Természetes szteroid-glikozidok és 3-arilidén-1-tioflavan-4-on oxidációs termékek NMR szerkezetvizsgálata

Természetes szteroid-glikozidok és 3-arilidén-1-tioflavan-4-on oxidációs termékek NMR szerkezetvizsgálata

Készítette:

Kovács József Témavezetõ:

Dr. Tóth Gábor c. egyetemi tanár

Budapest 2002 Készült a

BUDAPESTI MÛSZAKI és GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM ÁLTALÁNOS ÉS ANALITIKAI KÉMIA TANSZÉKÉN 1. Bevezetés 1

Doktori értekezésemet a BME Vegyészmérnöki Kar, Általános és Analitikai Kémia Tanszék NMR Kutatócsoportjában készítettem Dr. Tóth Gábor c. egyetemi tanár témavezetésével, a Kar Bruker DRX-500 típusú NMR berendezésén. Munkám során egyrészt új, ismeretlen szerkezetû természetes

vegyületeket,

melyek

erõs,

szívre

gyakorolt

hatásuk

miatt

potenciális

szívgyógyszerek, másrészt biológiailag aktív vegyületeket és azok származékait vizsgáltam. A vizsgált természetes vegyületek sztereokémiai és NMR vizsgálatai az NMR Kutatócsoport és a Hannoveri Egyetem Szerves Kémia Intézete között egy DFG projekt keretében folynak. Ezeket a mintákat – szívglikozidokat – Egyiptomban honos gyógynövényekbõl izolálták. A tioflavanon epoxidok és származékainak (szulfoxidok, szulfonok) elõállítására a debreceni Kossuth Lajos Tudományegyetemen került sor Dr. Lévai Albert irányítása alatt. Az értekezésben eltekintek a kísérleti körülmények részletes megadásától, mivel a témákat feldolgozó közleményekben ezeket ismertettem. Ez alól kivételt képeznek a csatolási állandó meghatározásához szükséges mérési módszerek, mely a témával részletesebben foglalkozó 4. Fejezetben kaptak helyet. A könnyebb kezelhetõség végett a vegyületek számozását és az irodalomjegyzéket az egyes fejezetekben külön-külön adom meg. Az adott tématerülettel kapcsolatosan megjelent tudományos közlemények, elõadások és poszterelõadások felsorolása az egyes fejezetek végén található rövid összefoglaló részeként jelenik meg.

2

2. Szerves vegyületek szerkezet-felderítésének stratégiája1,2,3

A molekulák kémiai és biológia sajátságainak, továbbá esetleges hatás-szerkezet összefüggések megértéséhez elengedhetetlenül szükséges a dinamikus háromdimenziós molekulaszerkezet ismerete, valamint ennek különbözõ kölcsönhatásokban (pl. gazda-vendég) történõ speciális változásainak a feltérképezése is. Napjainkra a speciális két- és háromdimenziós módszerek rutinszerû használatának következtében az NMR spektrumban kapott jelek hozzárendelésének biztonsága rendkívül megnövekedett. Ennek hatására lehetõség adódik az egyes molekulák konformációs és dinamikus sajátságainak feltárására is. Az elsõdlegesen detektált idõfüggõ jelet, a FID-et Fourier-transzformációval alakítják át frekvenciafüggõ jellé. A többdimenziós mérések esetében azonban ez a frekvenciafüggõ jel modulálva van a pulzusprogramban meghatározottak szerint. Ez lehet valamilyen mag kémiai eltolódása, de megtalálhatjuk az egy és több kötésen keresztüli csatolási állandókat is. A teljes információ kinyeréséhez ezért összesen n-szer kell Fourier-transzformálnunk, ahol n a mérés dimenzióját jelenti. Alapvetõ mérési típusként a COSY, TOCSY, HMQC, HSQC, HMBC, NOESY, ROESY mérési módszereket említhetjük meg, melyek egy olyan mérési arzenált jelentenek, aminek segítségével viszonylag rövid idõ alatt eljuthatunk a különbözõ szerves molekulák szerkezetmeghatározásáig. Az 1. Ábrán a szerkezet-felderítés vázlatos stratégiáját mutatom be. Teljesen ismeretlen vegyület esetében szükségünk van egy biztos összegképletre, melyet vagy a klasszikus módszerekkel végzett elemanalízis, vagy pedig a nagyfelbontású MS spektroszkópia szolgáltat. Ezek után felvesszük a vegyület 1H és 13C spektrumát (vagy egyéb, a mintában jelentõs számban elõforduló

mag

NMR

spektrumát,

amennyiben

ez

lehetséges).

Ezek

alapján

már

következtethetünk a jellegzetes csoportok (pl. aldehid, észter, aromás jellegû csoportok) meglétére. Teljes bizonyosságot azonban csak a korrelációs mérési módszerek használatával érhetünk el. A 1H,1H-COSY mérés segítségével az egymáshoz kapcsolódó XHn egységek (X: C, N, esetenként O, stb.) sorrendjét kapjuk, meg míg a spinlock körülmények között felvett TOCSY módszer segítségével az egész csatolódó spinrendszert nyomon követhetjük egészen addig, míg vagy kvaterner szénatom, vagy heterotaom nem állja a transzfer útját. Mivel az átvitt mágnesezettség függ az egyes protonok közötti csatolási állandótól, ezért némely esetben a

3

Elemanalízis

Összegképlet

Nagyfelbontású MS

↓ 1

H kémiai eltolódások

Funkciós csoportok

13

C kémiai eltolódások

↓ H,H−COSY

Szerkezeti

(TOCSY) (nJH,H)

alegységek

C,H−COSY (nJC,H)

↓ H,H−NOE(SY) H,H−ROESY

2

Szerkezeti képlet

JC,H, 3JC,H és 1JC,C kapcsolata

↓ Relatív konfiguráció ↓ NOESY, ROESY (EXSY)

3

Konformáció

JH,H és 3JC,H diéderes szög

↓ EXSY

Dinamika, host/guest

T1 és T2 relaxáció

kölcsönhatás

Hõmérsékletfüggés

↓ Háromdimenziós molekulaszerkezet 1. Ábra: Az NMR módszerekkel történõ szerkezet-felderítés stratégiájának vázlata

4

nullához közeli csatolási állandó nagymértékben lecsökkentheti a módszer hatékonyságát. Ekkor az éppen ilyen kis csatolásokra optimált távolható (Long-range) COSY-t célszerû alkalmazni. Az egyes CHn protonokhoz tartozó szénatomokat a korrelációs spektroszkópia heteronukleáris változataival, leggyakrabban HMQC és HSQC mérésekkel tudjuk meghatározni: a kapott spektrumban az adott proton (vagy protonok) keresztcsúcsot ad a hozzá kötõdõ

13

C atommal.

Amennyiben a mérés nem az egykötésen keresztüli csatolásokra van optimálva, hanem a lényegesen kisebb 2JC,H és 3JC,H csatolásokra, úgy eljutunk a HMBC méréshez (direkt detektált változata a COLOC). A HMBC segítségével, mely a két, illetve három kötésre lévõ

13

C és 1H

atomok között teremt kapcsolatot, megvalósíthatjuk az egyes csoportok szerkezeti alegységekké történõ rendezését, ezek kapcsolódási sorrendjének meghatározását. Így eljutunk a szerkezeti képlethez. Ennek alátámasztására és finomítására hasznosíthatjuk a nukleáris Overhauser effektust (NOE) is, ami abban nyilvánul meg, hogy egy atommag besugárzásának hatására a térközelben

elhelyezkedõ

egyéb

magok

jelének

intenzitása

megnövekszik.

Ez

az

intenzitásnövekedés azonban a protonok közti atomtávolság növekedésével erõteljesen (a távolság hatodik hatványával fordítottan) csökken, így a maximum 50 nm-nél (5Å) közelebbi hidrogénatomok azonosíthatók. A mérés kétdimenziós változata, a NOESY (ROESY) spektroszkópia, a keresztcsúcsok térfogati integrálja alapján a távolságok kvantitatív meghatározását is lehetõvé teszi, amennyiben megfelelõ viszonyítási térfogat/távolság a rendelkezésre áll. Az eddigi spektrális adatok alapján már megállapíthatjuk a molekula relatív konfigurációját, azaz a háromdimenziós szerkezetét. Azonban a szerkezetvizsgálat itt még koránt sem ér véget, hisz ez csupán egy álló, statikus kép. Egy molekulaszerkezetnek, azonban idõfüggése, dinamikája is van, mely jórészt az egyes konformerek (energiaminimumok) és tautomerek egymásba alakulását jelentik a megfigyelési hõmérsékleten. A konformációs viszonyok leírásához elsõsorban a vicinális csatolási állandók és a csatolást kialakító atomok közötti diéderes szög ún. Karplus-típusú összefüggését, valamint a cserélõdési viszonyokat megadó EXSY módszert használhatjuk fel. Sor kerülhet még a továbbiakban hõmérsékletfüggõ NMR mérésekre, végül a T1 és T2 relaxációs idõk meghatározásával tehetjük teljessé a vizsgálatokat, kapjuk meg az adott molekula térbeni és idõbeni leírását.

5

2.1 Irodalomjegyzék

[1] Tóth G. Magyar Kémikusok Lapja, 1998, 53: K62. [2] Duddeck H, Dietrich W, Tóth G. Structure Elucidation by Modern NMR (workbook), Springer, 3rd and revised ed., 1998. [3] Brown S, Kalinowsky HO, Berger S. 150 and More Basic NMR experiments, Wiley-WCH, 1998.

6

1 3. Az NMR módszer ek fejlõdésének irányai

Idén ötvenhét éve annak, hogy két amerikai egyetem kutatói függetlenül egymástól észlelték a mágneses magrezonancia jelenségét: Bloch, Hansen és Packard (Stanford University), valamint Purcell, Torrey és Pound (Harward University). Felfedezést követõ évtizedek NMR fejlõdését jól mutatja, hogy 1952-ben a fent nevezett kutatók nem kémiai, hanem fizikai Nobel-díjat kaptak. Azóta eltelet számos évtizednyi fejlesztõi munka, melynek eredményeképpen napjainkban az NMR spektroszkópia a kémiai szerkezetkutatás egyik alapvetõ és mondhatni, leghatékonyabb módszerévé vált. Felhasználása rendkívül széles, megtalálhatjuk mind a szerves- és biokémia, gyógyszerkémia, mind az anyagszerkezet vizsgálat és analitika területén. Újabban rendkívüli jelentõséggel bír az orvosi diagnosztikában is. A fejlõdés azonban koránt sem állt meg, hiszen az újabb és nagyobb térerejû mûszerek, a digitális elektronika kiterjesztése, a rádiófrekvenciás tekercsek fejlesztése, valamint a többcsatornás mérõfejek bevezetése biztosítják a terület töretlen fejlõdését. Ezt nagyon jól tükrözi az NMR egyik legnagyobb úttörõjének, Richard Ernstnek 1991ben kapott kémiai Nobel-díja. Az NMR hatékonysága és teljesítõképessége is rendkívül sokat fejlõdött, még akkor is, ha csak az elmúlt tíz évet nézzük. Áramló oldatos rendszerekben mûködõ készülékek naponta akár ezer spektrumot is képesek rögzíteni, ezzel jelentõsen csökkentve az egy mérésre esõ költségeket. Ennek hatására lehetõség adódott a kombinatorikus kémia területen történõ felhasználásra is, ahol a teljesítmény/ár hányados nagyságágának rendkívül fontos szerep jut. A szilárd fázisú NMR megvalósítása újabb lépést jelentett mind a kémiai, mind a biokémiai vizsgálatokban, melynek hatására még jobban megnõtt az NMR felhasználók tábora. Az NMR módszerek alkalmazása azonban nemcsak sokat nyújt, hanem rendkívül sokat is követel. Ez elsõsorban a meglehetõsen szerény (legalábbis a legtöbb alkalmazott spektroszkópiai módszerhez képest) érzékenységének tudható be, mely abból fakad, hogy a magspin alap és gerjesztett állapota között rendkívül kicsiny, kb. 10-25 J/spin, energiakülönbség van. Ezt jól tükrözi az NMR egyik alapegyenletének is tekinthetõ összefüggés (1. Egyenlet), mely a jel/zaj viszonyt (signal/noise) adja meg.

7

 G ⋅Q  3/ 2 S / N = n ⋅ γ gerj ⋅ γ det ⋅ NS1/ 2 ⋅ T −1 ⋅ T2−1 ⋅ B 3/ 2    c 2 ⋅ Tc  1. Egyenlet: NMR mérések jel/zaj viszony függése

Ahol az egyes betûk jelentése a következõ: n: molekulák száma γ: giromágneses tényezõ NS: akkumulálások száma T: abszolút hõmérséklet T2: spin-spin relaxációs idõ B: mágneses térerõ G: mérõfejre jellemzõ állandó Q: jósági tényezõ c2: elõerõsítõ zajfaktora Tc: rádiófrekvenciás adó- és vevõtekercsek aktuális hõmérséklete A zárójelben található paraméterek a mérõfejre vonatkoznak, így tulajdonképpen hardwarefüggõek. A következõkben jórészt a fenti képlet alapján szeretném bemutatni azokat a technikai újításokat, melyek az NMR közelmúltban való fejlõdését mutatják. A képletbõl kitûnik, hogy az NMR mérések érzékenységét jelentõsen növelhetjük, ha az egyes méréseket egymásra rögzítjük, akkumuláljuk. Ezen túlmenõen nagy hatása van az NMR hasznos mérési térfogatában jelenlévõ molekulák számának. Ennek növelésének legegyszerûbb módja, ha nem a szokásos 5 mm átmérõjû csövet alkalmazzuk, hanem szélesebb mintacsövet használunk. Ehhez azonban speciális mérõfej is szükséges, mely szélesebb furattal rendelkezik, valamint a mágneses tér mintán belül elérhetõ homogenitása is fordítottan arányos a mintacsõ szélességével. Amennyiben, és ez pl. természetes vegyületek vizsgálatakor mindennapos, csak korlátozott mennyiségû minta áll rendelkezésünkre, úgy elõnyösebb a nemrégiben elterjedt ún. Shigemi csõ használata, melyek olyan speciális üvegbõl készülnek, amelyek szuszceptibilitása megegyezik a deuterált oldószerével, valamint speciális kiképzésük folytán a megfelelõ homogenitáshoz elegendõ oldatmennyiség is jóval kevesebb. Természetesen minden oldószerhez külön csövet kell használnunk, azonban kb. 16-szoros érzékenységnövekedés rendszerint megéri ezt az áldozatot. Egy másik nagy elõrelépést ezen a területen az ún. átfolyó cellás mérõfej hozott, melyhez szükséges mintatérfogat csupán 60-200 µl, melyet folyamatos és stop/flow üzemmódban is

8

használhatunk. A módszer megnövekedett érzékenysége abból fakad, hogy megszûnt a mintát és a rádiófrekvenciás tekercseket elválasztó légrés, speciális anyagból készült és speciálisan kialakított adó- és vevõtekercsek közvetlenül a küvetta falán helyezkednek el, ami a G (mérõfejre jellemzõ állandó) és a Q (jósági tényezõ) nagymértékû javulását eredményezi. Az egyes mérõcella kialakításokat az 1. Ábrán követhetjük nyomon.

1. Ábra: NMR mérõcsövek

A

manapság

használatos

modern

NMR

spektroszkópiában

rendszerint

olyan

pulzustechnikákat használnak, melynél mind a gerjesztéshez (γgerj), mind a detektáláshoz (γdet) a hidrogén atomot használják, mivel ez a mag rendelkezik a legnagyobb giromágneses tényezõvel. Pl. γ1H/γ13C = 4. Egyéb lehetséges variációkat az 1. Táblázatban mutatok be a relatív érzékenység és idõ feltüntetésével együtt.2 Amint látható, az érzékenység jelentõs növekedése miatt, a megfelelõ minõségû spektrum felvételéhez szükséges idõ drámaian lecsökken, teret adva az adott minta sokrétû vizsgálatának. Kísérlet 1D C{ H} NOE nélkül 1D 13C-DEPT 2D C,H-COSY 2D H,C-COSY 13

1

gerj./det. mag 13 13 C/ C 1 H/13C 1 H/13C 1 1 H/ H

relatív érzékenység 1 4 4 32

1. Táblázat: Hagyományos mérési módszerek relatív érzékenysége

9

fajlagos idõ 1024 64 64 1

A nagy mágneses térerõn végzett, protondetektált (inverz) heteronukleáris mérési módszerek megnövelt érzékenysége folytán manapság már olyan módszerekkel rendelkezünk, melyekkel alig néhány mg, néhány esetben ng anyagmennyiségû mintából a teljes szerkezet felderíthetõ még viszonylag bonyolult molekulák esetében is. Azaz rövid idõ alatt képet kapunk a minta konformációs, izoméria és tautomer viszonyairól. A mágnesezettség egyik magról a másikra történõ átvitele és kifejlõdése a kötõ elektronok közvetítésével, téren keresztül, dipól-dipól kölcsönhatások, vagy kémiai kicserélõdés révén történhet meg. Ennek alapján a kétdimenziós NMR mérési módszerek 2. Ábrán látható csoportosítását tehetjük meg. 1.) kötõ elektronok közvetítésével

2.) téren keresztül, dipol-dipol kölcsönhatások révén (dipoláris csatolódás)

(skaláris csatolódás, J) 1.a) kémiai eltolódás korreláció COSY (TOCSY)

NOESY (ROESY)

1.b) csatolás felbontott spektroszkópia (J resolved)

3.) kicserélõdési spektroszkópia (EXSY)

J

2. Ábra: A mágnesezettség átvitelének és kifejlõdésének módjai

10

Az 1. Egyenlet további tanulmányozásakor kitûnik, hogy a mérések érzékenysége, és ezzel párhuzamosan a hatékonysága is nagyban függ az alkalmazott mágneses térerõtõl (∼B2/3). Ezen a területen a jelentõs áttörést a szupravezetõ mágnesek hozták meg, mellyel a 90-es évek elejére a cseppfolyós hélium hõmérsékletén mûködõ mágnesek már 17.6 Tesla térerõt voltak képesek létrehozni, amely a 750 MHz 1H frekvenciának felel meg. A továbblépést a napjainkban kereskedelmi forgalomban is kapható 21.1 Tesla (900 MHz) térerõt elérõ mûszerek felé az ún. Joule-Thompson hûtõegység bevezetése jelentette, melynek segítségével a hélium folyamatos elpárologtatása révén a szupravezetõ 2 Kelvin fokra történõ hûtése lehetséges. A nagyobb térerõ hasznossága nemcsak az érzékenység növekedésében, hanem a jelek diszperzitásában is megnyilvánul, így egy 500 MHz-en „zsúfolt” proton spektrum jelei lényegesen jobban elkülönülnek magasabb térerõn, amely nagyban megkönnyíti a jelek biztos hozzárendelését. Az érzékenységet leíró egyenletet tovább szemlélve eljutunk a zárójelben lévõ tényezõkhöz, amik közül a G és Q már említettem a mérõcsövek tárgyalása kapcsán. A kedvezõtlen termikus zaj csökkentésének egyik megoldása, hogy magukat a rádiófrekvenciás tekercsek hõmérsékletét csökkentjük le az ún. kriogén tartományba. Ekkor a tekercsek ellenállása lecsökken, aminek folytán a Q jósági tényezõ jelentõsen nõ. További elõrelépést jelentett a rádiófrekvenciás tekercsek 25 Kelvinen mûködõ, szupravezetõ kerámiából történõ elõállítása, valamint a hûtött elõerõsítõvel egybeépített ún. Cryo-fej használata. Ezek a fejlesztések annyira erõteljesen növelik az érzékenységet, hogy a szükséges anyagmennyiséget a ng tartományba sikerült leszorítani, ugyanis a jel/zaj viszony akár 3-7-szeresére is növelhetõ, ezzel együtt a szükséges mérési idõ jelentõsen lecsökken (2. Egyenlet).

 ( S / N ) hagyományos  mérésidõcryo = mérésidõhagyományos ⋅    ( S / N ) cryo 

2

2. Egyenlet: Mérési idõ számolása Cryo-fej esetén

Az NMR mérési módszer másik nagy problémája a kis érzékenység mellett az, hogy a minta szennyezései nagyban nehezíthetik a jelhozzárendelést. Elsõsorban akkor, ha a szennyezése mennyiségileg összemérhetõ a meghatározandó anyagéval. Az egyik lehetséges módszer ebben az

11

esetben az egyes komponensek diffúziója szerinti szétválasztás, amivel a DOSY (Diffusion Ordered SpectroscopY) módszer foglalkozik. Azonban a leghatékonyabb megoldásnak a folyadékkromatográfia (LC) és az NMR összekapcsolása bizonyult. Ehhez az elsõ ábrán látható átfolyó cella használatos. A legnagyobb problémákat ebben az esetben a rendkívül nagy oldószerjelek (eluens), valamint az LC a mágnestõl való viszonylag távoli elhelyezése okozza. Az elõbbi probléma kiküszöbölésére számos olyan speciális pulzusprogram született, amely hatékonyan képes elnyomni az oldószerektõl származó jeleket. Míg az utóbbi probléma esetén igazi áttörést csak a különleges árnyékolású mûszerek megjelenése jelentett. Az UltraShield technológiának nevezett módszer lényege, hogy a belsõ szupravezetõ tekercs mellett, ami a mágnes furatán belüli mágneses térért felel, egy külsõ, ellentétes polaritású mágnes is helyet kap a mûszerben. Ennek hatására a külsõ mágneses tér nagyrészt kioltja a belsõ mágnes szórt terét. Ezenfelül növeli a mintában képzõdõ tér homogenitását is. Ennek az árnyékolási technikának köszönhetõen az LC mûszereket, valamint egyéb elektronikus egységeket is, lényegesen közelebb lehet elhelyezni a mágneshez, mely nagymértékben csökkentette a kromatográfiás holtidõ nagyságát, valamint a szükséges oldószermennyiséget. Végezetül röviden kitérnék a szilárd fázisú NMR spektroszkópia néhány aspektusára. Egyik legfontosabb módszere a HR-MAS (High Resolution Magic Angle Spinning), ami inhomogén minták esetében is alkalmas nagyfelbontású proton felvételek készítésére. A módszer alapja, hogy a mintát kis térfogatú, a mágneses térhez képest 54.7 fokot (ún. mágikus szöget) bezárva helyezik el, és néhány KHz-es frekvenciával forgatják, ezáltal a dipoláris csatolások okozta jelkiszélesedés elmarad. Az érzékenység növelésének új vonalait a dinamikus magpolarizáción alapuló ELDOR technika, valamint a SPINOE effektuson alapuló módszerek jelentik. Az elõbbi esetben kis mágneses térben gyököket állítanak elõ állófázison kötött molekulákból. A vizsgált mintát ezen az állófázison vezetik keresztül, melynek hatására a mágnesezettség az elektronspinrõl a magspinre tevõdik át. Ennek hatására az elektron giromágneses tényezõjébõl adódóan proton esetében 660-szoros, míg

13

C esetében 2640-szeres érzékenységnövekedés valósítható meg. A

SPINOE (Spin Polarization Induced Nuclear Overhauser Effect) esetében lézerpolarizált xenon és hélium keresztrelaxáció révén képes a lézer által kiváltott magpolarizációt más magra átvinni. Ez egyrészt kb. ötszörös érzékenységnövekedést jelent, másrészt az átvitt polarizáció nagysága függ

12

a xenon és a célmag távolságától, így a módszer távolságmérésre is alkalmas. Ezt a sajátságot élõ szövetek vizsgálatánál is alkalmazzák az orvosi diagnosztikában használt MRI módszernél.

3.1 Irodalomjegyzék

[1] Tóth G. Magyar Kémikusok Lapja, 2002. megjelenés alatt [2] Gemecker G, Kessler H. Methodology and Applications of Heteronuclear and Multidimensional 13C NMR to the Elucidation of Molecular Structure and Dynamics in the Liquid State. - in: Carbon-13 NMR Spectroscopy of Biological Systems. Ed: Beckmann N, Academic Press, Inc. 1995, 7-64.

4. Távolható csatolási állandók meghatározása A vicinális csatolási állandó diéderes szögtõl való függése közismert1 és rendkívül fontos szerepet játszik a pontos szerkezetvizsgálatban. Protonok közt viszonylag egyszerûen mérhetõ (vagy számolható) ez a csatolási állandó, azonban a kis NMR érzékenységgel rendelkezõ, ámbár a szerves kémiában nagy gyakorisággal elõforduló magok (pl.

13

C,

15

N) esetében meglehetõsen

komoly mérési problémákkal találjuk magunkat szemben. Ez egyrészt oda vezet, hogy kevés olyan mérési szekvencia létezik, mellyel gyorsan és hatékonyan tudunk távolható heteronukleáris csatolásokat meghatározni, másrészt még kevesebb olyan módszer található, amit a molekulák széles körében tudunk hasznosítani. Doktori munkám során gyakorta találkoztam a távolható csatolási állandók meghatározásának problémájával, elsõsorban konformációs vizsgálatok során. Ezért úgy éreztem, hogy dolgozatomban létjogosultsága van egy, a csatolási állandók meghatározásával foglalkozó résznek, amely elsõsorban az utóbbi években megjelent, témába vágó publikációkra alapoz, és fõ témája a 3J(C,H) meghatározása. Modellvegyületként a sztrichnint használtam. A dolgozat szerkesztésének megkönnyítése végett néhány spektrum irodalmi eredetû (ezeket külön jelzem a spektrumok magyarázatában), míg a többi esetben a Lipcsei Egyetem 400 MHz-es mûszerén felvett mérések eredményét mutatom be.

13

A fejezet a következõ mérési módszerek áttekintését tartalmazza: gs-HETLOC, HSQCTOCSY, HSQC-HECADE, GSQMBC, HSQMBC, J-HMBC-1, J-HMBC-2, broadband J-HMBC, J-IMPEACH-MBC, J-HMQC.

4.1 Érzékenység-növelt gs-HETLOC

A HETLOC módszer alapjait 1991-ben Kurtz és munkatársai közölték, mely azonban nem rendelkezett megfelelõ érzékenységgel.2 A gradiens szelekció elterjedésével megjelent a gsHETLOC is, melynek egyik legutolsó, érzékenység növelt változatát Uhrin és munkatársai (köztük Batta Gyula és Kövér Katalin) 1998-ban közölték.3 A módszer E.COSY típusú jeleket eredményez, ami azt jelenti, hogy az F2 dimenzióban a távolható heteronukleáris csatolási állandó szerint, míg az F1 dimenzióban az egykötésen keresztüli heteronukleáris csatolási állandó szerint válnak szét a jelek.

14

1. Ábra: a gs-HETLOC pulzusprogram, a fehér és fekete téglalapok 90 és 180 fokos pulzusokat jelentenek, φ1: 0000000022222222, φ2: 11113333, φ3: 02022020, d2 = [4·(1JC,H)]-1, d3 = [2·(1JC,H)]-1, d20 = 3·δ, δ = effektív gradiens hossz, Gx: 1 ms hosszú gradiens pulzus, G1: G2: G3: G4: G5 = -20: -25: 25: 11: ±11.

A pulzusprogramot az 1. Ábrán mutatom be. A szekvencia az eredeti BIRD elõkészítés helyett egy z,z-gradiens X-szûrõvel indul, melynek feladata a

12

C atomokhoz kötött protonok

jelének szûrése a lehetõ legkisebb hasznos jelveszteséggel, melyet az elsõ gradiensnek ezen magokra történõ defókuszálásával érnek el. A továbbiakban adott kompozit X pulzus elsõ 90 fokos pulzusa váltakozó elõjelû a

12

C-hez kötött protonok hatékony szûréséhez. A kémiai

eltolódás kifejlõdéséért felelõs t1 periódus közepére egy ún. G-BIRDr szekvencia került, mely a távolható homonukleáris csatolásokhoz tartozó mágnesezettséget invertálja, míg a közvetlenül csatolt protonokhoz és az X magokhoz mágnesezettségre 0 fokos forgatás hat. A két egyenlõ nagyságú, de ellentétes irányú gradiens pulzus segítségével így a homonukleáris csatolásokat kiszûri a G-BIRDr. Ez elsõdlegesen egyszerûbbé teszi a spektrumot, másrészt növeli az érzékenységet. Másodlagos funkcióként skálázást alkalmazhatunk az egykötésen keresztüli csatolásokra, mely az F1 dimenzióban fellépõ zsúfoltságot szüntetheti meg hatékonyan. A pulzusprogram végén egy gs-TOCSY szekvenciát találunk, mely az érzékenységnövelt DIPSI-2 keverési módot használja, mely mind a P-, mind az N-típusú mágnesezettségi komponenst megtartja. Végül echo/anti-echo gradiens szelekciót alkalmazunk az akvizíció elõtt, mely az érzékenység további növelését hivatott elvégezni. Amint a 2. Ábrán bemutatott spektrumon láthatjuk, a pulzusprogram jelentõsen megújult, a módszer érzékenysége olyan jelentõsen megnõtt, hogy képes a mai elvárásoknak is

15

2. Ábra: A sztrichnin érzékenységnövelt gs-HETLOC spektruma;4 a csatolási állandók az egyes keresztcsúcsok F1 dimenzióban felhasadt szeleteinek (d – e és f - g) eltolódáskülönbségével egyenlõek

megfelelni. A kapott spektrum analízise rendkívül egyszerû, hiszen elegendõ az F1-ben dublettként szétvált keresztcsúcs két részének F2-beli különbségét leolvasni, mivel ez a különbség megegyezik a heteronukleáris csatolási állandóval. A módszer nagy elõnye, hogy a meghatározás pontossága csupán az F2 dimenzió felbontásától függ, így olyan esetekben is jól használható, amikor a csatolási állandó kisebb, mint a jelek szélessége az F2 dimenzióban. A kapott csatolási állandók tovább is megkülönböztethetõek, mivel az egy- és háromkötésen keresztüli csatolások ellentétes eltolódást okoznak F2-ben, mint a kétkötésen keresztüliek.

16

A módszer hátrányai között elsõsorban a TOCSY mágnesezettségi átvitelt kell megemlíteni, mely a folytonos proton-proton spinredszerekre csökkenti le a módszer alkalmazhatóságát. Ugyancsak ezzel függ össze az a tény is, hogy a keresztcsúcs nagysága közvetlenül függ az átvitelben résztvevõ protonok közötti csatolási állandótól. A proton dimenzió spektrális diszperziójából származó hibák kiküszöbölésére született meg a HSQC-TOCSY és a HSQCHECADE mérési módszer.

4.2 HSQC-TOCSY

Kövér és munkatársai 1997-ben publikálták a HSQC-TOCSY legújabb, érzékenység-növelt változatát,5 melyben a Kay és munkatársai által javasolt gradiens szelekciót alkalmazták.6 A módszer a mágnesezettség átvitelhez az egykötésen keresztüli 1J(C,H) csatolási állandókat, valamint TOCSY transzfert használ, ezáltal elkerüli a kis távolható csatolásokon keresztüli átvitel összes problémáját.

3. Ábra: a HSQC-TOCSY pulzusprogram, a fehér és fekete téglalapok 90 és 180 fokos pulzusokat jelentenek, a szürke téglalap egy 2 ms hosszú trim pulzust jelöl, φ1: 0202, φ2: 0022, φ3: 1133, φ4: 0220, d2 = [4·(1JC,H)]-1, δ = effektív gradiens hossz, Gx: 1 ms hosszú gradiens pulzus, G1: G2 = 40: ±10 (γH: ±γX)

A pulzusprogramot a 3. Ábrán láthatjuk, melynek fõ részei közé tartozik a DIPSI-2 keverési módszer, mely mind az N-típusú, mind a P-típusú mágnesezettségi komponenst megtartja, ezáltal

17

növelve a mérés érzékenységét (MLEV típusú keverésnél ez nem lehetséges). A program 2 ms-os trim-pulzust használ a nem NMR aktív szénatomokhoz kötött protonok kiszûrésére, valamint gradiens pulzusokat és egy négylépéses fázisciklust a nem

4.a Ábra: A sztrichnin 13C-lecsatolt HSQC-TOCSY spektruma

18

4.b Ábra: A sztrichnin 13C-csatolt HSQC-TOCSY spektruma

kívánt mágnesezettség kiszûrésére. A fázisciklus során a

13

C 90 fokos pulzusok fázisa

invertálódik. A fázisciklus minden második lépésében az elsõ 90 fokos pulzus invertálódásával összhangban a vevõ fázisa is megváltozik, majd a harmadik és negyedik lépésben a második és harmadik 90 fokos pulzus is invertálódik, aminek megfelelõen a vevõ fázisa is megváltozik a gradiens pulzus koherencia-szelekciójával összhangban. A csatolási állandók mérése két lépésben történik. Az adott mintáról fel kell vennünk egy, a heteroatom által lecsatol spektrumot (4.a Ábra), valamint egy másik spektrumot, amelyben az akvizíció alatt engedjük a heteronukleáris csatolások fejlõdését (4.b Ábra). Ezáltal a második mérésbõl származó keresztcsúcsok tartalmazzák a heteroatom csatolását, míg az elsõ mérés során kapott jelek csupán a homonukleáris csatolások szerint hasadnak fel, így ez utóbbi jelet, mint referenciát használhatjuk fel a heteroatom által csatolt jelek szimulálásához. A kívánt sort kivéve, majd a referenciajelet a távolható csatolás értéknek felével balra és jobbra eltolva, majd összeadva a két eltolt jelet, szimulálhatjuk a távolható csatolásból származó hatást. Természetesen ez egy többlépéses folyamat, amelynek során egyre jobban megközelítjük a mért

19

jelet a szimulált jellel. A megfelelõ minõségû egyezés esetén az eltoláskor használt értéket tekinthetjük a meghatározandó csatolási állandónak. Ezt a folyamatot számítógépes segítséggel is elvégezhetjük, amely lényegesen meggyorsítja a folyamatot. Az eddigiekbõl kitûnik, hogy a módszer alkalmazásához nem szükséges teljesen abszorptív jeleket produkálnunk, hiszen a csatolt és lecsatolt spektrum fázisa teljesen megegyezik. Ez rögtön megszûnteti a referenciajel felvételének problémáját is, amely minden fázisérzékeny módszer ilyen típusú felhasználásának sajátja. A módszer legnagyobb hátrányát, csakúgy, mint a HETLOC esetében, a TOCSY transzfer jelenti, mivel csatolódó protonok nélkül nem tudjuk átvinni a mágnesezettséget, azaz kvaterner szénatomon, illetve heteroatomon keresztül nem tudunk csatolási állandót mérni. Ez a hátrány egyes esetekben (pl. glikozidos kötés körüli konformációs viszonyok vizsgálata) teljesen meggátolja a HSQC-TOCSY használatát.

4.3 HSQC-HECADE

A HETLOC mérési módszer alapjaira épülõ HSQC-HECADE (Heteronuclear Couplings from ASSCI-Domain experiment with E.COSY-type cross peaks) pulzusszekvenciát Kozminski és Nanz publikálta.7 A mérés az egyszeres kvantum koherenciára épül, melyet az érzékenységnövelt HSQC szekvenciával érnek el.8 A módszernek létezik többszörös kvantumú változata is, azonban ennek hosszabb volta miatt ez nem kedvelt. A publikált pulzusprogram az 5.a. Ábrán látható, mely az alap gradiens szelekciót tartalmazó HSQC rész mellett egy, az érzékenységet növelõ részt (szaggatott vonallal körbevett rész), valamint egy

20

5.a Ábra: a HSQC-HECADE pulzusprogram, a fehér és fekete téglalapok 90 és 180 fokos pulzusokat jelentenek, φ1: 0202, φ2: 0022, φ3: 0220, ψ: -π/2 echo-nál és +π/2 anti-echo esetén, R: BIRDX szekvencia, vagy szelektív gerjesztés (lásd alább), d2 = [4·(1JC,H)]-1, δ = effektív gradiens hossz, Gx: 1 ms hosszú gradiens pulzus, G1: G2: G3: G4 = 30: ±40: ±40: 20.

5.b Ábra: Az R két lehetséges jelentése: BIRDx szekvencia (bal), d3 = [2·(1JC,H)]-1; szelektív gerjesztés (jobb)

ún. pszeudó evolúciós idõt (t1*) is találunk. Ezt követi a DIPSI-2 szekvenciát használó izotróp keverés. Mind az érzékenységet növelõ, mind az I-spin keverési rész opcionális, azonban távolható csatolások meghatározásához ez utóbbi elengedhetetlenül szükséges, különben csak az egykötésen keresztüli csatolásokat tudjuk meghatározni. Mivel a t1 evolúciós idõ alatt a heteronukleáris csatolások refókuszálódnak (a 180 fokos Ipulzus miatt), ezért bevezették a t1* pszeudó evolúciós idõt, melynek közepén elhelyezett BIRDX szekvencia (5.b Ábra, bal) biztosítja a heteronukleáris csatolások fejlõdését, valamint megakadályozza a homonukleáris csatolások és kémiai eltolódások fejlõdését. Ennek eléréséhez nem csak BIRDX szekvenciát használhatunk, hanem akár 180 fokos szelektív I-pulzust is (5.b Ábra, jobb). Ez utóbbi fõleg 1H,15N méréseknél kedvezõ, hiszen a HN tartományt könnyû szelektíven gerjeszteni, és ennek szekvenciának hossza lényegesen rövidebb, mint a BIRD pulzusé. Érdemes megemlíteni még a DIPSI-2 elõtt található kompozit S-pulzust. Eredményül a 6. Ábrán látható spektrumtípust kapjuk. A csatolási állandó – A HETLOC méréshez hasonlóan - megegyezik az F2 dimenzióban található jeleltolódással, míg az F1 dimenzióban megfigyelhetõ felhasadás nagysága 1JIS·(t1*/t1). Ez utóbbiból következik, hogy tetszés szerint (de természetesen a T2 relaxáció figyelembevételével) tudjuk változtatni a felhasadás mértékét F1-ben, ami erõsen átfedõ jelek esetében rendkívül hasznos. A mérés számos

21

elõnye (lásd HETLOC) mellett azonban szintén szenved a DIPSI-2 mágnesezettségi átvitel hátrányaitól, nevezetesen nem alkalmas kvaterner szénatomokon és heteroatomokon keresztüli csatolási állandó mérésre.

6. Ábra: A sztrichnin HSQC-HECADE spektrumának egy jellemzõ részlete

22

4.4 GSQMBC és HSQMBC

7. Ábra: A GSQMBC pulzusprogram, a fehér és fekete téglalapok 90 és 180 fokos pulzusokat jelentenek, φ4: 0220200220020220, d2 = [4·(1JC,H)]-1, Gx: 1 ms hosszú gradiens pulzus, G1: G2: G3 = 20: 60: ±10

Marek és munkatársai 1997-ben publikálták a viszonylag rövid, ámbár meglehetõsen hatékony módszerüket távolható csatolások méréséhez, melynek a GSQMBC (Gradient-enhanced Single Quantum Multiple Bond Correlation) nevet adták.9 Amint a névbõl, valamint az 7. Ábrán lévõ pulzusprogramból is kiderül a módszer egyszeres kvantumú koherencia generálásán alapul, melyet a program elején található INEPT transzfer hoz létre. Majd a heteroatomra (pl.

13

C,

15

N)

átkerült mágnesezettség a t1 evolúciós idõ alatt az X mag kémiai eltolódásával modulálva lesz. Ezt követõen egy 180 fokos, X magra adott kompozit pulzus két oldalán található a két defázisoló gradiens. A mágnesezettség protonra történõ visszavitele után az akvizíció alatt (t2) fejlõdnek a heteronukleáris csatolások, valamint itt történik a dekódóló gradiens adása is. A szükséges gradiensnagyságot különbözõ magokra az 1. egyenlet segítségével számolhatjuk. A dekódoló gradienst alternálva adjuk, hogy fázisérzékeny adatokat nyerjünk, melyet a szokásos echo/antiecho protokoll szerint dolgozunk fel.

G2-G1=(γΗ/γX)·G3 1. Egyenlet: Gradiens erõsségek összefüggése GSQMBC mérésnel

23

8. Ábra: A sztrichnin GSQMBC spektruma;4 a csatolási állandót az egyes keresztcsúcsok kétféle fázisolásából (lásd a szöveget) származó υa és υd értékekbõl számíthatjuk a 2.Egyenlet segítségével

A mérés eredményeképpen egy, a HMBC-vel analóg spektrumot kapunk (8. Ábra), mely keresztcsúcsainak szerkezete tartalmazza a megfelelõ csatolási állandót. Ennek meghatározása történhet közvetlen leolvasással is abban az esetben, ha proton jelünk multiplicitása kicsi. Ugyanis a keresztcsúcsnak a heteroatom sorában kivágott szeletének jelformáját úgy 24

modellezhetjük, hogy a proton jelet eltoljuk a csatolási állandóval, majd invertáljuk és hozzáadjuk az eredeti jelhez. Ennek megfelelõen egy szingulett jelbõl egy antifázisú dublett keletkezik, melynek két ága közt mért távolság megegyezik a csatolási állandóval. A jelforma természetesen annál inkább bonyolódik, minél nagyobb a proton multiplicitása és minél közelebb van a heteronukleáris csatolási állandó értéke a homonukleáris csatolásokéhoz. További problémát jelentenek a kis csatolások meghatározása, ugyanis ha a csatolás nagysága összemérhetõ a jel szélességével, akkor közvetlen leolvasáskor túlbecsüljük a csatolási állandó értékét. Hasonló probléma kiküszöbölésére Prestegard és Kim 1989-ben egy külön eljárást javasolt.10 Ehhez szükségünk van két csatolási állandóra, melyek egyikét (υa) a jel legabszorptívabb formájából, míg a másikat (υd) az ettõl 90 fokkal fáziseltolt jelbõl olvassuk le. Az így kapott értékekbõl a 2. Egyenlet segítségével kapjuk meg a valódi csatolási állandót.

3 3  81 9 21 1 υ8 9 J 6 − υa2 J 4 +  υ a4 − υ a2υ d2 − υ d4  J 2 + υ a6 − υa4υ d2 − υ a2υd4 − υ d6 + d 2 = 0 2 4  64 16 32 16 64υ a 4 2. Egyenlet: csatolási állandó (J) meghatározása υa és υd felhasználásával.

Amint láthatjuk a GSQMBC egy nagyon hatékony mérési módszer, melynek egyik legfõbb elõnye, hogy képesek vagyunk vele kvaterner szénatomon és heteroatomon keresztül is csatolási állandókat mérni. Megfelelõen nagy érzékenységgel rendelkezik ahhoz, hogy akár kis érzékenységû magokról (pl.

13

C,

15

N) viszonylag rövid idõ alatt csatolásokat határozzunk meg

abban az esetben is, ha a minta ezeket a magokat csupán a természetben elõforduló

25

9. Ábra: A HSQMBC pulzusprogram, a fehér és fekete téglalapok 90 és 180 fokos pulzusokat jelentenek, a szürke téglalap egy 2 ms hosszú trim pulzust jelöl, φ1: 0202, φ2: 0022, φ3: 00002222, φ4: 02022020, d2 = [4·(1JC,H)], δ = effektív gradiens hossz, Gx: 1 ms hosszú gradiens pulzus, G1: G2: G3 = 80: 10: ±20

1

gyakorisággal tartalmazza. Legfõbb hátrányaként talán a csatolási állandók komplikált meghatározási módszerét kell megemlítenünk, mely a csatolásban résztvevõ proton multiplicitásának növekedésével arányosan növekszik.

26

10. Ábra: A sztrichnin HSQMBC spektruma;4 a g és k mért jelformákat a d és h mért referencia jelek segítségé-vel szimuláljuk az invertált és eltolt formáikkal (e és i) történõ öszeadással (f és j); az eltolás értéke a heteronukleáris csatolási állandóval egyenlõ

Ehhez a módszerhez szervesen kapcsolódik a HSQMBC (Heteronucelar Single Quantum Multile Bond Correlation) mérési módszer is,11 amely tulajdonképpen a GSQMBC egy finomított

27

változatának tekinthetõ. A pulzusprogramot megfigyelve (9. Ábra) tapasztalhatjuk, hogy egy GBIRDR,X szekvencia került az INEPT részbe, mely amellett, hogy eltávolítja az egykötésen keresztüli korrelációkat, növeli a módszer érzékenységét. Ugyanis hatékonyan lecsatolja a távoli protonokat az INEPT preparáció alatt, melynek hatására egyrészt nõ hasznos jel nagysága, másrészt egységesebb fázist biztosít. A továbbiakban egy 2 ms hosszú trim-pulzust is találunk, mely a nem kívánt mágnesezettség defázisolását, valamint a vízjel elnyomását segíti. Mindezek mellett a pulzusszekvencia egy gradiens z,z-szûrõvel egészült ki, amely a mágnesezettség protonokra történõ visszavitele elõtt kapott helyet, mely a jelalak diszperzív hozzájárulását okozó mágnesezettséget szünteti meg. A fentebb ismertetett módosításoknak köszönhetõen az alapelgondolás egy megnövekedett érzékenységgel valósul meg. A feldolgozási módot, valamint magát a spektrumot a 10. Ábrán láthatjuk.9 Referencia jelnek legjobban az egykötésen keresztüli keresztcsúcs használható, hiszen a keresztcsúcs több mint 100 Hz-es 1J(C,H) csatolással elválasztott két részének metszete csak a homonukleáris csatolásokat tartalmazza (10. Ábra d és h). Az elõnyök és hátrányok a GSQMBCnél ismertetettekkel azonosak, így itt nem kívánok kitérni ezekre ismét.

4.5 J-HMBC-1 és J-HMBC-2

Furihata és Seto 1999-ben közölték legújabb módszerüket, a csatolási állandó skálázott HMBC-t,12 amely azon túlmenõen, hogy számos, a csatolási állandók meghatározásakor felmerülõ problémát elkerül, viszonylag egyszerû pulzusszekvenciával rendelkezik. Ha megfigyelünk egy rutin HMBC módszert, tapasztalni fogjuk, hogy a heteronukleáris csatolási állandók csupán a kémiai eltolódás kifejlõdése alatt vannak lecsatolva (a t1 idõ felénél lévõ 180 fokos proton pulzussal). Az elsõ két 90 fokos szénpulzus között szabadon fejlõdhetnek a csatolási állandók, mely idõ hosszával a HMBC mérésünket optimalizálhatjuk különbözõ nagyságú csatolásokra. Ennek eredményeképpen az összes keresztcsúcs tartalmazza a megfelelõ heteronukleáris csatolási állandót az indirekt dimenzióban. Természetesen ezek mérése, a meglehetõsen kicsi digitális felbontás miatt, gyakorlatilag lehetetlen. Furihata és Seto azonban itt alkalmazta az ún. J-scaling módszert, azaz egy megfelelõ szekvenciával olyan növelte a csatolási állandókat, amely már mérhetõ az F1 dimenzió felbon-

28

nagyságúra

11. Ábra: A J-HMBC-1 pulzusprogram, a fehér és fekete téglalapok 90 és 180 fokos pulzusokat jelentenek, φ1: 0202, φ2: 0022 , φ3: 0220, ∆1 = [2·(1JC,H)]-1, n: skálafaktor, Gx: 1 ms hosszú gradiens pulzus, G1: G2: G3 = 50: 30: 40.1.

29

12. Ábra: A sztrichnin J-HMBC-1 spektruma

tása mellett is. Természetesen „növelte” szó nem a tényleges állandók megváltozását jelenti, csupán azoknak a spektrumban megjelenõ nagyságát változtatja. A J-HMBC-1 szekvenciát tekinthetjük a módszer alapjának,12 mivel csak a csatolási állandó növeléséhez szükséges plussz pulzusokat tartalmazza. Ez pedig nem más, mint az 11. Ábrán látható n·t1 idõintervallum, melynek közepén 180 fokos proton és 180 fokos szén (vagy az X magra adott) pulzus található. Az indirekt dimenzió kémiai eltolódása csak t1 idõ alattfejlõdik, mivel n·t1 alatt lecsatolódik. A proton-proton csatolások fejlõdését nem tudjuk lecsatolni, így ezek fejlõdése (n+1)·t1 idõ alatt történik, míg a heteronukleáris csatolási állandók fejlõdésére n·t1 idõ áll rendelkezésre, mivel ezek t1 alatt lecsatolódnak. Ennek eredményeképpen a keresztcsúcsok F1 dimenzióban egyrészt tartalmazzák a (n+1)-szeres nagyságúra növelt proton-proton csatolásokat, másrészt az n-szeres nagyságúra növelt heteronukleáris csatolást. Amint a sztrichnin példáján láthatjuk (12. Ábra) ez nagyobb multiplicitású proton jelek korrelációinál meglehetõsen bonyolult keresztcsúcsokat

eredményez,

mely

megnehezíti

a

heteronukleáris

csatolási

állandó

meghatározását. Ennek kiküszöbölésére a szerzõk rögtön meg is találták a megoldást a J-HMBC2 formájában (13. Ábra).12

13.Ábra: A J-HMBC-2 pulzusprogram, a fehér és fekete téglalapok 90 és 180 fokos pulzusokat jelentenek, φ1: 0202, φ2: 0022 , φ3: 0220, ∆1 = [2·(1JC,H)]-1, ∆2 = (n+1)·t1max, n: skálatfaktor, m = n+1, Gx: 1 ms hosszú gradiens pulzus, G1: G2: G3 = 50: 30: 40.1.

30

Mivel a proton-proton csatolásokat csak úgy tudjuk az F1 dimenzióban lecsatolni, ha a azok kifejlõdését függetlenné tesszük t1-tõl, ezért egy újabb 180 fokos pulzus bevezetésével elérték azt, hogy a teljes pulzusszekvencia mindig ugyanolyan hosszú, függetlenül attól, hogy éppen hányadik sort vesszük fel a HMBC-bõl. Amint a 13. Ábrán láthatjuk, az újonnan bekerült 180 fokos proton pulzus egy ∆2-m·t1 idõ közepére került, ahol a ∆2 jelenti az imént említett szekvenciahosszt. Mivel ez egy konstans idõ minden egyes t1 esetében, ezért a módszert konstans idejû J-HMBCnek is szokás nevezni. Mivel t1 kezdeti értéke nagyon kicsi (rendszerint 3 µs), ezért kezdetben a ∆2-m·t1 gyakorlatilag ∆2-vel egyenlõ. Majd a t1 növelésével az n·t1 tag lesz a leghosszabb, míg a ∆2-m·t1 lecsökken. Ideális esetben ∆2-m·t1 nullára csökken, mivel ekkor lesz a lehetõ legkisebb ∆2, ami rendkívül fontos egyrészt az érzékenység, másrészt a T2 relaxáció miatt is. Ennek teljesüléséhez az m = n+1 összefüggés szerint kell beállítanunk a mérést, azaz ∆2 = (n+1)·t1max , ahol t1max az utolsó mérési sorhoz tarozó inkrementum, melyet in0·td1 kifejezéssel adhatunk meg.

31

14. Ábra: A sztrichnin J-HMBC-2 spektruma

A sztrichnin J-HMBC-2 módszerrel felvett spektrumát a 14. Ábrán szemléltetem. Jól látható, hogy

a

proton-proton

csatolások

lecsatolásával

lényegesen

egyszerûbb

szerkezetû

keresztcsúcsokat kapunk. A felskálázott csatolási állandót a keresztcsúcsnak F1 dimenziójú szeletébõl határozhatjuk meg úgy, hogy leolvassuk a dublett két csúcsának távolságát. Ezek után az n ismeretében a valódi csatolási állandó egy egyszerû osztással számolható. A módszer számos elõnnyel bír. Egyrészt a HMBC alapszekvenciának köszönhetõen lehetõség van kvaterner szénen, és heteroatomon keresztüli mérésre, másrészt a széles tartományban változó kifejlõdési idõnek köszönhetõen nem kell egyetlen csatolási állandóra optimálnunk a mérést, valamint a csatolási állandó meghatározása rendkívül egyszerû, nem igényeli a spektrum semmiféle utófeldolgozását. Már sok szó esett az n faktorról, ami megadja, hogy hányszorosára növeljük a csatolási állandót a mérés során, azonban ennek nagyságát még nem diszkutáltuk. A J-scaling módszerek esetében vissza kell nyúlnunk egy rendkívül alapvetõ egyenlethez, mely Nyquist nevéhez fûzõdik és azt adja meg, hogy egy frekvencia megfelelõen pontos méréséhez mekkora mintavételezési idõre van szükség. Ezt alkalmazva azt tapasztaljuk, hogy az n·t1max –nak nagyobban kell lennie, mint 1/

n

J. Azaz ha a 2 Hz-es csatolási állandókat is megfelelõ pontossággal akarjuk

meghatározni, akkor n·t1max-nak legalább 500 msec-nak kell lennie. Mivel t1max értéke egy rutin HMBC mérésnél a 20-30 msec tartományba esik, ezért n = 20-30 értékeket adhatunk anélkül, hogy a pulzusszekvencia hossza a T2 relaxáció tartományába essen. Ez az érték természetesen minden molekulára más és más, de kis és közepes nagyságú vegyületesetében a 600-700 msec-os tartományt általánosan elfogadottnak tekinthetjük. A J-HMBC alapú mérések (lásd a továbbfejlesztett módszereket is) esetében számos dologra kell ügyelnünk a beállítások tekintetében. Alapvetõ érdekünk, hogy az n paraméter, valamint az F1 dimenzió felbontása a lehetõ legnagyobb legyen, mivel ekkor tudunk kis csatolásokat is megfelelõ pontossággal mérni. Mindkét paraméter nagyban függ a t1max értékétõl, amit a korábbiakban megadott in0·td1 összefüggés ad meg, ahol in0 az az érték, amivel a t1-et inkrementáljuk sorról-sorra, td1 pedig nem más, mint az inkrementált sorok száma (F1-ben). Mivel in0 értéke a spektrális szélességtõl, valamint a módszertõl (nd0) függ, ezért itt csak td1-et tudjuk változtatni. Tehát a következõ egyenletek állnak rendelkezésünkre: ∆2 = (n+1)·t1max, t1max = 32

in0·td1, valamint tudjuk, hogy ∆2 = 600-700 msec. Ezekbõl azt a következtetést vonhatjuk le, hogy hiába növeljük meg jelentõsen az alkalmazott sorok számát (td1), ezzel nem nyerünk sok mindent, hiszen ekkor kisebb n tényezõt kell alkalmaznunk, hogy elkerüljük ∆2 túlzott megnövekedését. Úgy is fogalmazhatnánk, hogy amit nyerünk a réven, elvesztjük a vámon. Ebbõl kifolyólag a módszer maga rendelkezik egy bizonyos korláttal, ami a csatolási állandók mérésének alsó határát jelenti, mely a 1-1,5 Hz-es tartományban realizálódik. Egy másik típusú hátrányt jelent a viszonylag nagyszámú 180 fokos pulzus, melybõl eredõen érzékenységveszteség léphet fel. Ezt egyrészt kompozit pulzusok alkalmazásával, másrész további, J-HMBC alapú technikák kifejlesztésével küszöbölték ki.

4.6 Broadband J-HMBC

A J-HMBC sikereire alapozva jelentette meg Meissner és Sørensen 2001. elején saját verziójukat, melynek a Broadband (szélessávú) J-HMBC nevet adták.13 A pulzusprogram, amellett, hogy eggyel kevesebb 180 fokos pulzust tartalmaz, mint a J-HMBC-2, egy hatékony low-pass J-szûrõvel, valamint echo/anti-echo gradiens szelekcióval is rendelkezik. Ezáltal nagyobb érzékenységre tehetünk szert.

15. Ábra: A brodband J-HMBC pulzusprogram, a fehér és fekete téglalapok 90 és 180 fokos pulzusokat jelentenek, φ1: 0202, φ2: 0022, φ3: 0220, ∆11, ∆12, ∆13: az LPJF-ben használt idõk (lásd a szöveget), δ = effektív gradiens hossz, Gx: 1 ms hosszú gradiens pulzus, G1: G2: G3: G4: G5: G6 = 28: -16: -8: -4: 50/-30: -30/50, tA = ½·[∆-Σ∆1i+t1max-t1-2δ], tB = = ½·[∆+t1max-(1+n)·t1], tC = = ½·[n·t1+Σ∆1i+2δ].

33

Amint azt a 15. Ábrán láthatjuk a pulzusprogram egy harmadrendû low-pass szûrõvel rendelkezik, mely az egykötésen keresztüli csatolásokat hivatott hatékonyan kiszûrni, ugyanis ezek ugyanúgy felskálázódnak a mérés folyamán, ezzel zsúfoltabbá téve a spektrumot. Ez a szûrõ egy teljesen különálló részként kezelendõ, hiszen az egykötésen keresztüli csatolások kiszûrésén kívül semmilyen más hatással nem rendelkezik, melyet jól mutat az is, hogy az alkalmazott gradiensek összege zérus. Azt már itt meg szeretném jegyezni, hogy általános esetben nem szükséges a harmadrendû szûrõ alkalmazása, mivel egy másodrendû szûrõ is megfelelõen hatékony. Magasabbrendû szûrõk alkalmazása csak extrém esetekben ajánlott, hiszen ez is növeli a pulzusszekvencia hosszát. Egy n-ed rendû szûrõ esetében 1 darab proton és n darab 90 fokos szénpulzus alkalmazandó, melyek között így n darab várakozási idõt kell optimálnunk. Ezek hossza a kívánt szûrési tartománytól (Jmax - Jmin) függ, pl. elsõrendû szûrõ esetén: τ1 = (Jmax-Jmin)1

, másodrendû szûrõnél: τ1 = ½·[Jmin+0,146·(Jmax-Jmin)]-1; τ2 = ½·[Jmax-0,146·(Jmax-Jmin)]-1; míg

harmadrendû szûrõnél: τ1 = ½·[Jmin-0,07·(Jmax-Jmin)]-1; τ2 = (Jmax+Jmin)]-1; τ3 = ½·[Jmax-0,07·(JmaxJmin)]-1. Az elsõ szénpulzus elõtt, illetve az n darab szénpulzus után összesen tehát n+1 darab gradienst kell adni, melyek sorrendben úgy aránylanak egymáshoz, mint 2n-1, 2n-1, 2n-2, …, 1. A fent ismertetett szabályszerûségek ismeretében tetszõleges mérési módszerhez készíthetünk lowpass szûrõt, ezáltal megszabadítva spektrumunkat a nem kívánt korrelációk megjelenésétõl.

34

16. Ábra: A sztrichnin broadband J-HMBC spektruma

Magában a pulzusprogramban az eddigi három darab 180 fokos pulzus helyett csupán kettõ kapott helyet. Ezt az elõnyt annak rovására élvezhetjük, hogy a konstans pulzushosszért felelõs várakozási idõk (tA, tB és tC) mindegyike más-más módon függ t1-tõl. Hatásuk teljesen megegyezik a J-HMBC-2 résznél leírtakkal, így erre külön itt nem térek ki. Ami viszont külön említésre méltó, az a gradiens szelekció megváltozása, mivel itt egy antiszimmetrikus echo/antiecho szelekcióval találkozunk, amely

13

C és 1H esetében +5/-3 és –3/+5 arányú gradienseket

jelent echo és anti-echo esetekben. Ennek gyakorlati megvalósítása külön problémát jelent, melyhez gradiens fájlokat használtam. Az EA módszer kb. kétszeresére növeli az érzékenységet, amint azt a 16. Ábrán látható spektrum jól példáz, ha összehasonlítjuk a J-HMBC-2 módszerrel felvett spektrummal (14. Ábra).

35

4.7 J-IMPEACH-MBC

Williamson és munkatársai szintén 2001. elején ismertették a J-HMBC-2 szekvenciára alapuló módszerüket, a J-IMPEACH-MBC programot (17. Ábra).14 Ez még kevesebb 180 fokos pulzust tartalmaz, mint az elõbbiekben bemutatott broadband J-HMBC pulzusprogram. A JIMPEACH-MBC a Hadden és munkatársainak 1999-ben publikált IMPEACH-MBC programján alapul,15 azzal a különbséggel, hogy eltávolították a t2-t megelõzõ refókuszáló tagot, valamint a J-scaling technikának megfelelõen módosult a program közepe.

17. Ábra: A J-IMPEACH-MBC pulzusprogram, a fehér és fekete téglalapok 90 és 180 fokos pulzusokat jelentenek, φ1: 0202, φ2: 0022, φ3: 0220, ∆11, ∆12: az LPJF-ben használt idõk (lásd a szöveget a broadband J-HMBC résznél), δ = effektív gradiens hossz, Gx: 1 ms hosszú gradiens pulzus, G1: G2: G3: G4: G5: G6: G7: G8 = 28: -18.5: -9.5: 4: -4: 50: 30: 40.1

A módszer nagy elõnyét a csupán egyetlen 180 fokos pulzust használó konstans idejû rész jelenti, amelyet a szemléletesség kedvéért két részre oszthatunk. Az elsõ részben, melynek közepén a 180 fokos, heteroatomra adott pulzus található, a heteronukleáris csatolási állandók nem fejlõdnek, mivel a 180 fokos pulzus lecsatolja õket. Ennek a résznek a szerepe mindössze annyi, hogy a második rész (n·t1), ahol a heteronukleáris csatolási állandók fejlõdnek, soronkénti

36

növekedését kompenzálja. Ezáltal a másodrendû low-pass szûrõ és a szokásosnak mondható kémiai eltolódás kifejlõdéséért felelõs rész közötti idõ állandó, azaz az itt kifejlõdõ homonukleáris csatolások nincsenek hatással az F1 dimenzióban kialakuló jelformára. Viszont a kémiai eltolódás fejlõdése mellett t1 idõtartományban a homonukleáris csatolások is fejlõdnek, míg a heteronukleáris csatolásokat lecsatolja a 180 fokos proton pulzus. Ennek eredményeképpen látszólag egy olyan spektrumot kapunk (18. Ábra), mint amilyet a J-HMBC-2 (14. Ábra), vagy a broadband J-HMBC (16. Ábra) módszerek is nyújtanak, azonban az F1 dimenzióban megjelenõ dublettek az adott homonukleáris csatolás-

18. Ábra: A sztrichnin J-IMPEACH-MBC spektruma

-nak megfelelõen kiszélesednek. Ez elméletileg rontja a csatolási állandók meghatározásának pontosságát, azonban, ha figyelembe vesszük, hogy a felskálázott (akár 100-300 Hz nagyságú)

37

csatolások mellett a vicinális homonukleáris csatolások 0-9 Hz-es értéke jószerivel elhanyagolható, úgy azt mondhatjuk, hogy a módszer hatékonyságát ez csupán kis mértékben csökkenti.

4.8 J-HMQC

19. Ábra: A J-HMQC pulzusprogram, a fehér és fekete téglalapok 90 és 180 fokos pulzusokat jelentenek, a szaggatottal jelölt 180 fokos pulzus elhagyható (lásd a szöveget), φ1: 0202, φ2: 0022, φ3: 0220, ∆1 = [2·(1JC,H)]-1, Gx: 1 ms hosszú gradiens pulzus, G1: G2: G3 = 50: 30: 40,1.

Furihata és Seto a J-HMBC szekvencia kifejlesztése után két évvel közölte a módszer teljesen analóg alkalmazását a HMQC pulzusszekvenciára.16 Ez felhasználását tekintve kicsit kilóg eme fejzetbõl, de mindenképpen ideillik, mint a J-skálázásos módszerek egyik képviselõje. Amint a 19. Ábrán láthatjuk a csatolások skálázásáért felelõs rész ezúttal a pulzusprogram végén kapott helyet. Mivel egyszerre két 180 fokos pulzust alkalmazunk a proton és az X csatornán, ezért a pulzusprogram ezen részében mind a homonukleáris, mind a heteronukleáris csatolások fejlõdhetnek. Összességében a következõket állapíthatjuk meg. A kémiai eltolódás csak t1 idõ alatt, a heteronukleáris csatolások n·t1 idõ alatt, míg a homonukleáris csatolások n·t1+t1 = (n+1)·t1 idõ alatt fejlõdnek. Mivel a ∆1 idõ az egykötésen keresztüli csatolásokra van optimálva, ∆1 = (2·1JX,H)-1, ezért a heteronukleáris csatolások közül csupán az egykötésen keresztüli csatolások fognak megjelenni. Ha az ábrán szaggatott vonallal jelzett 180 fokos, heteroatomra adott pulzust eltávolítjuk, úgy F1 dimenzióban kvázi 38

20. Ábra: A sztrichnin JCH-HMQC spektruma

39

21. Ábra: A sztrichnin JHH-HMQC spektruma

lecsatoljuk a heteronukleáris csatolásokat. A szerzõk a két esetet sorrendben JCH- és JHH-HMBCnek nevez-ték el. A két módszer eredményét összehasonlíthatjuk a 20. és 21. Ábrák összevetésével, mely a sztrichninbõl készített JCH- és JHH-HMBC spektrumok azonos részletét tartlamazza. Amint látható,

a

JCH-HMQC

esetében

az

egykötésen

keresztüli

csatolások

felskálázása

(1J(C,H)·skálafaktor) miatt a keresztcsúcsok két, a felskálázott homonukleáris csatolásokat tartalmazó része jól elkülönül az F1 dimenzióban (több ezer Hz-el). Ez a jelek szeparálását segíti elõ abban az esetben, ha a JHH-HMBC spektrum túl zsúfolt lenne. Ez utóbbiban, a fent leírtaknak megfelelõen, ugyanis F1 dimenzióban csak a felskálázott homonukleáris csatolásokat, míg F2 dimenzióban az 1J(C,H) csatolást találjuk. A módszerek gyakorlati felhasználása közül a legfontosabb, hogy olyan esetekben, amikor két csatoló proton kémiai eltolódás-különbsége a csatolással összemérhetõ, azaz egy rutin spektrumból (pl. proton, HMQC) a csatolási kép magasabbrendû volta miatt nem tudjuk meghatározni a proton-proton csatolási állandót, akkor a J-HMQC módszereket alkalmazva könnyedén hozzájuthatunk a kívánt csatolásokhoz. Mivel ekkor a csatolódó jelek a skálázás következtében eltávolodnak egymástól, ezzel hasonló eredményt adva, mint a szintén nemrégiben közölt

13

C szatellit módszer.17 Magasabbrendû spektrumokkal számos esetben találkozunk, pl.

kettõs kötések geometriai konfigurációjának meghatározásakor, vagy zsúfolt protonspektrumú, nagy móltömegû vegyületeknél. Ez utóbbiaknál különösen fontos a proton-proton csatolások biztos

meghatározása,

hiszen

a

számítógéppel

történõ

szerkezetfinomításhoz

ezek

elengedhetetlen paraméterek.

4.9 Összefoglalás

A

fejezet

összefoglalásaként

összegezném

a

mérési

módszerekkel

kapcsolatos

észrevételeimet: a) felhasználás szempontjából: A gs-HETLOC, HSQC-TOCSY és HSQC-HECADE mérések éppen a módszerek nagy elõnyt jelentõ TOCSY típusú mágnesezettségi átvitel miatt szenvedik el a legnagyobb hátrányukat, legalábbis a felhasználásuk szemszögébõl. Ugyanis olyan esetekben, 40

amikor a csatolási állandó szempontjából kérdéses magok között heteroatom, vagy kvaterner szénatom található, a módszer nem alkalmazható. Ezzel szemben a GSQMBC, HSQMBC, valamint a J-HMBC módszerek esetében ez nem probléma, mivel ezekben az esetekben HMBC jellegû spektrumokat kapunk. b) érzékenység szempontjából: Az itt bemutatott módszerek minden esetben gradiens szelekciót, valamint inverz detektálást alkalmaznak, így jelentõs különbséget nem tapasztalunk érzékenység szempontjából. A kisebb eltéréseket elsõsorban a hosszabb pulzusoknál, illetve az echo/anti-echo (röviden EA) gradiens szelekciót használó szekvenciák esetében találunk. Így a konstans idejû pulzushosszt megvalósító J-HMBC módszerek mindenképpen gyengébb teljesítõképességûek, melyek esetében a broadband J-HMBC EA szelekciója részben kompenzálja ezt a hátrányt. c) csatolások meghatározása szempontjából: Ezen a területen egyértelmûen azok a módszerek „vezetnek”, amelyek spektrumából a csatolási állandó egyszerûen, további szerkesztések nélkül megkaphatók. Így a HETLOC, HSQC-HECADE, J-HMBC-2, broadband J-HMBC, JIMPEACH-MBC, J-HMQC módszerek elõnyt élveznek. Ebbõl a szempontból a GSQMBC, HSQMBC és a HSQC-TOCSY sem szenved nagy hátrányt, hiszen ezeknél a méréseknél csak akkor találkozunk bonyolultabb kiértékeléssel, ha a vizsgált proton multiplicitása nagyobb (triplett, kvartett, stb.). d) a mért csatolási állandó pontossága szempontjából: Ebbõl a szempontból elsõ helyen mindenképpen a HETLOC és HSQC-HECADE módszerek állnak, hiszen itt még abban az esetben is 0.1 Hz pontossággal tudunk mérni, amikor a csatolási állandó nagysága összemérhetõ a proton jel félérték-szélességével. Hasonló pontosságot érhetünk el a GSQMBC, a HSQMBC és a HSQC-TOCSY módszerekkel is, azonban ebben az esetben a szükséges számítások, illetve jelszimulálás a csatolási állandó mérésének rovására mehet. Az eddig említett módszerekkel a minimális, pontosan meghatározható csatolási állandó kb. 0.5 Hz. A J-HMBC módszerek esetében a pontosság valamivel gyengébb, 0.2 Hz körüli, valamint a mérés alsó határa is kb. 1 Hz-re módosul.

Amint látható, az egyes mérések közül mindig azt kell kiválasztanunk, ami az adott célra leginkább megfelel, mivel számos korláttal találkozunk az egyes esetekben. Általánosságban azonban mindenképpen az érzékenyebb J-HMBC módszerek (broadband J-HMBC és J-

41

IMPEACH-MBC) azok, amiket akár a napi rutinméréseknél is alkalmazhatunk. Ezek a módszerek gyorsak, nagy hatékonyságúak és kiértékelésük is egyszerû, valamint megvan az a nagy elõnyük, hogy a csatolásban résztvevõ atomok közötti heteroatomok, illetve hidrogénnel nem rendelkezõ atomok nem akadályozzák meg a csatolási állandó mérését. Éppen ez az oka, hogy, az egyébként nagyon jó tulajdonságokkal rendelkezõ, HETLOC-alapú módszerek felhasználása nem terjedt el jelentõsen.

4.10 Irodalomjegyzék

[1] Karplus M. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85: 2870. [2] Kurz M, Schmieder P, Kessler H. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1991, 30: 1329. [3] Uhrin D, Batta Gy, Hruby VJ, Barlow PN, Kövér KE. J. Magn. Reson. 1998, 130: 155. [4] Marquez BL, Gerwick WH, Williamson RT. Magn. Reson. Chem. 2001, 39: 499. [5] Kövér KE, Hruby VJ, Uhrin D. J. Magn. Reson. 1997, 129:125. [6] Kay LE, Keifer T, Saaerinen T. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114: 10663. [7] Kozminski W, Nanz D. J. Magn. Reson. 2000, 142: 294. [8] Palmer AG III, Cavanagh J, Wright PE, Rance M. J. Magn. Reson. 1991, 93: 151. [9] Marek R, Kralik L, Sklenaø V. Tetrahedron Lett. 1997, 38: 665. [10] Prestegard JH, Kim Y. J. Magn. Reson. 1989, 84: 9. [11] Wu M, Okino T, Nogel LM, Marquez BL, Williamson RT, Sitachitta N, Berman FW, Murray TF, McGough K, Jacobs R, Colsen K, Asano T, Yokokawa F, Shioiri T, Gerwick WH. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122: 12041. [12] Furihata K, Seto H. Tetrahedron Lett. 1999, 40: 6271. [13] Meissner A. Sørensen OW. Magn. Reson. Chem. 2001, 39: 49. [14] Williamson RT, Marquez BL, Gerwick WH, Martin GE, Krishnamurthy VV. Magn. Reson. Chem. 2001, 39: 127. [15] Hadden CE, Martin GE, Krishnamurthy VV. J. Magn. Reson. 1999, 140: 274. [16] Furihata K, Seto H. Tetrahedron Lett. 2001, 42: 859. [17] Williamson RT, Carney JR, Gerwick WH. J. Nat. Prod. 2000, 63: 876.

42

5. Szteroid-glikozidok szerkezetvizsgálata 5.1 Bevezetés

A szteroidok tetraciklikus vázrendszerrel rendelkeznek, melyhez két anguláris metil-csoport kapcsolódik (18-as és 19-es helyzetben). A természetes vegyületek körében kiemelkedõ fontossággal bírnak. Biológiai szempontból vitaminhatás, hormonszerû viselkedés, gyulladást csökkentõ készség, anyagcserére gyakorolt hatás egyaránt megfigyelhetõ. Nemcsak biológiai szempontból érdekes ez a vegyületcsalád, hanem az ipar, elsõsorban a gyógyszeripar szempontjából is.

O 21 18

19

11

C

13 14

HO

O

23 22

Me O OH

20

OH

O

17

6-dezoxi-β-D-allopiranozil-

D

1 3

A

10 5

B

8

OH

OH

HO

R

HO 1

R

Glu(1-4)6-dezoxi-allozil

O OH

2 Glu(1-2)Glu

O

Glu: β-D-glükopiranozil-

1. Ábra: Az 1 és 2 vegyületek szerkezete

A természetes eredetû szteránvázas vegyületeket egyik csoportja a szívre ható szteroidglikozidok, melyek a gyógyászatban már régóta használt anyagok, mivel a szívizom összehúzódásának erõsségét fokozzák. Ilyen anyag a digitoxigenin és a strophantin is, melyek a leggyakrabban alkalmazott szívgyógyszerek közé tartoznak. A szteroidok ezen fajtájának közös jellemzõje, hogy valamilyen egyszerû, vagy összetett cukorral alkotott glikozidjaik formájában jelennek meg. Azok a növények, melyek az emberi szívre ható glikoszteroidokat termelik, régóta

43

ismert fajok: Digitalis prupuera, Digitalis lanata, Scilla maritima, Strophathus kome, Acokanthera spectabilis, Calotropis procera, stb. Megjegyezendõ, hogy a szívre ható glikozidokhoz hasonló szerkezetû bufotoxinok nem növényi eredetû hatóanyagok, hanem varangymérgek, a varangyok váladékának alkotórészei. Az általam vizsgált vegyületeket (1 és 2) a Calotropis Procera vegetatív részeibõl izolálták M. Hani A. Elgamal és munkatársai (National Research Center, Kairó). A Calotropis Procera vadon nõ az egyiptomi sivatagban, de elõfordul Ázsiában és Afrika más részein is. Az arabok már az ókor óta használják galenikumként1 a népi gyógyászatban, illetve nyílméregként2. A növény tejébõl Hesse3 és munkatársai több szívglikozidot, kalotropint, kalaktint, usaridint, usarin calotoxint és vorusarint izoláltak. Míg a növény magja frugozidot, koroglaucigenint és krotoxigenint tartalmazott.4 Más szerzõk procerozidot, uzarigenint, sziriogenint, proceragenint,4,5 valamint szterolokat és triterpéneket mutattak ki.6 A szteroidok kémiai szerkezete sok esetben csak a gyûrûkapcsolatok cisz, vagy transz jellegében, továbbá egy-két funkciós csoport α, vagy β térhelyzetében tér el egymástól. A viszonylag csekély különbözõségük ellenére mégis drámai funkcionális eltérések jelentkezhetnek biológiai hatásmechanizmusukban. Éppen ezért, a biológiai tulajdonságok szerkezettõl való erõs függése miatt a megbízható, nagy pontosságú szerkezet-vizsgálat alapfeltétele a szteroid kutatásnak. Egy ilyen vizsgálat részleteit mutatom be ebben a fejezetben.

5.2 Extrakció és izoláció

A Calotropis Procera vegetatív részeit a Sínai-félszigeti Elarich-ban gyûjtötték 1996. májusában, melyet Dr. M. El-Gibaly azonosított. A növény egy példánya bizonyítékként a kairói Központi Kutatóintézet herbáriumába került. Az extrakciót és izolációt egyiptomi kooperációs partnereink végezték a National Research Centre, Laboratory of Natural Products kairói intézetében. Ezen munka részletei a témakört ismertetõ publikációban (lásd melléklet) találhatóak.

44

5.3 Jelhozzárendelés

Az NMR módszerekkel történõ szerkezet-felderítés alapját képezõ jelhozzárendelést az 1 vegyületen mutatom be részletesen. A vegyületbõl csak 2 mg állt rendelkezésemre, valamint a vizsgálat idõpontjában csoportunk még nem rendelkezett Shigemi mérõcsövekkel (lásd 3. Fejezet), ami a jelen vizsgálatokat tovább nehezítette. A szerkezet meghatározásához az olvadáspontok, valamint a tématerületen eddig szerzett tapasztalataim alapján7 az 1. Ábrán látható aglikon alapszerkezetet feltételeztem, melyen csupán az egyes szubsztituensek minõsége és helye volt kérdéses. A 2 vegyület hozzárendelése analóg módon történt. A folyamat nyomon követéséhez az 1. és 2. Táblázat nyújt segítséget, melyben megadtam a 1H és

13

C kémiai

eltolódásokat, valamint a karakterisztikus HMBC és ROESY korrelációkat. A jelhozzárendelést a HSQC spektrum feldolgozásával kezdtem. A spektrumból a közvetlenül kapcsolódó 1H és

13

C atomokat lehet meghatározni. Így nem csak az egyes

13

C

jelekhez tartozó 1H jeleket tudjuk meghatározni, hanem a protonok számából következtethetünk arra is, hogy az adott 13C atom milyen csoporthoz (C, CH, CH2, CH3) tartozik. A CH, illetve CH3 csoportok megkülönböztetéséhez, mivel mindkettõ esetben a

13

C jelhez egy 1H jel tartozik, a 1H

NMR spektrumot is vizsgálnunk kell, melyben a metil csoport protonjainak jelei a háromszoros intenzitás miatt jól megkülönböztethetõek. E csoportosítás után a jelhozzárendelés lényegesen egyszerûsödik, mivel pl. egy CHaHb metilén-csoport Ha atomjának jelhozzárendelésével az egész csoport jelhozzárendelését is elvégeztük. Eredményképpen megállapíthatjuk, hogy a

13

C

spektrumban detektált 35 jel közül 3 metil-csoportot, 11 CH2-csoportot, 16 CH-csoportot és 5 kvaterner szénatomhoz tartozik.

45

1

1 α β 2 α β 3 α 4 α β 5 α 6 α β 7 α β 8 β 9 α 10 11 α β 12 α β 13 14 15 α β 16 α β 17 α 18 19 20 21 a b 22 23 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 1” 2” 3” 4” 5” 6” a b

H

0.86 1.57 2.03 1.60 3.84 1.70 1.27 0.81 1.03 1.05 1.03 2.23 1.60 0.80 1.11 1.33 1.21 1.31 1.99 1.80 2.03 1.88 2.70 0.93 0.57 4.98 5.25 6.07 5.33 3.88 5.02 3.78 4.45 1.66 4.99 3.95 4.21 4.16 3.90 4.39 4.27

13

C

HMBC (13C partnerek) 2α, 3α 2α 1α, 1β, 2β 2α 1α, 2α, 4α, 1’ 3α, 5α, 4β, 1’ 4α, 19 4α, 6α 9α, 5α 7β 9α, 7β 6α, 6β, 7α, 8β 11β, 12β, 18, 19 6α,7α, 12α,

37.0 29.6 76.9 34.3

C-1’

43.9 28.6 27.5 41.2 49.4 35.7 21.0

11β, 9α 11β, 18, 19 9α, 17α 8β, 17α, 19

39.2 49.6 84.1 32.6

C-12, C-13, C-14, C-17 C-1, C-5, C-9, C-10

9α, 15β, 17α 15α 16β, 17α 16α, 21a, 21b 12α, 12β, 15α, 16α, 16β, 18, 21a, 21b, 22 8β, 11β, 12β, 17α, 21a, 21b, 22 4β, 6β, 8β, 11β

C-20 C-20 C-21, C-23

21b, 16β, 17α, 18 21a, 16β, 17α, 18 16β, 17α, 18

C-3 C-1’

3α, 4α, 2’, 5’ 1’, 3’, 4’ 2’, 4’, 5’ 2’, 3’, 6’, 1’’ 1’, 6’, 1’’ 4’, 5’, 1’’ 4’, 5’, 6’, 2’’, 3’’, 5’’ 1’’ 1’’, 5’’ 1’’ 1’’, 6’’a 5’’, 6’’b 6’’a

26.8 50.9 15.7 11.7 175.9 73.3 117.1 174.3 98.9 71.7 72.0 83.1 68.4 18.1 105.8 74.7 77.8 71.1 77.7 62.6

ROESY

C-6’ C-5’, C-4’ C-4’ C-3’’, C-1’’ C-4’’ C-3’’, C-5’’

1. Táblázat: Az 1 vegyület 1H és 13C kémia eltoldásai, valamint karakterisztikus HMBC és ROESY korrelációi piridin-d5 oldószerben

46

1

13

0.76 1.53 2.06 1.66 3.90 1.51 1.91 0.79 1.04 1.18 1.04 2.21 1.59 0.75 1.30 1.09 1.19 1.30 1.94 1.79 2.02 1.90 2.71 0.93 0.66 5.25 4.97 6.07 5.02 4.09 4.32 4.13 3.90 4.50 4.30 5.20 4.05 4.19 4.24 3.90 4.46 4.37

37.2

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 1” 2” 3” 4” 5” 6”

α β α β α α β α α β α β β α α β α β α β α β α

a b

a b

a b

C

HMBC (13C partnerek)

1β, 3α 1α, 11α, 19 2β, 3α, 4α 2α, 19 1α, 2α 2α, 4β, 6α 4α, 5α, 6β 4β 4α, 6β, 9α 4β, 6α, 7β 7β, 9α, 15α, 15β 6β, 7α, 8β 7β, 11β, 18, 19 6α, 7α, 11α

29.7 78.1 34.5 44.2 28.8 27.8 41.4 49.7 35.8 21.3

1β, 9α, 11β 8β, 11α, 18, 19 17α 17α, 18

39.5 49.9 84.2 32.9

C-12, C-13, C-14, 1-17 C-1, C-5 C-9, C-10

7α, 15β, 17α 7α, 15α 17α 17α, 21b, 22 12α, 12β, 16α, 16β, 18, 22 8β, 11β, 12β, 17α, 21a, 21b, 22 1β, 2β, 8β, 11β

C-22 C-22 C-21

18, 21b 18, 21a 17α, 18

C-3 C-1’, C-3’, C-1’’ C-2’, C-4’ C-3’, C-6’

3’, 5’ 1’’

27.1 51.2 16.0 12.1 176.1 73.7 117.4 174.6 101.0 84.4 77.7 71.3 78.4 62.4 106.2 76.7 77.8 71.3 78.6 62.4

ROESY

C-2’ C-3’’, C-1’’ C-2’’, C-4’’, C-2’’ C-3’’, C-6’’

6’a, 6’b 5’, 6’b 5’, 6’a 2’, 3’’, 5’’

6’’a, 6’’b 5’’, 6’’b 5’’, 6’’a

2. Táblázat: A 2 vegyület 1H és 13C kémia eltoldásai, valamint karakterisztikus HMBC és ROESY korrelációi piridin-d5 oldószerben

47

5.3.1 Az aglikon jelhozzárendelése Az egyes csoportok összekapcsolásához 1H,1H-COSY (2. Ábra, továbbiakban csak COSY), HMBC (3. Ábra, lent), és ROESY (3. Ábra, fent) spektrumokat használtam. Az egyes hidrogénés szénatomok konnektivitásának megbízható felderítéséhez biztos kiindulópontra van szükség. Jelen esetben az anguláris metil-csoportok ilyen biztos kiindulópontok. Mivel a három metilcsoport közül az 1.66 ppm eltolódású dublett szerkezetû, azaz a cukorrészre jellemzõ CH-Me szerkezetet mutatja, így a kiindulópontok biztos hozzárendelése a 18 és 19 metil-csoportok azonosítására korlátozódik. A feltételezett szerkezetet vizsgálva az látható, hogy a 18-as helyzetû protonok két kvaterner 13C atomot ( C-13, C-14 ) jelölhetnek ki, míg a 19-es helyzetûek csupán egyet ( C-10 ). Megvizsgálva a HMBC spektrumot azt tapasztaljuk, hogy a nagyobb kémiai eltolódású metil-jel két kvaterner

13

C atommal ad kapcsolatot (δC: 49.6, 84.1), a kisebb kémiai

eltolódású pedig egyel (δC: 35.7). Ezáltal bizonyítottá vált, hogy a nagyobb kémiai eltolódású jel a H-18 atomokhoz tartozik a keresztcsúcsot adó jelek közül. A vizsgált HMBC keresztcsúcsok alapján a 10, 13 és 14-es helyzetû kvaterner atomok jelhozzárendelése is megtörtént, mivel a C14 atom kémiai eltolódását a glikozidokra jellemzõ, a hozzá kapcsolódó elektronvonzó OHcsoport jelentõsen megnöveli. A C-17 azonosítása is egyértelmû H-18-ról, mivel csupán ez az egy szénatom tarozik CH-csoporthoz. A továbbiakban H-17 a COSY spektrumban kijelöli a 16-os helyzetû protonokat, melyekrõl szintén a COSY spektrumban eljutunk a 15-ös helyzetû protonokig. Innen tovább nem vezet korreláció, mely egyezésben van a D-gyûrû öttagú szerkezetével. Visszatérve a H-18 HMBC korrelációihoz, láthatjuk, hogy a megmaradt egy szénjel csakis a 12-es helyzethez tartozhat. A H-12 protonok a COSY spektrumban megadják a H-11 protonokat, ahonnan továbblépve megkapjuk H-9-et. C-9-et H-19 is kijelöli a HMBC spektrumban. H-9-rõl folytatva a COSY spektrum vizsgálatát eljutunk H-8-ra, majd a 7-es helyzetû, továbbiakban pedig a 6-os helyzetû protonokhoz. Az 5-ös helyzet azonosítása H-19-rõl HMBC segítségével, vagy H6-ról COSY-val történhet. Az itt megadott korrelációk összhangban vannak a feltételezett szerkezettel.

48

2. Ábra: Az 1 vegyület 1H,1H-COSY spektrumának két részlete: fent: cukor, lent: aglikon

49

3. Ábra: Az 1 vegyület ROESY (fent) és HMBC (lent) spektrumainak fontosabb részletei

50

Visszatérve H-19 HMBC korrelációihoz, láthatjuk, hogy a megmaradt egy szénatom csakis az 1-es helyzethez tartozhat, melyrõl a protonok a COSY spektrumban kijelölik a 2-es helyzetû protonokat. A 3-as helyzet hozzárendelése a COSY spektrum segítségével a 2-es helyzetrõl teljesen egyértelmû, hiszen H-3 jele a 3-as helyzethez kapcsolódó oxigén atom miatt teljesen elkülönül az aglikon protonjeleitõl. Ennek megfelelõen a H-3/H2-4 keresztcsúcsok is jól láthatóak. Mivel a 4-es helyzetû protonok szintén kijelölik H-5-öt a COSY spektrumban, ezért az A-gyûrû hattagú volta bizonyítottá válik. Ezzel az aglikon teljes jelhozzárendelése megtörtént, mely alapján látható, hogy a feltételezett négygyûrûs szerkezet helytálló. A 17-es helyzethez egy γ-lakton gyûrû, míg a 14-es helyzethez egy OH-csoport kapcsolódik, valamint az aglikont a cukorral összekötõ glikozidos kötés az aglikon 3-as helyzetén alakult ki, melyre a H-3 és C-3 kémiai eltolódások is bizonyságul szolgálnak. A 17-es helyzethez kapcsolódó γ-lakton gyûrû jelhozzárendelését nagyban megkönnyítette a lakton gyûrû speciális szerkezete, melynek eredményeképpen a =CH proton szingulettje és az oxigén atom melletti CH2-csoport csak geminális csatolást tartalmazó dublettjei könnyen azonosíthatók a jelátfedések ellenére is. A C-20 és C-23 jelek megkülönböztetése már nem ennyire egyszerû, ugyanis sem a H-21a és H-21b, sem a H-22 protonok nem adnak egyértelmû HMBC korrelációt a két kvaterner szénatomra. A kettõ és három kötésen keresztüli korrelációk megkülönböztetése nem bizonyító erejû a szerkezet-felderítés szempontjából. Mivel a HMBC mérés F1 dimenzióbeli digitális felbontása nem teszi lehetõvé a két nagyon közeli szénatom megkülönböztetését a H-17/C-20 keresztcsúcs esetén, ezért szelektív INAPT kísérletet végeztem, melynél a H-17 protont besugározva az egyértelmûen kijelöli a C-20-at.

5.3.2 A cukeregységek jelhozzárendelése

A rendelkezésre álló „alkotóelemekbõl” 1 metil-csoport, 1 CH2-csoport és 10 CH-csoport maradt arra, hogy a cukrok szerkezetét „felépítsük”. A jobb áttekinthetõség kedvéért az aglikonhoz közvetlenül kapcsolódó cukoregységet A-val, míg a másikat B-vel jelöltem. A kiinduláshoz a 3-as helyzet és az 1A helyzet közötti H-3/C-1A és H-1A/C-3 HMBC korrelációkat használtam fel, melyek egyértelmûen megadják az 1A helyzet proton és szén kémiai

51

eltolódásokat. A továbbiakban a COSY mérés segítségével megkaptam ennek a cukornak a teljes jelhozzárendelését, mely azt mutatta, hogy 1A-5A helyzetekben CH-csoportok, míg 6A helyzetben metil-csoport található. A protonok között mért vicinális csatolási állandók a következõk: 3J(H-1A,H-2A) = 8.0 Hz, 3J(H-2A,H-3A) = 3.1 Hz, 3J(H-3A,H-4A) = 2.7 Hz, 3J(H4A,H-5A) = 9.4 Hz, 3J(H-5A,H-6A) = 6.2 Hz. Ezek alapján kijelenthetjük, hogy az 1A, 2A, 4A és 5A helyzetekben axiális, míg 3A helyzetben ekvatoriális protonok találhatóak. Az aglikonhoz közvetlenül kapcsolódó cukoregység 6-dezoxi-β-D-allopiranozil csoport. A megmaradt 5 CH és 1 CH2 egységeket szintén a kiemelkedõen nagy kémiai eltolódású anomer pozícióból kiindulva tudjuk „összefûzni” a COSY spektrum segítségével, melynek eredményéül azt kapjuk, hogy 1B-5B helyzetekben CH-csoport, míg 6B helyzetben CH2-OH csoport található. A 6-dezoxi-allózzal létrehozott glikozidos kötés helyét a H-1B/C-4A HMBC korreláció egyértelmûen megadja, azaz a második cukoregység a 6-dezoxi-allóz 4A helyzetéhez kapcsolódik. A cukor azonosításához szintén nagy segítségemre voltak a vicinális proton-proton csatolási állandók: 3J(H-1B,H-2B) = 8.0 Hz, 3J(H-2B,H-3B) = 8.5 Hz, 3J(H-3B,H-4B) = 9.1 Hz, 3

J(H-4B,H-5B) = 9.1 Hz, 3J(H-5B,Ha-6B) = 2.4 Hz, 3J(H-5B,Hb-6B) = 5.2 Hz. Ezek alapján

ebben a cukorban a CH egységek protonjai axiális helyzetet foglalnak el, melybõl következik, hogy a cukor egy β-D-glükopiranozil egység. A meghatározott cukorszerkezeteket teljes mértékben alátámasztják a ROESY spektrumban tapasztalt, a térközelséget jelzõ korrelációk.

5.4 Szerkezeti sajátságok vizsgálata

5.4.1 Az aglikon gyûrûkapcsolódási jellegének meghatározása

Az aglikont felépítõ egy öttagú és három hattagú gyûrû kapcsolódási jellegének meghatározásához a ROESY spektrum által jelzett térközelségeket használtam fel (5. Ábrán látható kettõs nyilak). A hattagú gyûrûk esetében az energetikailag legstabilisabb szék-konformert vettem alapul. Az A/B-transz gyûrûkapcsolódást a H-19 metil protonok és a H-4β közötti térközelség jelzi. A B/C-transz gyûrûkapcsolatot a H-19/ H-8β és H-18/H-8β keresztcsúcsok jelzik. A C/D-cisz gyûrûkapcsolódás pedig egyértelmûen következik a H-9/H-15α térközelségbõl. Itt szeretném megjegyezni, hogy a B/C és C/D gyûrûkapcsolódások összhangban vannak a

52

természetben elõforduló szívglikozidok gyûrûkapcsolódási jellegével. Az ilyen típusú vegyületeket az A/B gyûrûkapcsolódást egyértelmûen jelzõ H-5 pozíciójának megadásával szokás jellemezni, így e két vegyület az 5α-kardenolidok csoportjába tartozik.

H O

CH3

H

H CH3

OH

O

H RO

H

H

H 5. Ábra: A ROESY spektrum alapján meghatározott fontosabb térközelségek, melyeket a nyilak jelölnek

5.4.2 Szubsztituensek pozíciója

A ROESY keresztcsúcsok, valamint a vicinális proton-proton csatolások alapján határoztam meg az aglikonhoz kapcsolódó szubsztituensek térhelyzetét. A 3-as helyzethez kapcsolódó cukoregység térállásának megállapításához a H-3 jel multiplicitását vizsgáltam. A H-3 proton két 12 Hz és két kb. 3 Hz nagyságú vicinális csatolási állandóiból egyértelmûen következik a proton axiális térállása. A C(3)-as helyzetû szubsztituens β térállása igazolást nyert. A fentieket támasztják alá a H-3/H-1α, H-3/H-2α és H-3/H-4α ROESY korrelációk is. A 14-es helyzethez kapcsolódó OH-csoport esetében részletes vizsgálat nem szükséges, hiszen a C/D-cisz gyûrûkapcsolat egyértelmûen meghatározza a csoport β pozícióját. A 17-es helyzethez kapcsolódó γ-lakton gyûrû pozíciója a H-17 és H-15α protonok között mért térközelség alapján β-nak bizonyult. A C-17 – C-20 kötés körül a lakton gyûrû szabadon elfordulhat, melyet a H18/H-21a, H-18/H-21b és H-18/H-22 ROESY keresztcsúcsok igazolnak. A kapott eredményeket szintén az 5. Ábra mutatja be.

53

5.4.3 A glikozidos kötések mentén kialakuló konformációs viszonyok vizsgálata

Glikozidos kötés mentén kialakuló konformációs viszonyok vizsgálatánál figyelembe kell venni bizonyos effektusokat, melyek alapvetõen befolyásolják az egyes konformerek kialakulási valószínûségét. Ilyen effektus az anomer effektus és az exo-anomer effektus. Az anomer effektus, mely X-C1-Y-R fragmenseknél lép fel, ahol X és Y heteroatomok közül legalább az egyik O, N vagy F atom, és ahol az R vagy H, vagy C atom, azt eredményezi, hogy az X és R atomok szünklinális helyzetûek, vagyis a C1-Y tengely körüli rotációs szög +30º és +90º, vagy -30º és 90º között van. Az exo-anomer effektus8 alapján azok a konformációs helyzetek kerülnek elõtérbe, melyeknél a glikozidos O atom nemkötõ elektronpályái a szacharidban lévõ C-O kötés lazító pályáival kölcsönhatásba tud lépni, mellyel stabilizáló hatást ér el. A glikozidos kötéseken keresztül mért heteronukleáris csatolási állandók (pl. 3J(C-1’,H-3)) 3 Hz körüli értéke, ami a Karplus-típusú összefüggés alapján közel 60 fokos diéderes szögnek felel meg, azt mutatja, hogy a kialakult domináns konformer összhangban van a fent említett effektusok által meghatározott szerkezettel.

5.5 Összefoglalás

Összefoglalásként elmondhatom, hogy a két vizsgált természetes vegyület az 5αkardenolidok családjába tartozik, az alapváz mindkét esetben az uzarigenin (3β, 14β-dihidroxi5α-kard-20(22)-enolid), melyhez 6-dezoxi-β-D-allopiranozil-[1,4]-β-D-glükopiranóz (1) és β-Dglükopiranozil-[1,2]-β-D-glükopiranóz (2) egységek kapcsolódnak. Ezek közül 1 egy teljesen új természetes vegyületnek bizonyult.

A tématerülettel kapcsolatban megjelent közlemények, elõadások (E) és poszterelõadások (P): Atef G. Hanna, M. Hani A. Elgamal, Nagy A. M. Morsy, Helmut Duddeck, József Kovács, Gábor Tóth, Magn. Reson. Chem. 1999, 37: 754. József Kovács, András Simon, Tamás Gáti, Helmut Duddeck, Gábor Tóth, NMR Investigation of 5α- and 5β-cardenolides isolated from Calotropis procera and Acokanthera spectabilis, Central European Discussion Groups, 14th NMR, Valtice, Csehország, 12.-14. 04. 1999. (E)

54

József Kovács, Tamás Gáti, András Simon, Helmut Duddeck, Gábor Tóth, Complete 1H and

13

C

signal assignment and structure elucidation of 5α- and 5β-cardenolides isolated from Acokanthera spectabilis and Calotropis procera, Central European NMR Symposium and Bruker NMR Users Meeting, 1999. 09. 2-3. Szeged (P)

5.6 Irodalomegyzék

[1] a) Dymock W. A. Pharmacographia India 1883, 3: 270, Zain Packaging Industries, Karachi; b) El-Antaki D. Takaret Oli Alabab. 1923, 217, Azharia Press, Cairo [2] Chopra RN, Badhwar RL, Ghosh S. Poisonous Plants Of India 1949, 674, Gout Of Indian Press, Calcutta. [3] a) Hesse G, Reicheneder F. Ann. Chem. 1936, 526: 252; b) Hesse G, Heuser LJ, Hütz E and Reicheneder F, Ann. Chem., 1950, 566: 130; c) Hesse G, Lettenbauer G. Angew. Chem. 1957, 69: 392. [4] Brüschweiler F, Stöcklin W, Atöckel A, Reichstein T. Helv. Chem. Acta. 1969, 52: 2086. [5] Brüschweiler F, Stöcklin W, Reichstein T. Helv. Chem. Acta. 1969, 52: 2276. [6] a) Akhtar N, Malik A, Ali SN, Kazmi SU. Phytochemistry 1992, 31: 2821; bKhan AQ, Ahmed Z, Kazmi SN, Malik A. J. Nat. Prod. 1988, 51: 925; c) Khan AQ, Malik A. Fitoterapia 1990, 61: 891; d) Pant R, Chaturvedi K. Curr. Sci. 1989, 58: 1093; e) Khan AQ, Malik A. Phytochemistry 1989, 28 2859; f) Bhutani KK, Gupta DK, Kapil RS. Tetrahedron Lett.1992, 33: 7593. [7] Hanna AG, Elgamal MHA, Hassan AZ, Duddeck H, Simon A, Kovács J, Tóth G. Magn. Reson. Chem. 1998, 36: 936. [8] a) Lemieux RU, Koto S, Voisin D. Anomeric Effect Origin and Consequences 1979, 87: 17, in Szarek WA, Horton D. (Eds.), ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington D. C.; b) Kirby AJ. The Anomeric Effect and Related Stereoelectronic Effects at Oxygen 1983, Springer, Heidelberg

6. Z-3-arilidén-1-tioflavan-4-on származékok epoxidációja 6.1 Irodalmi áttekintés

55

A 3-arilidén-flavanonok (flavindogenidek) jól ismert szerves vegyületek. E-izomereik, melyben a karbonil- és az aril-csoport a kettõs kötés ellentétes oldalán helyezkedik el, flavanonok és aromás aldehidek sav- és báziskatalizált kondenzációjával is elõállíthatók.1 Fotoizomerizáció segítségével megkaphatjuk a vegyületek Z-izomerét is, melyben az említett két csoport egy oldalon található.1a-c,2 Ezek az exociklikus α,β-telítetlen ketonok számos kémiai transzformáció kiindulási

vegyületének

bizonyultak,

melyek

tri-

és

tetraciklusos

gyûrûrendszereket

szolgáltatnak.3 Epoxidálásuk különösen érdekes preparatív szempontból, melyet számos oxidálószerrel valósítottak meg. Ilyen oxidálószerek az alkáli hidrogén-peroxid (Weis-Scheffer reakció),4 a nátrium-hipoklorid,5 vagy a m-klór-perbenzoesav. Közös jellemzõjük, hogy eredményül epoxidok diasztereomer keverékét kapjuk. Dimetil-dioxiránt (DMD) használva E-3arilidén-flavanonok epoxidálása során (1. Ábra) diasztereoszelektív reakcióban kizárólag transz,transz epoxid izomereket szolgáltat a reakció.2,6

O

O

Ph

O

Ph

O

H

Ar CH2Cl2 O

O

H

E-3-arilidén-flavanon

O

Ar

H

trans,trans ~ 100%

1. Ábra: E-3-arilidén-flavanonok sztereoszelektív epoxidálása

A 3-arilidén-flavanonok 1-tio-analógjai, azaz a 3-arilidén-1-tioflavanonok szintén ismert vegyületek. Elõállításuk hasonló lépésekkel történik, mint flavanon társaiké.7,8 Z-izomerjeik, melyben a karbonil- és az aril-csoport a kettõs kötés ellentétes oldalán helyezkednek el, fotoizomerizációval a megfelelõ E-izomerekké alakíthatóak. Oxidációjuk azonban koránt sem olyan egyszerû, mivel maga a kén atom is oxidációs centrumot jelent. Elektrofil reagensekkel (mklór-perbenzoesav, DMD) végezve az oxidációs reakciót epoxidok helyett 3-arilidén-1tioflavanon-1-oxidokat és -1,1-dioxidokat (szulfonokat) kapunk (2. Ábra), melyek még

56

feleslegben adott reagensekkel sem szolgáltatnak epoxidokat.7,9 Ezek alapján megállapíthatjuk, hogy elektrofil reagensek nem képesek az erõsen elektronhiányos kettõs kötést oxidálni.

O S

Ph Ar

O S

H

O

Ph

O

szulfoxidok

CH2Cl2

O

Ar O

O S

H

Ph Ar

Z-3-arilidén-1-tioflavanonok O

H

szulfonok 2. Ábra: Z-3-arilidén-1-tioflavanonok reakciója dimetil-dioxiránnal

6.2 Bevezetés

Az irodalmi adatok ismeretében Lévai és munkatársai nukleofil oxidálószereket (NaOCl és alkáli H2O2) alkalmaztak Z-3-arilidén-tioflavanonok (1) epoxidációjához. Az epoxidálási reakció során elméletileg négy izomer keletkezhet: transz,cisz; transz,transz; cisz,cisz és cisz,transz (3. Ábra). Az izomereket leíró elsõ elõtag a karbonil-csoport és az aril-csoport relatív pozícióját adja meg az epoxid gyûrûn, míg a második elõtag a 2-es helyzetû fenil-csoport és az epoxid gyûrû oxigénjének relatív helyzetét írja le. A jelen esetben a reakció két diasztereomer epoxid 2 és 3 3:2 arányú keverékét szolgáltatta, melyeket a továbbiakban folyadékkromatográfiás módszerrel választottak el. Mindkét vegyület racemát.

57

Ph H

S 8 5

8a 4a

1 4

O

2 3

4 1

O

+

3'

R

H

O

2 transz,cisz

Ph H

S

R

O

R H

3 transz,transz

i. NaOCl ii. H2O2 / NaOH

Ph H

S

H

O

Ph H

S

+

1

Ph H

S

H

H

O 1-3

a

b

c

d

e

f

R

H

4+-Me

4+-OMe

4+-F

2+-OMe

2+-Cl

O

O

O

R

R cisz,cisz

cisz,transz

3. Ábra: Z-3-arilidén-1-tioflavan-4-onok epoxidációjának lehetséges termékei

Munkám során NMR spektroszkópia segítségével a két keletkezett epoxidot azonosítottam, valamint szerkezeti és konformációs viszonyait vizsgáltam, melynek menetét ebben a fejezetben ismertetem. A kapott eredményeket kvantumkémiai számítások is alátámasztották.

6.3 Jelhozzárendelés A teljes 1H és 13C NMR jelhozzárendelést gs-1H,1H-COSY, gs-HSQC és gs-HMBC mérések segítségével végeztem el. A kapott eredményeket az 1. és 2. Táblázatok tartalmazzák. A proton spektrum jellegzetességeit a 4.a. Ábrán látható COSY spektrum projekcióján mutatom be a 2d vegyület esetében. Jól látható, hogy a peri-helyzetû karbonil-csoport anizotrop-effektusa jelentõs downfield eltolódást okoz a dublett szerkezetû H-5-ön, valamint a H-2 és H-3’ szingulettjei is nagyon jól elkülönülnek az aromás tartományban megtalálható többi jeltõl, vagy az esetenkénti metil- és metoxi-csoport hármas intenzitású jelétõl. A COSY spektrumon egyúttal nyomon követhetjük az egyes spinrendszerek meghatározását. A 2-es és 3’ helyzetekhez kapcsolódó aromás gyûrûk egyértelmû megkülönböztetését H-2 és H-3’ atomoknõ HMBC keresztcsúcsok

58

szolgáltatják. Ehhez azonban meg kell különböztetnünk ezt a két azonos intenzitású és multiplicitású jelet. Mint ismeretes, egy epoxid gyûrûben lévõ CH-csoport esetében az egykötésen keresztüli csatolási állandójának értéke rendkívül magas, 180 Hz körüli érték.

13

C-

csatolt HSQC spektrumot felvéve egyértelmûen megállapíthatjuk, hogy az 5.3/64 és 4.4/65 ppmnél lévõ keresztcsúcsok 180 Hz körüli egykötésen keresztüli csatolást tartalmaznak a 2 és 3 vegyületek esetében, melyek egyértelmûen bizonyítják, hogy a magasabb kémiai eltolódású szingulett jel tartozik a H-3’ atomhoz mindkét izomer esetében (4.b. Ábra).

2a

2b

2c

2d

2e

2f

3a

3b

3c

3d

3e

3f

2

3.96

3.98

3.98

3.88

3.93

3.86

4.22

4.26

4.20

4.17

4.11

4.19

3'

4.43

4.40

4.38

4.38

4.52

4.53

5.33

5.33

5.27

5.28

5.48

5.45

5

8.09

8.09

8.08

8.06

8.10

8.10

8.09

8.09

8.04

8.10

8.09

8.14

6

7.20

7.19

7.17

7.19

7.19

7.20

7.21

7.21

7.18

7.23

7.20

7.25

7

7.40

7.39

7.37

7.40

7.39

7.40

7.42

7.41

7.39

7.43

7.39

7.43

8

7.22

7.22

7.21

7.22

7.22

7.24

7.29

7.30

7.26

7.29

7.25

7.29

+

7.54

7.42

7.45

7.51

-

-

7.37

7.28

7.26

7.38

-

-

3+

7.44

7.25

6.96

7.13

6.97

7.47

7.31

7.14

6.83

7.00

6.68

7.27

4

+

7.44

-

-

-

7.39

7.38

7.32

-

-

-

7.25

7.24

5

+

7.44

7.25

6.96

7.13

7.00

7.35

7.31

7.14

6.83

7.00

6.96

7.24

6

+

7.54

7.42

7.45

7.51

7.38

7.50

7.37

7.28

7.26

7.38

7.37

7.41

Me

-

2.41

-

-

3.82

-

-

2.34

-

-

3.61

-

2",6"

7.52

7.52

7.52

7.49

7.50

7.50

6.98

7.05

7.00

6.99

7.05

7.00

3",5"

7.25

7.24

7.25

7.25

7.25

7.25

7.07

7.11

7.06

7.09

7.05

7.07

4"

7.23

7.22

7.22

7.23

7.23

7.25

7.11

7.09

7.09

7.13

7.05

7.13

2

1. Táblázat: A 2 és 3 vegyületek 1H kémiai eltolódásai kloroform-d oldószerben

59

2a

2b

2c

2d

2e

2f

3a

3b

3c

3d

3e

3f

2

45.2

45.2

45.2

45.2

45.1

45.1

46.5

46.4

46.4

46.6

47.0

47.1

3

66.7

66.7

65.7

66.6

66.6

66.7

64.2

64.2

64.1

64.0

63.5

64.1

3'

65.6

65.7

65.5

65.0

63.2

64.0

64.0

64.1

63.9

63.5

61.8

62.7

4

190.2 190.3 190.3 190.0 190.5 189.7 189.4 189.4 189.6 189.3 189.7 188.9

4a

132.0 132.0 131.9 132.0 132.1 131.8 131.1 131.1 131.2 131.1 131.5 131.2

5

129.4 129.3 129.2 129.4 129.3 129.4 129.8 129.7 129.7 129.8 129.7 129.9

6

125.9 125.8 125.8 126.0 127.4 125.8 125.9 125.8 125.8 126.0 125.9 126.0

7

134.6 134.5 134.5 134.7 134.4 134.6 134.6 134.5 134.5 134.7 134.4 134.6

8

128.2 128.2 128,1 128.2 128.1 128.2 128.6 128.2 128.2 128.3 128.5 128.3

8a

138.1 138.1 138.0 137.9 138.5 138.4 139.9 139.9 139.9 139.7 139.5 139.7

+

133.6 130.5 125.4 129.3 122.4 131.7 133.4 130.3 125.3 129.2 122.0 131.6

+

127.1 127.0 128.3 128.9 159.0 134.5 126.8 126.7 128.0 128.5 158.1 134.0

+

128.8 129.3 114.0 115.8 110.8 129.8 128.5 129.2 114.0 115.6 110.0 126.8

+

129.2 139.0 160.2 163.2 130.2 130.3 128.5 138.4 159.9 162.9 129.7 129.7

+

5

128.8 129.3 114.0 115.8 120.4 126.9 128.5 129.2 114.0 115.6 120.3 129.5

6+

127.1 127.0 128.3 128.9 127.4 128.1 126.8 126.7 128.0 128.5 127.1 127.8

1

2 3 4

Me 1"

-

21.5

55.4

-

55.7

-

-

21.4

55.4

-

55.0

-

136.8 136.9 136.9 136.6 137.3 136.7 136.5 136.4 136.5 136.5 137.1 136.4

2",6" 128.1 128.1 128.0 128.1 128.2 128.1 127.6 127.7 127.6 127.5 127.6 127.5 1 5 3",5" 128.7 128.7 128.7 128.8 128.7 128.8 128.2 128.5 128.5 128.6 128.2 128.5 4"

128.1 128,1 128,0 128.2 128.0 128.1 128.1 128.0 128.0 128.1 127.7 128.1

2. Táblázat: A 2 és 3 vegyületek 13C kémiai eltolódásai kloroform-d oldószerben

60

4.a Ábra: A 2d vegyület COSY spektrumának részlete

4.b Ábra: 13C-csatolt HSQC spektrumrészlet

61

6.4 Szerkezeti sajátságok vizsgálata

6.4.1 NOESY mérések

A protonok közötti térközelségek meghatározásához szelektív 1D-NOESY és kétdimenziós fázisérzékeny NOESY méréseket végeztem. Ezek alapján megállapítottam, hogy a H-2 atom és a C-3’-hoz kapcsolódó aromás gyûrû orto protonjai térközelségben vannak, míg H-3’ és H-2, valamint H-3’ és H-2”,6” atomok között nem tapasztaltam térközelséget. Ezek a megfigyelések arra engednek következtetni, hogy a két keletkezett izomer trans,cisz (2) és transz,transz (3) szerkezetûek. Így a cisz,cisz és cisz,transz izomerek jelenléte kizárható. Ez a megállapítás összhangban van azzal a megfigyeléssel, miszerint analóg flavanonok epoxidációja során a Z geometriájú kettõs kötésbõl transz, míg az E-bõl cisz epoxid izomerek keletkeznek.10,11

6.4.2 Konformációs vizsgálatok

A 2 és 3 spiroepoxidok sztereokémiájának és konformációs viselkedésének felderítését nagyban megnehezíti, hogy a kénatomot tartalmazó gyûrû flexibilis, így a következõ konformációs egyensúlyt kell vizsgálnunk: kád-A ⇔ boríték-A ⇔ boríték-B ⇔ kád-B, melyet az 5. Ábra mutat be a transz,transz izomerek esetében. A heterogyûrû inverziója a 2-es helyzetû fenil-csoport kvázi axiális (A konformerek) és kvázi ekvatoriális (B konformerek) átalakulásával jár.

62

Ar

H

O

Ph

S Ph

O

H Ar

H S

H

O

O

kád-A

kád-B

Ph

H H

O H

Ar

O

S

O

S Ph

Ar O H boríték-A 3

boríték-B

J(C-8a,H-2) = 7-8 Hz

δ H-3’ = 5.30 ; δ H-5 = 8.05 5. Ábra: A 3 vegyületek konformációs egyensúlya

Tóth és munkatársai korábban megállapították, hogy a H-2 és C-8a atomok között mért csatolási állandó értéke jellemzõ a 2-fenil-csoport térbeli pozíciójára. Egy közel 8 Hz-es érték kb. 180º-os, míg az 1 Hz körüli érték egy 80º-hoz közeli φ(H(2)-C(2)-S-C(8a)) diéderes szöggel függ össze.2,12,13,14 A fent említett csatolási állandó meghatározásához különbözõ mérési módszereket használtam fel: gradiens szelekciót alkalmazó proton detektált távolható

13

C,1H korrelációs

mérést,15,16 2D INAPT-ot,17 valamint GSQMBC-t.18 A 2c vegyület esetén jól látható, hogy mindhárom mérési módszer ugyanazt a csatolási állandót szolgáltatta: 3J(H-2,C-8a)=7.6 Hz (6. Ábra a-c). A különbözõ mérési módszerekkel dolgozva alkalmam nyílt az egyes módszerek

63

6. Ábra: A 3J(C-8a,H-2) mérése A) GSQMBC; B) 1D-gs-C/H távolható korreláció; C) 2D-INAPT módszerek segítségével

64

a felhasználó szempontjából történõ összehasonlítására. A GSQMBC módszert (lásd 4.4 Fejezet) találtam a leghatékonyabbnak, hiszen egyetlen mérésbõl az összes csatolási állandót megkaphatjuk viszonylag rövid idõn belül. A mérés pontosságának a határát az F2 dimenzió felbontása jelenti. Mivel kétdimenziós mérések esetében ez 2k-8k adatpontot jelent, ezért e tekintetben az egydimenziós

13

C,1H korrelációs mérés elõnyt élvez, hiszen ott 32k-64k

adatpontot is használhatunk még rutin körülmények között is. Ez utóbbi módszer hátránya abban jelentkezik, hogy csak a szelektíven besugárzott szénatomhoz tartozó heteronukleáris távolható csatolásokat kapjuk meg. A GSQMBC egyetlen hátránya nagy multiplicitással rendelkezõ protonok esetében nyilvánul meg, mivel ekkor a csatolási állandó leolvasása nem lehetséges közvetlenül, hanem számítógépes analízisre van szükség. A 2D INAPT nem szenved ettõl a problémától, hiszen a jelforma mindig dublett. A mérés pontossága itt az F1 dimenzió pontsûrûségétõl függ. A

13

C detektálás miatt érzékenysége meglehetõsen szerény.

Mindezeket figyelembe véve a GSQMBC bizonyult a legmegfelelõbb módszernek, hiszen a csatolási állandót egy szingulett protonról kellett meghatározni, így a csatolási állandó leolvasása lehetséges volt közvetlenül a spektrumból.

3

J(C-8a,H-2)

3

J(C-2”,6”,H-2)

3

+

+

J(C-2 ,6 ,H-3’)

2b

2c

2e

2f

3b

3c

3e

3f

7.6

7.6

7.5

7.5

7.3

7.0

7.2

7.0

3.8

3.4

4.4

2.8

3.5

3.7

4.0

4.1

4.1

2.9

2.1, 2.7

1.9, 3.5

2.5

1.8

2.1, 4.0

2.3, 3.0

3. Táblázat: Karakterisztikus 3J(C,H) értékek néhány 2 és 3 vegyület esetén

A mért értékeket összefoglaló 3. Táblázat mutatja, hogy a 3J(H-2,C-8a) csatolási állandó a 7.0-7.6 Hz-es tartományba esik, mely a 2-fenil-csoport kvázi axiális helyzetét támasztja alá, azaz a kitüntetett konformer a 2 és 3 vegyületek esetén boríték-A. A konformációs viszonyokat feltûntetõ 5. Ábrán látható, hogy, ha a mérési és a Karplus-összefüggés hibahatárait is figyelembe vesszük, akkor a kád-B konformer is szóba kerülhet. Ezt azonban a H-5 jel vizsgálatával egyértelmûen kizártam. Ahogy azt már a jelhozzárendelés résznél is említettem, a karbonil-csoport anizotrop-effektusa a H-5 atom kémiai eltolódását jelentõsen megnöveli, mely így a 8.04-8.14 ppm-es tartományba kerül. Ha figyelembe vesszük, hogy a flavanonokat és a tioflavanonokat összehasonlítva 0.2 ppm-es eltolódás-növekedést tapasztalunk H-5-ön a tioflavanonokban,8 valamint, hogy a 2 és 3 vegyületekkel analóg flavanon spiroepoxidokban δH-5 = 7.84-7.94, akkor joggal állíthatjuk,

65

hogy a karbonil-csoport és a kondenzált aromás gyûrû közel koplanáris helyzetû. Mindez ellentétben van a kád-B szerkezettel és további bizonyságul szolgál a boríték-A konformer dominanciájára. A kvantumkémiai számítások szintén a boríték-A konformert adták meg, mint a legkisebb energiával rendelkezõ konformert mindkét esetben. A számított φ(H(2)-C(2)-S-C(8a)) diéderes szög közel 180º volt (153.9º -170.4º ). A kád-A és boríték-B konformerek esetében ez a szög 60º -80º tartományban helyezkedik el. A kád-B jelenlétét ebben az esetben csak a konformerek energiájának összehasonlítása zárja ki, mivel a második legstabilabb konformer a boríték-B. A karbonil-csoport és a kondenzált aromás gyûrû közel koplanáris elhelyezkesédére is további bizonyítékul szolgáltak a számított szerkezetek, hiszen boríték-A konformer esetében a φ(O=C(4)-C(4a)-C(5)) diéderes szög 2.3º -8.5º tartományba esik, míg kád konformerek esetében ez a szög közel 25º . A 7. Ábrán a két izomerre számított legkedvezõbb konformer látható.

7. Ábra: A 2a és 3a vegyületek kitûntetett konformerei

6.4.3 Transz,cisz és transz ,transz izomerek megkülönböztetése

A 2-fenil-csoport és az epoxid gyûrû oxigénjének relatív helyzetét a H-3’ kémiai eltolódás segítségével határoztam meg, ezzel a két izomer karakterisztikus és rendkívül gyors megkülönböztetését lehetõvé téve. A transz ,transz izomerben a C-3’ kvázi ekvatoriális helyzetet foglal el a heterogyûrûben, így a H-3’ a karbonil-csoporthoz viszonylag közel 66

helyezkedik el és közelítõleg koplanáris vele, mely δ = 5.27-5.45 ppm kémiai eltolódást okoz. Transz,cisz izomer esetén azonban a H-3’ a karbonil-csoport síkja alatt foglal helyet, a diéderes szög kb. 35º , melynek hatására karbonil-csoport anizotrop-effektusa gyengébben érvényesül, mint az elõzõ esetben. Ez δ = 4.38-4.53 ppm kémiai eltolódást okoz. Mivel a két tartomány között jelentõs eltérés van, ezért egyetlen proton spektrum elegendõ az ilyen típusú izomerek meghatározásához és megkülönböztetéséhez. A fent közölt megállapítás további alátámasztására a karbonil-csoport anizotróp effektusa került számításra a két izomer esetében. A még egy ilyen nagyságú molekula esetében is rendkívül idõigényes számolás helyett a karbonil-csoport helyére H2C=O molekula került. Amint a 8.a Ábrán láthatjuk a transz ,cisz izomer esetében a H-3’ a -0.4 ppm-es hatású térrészbe (sárga) kerül, míg transz,transz esetben +0.4 ppm-es hatást (piros) tapasztalunk. Így a két izomerben fellépõ kb. 0.8 ppm-es eltérés jól értelmezhetõ.

6.4.4 A fenil- és aril-csoportok konformációs vizsgálata

A 2-es helyzethez kapcsolódó fenil-csoport, valamint a 3’ helyzetben lévõ aril-csoport konformációs (rotációs) tulajdonságait a

3

J(H-2,C-2”,6”) és

3

J(H-3’,C-2+,6+) csatolási

állandók segítségével vizsgáltam meg. Ha egy CH-csoport és a hozzá kapcsolódó aromás gyûrû koplanáris, úgy a CH-csoport protonja és az orto helyzetû szénatomok között mért csatolási állandó értéke 5-6 Hz között található, mely érték arányosan csökken ennek a rotamer-populációnak a csökkenésével.2,13,14 A 2 és 3 vegyületek esetében a fent említett csatolási állandók az 1.8-4.1 Hz-es tartományba esnek (3. Táblázat), melyek azt mutatják, hogy a C(2)-C(1”) és C(3)-C(1+) kötések körül nem található jelentõs energiaminimummal rendelkezõ rotamer, azaz az egyes rotamer-populációk között nem találunk olyanokat, amik lénygesen nagyobbak lennének. Természetesen a 3’-aril csoporton esetlegesen elhelyezkedõ orto-helyzetû szubsztituensek térkitöltöttségének megfelelõen tovább módosulnak az egyes rotamerek megjelenésének valószínûségei. Azonban csak a csatolási állandók vizsgálatával a közöltnél részletesebb információ nem nyerhetõ.

67

8.a Ábra: A karbonil-csoport számított anizotróp kúpja és hatása H-3’-re

8.b Ábra: Az aril-gyûrûáramok okozta anizotróp effektus 3a esetén

Az aromás gyûrûk kapcsán érdemes megemlíteni azt a tényt, hogy a transz ,transz vegyületek esetében a 2-fenil-csoport orto protonjainak kémiai eltolódása jelentõsen

68

lecsökken (δ = 6.98-7.05 ppm). Ez részben azzal magyarázható, hogy ezek a protonok a 3’aril-gyûrû gyûrûárama okozta árnyékolási térbe esnek. A 8.b Ábra a számolt anizotróp kúpot mutatja be -0.3 ppm (sárga) és +0.3 ppm (piros) ICSS felületeken keresztül. Jól látható, hogy a fenil-csoport orto helyzetû protonjai a fenil-csoport forgása során csak a sárgával jelzett, negatív eltolódást okozó térrészbe eshetnek.

6.5 Összefoglalás

Megállapítottam, hogy a Z-3-arilidén-1-tioflavanonok nukleofil oxidálószerekkel történt reakciója

során

transz ,cisz

megkülönböztetésésre

és

egyértelmû

transz ,transz NMR

spektrális

izomerek adatot

keletkeznek, találtam.

melyek

Legstabilabb

konformerként a boríték-A konformert azonosítottam, míg az aromás csoportok forgása nem korlátozott. Megállapításaimat kvantumkémiai számítások is igazolták.

A tématerülettel kapcsolatban megjelent közlemények, elõadások (E) és poszterelõadások (P): Gábor Tóth, József Kovács, Albert Lévai, Erich Kleinpeter and Andreas Koch, Magn. Reson. Chem. 2001, 39: 251.

Albert Lévai, Gábor Tóth, József Kovács, Tamás Patonay and Erzsébet B. Vass, Monat. Chem. 2001, 132: 707.

József Kovács, Gábor Tóth, Albert Lévai, Barbara Balázs Stereochemistry of spiroepoxides obtained by oxidation of 3-arylidene-1-thioflavanone, Central European Discussion Groups, 15th NMR, Valtice, Czech , 26.-28. 04. 2000. (E)

Kovács József, Tóth Gábor, B. Vass Erzsébet, Lévai Albert 3-Arilidén-1-tioflavanonok oxidációja során nyert spiroepoxidok sztereokémiája, MKE Vegyészkonferencia, Debrecen, 2000. 07. 5. (E)

József. Kovács, Gábor Tóth, Albert Lévai, Erich Kleinpeter, Andreas Koch, Stereochemistry of Spiroepoxides obtained by Oxidation of Z-arylidene-1-thioflavan-4-ones and GIAOHF/DFT Calculation of

13

C Chemical Shifts, 22nd Discussion Meeting, Progress in the

69

Magnetic Resonance of Bioactive Compounds and New Materials, Regensburg, Germany, September 27 - 30, 2000 (P)

Albert Lévai, Erzsébet B. Vass, Tamás Patonay, Gábor Tóth, József Kovács, Epoxidation of 3-arylidene-1-thioflavanones, 19th International Symposium Organic Chemistry of Sulfur, Sheffield, United Kingdom, 25-30. 06. 2000. (P)

Lévai Albert, Tóth Gábor, Kovács József, Patonay Tamás 3-Arilidén-1-tioflavanonok oxidációs átalakításai, MTA Heterociklusos Kémiai Munkabizottság 2001. évi elõadóülése, Balatonszemes, 2001. 05. 28-29. (P)

6.6 Irodalomjegyzék [1] a) Keane DD, Marathe KG, O’Sullivan WI, Philbin EM, Simons RM, Teague PC. J. Org. Chem. 1970, 35: 2286; b) Lévai A, Hetey EH. Pharmazie , 1978, 33: 378; c) Dhavale DD, Joshi P, Marathe KG. J. Chem. Soc. Perkin Trans 2, 1987, 449; d) Lévai A, Szabó Z. Pharmazie 1992, 47: 56. [2] Nemes C, Lévai A, Patonay T, Tóth G, Boros S, Halász J, Adam W, Golsch D. J. Org. Chem. 1994, 59: 900. [3] Lévai A, Tóth G. Trends Heterocycl Chem, 1995, 4: 89. [4] a) Doherty R, Keane DD, Marathe KG, O’Sullivan WI, Philbin EM, Simons RM, Teague PC. Tetrahedron Lett. 1968, 441; b) Keane DD, O’Sullivan WI, Philbin, EM, Simons RM, Teague PC. Tetrahedron 1970, 26: 2533 [5] Keane DD, O’Sullivan WI, Philbin EM, Simons RM, Teague PC. Tetrahedron 1971, 27: 3535. [6] Adam W, Bialas J, Hadjiarapoglou L. Chem. Ber. 1991, 124: 2377. [7] (a) Auwers K, Arndt F. Ber dtsch Chem. Ges. 1909, 42: 2706; (b) Arndt F, Fleming W, Scholz E, Löwensohn V. Ber dtsch Chem. Ges. 1923, 56: 1269; (c) Bierne JJ and O’Sullivan WI. Proc. Roy. Irish. A cad. 1977, 77B: 331. [8] Lévai A, Szöllõsy Á, Tóth G. A cta. Chim. Hung. 1991, 128: 359. [9] Adam W, Golsch D, Hadjiarapoglou L, Lévai A, Nemes C, Patonay T. Tetrahedron 1994, 46: 13113. [10] Keane DD, O’Sullivan WI, Philbin EM. Tetrahedron 1970, 26: 2533. [11] Keane DD, O’Sullivan WI, Philbin EM. Tetrahedron 1971, 27: 3535.

70

[12] Adam W, Halász J, Lévai A, Nemes Cs, Tóth G. Liebigs. A nn. Chem. 1994, 795. [13] Tóth G, Szöllõsy Á, Lévai A, Oszbach Gy, Dietrich W, Kühne H. Magn. Reson. Chem. 1991, 29: 801. [14] Tóth G, Lévai A, Szöllõsy Á, Duddeck H. Tetrahedron , 1993, 49: 863. [15] Stelten J, Leibfritz D. Magn. Reson.Chem. 1995, 33: 827. [16] Okogun JI, Duddeck H, Habermehl G, Krebs HC, Tóth G, Simon A. Magn. Reson. Chem. 1998, 36: 371. [17] Jippo T, Kamo O, Nagayama K, J. Magn. Reson.1986, 66: 344. [18] Marek R, Kralik L, Sklenaø V. Tetrahedron Lett., 1997, 33: 665.

71

7. Z-3-arilidén-1-tioflavan-4-on epoxidok oxidációja

7.1 Irodalmi áttekintés

Mivel ennek a fejezetnek a témája szorosan kapcsolódik a 6. Fejezethez, annak folytatásának tekinthetõ, ezért az irodalmi áttekintés ismétlésétõl itt eltekintek.

7.2 Bevezetés

A 6. Fejezetben már szó volt arilidén-flavanonok dimetil-dioxirános (DMD) reakciójáról, amely az oxidálószer karakterének megfelelõen nem az elektronszegény kettõs kötést oxidálta, hanem a reagens feleslegétõl függõen szulfoxid és szulfon termékeket adott.1,2 Ennek alapján a 6. Fejezetben vizsgált E-arilidén-flavanon epoxidokat Lévai és munkatársai DMD-vel reagáltatták, melynek során a reagens feleslegétõl függõen szulfoxidokat és szulfonokat nyertek. Az oxidációs lépések teljesebb áttekinthetõsége miatt a 6. Fejezetben már ismertetett reakciólépéseket is tartalmazza az 1. Ábra. Munkám során a feltételezett termékek azonosítását és teljes szerkezetvizsgálatát végeztem el. Az NMR vizsgálatok alapján megállapított szerkezeti sajátságokat kvantumkémiai számítások igazolták.

7.3 Jelhozzárendelés A teljes 1H és 13C jelhozzárendelést rutin kétdimenziós mérések alapján végeztem el: gsHSQC, gs-HMBC, gs-1H,1H-COSY. Mivel a vegyületek oxigén atomokat is tartalmaznak (4 és 5 esetében hármat, 6 és 7 esetében négyet), ezért a

17

O NMR spektrumok is felvételre

kerültek, ahol a detektált jelek hozzárendelése irodalmi adatok alapján történt.3 A kapott eredményeket az 1-4. Táblázatok foglalják össze. A proton spektrum általános jellemzõ sajátsága a H-5 rendkívül nagy eltolódású dublett jele, ami a peri-helyzetben lévõ karbonilcsoport hatása. A 4.3 – 5.2 ppm tartományban két szingulettet találunk, melyek a H-2 és H-3’ atomokhoz tartoznak. Megkülönböztetésükhöz azt vettem figyelembe, hogy az epoxidgyûrûben elhelyezkedõ CH-csoportok esetén az egykötésen keresztüli heteronukleáris csatolás nagysága lényegesen nagyobb, kb. 180 Hz körüli.

72

trans,cis Ph H

S

S i. NaOCl ii. H2O2 / NaOH

8 5

8a 4a

1 4

R

1 1-7 R

H

O

a H

2

b +

c +

d +

e +

O

2 3

O

f

trans,trans

Ph H

4 1

3'

Ph H

S

+

+

R

H

3

O

O

DMD

R H

DMD

+

4 -Me 4 -OMe 4 -F 2 -OMe 2 -Cl

O

O Ph H

S

O O

Ph H

S

R

O

H

O

4

5 DMD

O

O S

O

6

R H

O

DMD

O

O

Ph H

S

R H

O

O

Ph H R H

7

1. Ábra: Z-3-arilidén-tioflavanonok vizsgált oxidációs termékei

A 13C-csatolt HSQC spekrum felhasználásával megállapítottam, hogy H-3’ kémiai eltolódása mindig nagyobb, mint a 2-es helyzetben lévõ protoné. Ezek alapján az is bizonyítottá vált, hogy az oxidáció során az epoxid-gyûrû megmaradt. 5 és 7 esetében a karbonil-csoport anizotróp effektusa következtében 0.2 ppm értékû lowfield eltolódást tapasztalunk a H-3’ atomon. A 2 és 3’ helyzetekhez kapcsolódó aromás gyûrûk egyértelmû megkülönböztetését H2 és H-3’ atomokról történõ HMBC keresztcsúcsok szolgáltatják. Az egyes spinrendszereket és az azokon belüli kapcsolódási sorrendet a COSY mérések alapján állapítottam meg. A SOés SO2-csoportok –M-effektusa 0.5 – 0.6 ppm paramágneses eltolódást indukál a H-6 atomon, míg a C-6 atom egy kb. 7-8 ppm nagyságú kémiai eltolódás csökkenést szenved a megfelelõ 2 és 3 kiindulási vegyületekkel összehasonlítva.

73

2 3' 5 6 7 8 2+ +

3 4+ +

5 6+

4a 4.66 4.78 8.36 7.68 7.64 7.56

4b 4.68 4.75 8.37 7.69 7.64 7.56

4c 4.66 4.72 8.35 7.68 7.64 7.55

4d 4.60 4.73 8.35 7.69 7.64 7.56

4e 4.68 5.00 8.36 7.68 7.63 7.56

4f 4.64 4.99 8.35 7.70 7.66 7.60

5a 4.70 4.92 8.25 7.77 7.61 7.48

5b 4.70 4.90 8.25 7.72 7.61 7.49

5c 4.68 4.88 8.25 7.72 7.61 7.49

5d 4.63 4.90 8.26 7.75 7.63 7.50

5e 4.64 5.01 8.28 7.73 7.60 7.48

5f 4.67 5.08 8.29 7.76 7.64 7.52

7.44 7.34 7.36 7.43 7.15 7.04 7.06 7.12 7.43 7.25 6.96 7.12 6.97 7.47 7.07 6.89 6.61 6.78 6.34 6.93 7.42 7.38 7.35 7.06 7.08 7.08 7.43 7.25 6.96 7.12 6.96 7.27 7.07 6.89 6.61 6.78 6.86 7.21

7.44 Me 2",6" 7.16 3",5" 7.23 4" 7.22

7.34 7.36 7.43 7.12 7.20 2.41 3.85 3.84 7.17 7.16 7.16 7.17 7.17 7.24 7.2 7.23 7.23 7.23 7.21 7.2 7.22 7.21 7.22

7.15 6.60 6.93 6.99

7.04 2.20 6.63 6.95 7.01

7.06 3.70 6.64 6.96 7.01

7.12 6.62 6.97 7.03

7.36 3.43 6.62 6.90 6.99

7.46 6.62 6.94 7.02

1. Táblázat: A 4 és 5 szulfoxid izomerek 1H kémiai eltolódásai kloroform-d oldószerben

2 3' 5 6 7 8 2+

6a 4.46 4.79 8.35 7.78 7.76 7.82

6b 4.47 4.75 8.35 7.80 7.76 7.83

6c 4.45 4.73 8.34 7.78 7.76 7.82

6d 4.37 4.74 8.34 7.79 7.77 7.83

7.41 7.29 7.32 7.40

6e 4.47 4.98 8.35 7.77 7.74 7.83

6f 4.46 4.99 8.35 7.80 7.70 7.85

-

-

7a 4.40 5.05 8.27 7.82 7.77 7.84

7b 4.40 5.01 8.25 7.81 7.76 7.83

7c 4.38 4.99 8.25 7.81 7.76 7.83

7d 4.34 5.01 8.26 7.83 7.78 7.84

7.07 6.95 6.97 7.04

7e 4.34 5.11 8.27 7.82 7.76 7.82

7f 4.36 5.12 8.29 7.84 7.79 7.85

-

-

+

7.46 7.27 6.99 7.16 7.00 7.51 7.10 6.90 6.62 6.79 6.31 6.92

+

7.46

3 4

+

5

7.46 7.41 6 Me 2",6" 7.20 3",5" 7.29 4" 7.29 +

-

-

-

7.27 7.29 2.42 7.19 7.28 7.28

6.99 7.32 3.87 7.19 7.28 7.28

7.16 7.40 7.19 7.29 7.27

7.42 7.40 7.15 6.99 7.08 3.85 7.19 7.29 7.27

7.31 7.16 7.19 7.28 7.29

7.10 7.07 6.62 6.98 7.10

-

-

-

6.90 6.95 2.23 6.64 6.98 7.10

6.62 6.97 3.71 6.65 7.00 7.10

6.79 7.04 6.64 7.01 7.12

2. Táblázat: A 6 és 7 szulfon izomerek 1H kémiai eltolódásai kloroform-d oldószerben

74

7.12 7.14 6.91 7.36 3.32 6.61 6.95 7.08

7.28 7.48 6.60 6.98 7.11

4a

4b

4c

4d

4e

4f

5a

5b

5c

5d

5e

5f

2

61.2

61.2

61.5

61.3

61.7

61.9

65.3

65.2

65.3

65.4

65.9

65.9

3

60.8

60.3

61.2

60.8

60.9

61.1

59.1

59.1

59.2

59.1

59.0

59.4

3'

67.5

67.7

67.9

66.9

65.1

65.6

60.9

61.0

61.0

60.5

58.9

59.5

4

189.5 189.6 189.8 189.3 189.7 189.1 190.1 190.2 190.2 189.9 190.3 189.5

4a

131.7 131.8 132.1 131.7 131.7 131.4 130.7 131.7 131.8 131.6 131.9 131.5

5

129.6 129.6 129.8 129.7 129.6 129.7 129.9 129.9 129.9 130.0 130.0 130.1

6

133.1 133.1 133.4 133.1 132.9 133.0 133.4 133.4 133.4 133.5 133.3 135.5

7

135.1 135.2 135.4 135.2 135.0 135.2 134.6 134.6 134.6 134.7 134.4 134.6

8

131.2 131.2 131.5 131.2 131.4 131.2 130.7 130.7 130.8 130.8 130.7 130.8

8a

140.1 140.1 140.2 140.0 140.1 140.5 141.9 141.9 141.9 141.9 142.1 142.1

+

133.1 130.2 125.4 129.0 121.7 131.0 132.9 129.6 124.7 128.6 121.5 131.1

+

127.6 127.5 129.1 129.4 159.4 135.2 126.4 126.4 127.8 128.2 157.8 133.8

+

128.x 129.2 114.2 115.5 111.0 130.0 127.8 128.6 113.4 115.0 109.2 129.0

+

129.0 138.9 160.4 163.1 130.3 130.1 128.3 138.2 159.6 162.6 129.7 129.7

+

128.x 129.2 114.2 115.5 119.9 126.3 127.8 128.6 113.4 115.0 120.0 126.5

+

127.6 127.5 129.1 129.4 126.7 127.5 126.4 126.4 127.8 128.2 126.4 127.1

1

2 3 4 5 6

Me 1"

-

21.3

55.5

-

55.8

-

21.1

129.2

-

54.4

-

129.7 129.8 130.0 129.5 130.0 129.6 128.6 128.8 129.2 128.6 128.7 128.2

2",6" 128.x 128.3 128.6 128.3 128.5 128.5 128.2 128.4 128.3 128.3 128.5 128.4 3",5" 129.2 129.1 129.4 129.2 129.1 129.2 128.4 128.3 128.5 128.5 127.9 128.3 4" S=O epoxi

129.0 128.5 128.7 128.6 128.4 128.6 128.0 128.0 128.1 128.3 127.8 128.3 55.1 43.5

64.2 64.2

C=O 539.2

545.2

3. Táblázat: A 4 és 5 szulfoxid izomerek 13C és 17O kémiai eltolódásai kloroform-d és toluol-d6 oldószerekben

75

6a

6b

6c

6d

6e

6f

7a

7b

7c

7d

7e

7f

2

66.2

66.2

66.5

66.3

66.4

66.3

68.5

68.4

68.6

68.5

69.0

69.0

3

64.2

64.4

64.7

64.3

64.2

64.2

63.7

63.78

64.0

63.7

63.6

63.7

3'

68.3

68.5

68.7

67.7

66.0

66.5

62.9

63.0

63.1

62.4

60.9

61.4

4

6

188.6 188.7 188.9 188.4 188.7 188.1 188.0 188.1 188.2 187.8 188.2 187.3 1 132.1 130.6 130.8 130.5 130.5 130.3 132.3 132.3 132.5 132.3 132.6 132.3 3 128.7 128.8 129.9 128.8 129.2 128.9 129.0 128.9 129.0 129.0 129.0 129.2 4 7 5 133.9 133.9 134.1 133.9 133.7 133.9 134.0 133.9 134.0 134.0 133.9 134.1

7

3 135.3 135.3 135.5 135.4 135.2 135.5 135.2 135.1 135.2 135.3 134.9 135.2

8

124.8 124.9 125.1 124.9 124.9 125.0 125.4 125.3 125.5 125.4 125.4 125.5

8a

138.5 138.7 138.8 138.5 138.7 138.7 138.8 138.8 138.9 138.7 138.8 138.9

+

1

132.1 130.2 124.3 128.0 120.8 130.1 131.9 129.0 124.0 127.8 120.7 130.3

2+ 3

127.3 127.3 128.9 129.3 159.4 135.2 126.3 126.2 127.7 128.1 157.7 133.9 3 128.6 129.5 114.5 115.9 111.1 130.2 128.0 128.7 113.7 115.1 109.2 129.1

4+

129.4 139.5 161.0 163.3 130.7 130.6 128.6 138.5 159.9 162.7 130.0 130.0

+

5

128.6 129.5 114.5 115.9 120.0 126.6 128.0 128.7 113.7 115.1 120.0 126.7

6+

127.3 127.3 124.3 129.3 126.5 127.3 126.3 126.2 127.7 128.1 126.1 126.9

4a 5

+

Me

-

21.4

55.5

-

55.6

-

-

21.1

55.4

-

54.4

-

1"

128.7 128.9 129.1 128.6 129.1 128.6 128.8 128.9 129.0 128.8 128.8 128.3 5 2",6" 129.5 129.6 129.8 129.5 129.6 129.6 128.7 128.8 128.9 128.7 128.9 128.7 3",5" 128.9 129.0 129.2 129.0 128.9 128.9 128.3 128.2 128.4 128.4 127.7 128.3 4"

129.3 129.3 129.5 129.4 128.7 129.4 128.7 128.6 128.8 128.9 128.3 128.9

S=Oax 143.6 S=Oeq 180.9

138.8 182.2

epoxi

56.7

77.9

C=O 545.3

555.5

4. Táblázat: A 6 és 7 szulfon izomerek 13C és 17O kémiai eltolódásai kloroform-d és toluol-d6 oldószerekben

76

7.4 Szerkezeti sajátságok vizsgálata

7.4.1 Konformációs vizsgálatok

A heterogyûrû mozgékonyságát figyelembe véve mind transz ,cisz, mind transz,trans z izomerek esetében a HF ab-initio számítások során megkapott két konformert vettem figyelembe, melyeket 6a és 7a vegyületek esetében a 2. Ábrán tûntettem fel a számított relatív energiákkal együtt. Mint látható mindkét izomer esetében a 2-fenil-csoportot axiális helyzetben tartalmazó csavart boríték-A konformerek a stabilisabbak. A csavart boríték-B (transz ,cisz izomer) és boríték-B (transz,transz izomer) konformerek számított energiái 5.2, illetve 3.3 kcal/mol-lal nagyobbak, ami ezen konformerek (ekvatoriális 2-fenil-csoport) spektrális hatásának megfigyelését valószínûtlenné teszik. transz,cisz 6a

Ph O H O

H

O

S O

S PhO

O

O

H

Ar

H

O

Ar

csavart boríték-A

csavart boríték-B

Erel

Erel = 5.20 kcal/mol

= 0.00 kcal/mol

φcalc[O-C(4)-C(4a)-C(8a)] = 205.0o

φcalc[O-C(4)-C(4a)-C(8a)] = 169.8o transz,transz 7a

H

Ph H O H

Ar O

O

O O

S

S O Ph

O Ar O H csavart boríték-A Erel = 3.03 kcal/mol

boríték-B rel E = 6.34 kcal/mol φcalc[O-C(4)-C(4a)-C(8a)] = 186.5o

φcalc[O-C(4)-C(4a)-C(8a)] = 168.9o

2. Ábra: A 6 és 7 vegyületek számított konformációs egyensúlya

77

A heterogyûrû inverziója a 2-es helyzetû fenil-csoport kvázi axiális (A konformerek) és kvázi ekvatoriális (B konformerek) átalakulásával jár. Tóth és munkatársai korábban megállapították, hogy a H-2 és C-8a atomok között mért csatolási állandó értéke indikatív a 2fenil-csoport térbeli pozíciójára. Egy közel 8 Hz-es érték kb. 180º -os, míg az 1 Hz körüli érték egy 80º -hoz közeli φ(H(2)-C(2)-S-C(8a)) diéderes szöggel függ össze.4-7 A heteronukleáris csatolási állandók meghatározásához különbözõ mérési módszereket használtam: GSQMBC,8 proton detektált távolható 13C,1H korrelációs mérést,9,10 valamint az általam legjobbnak talált (lásd a csatolási állandók mérésével foglalkozó 4. Fejezetet) broadband J-HMBC-nek nevezett J-skálázott HMBC verziót.11 Példaként az 5b vegyületrõl készített J-HMBC mérés eredményét mutatom be (3. Ábra). A mért 3J(C-8a,H-2) csatolási állandókat 4-7 vegyületek esetében az 5. Táblázat tartalmazza.

3. Ábra: Az 5b vegyület broadband J-HMBC spektruma, skálafaktor = 20

78

a b c d e f

4 6.5 6.2 6.3 6.4 6.2 6.4

5 6.5 6.4 6.3 6.5 6.3 6.5

6 3.2 3.0 3.2 2.3 3.1 2.9

7 3.4 2.8 3.0 2.0 2.0 2.4

5. Táblázat: 3J(C-8a,H-2) csatolási állandók nagyságai 4-7 esetén

A mért értékek alapján megállapítottam, hogy a 4 és 5 szulfoxid vegyületek esetében (6.2 – 6.5 Hz-es értékek) a 2-es helyzetû fenil-csoport axiális állású. Azonban a 6 és 7 szulfon vegyületek esetében a mért csatolási állandót és a diéderes szög - 3J(C-8a,H-2) összefüggést megadó Karplus-típusú függvényt figyelembe véve azt kaptam, hogy az A és B típusú konformerek aránya kb. 1:1. Ez a szerkezet-felderítés jelen állásánál ellentmondásban áll a számítások által kapott feltételezett szerkezetekkel 6 és 7 esetében. Az ellentét feloldására további spektrális bizonyítékokra volt szükség. A térközelségek mérésére alkalmas 2D NOESY alapján megállapítottam, hogy a H-2 és a H-2+,6+ protonok térközelben találhatók a transz ,transz izomerekben (5 és 7), amely a csavart boríték-A konformer meglétét, azaz a fenil-csoport axiális állását bizonyította. A C-3’ atom kémiai eltolódása szintén jól látható összefüggésben van a konformációs viszonyokkal. Transz,transz izomerek (5 és 7) esetében egy 5-6 ppm nagyságú γ-gauche-effektus lép fel mind A, mind B típusú konformer esetében, ekkor a mért kémiai eltolódás 61 ppm körüli. Transz,cisz vegyületeknél a mért érték 68 ppm körüli, ami azt jelenti, hogy itt nem lép fel γgauche-effektus. Ha megvizsgáljuk a két lehetséges konformációtípust (A és B), akkor azt tapasztaljuk, hogy csak az A típusú, azaz a fenil-csoportot axiális helyzetben tartalmazó, konformer esetében nem tapasztaljuk a kémiai eltolódást csökkentõ effektust. Amint a fentiek alapján láthatjuk 6 és 7 esetben a 3J(C-8a,H-2) csatolási állandó alapján megállapított konformációs viszonyok nem helytállóak, mivel a többi módszer alapján egyedül a csavart boríték-A a kedvezményezett konformer. Ennek az érdekes jelenségnek a részletesebb tanulmányozásához tioanizolt, valamint annak szulfoxiddá és szulfonná oxidált származékait vizsgáltam. A 4. Ábrán a metil-csoport, valamint az ipszo helyzetû szénatom közötti csatolási állandót mutatom be a kénatom különbözõ oxidációs fokának függvényében.

79

A mérések „hitelességének” bizonyítékaként az alsó sorban néhány, elkülönült keresztcsúcsot adó korreláció szerepel.

4. Ábra: A 3J(C-1,Me) csatolási állandók tioanizol, valamint oxidációs származékainál (felsõ sor), a mérések jóságát bizonyítandó, az adott vegyületen belüli egyéb csatolási állandók (alsó sor)

Amint látható, tionaizol esetében a mért 3J(C-1,Me) csatolási állandó értéke 3.9 Hz, ami a három metil-proton csatolási állandójának átlaga. Az elsõ lépésben bevitt oxigén atom csupán kis mértékben csökkenti a csatolási értékeket. Azonban a második oxigén bevitele után a csatolási állandók átlaga 1 Hz-nél kisebb értékre csökken. Ezek alapján megállapítottam, hogy szulfon-csoporton keresztül mért csatolási állandók nem használhatók konformációs vizsgálatokra. Azaz 6 és 7 vegyületeknél a konformációs viszonyok vizsgálatánál el kell tekintenünk a 3J(C-8a,H-2) csatolási állandók felhasználásától.

80

7.4.2. Konfigurációs vizsgálatok

A 4 és 5 vegyületekben a szulfoxid-csoport megjelenésével egy új sztereogén centrum is jelentkezik a kénatom személyében, így az S=O csoportnak a 2-fenil-csoporthoz viszonyított relatív állását is fel kell deríteni. Mivel az 1H és 13C spektrumok csupán egy-egy jelsorozatot tartalmaznak, ezért rögtön megállapíthatjuk, hogy a szulfoxidokhoz vezetõ reakció erõsen sztereoszelektív. Mivel nem állt rendelkezésemre olyan diasztreomer modellvegyület, amelyekben az S=O csoportok oxigénje axiális, illetve ekvatoriális helyzetben található, valamint csak az NMR adatok alapján nem találtam egyértelmû bizonyítékot a S=O csoport állására nézve, ezért ennek a problémának a megoldásánál a kvantumkémiailag számított adatokat is figyelembe kellett vennem. Mivel magának az S=O csoportnak a konfigurációjára vagyunk kíváncsiak, ezért célszerûnek láttam az oxigén atom kémiai eltolódását vizsgálni. A 17O spektrum három jelen tartalmaz: a karbonil-csoport oxigénje 541 ppm körül bukkan fel, míg az epoxid-gyûrû és a szulfoxid-csoport oxigénje a 40-65 ppm-es tartományban helyezkedik el. A

17

O kémiai

eltolódások GIAO-módszerrel kerültek számításra12 mindkét diasztereomer esetében. A 6. Táblázat ezeket az adatokat mutatja be.

Mért értékek S=O

S=O

Számított értékek SO2

S=Oaxiális

S=Oekvat.

SO2

4a

5a

6a

7a

4a

5a

4a

5a

6a

7a

55.1

64.2

143.6

138.8

28.5

38.5

-13.0

-12.9

111.3

113.6

180.9

182.2

148.9

153.0

epoxi

43.5

64.2

56.7

77.9

12.6

33.8

16.3

21.2

21.3

34.7

C=O

539.2

545.2

545.3

555.5

544.6

545.6

537.4

537.5

550.3

549.7

6. Táblázat: Mért és számított 17O kémiai eltolódások 4a-7a vegyületek esetén.

A mért és számított adatok összehasonlítása alapján az S=O csoport axiális állása valószínûsíthetõ. A számított és mért értékek között ebben az esetben is van eltérés, azonban az egyes számított mennyiségek különbsége nagyon jól igazodik a mért értékek

81

különbségéhez. Amint láthatjuk a karbonil-csoport esetében nagyon jó egyezést is tapasztalhatunk. Az S=O-csoport axiális állását bizonyította az S=O csoportnak a H-8 protonra ható anizotróp effektusának számítása is. Ugyanis az S=O axiális elhelyezkedése esetén a számított effektus +0.26 ppm nagyságú 4a és 5a esetében, míg ekvatoriális állás esetén az effektus csak szerény, +0.03 ppm-es nagyságban lép fel. Ha összevetjük a 4a és 5a vegyületekben szereplõ H-8 kémia eltolódásokat (7.56 és 7.49 ppm) a kiindulási 2a és 3a vegyületekével (7.22 és 7.29 ppm), akkor egyértelmûvé válik, hogy a H-8 kémia eltolódásának megnövekedéséért az axiális helyzetbe belépõ oxigén a felelõs. Az összehasonlítást megtehetjük, hiszen majdnem teljesen azonosak a vegyületpárok konformációs viszonyai. Hasonló vizsgálatot folytattunk a H-2 proton esetében is, azonban itt azt találtuk, hogy az S=O állásától függetlenül a H-2-n fellépõ anizotrop effektus kb. +0.35-0.38 ppm nagyságú. Ez közelítõleg meg is felel a mért értékeknek. A DMSO modellvegyület segítségével számított anizotrop kúpot az 5. Ábrán mutatom be.

5. Ábra: Az S=O csoport anizotrop kúpja 5a esetén (sárga: -0.1 ppm, piros: +0.1 ppm nagyságú effektus)

82

Mindezek alapján bizonyítottá vált, hogy 4a és 5a szulfoxidok létrejöttekor a kén atomhoz kapcsolódó oxigén atom az axiális helyzetet foglalja el. Ez teljes egyezésben van azzal, hogy a DMD-vel történõ oxidáláskor az átmeneti állapot nagy térigényû, így a belépõ oxigén atom a kevésbé zsúfolt oldalról, azaz a 2-fenil-csoporttal ellentétes irányból közelíti meg a kén atomot. Érdekes megemlíteni azt a tényt is, hogy a transz ,cisz izomerek (4 és 6) esetében a H2”/6” protonok kémiai eltolódása kb. 0.5 ppm-el nagyobb, mint a transz ,transz (5 és 7) párjaiké. Ennek vizsgálatára az oxirán-gyûrû anizotrop effektusát számoltuk a két-két izomer kitüntetett konformerére. A 2-fenil-csoport forgása tiltott volt, így H-2” és H-6” esetében másmás eredményt kaptunk, melyek átlagát hasonlítottuk a mért értékekkel össze. Az eredményeket a 7. Táblázat, míg a számított anizotrop kúpot a 6. Ábra mutatja be.

Vegyület

4a

Anizotrop effektus [ppm] +0.23 (0.01)

6a

Anizotrop effektus [ppm] +0.24 (0.01)

5a

-0.18 (-0.03)

7a

-0.19 (-0.03)

Ää

-0.41 (-0.04)

Ää

-0.43 (-0.04)

Äämért

-0.56

Äämért

-0.58

Vegyület

7. Táblázat: Az oxirán gyûrû anizotrop effektusa H-2” (H-6”) protonokra

6. Ábra: Az oxirán-gyûrû anizotrop kúpja, valamint hatása H-2” és H-6” protonokra (sárga: -0.1 ppm, piros: +0.1 ppm nagyságú effektus)

83

7.5 Összefoglalás Megállapítottam, hogy a transz ,cisz és transz ,transz Z-3-arilidén-1-tioflavanon epoxidok (2 és 3) dimetil-dioxiránnal történõ oxidációjakor az oxidálószer a kénatomot oxidálta, a reagens feleslegétõl függõen, szulfoxid-, illetve szulfon-csoporttá. Az epoxid-csoport megmaradt a reakció során. Távolható csatolási állandók segítségével felderítettem az egyes termékek konformációs sajátságait. Megállapítottam, hogy minden vegyület (4-7) esetében a csavart boríték-A konformer a kitüntetett. A 4 és 5 vegyületeknél

17

O NMR mérésekkel és

kvantumkémiai számítások segítségével megállapítottam a reakció során létrejött új sztereogén centrum relatív konfigurációját. A belépõ oxigén atom az axiális helyzetet foglalja el, melynek tényét az utólagosan elvégzett röntgenfelvétel is igazolt.

A tématerülettel kapcsolatban megjelent közlemények, elõadások (E) és poszterelõadások (P): József Kovács, Gábor Tóth, András Simon, Albert Lévai, Andreas Koch, Erich Kleinpeter, Magn. Reson. Chem., in press

Albert Lévai, Tamás Patonay, Gábor Tóth, József Kovács, József Jekõ, J. Heterocycl. Chem. 2002, 39: 817.

József Kovács, Gábor Tóth, András Simon, Albert Lévai, Erich Kleinpeter, Stereochemistry of 3-arylidene-1-thioflavan-4-on sulfoxides and sulfones by 1H, 13C, 17O NMR and quantumchemical calculations, 17th NMR Valtice, Central European NMR Discussion Groups, Valtice, Czech Republik, 8-10. 04. 2002. (E)

József Kovács, Gábor Tóth,András Simon, Albert Lévai, Erich Kleinpeter, Structure elucidation 3-arylidenE-1-thioflavan-4-on sulfoxides and sulfones by NMR and quantumchemical calculations, Central European NMR Symposium and Bruker NMR Users Meeting, Budapest, 2-3. 09. 2002. (P)

84

7.6 Irodalomjegyzék

[1] a) Auwers K, Arndt F. Ber dtsch Chem. Ges. 1909, 42: 2706; b) Arndt F, Fleming W, Scholz E, Löwensohn V. Ber dtsch Chem. Ges. 1923, 56: 1269; c) Bierne JJ and O’Sullivan WI. Proc. Roy. Irish. A cad. 1977, 77B: 331. [2] Adam W, Golsch D, Hadjiarapoglou L, Lévai A, Nemes C, Patonay T. Tetrahedron 1994, 46: 13113. [3] Duddeck H, Tóth G, Simon A. Chemical Shifts and Coupling Constants for Oxygen-17, Landolt-Börnstein, New Series III/35E, Springer, 2002. [4] Nemes C, Lévai A, Patonay T, Tóth G, Boros S, Halász J, Adam W, Golsch D. J. Org. Chem. 1994, 59: 900. [5] Adam W, Halász J, Lévai A, Nemes Cs, Tóth G. Liebigs. A nn. Chem. 1994, 795. [6] Tóth G, Szöllõsy Á, Lévai A, Oszbach Gy, Dietrich W, Kühne H. Magn. Reson. Chem. 1991, 29: 801. [7] Tóth G, Lévai A, Szöllõsy Á, Duddeck H. Tetrahedron , 1993, 49: 863. [8] Marek R, Kralik L, Sklenaø V. Tetrahedron Lett., 1997, 33: 665. [9] Stelten J, Leibfritz D. Magn. Reson.Chem. 1995, 33: 827. [10] Okogun JI, Duddeck H, Habermehl G, Krebs HC, Tóth G, Simon A. Magn. Reson. Chem. 1998, 36: 371. [11] Meissner A, Sørensen OW. Magn. Reson. Chem. 2001, 39: 49. [12] Ditchfield R. Mol. Phys. 1974, 27: 789.

85

8. Összefoglalás

Doktori munkámhoz kapcsolódóan 4 közlemény jelent külföldi folyóiratokban, további 1 közlemény elfogadásra került. Eredményeimet 3 angol nyelvû és 1 magyar nyelvû elõadásban, valamint 5 angol nyelvû poszteren ismertettem különbözõ nemzetközi konferenciákon. Dolgozatom elkészítése közben számos német, cseh, egyiptomi kutatóval kerültem kapcsolatba, akikkel sikerült széleskörû együttmûködési kapcsolatot megvalósítani, így a jövõre nézve is kedvezõek a kooperációs lehetõségek. Doktori dolgozatomban röviden összefoglaltam a távolható csatolási állandók meghatározásához szükséges azon módszereket, melyeket elsõsorban Prof. Bergernél eltöltött fél éves lipcsei tartózkodásom alatt ismertem meg. A módszereket gyakorlatban is kipróbáltam és optimalizáltam a kutatócsoport NMR mûszerén. Meghatároztam két, Calotropis proceraból Egyiptomban izolált szteroid-glikozid szerkezetét, melyek az 5α-kardenolidok családjába tartoznak. A vegyületek alapváza mindkét esetben az uzarigenin (3β, 14β-dihidroxi-5α-kard-20(22)-enolid), melyhez 3-as helyzetben 6dezoxi-β-D-allopiranozil-[1,4]-β-D-glükopiranóz, valamint β-D-glükopiranozil-[1,2]-β-Dglükopiranóz egységek kapcsolódnak. Ezek közül az elõbbi egy teljesen új természetes vegyületnek bizonyult. Csoportunk

Debreceni

Egyetemmel

való

kooperációs

munkájának

részeként

megállapítottam, hogy a Z-3-arilidén-1-tioflavanonok nukleofil oxidálószerekkel történt reakciója

során

megkülönböztetésére

transz ,cisz egyértelmû

és

transz ,transz NMR

spektrális

izomerek adatokat

keletkeznek, találtam.

melyek

Legstabilabb

konformerként a boríték-A konformert azonosítottam, míg az aromás csoportok forgása nem korlátozott. Megállapításaimat kvantumkémiai számítások is igazolták, melyeket a Potsdami Egyetemen végeztek együttmûködésünk részeként. Az fenti kooperációs munka következõ lépéseként megállapítottam, hogy a transz ,cisz és transz ,transz Z-3-arilidén-1-tioflavanon epoxidok dimetil-dioxiránnal történõ oxidációjakor az oxidálószer a kénatomot oxidálta, a reagens feleslegétõl függõen, szulfoxid-, illetve szulfon-csoporttá. Az epoxid-csoport megmaradt a reakció során. Távolható csatolási állandók segítségével felderítettem az egyes termékek konformációs sajátságait. Megállapítottam, hogy a vizsgált vegyületek esetében a csavart boríték-A konformer a kitüntetett. Szulfoxidok esetében 17O NMR mérésekkel és kvantumkémiai számítások segítségével megállapítottam a reakció során létrejött új sztereogén centrum relatív konfigurációját. A belépõ oxigén atom az axiális helyzetet foglalja el.

86

9. Köszönetnyilvánítás

Doktori értekezésem megírásában nagyon sokan segítségemre voltak, akiknek itt szeretnék köszönetet mondani. Munkám során a legtöbb segítséget témavezetõmtõl, Dr. Tóth Gábortól, a kémiai tudományok doktorától kaptam, aki doktoránsi éveim alatt önzetlenül és rendkívül sokoldalúan irányította munkámat. Köszönettel tartozom azoknak a magyar és külföldi szerves kémikusoknak, akik az általam vizsgált vegyületeket elõállították, illetve izolálták. Dr. Lévai Albertnek a Debreceni Egyetem Szerves Kémia Tanszék professzorának, Dr. Helmut Duddecknek a Hannoveri Egyetem Szerves Kémiai Intézetének tanszékvezetõ professzorának, Dr. Atef G. Hannanak, Dr. M. Hani A. Elgamalnak és Dr. Nagy A. M. Morsynak, az egyiptomi Nemzeti Kutatási Centrum munkatársainak. Valamint Dr. Erich Kleinpeternek, Dr. Andreas Kochnak, a Potsdami Egyetem munkatársainak a kvantumkémiai számításokért és Dr. Stefan Bergernek, a Lipcsei Egyetem tanszékvezetõ professzorának, akitõl féléves tartózkodásom során sokmindent tanultam. Az értekezés elkészítésében nagy segítségemre voltak kutatócsoportunk tagjai, Dr. Szöllõsy Áron, Dr. Balázs Barbara, Dr. Simon András és Gáti Tamás, akik nap mint nap hasznos tanácsokkal láttak el. Külön köszönet illeti Dr. Pokol Györgyöt, a Budapesti Mûszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Általános és Analitikai Tanszékének vezetõjét, aki lehetõvé tette, hogy munkámat a tanszéken folytassam, Dr. Gál Sándort, a Varga József Alapítvány által nyújtott támogatásért, valamint a Gyógyszerkutató Intézet vezetõit, akik szintén hozzájárultak dolgozatom elkészítéséhez. Végül, de nem utolsó sorban köszönetemet fejezem ki szüleimnek és testvéremnek, akik nélkül ez az értekezés soha nem jött volna létre.

87