalsium klorida pada PRP2 adalah 0,153 dan kadar terendah 0,081. Apabila dibandingkan antara grafik absorbansi PRP1 dan PRP2 akan terlihat bahwa kadar absorbsi protein pada PRP1 lebih besar. Hasil ini kurang sesuai dengan jurnal yang ditulis oleh Amable, PR yang menyatakan bahwa recovery platelet pada PRP 2 lebih besar dibandingkan PRP1 sehingga hasil yang diinginkan berupa lebih besarnya kadar absorbansi pada PRP2 jika dibandingkan dengan PRP1.16 Hal ini dapat disebabkan oleh variasi demografis. Bain BJ telah menjelaskan dalam jurnalnya bahwa etnik merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi hitung platelet. Ras Afrika dan Afrikakaribian memiliki hitung platelet yang lebih rendah jika di banding ras Kaukasia.
24
Segal pada tahun
2006 juga mendapatkan bahwa ras kulit putih memiliki hitung platelet yang lebih rendah dari ras hitam non-hispanic di Amerika Serikat.25 Amable melakukan penelitian di Rio de Janeiro, Brazil. Di Negara Brazil terdapat berbagai etnik. Dua ras yang dominan berada di brazil adalah Afrika dan Kaukasia. 26 Peneliti melakukan penelitian di Indonesia yang memiliki ras Mongoloid dan belum terdapat penelitian yang membandingkan hitung platelet ras Mongoloid dengan ras Afrika dan ras Kaukasia. Perbedaan hasil juga kemungkinan disebabkan oleh alat ukur yang kurang baik. Alat ukur yang digunakan dalam penelitian ini adalah spektrofotometer. Spektrofotometer yang digunakan seharusnya dikalibrasi secara berkala. Namun, spektrofotometri yang digunakan belum pernah dikaliberasi. Selain spektrofotometer, Alat sentrifugasi kemungkinan menjadi salah satu penyebab terjadinya perbedaan hasil. Alat sentrifugasi yang digunakan oleh peneliti berbeda dengan alat sentrifugasi dalam jurnal rujukan
32
yang telah disertifikasi oleh Jouan Br4i, Saint-Herblain, Loire-Atlantique, France.16 Penyebab kemungkinan kesalahan lainnya adalah terdapat kurangnya keterampilan dan pengalaman kerja dalam mengambil darah menggunakan mikropipet. Kesalahan karena hal ini sebenarnya telah diminimalisir oleh peneliti dengan melakukan latihan menggunakan mikropipet selama terhitung satu tahun sebelum melakukan pengambilan data. Namun, peneliti tidak menutupi bahwa hal ini dapat menjadi salah satu faktor terjadinya perbedaan penghitungan. 4.3.1 Uji Korelasi Kadar Absorbansi Protein PRP2 Untuk mengetahui signifikansi hubungan kadar absorbansi protein pada kedua kelompok sampel, perlu dilakukan analisis uji signifikansi dengan uji korelasi. Dari uji korelasi ini, akan diketahui nilai p, yaitu batas nilai untuk mengetahui apakah Ha benar atau salah. Jika p<0,05, maka Ha dapat diterima. Uji ini memiliki ketetapan bahwa distribusi data haruslah normal. Oleh karena itu, dilakukan uji normalitas. Jumlah data yang dianalisa menentukan uji normalitas yang digunakan. Pada penelitian ini digunakan uji normalitas Saphiro Wilk . Tabel 4.3 Uji Normalitas dan Uji Korelasi Kadar Absorbansi Protein PRP2 Nama Variabel
Kadar Absorbansi Protein
Nilai
Normalitas
p
Distribusi
0,001
0,973
Uji normalitas disebut normal apabila nilai >0,05. Menurut analisis hasil statistic didapatkan distribusi sampel adalah 0,973 sehungga dapat disimpulkan bahwa distribusi sampel normal. Oleh karena itu, dapat dilakukan uji korelasi. Berdasarkan uji didapatkan nilai p 0,001 sehingga dapat disimpulkan terdapat peningkatan kadar absorbansi
33
protein sampel yang telah diinduksi kalsium klorida dibandingkan yang tidak. 4.4 Tingkat Konsentrasi Protein PRP2 Pengukuran tingkat konsentrasi protein pada sampel dilakukan dengan rumus persamaan linier, y= 0,022x + 0,107. Y merupakan kadar absorbansi protein sampel dan x merupakan tingkat konsentrasi yang dicari. Contoh perhitungan rumus : y = ax + b x= x=
–
x = 2.0909
Perhitungan seluruh sampel disajikan dalam grafik sebagai berikut,
2,500 2,000
Konsentrasi PRP2 (m)
1,500 1,000 0,500 0,000
-0,500
S1
S2
S3
S4
-1,000
S5
S6
Konsentrasi Ca
-1,500
Konsentrasi (-)
-2,000 -2,500
Sampel PRP2
Gambar 4.4. Grafik Tingkat Konsentrasi Protein Sampel PRP 2
Berdasarkan grafik diatas terlihat bahwa kurva konsentrasi protein dalam PRP2 yang diinduksi oleh kalsium klorida lebih tinggi daripada yang tidak diinduksi kalsium klorida. Adapun rata tingkat konsentrasi protein yang
34
diinduksi oleh kalsium klorida adalah 0,402 jika dibandingkan yang tidak yaitu - 0,364. Hal ini sebanding dengan data hsail kadar absorbansi yang didapat peneliti. 4.4.1 Uji Korelasi Tingkat Konsentrasi Protein PRP2 Data juga dianalisis normalitas distribusinya dengan uji normalitas yang sama dengan yang digunakan pada kadar absorbansi protein sampel. Tabel 4.4 Uji Normalitas dan Uji Korelasi Tingkat Konsentrasi Protein PRP2 Nama
Nilai
Normalitas
Variabel
p
Distribusi
Tingkat Konsentrasi Protein
0,001
0,963
Distribusi sampel normal dan P<0,05 yaitu 0,001 sehingga hipotesis peneliti dapat diterima yaitu terdapat peningkatan protein yang dideteksi pada PRP yang telah diinduksi kalsium klorida dibandingkan dengan tidak. Peningkatan tersebut sesuai dengan yang terdapat dalam jurnal Amable, tahun 2013 yang menyatakan bahwa kalsium klorida merupakan induksi yang sangat baik dalam mengeluarkan growth factor. Hamilton juga menyatakan bahwa pada PRP2 yang diinduksi kalsium klorida akan dihasilkan lebih banyak growth factor dibandingkan dengan yang diinduksi oleh senyawa lain seperti thrombin.16,22
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 1.1 Kesimpulan 1. Hasil penelitian tingkat konsentrasi protein sampel menunjukkan terdapat peningkatan tingkat konsentrasi protein PRP2 yang diinduksi oleh kalsium klorida (0,402) dibandingkan dengan tidak (- 0,364). Hal ini sebanding dengan peningkatan absorbansi protein pada PRP2 yang diinduksi kalsium (0,116) dibandingkan yang tidak (0,099) . 2. Terdapat perbedaan kadar absorbansi PRP1 dan PRP2 yang cukup signifikan, dimana kadar absorbansi PRP1 lebih besar dibandingkan dengan PRP2. Kadar absorbansi akan berjalan sebanding dengan konsentrasi sehingga didapatkan tingkat konsentrasi protein PRP1 lebih banyak dibanding PRP2. 1.2 Saran 1. Peneliti
menyarankan
untuk
dilakukan
penelitian
lanjutan
yang
membandingkan efektivitas dan pengaruh PRP1 dan PRP 2 dalam aspek klinis. 2. Peneliti menyarankan untuk dilakukan penelitian lanjutan mengenai seberapa besar pengaruh protein yang terdapat pada PRP dalam aspek klinis . 3. Peneliti menyarankan untuk dilakukan penelitian lanjutan yang lebih spesifik mengenai kuantifikasi growth factor yang terdapat dalam PRP1 dan PRP2.
35
DAFTAR PUSTAKA
1. Civinini, Roberto and Nistri, Lorenzo. Growth Factors in the Treatment of Early Osteoarthritis. Clinical Cases in Mineral and Bone Metabolism. 2013. 2. Winslow, Terese ,Regenerative Medicine. USA : National Institute of Health, 2006. 3. Sherwood, Lauralee. Human Physiology: From Cells to Systems. West Virginia : Cengage Learnig, 2012. 4.
International Cellular Medicine Society. Platelet Rich Plasma Guidlines. http:/www.cellmedicinesociety.org, International Cellular medicine Society 2011.
s.l. :
5. Ferrari, M, A New Technique for Hemodilution, Preparation of Autologous Platelet Rich Plasma and Intraoperative Blood Salvage in Cardiac Surgery. s.l. : Int J Artif Organs, 1987. 10(1):47-50. 6. Campbell, Neil A. etc. Biology. Jakarta : Erlangga, 2010. 7. Hoffbrand, A.V., Petit, J.E. and Moss, P.H. Kapita Selekta Hematologi. Jakarta : EGC, 2013. 8. Tortora, Gerard J and Derrickson, Bryan H. Principles of Anatomy and Phisiology. USA : John Wiley & Sons, Inc, 2009. 9. Diggs, L.W., Sturm, D. and Bell, A. The morphology of human blood cells. s.l. : Abbot, 2005. 10. Kumar, Vinay,etc. Basic Pathology Robbins & Cotran, Vol.1. Philadelphia : Elsevier, 2014. 11. Dorland. Dorland's Illustrated Medical Dictionary 32nd Ed. s.l. : Elsevier Saunders, 2011. 12. Everts PAM, Knape JTA, Weibrich G, Schönberger JPAM, Hoffmann, Platelet rich plasma and platelet gel, A review. USA : s.n. 21st Mechanisms of Perfusion Congress, 2006. 13. Rifa'i, Muhaimin. Signal Transduksi dan Sistem Pertahanan Tubuh. Malang : Galaxy Science, 2009. 14. Giusti I, Rughetti A .Identification of an optimal concentration of platelet gel for promotingangiogenesis in human endothelial cells.. s.l. : Transfussion, 2009. 15. Balk, SD, Calcium as regulatorof the proliferation of normal, but not transformed, chicken fibroblasts in a plasma containingmedium. USA : Proc Natl Acad Sci, 1971. [PubMed : 5277067].
36
37
16. Amable, Paola Romina, et al, Platelet-Rich Plasma Preparation for Regenerative medicine : Optimization and Quantification of Cytokines and Growth Factors. Vol. 4, Brazil : Stem Cell Research & Therapy, 2013. 17. Arnoczky, Steven P., Delos, Demetris and Rodeo, Scott A, What is Platelet Rich Plasma. Operative Technique in Sports Medicine ,s.l. : Elsevier Saunders, 2010. 18. Delong, Jeffrey M., Russel, Ryan P and Mazzocca, Augustus D, Platelet-Rich Plasma: The PAW Classification System. Vol. 28, USA : The Arthroscopy Association of North America, The Journal ofery Arthroscopic and Related Surg, 2012.. 19. Graziani F, Ivanovski C , The Invitro effect of Different PRP Concentrations on osteoblasts and fibroblast.. s.l. : Clin Oral Implants Res, 2006. 20. Weibrich G, Hansen K. Effect of Platelet Concentration in Platelet Rich Plasmaon periimplant bone regeneration. s.l. : Bone, 2004. 21. Martinez, Santos F,Practical Guidlines for Using PRP in the Orthopaedics Office. Illinois : AAOS, 2010. 22. Hamilton, Bruce and etc.Exercise And The Platelet Activator Calcium Chloride Both Influence The Growth Factor Content Of PRP: Overlooked Biochemical Factors That Could Influence PRP Treatment. New Zealand : Br J Sports Med, 2013. 23. Gore, Michael. Spectrophotometry & Spectrofluorimetry. NewYork : Oxford University Press, 2000. 24. Bain, Barbara J.Ethnic And Sex Differences In The Total And Differential White Cell Count And Platelet Count. London : Journal of Clinical Pathology, 1996. 25. Segal, Jodi B. Platelet Counts Differ by Sex, Ethnicity and Age in the United States. Baltimore : Elsevier, 2006. 26. Jansen, Roberta. Um Brasil Europeu. s.l. : O Globo, 2011. 27. Lu, Hellen H and Vo, Jennifer M ,Controlled delivery of platelet-rich plasma-derived.. New York : Wiley InterScience, January 2008. DOI: 10.1002/jbm.a.31740. 28. Soeroso, Admadi, Sitokin. Solo : Jurnal Oftalmologi Indonesia, 2007, Jurnal Oftalmologi Indonesia, Vol. 5. 1693-2587. 29. Pathak Rakesh R. Small Size Sampling. Surendranagar : Int J of Basic & Clin Pharmacology, 2012
38
Lampiran 1 Surat Persetujuan Responden Formulir Informed Consent TINGKAT KONSENTRASI PROTEIN PADA PLATELET RICH PLASMA 2 (PRP2) YANG DIINDUKSI OLEH KALSIUM Setelah memperoleh kejelasan mengenai tujuan, manfaat, prosedur dan kemungkinan resiko, serta jawaban atas pertanyaan yang diberikan oleh peneliti dalam penelitian, TINGKAT KONSENTRASI PROTEIN PADA PLATELET RICH PLASMA 2 YANG DIINDUKSI OLEH KALSIUM maka saya yang bertanda tangan di bawah ini: Nama : Alamat : Jurusan
:
Semester
:
Dengan ini menyatakan dengan penuh kesadaran bersedia berpartisipasi dalam penelitian tersebut dan bersedia diambil darah vena sebanyak 3 ml sesuai dengan
prosedur
yang
telah
ditetapkan
dalam
penelitian
TINGKAT
KONSENTRASI PROTEIN PADA PLATELET RICH PLASMA 2 YANG DIINDUKSI OLEH KALSIUM. Selanjutnya, Apabila dalam masa penelitian, saya merasa dirugikan karena penelitian ini, saya berhak mengundurkan diri dari keterlibatan saya, serta membatalkan persetujuan ini, tanpa sanksi apapun dan dari pihak manapun. Ciputat, …………….. 2015 Mengetahui, Responden
(
Peneliti
)
(Muthiah Miftahul)
38
39
Lampiran 2 Surat Tanda Terima Permohonan Penelitian
40
Lampiran 3 Tabel Data dan Hasil Uji Statistik 1. Tabel Data Pengambilan Sampel Tabel 1. Absorbansi Sampel PRP 1 PRP 1
ABSORBANSI Ca
(-)
Sampel 1
0.134
0.118
Sampel 2
0.139
0.103
Sampel 3
0.137
0.119
Sampel 4
0.119
0.107
Sampel 5
0.144
0.139
Sampel 6
0.132
0.082
Rata-Rata
0.134
0.111
Tabel 2. Absorbansi Sampel PRP 2 PRP 2
ABSORBANSI Ca
(-)
Sampel 1
0.153
0.139
Sampel 2
0.099
0.088
Sampel 3
0.081
0.064
Sampel 4
0.126
0.114
41
Sampel 5
0.109
0.083
Sampel 6
0.127
0.106
Rata-Rata
0.116
0.099
Tabel 3. Tingkat Konsentrasi Protein pada Sampel PRP2 PRP 2 KONSENTRASI Ca (-) Sampel 1 2.091 1.455 Sampel 2 -0.364 -0.864 Sampel 3 -1.182 -1.955 Sampel 4 0.864 0.318 Sampel 5 0.091 -1.091 Sampel 6 0.909 -0.045 Rata-Rata 0.402 -0.364 2. Hasil Uji Statistik Absorbansi PRP 2 Ca dan (-) Descriptives Statistic Mean
,11583
95% Confidence Interval for
Lower Bound
,08948
Mean
Upper Bound
,14219
5% Trimmed Mean
,11570
Median
,11750
Variance Abs Ca 2
Std. Error ,010252
,001
Std. Deviation
,025111
Minimum
,081
Maximum
,153
Range
,072
Interquartile Range
,039
Skewness
,122
,845
-,107
1,741
,09900
,010764
Kurtosis Mean Abs
95% Confidence Interval for
Lower Bound
,07133
(-) 2
Mean
Upper Bound
,12667
5% Trimmed Mean
,09872
42
Median
,09700
Variance
,001
Std. Deviation
,026367
Minimum
,064
Maximum
,139
Range
,075
Interquartile Range
,042
Skewness
,318
,845
Tests of Normality a
Kolmogorov-Smirnov Statistic Abs Ca 2
df
,162
Abs (-) 2
,162
Shapiro-Wilk
Sig. 6 6
Statistic
df
Sig.
,200
*
,982
6
,963
,200
*
,985
6
,974
*. This is a lower bound of the true significance. a. Lilliefors Significance Correction
3. Hasil Uji Statistik Konsentrasi PRP 2 Ca dan (-) Descriptives Statistic Mean
,40150
95% Confidence Interval for
Lower Bound
-,79649
Mean
Upper Bound
1,59949
5% Trimmed Mean
,39561
Median
,47750
Variance Kon Ca 2
,466038
1,303
Std. Deviation
1,141556
Minimum
-1,182
Maximum
2,091
Range
3,273
Interquartile Range
1,773
Skewness Kurtosis Mean Kon (-) 2
Std. Error
,122
,845
-,108
1,741
-,36367
,489403
95% Confidence Interval for
Lower Bound
-1,62172
Mean
Upper Bound
,89438
43
5% Trimmed Mean
-,37630
Median
-,45450
Variance
1,437
Std. Deviation
1,198787
Minimum
-1,955
Maximum
1,455
Range
3,410
Interquartile Range
1,909
Skewness Kurtosis
,318
,845
-,176
1,741
Tests of Normality a
Kolmogorov-Smirnov Statistic Kon Ca 2
df
,162
Kon (-) 2
Sig. 6
,162
Shapiro-Wilk
6
Statistic
df
,200
,982
6
,963
,200
*
,985
6
,973
*. This is a lower bound of the true significance. a. Lilliefors Significance Correction
4. Hasil Uji Korelasi kadar absorbansi protein PRP2 Correlations Abs Ca 2 Abs Ca 2
Pearson Correlation
Abs (-) 2 1
.976
Sig. (2-tailed)
Pearson Correlation Sig. (2-tailed)
**
.001
N Abs (-) 2
Sig.
*
6
6
**
1
.976
.001
N
6
6
**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).
5. Hasil Uji Korelasi tingkat konsentrasi protein PRP2 Correlations KonCa 2
Kon (-) 2
46
6.2.2 Pembuatan Reaktan Biuret (NaOH 10 % dan CuSO4 0,1%)
47
6.2.3 Pembuatan PRP2
49
Tempat, Tanggal Lahir
: Balikpapan, 08 september 1994
Alamat
: Jln. Baleno I E1 No.1Perumahan Permata Regensi Bekasi RT05/ RW 016, Wanasari, Cibitung, Bekasi 17521
Email
:
[email protected]
Riwayat Pendidikan
:
1. SDIT Thariq Bin Ziyad Bekasi Timur
2000-2006
2. MTs PPMI Assalaam Surakarta
2006-2009
3. SMAN 01 Tambun Selatan
2009-2012
4. PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2012-sekarang
