0e£rooi?aad
Nederland
[54J
[19]
NL
W e r k w i j z e w o w het bgreiden v a n easi reagens v o o r r a d i o ï m m u n o l o g i s c h e
tepsÈOT® van testosteron. IS1J
Int.C! 2 .: C07C169/14,
[71 i
Aanvrager: istituto F^rrnacologico S e r o n o S . p A fe Rome.
^
[741 Gem.: Ir, H.J.G. Ups c.s. Octrooi- er» Merkenbureau Hartevelt Amsteldijk 14
Amsterdam.
[21]
Aanvrage Nr. 7314599.
[22]
Ingediend 24 oktober 1J73.
[32]
--
[33]
--
[31]
--
[23]
--
[61]
--
[62]
--
[43]
Ter inzage gelegd 28 april 1975.
De aan dit blad gehechte stukken zijn een a f d r u k v a n de oorspronkelijk ingediende; beschrijving met conciusie(s) én eventuele tekening(en).
Aanvrageri Ijéstituto Farmacologico Serono S.p.A., Rome, Italië
' •
/
Sejnachtigde: Octrooi- en Merkenbureau Hartevelt (Ir.H.J.G.Lips c. Amsteldijk 14T Amsterdam., Ingeroepen recht van voorrang: geen Korte aanduiding; Werkwijze voor het bereiden van een reagens voor radioimmunologische bepaling \an testosteron
De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een reagens voor radioiromunologische bepaling van testosteron. Immunologische hormoonbepalingen berusten op het vermogen van een bepaald hormoon om bij een gegeven immunologische reactie als antigeen te werken. Op dit principe zijn onlangs radioimmunologische bepalin- . gen ontwikkeld, waarbij een niet-bekende hoeveelheid van een te bepalen niet-gelabeld (koud) hormoon in aanwezigheid van de bekende hoeveelheid van hetzelfde gelabelde (gemerkte) hormoon met een geschikte hoeveelheid van een specifiek antiserum wordt geincubeerd. Een niet bekende hoeveelheid hormoon kan uit het radioactiviteitsgetal van het antigeen-antilichaamcomplex door vergelijking met een standaardkromme, die vooraf
731^ 5 99
is vervaardigd dooïf gebruik van bekende hoeveelheden van het specifieke antiserum, het "koude" hormoon en het gelabelde hormoon,, gemakkelijk worden bepaald, waarbij het koude en het gelabelde hormoon evenredig (dab wil zeggen in verhouding tot dfe respektievelijke hoeveelheden) hebben bijgedragen tot de worming van het antigeen-antilichaamcomptex. Het radloaelëiviteitsgetal van het antigeen-antiXichaafflcoaplex is osagekeerd evenredig met de .bij het reactiemengsel gevoegde: hoeveelheid koud hormoon,, waarbij de hoeveelheden antiserum en gelabeld hormoon ongewijzigd blij
10
Door Oliver et 'alo, wordt in J.Clin. Investig. 47,1035 \) een radioimstttnologische bepaling voor steroidhor125 : monen* gebaseerd op.rhet gebruik van I-gelabeld steroideI
*.
'
; tyrosinemethylesteréonjugaten vooi^steld en in het bij15
zonder toegepast opw'het meten van farmacologische niveau's r
• van digitoxine in menselijk serum. ;
D'e JSij toepassing '*öp de radioimmunologische bepaling van testosteron van deze: techniek houdt dit de synthese in van
• het geconjugeerde t'§l3tosteron-3-(O-carboxymeth^l) oxiiiu20' tyrosinemethylester .(verder in de beschrijving aangeduid 125 als T-3-TME) , het mearken met I in de fenolfeyrosinering en gebruik als radilfictief middel bij de radioimmunologische • reactie.
's
De relatieve mollire activiteit van T-3-TME bij de 25
testosteron-3-radioifranunologie is gevonden door Midgley et al., Recent Progress in Hormone Research, 27/235 (1971)' en bedraagt 0*7 maal de activiteit van testosteron. Dit I A betekent, dat terwijl, een geconjugeerd steroid, zoals T-3-TME, zich weliswaar niet bindt met een antilichaam, dat exact
30
hetzelfde is als het oorspronkelijke steroid, de verschil; len, zoals deze aanwëzig zijn, klein zijn. Hieruit blijkt | duidelijk de bruikbaarheid van het T-3-TME conjugaat bij • de t&dioiiranulogieve Éepaling van testosteron. De syiüthese VSh ;T-3-TME is niet in het bijzonder beschreven.. De enige
35 j VÖörgestelde aiethodë^Ls de. isobutylchloorformiaatmethodè pC'gMfengd anhydride), ';die door Oliver et al. voor de 'synthese ^Wm
»q 3 y y
462
van 3-0-succinyldigitoxygenidetyrosinemethylesterconjugaat wordt beschreven. Wanneer deze gemengde anhydridemethode echter wordt toegepast op de synthese van T-3-TME, dan worden geen aantoonbare hoeveelheden produkt verkregen. 5
Volgens de uitvinding laat men testosteron-3-(O-carboxymethyDoxym.--: en tyrosinemethylester in aanwezigheid van N,N-dicyclohexylcarbodiimide in een apolair-; oplosmiddel ; reageren, waardoor het gewenste TME-conjugaat met hoge opbrengst wordt verkregen. Bij voorkeur wordt gebruik ge-
10
maakt van equimolaire hoeveelheden van de reagentia, een geringe molaire overmaat van N,N-dicyclohexylcarbodiimide, van apolaire oplosmiddelen, zoals methyleenchloride, N,Ndimethylformaide en chloroform en van een reactietemperatuur van ongeveer 0-25°C, in het bijzonder een reactietem-
1J5
peratuur van ongeveer 10°C. Na voltooiing van de reactie wordt het oplosmiddel verdampt en het residu wordt door herkristallisatie gezuiverd. Voorbeeld
20
Bij een suspensie van 2,31 g tyrosinemethylesterhydro3 chloride in 80 cm methyleenchloride voegde men onder roeren 3 1,4 cm triethylamine en na 30 minuten voegde men onder roeren 3,61 g testosteron -3-(O-carboxymethyl)oxim toe. Het reactiemengsel werd op een temperatuur van -10°C gekoeld, waarna 2,47 g N,N-dicyclohexylcarbodiimide werd
25
toegevoegd, vervolgens werd het reactiemengsel op een temperatuur van +10°C gebracht en gedurende 24 uur op deze temperatuur gehouden. Na filtreren en in vacuum droog in3 dampen werd het semivaste residu opgelost in 50 cm 50--%-ig ethanol, gefiltreerd en het filtraat werd onder vacuum
30
droog ingedampt, waardoor een olieachtige residu werd verkregen, dat als een kristallijne vaste stof werd neer3 geslagen door toevoeging van ongeveer 20 cm gedestilleerd water 3aan een oplossing, verkregen door het residu in 10 cm
35
95%-ig ethanol op te lossen. De opbrengst bedroeg
2,15 g (40%) kristallijn testosteron-3-0-carboxymethyl)oxim-TME, dat na herkristallisatie uit water-ethanol met
7314599
4
een smeltpunt van 94-95°C had. ; Analysewaarc&3 voor C ^ H ^ O g ^ '
C
H
N
j berekend
69,12%
7,86%
5,20%
; gevonden
68,95%
8,36%
5,06%
5
Het UV-spectrum en het IR-spectrum waren volledig in overeenstemming met de verwachte structuur voor T-3-TME. ! Het op bovenstaande wijze verkregen produkt werd met • 125 ; I gelöbeld volgens Greenwood et al.,. Biochen. J. 89,114 10 ji (1963), waardoor een reagent werd verkregen, dat geschikt | was voor radioimmunologische bepaling van testosteron-3 i en dat een grotè4.e specifieke activiteit had» t
C o n c l u s i e s 1.Werkwijze voor het bereiden van testosteron-3-(O-carboxy-
15
methyl) oxim-tyrosinemethylester, m e t
h e t
k e n m e r k ,
dat men testosteron-3-(O-carboxymethyl)oxim en de tyrosinemethylester in aanwezigheid van N,N-bicyclohexylcarbodiimide laat reageren in een apolair oplosmiddel bij een temperatuur 20 ' van 0-25°C, en het oplosmiddel wordt verdampt en het .ruwe residu wordt uitgekristalliseerd. • 2.Werkwijze volgens conclusie 1, m e t
h e t
k e n m e r k ,
;'dat methyleenchloride, N,N-dimethy1formamide of chloroform } ! als apolair oplosmiddel worden gebruikt. 25 j 3.Werkwijze volgens conclusie 1, m e t
het
k e n m e r k ,
| dat men equimolaire hoeveelheden testosteron-3-(O-carboxy• methyl)oxim en tyrosinemethylester in aanwezigheid van een !' geringe molaire overmaat N,N-dicyclohexylcarbodiimide laat ' reageren. i 30 . 4.Werkwijze volgens conclusie 1, m e t
h e t
k e n m e r k ,
. dat het ruwe residu wordt herkristalliseerd uit water-ethanol. ! I
75 1 4 5 9 9
