THERAPIE VAN BORSTKANKER MET BEHULP VAN MONOKLONALE ANTILICHAMEN

FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN

Academiejaar 2011 - 2012

THERAPIE VAN BORSTKANKER MET BEHULP VAN MONOKLONALE ANTILICHAMEN

Shari VANDENBOSCH

Promotor: Prof. dr. Katleen De Preter Co-promotor: Annelies Fieuw

Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding

MASTER IN DE GENEESKUNDE

“De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”

03/05/2012

Shari Vandenbosch (auteur)

Prof. dr. K. De Preter ( promotor)

VOORWOORD Het kiezen van een onderwerp voor je masterproef is altijd een beetje een ‘gok’. Je ziet een heleboel titels maar weet eigenlijk niet wat die juist allemaal inhouden. Ik heb geluk gehad want het bleek dat het onderwerp van mijn masterproef me enorm boeide. Het is een zeer actueel en ruim onderwerp en het schrijven van deze masterproef heeft mijn inzichten en interesse in het thema erg vergroot. Ik zou vooral graag mijn begeleidster Annelies Fieuw willen bedanken voor haar aanwijzingen, vele tips en steun. Ondanks de afstand, waardoor de communicatie niet altijd gemakkelijk was, heeft ze steeds erg veel geduld gehad met mij. Ik vond het een heel aangename samenwerking. Heel erg bedankt hiervoor! Ook had ik graag mijn ouders en vriend bedankt voor al hun geduld en hulp. Het gevoel van steun en zekerheid dat zij me geven, ervaar ik zeker niet als vanzelfsprekend!

INHOUDSTAFEL 1. ABSTRACT…………………………………………………………………………………....1 2. INLEIDING……………………………………………………………………………………2 2.1. Kanker…………………………………………………………………………………….2 2.1.1. Definitie…………………………………………………………………………2 2.1.2. Epidemiologie…………………………………………………………………...3 2.1.3. Ontstaansmechanismen………………………………………………………….4 2.2. Borstkanker……………………………………………………………………………….8 2.2.1. Algemeen………………………………………………………………………..8 2.2.2. Ontstaansmechanismen………………………………………………………….9 2.2.3. Types borstkanker……………………………………………………………...10 2.2.4. Risicofactoren………………………………………………………………….12 2.2.5. Symptomen.……………………………………………………………………14 2.2.6. Klinisch onderzoek en diagnose…...…………………………………………..14 2.2.7. Behandeling……………………………………………………………………15 2.2.8. Prognose………………………………………………………………………..16 2.3. Gerichte kankerbehandelingen………………………………..……………………….17 3. MATERIAAL EN METHODEN…………………………………………………………...18 4. RESULTATEN………………………………………………………………………………19 4.1. Doelgerichte therapie…………………………………………………………………..19 4.1.1. De epidermale groeifactor receptor familie……………………………………19 4.1.2. Antilichamen………………………………………………………………...…20 4.1.3. Ontwikkeling van therapeutische antilichamen………………………………..21 4.1.4. Werkingsmechanismen………………………………………………………...22 4.1.5. Small molecule tyrosine kinase inhibitoren...………………………………….24 4.1.6. Borstkanker…………………………...………………………………………..25 4.1.6.1. Indicaties……………………………...……………………………..25 4.1.6.2. Moleculaire doelwitten………………………………………………26 4.2. Monoklonale antilichamen in borstkankertherapie…………………………………26 4.2.1. Anti- ErbB2 antilichamen……………………………………………...………26 4.2.1.1. Trastuzumab…………………………………………………………26 4.2.1.2. Pertuzumab…………………………………………………………..30 4.2.2. Anti-angiogenetische antilichamen…………………………………………….30 4.2.2.1. Bevacizumab………………………………..……………………….30

5. DISCUSSIE……………………………………………………………………………….….34 5.1. Vergelijking tussen de verschillende therapieën……………………………...34 5.2. Toekomstperspectieven………………………………………………...………35 6. CONCLUSIE…………………………………………………………...…………………….37 7. REFERENTIES…………………………………………………...…………………………38

1. ABSTRACT Borstkanker vormt wereldwijd een groot gezondheidsprobleem. Het is de meest gediagnosticeerde tumor en de belangrijkste kankergerelateerde doodsoorzaak bij vrouwen. De huidige behandelingen voor borstkanker kunnen echter bij een deel van de patiëntenpopulatie geen oplossing bieden. Daarom is de toegenomen kennis omtrent de ontstaansmechanismen van kanker een grote stap, aangezien het de mogelijkheid geboden heeft om op deze mechanismen in te grijpen en tumorcellen als specifiek doelwit te benaderen. Zo heeft de ontwikkeling van monoklonale antilichamen een enorme doorbraak betekend in de behandeling van kanker. De meerderheid van de humane epitheliale tumoren, waaronder borstkanker, worden gekenmerkt door een functionele activatie van groeifactoren en groeifactor receptoren van de epidermale groeifactor receptor (EGFR) familie. Deze zijn dan ook het voornaamste doelwit geworden voor de monoklonale antilichamen. Voorlopig is enkel het anti-HER2 (humane epidermale groeifactor receptor 2) /neu antilichaam trastuzumab goedgekeurd door de food and drug administration (FDA) voor gebruik bij borstkanker. In combinatie met adjuvante chemotherapie wordt het risico op herval gereduceerd en wordt het ziektevrije interval en de totale overleving verlengd in patiënten met gemetastaseerde HER2 positieve borstkanker. Er zijn momenteel echter heel wat clinical trials lopende om het gebruik van monoklonale antilichamen te verbeteren en verder uit te breiden. In deze masterproef zullen de belangrijkste monoklonale antilichamen als huidige of mogelijk toekomstige behandeling van borstkanker besproken worden, namelijk trastuzumab, pertuzumab en bevacizumab.

1

2. INLEIDING 2.1. KANKER 2.1.1. Definitie Kanker wordt gekenmerkt door een ongecontroleerde groei van abnormale lichaamscellen als gevolg van een aanhoudende celdeling (1, 2). Het is een meerstapsproces waarbij normale cellen progressief evolueren naar neoplastische cellen. Tijdens dit proces ontwikkelen de cellen specifieke eigenschappen, die ervoor zorgen dat ze een groeivoordeel hebben ten opzichte van normale cellen (3, 4). Tot deze fundamentele kankereigenschappen behoren onder andere de continue toegang tot groeisignalen, het ontwijken van groei-onderdrukkende signalen, het ontwijken van geprogrammeerde celdood of apoptose, de mogelijkheid om oneindig te delen, angiogenese of bloedvatvorming en invasie en metastasevorming (3, 5) (figuur 1).

Figuur 1. Belangrijke verworven eigenschappen tijdens de vorming van kankercellen, samen met de therapeutische mogelijkheden om op deze eigenschappen in te werken (3).

2

2.1.2. Epidemiologie Kanker is de belangrijkste doodsoorzaak in ontwikkelde landen en de tweede doodsoorzaak in ontwikkelingslanden (6). Factoren die in belangrijke mate bijdragen tot de stijgende kankerincidentie in ontwikkelde landen zijn onder meer de vergrijzing van de populatie en de westerse levensstijl, bijvoorbeeld roken en gebrek aan beweging (6). De meest voorkomende tumoren bij mannen in ontwikkelde landen zijn longkanker, prostaatkanker en colorectale kanker. Bij vrouwen zijn dit borstkanker, longkanker en colorectale kanker (1, 6) (Figuur 2).

Figuur 2. Deze figuur geeft het aantal sterftes weer wereldwijd in 2008 als gevolg van kanker. Dit aantal werd geschat op 12,7 miljoen kankergevallen waarvan 7,6 miljoen sterftes. Ontwikkelde landen worden vaker getroffen door de ziekte maar in ontwikkelingslanden veroorzaakt borstkanker vaker sterfte (6).

3

2.1.3.

Ontstaansmechanismen

Onder normale omstandigheden worden cellen geactiveerd door groeisignalen. Zij maken de overgang mogelijk van cellen in rusttoestand naar actieve prolifererende cellen. Groeisignalen worden voornamelijk overgebracht door groeifactoren (3). Die binden aan receptoren op het celoppervlak dewelke vaak tyrosine kinase domeinen bevatten, waardoor een intracellulaire signaalcascade in gang wordt gezet met invloed op onder andere de celcyclus en celgroei (3, 7). In normaal weefsel is er een nauwgezette controle van groeistimulerende signalen en in afwezigheid van deze stimulerende signalen kunnen normale cellen niet prolifereren. Dit zorgt ervoor dat celaantal,weefselarchitectuur en -functie behouden blijven. Kankercellen kunnen deze controlemechanismen echter ontwijken waardoor er een ongecontroleerde celgroei ontstaat. Dit vermogen tot continue proliferatie kunnen kankercellen op verschillende manieren bekomen. Er kan bijvoorbeeld een overproductie zijn van de groeifactor liganden, of de groeifactorreceptoren kunnen onafhankelijk van deze liganden intracellulair groeisignalen doorsturen (3). Een tweede eigenschap van kankercellen is de mogelijkheid om signalen die de groei onderdrukken te ontwijken. Deze groei-onderdrukkende signalen verlopen voornamelijk via twee belangrijke signaalwegen, enerzijds aangestuurd door RB1 en anderzijds door p53 (3). RB1 is een nucleair eiwit met een belangrijke functie in de celcyclus. Het inhibeert namelijk de overgang van de G1 (gap) fase naar de S (synthese) fase en verhindert hierdoor celgroei. De G1/S overgang is een complex proces waarbij cyclines en cycline-dependente kinasen een belangrijke rol spelen. Die kunnen RB1 fosforyleren waardoor de interactie met transcriptiefactoren verloren gaat, ze actief worden en transcriptie kan plaats vinden. Dit induceert de overgang van de cel van de G1 fase naar de S fase (figuur 3). Bij deletie of inactivering (bv. door inactiverende mutaties) van het RB1 eiwit gaat deze controle op de celdeling verloren. Dit is een bevorderende factor in heel wat tumoren en kan een verklaring vormen voor een verschillende reactie op therapeutische agentia (8). TP53 codeert voor de tumor suppressor p53. Omwille van zijn functie wordt het eiwit ook wel ‘de bewaker van het genoom’ genoemd. Het wordt geactiveerd als gevolg van intracellulaire schade, zoals DNA schade of hypoxie. Afhankelijk van de ernst van deze schade wordt ofwel de celcyclus stilgelegd en komt er een herstellingsproces op gang, of wordt apoptose of geprogrammeerde celdood geïnduceerd (figuur 3). Dit vormt een natuurlijke bescherming tegen kanker en defecten in deze signaalweg, bijvoorbeeld via mutaties in TP53, kunnen ervoor zorgen dat kankercellen de kans krijgen om te blijven prolifereren en resistent te worden aan apoptose. Hierdoor zullen defecten in DNA niet hersteld worden wat leidt tot genomische instabiliteit. Dit is een voorbeschikkende factor voor het ontstaan van kanker, omdat een normale cel uiteindelijk maligne zal worden door accumulatie van die mutaties. In normale omstandigheden beschikt de cel over een aantal belangrijke mechanismes die bescherming bieden tegen genomische instabiliteit waarvan de belangrijkste de tumor suppressor

4

proteïne p53 is (9). Mutaties in of verlies van TP53 is één van de frequentste genetische veranderingen in tumoren. Het spreekt dan ook voor zich dat dit gen een belangrijk doelwit vormt voor therapeutische mogelijkheden (10).

Figuur 3. DNA schade is een veel voorkomende gebeurtenis in het leven van een cel. In normale omstandigheden is de cel hiertegen gewapend, onder andere door middel van het tumor suppressor eiwit p53 en het RB1 eiwit. Activatie van p53 zal bijvoorbeeld leiden tot activatie van het p21 gen, dewelke een inhibitor is van het cycline dependente kinase 2 (CDK2). Dit voorkomt intrede van beschadigde cellen in de S fase, zodat deze cellen zich niet kunnen vermenigvuldigen. Wanneer beschadigde cellen dan toch de overgang van de G1 fase naar de S fase hebben kunnen voltooien, zullen deze op een volgend niveau worden tegengehouden en dit tot wanneer de DNA integriteit hersteld is. Bij onherstelbare schade wordt apoptose geïnduceerd. In de meeste humane tumoren zal er, door een mutatie in één van de twee bovengenoemde tumor suppressor genen, een verminderde functie optreden van het DNA herstelmechanisme ter hoogte van de G1 fase in de celcyclus (8).

Daarnaast worden kankercellen ook gekenmerkt door het vermogen tot ongelimiteerde celdeling. Normale cellen kunnen slechts een beperkt aantal celdelingen uitvoeren. Er zijn twee mechanismen die hiervoor verantwoordelijk zijn: veroudering en crisis. Als een cel na een bepaald aantal delingen stopt met prolifereren, maar nog levensvatbaar is, dan spreekt men van veroudering. In dit verouderingsproces spelen telomeren een belangrijke rol (3). Telomeren zijn nucleoproteïnen opgebouwd uit een combinatie van zes nucleotiden, in vertebraten TTAGGG, dewelke repetitief is (11). Ze beschermen de uiteinden van eukaryotische chromosomen. Bij iedere celdeling wordt het 5

telomeer korter. Uiteindelijk zullen de telomeren te kort worden om de uiteinden van de chromosomen te beschermen. De cel kan niet meer delen, veroudert en sterft. Dit is een fysiologisch proces dat de delingscapaciteit van normale lichaamscellen beperkt. Hoe langer het telomeer, hoe meer succesvolle celdelingen kunnen plaatsvinden (3, 12). In kankercellen heb je echter een verhoogde activiteit van het telomerase enzym, een gespecialiseerde DNA polymerase dat het telomeer na iedere celdeling weer zal verlengen tot zijn oorspronkelijke lengte. Die telomerase activiteit is aanwezig in geslachtscellen, stamcellen en kankercellen maar is zo goed als afwezig in de andere lichaamscellen (3, 11). Nadat cellen de verouderingsfase hebben doorlopen, komen ze terecht in de crisisfase. In de crisisfase zal het grootste deel van de cellen afsterven. Onder bepaalde zeldzame omstandigheden is het echter mogelijk dat cellen in crisis een ongelimiteerd groeipotentieel verwerven. Deze transitie wordt immortalisatie genoemd wat bijdraagt tot de vorming van kankercellen (3). Angiogenese of bloedvatvorming is een volgende noodzakelijke eigenschap van kankercellen. Enerzijds voorzien bloedvaten de cel van zuurstof en voedingsstoffen, cruciaal voor de celfunctie en celoverleving. Anderzijds verzorgen ze ook de afvoer van metabole afvalstoffen en koolstofdioxide. Angiogenese speelt een belangrijke rol in wondheling en in de vrouwelijke reproductieve cyclus waarbij het kortstondig wordt geactiveerd. Tijdens tumorprogressie daarentegen is angiogenese bijna continu geactiveerd met voortdurend vorming van nieuwe bloedvaten. Die hebben echter een afwijkende vorm en worden gekenmerkt door onder andere het vroegtijdig ontstaan van capillairen, vergrote vervormde vaten, aanwezigheid van bloedingen, een overvloedig aantal vertakkingen, toegenomen endotheelproliferatie en apoptose. Tumoren verstoren namelijk het evenwicht tussen de aanzet tot of de inhibitie van angiogenese (3). De belangrijkste mediator in tumor angiogenese is de vasculaire endotheliale groeifactor A (VEGF-A). Die wordt in de meeste humane tumoren in toegenomen mate tot expressie gebracht en het gaat vaak gepaard met een minder gunstige prognose. De verhoogde expressie van VEGF-A in tumoren kan veroorzaakt worden door verschillende omgevingsfactoren zoals hypoxie, een lage pH en groeifactoren. Het oefent zijn werking uit door binding aan een VEGF receptor waarvan VEGRF-2 de belangrijkste is in tumor angiogenese (13). Op een bepaald moment zullen de meeste tumoren het vermogen ontwikkelen om het omliggend weefsel te gaan invaderen en om te metastaseren (3). Invasie is een noodzakelijke vereiste voor metastase, maar dit betekent niet noodzakelijk dat een invaderende kanker zal metastaseren. Er zijn namelijk een heleboel tussenstappen nodig om van een beginnende kanker naar een metastaserende ziekte te evolueren (14) (figuur 4). Deze cascade wordt vaak de invasie-metastase cascade genoemd. Deze begint met lokale invasie, gevolgd door intravasatie, waarbij het basale membraan wordt doorbroken en de kankercellen verschijnen in nabijgelegen bloed- en lymfevaten (3, 15). Hierop volgt het transport van de kankercellen in het lymfatisch en hematogeen systeem en het uittreden van de cellen uit het lumen van de vezels naar het parenchym van verder afgelegen weefsel, een proces dat extravasatie wordt genoemd. Uiteindelijk worden kleine nodules van kankercellen gevormd, namelijk 6

micrometastasen, dewelke zullen uitgroeien tot macroscopische tumoren. Deze laatste stap wordt kolonisatie genoemd (3). Metastase wordt dus gedefinieerd als uitzaaiing van maligne cellen van het initieel aangetaste orgaan naar een ander orgaan of weefsel op afstand. Het is de doodsoorzaak in negentig procent van alle humane tumoren (14).

Figuur 4. Ontstaan van een invasief carcinoom en metastasen uit normaal plaveiselepitheel (16).

7

De hierboven opgesomde eigenschappen zijn noodzakelijk voor het ontstaan van kanker. We beschikken echter over controlemechanismen, die afwijkingen in het DNA snel ontdekken en herstellen. Ze staan in voor het bewaren van de integriteit van het genoom en zorgen ervoor dat mutaties zeldzame gebeurtenissen zijn. Toch treedt kanker regelmatig op in de populatie. De reden hiervoor is het slecht functioneren van specifieke componenten van de caretaker systemen. Hierdoor krijgt het genoom een verhoogde gevoeligheid voor mutaties. Defecten treden voornamelijk op in de genen betrokken in de detectie van DNA schade en activatie van het herstelmechanisme, in het onmiddellijke herstel van DNA schade en in de genen die mutagenen inactiveren voordat ze schade aan het DNA verrichten (3). Zoals reeds eerder gezegd, speelt het p53 tumor suppressor eiwit een belangrijke rol in het behouden van de integriteit van het genoom. Als antwoord op DNA schade zal het de celcyclus stilleggen zodat DNA herstel of apoptose mogelijk is (3, 10). Een groter inzicht in de ontstaansmechanismen van kanker heeft de mogelijkheid gecreëerd om hierop in te grijpen (4). Het heeft de kans geboden nieuwe kankertherapieën te ontwikkelen die specifiek hun werking uitvoeren op kankercellen, met behoud van het normale weefsel. Die moleculaire gerichte technieken omvatten onder andere monoklonale antilichamen, small molecules, peptide mimetica en antisense oligonucleotiden (17), waarvan monoklonale antilichamen en small molecules inhibitoren de belangrijkste zijn. De monoklonale antilichamen zullen in deze masterproef in detail besproken worden.

2.2. BORSTKANKER 2.2.1. Inleiding Borstkanker of mammacarcinoom is een maligne proliferatie van cellen uitgaande van het borstklierweefsel (18). Het is de meest gediagnosticeerde tumor en de belangrijkste kankergerelateerde doodsoorzaak bij vrouwen wereldwijd (6, 19). Een vrouw heeft een risico van tien procent om borstkanker te krijgen, met een risico op sterfte hieraan van 3,5 procent (20). In de laatste twintig jaar kunnen we een daling in borstkankerincidentie en –sterfte vaststellen, dankzij vroegtijdige detectie met screeningprogramma’s en aanvullende systemische therapie (21). Ondanks de grote vooruitgang in diagnose en behandeling van borstkanker blijven er nog steeds belangrijke vragen onopgelost. Vragen met betrekking tot preventie (wie moet er gescreend worden en wanneer moet er gescreend worden), diagnose (nood aan meer specifieke en sensitieve methoden), tumorprogressie en –herval (wat is de oorzaak en hoe kunnen we het voorkomen), behandeling (wie moet behandeld worden en hoe moet er behandeld worden) en therapieresistentie (hoe te voorspellen, voorkomen en overwinnen). Borstkanker is een heterogene ziekte, wat het antwoorden op bovenstaande vragen er niet makkelijker op maakt (19). 8

2.2.2. Ontstaansmechanismen Een normale borst bestaat uit 15-20 lobes, gescheiden door fascia. Die lobes, zelf opgebouwd uit alveoli of acini, worden elk afzonderlijk gedraineerd door een ductaal systeem, dat uitmondt in een lobaire ductus (20, 22). Normale borstducti en acini bevatten een centraal lumen omzoomd door twee cellagen, een binnenste laag luminale epitheelcellen en een buitenste laag myoepitheelcellen. Hierrond bevindt zich het basaal membraan, dewelke het epitheel van het stroma scheidt. Het stroma bestaat uit vet, bindweefsel, bloedvaten, zenuwen en lymfevaten (19, 22). Borstkanker ontstaat in het borstweefsel, meest frequent in de ducti, door transformatie van één enkele cel, gevolgd door ongecontroleerde celdeling en –groei (19). De organisatie van het borstweefsel wordt verstoord en de celpolariteit gaat verloren (figuur 5). Wanneer de kankercellen binnen het ductaal-lobulair systeem blijven en dus het basaal membraan niet overschrijden, spreekt men van een in situ carcinoom (22). Eens het basale membraan doorbroken is, kunnen de tumorcellen de omgevende weefsels gaan invaderen en migreren naar organen op afstand. We spreken dan over een invasief carcinoom (figuur 4). In tegenstelling tot de goedaardige in situ carcinomen, is het invasief carcinoom maligne en zal het uiteindelijk leiden tot het ontstaan van metastasen (19) (figuur 6).

Figuur 5. De verschillen in histologie tussen normaal en maligne borstweefsel. In normaal borstweefsel bestaan de acini en ducti uit een hol lumen omringd door een binnenste cellaag luminale epitheelcellen en een buitenste laag myoepitheelcellen. Die structuur is omgeven door het basaal membraan, die een scheiding vormt met het stroma. In borstkanker daarentegen is deze weefselorganisatie verstoord, waarbij onder andere het lumen verloren gaat (22).

9

Figuur 6. Veranderingen in de structuur en organisatie van de cel als gevolg van kanker. Naarmate de kanker vordert, is er een toename van de verschillende celsoorten. Bij een in situ carcinoom kan reeds een plaatselijke onderbreking van de myoepitheliale cellaag gezien worden. Wanneer het basaal membraan echter wordt onderbroken resulteert dit in het ontstaan van een invasief carcinoom, dat over de capaciteit beschikt om zich te verspreiden naar de omliggende weefsels en metastasen te veroorzaken (19).

2.2.3. Types borstkanker Er zijn twee grote types borstkanker: het ductaal carcinoma en het lobulair carcinoma (21, 23). Het ductaal carcinoma start in de ducti die de melk transporteren van de borst naar de tepel. Dit is de meest frequente vorm. Het lobulair carcinoma ontstaat in de lobules, dewelke melk produceren. Uitzonderlijk kan borstkanker ontstaan in andere delen van de borst. Zoals reeds vermeld kan borstkanker invasief of niet-invasief zijn. Bij de invasieve vorm is er uitzaaiing van de ducti of lobules naar andere weefsels in de borst. Bij de niet-invasieve vorm daarentegen is de kanker gelokaliseerd en nog niet uitgezaaid. Deze vorm noemt men in situ. Zo heb je het ductaal carcinoma in situ (DCIS) en het lobulair carcinoma in situ (LCIS). Hierbij is er dus nog geen invasie in het omliggend weefsel, maar onbehandeld kunnen ze wel evolueren naar een invasief carcinoom (23) (figuur 7).

10

Figuur 7. Histologische veranderingen bij borstkankerprogressie (24).

11

In een groot aantal gevallen is borstkanker oestrogeengevoelig, wat betekent dat oestrogeen de tumorgroei stimuleert. De kankercellen hebben dan oestrogeenreceptoren op hun celoppervlakte. Dit noemt men oestrogeen-receptor-positieve kanker (23). In ongeveer vijftien tot twintig procent van alle mammacarcinomen heb je een overexpressie van het HER2 (humane epidermale groeifactor receptor 2)/neu gen en dus ook van het gelijknamige eiwit. Dit is een transmembranaire tyrosine kinase receptor en speelt een belangrijke rol in celgroei, differentiatie en -overleving. HER2/neu positieve borsttumoren kennen een agressiever verloop zoals snellere groei, toegenomen invasiviteit, stimulatie van angiogenese en een verhoogd risico op perifere metastasering. De patiënten hebben een slechtere prognose en een hogere therapieresistentie. In de behandeling van deze tumoren wordt gebruik gemaakt van monoklonale antilichamen, bijvoorbeeld Trastuzumab. Die zijn gericht tegen een specifiek domein van de HER2/neu proteïne en veroorzaken degradatie van de receptor (20, 23).

2.2.4. Risicofactoren Aangezien de meeste vormen van borstkanker hormoondependent zijn, kunnen het merendeel van de risicofactoren hiermee in verband gebracht worden. Langdurige blootstelling aan seksuele hormonen, van de menarche tot de menopauze, verklaart waarom borstkanker zo frequent voorkomt bij de vrouw (20). Enkele van deze risicofactoren zijn: •

Leeftijd en geslacht. Het risico op borstkanker stijgt met de leeftijd en de piekincidentie ligt rond de leeftijd van vijftig jaar (20). Vrouwen hebben honderd keer meer kans om getroffen te worden dan mannen (23).

•

Leeftijd van de menarche en menopauze. Een vroegtijdige menarche (voor de leeftijd van 12 jaar) of laattijdige menopauze (na de leeftijd van 55 jaar) betekent een langere blootstelling aan seksuele hormonen en dus een hoger risico op borstkanker (20, 23).

•

Genetische predispositie. Een belangrijk deel van alle mammacarcinomen zijn het gevolg van genetische predispositie. De genen die hiervoor verantwoordelijk zijn, zijn het BRCA1 gen, gelegen op chromosoom

12

17, en het BRCA2 gen, gelegen op chromosoom 13. Deze genen produceren normaal proteïnen die beschermend werken tegen kanker (20, 23). •

Familiale voorgeschiedenis van borstkanker. De aanwezigheid van familieleden met een geschiedenis van borst-, uterus-, ovarium- of colonkanker verhoogt ook het risico op borstkanker (23).

•

Voorgeschiedenis Als er een voorgeschiedenis is van goedaardige borstaandoeningen, zoals eenvoudige epitheliale hyperplasie, papillomatosis of adenosis, neemt het risico eveneens toe (20).

Aan bovenstaande risicofactoren kan je niets veranderen, ze zijn inherent aan de persoon (23). Andere risicofactoren zijn: •

Pariteit en leeftijd van de eerste zwangerschap. Nullipare vrouwen of vrouwen met een eerste zwangerschap na de leeftijd van dertig jaar hebben een verhoogd risico op borstkanker (20).

•

Ioniserende straling. Dit is voornamelijk het geval wanneer het borstklierweefsel op jonge leeftijd wordt blootgesteld aan ioniserende straling. Dit is dan ook de reden dat men de mammografie afraadt op jongere leeftijd. Voor de leeftijd van vijfendertig jaar zal men voor de evaluatie van een symptomatische afwijking een echografie doen in plaats van een mammografie (20, 23).

•

Geografische factoren. De incidentie is het hoogst in West- en Noord-Europa, Australië, Nieuw-Zeeland en NoordAmerika. De laagste incidentie wordt teruggevonden in het Verre Oosten. Hieruit kan men afleiden dat levensgewoonten, waaronder voeding, een rol spelen in de incidentie van borstkanker (6, 20).

•

Dieet. Het dagelijks gebruik van één of twee glazen alcohol doet het risico op borstkanker toenemen doordat het de endogene oestrogeenspiegel verhoogd. Ook obesitas zou een risicofactor zijn, opnieuw door een toegenomen blootstelling aan oestrogenen (20, 23).

13

•

Hormonale medicatie. Het gebruik van hormonale anticonceptie voor een periode langer dan tien jaar voor vrouwen jonger dan vijfendertig jaar zou eveneens een licht verhoogd risico met zich meebrengen. Dit effect zou echter verdwijnen tien jaar na het beëindigen van de hormonale anticonceptie (20, 23).

2.2.5. Symptomen Het beginstadium van borstkanker verloopt vaak symptoomloos. Wanneer de kanker verder uitbreidt, ontstaan symptomen zoals een harde, onregelmatige, meestal pijnloze massa. Die kan zich in de borst bevinden, maar kan zich ook situeren in de oksel (20, 23). Andere mogelijke afwijkingen zijn onder andere roodheid, huid- of tepelintrekking, oedeem, pijn en een zwaar gevoel. Ook asymmetrische verdikkingen of unilateraal tepelsecreet kunnen wijzen op borstkanker en moeten bijgevolg goed opgevolgd en onderzocht worden (18, 20, 23). In een verder gevorderd stadium kan de patiënt symptomen vertonen als botpijn, ulcera, borstpijn, zwelling van de arm aan de zijde waar de tumor zich bevindt en gewichtsverlies (23).

2.2.6. Klinisch onderzoek en diagnose Doordat het beginstadium van borstkanker vaak symptoomloos verloopt, is het belangrijk dat op regelmatige basis een borstonderzoek gedaan wordt (23). Dit gebeurt door middel van een klinisch onderzoek waarbij de borsten eerst geïnspecteerd worden, waarna een palpatie van de borst en de omgevende klierregio’s (oksel, hals, supra- en infraclaviculair) gedaan wordt om tenslotte tepelsecreet te gaan opsporen (20). Aan de hand van inspectie en palpatie worden veranderingen in grootte, vorm en consistentie van de borst en tepel opgezocht. Hierbij wordt de patiënt in verschillende houdingen onderzocht. In het normale borstklierweefsel kan men, voornamelijk bij jongere vrouwen, tijdens de palpatie verdikkingen of nodulaire massa’s voelen. Dit betekent echter niet dat de vrouw borstkanker heeft. Borstklierweefsel is namelijk niet homogeen, wat het onderscheid met tumoren bemoeilijkt (20). Zoals reeds vermeld gaan we ook steeds tepelsecreet opsporen aangezien dit eveneens een symptoom kan zijn van borstkanker. Voornamelijk unilateraal tepelsecreet is verdacht. Dit wordt verder onderzocht door een rechtstreeks microscopisch onderzoek (20).

14

Voor verdere diagnose is echter beeldvorming nodig. Afhankelijk van de indicaties wordt gebruik gemaakt van mammografie, echografie en, uitzonderlijk, MRI voor de beeldvorming. In Vlaanderen wordt een screeningsprogramma georganiseerd waarbij alle vrouwen tussen 50 en 70 jaar om de twee jaar gratis een mammografie kunnen laten nemen. Bij patiënten met een positieve familiale anamnese begint de screening vroeger en gebeurt ze frequenter (20). Wanneer bij klinisch onderzoek of via beeldvorming een vermoedelijk kwaadaardig letsel werd vastgesteld, moet dit bevestigd worden via cytologisch of histologisch onderzoek. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een dunnenaald-aspiratiecytologie of een dikkenaaldbiopsie (20, 25). Om de overlevingskansen te bepalen en de therapie te kiezen, wordt gebruik gemaakt van de TNMclassificatie. Dit is een internationaal gestandaardiseerd classificatiesysteem dat kanker in verschillende stadia opdeelt.

‘T’ (tumor) geeft informatie over de diameter van de tumor in

centimeter, ‘N’ (node) is positief wanneer er palpabele lymfeklieren zijn en ‘M’ (metastasis) wanneer er metastasen zijn (20). Metastasen zijn het frequentst terug te vinden in de lymfeklieren, longen, lever en het bot (18). Voor de TNM-stadiëring wordt gebruik gemaakt van lichamelijk onderzoek, röntgenonderzoek van de thorax, bloedonderzoek, botscan en echografie van de lever (18, 20). Bij vrouwen met een verhoogd risico op een erfelijke vorm van borstkanker wordt ook DNA onderzoek aangeboden (18).

2.2.7. Behandeling Hoe borstkanker behandeld wordt is afhankelijk van hoe ver de ziekte zich heeft uitgebreid. Zo wordt een DCIS behandeld met een mastectomie. Hierbij wordt zowel de hele borst verwijderd als de okselklieren weggeruimd. Dit is een radicale behandeling die genezend is in 98-99 procent van de gevallen. Wanneer de tumor klein is en beperkt tot een bepaalde regio in de borst kan lokale resectie van de tumor gevolgd door radiotherapie een minder radicale oplossing bieden (18, 20). De visie op de behandeling van kanker is de laatste dertig jaar sterk gewijzigd. Vroeger dacht men dat de patiënten voornamelijk overleden ten gevolge van lokale recidieven en ging men vooral extensieve chirurgie toepassen. Nu is het echter duidelijk dat de meerderheid overlijdt als gevolg van metastasering. Men moet met andere woorden niet enkel lokale controle bewerkstelligen maar eveneens controle van eventuele micrometastasen. Dankzij deze nieuwe visie wordt het invasief carcinoom nu gelijktijdig op drie niveaus behandeld, namelijk lokaal (door middel van een tumorextractie), locoregionaal (met radiotherapie ter preventie van lokale recidieven) en systemisch (met hormonale therapie en chemotherapie ter preventie van metastasen) (20).

15

De chirurgische behandeling van een invasief carcinoom houdt een tumorectomie in, gevolgd door radiotherapie. Hierbij wordt de tumor ruim gereseceerd en wordt de schildwachtklier of sentinel okselklier verwijderd. Dit is de eerste klier waar de kankercellen naar zullen uitzaaien. Wanneer die klier niet ingenomen is, mag er aangenomen worden dat er geen uitzaaiingen zijn. Wanneer een tumorectomie niet haalbaar is, wordt een mammectomie uitgevoerd (20). Bij een risico op locoregionaal recidief van meer dan dertig procent wordt radiotherapie gegeven, wat de overlevingskansen verhoogt met vijf procent. Dit betekent dat radiotherapie aangewezen is wanneer de okselklieren ingenomen zijn, na een mastectomie bij tumoren met een diameter van meer dan 5 centimeter, bij stadium pT4-tumoren en na een tumorectomie. Ook wordt het gebruikt om de symptomen van metastasen te bestrijden, zoals pijn door botmetastasen of neurologische uitval door hersenmetastasen (20). De mogelijke adjuvante systemische therapieën zijn hormonale therapie, chemotherapie en doelgerichte therapie. (20, 25). De hormonale behandeling kan worden toegepast bij oestrogeen- en/ of progestageengevoelige tumoren. Dit is het geval bij één derde van de borstkankerpatiënten (20, 25). De mogelijke hormonale adjuvante behandelingen zijn: ovariële suppressie door middel van een bilaterale ovariëctomie of toediening van een langwerkend GnRH-analoog, van anti-oestrogenen (waarvan tamoxifen momenteel de belangrijkste is) en van aromatase-inhibitoren. Bij premenopauzale vrouwen wordt

geopteerd voor

ovariële suppressie of voor

tamoxifen,

een selectieve

oestrogeenreceptormodulator (SERM) met een anti-oestrogeeneffect ter hoogte van de borst (20). Bij postmenopauzale vrouwen genieten tamoxifen of aromastase-inhibitoren de voorkeur. Bij receptor positieve borstkanker kan toediening van tamoxifen na chirurgie het risico op overlijden verminderen met twaalf procent (20, 25). Chemotherapie wordt gebruikt bij patiënten die niet reageren op hormoontherapie of wanneer een snelle respons vereist is vanwege een hoog risico op bijvoorbeeld leverfalen (25). Chemotherapie vernietigt micrometastasen en verkleint op deze manier het risico op herval en overlijden. Bij vrouwen jonger dan vijftig jaar reduceert het de kans op overlijden met 27 procent en bij vrouwen tussen 50-69 jaar met 11 procent (20). Doelgerichte therapie kan aangewend worden in borstkankertumoren met overexpressie va het HER2/ neu gen (20). Dit zal verder besproken worden in de resultaten sectie.

2.2.8. Prognose De gemiddelde vijfjaarsoverleving is meer dan tachtig procent. Hoe vroeger de diagnose wordt gesteld, hoe sneller men kan ingrijpen en hoe beter de prognose (18). Zo wordt de tienjaarsoverleving van kleine laaggradige lymfeklier negatieve tumoren geschat op meer dan negentig procent, terwijl dit voor grote hooggradige tumoren met uitzaaiing naar de lymfeklieren nog slechts 10% is (25). 16

De prognose van de patiënten is afhankelijk van verschillende prognostische factoren, waaronder tumorgrootte, histologisch type, differentiatiegraad, status van de oestrogeen en progesteron receptor, de leeftijd van de patiënt en menopauzale status. Wanneer de kankercellen receptor positief zijn, kunnen ze behandeld worden met hormoontherapie, wat dit tot een gunstige prognostische factor maakt (25). Factoren die de prognose negatief beïnvloeden zijn het optreden van borstkanker op jonge leeftijd, een grote tumor, een hoge graad van differentiatie, een oestrogeen en progesteron receptor negatieve tumor en de aanwezigheid van positieve lymfeknopen (25).

2.3. GERICHTE KANKERBEHANDELINGEN Doordat we de laatste jaren meer inzicht hebben gekregen in de ontstaansmechanismen van kanker is de mogelijkheid gegroeid om hierop in te grijpen (4). Ongeveer een eeuw geleden ontstond de magic bullet hypothese. Deze hield in dat een bepaalde chemische substantie, een zogenaamde magic bullet, ontwikkeld kon worden die specifiek gericht is tegen welbepaalde micro-organismen. Met de ontwikkeling van de hybridoma technologie kon dit concept, namelijk doelgerichte therapie, in praktijk worden omgezet. Hierbij werden monoklonale antilichamen ontworpen met het vermogen om zeer specifieke associaties aan te gaan met hun doelwitantigenen. De eerste generatie monoklonale antilichamen werden echter in hun gebruik beperkt door hun immunogeniciteit, wat inhoudt dat er een immuunrespons van het lichaam ontstaat tegen de monoklonale antilichamen, en hun lage capaciteit om die immuunrespons op te wekken. Deze gebreken werden opgelost door de ontwikkeling van de chimere en gehumaniseerde monoklonale antilichamen (17, 26). De ontdekking van receptor tyrosine kinasen heeft een enorme doorbraak betekend in de behandeling van kanker. Deze kinasen zijn een subklasse van de celoppervlakte groeifactor receptoren met een intrinsieke ligand gecontroleerde tyrosine kinase activiteit. Ze staan in voor de regulatie van verschillende celfuncties waaronder proliferatie, migratie, differentiatie en overleving en spelen een cruciale rol in de oncogenese. In normale omstandigheden wordt de tyrosine kinase activiteit strikt gecontroleerd. In kankercellen kan een structurele verandering in de tyrosine kinase receptor echter leiden tot overactivatie van de receptor en zijn downstream pathways. Tyrosine kinasen zijn dus oncogenen die betrokken kunnen zijn in de ontwikkeling en progressie van heel wat humane tumoren (7). De meerderheid van de humane epitheliale tumoren worden gekenmerkt door een functionele activatie van groeifactoren en groeifactor receptoren van de epidermale groeifactor receptor (EGFR)-familie (27). Dit is dan ook de reden dat receptor tyrosine kinasen en hun liganden, voornamelijk de epidermale groeifactor receptor, doelwit zijn geworden voor therapeutische interventie. Ze hebben een 17

enorme doorbraak betekend in de behandeling van kanker. Enkele van deze gerichte therapieën zijn onder andere gehumaniseerde monoklonale antilichamen en small molecules. Deze therapieën worden momenteel reeds gebruikt in de behandeling van borstkanker, gastro-intestinale stromale tumoren en niet-kleincellige longkanker (7). De verschillende gerichte kankerbehandelingen en hun werkingsmechanismen zullen verder besproken worden in het resultaten- en discussiegedeelte.

18

3. MATERIAAL EN METHODEN Om relevante publicaties op te zoeken betreffende het onderwerp van deze masterproef werd eerst en vooral gebruik gemaakt van de zoekmachine PubMed (28). De initiële zoektermen waren ‘monoclonal antibody’, ‘targeted therapy’ en ‘cancer’. Deze zoektermen werden verder aangevuld met bijkomende criteria om al een eerste selectie uit te voeren, zoals de datum van publicatie (2001-2011) en de taal waarin het artikel gepubliceerd werd (Nederlands, Engels en Frans). Zo werd een ruim aanbod aan artikels gevonden die voornamelijk gebruikt werden om achtergrondinformatie te verwerven. Die hoeveelheid artikels was echter te ruim en er werden additionele zoektermen gebruikt. Wanneer bijvoorbeeld receptor tyrosine kinasen besproken werden, werd dit toegevoegd als zoekterm. Indien er moeilijkheden waren met het vinden van artikels met algemene informatie over een bepaald onderwerp, bijvoorbeeld de faag display technologie, werd gebruik gemaakt van Google Scholar (28). Doelgerichte therapieën zijn momenteel een zeer relevant onderwerp en omvatten een groot onderzoeksgebied in kanker. Bovendien worden vele van deze therapieën momenteel ook getest in verschillende klinische studies (29). Omwille van het grote aantal gevonden publicaties en de grote heterogeniteit aan toepassingen en tumoren waarin deze gerichte therapieën en meer bepaald de monoklonale antilichamen van belang zijn, werd ervoor gekozen om de zoektocht toe te spitsen op één type kanker, namelijk borstkanker. Deze tumor werd gekozen omwille van de relevantie van deze tumor in het therapeutisch onderzoek naar targeted therapies en monoklonale antilichamen. Hiertoe werd de zoekterm ‘breast cancer’ toegevoegd aan de vorige zoektermen. Voor algemene informatie betreffende borstkanker werd ook gebruik gemaakt van de zoekmachine Google Scholar (28), en van de online encyclopedie MedlinePlus (28). Aan de hand van de gevonden informatie kon er meer specifiek naar de meest gebruikte en/of onderzochte monoklonale antilichamen gezocht worden, met name ‘Trastuzumab’, ‘Bevacizumab’ en ‘Pertuzumab’ (30). Die termen werden dan afzonderlijk aan de zoektermen toegevoegd om nog specifieker te zoeken naar de verschillende doelgerichte therapieën in borstkanker. Een belangrijk criterium bij de selectie en het kritisch lezen van de publicaties is het tijdschrift waarin deze gepubliceerd worden, meer bepaald de impact factor van deze tijdschriften. Deze impact factor, die een maat is voor de belangrijkheid van het tijdschrift, werd opgezocht via ISI Web of Science (31). Een tweede belangrijk punt om in rekening te brengen was of er geen belangenvermenging was, bijvoorbeeld doordat een producent van één van de besproken antilichamen een sponsor van de paper was. Dit was bij enkele artikels het geval, dewelke kritischer werden gelezen en, indien mogelijk, werden de resultaten nagegaan in andere artikels over hetzelfde onderwerp.

19

4. RESULTATEN 4.1.

DOELGERICHTE THERAPIE

De introductie van het magic bullet concept, waarbij tumorcellen als specifiek doelwit worden benaderd, heeft ons toegelaten om monoklonale antilichamen en small molecule inhibitoren als therapie te gebruiken (17). Aangezien de meerderheid van de humane epitheliale tumoren gekenmerkt worden door een activatie van groeifactoren en receptoren van de epidermale groeifactor receptor (EGFR) familie, is dit een uitstekend doelwit voor deze vorm van kankertherapie (27).

4.1.1. De epidermale groeifactor receptor familie De EGFR of ERBB familie bestaat uit vier leden: HER1 (EGFR), HER2, HER3 en HER4. Deze hebben alle vier een extracellulair ligandbindingsdomein, een enkelvoudige transmembraanregio en een cytoplasmatisch tyrosine kinase-bevattend domein. Activatie van HER receptoren is, onder normale omstandigheden, afhankelijk van de aanwezigheid van hun liganden. Die liganden behoren tot de EGF-familie van groeifactoren en binden aan HER1, HER3 en HER4, maar niet aan HER2, dat permanent actief is en geen ligand nodig heeft. Na binding van het ligand vormen de receptoren homoen heterodimeren, waarbij HER2 de voorkeurspartner is voor de andere leden van de HER-familie. Het resultaat van de dimerisatie is een cascade van intracellulaire signalen die uiteindelijk zal leiden tot ontsnapping aan apoptose en stimulatie van proliferatie, angiogenese, celadhesie, invasie en metastasering. Activatie van HER leidt met andere woorden tot het verwerven van eigenschappen nodig voor de transformatie naar een kankercel (4, 32, 33) (Figuur 8).

4.1.2. Antilichamen Antilichamen of immunoglobulines (Ig) worden geproduceerd door plasmacellen als reactie op antigenen. Wanneer de plasmacel in contact komt met een antigen, wordt ze gestimuleerd en begint ze grote hoeveelheden antilichamen te produceren met als doel de antigenen te neutraliseren. Antilichamen zijn opgebouwd uit vier ketens, namelijk twee identieke zware ketens (α, δ, ε, γ of μ) en twee identieke lichte ketens (κ of λ), samengehouden door middel van disulfide bruggen. Zij bevatten elk een variabel domein en een constant domein. Het variabele domein herkent en bindt de antigenen, terwijl het constante domein instaat voor de stabiliteit en voor de interactie met de lichaamseigen receptoren. Een immunoglobuline kan in drie delen gesplitst worden: twee antigen bindende fragmenten, Fabs, dewelke gebonden zijn aan een constant deel, Fc (34, 35).

20

Afhankelijk van de zware keten, worden de immunoglobulinen opgedeeld in vijf verschillende klassen: IgA, IgD, IgE, IgG, en IgM. Ongeveer tachtig procent van de antilichamen in ons serum zijn IgG. Dit is ook de klasse die gebruikt wordt als therapeutische antilichamen (34).

Figuur 8. Activatie van de EGFR-afhankelijke intracellulaire signaal cascade verloopt in drie belangrijke stappen. Eerst bindt een receptor-specifieke ligand aan het extracellulaire domein van de EGFR of aan de HER 2(humane epidermale groeifactor receptor 2, HER3 of HER4. Vervolgens ontstaat er een EGFR-EGFR dimeer (homodimeer) of een EGFR-HER2, EGFR-HER3 of EGFR-HER4 dimeer (heterodimeer). Door deze dimerisatie vindt ATP-afhankelijke fosforylatie plaats van het tyrosine kinase domein wat uiteindelijk leidt tot het verderzetten van de signalisatie naar het cytoplasma en naar de kern (27).

4.1.3 Ontwikkeling van therapeutische antilichamen In 1975 introduceerden Köhler en Milstein de muis hybridoma technologie (36). Hiermee werden, door de fusie van antilichaam producerende B-lymfocyten (plasmacellen) en myeloomcellen, hybride cellen geproduceerd die eigenschappen bevatten van beide cellen. Ze kunnen namelijk antilichamen aanmaken, een eigenschap afkomstig van de B-lymfocyten, én onbeperkt gekweekt worden in vitro, een eigenschap afkomstig van de myeloomcellen (34, 35).

21

Deze antilichamen bleken echter beperkt bruikbaar als therapeutisch agens omwille van hun korte halfleven in het serum, hun gebrek aan effect in het lichaam van de gastheer en de productie van humane anti-muriene antilichamen, de HAMA respons. Die respons hield in dat het menselijk lichaam de muriene antilichamen als vreemd beschouwde en bijgevolg antilichamen ging aanmaken die specifiek gericht waren tegen de muriene immunoglobulinen (34, 35, 37). Deze beperkingen gaven aanleiding tot het ontwerpen van chimere antilichamen met als doel de immunogeniciteit, die de muriene antilichamen opwekken, te verminderen. Een chimeer antilichaam heeft een humaan constant domein maar een variabel domein van een muis. Hiertegen werden echter ook antilichamen geproduceerd. Verdere humanisering van de antilichamen werd mogelijk door CDR (complementary determining region) grafting. Daarnaast heeft de mogelijkheid om de genen die coderen voor humane variabele regio’s te isoleren en tot expressie te brengen in Escherichia Coli samen met de introductie van de faag-display technologie eveneens het ontwikkelen van therapeutische antilichamen heel wat vergemakkelijkt. Door deze technologische verbeteringen werden de antilichamen uiteindelijk bruikbaar voor klinisch gebruik (34, 35) (Figuur 9). Faag-display is een techniek die toelaat een groot aantal peptiden en proteïnen die specifieke functies kunnen uitvoeren, zoals bijvoorbeeld antilichamen, te produceren en te isoleren. De DNA sequenties van de antilichamen worden geïntegreerd in het genoom van de bacteriofaag. Zo kunnen de fagen alle mogelijke antilichamen tot expressie brengen die voorkomen in het organisme waarvan het DNA afkomstig is en die zullen ze dan presenteren op hun oppervlakte. Op deze manier kan een bibliotheek van fagen worden aangelegd die verschillende antilichamen tot expressie brengen. Het grote voordeel van deze antilichaambibliotheken is dat selectie plaats vindt in vitro, waardoor men specifiek antilichamen kan isoleren voor onder andere bepaalde geneesmiddelen (35, 38). Tegenwoordig is de selectie van humane antilichamen uit deze faag bibliotheek de meest gebruikte en gekende technologie voor de ontwikkeling van nieuwe humane antilichamen (35).

22

Figuur 9. De verschillende soorten therapeutische monoklonale antilichamen met bijhorende nomenclatuur. Het chimere antilichaam bevat zowel humane als muriene componenten. Dankzij onder andere CDR grafting werd verdere humanisering van het antilichaam mogelijk. Uiteindelijk kon men een volledig humaan antilichaam ontwikkelen. Hierdoor wordt immunogeniciteit ontweken en kunnen de antilichamen aangewend worden voor klinisch gebruik (35, 39).

4.1.4. Werkingsmechanismen Monoklonale antilichamen worden voornamelijk gebruikt voor membraangebonden doelwitten (40). De meeste antilichamen herkennen specifiek een welbepaald antigen en manipuleren de immuunrespons van de gastheer tegen tumoren. Andere blokkeren ligandbinding aan de receptor, veroorzaken een toename van receptorinternalisatie, inhiberen de celcyclusprogressie of DNA herstel of leiden tot afname van angiogenese. Ook kan binding van een antilichaam aan zijn receptor leiden tot overstimulatie waardoor apoptose wordt geïnduceerd. Ten slotte kunnen de antilichamen als transportmiddel gebruikt worden om de kankercellen te bestoken (4, 17, 26). Een eerste mechanisme van de therapeutische werking is antilichaam afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC). ADCC treedt op wanneer een monoklonaal antilichaam bindt aan een antigen op een tumorcel en het Fc domein van het antilichaam een binding aangaat met de Fc receptor van een immuun-effectorcel, wat uiteindelijk leidt tot fagocytose of onmiddellijke cytolyse (26). Het antigen wordt verwerkt en aangeboden via MHC klasse I of II moleculen aan antigen-presenterende cellen. In de gastheer wordt een immuunantwoord gegenereerd met productie van cytotoxische T-lymfocyten en/of antilichamen gericht tegen de tumor (41) (figuur 10). 23

Figuur 10. Activatie van de adaptieve of verworven immuunrespons door antilichaam-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit. Een monoklonaal antilichaam, gericht tegen een welbepaalde tumor, hecht zich enerzijds aan een antigen op de tumorcel en anderzijds aan een Fc receptor op een killer cel. De fagocytose of cytolyse die hiervan het gevolg is, geeft uiteindelijk aanleiding tot de productie van T-lymfocyten en/of antilichamen dankzij inductie van de adaptieve immuniteit (41).

Een tweede mechanisme is complement-afhankelijke cytotoxiciteit, waarbij na binding van het monoklonale antilichaam aan het celoppervlak, blootstelling plaatsvindt van de bindingssite van het antilichaam voor proteïnen, die zo dan de complementcascade in gang zetten. De loslating van chemotactische factoren en vorming van een complex dat schade toebrengt aan het celmembraan, resulteert uiteindelijk in cellyse (26). Veranderingen induceren in de signaaltransductie is een derde werkingsmechanisme van monoklonale antilichamen. Een groot deel van de tumorgeassocieerde antigenen die gebruikt worden als doelwit zijn groeifactor receptoren. Binding van groeifactoren aan deze receptoren beïnvloedt onder andere differentiatie, migratie en overleving van de cel. Overexpressie van die receptoren, vaak voorkomend in tumoren, leidt dus vanzelfsprekend tot groei van die tumorcellen en vermindert de gevoeligheid aan chemotherapeutica. Door middel van een verminderde signalisatie via deze receptoren, zorgen monoklonale antilichamen voor normalisatie van de groeisnelheid en wordt de gevoeligheid aan cytotoxische agentia hersteld. De krachtigste inhibitoren van de signaaltransductie pathway zijn antilichamen die zich richten op leden van de EGFR familie (26, 27).

24

Een volgende werking van monoklonale antilichamen is het opwekken van een immuunreactie waardoor de kankercellen worden opgeruimd. Dit werd aangetoond in diermodellen, maar men weet nog niet of dit mechanisme ook een rol speelt bij de mens (4, 26). Tenslotte kunnen monoklonale antilichamen ook gebruikt worden als transportmiddel voor cytotoxische stoffen, gericht tegen de kankercellen. Die cytotoxische agentia kunnen onder andere radio-isotopen, toxines, cytokines en enzymen zijn (4, 26).

4.1.5. Small molecule tyrosine kinase inhibitoren Zoals hierboven vermeld werd, spelen tyrosine kinasen een belangrijke rol in heel wat cruciale cellulaire processen waaronder celproliferatie, differentiatie, migratie, angiogenese en celcylus regulatie, waardoor de werking van deze kinasen vaak ontregeld is in kanker (17, 42). Dit verklaart waarom ze niet alleen een doelwit vormen voor monoklonale antilichamen, maar eveneens voor de small molecule inhibitoren. In tegenstelling tot monoklonale antilichamen hebben small molecule inhibitoren een direct effect op de tumorcellen (17). Er zijn verschillende soorten tyrosine kinase inhibitoren, maar de meeste zijn ATP mimetica die op de ATP-bindingsplaats binden, waardoor de intracellulaire signaaloverdracht geblokkeerd wordt. De cel kan bijgevolg niet meer prolifereren en gaat in apoptose (4). Imatinib, één van de eerste succesvolle small molecule inhibitoren, inhibeert bijvoorbeeld de kinase activiteit van het BCR-ABL fusie eiwit en van KIT. Ook oncogenen zoals EGFR, de vasculaire endotheliale groeifactor receptor (VEGFR) en de platelet-derived groeifactor receptor (PDGFR) zijn vaak een doelwit van de tyrosine kinase inhibitoren (17, 43). Small molecule inhibitoren kennen enkele voordelen ten opzichte van monoklonale antilichamen. Om te beginnen kunnen ze oraal toegediend worden en worden ze goed verdragen. Bovendien zijn het kleine moleculen die zich kunnen verplaatsen doorheen het plasmamembraan en intracellulair hun effect kunnen uitvoeren. Tenslotte kunnen ze zich zo ook sneller verplaatsen en zich beter verspreiden (4, 44) en kunnen ze doorheen de bloedhersenbarrière geraken om ook hun effect uit te oefenen in het centraal zenuwstelsel (44). Het verschil tussen monoklonale antilichamen en small molecule inhibitors wordt ook opgemerkt in de naam: respectievelijk –mab en –nib. Ze verschillen echter ook op heel wat andere gebieden zoals onder andere in toedieningswijze, farmacologie, farmacokinetiek en -dynamiek, in het opwekken van een immuunrespons, bijwerkingen en kostprijs (4, 17, 26, 45) (Figuur 11). In deze masterproef zullen de small molecule tyrosine kinase inhibitoren niet verder uitgediept worden en blijft de focus op de monoklonale antilichamen.

25

Figuur 11. Verschillen tussen monoklonale antilichamen (Mabs) en tyrosine kinase inhibitoren (Nibs) (4).

4.1.6. Borstkanker 4.1.6.1. Indicaties Er wordt reeds een twintigtal jaar gebruik gemaakt van een combinatie van twee types adjuvante systemische therapie ter behandeling van borstkanker, namelijk hormonale therapie en chemotherapie. Het gebruik hiervan heeft geleid tot een verbetering op het vlak van overleving en herval van de tumor, maar die verbetering is de laatste jaren gestagneerd (20, 45). Intussen is het concept van doelgerichte therapie echter sterk veranderd, waarbij geneesmiddelen worden ontwikkeld die zich specifiek richten op de moleculaire afwijkingen, onder andere degene verantwoordelijk voor oncogenese (46). Het gebruik van deze doelgerichte therapie bij de behandeling van borstkanker wordt momenteel volop onderzocht en evolueert nog steeds. Het huidige gebruik beperkt zich voornamelijk tot de behandeling van HER2-positieve borstkanker patiënten. Trastuzumab is een voorbeeld van zo'n monoklonaal antilichaam dat specifiek tegen de HER2 receptor werkt en reeds wereldwijd gebruikt wordt. Andere HER2 antilichamen, zoals Pertuzumab, zijn in ontwikkeling. Ook geneesmiddelen tegen andere receptoren zoals het VEGF-A antilichaam, Bevacizumab, blijken veelbelovend te zijn. Heel wat monoklonale antilichamen en small molecule inhibitors worden reeds gebruikt in de behandeling van andere tumoren. Hun veiligheid en hun mogelijkheden voor behandeling van borstkanker wordt momenteel volop onderzocht (46).

26

4.1.6.2. Moleculaire doelwitten De belangrijkste doelwitten van monoklonale antilichamen in de behandeling van borstkanker zijn de epidermale groeifactor receptor familie en de vasculaire endotheliale groeifactor familie (46). Zoals hoger vermeld bestaat de EGFR familie uit vier verschillende receptor tyrosine kinasen: EGFR (ErbB-1), ErbB-2 (HER2), ErbB-3 (HER3) en ErbB-4 (HER4). Zij spelen een belangrijke rol in celgroei, celdifferentiatie en celoverleving (47). De receptoren zijn gelokaliseerd in het celmembraan en zijn opgebouwd uit een extracellulair ligand bindingsdomein, een transmembranair domein en een cytoplasmatisch domein met tyrosine kinase activiteit (30, 46). De EGFR familie wordt in heel wat humane tumoren tot overexpressie gebracht (32). Zo vertoont twintig tot dertig procent van alle borsttumoren een overexpressie van het HER2 eiwit, wat gepaard gaat met een agressievere vorm van borstkanker gekenmerkt door een snellere groei, toename van de invasiviteit en angiogenese, verhoogd risico op metastasering en dus vanzelfsprekend een minder gunstige prognose (20). Angiogenese stimulerende factoren worden vaak in verhoogde mate tot expressie gebracht in borstcarcinomen, wat hen tot een tweede belangrijk doelwit maakt voor doelgerichte therapie. Voornamelijk de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), die instaat voor de regulatie van endotheelcelproliferatie, -migratie en -genexpressie, inhibitie van endotheliale apoptose, toegenomen vasculaire permeabiliteit en vasodilatatie, is betrokken in borstkanker. Op deze manier wordt verspreiding van de tumorcellen bevorderd (45, 46).

4.2.

MONOKLONALE ANTILICHAMEN IN BORSTKANKERTHERAPIE

Doelgerichte therapie voor borstkanker kan verdeeld worden in drie verschillende groepen. De eerste groep bestaat uit geneesmiddelen gericht tegen specifieke tumorale kenmerken, zoals tegen de HER2 receptor. De tweede groep wordt gevormd door agentia gericht op de tumoromgeving, zoals antiangiogenische middelen. De laatste groep zijn inhibitoren van specifieke signaalwegen. Hun rol in de behandeling van borstkanker is nog niet volledig aangetoond (30).

4.2.1. Anti-ErbB2 antilichamen 4.2.1.1. Trastuzumab (Herceptine ®) Trastuzumab is het eerste gehumaniseerde monoklonale antilichaam dat gebruikt werd in de therapie van borstkanker (4). Het is gericht tegen het extracellulaire domein van de HER2 receptor en zorgt voor de degradatie van de receptor, waardoor de receptor gemedieerde signaaltransductie wordt 27

onderbroken en activatie van het intracellulaire tyrosine kinase domein geïnhibeerd wordt. Dit leidt tot de onderdrukking van bepaalde signaalwegen, zoals onderbreking van de celcyclus en een afname van de angiogenese (20, 48, 49). Omtrent de werking van trastuzumab zijn reeds verschillende hypothesen naar voren gebracht (33) (figuur 12). Een eerste mogelijkheid is activatie van antilichaam-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit. Trastuzumab bevat een IgG1 Fc structuur die aan een doelwit kan binden, in dit geval de kankercellen. Wanneer immuuncellen, voornamelijk natural killer cellen, deze Fc structuur herkennen, zetten ze de aanval in door middel van rekrutering van meer immuuncellen. De kankercellen worden met andere woorden aangevallen door het eigen immuunsysteem (33, 50). Een volgende hypothese is blokkering van de proteolytische klieving van het extracellulair domein van de HER2 receptor. Deze klieving resulteert normaal gezien in de loslating van het extracellulair domein en in de productie van het p95 fragment. Dit fragment wordt gefosforyleerd in borstkankercellen en de aanwezigheid ervan gaat gepaard met een verhoogd risico op lymfekliermetastase. Het extracellulair domein van HER2 kan worden teruggevonden in het serum van patiënten met borstkanker en hoe hoger de serumwaarden, hoe slechter de prognose en hoe slechter de respons op hormoon- en chemotherapie bij patiënten met gevorderde borstkanker. Trastuzumab zou dus door middel van inhibitie van de proteolytische klieving, eveneens de loslating van het extracellulair domein en de vorming van het p95 fragment voorkomen en op die manier de prognose verbeteren (33, 51). Een andere werking van trastuzumab zou de inhibitie van de intracellulaire signaaltransductie kunnen zijn door middel van inhibitie van de PI3K-Akt (Phosphatidylinositol 3-kinase- Proteïne kinase B) en MAPK (Mitogen-activated protein kinases) pathways. Deze signaalwegen staan in voor de regulatie van allerlei fysiologische processen in de cel waaronder apoptose, waardoor een verstoring van deze pathways tumorceloverleving en tumorprogressie kan bevorderen (33, 49). Een vierde mogelijk werkingsmechanisme is de inhibitie van angiogenese die geïnduceerd wordt door tumorcellen door middel van loslating van groeifactoren, zoals de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), transforming growth factor α, angiopoietine 1 en plasminogen activator inhibitor 1. In diermodellen is aangetoond dat inhibitie van deze angiogenese ervoor zorgt dat de tumor minder essentiële voedingsstoffen krijgt waardoor het tumorvolume afneemt en de vasculaire permeabiliteit vermindert. Dit vertraagt de tumorgroei en verbetert dus op die manier de overlevingsduur (33, 45). De laatste hypothese is inhibitie van het herstel van DNA schade geïnduceerd door de chemo- en radiotherapie. De cel reageert op deze schade door activatie van genen die betrokken zijn in het stilleggen van de celcyclus, inductie van DNA herstel en apoptose. Wanneer deze signaalwegen 28

stilgelegd worden, worden de genen die instaan voor DNA herstel niet geactiveerd (33). Aangezien deze signaalwegen ook belangrijk zijn voor het herstel van normale cellen, zou hierbij de bedenking kunnen gemaakt worden of dit mechanisme niet schadelijk is voor de normale lichaamscellen en bijgevolg met heel wat bijwerkingen gepaard gaat.

Figuur 12. Mogelijke hypothesen omtrent de werking van trastuzumab (33).

Trastuzumab wordt als monotherapie gebruikt of in combinatie met chemotherapie (paclitaxel (wekelijks of driewekelijks), docetaxel (wekelijks of driewekelijks) of vinorelbine (wekelijks)). Wanneer meerdere chemoterapeutica moeten worden gecombineerd, worden volgende combinaties aangeraden door het National Comprehensive Cancer Network (NCCN), namelijk trastuzumab in combinatie met paclitaxel en carboplatine of met docetaxel en carboplatine. De combinatie van trastuzumab met eerstelijns chemotherapie leidt tot een verbetering van de overleving in vergelijking met chemotherapie alleen en wordt momenteel aangeraden als behandeling voor HER2 positieve gemetastaseerde borstkanker (4, 52). Men heeft ook onderzocht of trastuzumab een meerwaarde heeft wanneer het wordt toegevoegd aan chemotherapie in de adjuvante setting (dit is na tumorexcisie en chemotherapie met eventueel ook radiotherapie). Dit blijkt nu uit verschillende studies inderdaad te leiden tot een afname van het risico op herval of sterfte in vergelijking met patiënten die geen trastuzumab ontvingen (33, 53, 54). Trastuzumab heeft een halfleven van 28 dagen en wordt slechts traag door het lichaam uitgescheiden waardoor het niet zo frequent moet worden toegediend. De aanbevolen dosis is dezelfde zowel voor de behandeling bij gemetastaseerde ziekte als voor het gebruik als adjuvans en is afhankelijk van het 29

lichaamsgewicht. Na het ontvangen van een initiële ladingsdosis, een hogere dosis aan het begin van de behandeling, wordt trastuzumab intraveneus toegediend op wekelijkse of driewekelijkse basis in een lagere dosis, namelijk de onderhoudsdosis. Bij gemetastaseerde borstkanker wordt de behandeling met trastuzumab voortgezet tot wanneer kankerprogressie optreedt. De rol van trastuzumab na het optreden van kankerprogressie is echter nog niet helemaal duidelijk en wordt verder onderzocht (48, 52, 53). Trastuzumab heeft echter, zoals elk geneesmiddel, ook bijwerkingen. Het belangrijkste neveneffect is de cardiotoxiciteit (congestief hartfalen, cardiomyopathie of een afname van de linker ventrikel ejectiefractie van meer dan tien procent ), waardoor men extra voorzichtig moet zijn bij personen met symptomatisch hartfalen, hypertensie in de voorgeschiedenis of een aandoening van de coronaire arteriën. In monotherapie treedt de cardiale dysfunctie minder frequent op maar gecombineerd met chemotherapie, en voornamelijk met anthracyclines, stijgt de incidentie van cardiale dysfunctie drastisch wegens sensitisatie van de anthracycline geïnduceerde cardiotoxische effecten. Daarom wordt aangeraden behandeling met anthracyclines te vermijden tot 25 weken na het stoppen van trastuzumab gezien de lange halfwaardetijd van dit agens. Aangezien er geen gevalideerde richtlijnen bestaan wat betreft screening of behandeling van trastuzumab geïnduceerde cardiomyopathie, is geïndividualiseerde opvolging en zorg noodzakelijk (48, 53, 55). Andere mogelijke bijwerkingen zijn overgevoeligheids- en infusiereacties (met o.a. rillingen, hypo- of hypertensie, palpitaties, aritmie, cardiale fibrillatie, zwelling van het gezicht), huidreacties, pulmonaire toxiciteit en hypomagnesiëmie. De meeste trastuzumab gerelateerde infusiereacties treden op gedurende de eerste infusie of binnen 24 uur na de infusie. Meestal zijn ze niet ernstig en treden ze nadien niet meer op, in zeldzame gevallen kunnen ze echter een fatale afloop kennen (55). Contra-indicaties voor behandeling met trastuzumab zijn een voorgeschiedenis van overgevoeligheid ten opzichte van trastuzumab of muizeneiwitten, ernstige dyspneu in rust ten gevolge van een gevorderde maligniteit of wanneer aanvullende zuurstoftherapie noodzakelijk is (56). Een toenemend probleem is echter de ontwikkeling van resistentie tegen trastuzumab. Slechts dertig procent van de patiënten met HER2 positieve gemetastaseerde borstkanker reageert op trastuzumab, waardoor zeventig procent initieel reeds resistent is aan het agens. Bovendien ontwikkelt de meerderheid die aanvankelijk gevoelig was voor trastuzumab, secundair resistentie binnen één of twee jaar. Er zijn reeds heel wat pogingen gedaan om de intrinsieke en secundaire resistentie aan trastuzumab te verklaren. Vermoedelijk ontstaat resistentie aan trastuzumab als gevolg van mechanismen die de HER2 signaalwegen wijzigen (53, 57).

30

4.2.1.2. Pertuzumab ( Omnitarg ™) Pertuzumab is een gehumaniseerd monoklonaal antilichaam dat eveneens gericht is tegen het extracellulair domein van de HER2 receptor. Het bindt echter op een andere plaats dan trastuzumab, namelijk aan het junctiegedeelte van het extracellulair domein. Hierdoor wordt hetero- of homodimerisatie verhinderd en worden dus ook de signaalwegen die hierdoor geïnduceerd worden geïnhibeerd (53, 57). Pertuzumab wordt over het algemeen goed verdragen met als belangrijkste bijwerkingen diarree, moeheid, nausea, braken en rash. Deze zijn echter slechts mild tot matig aanwezig (46). Er wordt nog volop onderzoek gedaan naar pertuzumab. Enkele studies hebben ons echter al wat informatie kunnen

verschaffen over de farmacokinetiek. Pertuzumab heeft een halfleven van

ongeveer twee tot drie weken. Daarom wordt toediening voorgesteld op driewekelijkse basis (58, 59). In monotherapie heeft Pertuzumab slechts geringe antitumorale activiteit (60). Pertuzumab heeft echter een synergistisch effect met trastuzumab en het is aangetoond dat het product ook effectief is in trastuzumab refractaire gemetastaseerde borstkanker (57, 61). Momenteel loopt er ook een studie, genaamd CLEOPATRA (CLinical Evaluation Of Pertuzumab and TRAstuzumab), om de veiligheid en doeltreffendheid na te gaan van de combinatie trastuzumab, pertuzumab en docetaxel als behandeling van eerstelijns HER2 positieve gemetastaseerde borstkanker. Hierbij ontvangt een deel van de patiënten een combinatie van trastuzumab, pertuzumab en docetaxel en een ander deel enkel trastuzumab en docetaxel (53, 57, 62). Een andere studie die nu loopt is de NEOSPHERE studie die de respons rate wil evalueren van de combinatie trastuzumab, pertuzumab en docetaxel in een neoadjuvante setting, dit is bij patiënten met lokaal gevorderde inflammatoire borstkanker of HER2 positieve borstkanker in een vroeg stadium. De eerste klinische resultaten tonen aan dat de combinatie trastuzumab, pertuzumab en docetaxel gegeven in een neoadjuvante setting, voorafgaand aan chirurgie, de respons rate aanzienlijk verbeterde in vergelijking met de combinatie trastuzumab en docetaxel (zonder pertuzumab) (57). Er lopen nog heel wat klinische trials in verband met pertuzumab waarvan de resultaten nog niet bekend zijn. Daarom wordt pertuzumab hier slechts beknopt besproken. Bovendien is pertuzumab tot op heden nog niet goedgekeurd door de FDA (Food and Drug Administration) als therapie voor borstkanker (26, 63) .

31

4.2.2. Anti-angiogenetische antilichamen 4.2.2.1. Bevacizumab (Avastin™) In afwezigheid van angiogenese komen tumoren terecht in een toestand van hypoxie waardoor ze onvoldoende zuurstof en voedingsstoffen krijgen en als gevolg hiervan niet groter kunnen worden dan een diameter van 2 millimeter. Het normale antwoord van een cel op hypoxie is de productie van groeifactoren die vorming van nieuwe bloedvaten stimuleren, onder andere VEGF, TGF-β (Transforming growth factor beta) en PDGF (64, 65). De VEGF familie bestaat uit vijf leden: VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD en PIGF (Placental growth factor) en deze groeifactoren functioneren als liganden voor de VEGF tyrosine-kinase receptoren, VEGFR-1, VEGRF-2 en VEGFR-3. Deze receptoren worden tot expressie gebracht door de endotheelcellen (64). VEGF-A of VEGF is een endotheliale groeifactor met een belangrijke rol in verschillende fysiologische processen waaronder embryogenese, skeletgroei en wondheling. Het wijzigt de vasculaire permeabiliteit en reguleert angiogenese. VEGF wordt tot overexpressie gebracht in een groot aantal tumoren, waaronder borstkanker. Het is dan ook de belangrijkste groeifactor in tumor angiogenese en voornamelijk de isovormen VEGF121 en VEGF165 spelen hierin een belangrijke rol: deze activeren VEGFR-2 met als gevolg endotheel proliferatie en migratie (64, 65). VEGFR speelt bovendien een cruciale rol in groei en metastase van borstkanker en is een bepalende factor in de klinische uitkomst van de borstkankerpatiënt. Dit maakt het een interessant doelwit voor therapie (65). Bevacizumab is een gehumaniseerd monoklonaal antilichaam dat de verschillende isovormen van VEGF herkent en inhibeert, waardoor de binding aan de VEGF receptoren, en dus eveneens VEGF geïnduceerde angiogenese, verhinderd wordt. Niet alleen induceert bevacizumab regressie van de reeds bestaande abnormale tumorvascularisatie door middel van apoptose van de endotheelcellen maar het normaliseert eveneens de overblijvende tumor vascularisatie en inhibeert de vorming van nieuwe bloedvaten (30, 64-66) (figuur 13). Echter, wanneer behandeling met anti-VGEF wordt stopgezet, zullen de tumorale bloedvaten spoedig terugkomen en zal de tumor dus terug beginnen groeien. Rekening houdend met de duur van de behandeling, moet anti-VEGF behandeling daarom, om van klinisch belang te zijn, zeker aangehouden worden tot progressie van de tumor (64, 65). In monotherapie is bevacizumab niet curatief omdat het niet sterk genoeg is om alle kankercellen te elimineren. Op lange termijn zal de bloedvoorziening ook onvoldoende zijn om transport en afzetting van medicatie toe te laten. Dit is dan ook de reden dat het monoklonale antilichaam dient gecombineerd te worden met een chemotherapeuticum. In chemogevoelige tumoren hebben bevacizumab en het chemotherapeuticum een synergistisch effect doordat bevacizumab de afzetting van het chemotherapeuticum bevordert. Dankzij de stabilisering van de bloedvoorziening, als gevolg 32

van VEGF inhibitie, zullen de kankercellen ook minder snel gaan metastaseren. In combinatie met chemotherapie zal ook de normalisatie van de tumorale bloedvoorziening voordeel ondervinden. De cytotoxische agentia zullen namelijk prolifererende endotheelcellen elimineren en op deze manier normalisatie van de tumor vascularisatie en afzetting van de medicatie in de tumor bevorderen. Deze resultaten worden echter niet bekomen in chemotherapie-refractaire metastatische borstkanker aangezien de toegenomen afzetting van het chemotherapeuticum een minder groot effect heeft (66). In 2008 werd bevacizumab versneld goedgekeurd door de FDA als eerstelijnsbehandeling van HER2 negatieve gemetastaseerde borstkanker in combinatie met het eerstelijns chemotherapeuticum, paclitaxel. Het toevoegen van bevacizumab aan een chemotherapeuticum, zoals paclitaxel, docetaxel, capecitabine, een taxaan of een anthracycline, leidt tot een aanzienlijke verbetering van de progressievrije overleving, maar niet tot een verbetering van de totale overleving. Ook werden de resultaten van de Easter Cooperactive Oncology Group E2100 trial, waarbij werd aangetoond dat bevacizumab een toename van de progressievrije overleving teweeg brengt, niet opnieuw bereikt in volgende studies. Het gebrek aan toename in totale overleving en de elkaar tegensprekende studies zijn dan ook de reden dat de FDA de licentie voor het gebruik van bevacizumab als therapie voor borstkanker momenteel heeft ingetrokken in de Verenigde Staten. De discussie omtrent het gebruik van bevacizumab is echter nog niet afgesloten en volgens het Breast Cancer Guideline Committee of the NCCN en het European Medicines Agency (EMA) wordt het nog steeds aangeraden als therapeutische mogelijkheid (46, 64, 65, 67-69). Bevacizumab wordt intraveneus toegediend en heeft een halfleven van 17 à 21 dagen. Het wordt om de twee (10 mg/kg) of drie weken (15 mg/kg) toegediend en over het algemeen goed verdragen. De meest voorkomende bijwerking is hypertensie. Inhibitie van VEGF leidt tot toegenomen concentraties van nitriet oxide wat vasoconstrictie en dus hypertensie veroorzaakt. De hypertensie kan behandeld worden met de standaard antihypertensiva. Het is echter wel belangrijk dat de bloeddruk van de patiënten opgevolgd wordt gedurende de behandeling (64, 65). Andere mogelijke bijwerkingen zijn proteïnurie als gevolg van aantasting van de glomerulaire vasculaire permeabiliteit, hoofdpijn, gebrek aan energie, bloedingen (voornamelijk kleine mucocutaneuze bloedingen, zoals epistaxis), bloedstolsel met verstopping van bloedvaten, cardiale toxiciteit, gastro-intestinale perforatie of problemen met de wondgenezing (64, 65). Net zoals bij trastuzumab zijn bij het gebruik van bevacizumab ook problemen met resistentie opgetreden. Een deel van de patiënten reageert niet op toediening van bevacizumab en zelfs wanneer er reactie is, blijkt die slechts van korte duur te zijn. Aangezien bevacizumab in combinatie met chemotherapie wordt toegediend, is het moeilijk te identificeren of de resistentie optreedt tegen de anti-VEGF behandeling of tegen het chemotherapeuticum, deze identificatie zou echter belangrijk kunnen zijn voor verdere therapeutische mogelijkheden (64). 33

Aangezien bevacizumab en andere anti-angiogenetische middelen aan belang winnen in de dagelijkse klinische praktijk, dringt de nood aan biologische merkers zich op, om een patiëntenpopulatie af te bakenen die in aanmerking komt voor het gebruik van deze middelen. Daarom wordt er momenteel volop onderzoek gedaan naar biomerkers. De HER2 status is in zekere mate al een eerste selectie van de juiste patiënten voor de specifieke behandeling. De ideale biomerkers geven echter informatie over de totale overleving, hebben een hoge negatieve predictieve waarde en laten toe om geïnformeerde beslissingen te nemen wat betreft de gepaste tweedelijns behandeling. Wanneer men het gebruik van bevacizumab en andere gerichte therapieën wil invoeren als standaardtherapie ter bestrijding van kanker, zal aan deze voorwaarden moeten voldaan worden (65, 70).

34

5. DISCUSSIE 5.1.

VERGELIJKING TUSSEN DE VERSCHILLENDE THERAPIEËN ALS BEHANDELING VOOR BORSTKANKER

Antilichaam

Type

Doelwit

Indicatie in borstkanker

Werkingsmechanisme

FDA

goedkeuring

als

therapie voor borstkanker Trastuzumab

Gehumaniseerd

ErbB2

HER2 positieve borstkanker, als

Inhibitie van HER2

IgG1 antilichaam

(HER2/neu)

monotherapie of in combinatie met

signaalwegen en ADCC

ja

chemotherapie als adjuvante of palliatieve behandeling. Pertuzumab

Gehumaniseerd

ErbB2

Trastuzumab refractaire gemetastaseerde

Inhibitie van HER2 (en

IgG1 antilichaam

(HER2/neu)

borstkanker

indirect HER)

Mogelijk gunstig resultaat in combinatie

dimerisatie

Neen

met trastuzumab in gemetastaseerde HER2 positieve borstkanker Bevacizumab

Gehumaniseerd IgG1 antilichaam

VEGF

In combinatie met een

Inhibitie van VEGF

chemotherapeuticum als eerstelijns

signalering

Neen

behandeling in gemetastaseerde HER2 negatieve borstkanker Tabel 1. Monoklonale antilichamen met indicatie, doelwit, werkingsmechanisme en FDA goedkeuring met betrekking tot borstkanker (26, 47, 63, 65).

35

5.2. TOEKOMSTPERSPECTIEVEN Monoklonale antilichamen als kankertherapie is nog steeds een evoluerend gebied en het gebruik ervan in de kliniek blijft stijgen. Men is er reeds in geslaagd om muriene antilichamen volledig te humaniseren en zo hun gebruik in de praktijk te verbeteren. Volgende stappen die nog nodig zijn, zijn bijvoorbeeld het verbeteren van het gebruik van antilichamen als transportmiddel voor toxines en medicatie. Daarnaast zal er ook nog geprobeerd worden om de antilichamen te fragmenteren, zodat problemen gerelateerd aan de grootte van de antilichamen en de immunogeniciteit overbrugd kunnen worden. Deze aanpassingen vergen echter ook nog een evolutie in de technologieën om dit te bewerkstelligen en zullen dus nog niet in de nabije toekomst gerealiseerd kunnen worden. Een belangrijk element in de ontwikkeling van therapeutische antilichamen is natuurlijk een beter begrip van de ontstaansmechanismen van kanker en de progressie ervan. Slechts wanneer dit volledig ontcijferd is, zal de mogelijkheid ontstaan hier specifiek op in te grijpen (71). Ideale doelwitten voor antilichaamtherapie beschikken over volgende eigenschappen: ze komen enkel tot overexpressie in maligne cellen, bezitten een hoge celoppervlakte densiteit en zitten verankerd in het celmembraan (in plaats van gesecreteerd te worden door de tumorcellen). Het is belangrijk om de binding van de monoklonale antilichamen aan maligne cellen te bevorderen terwijl de interactie met normale cellen zoveel mogelijk vermeden wordt (29, 71). Ook is het belangrijk dat in de toekomst biomerkers worden geselecteerd teneinde de patiëntenpopulatie die in aanmerking komt voor een welbepaald antilichaam als therapie beter af te bakenen. Hierbij speelt niet alleen de doeltreffendheid een belangrijke rol, het is ook van cruciaal belang factoren te ontdekken die de (neven-)effecten van de medicatie op de patiënt zo goed mogelijk kunnen voorspellen. Zo oefent trastuzumab een positieve werking uit in dertig procent van de HER2 positieve borstkankerpatiënten. Dit betekent echter dat zeventig procent geen baat ondervindt van een behandeling met trastuzmab en dat het dus ook een verspilling van geld en middel zou zijn om deze patiënten hiermee te behandelen. Bovendien is vastgesteld dat de meerderheid van de patiënten die initieel een reactie vertoonden, één jaar na het opstarten van de behandeling, opnieuw ziekteprogressie vertoont. Het is dus duidelijk dat biomerkers moeten ontwikkeld worden om de mogelijkheid te creëren doelgerichte therapie zo individueel mogelijk toe te passen en op deze manier enkel die patiënten te behandelen die voordeel zullen halen uit de therapie. Om het ontstaan van resistentie te kunnen omzeilen is het belangrijk de oorzaak en het mechanisme erachter te kennen (46). Zo kunnen de bestaande middelen aangepast worden of nieuwe antilichamen ontwikkeld worden. Momenteel is men bijvoorbeeld bezig aan de uitwerking van een HER2 monoklonaal antilichaam geconjugeerd aan een chemische stof, genaamd trastuzumab-DM1 of trastuzumab emtansine. Hierbij word trastuzumab geconjugeerd met een cytotoxische derivaat van maytansine 1, DM1. Dit zou een oplossing bieden voor trastuzumab resistentie en de doeltreffendheid verbeteren. Maytansine 1 is namelijk 1000 keer meer cytotoxisch dan eender welk chemotherapeuticum. In trastuzumab-DM1 transporteert 36

trastuzumab DM1 naar HER2 positieve tumorcellen. Trastuzumab-DM1 vereist, in tegenstelling tot trastuzumab, geen HER2 signalering, maar enkel de aanwezigheid van HER2 op de celoppervlakte van de tumorcellen. Op die manier kan het enkele resistentiemechanismen aan trastuzumab gerelateerd aan HER2 signalering omzeilen (57). Men is momenteel bezig met de verdere uitwerking van het concept multidrug therapie. Dit concept is gebaseerd op het idee dat het simultaan gebruik van geneesmiddelen met verschillende werkingsmechanismen een sterker effect zou teweegbrengen tegen kanker, omdat de kanker op deze manier minder mogelijkheden heeft om de therapie te ontwijken. Multidrug therapie is reeds aanvaard en in gebruik in therapieën die gebruik maken van cytotoxische agentia. Vanzelfsprekend is dit concept interessant om uit te breiden naar doelgerichte therapie. Zo zou bijvoorbeeld de combinatie van trastuzumab en pertuzumab doeltreffender zijn dan wanneer ze in monotherapie worden toegediend. De vraag is echter of dit geen toename van bijwerkingen met zich meebrengt. Momenteel wordt in verschillende klinische studies onderzocht of het simultaan gebruik van meerdere doelgerichte medicaties daadwerkelijk een verbetering van de prognose teweeg brengt, of het veilig is en of er effectief een synergistisch effect optreedt (29, 46).

37

6. CONCLUSIE Ondanks het feit dat monoklonale antilichamen een enorme doorbraak betekenen op gebied van kankertherapie, zijn er nog heel wat hindernissen die overwonnen moeten worden (71). Zo dringt onder andere de nood zich op tot de selectie van biomerkers en moeten er oplossingen gezocht worden om de resistentiemechanismen tegen monoklonale antilichamen te omzeilen (46). Doelgerichte therapie is bovendien erg duur en er gaat veel geld naar het onderzoek en de ontwikkeling ervan. Monoklonale antilichamen vertegenwoordigen op dit ogenblik het grootste deel van de biologische therapieën in ontwikkeling. Naarmate er meer gebruik zal gemaakt worden van deze vormen van therapie, zal er ook meer geld voor nodig zijn. Aangezien er (nog) geen generische competitie is, zet dit het hele gezondheidssysteem nog meer onder druk (46, 72). Momenteel is enkel het monoklonale antilichaam trastuzumab goedgekeurd door de FDA in de behandeling van borstkanker maar het ziet ernaar uit dat het gebruik ervan zal toenemen naarmate meer informatie zal worden bekomen over de verschillende onderliggende mechanismen (29, 46, 47, 57).

38

7. REFERENTIES 1. Cancer [database on the Internet]. Available from: http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/001289.htm. 2. Kanker [database on the Internet]. Available from: http://nl.wikipedia.org/wiki/Kanker. 3. Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011;144(5):64674. Epub 2011/03/08. 4. SC. L. Ins en Outs van Nibs en Mabs. Tijdschrift Kanker. 2007 Juni. 5. Tennant DA, Duran RV, Boulahbel H, Gottlieb E. Metabolic transformation in cancer. Carcinogenesis. 2009;30(8):1269-80. Epub 2009/03/27. 6. Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics. CA: a cancer journal for clinicians. 2011;61(2):69-90. Epub 2011/02/08. 7. Gschwind A, Fischer OM, Ullrich A. The discovery of receptor tyrosine kinases: targets for cancer therapy. Nature reviews Cancer. 2004;4(5):361-70. Epub 2004/05/04. 8. Lapenna S, Giordano A. Cell cycle kinases as therapeutic targets for cancer. Nature reviews Drug discovery. 2009;8(7):547-66. Epub 2009/07/02. 9. Brown JM, Attardi LD. The role of apoptosis in cancer development and treatment response. Nature reviews Cancer. 2005;5(3):231-7. Epub 2005/03/02. 10. Rivlin N, Brosh R, Oren M, Rotter V. Mutations in the p53 Tumor Suppressor Gene: Important Milestones at the Various Steps of Tumorigenesis. Genes & cancer. 2011;2(4):466-74. Epub 2011/07/23. 11. Artandi SE, DePinho RA. Telomeres and telomerase in cancer. Carcinogenesis. 2010;31(1):918. Epub 2009/11/06. 12. Cong YS, Wright WE, Shay JW. Human telomerase and its regulation. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 2002;66(3):407-25, table of contents. Epub 2002/09/05. 13. Kerbel RS. Tumor angiogenesis. The New England journal of medicine. 2008;358(19):2039-49. Epub 2008/05/09. 14. Wittekind C, Neid M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 2005;69 Suppl 1:14-6. Epub 2005/10/08. 15. Thompson EW, Newgreen DF, Tarin D. Carcinoma invasion and metastasis: a role for epithelial-mesenchymal transition? Cancer research. 2005;65(14):5991-5; discussion 5. Epub 2005/07/19. 16. Velde CJHvd. Oncologie. zevende ed: Bohn Stafleu van Loghum; 2010. 17. Imai K, Takaoka A. Comparing antibody and small-molecule therapies for cancer. Nature reviews Cancer. 2006;6(9):714-27. Epub 2006/08/25. 18. Pinkhof Geneeskundig woordenboek. 11 ed. Houten: Bohn Stafleu van Loghum; 2006. Mammacarcinoom; p. 682-3. 19. Polyak K. Breast cancer: origins and evolution. The Journal of clinical investigation. 2007;117(11):3155-63. Epub 2007/11/03. 20. Dhondt M, Devroey P, Gerris J, Jacquemyn Y, Vergote I. HANDBOEK GYNAECOLOGIE. First ed. Leuven: Acco; 2009. p. 223-44. 21. Bombonati A, Sgroi DC. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of pathology. 2011;223(2):307-17. Epub 2010/12/03. 22. Weigelt B, Bissell MJ. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Seminars in cancer biology. 2008;18(5):311-21. Epub 2008/05/06. 23. Breast Cancer [database on the Internet]. Available from: http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/000913.htm. 24. Wiechmann L, Kuerer HM. The molecular journey from ductal carcinoma in situ to invasive breast cancer. Cancer. 2008;112(10):2130-42. Epub 2008/04/03.

39

25. Kumar P, Clark M, editors. Kumar & Clark's Clinical medicine. 7 ed. Edinburgh: Elsevier Health Sciences; 2009. 26. Adams GP, Weiner LM. Monoclonal antibody therapy of cancer. Nature biotechnology. 2005;23(9):1147-57. Epub 2005/09/10. 27. Ciardiello F, Tortora G. EGFR antagonists in cancer treatment. The New England journal of medicine. 2008;358(11):1160-74. Epub 2008/03/14. 28. . Available from: http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/. 29. Reichert JM, Valge-Archer VE. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature reviews Drug discovery. 2007;6(5):349-56. Epub 2007/04/14. 30. Normanno N, Morabito A, De Luca A, Piccirillo MC, Gallo M, Maiello MR, et al. Target-based therapies in breast cancer: current status and future perspectives. Endocrine-related cancer. 2009;16(3):675-702. Epub 2009/06/16. 31. Web of Science [database on the Internet]. Available from: http://apps.webofknowledge.com/WOS_GeneralSearch_input.do?last_prod=WOS&SID=U1JJCamnIH Gc%405imdfG&product=WOS&highlighted_tab=WOS&search_mode=GeneralSearch. 32. Cai Z, Zhang H, Liu J, Berezov A, Murali R, Wang Q, et al. Targeting erbB receptors. Seminars in cell & developmental biology. 2010;21(9):961-6. Epub 2010/09/21. 33. Spector NL, Blackwell KL. Understanding the mechanisms behind trastuzumab therapy for human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2009;27(34):5838-47. Epub 2009/11/04. 34. Wang W, Wang EQ, Balthasar JP. Monoclonal antibody pharmacokinetics and pharmacodynamics. Clinical pharmacology and therapeutics. 2008;84(5):548-58. Epub 2008/09/12. 35. Brekke OH, Sandlie I. Therapeutic antibodies for human diseases at the dawn of the twentyfirst century. Nature reviews Drug discovery. 2003;2(1):52-62. Epub 2003/01/02. 36. Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975;256(5517):495-7. Epub 1975/08/07. 37. Klee GG. Human Anti-Mouse Antibodies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 2000;124(6):921-3. 38. Azzazy HM, Highsmith WE, Jr. Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical biochemistry. 2002;35(6):425-45. Epub 2002/11/05. 39. Dongen JJM. Nieuwe ontwikkelingen in de medische immunologie, 2010. Afdeling Immunologie, Erasmus MC, Universitair Medisch Centrum Rotterdam; 2010. p. 175-86. 40. Ma WW, Adjei AA. Novel agents on the horizon for cancer therapy. CA: a cancer journal for clinicians. 2009;59(2):111-37. Epub 2009/03/13. 41. Weiner LM, Dhodapkar MV, Ferrone S. Monoclonal antibodies for cancer immunotherapy. Lancet. 2009;373(9668):1033-40. Epub 2009/03/24. 42. Zhang J, Yang PL, Gray NS. Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nature reviews Cancer. 2009;9(1):28-39. Epub 2008/12/24. 43. Arora A, Scholar EM. Role of tyrosine kinase inhibitors in cancer therapy. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 2005;315(3):971-9. Epub 2005/07/09. 44. Lin NU, Winer EP. New targets for therapy in breast cancer: small molecule tyrosine kinase inhibitors. Breast cancer research : BCR. 2004;6(5):204-10. Epub 2004/08/21. 45. Widakowich C, de Azambuja E, Gil T, Cardoso F, Dinh P, Awada A, et al. Molecular targeted therapies in breast cancer: where are we now? The international journal of biochemistry & cell biology. 2007;39(7-8):1375-87. Epub 2007/06/05. 46. Mukai H. Targeted therapy in breast cancer: current status and future directions. Japanese journal of clinical oncology. 2010;40(8):711-6. Epub 2010/04/13. 47. Di Cosimo S, Baselga J. Targeted therapies in breast cancer: where are we now? European journal of cancer (Oxford, England : 1990). 2008;44(18):2781-90. Epub 2008/11/18. 48. Hudis CA. Trastuzumab--mechanism of action and use in clinical practice. The New England journal of medicine. 2007;357(1):39-51. Epub 2007/07/06. 40

49. Baselga J, Swain SM. Novel anticancer targets: revisiting ERBB2 and discovering ERBB3. Nature reviews Cancer. 2009;9(7):463-75. Epub 2009/06/19. 50. Nahta R, Esteva FJ. Herceptin: mechanisms of action and resistance. Cancer letters. 2006;232(2):123-38. Epub 2006/02/07. 51. Molina MA, Codony-Servat J, Albanell J, Rojo F, Arribas J, Baselga J. Trastuzumab (herceptin), a humanized anti-Her2 receptor monoclonal antibody, inhibits basal and activated Her2 ectodomain cleavage in breast cancer cells. Cancer research. 2001;61(12):4744-9. Epub 2001/06/19. 52. Ross JS, Slodkowska EA, Symmans WF, Pusztai L, Ravdin PM, Hortobagyi GN. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. The oncologist. 2009;14(4):320-68. Epub 2009/04/07. 53. Murphy CG, Modi S. HER2 breast cancer therapies: a review. Biologics : targets & therapy. 2009;3:289-301. Epub 2009/08/27. 54. Piccart-Gebhart MJ, Procter M, Leyland-Jones B, Goldhirsch A, Untch M, Smith I, et al. Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. The New England journal of medicine. 2005;353(16):1659-72. Epub 2005/10/21. 55. Hansel TT, Kropshofer H, Singer T, Mitchell JA, George AJ. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature reviews Drug discovery. 2010;9(4):325-38. Epub 2010/03/23. 56. Boekhout AH. Evaluation and Management of Side Effects of Breast Cancer Treatment [PhD Thesis]. Amsterdam: Universiteit van Utrecht; 2011. 57. Fang L, Barekati Z, Zhang B, Liu Z, Zhong X. Targeted therapy in breast cancer: what's new? Swiss medical weekly. 2011;141:w13231. Epub 2011/06/28. 58. Kristjansdottir K, Dizon D. HER-dimerization inhibitors: evaluating pertuzumab in women's cancers. Expert opinion on biological therapy. 2010;10(2):243-50. Epub 2009/12/17. 59. Yamamoto N, Yamada Y, Fujiwara Y, Yamada K, Fujisaka Y, Shimizu T, et al. Phase I and pharmacokinetic study of HER2-targeted rhuMAb 2C4 (Pertuzumab, RO4368451) in Japanese patients with solid tumors. Japanese journal of clinical oncology. 2009;39(4):260-6. Epub 2009/03/06. 60. Gradishar WJ. HER2 Therapy — An Abundance of Riches. New England Journal of Medicine. 2012;366(2):176-8. 61. Baselga J, Gelmon KA, Verma S, Wardley A, Conte P, Miles D, et al. Phase II trial of pertuzumab and trastuzumab in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer that progressed during prior trastuzumab therapy. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2010;28(7):1138-44. Epub 2010/02/04. 62. Baselga J, Cortés J, Kim S-B, Im S-A, Hegg R, Im Y-H, et al. Pertuzumab plus Trastuzumab plus Docetaxel for Metastatic Breast Cancer. New England Journal of Medicine. 2012;366(2):109-19. 63. Scott AM, Wolchok JD, Old LJ. Antibody therapy of cancer. Nature reviews Cancer. 2012;12(4):278-87. Epub 2012/03/23. 64. Koutras AK, Fountzilas G, Makatsoris T, Peroukides S, Kalofonos HP. Bevacizumab in the treatment of breast cancer. Cancer treatment reviews. 2010;36(1):75-82. Epub 2009/11/26. 65. Yang SX. Bevacizumab and breast cancer: current therapeutic progress and future perspectives. Expert review of anticancer therapy. 2009;9(12):1715-25. Epub 2009/12/04. 66. Jain RK, Duda DG, Clark JW, Loeffler JS. Lessons from phase III clinical trials on anti-VEGF therapy for cancer. Nature clinical practice Oncology. 2006;3(1):24-40. Epub 2006/01/13. 67. Chan A, Miles DW, Pivot X. Bevacizumab in combination with taxanes for the first-line treatment of metastatic breast cancer. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 2010;21(12):2305-15. Epub 2010/03/26. 68. Arteaga CL, Sliwkowski MX, Osborne CK, Perez EA, Puglisi F, Gianni L. Treatment of HER2positive breast cancer: current status and future perspectives. Nature reviews Clinical oncology. 2012;9(1):16-32. Epub 2011/11/30. 69. Bates SE, Amiri-Kordestani L, Giaccone G. Drug development: portals of discovery. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2012;18(1):2332. Epub 2012/01/05. 41

70. Jubb AM, Harris AL. Biomarkers to predict the clinical efficacy of bevacizumab in cancer. The lancet oncology. 2010;11(12):1172-83. Epub 2010/12/04. 71. Axelson MD, Gerber DE. Pharmaceutical Perspectives of Cancer Therapeutics: Current Therapeutic Uses of Monoclonal Antibodies. In: Lu Y, Mahato RI, editors.: Springer US; 2009. p. 32163. 72. Scolnik PA. mAbs: a business perspective. mAbs. 2009;1(2):179-84. Epub 2010/01/12.

42