Návod k použití
Obsah Testovací kity Protrans HLA SBT 1.0 Strategie Protrans sekvenování 2.0 PROTRANS HLA Sekvenační systém 2.0 PROTRANS Sekvenačníí kity (S4, S3, Domino Stones, S2, S1) 3.0 Procedura Protrans sekvenování 4.0 Materiály dodávané v HLA sekvenačních kitech 5.0 Skladování a trvanlivost testovacích činidel 6.0 Opatření a varování 6.1 Materiály a vybavení nedodávané s PRE PCR kitem 6.2 Materiály a vybavení nedodávané s POST PCR kitem 7.0 Příprava a zpracování vzorků 7.1 Extrakce DNA a koncentrace DNA 8.0 Program Thermocycleru Protrans SBT 9.0 Specifikace amplifikačních primerů 10.0 PROTRANS S4 sekvenační kity 10.1 PROTRANS S4 předplněné PCR stripy v sekvenačních kitech 10.2 Nastavení amplifikace pro PROTRANS S4 sekvenační kity 10.3 PROTRANS S3 sekvenační kity 10.4 PROTRANS S3 předplněné PCR stripy v sekvenačních kitech 10.5 Nastavení amplifikace pro PROTRANS S3 sekvenační kity 10.6 PROTRANS Domino Stones sekvenační kity 10.7 Nastavení amplifikace pro PROTRANS Domino Stones sekvenační kity 10.8 PROTRANS S2 Sekvenační kit 10.9 PROTRANS S2 předplněné PCR stripy v sekvenačních kitech 10.10 Nastavení amplifikace pro PROTRANS S2 sekvenační kity 10.11 PROTRANS S1 sekvenační kit 10.12 Nastavení amplifikace pro PROTRANS S1 sekvenační kity 11.0 Analýza výsledků PCR amplifikace. Stanovení Haplotypů 12.0 Dokumentace pozitivních reakčních stanovení Haplotypů 13.0 PROTRANS příloha 32 14.0 Čištění haplotypů (pozitivní PCR produkty) 14.1 PROTRANS AmpliPur-Fast 14.2 ExoSAP-IT® čištění 14.3 „Beads fishing“ metoda 15.0 Výběr sekvenačních primerů 34 15.1 Nastavení sekvenační reakce 2 haplotypy 15.2 Nastavení sekvenační reakce pouze 1 haplotyp nebo lokus-specifická amplifikace (LSA) 16.0 Nastavení sekvenační reakce 17.0 Čištění sekvenační reakce 17.1 PROTRANS DyePUR 17.2 Precipitace v ethanolu 17.3 Altrenativní purifikační metody 18.0 Přípravné sekvenační reakce pro elektroforézu 19.0 Spuštění přístroje 20.0 Identifikování HLA alel PROTRANS Alely identifikující software 21.0 Zásady popisů vzorků 22.0 Provedení identifikace alel 23.0 Průvodce nejčastějšími problémy
Strana 1 3 4 4 8 9 17 17 18 19 20 20 21 22 22 23 24 25 26 26 27 27 28 28 28 29 29 30 30 33 33 33 34 35 35 36 37 37 38 39 39 40 40 41 42 42
1
2
1.0 Strategie PROTRANS sekvenování Protrans kity by měly být používány v souladu s aktuálními pokyny pro zajištění kvality schválenými Evropskou federací pro imunogenetiku (EFI) nebo Americkou společností pro histokompatibilitu a imunogenetiku (ASHI). Sekvenování dává nejspolehlivější a nejpřesnější informaci o sekvenci DNA genu a proto je v popředí zájmu celková charakterizace genetické komplexnosti a odlišností alel HLA genů v lidském hlavním histokompatibilním komplexu (MHC). Plná komplexnost diversity alel v HLA třídě I a třídě II činí z PCR-SBT metodu volby při typizaci HLA. Typizace HLA sekvenováním by měla být uvážena vždy, když je zapotřebí u jedince určení HLA typu. Současný vývoj učinil sekvenování zároveň jednoduchým i výkonným, což jej činí vynikajícím pro diagnózu pacientů a typizace registru kostní dřeně. S Protrans sekvenačním systémem je snadné typizovat v nízkých i vysokých výkonnostních formátech na každém požadovaném stupni automatizace a rozlišení. Sekvenování může být provedeno ručně nebo plně automaticky v závislosti na individuálních požadavcích laboratoře. Sekvenování genu podá nejspolehlivější a nejpřesnější informaci o DNA. Počet známých a stále nově identifikovaných HLA genů v lidském hlavním histokompatibilním komplexu (MHC) vyžaduje vysoké rozlišení, jednoznašnou a přesnou typizační metodu pro HLA alelovou třídu I a třídu II. Protrans sekvenační systém je praktická, spolehlivá a nastavitelná typizační metoda. S Protrans sekvenačním systémem je snadné typizovat všechna HLA místa v rutinních nízkých nebo vysokých výkonnostních formátech ručně nebo při jakémkoli požadovaném stupni automatizace a rozlišení. Protrans sekvenační systém lze snadno využít nejen v registru kostní dřeně, ale také jako diagnostický nástroj pro charakterizaci pacientů v denní rutině. Se softwarem SEQUENCE PILOT© je snadné provést analýzu sekvenačních souborů Protrans sekvenačního systému pro HLA třídu I a třídu II.
Strategie Protrans sekvenování 1 PROTRANS S4
Odděluje haplotypy Amplifikace a sekvenování specifické pro jednu alelu a lokus Bez ambiquit
2 PROTRANS S3
Odděluje haplotypy Amplifikace a sekvenování specifické pro jednu alelu a lokus Bez ambiquit
PROTRANS Domino Stones
Sekvenování specifické pro haplotyp. Bez ambiquit Domino Stones vám dá vysoké výsledky LCT, SSP, SSO
3
4 PROTRANS S2
Odděluje haplotypy Amplifikace a sekvenování specifické pro HLA slupinu
5 PROTRANS S1
Amplifikace a sekvenování specifické pro HLA-lokus (LSA)
3
2.0 PROTRANS HLA Sekvenační systém Protrans sekvenační systém je navržen tak, aby dosáhnul maximálního stupně alelaspecifického sekvenování a naopak nejnižšího počtu ambiquit. Se separací DNA se specifickými mixy primerů ve dvou oddělených Haplotypech je zajištěno rozeznání obou alel skoro ve všech případech. Protrans sekvenační systém dovoluje u HLA třídy I sekvenování od Exonu 1 po Exon 4. u HLA třídy II sekvenování od Exonu 2 po kodon 86TG. Zvláštní důraz byl kladen na kompletní pokrytí exonů 1, 2, 3 a 4 k vyřazení téměř všech ambiquit způsobených variacemi vně Exonů 2 a 3, stejně jako na umístění sekvenčních primerů k zajištění kompletních sekvencí Exonů v obou směrech.
Zamýšlené použití Protrans sekvenační systém lze snadno využít nejen v registru kostní dřeně, ale také jako diagnostický nástroj pro charakterizaci pacientů v denní rutině.
Protrans S4 Sekvenační kity Protrans S4 HLA SBT typizační kity jsou navrženy tak, aby dosáhly maximálního stupně alela-specifického sekvenování a zároveň nejnižšího počtu ambiquit. Toto je dosaženo oddělením Haplotypů před sekvenováním každého Haplotypu zvlášť. U HLA třídy I bude DNA amplifikována až 14 Group-Specific PCR amplifikacemi (GSA) a navíc lokus specifickou amplifikací (LSA) paralelně při pokrytí Exonů 1, Exonu 2, Exonu 3 a Exonu 4. Single Allele nebo Group-specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 16-jamkových PCR stripech. U HLA třídy I byl kladen zvláštní důraz na kompletní pokrytí Exonů 1, 2, 3 a 4 k vyřazení téměř všech ambiquit způsobených variacemi vně Exonů 2 a 3. U HLA třídy II bude DNA amplifikována až 14 Group-Specific PCR amplifikacemi (GSA) paralelně při pokrytí kompletního lokusu Exonu 2. Single Allele nebo Group-specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 16-jamkových PCR stripech. V téměř všech případech bude dosaženo analýzy sekvence obou alel zvlášť. U HLA-DRB1 byl kladen zvláštní důraz na separaci DR52-asociovaných HLA-DRB1 alel k zajištění jednoznačných výsledků téměř u všech vzorků. Speciální důraz byl kladen na umístění sekvenčních primerů k zajištění kompletních sekvencí Exonů v obou směrech.
K usnadnění použití • •
• • •
Group-Specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 8-jamkových PCR stripech. Testovací procedura a program thermocycleru pro amplifikaci, sekvenování a nastavení sekvenátoru jsou pro všechny Protrans Sekvenační kity a pro všechna HLA místa stejná Purifikace PCR produktů a sekvenčních produktů jsou identická pro všechna HLA místa Je velmi snadné typizovat různá HLA místa několika DNA vzorků paralelně Je vždy možné zkombinovat různé Protrans Sekvenační kity v různých Strategiích Protrans sekvenování
4
Protrans S3 Sekvenační kity Protrans S3 sekvenační kity jsou navrženy tak, aby splnily požadavky vysokého výkonu vzorku stejně jako alela-specifického sekvenování pro méně ambiquit. Tohoto je dosaženo oddělením Haplotypů před sekvenováním každého Haplotypu zvlášť. U Protrans SBT Testovacího kitu HLA-A, B, C bude DNA amplifikována 7 Group-Specific PCR Amplification Mixy (GSA) a navíc Locus specific Amplification Mixem (LSA). U Protrans SBT Testovacího kitu HLA-DQB1 bude DNA amplifikována 6 Group-Specific PCR Amplification Mixy (GSA) a navíc 2 Locus specific Amplification Mixy (LSA). U Protrans SBT Testovacího kitu HLA-DRB1 bude DNA amplifikována 8 Group-Specific PCR Amplification Mixy (GSA). Pokud GSA reakce neindikují dvě oddělené alely, musí být LSA reakce sekvenována. Toto zajistí ve všech případech rozpoznání obou alel. U Protrans SBT Testovacího kitu HLA-třída I jsou pokryty Exony 1, Exon 2, Exon 3 a Exon 4 a u Protrans SBT Testovacího kitu HLA-třída II jsou pokryty Exon 2 (DRB1, DQB1) a Exon 3 (DQB1). Amplification Primer Mixy jsou předpipetovány v 8-jamkových PCR stripech a každý HLAlokus má jinou barvu. Ve většině případů bude dosaženo sekvenční analýzy oddělených obou alel. U HLA třídy I je kladen zvláštní důraz na kompletní pokrytí Exonů 1, 2, 3 a 4 k vyřazení téměř všech ambiquit způsobených variacemi vně Exonů 2 a 3. Speciální důraz byl kladen na umístění sekvenčních primerů k zajištění kompletních sekvencí Exonů v obou směrech.
K usnadnění použití • •
• • •
Group-Specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 8-jamkových PCR stripech. Testovací procedura a program thermocycleru pro amplifikaci, sekvenování a nastavení sekvenátoru jsou pro všechny Protrans Sekvenační kity a pro všechna HLA místa stejná Purifikace PCR produktů a sekvenčních produktů jsou identická pro všechna HLA místa Je velmi snadné typizovat různá HLA místa několika DNA vzorků paralelně Je vždy možné zkombinovat různé Protrans Sekvenační kity v různých Strategiích Protrans sekvenování
Protrans Domino Stones HLA SBT Jsou navrženy pro maximální flexibilitu při splňování individuálních požadavků HLA laboratoře. Domino Stones Locus- a různé Group-Specific PCR Amplification Mixy (Domino Stones) jsou dodávány odděleně pro umožnění individuálního nastavení podle individuálních požadavků. Při použití Protrans Domino Stones je pro všechna HLA místa možné změnit typizovaný výsledek s nízkým rozlišením z ostatních technik (SSP nebo SSO) na 4-digitální výsledek s vysokým rozlišením. Locus- a Group-Specific PCR Amplifications pokrývají nejméně Exony 2 a 3 u HLA míst třídy I a Exon 2 u HLA místa třídy II.
5
Protrans S2 Sekvenační Kit Protrans S2 sekvenační kity jsou navrženy tak, aby splňovaly požadavky velmi vysoké výkonnosti vzorku stejně jako alela-specifického sekvenování pro méně ambiquit. Tohoto je dosaženo aplikací 4 Group-Specific PCR Amplications (GSA) paralelně pokrytím nejméně exonů 2 a 3 u HLA míst třídy I a exonu 2 u HLA míst třídy II, což dovoluje v mnoha případech sekvenční analýzu obou alel odděleně.
K usnadnění použití • • • • •
Group-Specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 8-jamkových PCR stripech. Testovací procedura a program thermocycleru pro amplifikaci, sekvenování a nastavení sekvenátoru jsou pro všechny Protrans Sekvenační kity a pro všechna HLA místa stejná Purifikace PCR produktů a sekvenčních produktů jsou identická pro všechna HLA místa Je velmi snadné typizovat různá HLA místa několika DNA vzorků paralelně Je vždy možné zkombinovat různé Protrans Sekvenační kity v různých Strategiích Protrans sekvenování
Protrans S1 Sekvenační kit Protrans S1 sekvenační kity jsou narženy tak, aby splňovaly požadavky velmi vysoké výkonnosti vzorku. Tohoto je dosaženo Locus-Specific PCR Amplification (LSA) s pokrytím HLA třídy I Exon 1, Exon 2, Exon 3 a Exon 4 a HLA třídy II Exon 2, umožňující sekvenční analýzu obou alel najednou. Zvláštní důraz byl kladen na umístění sekvenčních primerů k zajištění kompletních sekvencí Exonů v obou směrech. Protrans Sekvenační Kity Protrans S1 swift REF 2101 a 2102 jsou variantami Protrans S1 Kitů. Tyto kity jsou narženy tak, aby splňovaly požadavky velmi vysoké výkonnosti vzorku. Tohoto je dosaženo Locus-Specific PCR Amplification (LSA) s pokrytím Exonů 2 a 3 u HLA místa třídy I bez vyřešení ambiquit kvůli variací vně Exon 2 a 3. Zvláštní důraz byl kladen na vytváření krátkých PCR produktů ke zvýšení výkonu v případě nižší kvality DNA.
K usnadnění použití • •
• • •
Group-Specific Primer Mix je v jediné zkumavce. Testovací procedura a program thermocycleru pro amplifikaci, sekvenování a nastavení sekvenátoru jsou pro všechny Protrans Sekvenační kity a pro všechna HLA místa stejná Purifikace PCR produktů a sekvenčních produktů jsou identická pro všechna HLA místa Je velmi snadné typizovat různá HLA místa několika DNA vzorků paralelně Je vždy možné zkombinovat různé Protrans Sekvenační kity v různých Strategiích Protrans sekvenování
6
Specifikace Primer Mixu a Specifikační tabulky Protrans HLA Sekvenační Kity jsou neustále aktualizovány. Aby byla uživateli dodávána nejaktuálnější verze kitu, Specifikace Primer Mixu jsou uvedeny jako příloha u Primer Mix Specifikačních tabulek. Prosím ujistěte se, že verze kitu je shodná s verzí Primer Mix Specifikační tabulky.
PCR Amplifikace Metoda je založena na PCR amplifikacích začínajících genomovou DNA. PCR amplifikační reakce zahrnují nejméně Exony 2 a 3 u HLA míst třídy I a Exon 2 u HLA míst třídy II a byly navrženy, aby byly specifické pouze pro jednu skupinu alel. Každá PCR formulace byla validována oproti panelu dobře charakterizovaných buněčných linií k zamezení nespecifické amplifikace a preferenční amplifikace jedné alely před druhou u heterozygotních kombinací.
Sekvenování Po PCR vyčištění jsou pozitivní Group-SPecific Amplifikační reakce použity jako templáty k přímému sekvenování nejméně Exonů 2 a 3 u HLA míst třídy I a Exonu 2 u HLA míst třídy II. PCR templáty byly optimalizovány pro použití u cyklického sekvenování terminovaného chemickými barvivy pro vytvoření informace o typizaci alely.
Stanovení alely Konečný krok v sekvenační analýze se skládá ze stanovení alely za použití SEQUENCE PILOT© alely identifikujícího softwaru. Tento program provádí identifikaci alel, dovoluje manuální sledování nebo úpravu sekvenčních dat stejně jako vyhodnocování, exportování a archivování sekvencí nebo výsledků. SEQUENCE PILOT© alely identifikující software dovoluje rychlé a snadné stanovení alely. Software umožňuje manuální sledování nebo úpravu sekvenčních dat Exonu 1 až Exonu 8. Heterozygotní pozice stejně jako neshody jsou detekovány a hlášeny. Výsledky typizace a sekvenační elektroferogramy mohou být vytištěny, exportovány a archivovány. Software je dostupný jako Windows™ single-user-verze nebo jako Windows™ nebo Linux™ server-client-verze pro práci v síti s několika pracovními stanicemi. HLA databáze je neustále aktualizována podle nejnovějších vědeckých výzkumů oficiální IMGT/HLA databáze.
Program přístroje PCR a sekvenační profil uváděné v tomto návodu byly použity s Thermal Cyclery od Applied Biosystems GeneAmp PCR Systémy 2700, 9600 a 9700. Měly by také fungovat s kompatibilními přístroji, ale mohou vyžadovat nastavení profilu nebo napodobení výše uvedených přístrojů. Sekvenační kity stejně jako SEQUENCE PILOT© alely identifikující software jsou kompatibilní se všemi dostupnými čtyřbarevnými kapilárními sekvenátory.
7
3.0 Procedura Protrans sekvenačního systému
8
4.0 Materiály dodávané s HLA sekvenačními kity
9
10
11
12
13
14
15
16
Poznámka Podívejte se na Primer Mix Specifikační tabulky (Příloha) dodávané s kity, abyste vybrali vhodné PCR produkty a Sekvenační primery. Ujistěte se, že verze kitu a verze Primer Mix Specifikačních tabulek jsou shodné. Poznámka Všechna činidla dodávaná s Protrans HLA Sekvenačními kity by měla být použita Pro Amplification Primer stejná verze a Pro Sequencing Primer stejná šarže Amplification Primer nemůže být smíchán ze dvou různých verzí, podle přílohy každého kitu Sequencing Primer nemůže být smíchán ze dvou různých šarží, podle přílohy každého kitu Poznámka V případě poškozených zkumavek nebo krabic nemohou být vyloučeny závady. Takovéto kity nesmí být použity.
17
5.0 Skladování a trvanlivost
Při skladování za vhodných podmínek mohou být komponenty kitu použity do data expirace vyznačeného na Pre PCR boxu a Post PCR boxu kitu. Otevřené balení a zkumavky musí být uzavřeny a skladovány za stejných podmínek jako uzavřené balení a zkumavky a mohou být použity do data expirace. Pouze komponenty ze stejné verze kitu mohou být použity dohromady a pouze do vyznačeného data expirace.
6.0 Opatření a varování: IVD Činidla pouze pro in vitro diagnostické použití V USA pouze pro výzkum (RUO)
Protrans testkity musí být používány dobře školenými a autorizovanými laboratorními pracovníky. Se všemi činidly by mělo být zacházeno podle správné laboratorní praxe a vhodných opatřeních. Dále zacházejte se všemi vzorky pacientů jako s potenciálně infekčními. Nepipetujte ústy. Se všemi použitými PCR-Cyclerplaty by mělo být zacházeno jako s potenciálně infekčními a měly by být zlikvidovány podle platných národních nařázení. Nepoužívejte činidla po uplynutí doby expirace. Viz datum expirace na etiketě. Pre-PCR a Post-PCR oblasti musí být přísně odděleny. Používejte jiné pipety v Pre-PCR oblasti a v Post-PCR oblasti. Ethidium bromid použitý k barvení DNA je potenciální karcinogen. Noste vždy ochranné rukavice při manipulaci s barvícím gelem. Zlikvidujte podle národních nařízení. Noste UV-blokující ochranu očí a vyvarujte se přímému UV světlu při pozorování nebo fotografování gelů. Viz bezpečnostní list (MSDS) pro více informací. Dostupné u Protrans.
18
6.1 Materiály a vybavení nedodávané s kitem
Poznámka PCR a sekvenační profil uváděné v tomto návodu byly použity s Thermal Cyclery od Applied Biosystems GeneAmp PCR Systémy 2700, 9600 a 9700. Měly by také fungovat s kompatibilními přístroji, ale mohou vyžadovat nastavení profilu nebo napodobení výše uvedených přístrojů. Viz Příloha A, nejčastější problémy.
19
6.2 Materiály a vybavení nedodávané s kitem
20
1
Poznámka Činidla a přístroje uvedené jako 1 byly validovány pro Protrans HLA sekvenační kity. Protrans nepřebírá žádnou zodpovědnost, pokud jsou použity jiné materiály nebo zařízení. Uživatel musí validovat činidla a přístroje, které nejsou označeny jako 1. 2
Poznámka Činidla a přístroje uvedené jako 2 byly validovány pro Protrans HLA sekvenační kity. Protrans nepřebírá žádnou zodpovědnost, pokud jsou použity jiné materiály nebo zařízení. Uživatel musí validovat činidla a přístroje, které nejsou označeny jako 2.
7.0 Příprava a zpracování vzorků 7.1 Extrakce DNA a koncentrace DNA Genomová DNA může být získána ze všech jaderných buněk. Nejjednodušší metodou je izolovat DNA z buněčných suspenzí (krev, buffy coat=leukocyty a destičky, nebo kultivované buňky), k níž je dostupných mnoho protokolů a kitů. Pro DNA sekvenování by měly být použity jen ty metody, které vytěžují DNA vysoké kvality a kvantity. PROTRANS DNA Box 500 PROTRANS DNA extraktion-kit PROTRANS DNA Box 500 poskytuje vysoce kvalitní DNA, optimalizovanou pro PROTRANS HLA sekvenační kity. Ostatní extrakční metody musí být před rutinním sekvenováním validovány. Poznámka Používejte buď EDTA nebo ACD krev. Krev antikoagulovaná heparinem by neměla být použita, jelikož bylo dokázáno, že heparin závažně inhibuje PCR. Koncentrace DNA musí být 50 – 100 ng/µl.
Práce se vzorky lidské krve má potenciál přenosu infekčních nemocí a měla by být vykonávána opatrně. Vždy noste vhodné ochranné brýle, oblečení a rukavice.
21
8.0 Program Thermocycleru Protrans SBT Všechny Protrans HLA Sekvenační Kity (Protrans S4, S3, S2, S1 a Domino Stones) fungují se stejným teplotním profilem pro PCR amplifikaci a sekvenování. Tento program je standardizován pro všechna HLA místa (Důležitá poznámka: Ramp Rate 1°C/s).
Poznámka PCR a sekvenační profil uváděné v tomto návodu byly použity s Thermal Cyclery od Applied Biosystems GeneAmp PCR Systémy 2700, 9600 a 9700. Měly by také fungovat s kompatibilními přístroji, ale mohou vyžadovat nastavení profilu nebo napodobení výše uvedených přístrojů. Viz Příloha A, nejčastější problémy.
22
9.0 Specifikace amplifikačních primerů Metoda je založená na PCR amplifikaci začínající genomovou DNA. PCR amplifikační reakce zahrnují nejméně Exony 2 a 3 u HLA třídy I a Exon 2 u HLA třídy II a byly navrženy, aby byly specifické pouze pro jednu skupinu HLA alel a jedno HLA místo. Každá PCR rerakce byla validována oproti panelu dobře charakterizovaných buněčných linií k zamezení nespecifické amplifikace a preferenční amplifikace jedné alely před druhou u heterozygotních kombinací. Protrans SBT Kity jsou neustále aktualizované. Přílohou každého kitu je specifikace šarže a verze. Pro interpretaci výsledků amplifikace a výběr sekvenačních primerů musí být výhradně použitá příloha se specifikací verze a databáze dodávaná s kitem. Protrans HLA sekvenační kity jsou neustále aktualizované. Aby byly uživateli dodávány nejnovější verze kitu, je specifikace primer mixu uvedena v příloze v Primer Mix Specifikační tabulce dodávané s každým kitem. Prosím ujistěte se, že verze kitu je shodná s verzí PŘÍLOHY v Primer Mix Specifikační tabulce v testkitu.
10.0 PROTRANS S4 Sekvenační kity Protrans S4 HLA SBT Typizační kity jsou navrženy tak, aby dosáhly maximálního stupně alela-specifického sekvenování při nejnižším počtu ambiquit. Tohoto je dosaženo oddělením Haplotypů před sekvenováním každého Haplotypu odděleně. U HLA třídy I bude DNA amplifikována až 14 Group-Specific PCR amplifikacemi (GSA) a navíc lokus specifickou amplifikací (LSA) paralelně při pokrytí Exonů 1, Exonu 2, Exonu 3 a Exonu 4. Single Allele nebo Group-specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 16-jamkových PCR stripech. U téměř všech případů bude dosaženo sekvenační analýzy obou oddělených alel. U HLA třídy I byl kladen zvláštní důraz na kompletní pokrytí Exonů 1, 2, 3 a 4 k vyřazení téměř všech ambiquit způsobených variacemi vně Exonů 2 a 3. U HLA třídy II bude DNA amplifikována až 14 Group-Specific PCR amplifikacemi (GSA) paralelně při pokrytí kompletního lokusu Exonu 2. Single Allele nebo Group-specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 16-jamkových PCR stripech. V téměř všech případech bude dosaženo analýzy sekvence obou alel zvlášť. U HLA-DRB1 byl kladen zvláštní důraz na separaci DR52-asociovaných HLA-DRB1 alel k zajištění jednoznačných výsledků téměř u všech vzorků. Speciální důraz byl kladen na umístění sekvenačních primerů k zajištění kompletních sekvencí Exonů v obou směrech. K usnadnění použití Allele- a Allele-Group-Specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 16-jamkových PCR stripech. Barva stripu je pro každé HLA místo jiná. Testovací procedura a program thermocycleru pro amplifikaci, sekvenování a nastavení sekvenátoru jsou pro všechny Protrans Sekvenační kity a pro všechna HLA místa stejná. Purifikace PCR produktů a sekvenčních produktů jsou identická pro všechna HLA místa Je velmi snadné typizovat různá HLA místa několika DNA vzorků paralelně. Je vždy možné zkombinovat různé Protrans Sekvenační kity v různých Strategiích Protrans sekvenování.
23
10.1 PROTRANS S4 předplněné PCR stripy v sekvenačních kitech
24
10.2 Nastavení amplifikace pro PROTRANS S4 sekvenační kity
25
10.3 Protrans S3 Sekvenační Kity Protrans S3 sekvenační kity jsou navrženy tak, aby splnily požadavky vysokého výkonu vzorku stejně jako alela-specifického sekvenování pro méně ambiquit. Tohoto je dosaženo oddělením Haplotypů před sekvenováním každého Haplotypu zvlášť. U Protrans SBT Testovacího kitu HLA-A, B, C bude DNA amplifikována 7 Group-Specific PCR Amplification Mixy (GSA) a navíc Locus specific Amplification Mixem (LSA). U Protrans SBT Testovacího kitu HLA-DQB1 bude DNA amplifikována 6 Group-Specific PCR Amplification Mixy (GSA) a navíc 2 Locus specific Amplification Mixy (LSA). U Protrans SBT Testovacího kitu HLA-DRB1 bude DNA amplifikována 8 Group-Specific PCR Amplification Mixy (GSA). Pokud GSA reakce neindikují dvě oddělené alely, musí být LSA reakce sekvenována. Toto zajistí ve všech případech rozpoznání obou alel. U Protrans SBT Testovacího kitu HLA-třída I jsou pokryty Exony 1, Exon 2, Exon 3 a Exon 4 a u Protrans SBT Testovacího kitu HLA-třída II jsou pokryty Exon 2 (DRB1, DQB1) a Exon 3 (DQB1). Amplification Primer Mixy jsou předpipetovány v 8-jamkových PCR stripech a každý HLAlokus má jinou barvu. Ve většině případů bude dosaženo sekvenační analýzy oddělených obou alel. U HLA třídy I je kladen zvláštní důraz na kompletní pokrytí Exonů 1, 2, 3 a 4 k vyřazení téměř všech ambiquit způsobených variacemi vně Exonů 2 a 3. Speciální důraz byl kladen na umístění sekvenčních primerů k zajištění kompletních sekvencí Exonů v obou směrech. K usnadnění použití • Group-Specific Primer Mixy jsou předpipetovány v 8-jamkových PCR stripech. • Testovací procedura a program thermocycleru pro amplifikaci, sekvenování a nastavení sekvenátoru jsou pro všechny Protrans Sekvenační kity a pro všechna HLA místa stejná • Purifikace PCR produktů a sekvenčních produktů jsou identická pro všechna HLA místa • Je velmi snadné typizovat různá HLA místa několika DNA vzorků paralelně • Je vždy možné zkombinovat různé Protrans Sekvenační kity v různých Strategiích Protrans sekvenování
26
10.4 PROTRANS S3 předplněné PCR stripy v sekvenačních kitech
10.5 Nastavení amplifikace pro PROTRANS S3 sekvenační kity
27
10.6 PROTRANS Domino Stones HLA SBT Sekvenační Kity Protrans Domino Stones jsou navrženy pro maximální flexibilitu při splňování individuálních požadavků HLA laboratoře. Domino Stones Locus- a různé Group-Specific PCR Amplification Mixy (Domino Stones) jsou dodávány odděleně pro umožnění individuálního nastavení podle individuálních požadavků. Při použití Protrans Domino Stones je pro všechna HLA místa možné změnit typizační výsledek s nízkým rozlišením z ostatních technik (SSP nebo SSO) na 4-digitální výsledek s vysokým rozlišením. Locus- a Group-Specific PCR Amplifications pokrývají nejméně Exony 2 a 3 u HLA třídy I a Exon 2 u HLA třídy II. K usnadnění použití • Testovací procedura a program thermocycleru pro amplifikaci, sekvenování a nastavení sekvenátoru jsou pro všechny Protrans Sekvenační kity a pro všechna HLA místa stejná • Purifikace PCR produktů a sekvenčních produktů jsou identická pro všechna HLA místa • Je velmi snadné typizovat různá HLA místa několika DNA vzorků paralelně • Je vždy možné zkombinovat různé Protrans Sekvenační kity v různých Strategiích Protrans sekvenování
10.7 Nastavení amplifikace pro PROTRANS Domino Stones sekvenační kity
28
10.8 PROTRANS S2 Sekvenační kity Protrans S2 sekvenační kity jsou navrženy tak, aby splňovaly požadavky velmi vysoké výkonnosti vzorku stejně jako alela-specifického sekvenování pro méně ambiquit. Tohoto je dosaženo aplikací 4 Group-Specific PCR Amplications (GSA) paralelně pokrytím nejméně exonů 2 a 3 u HLA třídy I a exonu 2 u HLA třídy II, což dovoluje v mnoha případech sekvenční analýzu obou alel odděleně. K usnadnění použití • 4 Group-Specific Primer Mixy jsou předpipetovány dvakrát v 8-jamkových PCR stripech. • Testovací procedura a program thermocycleru pro amplifikaci, sekvenování a nastavení sekvenátoru jsou pro všechny Protrans Sekvenační kity a pro všechna HLA místa stejná • Purifikace PCR produktů a sekvenčních produktů jsou identická pro všechna HLA místa • Je velmi snadné typizovat různá HLA místa několika DNA vzorků paralelně • Je vždy možné zkombinovat různé Protrans Sekvenační kity v různých Strategiích Protrans sekvenování
10.9 Protrans S2 předplněné PCR stripy v sekvenačních kitech
10.10 Nastavení amplifikace pro Protrans S2 sekvenační kity
29
10.11 Protrans S1 Sekvenační Kity Protrans S1 sekvenační kity jsou navrženy tak, aby splňovaly požadavky velmi vysoké výkonnosti vzorku stejně tak jako prodlouženého sekvenování u HLA třídy I k vyřazení všech ambiquit způsobených vně exonů 2a 3. Tohoto je dosaženo Locus-Specific PCR Amplification (LSA) s pokrytím Exonu 1, 2, 3 a 4 u HLA třídy I a Exonu 2 u HLA třídy II, umožňující sekvenční analýzu obou alel najednou. Zvláštní důraz byl kladen na umístění sekvenčních primerů k zajištění kompletních sekvencí Exonů v obou směrech. Pro usnadnění použití je Locus-Specific Amplification Mix připraven k použití. Variantou designu Protrans S1 kitu je Protrans S1 swift Sekvenační kit. Protrans S1swift sekvenační kit je navržen tak, aby splňoval požadavky velmi vysoké výkonnosti vzorku. Tohoto je dosaženo Locus-Specific PCR Amplification (LSA) s pokrytím Exonů 2 a 3 u HLA míst třídy I bez vyřešení ambiquit kvůli variacem vně Exon 2 a 3. Zvláštní důraz byl kladen na vytváření krátkých PCR produktů ke zvýšení výkonu v případě nižší kvality DNA. Pro usnadnění použití je Locus-specific Amplification Mix připraven k použití. Nastavení PCR amplifikace je shodné pro Protrans S1 i Protrans S1swift.
10.12 Nastavení amplifikace pro Protrans S1 sekvenační kity
30
11.0 Analýza výsledků PCR amplifikace. Stanovení Haplotypů PCR produkty jsou identifikovány elektroforézou na fluorescenčním agarózním gelu pomocí UV detekce PCR pruhů.
12.0 Dokumentace pozitivních reakčních stanovení haplotypů Vyfotografujte záznam PCR amplifikace a nahrajte výsledky na kopii Protrans přílohy, Primer Mix Specifikačních tabulek dodávaných s každým kitem, a stanovte PCR produkty k sekvenování. Amplifikační reakce je považována za pozitivní, pokud se objeví intenzivní PCR fragment. Protrans S1 a Protrans Domino Stones PCR produkty mohou být přímo čištěny a sekvenovány bez analýzy na agaru. U Protrans S4, S3 a S2 HLA Sekvenačních Kitů mohou být v závislosti na zkoumaných alelách přítomných ve vzorku DNA pozitivní jedna, dvě, tři nebo čtyři PCR. Amplifikační záznam by měl být stejný se specifikacemi uvedenými v Protrans příloze (Primer Mix Specifikační tabulky). Poznámka Je doporučeno vybrat pro sekvenování takové produkty PCR, které nebyly vytvořeny překrytím primer mixů. Pokud není dosaženo PCR separace alel, je velmi doporučeno sekvenovat v obou směrech. Poznámka Záznam PCR amplifikace by měl být ve shodě se specifikační tabulkou a měl by dávat přesvědčivý výsledek. Pokud je záznam PCR amplifikace nepřesvědčivý, např. pokud ukazuje na přítomnost více než dvou alel, potom se mohla vyskytnout kontaminace, nebo variatní alela. Pokud negativní kontrola vylučuje kontaminaci, může být provedeno sekvenování dvou PCR produktů. Pokud výsledky sekvenování ukazují identické sekvence, měly by být sekvenovány další group-specific PCR produkty. Poznámka Přídružená pozitivní amplifikační kontrola by měla být pozitivní a přidružená negativní amplifikační kontrola musí být negativní k vyloučení kontaminace.
31
2 PCR jsou pozitivní (2 Haplotypy) Pokud jsou pozitivní dvě PCR, musí být sekvenovány oba PCR produkty, každý v jednom směru, přímo nebo zpět. Pokud jsou pozitivní více než dvě PCR, musí být sekvenovány PCR produkty s nejmenším překryvem specifikace, každý v jednom směru, přímo nebo zpět. Pokud se záznam PCR amplifikace neshoduje s Primer Mix Specifikačními tabulkami, např. pokud ukazuje na přítomnost více než dvou alel, potom se mohla vyskytnout kontaminace, nebo variatní alela. Pokud negativní kontrola vylučuje kontaminaci, musí být provedeno sekvenování PCR produktů s nejmenším překryvem specifikace v jednom směru. Pokud výsledky sekvenování ukazují identické sekvence těchto PCR produktů, musí být sekvenovány další group-specific PCR produkty k vyloučení homyzygosity.
Pouze jedna PCR je pozitivní Pokud je pozitivní pouze jedna PCR, musí být LSA PCR produkt nebo GSA PCR produkt u HLA-DRB1 sekvenován v obou směrech, přímo i zpět. Poznámka HLA-DRB1 sekvenační kity jsou založeny na group-specifické odlišnosti sekvencí vně exonu 2. Pro několik HLA-DRB1 alel nejsou tyto sekvence ještě dostupné. Ukázalo se, že vně exonu 2 jsou HLA-DRB1 alely uloženy v alelových skupinách a jsou tudíž amplifikovány určeným primer mixem. Nicméně nemůže být úplně vyloučeno, že některé alely s neznámým motivem vně exonu 2 nejsou kryty HLA-DRB1 primer mixy. Je důležité toto možné omezení vzít na vědomí a je velmi doporučováno provést nízkorozlišovací typizace PCR metodami, pokud byla identifikována pouze jedna alela. Označte pozitivní PCR primer mixy v Protrans příloze. Vyberte Haplotypy, které budou sekvenovány. Vneste výsledek do Protrans Pipetting Assistant nebo pipetovacího návrhu Vytvořte purifikační plate a sekvenční plate podle PROTRANS Pipetting Assistant
32
13.0 Protrans příloha
33
14.0 Čištění Haplotypů Čištění pozitivních PCR produktů PCR produkty musí být před jejich použitím jako sekvenční templáty přečištěny, protože zbytky PCR primerů a nukleotid trifosfátů (dNTPs) mohou interferovat s chemií sekvenování, což by znamenalo nižší kvalitu dat.
14.1 PROTRANS AmpliPur-Fast PROTRANS AmpliPUR-Fast PCR purifikační kit nabízí vhodný nástroj pro rychlé a efektivní přečištění PCR produktů.
Návod 1) 150 µl Binding Buffer vortexujte a napipetujte do PCR produktů, které mají být vyčištěny 2) umístěte Protrans Spin filter do označených Protrans Receiver Tubes 2,0 ml 3) PCR produkt s Binding Buffer napipetujte do středu spin column 4) Protrans Receiver Tubes centrifugujte při 10000 rpm 3 min 5) umístěte Protrans Spin filter do nově označených Protrans Receiver Tubes 1,5 ml 6) 30 µl Elution Buffer (EB) napipetujte do středu Protrans spin column 7) inkubujte při pokojové teplotě 1 min 8) centrifugujte při 6000 rpm 1 min
14.2 ExoSAP-IT® Purifikace Purifikace PCR produktů směsí Exonukleasy I a alkalické fosfatázy (z garnátů) ExoSAP-IT®. Degradace nenavázaných primerů a dNTPs.
Návod 1) 3 µl ExoSAP-IT® před použitím vortexujte. Předpipetujte na PCR stripy nebo PCR platu 2) 10 µl PCR Produktu (Haplotypu), který má být přečištěn, napipetujte na definované místo na PCR plate 3) Uzavřete PCR stripy nebo PCR platy, odstřeďte a umístěte do thermocycleru
34
14.3 Beads Fishing Metoda Alternativou k purifikaci pomocí ExoSAP-IT® je použití Agencourt AMPure technologie založené na kuličkách (Beckman Coulter, 2.3), která zachycuje PCR produkty připoutáním je ke kuličkám a umožňuje odmýt zbytky primerů a dNTPs. Tato technika nepotřebuje thermocycler a může být snadno zautomatizována. Purifikace kuličkami je kompatibilní s nízkým i vysokým výkonnostním formátem při použití jednotlivých zkumavek, 96 nebo 384 jamkovými mikroplaty.
15.0 Výběr sekvenačních primerů Protrans S4, S3, S2 a Protrans Domino Stones HLA Sekvenační Kity jsou navrženy k amplifikaci a sekvenování obou alel zvlášť.
Protrans S1 HLA Sekvenační Kity jsou navrženy k amplifikaci a sekvenování obou alel zároveň. Poznámka Podívejte se do Protrans Přílohy (Primer Mix Specifikační tabulky) pro výběr sekvenčního primeru.
U HLA třídy I by měly být sekvenovány nejméně Exony 2 a 3 k získání 4-digitálního HLA typizačního výsledku.
U HLA třídy II by měl být sekvenován nejméně Exon 2 k získání 4-digitálního HLA typizačního výsledku. Pro HLA typizační výsledky s nižším rozlišením může být dostačující méně sekvenačních informací.
Pokud je separace alel úspěšná (2 Haplotypy), je dostačující sekvenovat každý z dvou vybraných PCR produktů v jednom směru.
U HLA třídy I Pro získání kompletních sekvencí Exonu je doporučeno použít
Reverse Sequencing Primers Exon 2 (E2R) a Exon 3 (E3R). U HLA třídy II Pro získání kompletních sekvencí Exonu je doporučeno použít
Forward sequencing primers Exon 2 (E2F) Pokud není dosáhnuto PCR separace alel, je požadováno sekvenování v obou směrech. Abyste se vyhli ambiquitám i u heterozygotního sekvenování kvůli nedefinovaným cis spojům, použití Sequence-Specific Sequencing Primerů dovolí selektivní sekvenování pouze jedné ze dvou alel. Spolu s výsledky heterozygotního sekvenování může být potom získána jednoznačná definice cis spojů u obou alel.
Sequence-specific Sequencing Primer HLA-DRB1 (DR-86TG) je momentálně dostupný pro selektivní sekvenování kodonu 86.
35
15.1 Nastavení sekvenační reakce DNA je rozdělena na 2 Haplotypy
Je možné sekvenovat každý Haplotyp pouze v jednom směru.
15.2 Nastavení sekvenační reakce Pouze 1 alela nebo pouze jeden Locus specific Amplification Produkt (LSA)
Ve většině případů může být sekvenování exonů 2 a 3 dostatečné i pro 4-digitální typizace a je vždy dostatečné, pokud je požadována pouze 2-digitální typizační informace. Sekvence exonů 1 a 4 modou být požadovány k vyloučení jistých ambiquit stejně neexprimovaných (nulových) alel.
Příloha (viz uvnitř kitu) Ukazuje Specifikace Amplifikačního primeru a další možnosti k využití Sekvenčních primerů pro Exon 1 nebo Exon 4. Exon 1 reversní sekvenování může být také umožněno prodloužení sekvenčního runu Exonu 2 reverse. Exon 2 forward sekvenování může být také umožněno prodloužení sekvenčního runu Exonu 2 forward. Nicméně, toto vyžaduje delší a kvalitnější podmínky a specifické nastavení sekvenátoru. Navíc v jistých kombinacích alel způsobuje delece na intronu 1 posun chromatogramu inhibující sekvenční analýzu Exonu 1 a/nebo 2.
36
16.0 Nastavení sekvenační reakce (3-dot-metoda) 1) Vytvořte sekvenační plate pomocí Protrans Pipetting Assistant (Protrans SEQ 1) nebo Pipetting Scheme vzoru 2) Protrans PCR Workstation -20°C - PCR plate nebo MicroAmp optický plate - Big DyeTerminators - Sekvenační primery 3) Vortexujte Big DyeTerminators 4) 2 µl Big Dyes naneste na levou stranu jamek na MicroAmp optický plate (RAININ Multistepper) 5) Odstřeďte sekvenační primery na mini-centrifuze. 6) 6 µl Sekvenačních primerů naneste na levou stranu jamek na MicroAmp optický plate (RAININ Multistepper) 7) 2 µl Přečištěných PCR Produktů napipetujte do středu jamek na MicroAmp optický plate (RAININ Multistepper) 8) Uzavřete důkladně plate a umístěte plate na thermocycler. Poznámka Pokud sekvenční reakce dává silné signály, může být vhodné naředění BDT RR Mixu, začínejte s ředěním 1:2. Zřeďte Bid Dye Terminators 1.1 pětinásobným množstvím Sequencing Buffer 1:2. Poznámka Pokud sekvenční reakce dává vzestup signálu pozadí nebo větší snížení signálu, může být vhodné naředění PCR produktu, začínejte s ředěním 1:2.
37
17.0 Purifikační Sekvenační reakce 17.1 PROTRANS DyePUR Sekvenční produkty musí být přečištěny k odstranění nezabudovaných dye terminators. PROTRANS DyePUR purifikační kit pro purifikaci sekvenačních reakcí je založen na odstředivé filtraci pomocí Sephadexu G-50 a PROTRANS DyePUR kolon. Metoda dává vysokou kvalitu sekvenčních dat. Příprava gelu Sephadex pro 20 kolon. 1) 2) 3) 4)
50 ml Falcon zkumavka. 1 g Sephadex™ G-50 DNA Grade F 12 ml HPLC voda (Merck) Inkubace při pokojové teplotě 30 min. Promíchejte nebo vortexujte několikrát během inkubace.
Označte Protrans Receiver Zkumavky (2ml). 5) Několik minut před ukončením programu thermocycleru pro sekvenační reakci naplňte kolony suspenzí gelu Sephadex do asi ¾ zkumavky. Použijte plastovou Pasteurovu pipetu. Odstřeďte Protrans Receiver Zkumavky s filtračními kolonami při 2000 g po dobu 90 sekund. Odstřeďovací čas a g musí být přísně dodrženy. 6) Označte Protrans Receiver Tubes 1,5 ml reakční zkumavky podle počtu sekvenčních reakcí, které musí být přečištěny, a umístěte PROTRANS filtrační kolony se suspenzí gelu Sephadex do Protrans Receiver zkumavek 1,5 ml. Čištění sekvenačních produktů 1) Vyndejte jednu odstřeďovací kolonu ven z Protrans Receiver Zkumavek 1,5 ml a podržte ji v ruce. 2) Opatrně napipetujte 10 µl Sekvenčního produktu do středu nakloněného povrchu odstředěných Sephadex kolon. Dávejte pozor, aby se špička nedotkla gelu Sephadex. Pro dobrou separaci je hlavní důkladné nanesení vzorku do středu. Dejte pozor, aby vzorek netekl po stranách Sephadex kolon. 3) Umístěte odstřeďovací filtr zpátky do označené 1,5 ml zkumavky. 4) Odstřeďte Protrans kolonu při přesně 2000 g po dobu 1 min. Odstřeďovací čas a g musí být přesně dodrženy. 5) Do nanášení by měly být označené sekvenční produkty skladovány při 4-8°C nebo pro delší období při -20°C chráněné před světlem. Nastavení sekvenování 1) 18 µl HPLC vody napipetujte na MicroAmp Optický plate. 2) 2 µl Přečištěného sekvenčního produktu napipetujte na MicroAmp Optický plate, vždy použijte nové filtr-špičky. 3) Sekvenční produkty jsou připraveny pro nanesení do sekvenátoru. Do nanesení by měly být platy skladovány při 4-8°C chráněné před světlem.
38
17.2 Precipitace ethanolem 1) 80% Ethanol: 8 částí Ethanolu 100% a 2 části HPLC vody. 2) Krátce odstřeďte 96-jamkový MicroAmp Optický plate se sekvenčními produkty 3) Vezměte EDTA/NaOAc pufr a trochu vortexujte/odstřeďte před otevřením vialky, uchovávejte na ledu (Protrans PCR-Workstation). 4) 2 µl NaOAc/EDTA pufru (Teknova, cat.no. S2080) napipetujte do každé sekvenční reakce. Přidejte kapku na stěnu každé jamky pomocí 8-kanálové multipipety. Poznámka: Ve špičce může zůstat kapka, ujistěte se, že tam nebude. 5) Odstřeďte krátce MicroAmp Optický plate. 6) 25 µl 100% Ethanolu napipetujte do každé jamky za použití 8-kanálové multipipety. 7) Důkladně vortexujte plate 30 sekund. Používejte plochý poklop na plate k předejití vylití (např. hliníkový plate). Poznámka: Nedokonalé promíchání se odrazí ve slabé kvalitě dat. 8) Odstřeďte MicroAmp Optický plate při 2000 g po dobu 30 min. 9) Ihned odstraňte supernatant otočením a jemně osušte poklepáním papírovou utěrkou. Umístěte obrácený nosič s papírovou utěrkou do centrifugy. 10) Odstřeďte MicroAmp Optický plate k odstranění supernatantu při 180 g po dobu 20 sekund. Poznámka: Odstředění je nezbytné k zajištění kompletního odstranění degradovaných produktů. 11) 50 µl 80% Ethanolu napipetujte do každé jamky za použití 8-kanálové multipipety. 12) Odstřeďte MicroAmp Optický plate při 2000 g po dobu 5 min. 13) Ihned odstraňte supernatant otočením a jemně osušte poklepáním papírovou utěrkou. Umístěte obrácený nosič s papírovou utěrkou do centrifugy. 14) Odstřeďte MicroAmp Optický plate k odstranění supernatantu při 180 g po dobu 20 sekund. Poznámka: Odstředění je nezbytné k zajištění kompletního odstranění degradovaných produktů. 15) Usušte nosič v temnu (reakce jsou citlivé na světlo) 15 minut. 16) 10 µl HPLC vody do každé jamky, pomocí 8-kanálové multipipety. Resuspendujte sekvenční produkty pipetováním třikrát tam a zpátky. 17) 90 µl HPLC vody do každé jamkym, pomocí 8-kanálové multipipety. Uzavřete plate a vortexujte! 18) Odstřeďte krátce MicroAmp Optický plate a umístěte na ABI Support Base®. 19) Umístěte Full Plate Septa® mat na nosič, následně 96-jamkový Plate Retainer a umístěte kompletní nosič do ABI Sekvenátoru. Alternativní kroky Připravte 125mM EDTA sodný (pH 7,0): 1 část 0,5M EDTA a 3 části HPLC-H20. 4) 2 µl 125mM EDTA (pH 7,0) přidejte k sekvenčním reakcím (jednoduchá nebo 8kanálová multipipeta). Použijte špičky s filtrem. 2 µl 3M octan sodný (pH 5,2) přidejte k sekvenčním reakcím (jednoduchá nebo 8kanálová multipipeta). Použijte špičky s filtrem. 16) 15 µl Hi Di Formamidu do každé jamky, pomocí 8-kanálové multipipety. Uzavřete plate. 17.1) Inkubujte při 95°C (thermocycler) 2 min. 17.2) Uchovávejte na ledu (Protrans PCR-Workstation) 2 min.
39
17.3 Alternativní purifikační metody Zahrnují mimo jiné Agencourt CleanSEQ beads purifikační technologii, precipitaci ethanolem nebo Millipore Montage filtrační technologii, u kterých bylo prokázáno získání dat o vysoké kvalitě. Tyto techniky mohou být také použity na 96-jamkovém formátu pro požadavky vysoké výkonnosti. Navíc Agencourt a Millipore technologie mají dobrý potenciál k automatizaci. Spousta dalších metod je doskutpných k purifikaci sekvenačních reakcí a po zvalidování mohou být používány v laboratoři.
18.0 Přípravné sekvenační reakce pro elektroforézu Různé sekvenátory mohou vyžadovat různé přípravy vzorků před jejich nanesením na gel nebo kapiláru. Následující kapitoly popisují přípravu vzorků pro kapilární sekvenátory 310, 3100, 3130, 3700 a 3730 a destičkovém gelovém sekvenátoru 377 (Applied Biosystems). Pro ostatní sekvenátory DNA mohou být tyto přípravy také vhodné. Pro detailnější informace se odkažte na doporučení výrobce. Pro přípravu přečištěných sekvenačních reakcí pro kapilární elektroforézu může být možné resuspendování ve formamidu nebo vodě. Pro usnadnění použití, vyšší opakovatelnost a vyšší kvalitu dat je doporučen vodní protokol Protrans HLA Sekvenačních Kitů.
Přípravné sekvenační reakce pro kapilární elektroforézu Jak je popsáno v 22.1 a 22.2, nařeďte přečištěnou sekvenční reakci 10 µl přečištěné sekvenční reakce s 90 µl HPLC vody Uzavřete důkladně plate nebo zkumavky a umístěte je do autosampleru. Poznámka Různé sekvenátory mohou mít různé citlivosti fluorescenční detekce a mohou proto vyžadovat různá ředění. Poznámka Pokud je použito méně nebo více DyeTerminators v sekvenační reakci, jak je uvedeno v 17, musí být tomu přizpůsobeno ředění přečištěné sekvenční reakce. Poznámka Zbylá sekvenační reakce může být skladována pro zálohu při -4°C po několik dnů v temnu.
Přípravné sekvenační reakce pro destičkovou gelovou elektroforézu Vysušte přečištěné sekvenované vzorky ve vakuové centrifuze nebo na tepelném bloku při 70°C po dobu 45 minut. 4 µl Loading pufru (roztok rekrystalizovaného formamidu a modrého dextranu, 5:1; vždy připravte čerstvé pro každé použití), resuspendujte vysušený sekvenovaný vzorek. Pokud byla použita odstřeďovací filtrace (18.1 přeskočte 5), neřeďte a přidejte 4 µl Loading pufru. Pokud byla použita precipitace ethanolem (18.2 krok 15), neřeďte a přidejte 4 µl Loading pufru. Poznámka Různé sekvenátory mohou mít různé citlivosti fluorescenční detekce a mohou proto vyžadovat různá ředění. Poznámka Pokud je použito méně nebo více DyeTerminators v sekvenační reakci, jak je uvedeno v 3.4.1, musí být tomu přizpůsobeno ředění přečištěné sekvenční reakce. Denaturujte resuspendované vzorky při 90°C po dobu 2 minut a před nanesením na gel uchovávejte na ledu.
40
19.0 Spuštění přístroje Vlastnosti přístroje Protrans HLA Sekvenační kity jsou kompatibilní se všemi dostupnými čtyřbarevnými sekvenátory. Řiďte se návody pro standardní spuštění podle výrobce. Čtecí délka 350 bazí je dostačující.
Pro podrobnější informace o těchto přístrojích a pro informace o ostatních čtyřbarevných DNA sekvenátorech se odkažte na návody k použití výrobců. Poznámka Protrans HLA Sekvenační kity byly validovány pro Applied Biosystems DNA Sekvenátory 3100 Genetic Analyzer a 3730 DNA Analyzer. Ostatní čtyřbarevné sekvenátory by měly být před rutinním použitím validovány.
20.0 Identifikování HLA alel Protrans Alely identifikující software Finální krok v sekvenční analýze se skládá z určení alel pomocí Protrans Software Sequence Pilot© Alely identifikujícího softwaru (JSI medical system, www.jsi-medisys.de). Tento program provádí identifikaci alel na základě cDNA sekvenční databáze všech sekvencí exonů HLA třídy I a II, detekuje heterozygotní pozice stejně jako neshody se sekvenční databází, umožňuje manuální sledování nebo úpravu sekvenčních dat stejně jako vyhodnocování, exportování, tisk a archivování sekvencí a výsledků. HLA cDNA sekvenční knihovna je aktualizovaná s každým novým uvedením Sekvenční databáze HLA informační skupiny (www.anthonynolan.com/HIG) a může být spuštěna z www.jsi-medisys.de. Software je dostupný jako Windows™ single-user verze nebo jako Windows™ nebo Linux™ server-client verze. Tato kapitola je určena k rychlému odkazu na pomoc při základních krocích zahrnutých v provedení analýzy softwarem Sequence Pilot©. Pro více detailů se odkažte na návod k použití Sequence Pilot©. Sequence Pilot© Alely identifikující software je kompatibilní nebo přízpůsobitelný ke všem dostupným čtyřbarevným sekvenátorům.
41
21.0 Zásady popisů vzorků Návod Sequence Pilot© Software automaticky pozná sekvenovaný lokus a exon, stejně jako směr sekvenování. Aby bylo umožněno softwaru automaticky spojovat nebo párovat sekvenční výsledky, které k sobě patří (např. přímý nebo zpětný směr sekvenování stejného PCR produktu), musí být dodržována jistá pravidla popisu vzorků. I když nepoužíváte automaticky spojující funkci softwaru Sequence Pilot©, mělo by být dodržováno popisování vzorků k zjednodušení manuálního procesu. Vložte následující typ informací v závorce: (ID vzorku_Amplification Mix_Sequencing Primer)_jakákoli další informace
Oddělené alely Sekvenční reakce DNA vzorku, které byly amplifikovány Group-Specific Mixy S4R2 (DRB1*15, *16) a S4R4 (DRB1*04), mají následující názvy souborů.
Příklad (ID vzorku_S4R2_DR-E2F)_... (ID vzorku_S4R4_DR-E2F)_...
koresponduje s Haplotyp 1 forward koresponduje s Haplotyp 2 forward
Neoddělené alely Sekvenční reakce DNA vzorku, které byly amplifikovány Group-Specific Mixy S4R2 (DRB1*15, *16), mají následující názvy souborů.
Příklad (ID vzorku_S4R2_DR-E2F)_... (ID vzorku_S4R2_DR-E2R)_...
koresponduje s Haplotyp 1+2 forward koresponduje s Haplotyp 1+2 reverse
Díky tomuto označování vzorků software Sequence Pilot© automaticky rozpozná, že tyto sekvenční výsledky k sobě patří a provede určení alel založené na obou výsledcích.
42
22.0 Provedení identifikace alel Menu Result Files 1) Označte výsledný soubor(y) patřící ke stejnému Haplotypu vzorku DNA. Vyberte „save“ k jejich přenesení jako spojených nebo zpárovaných výsledných souborů do tabulky „joined result files“. Process - Vybírá, páruje (přímo nebo zpět) nebo spojuje (různé exony) výsledné soubory, které patří dohromady a musí být dohromady analyzovány - Poznámka Toto je provedeno automaticky, pokud byly dodrženy zásady popisu vzorků. - Vytváří zkombinovanou sekvenci pro zpárované přímé a zpětné sekvence. Začíná identifikaci alel u zpárovaných nebo spojených výsledných souborů tím, že porovná výsledky sekvence s knihovnou HLA sekvencí.
Menu Analysis 2) Označte spojené výsledné soubory ve „Worklist“ a vyberte „Sequence“ v okně analýzy. Process - Zobrazí elektoferogramy a výsledek určení alely v okně „Data Analyzer“. 3) Zkontrolujte výsledky pomocí voleb elektroferogramu. Process - upravuje a re-analyzuje výsledné sekvence, pokud je potřeba. 4) Schvalte konečnou analýzu. Process - validuje identifikaci alel, ukládá data v databázi výsledků, přesunuje výsledky do místní LIS (na požadavek) a tiskne konečnou zprávu k dokumentaci.
23.0 Průvodce nejčastějšími problémy PCR problémy
PCR je extrémně citlivá metoda, která umí efektivně amplifikovat i nejmenší množství DNA. Z toho vyplývá, že i stopy kontaminující DNA ve vzorku mohou být amplifikovány v PCR reakci a zfalšovat výsledek testu. Jeden zvláštní zdroj kontaminace je amplifikovaná DNA, která přijde do kontaktu se vzorky, které musí být stále amplifikovány. K zamezení kontaminace s amplifikovaným materiálem je doporučeno rozdělení pracovního místa následovně:
Předchozí opatření Pre-PCR oblast: Všechna činnost vykonávaná před PCR (příprava a skladování vzorku DNA, příprava PCR amplifikačních reakcí, nastavení a skladování činidel a roztoků k izolaci DNA a PCR). Post-PCR oblast: Všechna činnost vykonávaná po PCR (průběh thermocyclerů a DNA sekvenátorů, provedení elektroforézy na agarózním gelu, přípravné a purifikační sekvenační reakce, skladování amplifikované DNA nebo sekvenčních reakcí). Materiály a vybavení z post-PCR oblasti nesmí být převzaty do prePCR oblasti. Při pipetování v pre-PCR oblasti a pro nastavení sekvenačních reakcí by měly být použity špičky s aerosolovou bariérou (s filtrem). Je doporučeno pro každý amplifikovaný vzorek DNA provedení negativní kontroly jako indikace kontaminace cizí DNA.
43
Následující tabulka zahrnuje možné příčiny a řešení PCR problémů. Problém Možná příčina Žádný PCR Žádný ethidium produkt nebo bromid v gelu slabý PCR produkt Nedokonalé promísení AmpliTaq Gold™ a PCR reakční směsi Degradovaná DNA
Řešení Druhotné barvení gelu v barvicí lázni (1X TBE s 0,5 µg/ml ethidium bromidu); nezapomeňte přidat ethidium bromid před nalitím gelu Zopakujte PCR s kladením důrazu na promíchání
Zhodnoťte na agarózním gelu a reextraktujte DNA, pokud je to nezbytné DNA nezměřena Změřte DNA znovu a upravte na 50 správně – 100 ng/µl PCR inhibitory Reextraktuje genomovou DNA v genomové DNA pomocí jedné z doporučených metod (viz „Příprava vzorku DNA“); vyhněte se použití krve s heparinem Nevhodné Zkontrolujte profil cyklu a případně parametry cyklu upravte Problémy Cyklické profily uváděné v tomto s thermocyclerem návodu jsou optimalizovány pro GeneAmp PCR Systems 2400, 2700, 9600 a 9700 (Applied Biosystems) a také pro PTC-100, PTC-200, Dyad a Tetrad (MJ Research). Použití jiných thermocyclerů může vyžadovat přenastavení cyklického profilu. 2 PCR pásy Nevhodné podmínky Vytvořte agarózní gel podle na agarózním gelu vhodných podmínek Nespecifické Nevhodné Zkontrolujte profil cyklu a případně PCR pásy parametry cyklu upravte Thermocycler Cyklické profily uváděné v tomto problémy návodu jsou optimalizovány pro GeneAmp PCR Systems 2400, 2700, 9600 a 9700 (Applied Biosystems) a také pro PTC-100, PTC-200, Dyad a Tetrad (MJ Research). Použití jiných thermocyclerů může vyžadovat přenastavení cyklického profilu. Nevhodná DNA Taq Opakujte PCR s AmpliTaq Gold™ polymerasa DNA Taq polymerasou Kontaminace PCR Zkontrolujte PCR negativní kontrolu činidel k vyloučení kontaminace PCR činidel. Používejte špičky s filtry. Kontaminace PCR K vyloučení kontaminace DNA vzorku vzorku reextraktujte DNA z nového zdroje vzorku. Používejte špičky s filtry.
44
Problémy se sekvenováním
Problémy se sekvenováním mohou být spojeny se sekvencemi jako takovými nebo pouze s heterozygotními sekvencemi. Problémy s heterozygotními sekvencemi mohou být shifty peaků nebo slabé heterozygotní signály. Většina těchto anomálií se vyskytuje pouze v jednom sekvenovacím směru pro některou pozici bazí a může být vyřešena pozorováním dat v jiném směru. Následující tabulka zahrnuje možné příčiny a řešení hlavních sekvenovacích problémů. Problém Slabá síla signálu
Příliš silný signál
Rušená baseline
Rušená baseline
Řešení Kvůli variacím mezi přístroji, přenastavení času nástřiku a/nebo objemu nástřiku múže být požadováno k získání signálu mezi 100 – 2000 relativními fluorescenčními jednotkami Příliš málo použité Kapilární DNA sekvenátor: sekvenční reakce Zvyšte čas nástřiku, objem nástřiku nebo koncentraci sekvenční reakce. Destičkový gelový DNA sekvenátor: Zvyšte nanesený objem nebo koncentraci sekvenční reakce. Nevhodný čas Kvůli variacím mezi přístroji, nástřiku nebo přenastavení času nástřiku objem nástřiku a/nebo objemu nástřiku múže být požadováno k získání signálu mezi 100 – 2000 relativními fluorescenčními jednotkami Finálně připravená Zvyšte zředění v posledním sekvenční reakce kroku přípravy sekvenčních byla příliš reakcí pro elektroforézu (36 µl koncentrovaná místo 18 µl HPLC vody). Nevhodné Viz „Přečištění PCR produktů pro přečištění PCR sekvenování“. produktu nebo opomenuté přečištění před sekvenováním Nevhodné Znovu přečistěte sekvenční přečištění reakci (viz „Přečištění sekvenční sekvenční reakce reakce“). Nezapomeňte napipetovat celou sekvenční reakci opatrně do středu nakloněného povrchu Sephadex bez dotyku. Napipetování na střed je nezbytné pro vysoce kvalitní přečištění. Nenechte vzorek stékat po stěnách. Kontaminace PCR Zkontrolujte PCR negativní produktu kontrolu k vyloučení kontaminace PCR činidel. K vyloučení kontaminace DNA vzorku reextraktujte DNA Možná příčina Nevhodný čas nástřiku nebo objem nástřiku
45
z nového zdroje vzorku. Používejte špičky s filtry. Kontaminace Opakujte sekvenování s čerstvou sekvenčního zkumavkou sekvenčního primeru primeru. Používejte špičky s filtry. Kontaminace dye Opakujte sekvenování s čerstvou terminator činidel zkumavkou dye terminators. Používejte špičky s filtry. Široké artefakty Nevhodné Znovu přečistěte sekvenční fluorescenčních přečištění reakci. Nezapomeňte terminátorů sekvenčního napipetovat celou sekvenční (fleky barviv) produktu reakci opatrně do středu nakloněného povrchu Sephadex bez dotyku. Napipetování na střed je nezbytné pro vysoce kvalitní přečištění. Nenechte vzorek stékat po stěnách. Vysoké Vzduchové bubliny Kapilární DNA sekvenátor: fluorescenční v kapiláře nebo Znovu naplňte kapiláry. Zvažte peaky polyakrylamidovém možnou výměnu sady kapiláry gelu nebo kontaktujte služby výrobce vašeho sekvenátoru. Destičkový gelový DNA sekvenátor: Nalijte gely pečlivě a použijte na strany gelu skleněné destičky k zamezení vzduchových bublin. Kontaktujte služby výrobce vašeho sekvenátoru.
46
