Differentiële effecten van testosteron en oestradiol op de eiwitsynthese in de skeletspier van de muis
Lars MEYERS
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. J.-M. Kaufman Begeleiders: Prof. Dr. Y. Taes en Drs. H. De Naeyer Vakgroep: Inwendige ziekten – Endocrinologie
Academiejaar 2011-2012
Differentiële effecten van testosteron en oestradiol op de eiwitsynthese in de skeletspier van de muis
Lars MEYERS
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. J.-M. Kaufman Begeleiders: Prof. Dr. Y. Taes en Drs. H. De Naeyer Vakgroep: Inwendige ziekten – Endocrinologie
Academiejaar 2011-2012
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
16 mei 2012
Lars Meyers
Prof.Dr. J.M.Kaufman
VOORWOORD
Het finaliseren van deze masterproef, als sluitstuk van mijn opleiding Biomedische Wetenschappen aan de UGent, was niet mogelijk geweest zonder de hulp van een aantal mensen, die ik bij deze wil bedanken. Eerst en vooral gaat mijn dank naar Prof.Dr. Kaufman en Prof.Dr. Taes omwille van de mogelijkheid die ze mij geboden hebben om mee te kunnen werken aan het onderzoek in het labo endocrinologie. Mijn bijzondere dank gaat uit naar Hélène De Naeyer, zonder wiens ondersteuning en begeleiding ik deze masterproef nooit zou gerealiseerd hebben. Zij heeft mij steeds bijgestaan bij de praktische uitvoeringen in het experimenteel onderzoek en ik kon steeds bij haar terecht met talloze vragen. Langs deze weg wens ik haar alle succes toe met de verdere uitvoering van haar doctoraatsonderzoek en het behalen van haar doctoraat. Verder wens ik alle medewerkers van het labo endocrinologie te bedanken voor hun bereidwilligheid tijdens mijn stageperiode. Last but not least gaat mijn dank naar mijn ouders, aangezien zij mij de kans geboden hebben aan de UGent te studeren en mij steeds gesteund hebben.
INHOUDSTAFEL SAMENVATTING ...............................................................................................................1 1.INLEIDING .......................................................................................................................2 1.1.Sarcopenie: situering van de problematiek ................................................................2 1.2. Eiwitsynthese & Testosteron suppletie......................................................................3 1.3. Histologische veranderingen tgv. testosteron suppletie ............................................5 1.4.Oestrogeen suppletie ...................................................................................................7 1.5. Signaalwegen voor hypertrofie en atrofie. ................................................................8 1.6. Onderzoeksdoel. .........................................................................................................9 2.MATERIALEN EN METHODEN ................................................................................. 11 2.1. Studie design – Orchidectomie & Sex-steroïdensuppletie - Spierbiopten. ............ 11 2.1.1. Studie design ...................................................................................................... 11 2.1.2. Orchidectomie & sex-steroïden suppletie ........................................................ 11 2.1.3. Spierbiopten ..................................................................................................... 12 2.2. q-PCR-analyse van spierbiopten. ............................................................................ 12 2.2.1. RNA-isolatie ...................................................................................................... 14 2.2.2. cDNA-synthese .................................................................................................. 14 2.2.3. q-PCR ................................................................................................................ 14 2.2.4. Referentiegenen ................................................................................................. 17 2.2.5. Testen van primers ............................................................................................ 17 2.2.6. Delta-Delta Ct-methode .................................................................................... 18 2.2.7. Statistische verwerking ..................................................................................... 18 3. RESULTATEN ............................................................................................................... 19 3.1.Effecten van orchidectomie en sex-steroïden suppletie op lichaamsgewicht en spiermassa. ...................................................................................................................... 19 3.1.1. Lichaamsgewicht en gewicht van de zaadblaasjes ........................................... 19 3.1.2. Spiermassa ......................................................................................................... 20
3.2. Effecten van orchidectomie en sex-steroïden suppletie op genexpressies ............. 21 3.2.1. Atrogin-1............................................................................................................ 21 3.2.2. MuRF1 ............................................................................................................... 23 3.2.3. S6K1................................................................................................................... 24 3.2.4. 4EBP1 ................................................................................................................ 24 3.2.5. MSTN (myostatine) ........................................................................................... 25 3.2.6. IGF-1 ................................................................................................................. 26 4. BESPREKING ................................................................................................................ 28 4.1. Androgene en oestrogene regulatie van lichaamsgewicht en spiermassa .............. 28 4.2. Effecten van orchidectomie en sex-steroïden suppletie op genexpressies ............ 28 4.2.1. Atrofie signaalwegen, door Atrogin-1 en MuRF1 gekarakteriseerd ............... 28 4.2.2. Signalisatie van de hypertrofie signaalwegen via S6K1 en 4EBP1 .................. 30 4.2.3. Myostatine, een negatieve regulator in de eiwitsynthese ................................. 30 4.2.4. IGF-1, een mediator in de proteinesynthese ..................................................... 31 5.ALGEMEEN BESLUIT .................................................................................................. 32 6. REFERENTIES .............................................................................................................. 33 7. BIJLAGEN ..................................................................................................................... 36 7.1 Goedkeuring van het onderzoeksprotocol voor het dierexperimenteel onderzoek 37 7.2. Statistische gegevens betreffende androgene en oestrogene regulatie van lichaamsgewicht en spiermassa ...................................................................................... 38 7.3. Statistische gegevens betreffende de genexpressies ................................................ 39
SAMENVATTING
Eiwitsynthese en -degradatie in de skeletspier wordt door verschillende signaalwegen gereguleerd en androgenen kunnen de spiermassa en signaalwegen beïnvloeden. Vandaar dat genexpressies, na sex-steroïden deprivatie en suppletie, een beeld kan vormen over de moleculaire regulatie en therapeutische targets kunnen bieden voor de behandeling van spieratrofie. Bij mannelijke C57BL/6JOla-muizen werden normaalfysiologische testosteronof oestradiol suppletie na orchidectomie, toegediend. De activatie van de hypertrofie en atrofie signaalwegen werd op mRNA-niveau bestudeerd: RNA werd uit 3 verschillende spierbiopten geïsoleerd en genexpressies van Atrogin-1 en MuRF1 (in SOL, EDL en LA/BC) en S6K1, 4EBP1, MSTN en IGF-1 (in SOL en EDL), werden aan de hand van q-PCR-analyse geëvalueerd. De resultaten werden vergeleken met controlegroep. Het belang van hormonale interventies bij dalende endogene androgeen concentraties werd aangetoond. Behoud van lichaamsgewicht en spiermassa werd door testosteron suppletie, maar - zoals verwacht - niet door oestradiol suppletie geïnduceerd. Spieratrofie ten gevolge van orchidectomie, maar ook spierhypertrofie na testosteron suppletie, vertoonde grote verschillen per spiergroep, wat het voorkomen van androgeen gevoelige spieren aantoonde. Atrogin-1 en MuRF1 profileerden zich als belangrijke regulatoren in de atrofie signaalwegen in de androgeen gevoelige LA/BC, maar in castratie geïnduceerde atrofie signalering in skeletspieren kwam deze functie minder tot uiting. Atrofiesignalering en genexpressies van Atrogin-1 en MuRF1 bleken hierdoor spierspecifiek te zijn. Onderzoek naar genexpressies van Atrogin-1 en MuRF1 over verschillende interventieperiodes kan de moleculaire regulatie van deze atrogenen verduidelijken. Genexpressies van S6K1 en 4EBP1 leverden onvoldoende waardevolle gegevens over de
moleculaire regulatie in de skeletspieren, waardoor de
signalisatie van de hypertrofie signaalwegen via S6K1 en 4EBP1 niet in beeld kon gebracht worden. Ondanks de gekende rol van MSTN als endogene inhibitor van de eiwitsynthese, bleek de moleculaire regulatie van MSTN in de atrofie signalering na androgeen deprivatie te verschillen naargelang het spiertype. Onderzoek op eiwitniveau en downstream target van MSTN is noodzakelijk om verduidelijking in deze regulatie te brengen. Verder onderzoek moet eveneens uitklaren of ook in het geval van IGF-1, het spiertype een bepalende factor is om de moleculaire regulatie te determineren.
[1]
1.INLEIDING
1.1.Sarcopenie: situering van de problematiek Het fenomeen van ‘global aging’ in de westerse beschaving heeft er voor gezorgd dat ‘agingresearch’ aan toenemend belang gewonnen heeft. De onderliggende mechanismen van de veranderingen tijdens het humane verouderingsproces zijn nog niet volledig achterhaald, maar vast staat dat de musculaire veroudering of leeftijdsgebonden verlies aan spierkracht en spiermassa (sarcopenie), bijzondere aandacht krijgt (1,2,4). De functionele implicaties tengevolge van sarcopenie, zoals dalende fysieke activiteit en fysisch functioneren, toegenomen zwakte, verhoogd valrisico en risico op fracturen, kunnen leiden tot het verlies van zelfstandigheid en stijging van de mortaliteit. Vandaar dat het voorkomen van sarcopenie een significante impact heeft op de gezondheidszorg (3,18,23). Het optreden en de progressie van sarcopenie is een ingewikkeld proces, dat wellicht een multidisciplinaire aanpak vereist. Aangezien een sedentaire levensstijl en onderbelasting van het bewegingsapparaat een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van sarcopenie, mag verwacht worden dat het stimuleren van ‘lifestyle changes’ bij ouderen, waarbij de fysieke activiteit en musculaire conditie kwalitatief en kwantitatief geoptimaliseerd worden, een belangrijke bijdrage leveren. Studies duiden aan dat krachttraining hiervoor de meest efficiënte oefenvorm is (10,17,18). Anderzijds kunnen adaptaties aan het nutritioneel leefpatroon van ouderen het optreden van sarcopenie op een belangrijke wijze onderdrukken. Malnutritie is echter vaak de reden waardoor ouderen onvoldoende rendement uit de fysieke training halen en waardoor een hogere graad van proteïne-catabolisme optreedt (5,6,16). De onderliggende mechanismen van de pathogenesis van sarcopenie, zijn niet volledig bekend. Toch zou het optreden van sarcopenie bij oudere mannen, in grote mate toegeschreven kunnen worden aan een daling van de endogene androgeenconcentraties met de leeftijd, aangezien tijdens de zogenaamde ‘andropauze’ het serum testosteron tot hypogonadaal niveau (hypogonadisme) daalt (7,17,34). Vandaar dat bijzondere aandacht geschonken wordt aan het effect van hormonale interventies (testosteron suppletie) waarbij circulerende testosteron-concentraties, opnieuw binnen de fysiologische grenzen kunnen gebracht worden, met als doel het optreden van sarcopenie te voorkomen, te vertragen of zelfs om te keren (15,16,34). Naast een daling in androgeenconcentraties wordt aangenomen dat ook andere processen, zoals inflammatie, oxidatieve stress, mitochondriale dysfunctie, neurodegeneratie, daling van het aantal satellietcellen,…, aan de basis liggen van het ontstaan en/of versnellen van sarcopenie (1,3,4).
[2]
1.2. Eiwitsynthese & Testosteron suppletie Behoud van spiermassa is het resultaat van een balans in het dynamisch proces tussen eiwitsynthese en eiwitdegradatie, imbalans daarentegen resulteert ofwel in spierhypertrofie ofwel in spieratrofie (8). Eiwitsynthese kan gestimuleerd worden door verscheidene prikkels zoals functionele overload, metabolische vraag en hormonale prikkels. Groeihormoon (GH) en androgenen (waaronder testosteron), zijn anabole hormonen dewelke de eiwitsynthese stimuleren en eiwitdegradatie inhiberen (6,8). De moleculaire mechanismen van deze hormonale prikkels op de eiwitsynthese zijn niet volledig gekend, maar duidelijk is dat de dalende circulerende concentraties van deze hormonen in het menselijk lichaam tijdens het verouderingsproces een inhiberend effect hebben op de eiwitsynthese, waardoor zij kunnen bijdragen tot de ontwikkeling van sarcopenie (4,7,9). De populariteit en het misbruik van testosteron - onder andere bij sporters - is voornamelijk te wijten aan zijn anabolische effecten op de skeletspier. Al is de relatie tussen testosteron suppletie en spiermassa bij de eugonadale man niet duidelijk, studies tonen aan dat suprafysiologische testosteron suppleties, ongeacht de leeftijd, een toename van spiermassa en spierkracht veroorzaken, waarbij deze toename dosisafhankelijk is (7,14,33). Eerdere studies op ratten hebben aangetoond dat de effecten van suprafysiologische testosteron suppletie ten opzichte van normaal- of subfysiologische suppletie geen voordelen boden op het vlak van gewichtstoename voor de ‘lean body mass’ (vetvrije massa) (34). Daarnaast is gebleken dat ook normaalfysiologische testosteron suppletie, in het geval van hypogonadisme, tot een substantiële toename van spiermassa leidt, waardoor het een therapeutisch effect heeft (13,34). Het vermogen van testosteron om toename van spiermassa te stimuleren is goed gekend, maar langdurige testosteron suppletie bij oudere mannen, kan een toenemend risico op prostaatkanker en cardiovasculaire aandoeningen tot gevolg hebben (11,12,17). Vandaar dat verder onderzoek zich opdringt om de onderliggende moleculaire mechanismen te achterhalen, die testosteron suppletie op de skeletspiermassa en -kracht teweegbrengt. Betere inzichten in deze mechanismen, kunnen als moleculaire targets dienen voor de ontwikkeling van therapeutische behandelingen. Verwacht wordt dat de ontwikkelingen op het vlak van ‘SARMs’ (specific androgen receptor modulators, t.t.z. niet-steroïdale agentia die binding vormen met de androgeen receptoren) en myostatine-inhibitoren (myostatine is een endogene inhibitor van de eiwitsynthese, die spieratrofie initieert), gunstiger vooruitzichten bieden in het kader van anabole effecten op de spierhypertrofie. Deze onderzoeken bevinden zich evenwel nog in een ontwikkelingsfase, waarbij tot op heden enkel dierexperimenteel onderzoek verricht werd (1,3). [3]
Androgenen en oestrogenen - onze geslachtshormonen - worden zowel bij mannen als vrouwen aangemaakt, al is er een belangrijk verschil in de aanmaak per dag. Het belangrijkste androgeen bij de man is testosteron (17β-hydroxy-4-androstene-3-one), een C19-steroid, dat voor 95% in de testis (Leydig cellen) en voor 5% in de bijnier - uitgaande van cholesterol, via verschillende tussenstappen en aangedreven door verschillende enzymen, gesynthetiseerd wordt. Testosteron wordt in het lichaam deels omgevormd tot 2 belangrijke hormonen: enerzijds naar het niet-aromatiseerbare dihydrotestosteron (DHT), anderzijds door aromatisatie naar 17β-estradiol (E2), het belangrijkste oestrogeen (10). De regulatie van androgeen- en oestrogeenproductie in het menselijk lichaam gebeurt niet ongelimiteerd maar wordt gecontroleerd door hormoonproductie in de hersenen, dat functioneert als een negatief feedback mechanisme langs de hypothalame-hypofysaire-gonadale as. Gonadotropine releasing hormoon (GnrRH) wordt door de hypothalamus vrijgesteld, waardoor de hypofyse aangezet wordt om LH (luteïniseringshormoon) en FSH (follikel stimulerend hormoon) in de bloedbaan vrij te stellen, wat de productie van testosteron stimuleert. Bij een voldoende endogene testosteron concentratie, treedt de feedbackactie op, waardoor de vrijstelling van GnrRH, LH en FSH in de hypothalamus en hypofyse daalt en bijgevolg ook de productie van testosteron zal afnemen (10). Testosteron heeft zeer belangrijke en diverse effecten op het menselijk
lichaam,
zoals
de
effecten
op
de
ontwikkeling
van
de
secundaire
geslachtskenmerken, de productie van sperma en de invloed op het libido van de man. Daarnaast speelt testosteron een belangrijke rol in de ontwikkeling en onderhoud van botweefsel en bij het metabolisme van eiwitten, suikers en vetten, waardoor het een belangrijke invloed heeft op de lichaamssamenstelling (spiermassa en vetweefsel) (figuur 1). Testosteron, maar ook dihydrotestosteron en oestradiol, worden in de spiercel opgenomen door binding met hun respectievelijke receptoren: androgeen-receptor (AR) en oestrogeenreceptor (ER). Van DHT is bekend dat het een veel grotere affiniteit heeft voor de AR dan testosteron. Het steroïd-receptor-complex migreert naar de celkern waar na transcriptie van de genetische code (in het DNA opgeslagen) naar mRNA en post-translationele modificaties zoals het toevoegen van fosfaatgroepen - de eiwitsynthese geïnitieerd wordt. Vandaar dat de effecten van androgenen en oestrogenen niet alleen bepaald wordt door de circulerende (endogene en/of exogene) concentraties, maar ook en vooral door de hoeveelheid receptoren die in het spierweefsel aanwezig zijn en de lokale omzetting van de sex-steroïden ( kan zowel activering als desactivering zijn) (10,14).
[4]
Figuur 1:Diverse effecten van testosteron op het menselijk lichaam. [ Figuur overgenomen van http://www.mediserve.ie]
1.3. Histologische veranderingen tgv. testosteron suppletie Leeftijdsgebonden verlies aan dwarsgestreepte spiermassa is deels te wijten aan een significante afname van het aantal type I en type II spiervezels en een verkleining van de spiercellen, waarbij de type II spiervezels een voorkeur vertonen tot atrofie (23) (figuur 2).
Figuur 2: Schematische voorstelling van het effect van de leeftijd op de spiervezels van dwarsgestreepte skeletspieren bij ‘jongeren’(A), ‘ouderen’(B) en ‘ouderen lijdend aan sarcopenie’(C), waarbij in situatie(B) een denervatie van type II-vezels en een rekrutering van type I-vezels optreedt en in situatie(C) een daling van type II-vezels optreedt. [ Figuur overgenomen van Lang T. et al (3)]
[5]
Testosteron suppletie induceert een toename van spiermassa en type-I spiervezels blijken hiervoor een grotere sensibiliteit te vertonen dan type-II spiervezels. De verwachte morfologische effecten van steroïdensuppletie op spiervezels vertalen zich in een grotere vezeldiameter en een groter aantal myonucleï en satellietcellen, zonder daarbij een effect te hebben op de spiervezelsamenstelling (8,14)(figuur 3).
Figuur 3: Schematische voorstelling van testosteronsuppletie op de skeletspier, waarbij de spierhypertrofie o.a. gemedieerd wordt door proliferatie van satellietcellen na binding van testosteron met de androgeen receptor .[ Figuur overgenomen van Kadi F. (14)]
Op histologisch vlak wordt testosteron als een mediator voor de stimulatie van de mytose van satellietcellen naar myoblasten gezien, waarbij testosteron de toename van myonucleï induceert. Belangrijk onderscheid dient hierbij gemaakt te worden tussen verschillende spiergroepen. Het is bekend dat skeletspieren, waaronder M. Soleus (SOL, type-I, slowtwitch) en
M. Extensor Digitorum Longus (EDL, type-II, fast-twitch) van volwassen
knaagdieren, in het algemeen vaak een lage respons hebben op androgeen suppletie, als gevolg van een lage androgeen-receptor expressie (14). Uitzondering hierbij is de M. Levator Ani/Bulbocavernosus (LA/BC), waarvan bekend is dat het een androgeen gevoelige skeletspier is, waarbij de ontwikkeling en de functie sterk gereguleerd wordt door androgenen. Bij mannelijke knaagdieren vertoont LA/BC een uitgesproken hypertrofie ten gevolge van een verhoogde serumtestosteron concentratie tijdens de puberteit, enerzijds en een uitgesproken atrofie in de postpuberale fase na orchidectomie, anderzijds (27). [6]
1.4.Oestrogeen suppletie Het optreden van verschillende spierpathologiën bij de vrouw, wordt deels veroorzaakt door dalende oestrogeenwaarden gedurende de post-menopauze-jaren, wat resulteert in sarcopenie (29,31). In tegenstelling tot wat vastgesteld wordt bij hypogonadale oudere mannen, waar testosteronsuppletie resulteert in een significante toename van spiermassa, maar slechts een beperkt effect heeft op de toename van spierkracht (15,16,17), geven studies aan dat oestrogeensuppletie met 17β-estradiol (E2) bij vrouwen in de postmenopauze-fase, zowel spiermassa als -kracht doen toenemen (29,30). De effecten van oestrogenen op het spiermetabolisme bij de man zijn tot op heden echter onvoldoende gerapporteerd, ook al is het klassieke geslachtsdimorfisme, waarbij testosteron de gonadale steroïdeffecten bij de man medieert en oestradiol bij de vrouw, niet meer van toepassing. Immers, na aromatisatie van testosteron wordt oestradiol gevormd, welke belangrijke effecten uitoefenen op de botparameters bij de man (29,30,43). Dierexperimenteel onderzoek met oestradiolsuppletie, uitgevoerd bij oestrogeendeficiënte muizen, heeft aangetoond dat het de contractiele eigenschappen van de skeletspier ondersteunt door een rol te spelen in de proliferatie en differentiatie van myoblasten. Het effect van oestradiolsuppletie op de eiwitsynthese wordt hierdoor benadrukt, al zijn de onderliggende mechanismen nog onvoldoende gekend (28,31,32). Op moleculair vlak werd recent duidelijk dat 17β-estradiol (E2) een rol speelt in de inhibitie van apoptose van de skeletspier en - net als bij testosteron - zijn deze effecten dosisafhankelijk (29,31,33). Svensson et al (33) toonden aan dat zowel androgeen- als oestrogeenreceptor gemedieerde signalisatie een positief effect hebben op de eiwitsynthese van de skeletspier. Diepere inzichten aangaande de moleculaire mechanismen kunnen duidelijkheid brengen over de signaalwegen die de actie van E 2 in de skeletspiercel mediëren, wat kan bijdragen tot de ontwikkeling van therapieën voor preventie en behandeling van sarcopenie, ten gevolge van oestrogeendeficiëntie (32). Toediening van suprafysiologische sex-steroiden concentraties wordt met hypertrofie van de skeletspier
geassocieerd
(9,14,30).
Hoewel
de
moleculaire
mechanismen,
welke
spierhypertrofie in de skeletspier mediëren onvolledig gekend zijn, kent de eiwitsynthese een belangrijke controle vanuit meerdere initiatie- en groeifactoren. Sex-steroiden (testosteron en oestradiol) suppletie initieert binding van de sex-steroiden met hun respectievelijke receptoren, waardoor het steroïd-receptoren-complex naar de celkernen migreert en overschrijving van bepaalde genen verhoogd of verlaagd wordt, resulterend in veranderingen van het eiwitmetabolisme. Studies hebben aangetoond dat de hypertrofie signaalwegen bij suprafysiologische androgeen en oestrogeen suppleties geactiveerd worden, waardoor er [7]
veranderingen in de eiwitsynthese van de skeletspieren optreden. Analyse van de genexpressie kan een beeld geven over de moleculaire regulatie (14,23,29).
1.5. Signaalwegen voor hypertrofie en atrofie. Eiwitsynthese en -degradatie in spieren (spierhypertrofie en -atrofie) wordt gereguleerd door pathways, die o.a. door hormonale prikkels beïnvloed worden en transcriptie van genen in de spiercel reguleren (8,19,23). Spierhypertrofie en -atrofie zijn mechanismen die door verschillende signaalwegen gereguleerd worden, waarbij deze signaalwegen met elkaar op verschillende niveaus interfereren (4,8,19) (figuur 4). IGF1/AKT signalering IGF-1
(insulin-like
growth
factor)
is
één
van
de
best
gekarakteriseerde
spiergroeibevorderende factoren die onder invloed van groeihormoon (GH) door de lever en de skeletspier geproduceerd wordt. Op moleculair niveau is IGF-1 betrokken in de AKT/mTOR hypertrofie signaalweg in de spiercel (9,22,23). Het door IGF-1 gerekruteerde PI3K, fosforyleert en activeert AKT. Deze PI3K/AKT signaalweg is van cruciaal belang als intracellulaire mediator downstream. AKT/mTOR signaalweg: De gekende hypertrofie signaalweg in de spiercel - AKT/mTOR pathway - verloopt via groeihormoon GH/STAT5 (signal transducer and activator of transcription) en insulin-like growth factor IGF1/Akt. AKT reguleert de eiwitsynthese in de skeletspieren door inhibitie van TSC (tubereuze sclerose complex), waardoor mTOR (mammalian target of rapamycin) wordt geactiveerd. Downstream de AKT/mTOR hypertrofie signaalweg, wordt S6K1 (ribosomal protein S6 kinase beta1) - een activator van de eiwitsynthese - door mTOR gestimuleerd en wordt 4EBP1 (eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1) een inhibitor van de eiwitsynthese - door mTOR geïnhibeerd (9,13,26). IGF1/AKT/FoxO signalering: Atrofie signaalwegen worden via TNFα/SOCS3 (tumor necrosis factor/supressor of cytokine signalling) en via Atrogin-1/MAFbx en MuRF1 gekarakteriseerd. AKT inhibeert in deze signaalweg de activatie van FoxO (forkhead family of transcriptors factors), welke na defosforylatie Atrogin-1/MAFbx en MuRF1 (spierspecifieke ubiquitin ligasen) activeren, waardoor eiwitdegradatie geïnduceerd wordt (18). Spieratrofie wordt hierdoor niet langer gelijkgesteld met het ontbreken van hypertrofe stimuli, maar wordt gezien als een actief proces dat door transcriptionele processen gereguleerd wordt. Genen die in dit proces betrokken zijn, worden atrogenen genoemd, waarbij Atrogin-1/MAFbx en MuRF1 als [8]
mastergenen voor spieratrofie erkend worden (19). MSTN signalering: MSTN (myostatine), een transforming growth factor-β (TGF-β), is een endogene inhibitor van de eiwitsynthese, die verantwoordelijk is voor de inhibitie van satellietcel-proliferatie en als negatieve regulator van AKT-fosforolyse optreedt (24,25,27). De downstream targets van de myostatine signaalweg en hun rol in het eiwitmetabolisme zijn nog niet volledig gekend (19).
Figuur 4: Schematische voorstelling van de voornaamste pathways die een rol spelen in de regulatie van de spiervezelgrootte. Gestippelde lijnen duiden pathways aan waarvan het moleculair mechanisme in de volwassen skeletspieren tot op heden nog niet volledig gedefinieerd is.[ Figuur overgenomen van Sandri M. (19) en bewerkt]
1.6. Onderzoeksdoel. Aangezien hypogonadisme geassocieerd is met een uitgesproken spieratrofie, kan verondersteld worden dat daling van endogene androgeenconcentraties de atrofie signaalweg induceert, wat aan de basis kan liggen van de ontwikkeling van sarcopenie. Daarnaast zijn de moleculaire mechanismen van de effecten van androgeen suppletie op de eiwitsynthese van de skeletspier alsook de complexiteit van de androgeen-receptoren-regulatie - de mediatoren in de evolutie naar spierhypertrofie via deze signaalwegen - slechts beperkt gekend (10,14,20). Bovendien is bekend dat testosteron suppletie belangrijke neveneffecten induceert. [9]
Vandaar dat de analyse van de genexpressie na sex-steroïden deprivatie en suppletie, waardevolle gegevens kan opleveren om een beeld te vormen over de moleculaire regulatie van de skeletspiermassa. Betere inzichten in de moleculaire regulatie van de skeletspiermassa kan een belangrijke bijdrage leveren in de preventie en behandeling van spierverlies, zoals dit het geval is bij sarcopenie, maar ook voor andere aandoeningen met spierverlies zoals chronisch obstructieve longziekte (COPD), kanker, neuromusculaire ziekten, na langdurige immobiliteit (ruimtevaarders), e.a. (6,7,23). Deze masterproef omvat een dierexperimenteel onderzoek, waarbij de ‘Differentiële effecten van testosteron en oestradiol op de eiwitsynthese in de skeletspier van de mannelijke muis’ beschreven worden. Er wordt onderzocht wat de effecten zijn van normaalfysiologische testosteron- en oestradiolsuppleties na orchidectomie, waarbij door middel van de analyse van de genexpressies van IGF-1, S6K1, 4EBP1, MSTN, Atrogin-1 en MuRF1 in M. Soleus (SOL), M. Extensor Digitorum Longus (EDL) en M. Levator Ani/Bulbocavernosus (LA/BC), getracht wordt om een beeld te bekomen van de moleculaire regulatie van de eiwitsynthese. Het dierexperimenteel onderzoek kadert in een doctoraatsstudie aan de UGent. De relevantie van de keuze van bovengenoemde genen, omwille van hun betrokkenheid in de regulatie van de hypertrofie- en atrofie signaalwegen van de skeletspier, blijkt uit de wetenschappelijke literatuur (zie 1.5.). Daarnaast bevestigen studies de toepasselijkheid van de gekozen skeletspieren. Immers, het is bekend dat er een duidelijke differentiatie bestaat in contractiele eigenschappen, enerzijds en hypersensibiliteit ten aanzien van androgenen, anderzijds, waardoor genexpressies een verschillend beeld kunnen vormen (zie 1.3.).
[10]
2.MATERIALEN EN METHODEN 1 2.1. Studie design – Orchidectomie & Sex-steroïdensuppletie - Spierbiopten. Om betere inzichten te verwerven in de moleculaire mechanismen, betrokken in de regulatie van de skeletspiermassa, werd een dierexperiment met mannelijke C57BL/6JOla-muizen opgezet. Het protocol voor dit dierexperimenteel onderzoek werd door de ethische commissie dierproeven van de faculteit geneeskunde en gezondheidswetenschappen van de Universiteit Gent goedgekeurd.
2.1.1. Studie design Volwassen (8 weken oud) mannelijke C57BL/6JOla-muizen (Harlan Laboratories) werden ad random in 4 testgroepen (N=12/groep) opgedeeld. De muizen ondergingen ofwel een Shamoperatie (SHAM), ofwel orchidectomie (ORX+V), ofwel testosteron suppletie na orchidectomie (ORX+T), ofwel oestradiol suppletie na orchidectomie (ORX+E), gedurende een interventieperiode van 30 dagen. Doel van de orchidectomie was de endogene androgeenproductie te onderdrukken. Voorafgaand aan de orchidectomie werd een 2-weken acclimatisatieperiode voor de proefdieren voorzien. Gedurende het gehele dierexperiment werd voor de proefdieren water en voedsel ‘ad libitum’ voorzien.
2.1.2. Orchidectomie & sex-steroïden suppletie Voorafgaand aan de orchidectomie werd het lichaamsgewicht van de proefdieren bepaald (LGdo). Anesthesie gebeurde door Isofluraan inhalatie (Forene; Abbott, Brussel, België), waarna orchidectomie werd uitgevoerd. Via een subcutane cervicale implantatie van een 0,5cm salistic tube (Silclear tubing 1,57x2,41mm, Degania, Israël), werden testosteron (ORX+T) of oestradiol (ORX+E) (Sigma-Aldrich), respectievelijk 1/2 en 1/16 met cholesterol verdund, toegediend zoals beschreven door Vanderscheuren et al (34).
1
Dit eindwerk - voorgedragen tot het behalen van de graad ‘Master in de Biomedische Wetenschappen’ - omvat een dierexperimenteel onderzoek dat door de student zelfstandig uitgevoerd werd, behoudens de bepaling van de genexpressie voor Atrogin-1en MuRF1 en hun respectievelijke statistische verwerking. Laatstgenoemde gegevens werden uit de ruimere doctoraatsstudie - waarin dit dierexperimenteel onderzoek kadert - betrokken, met als doel een zo ruim mogelijk beeld te schetsen over de ‘Differentiële effecten van testosteron en oestradiol op de eiwitsynthese in de skeletspier van de muis’.
[11]
Het succes van orchidectomie werd nagegaan door het meten van het gewicht van de zaadblaasjes. Om de behandeling van oestradiol te controleren werd de uterusmassa van 4 mature vrouwelijke muizen bepaald die na ovariectomie eenzelfde dosis oestradiol toegediend kregen2. Lege salistic tubes werden bij de ORX+V testgroep ingeplant, waardoor de effecten van het implantaat uit te sluiten zijn. Testgroep die Sham-operatie onderging (om de effecten van de chirurgische ingreep uit te sluiten), had tot doel om als controlegroep te fungeren.
2.1.3. Spierbiopten Dertig dagen na orchidectomie werden de proefdieren van de 4 testgroepen (N=12/groep) geëuthanaseerd. Voorafgaand aan de euthanasie werd het lichaamsgewicht opnieuw bepaald (LGd30 ). Euthanasie werd uitgevoerd door cervicale dislocatie. LA/BC, enerzijds en SOL/ EDL (thv de achterpoot) anderzijds, werden zorgvuldig gedissecteerd waarna zij onmiddellijk ingevroren werden in vloeibare stikstof en vervolgens bewaard werden bij -80°C. Het gewicht van de zaadblaasjes (ZB) werd bepaald. Voorafgaand aan de RNA isolatie en onmiddellijk na de ontdooiing van de spierbiopsies, werd de spiermassa van SOL (SOL_massa), EDL (EDLmassa) en LA/BC (LA/BC_massa) gemeten.
2.2. q-PCR-analyse van spierbiopten. De activatie van de hypertrofie- en atrofie signaalwegen werd op mRNA-niveau bestudeerd (23). De genexpressies van Atrogin-1 en MuRF1 (in LA/BC, SOL en EDL), enerzijds en IGF1, S6K1, 4EBP1, MSTN (in SOL en EDL), anderzijds werden geanalyseerd met als doel inzicht te verwerven in de moleculaire regulatie. RNA werd uit spierbiopten geëxtraheerd, waarna een omzetting van enkelstrengig RNA naar dubbelstrengig cDNA bekomen werd. Aan de hand van q-PCR - ook kwantitatieve PCR genoemd - werden de veranderingen van genexpressies (over- of onderexpressie) onderzocht. De belangrijkste stappen in het protocol van deze laboratoriumtechniek worden in figuur 5 voorgesteld en hieronder beschreven.
2
De dosering en de doeltreffendheid van de oestradiol suppletie werd in een piloot experiment geverifieerd aan de hand van de analyse van de uterusmassa van 4 mature vrouwelijke muizen, maar de resultaten worden hier niet getoond.
[12]
(a)
(b)
(c) Figuur 5: Schematische voorstelling van de belangrijkste stappen van de q-PCR-analyse: RNA isolatie uit spierbiopten (a), cDNA synthese (b) en q-PCR (c). [Figuur samengesteld via http://img.springerimages.com (a), http://www.evrogen.com (b), http://www.langfordvets.co.uk (c)]
[13]
2.2.1. RNA-isolatie De omzetting van RNA tot cDNA gaat de eigenlijke PCR-reactie vooraf. RNA werd uit de spierbiopsie geïsoleerd, gebruik makend van ‘Tripure Isolation Reagent kit’ (Roche Diagnostics, Vilvoorde, België). Met behulp van de ‘RNase free DNase kit’ (Qiagen, Venlo, Nederland) werd contaminerend DNA uit de geïsoleerde RNA-stalen verknipt en verwijderd. Het bekomen RNA-staal werd op kamertemperatuur geïncubeerd, na toevoeging van 70 μl RDD Buffer aan 10 μl DNase1, waarna het aan de hand van ‘RNeasy Mini kit’ (Qiagen, Venlo, Nederland) opgezuiverd werd. De RNA-concentratie (ng/µl) - wat een beeld geeft van de efficiëntie van de RNA-isolatie - werd gemeten,
gebruik makend van de
NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer (Thermo Scientific). De zuiverheid van het RNA werd geanalyseerd aan de hand van absorptiemetingen. Aangezien de absorbantiemetingen gebaseerd zijn op de absorptie van licht door de molecules en lichtabsorptie door molecules bij specifieke golflengtes gebeurt, werd in het geval van RNA de ratio van absorbanties bij 260 en 280 nm gebruikt om de zuiverheid na te gaan. Op die wijze bestaat er een controle over de kwaliteit van het RNA, waarbij de ratio (A260/280) met waarde ‘2’ als “puur” RNA wordt beschouwd (36). In de uitvoering van deze stappen, werden de instructies van de fabrikanten gevolgd.
2.2.2. cDNA-synthese Met behulp van de ‘iScript cDNA Synthesis kit’ (BioRad, Nazareth, België), werd een omzetting van enkelstrengig RNA naar dubbelstrengig cDNA bekomen. De instructies van de fabrikant werden gevolgd.
2.2.3. q-PCR q-PCR (quantitative polymerase chain reaction) is een laboratoriumtechniek, die gebruikt wordt voor het amplificeren en simultaan kwantificeren van DNA. Het aantal kopijen van een RNA-transcript van een gen in een cel of weefsel weerspiegelt de snelheid van expressie en degradatie: aan de hand van q-PCR wordt het mogelijk om de veranderingen van deze genexpressie te bestuderen. Het principe van q-PCR steunt op het meten van het aanwezige DNA door een fluorescentiekleurstof die zich aan dubbelstrengig DNA bindt. Typisch voor qPCR gebeurt deze meting tijdens de amplificatie en niet op het einde van de reactie, zoals bij de gewone PCR. De q-PCR-reactie werd uitgevoerd gebruik makend van een Lightcycler 480 (Roche) en omvatte een groot aantal cycli van herhaald (40x) opwarmen en afkoelen van het DNA-staal (figuur 6). [14]
Figuur 6: Schematische voorstelling van de q-PCR-reactie: na activatie van de polymerase volgen 40 cycli van herhaald opwarmen en afkoelen van het DNA-staal, waardoor denaturatie van 2 DNA strengen, resulteert in primerhechting (forward en reverse primer) en elongatie van het DNA.
Figuur 7: Grafische voorstelling van de q-PCR-run. [Figuur overgenomen van het q-PCR-protocol, tijdens de uitvoering van het dierexperimenteel onderzoek]
Tijdens de ‘q-PCR-run’ (figuur 7), resulteert de opwarming (actieve polymerase) van het DNA in denaturatie van de twee DNA-strengen, waardoor de kleurstof zijn binding verliest en geen fluorescentie wordt uitgestraald. Aan het hieruit afgeleide enkelstrengig DNA hechten 2 primers (primer anealing), wat als template gebruikt wordt voor het DNA-polymerase. De q[15]
PCR-techniek is gebaseerd op elongatie van het DNA met 2 specifieke en verschillende primers (zie 2.2.5.), een ‘forward’ en ‘reverse’ primer (korte stukjes enkelstrengig DNA die complementair zijn aan het DNA dat onderzocht wordt). Bij een temperatuur van 72°C zorgt het polymerase voor enzymatische vermenigvuldiging van het DNA dat zich tussen de primers bevindt, waardoor de kleurstof opnieuw bindt en een hoger fluorescentiesignaal uitzendt, dat gedetecteerd wordt. Tijdens een optimale amplificatiecyclus van de PCR, verdubbelt de hoeveelheid cDNA van het target-gen. De q-PCR-reactie werd uitgevoerd met een oplossing van 8µl, bestaande uit 3µl cDNA (target-gen), 300nM ‘forward’ en ‘reverse’ primer en 4µl SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Halle, België) dat als fluorescerende detectiemolecule gebruikt werd (36). Bij amplificatie van het target-gen bindt het zich aan het dubbelstrengig-DNA, resulterend in een toename in het fluorescentiesignaal. Voor elke cyclus (fluorescentiesignaal werd om de 3°C gemeten) werd de intensiteit van de fluorescentie in een grafiek geplot, waaruit de fluorescentietreshold (Ct-waarde) afgeleid werd. De Ct-waarde is proportioneel met de initiële hoeveelheid materiaal aanwezig in elk staal. Hoe lager de Ct-waarde, hoe hoger de DNA-concentratie van het startmateriaal. De bekomen waarden worden geanalyseerd (genormaliseerd) ten opzichte van referentiegenen (zie 2.2.5.), waarvan de expressie constant is. De referentiegenen werden in deze studie gekozen met behulp van GeNorm, een computerprogramma dat ontwikkeld werd om referentiegenen te bepalen (35). Smeltcurven (15sec bij 95°C, 1min bij 60°C en 15sec bij 95°C, waarbij telkens om de 3°C fluorescentiemateriaal gemeten werd) werden uitgezet om na te gaan of de q-PCR specifiek verliep (figuur 8).
Figuur 8: Voorstelling van een smeltcurve, waaruit de specificiteit van de q-PCR-reactie kan afgeleid worden door het voorkomen van slechts één enkele piek in de fluorescentiemeting van de onderzochte stalen. [Figuur overgenomen uit het dierexperimenteel onderzoek]
[16]
2.2.4. Referentiegenen Normalisatie van de bekomen resultaten in q-PCR gebeurt ten aanzien van referentiegenen. Van referentiegenen is bekend dat de expressie onder verschillende condities en omstandigheden stabiel is. Uit recent onderzoek blijkt dat normalisatie ten opzichte van minimaal 3 referentiegenen aangewezen is om betrouwbare resultaten te bekomen (35). Het inbrengen van de Ct-waarden in GeNorm, geeft een aanduiding van de stabiliteit van de referentiegenen (37). In deze studie werden Ppia , B2M en RPLP0 als goede referentiegenen door GeNorm beschouwd voor de q-PCR. 2.2.5. Testen van primers Het resultaat van q-PCR wordt sterk bepaald door een correcte keuze van de primers: de efficiëntie van de primerkeuze is immers bepalend voor de relevantie van de resultaten. Vandaar dat de primerkeuze onderworpen werd aan een ‘in silico evaluation’, waarbij getest werd of primerparen mogelijke eigenschappen vertoonden die de q-PCR negatief konden beïnvloeden (39). Aan de hand van beschikbare computerprogramma’s werd a) getest wat de specificiteit van de primers was (BLAST, Basic Local Alignment Search Tool, via de Ensemble site), zodat zekerheid verworven werd dat primers gekozen werden die zich enkel op de gewenste doelwitsequentie zouden binden en niet op een gen dat zich elders op het genoom bevond; b) werd nagekeken of er secundaire structuren in het amplicon voorkwamen die primerbinding en amplificatie konden bemoeilijken (m-fold); c) en werd gecontroleerd op de afwezigheid van SNP’s (single nucleotide polymorphisms) en splice-varianten die primerbinding konden verhinderen. Om de efficiëntie van de primers na te gaan werd een standaardcurve opgesteld. De onderzochte stalen en de primer werden aan een verdunningsreeks reeks (1/5) onderworpen, waarbij een lineaire verhouding in de grafiek, als resultaat verwacht werd: met deze werd nagegaan of veranderingen in RNA-concentraties gepaard gingen met evenredige veranderingen in het signaal van de Lightcycler 480. Tabel 1 geeft een overzicht van de primersequenties (‘forward’ en ‘reverse’ primers) voor de onderzochte genen (IGF-1, S6K1, 4EBP1 en MSTN) en de referentiegenen (PPia, B2M en RPLP0). De primers werden overgenomen uit de RTprimerDB database (39) of werden ontworpen aan de hand van Primer Express software 3.0 (Applied Biosystems, Halle, België) gegenereerd (38).
[17]
Tabel 1: overzicht van de primersequenties voor de onderzochte genen (IGF-1, S6K1, 4EBP1 en MSTN) en de referentiegenen (PPia, B2M en RPLP0).
Gen
Forward Primer sequentie
Reverse Primer sequentie
IGF-1
TCA ACA AGC CCA CAG GCT ATG
ACA GCT CCG GAA GCA ACA CT
S6K1
ATA GAA TAC ATG GCC CCT GAA
TGC TCC CAA ATC CCA CCA AT
4EBP1
CTC TGC CTT GAA TTT TGT GAA CAC
TGA GAG TCA TTC CCC TGC AGT A
MSTN
TGC TAT AAG ACA ACT TCT GCC AAG A
AAG AGC CAT CAC TGG TGT CAT C
PPia
CAA ATG CTG GAC CAA ACA CAA ACG
GTT CAT GCC TTC TTT CAC CTT CCC
B2M
CAT GGC TCG CTC GGT GAC C
AAT GTG AGG CGG GTG GAA CTG
RPLP0
GGA CCC GAG AAG ACC TCC TT
GCA CAT CAC TCA GAA TTT CAA TGG
2.2.6. Delta-Delta Ct-methode De delta-delta Ct-methode is een vergelijkende Ct-methode, waarbij de Ct-waarden van het target-gen vergeleken worden met de Ct-waarden van een controle- of ‘sample’-gen. In deze studie werd de vergelijking gemaakt ten opzichte van het ‘sample’ met de laagste Ct-waarde (sample-min). De bekomen waarden (ruwe data) werden vervolgens genormaliseerd ten opzichte van het geometrisch gemiddelde van de ruwe data van de 3 referentiegenen. De delta-delta Ct-methode heeft tot doel om Ct-waarden te transformeren tot genormaliseerde relatieve expressieniveaus, waardoor onderlinge vergelijking tussen Ct-waarden van verschillende targetgenen mogelijk wordt (40). Volgende formule werd gehanteerd:
2.2.7. Statistische verwerking De bekomen resultaten werden via SPSS (SPSS 19.0, Chicago, Illinois) verwerkt. Variatieanalyse of vergelijking van de statistische gemiddelden van de testgroepen werd uitgevoerd met behulp van Oneway ANOVA-test, gevolgd door LSD Post hoc test. Significantie werd verondersteld wanneer p < 0.05 is.
[18]
3. RESULTATEN
3.1.Effecten van orchidectomie en sex-steroïden suppletie op lichaamsgewicht en spiermassa.
3.1.1. Lichaamsgewicht en gewicht van de zaadblaasjes Figuur 9 toont het lichaamsgewicht 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie (LGd3o), voor de 4 testgroepen.
Figuur 9: Lichaamsgewicht 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie (LGd3o), voor de 4 testgroepen. [significantie ten opzichte van SHAM wordt aangetoond door #:p<0.05; ##:p<0.01; ###:p<0.001]
Dertig dagen na orchidectomie (LGd3o) werd - ten opzichte van de SHAM groep - een significante (p < 0.001) reductie van het lichaamsgewicht waargenomen (-12,5%), die door testosteron suppletie (p = 0.001) gecompenseerd kon worden ( tot 97,9% van de SHAM groep), maar niet door oestradiol suppletie (p = 0.625). Figuur 10 toont het gewicht van de zaadblaasjes (ZB), 30 dagen na orchidectomie en sexsteroïden suppletie, voor de 4 testgroepen.
Figuur 10: gewicht van de zaadblaasjes(ZB), 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie, voor de 4 testgroepen. [significantie ten opzichte van SHAM wordt aangetoond door #:p<0.05; ##:p<0.01; ###:p<0.001]
[19]
Orchidectomie veroorzaakte - ten opzichte van de SHAM groep - een significant gewichtsverlies ( -88%, na 30 dagen) van de zaadblaasjes (p < 0.001) welke het succes van androgeen deprivatie aantoont. In vergelijking met de SHAM groep compenseerde testosteron suppletie na orchidectomie (p < 0.001) dit gewichtsverlies ( +18% ten opzichte van SHAM groep). Oestradiol suppletie na orchidectomie daarentegen, had - zoals verwacht - geen effect (p = 0.817) op het gewicht van de zaadblaasjes.
3.1.2. Spiermassa Figuur 11 toont de spiermassa van SOL (SOL_massa), EDL (EDL_massa) en LA/BC (LA/BC_massa), 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie, voor de 4 testgroepen.
[20]
Figuur 11: spiermassa van SOL (SOLmassa), EDL (EDLmassa) en LA/BC (LA/BCmassa) 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie. [significantie ten opzichte van SHAM wordt aangetoond door #:p<0.05; ##:p<0.01; ###:p<0.001]
Endogene androgeen deprivatie ten gevolge van orchidectomie, induceerde na 30 dagen spieratrofie voor zowel SOL (p = 0.029), EDL (p = 0.008) als LA/BC (p < 0.001) (resp. 14,5%, 12,8% en 56,5% gewichtsafname). Testosteron suppletie na orchidectomie onderdrukte de atrofie, voor zowel SOL (p = 0.030), EDL (p = 0.007) als LA/BC (p < 0.001). Oestradiol suppletie na orchidectomie kon het verlies aan spiermassa, noch bij SOL (p = 0.560), noch bij EDL (p = 0.901), noch bij LA/BC (p = 0.308) reduceren. In vergelijking met de SHAM groep werden voor wat betreft de toename van spiermassa ten gevolge van testosteron suppletie geen significante verschillen gevonden voor zowel SOL (p = 0.991) als EDL (p = 0.995). Voor LA/BC daarentegen werd, in vergelijking met de SHAM groep, wel een significante toename van spiermassa (p = 0.015) na testosteron suppletie gevonden.
3.2. Effecten van orchidectomie en sex-steroïden suppletie op genexpressies Genexpressies - 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie - van Atrogin-1 en MuRF1 ( in SOL, EDL en LA/BC) enerzijds en S6K1, 4EBP1, MSTN en IGF-1 ( in SOL en EDL) anderzijds, werden aan de hand van q-PCR-analyses bepaald.
3.2.1. Atrogin-1 Figuur 12 toont de genexpressies voor Atrogin-1, in SOL, EDL en LA/BC, 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie, voor de 4 testgroepen.
[21]
Figuur 12: genexpressies van Atrogin-1, in SOL, EDL en LA/BC, 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie, voor de 4 testgroepen. [significantie ten opzichte van SHAM wordt aangetoond door #:p<0.05; ##:p<0.01; ###:p<0.001]
In EDL werden geen significante verschillen gevonden voor wat betreft de Atrogin-1 mRNA expressie. In SOL daarentegen induceerde orchidectomie een significante overexpressie van Atrogin-1 ( p = 0.008) en werden in vergelijking met de SHAM groep geen significante verschillen gevonden in de Atrogin-1 mRNA expressieniveaus na sex-steroïden suppletie. In LA/BC veroorzaakte endogene androgeen deprivatie ten gevolge van orchidectomie een significante overexpressie van Atrogin-1 (p < 0.001), waarbij het expressieniveau een 10voud van het expressieniveau in de SHAM groep bedroeg. Testosteron was in staat om de Atrogin-1 mRNA upregulatie na orchidectomie te onderdrukken. In vergelijking met de SHAM groep werd een significante upregulatie van het Atrogin-1 mRNA expressieniveau [22]
gevonden (p = 0.002) voor de ORX+E groep.
3.2.2. MuRF1 Figuur 13 toont de genexpressies voor MuRF1, in SOL, EDL en LA/BC, 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie, voor de 4 testgroepen.
Figuur 13: genexpressies van MuRF1, in SOL, EDL en LA/BC, 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie, voor de 4 testgroepen. [significantie ten opzichte van SHAM wordt aangetoond door #:p<0.05; ##:p<0.01; ###:p<0.001]
In EDL werden geen significante verschillen gevonden voor wat betreft de MuRF1 mRNA expressie. In SOL werd een significante daling van de MuRF1 mRNA expressie vastgesteld in de ORX+T groep ( p = 0.011) en ORX+E groep ( p = 0.003), in vergelijking met de SHAM groep. In LA/BC induceerde endogene androgeen deprivatie na orchidectomie een significante upregulatie van MuRF1 (p < 0.001), waarbij het expressieniveau een 4-voud van [23]
het expressieniveau in de SHAM groep bedroeg. Testosteron was in staat om de MuRF1 mRNA upregulatie na orchidectomie te onderdrukken. In vergelijking met de SHAM groep werd voor de ORX+E groep een significante overexpressie ( p = 0.008) van het MuRF1 mRNA expressieniveau vastgesteld.
3.2.3. S6K1 Figuur 14 toont de genexpressies voor S6K1, in SOL en EDL, 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie, voor de 4 testgroepen.
Figuur 14: genexpressies van S6K1, in SOL en EDL, 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie, voor de 4 testgroepen. [significantie ten opzichte van SHAM wordt aangetoond door #:p<0.05; ##:p<0.01; ###:p<0.001]
Endogene androgeen deprivatie ten gevolge van orchidectomie, induceerde een significante downregulatie van S6K1 in EDL (p = 0.025), maar niet in SOL (p = 0.098). In vergelijking met de SHAM groep werd een significante daling in S6K1 mRNA expressie gevonden in de ORX+T groep in SOL (p = 0.011), enerzijds en in de ORX+E groep in EDL (p = 0.028) anderzijds.
3.2.4. 4EBP1 Figuur 15 toont de genexpressies voor 4EBP1, in SOL en EDL, 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie, voor de 4 testgroepen. [24]
Figuur 15: genexpressies van 4EBP1, in SOL en EDL, 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie, voor de 4 testgroepen. [significantie ten opzichte van SHAM wordt aangetoond door #:p<0.05; ##:p<0.01; ###:p<0.001]
Er werd een significante overexpressie van 4EBP1 (p = 0.008) gevonden in SOL na orchidectomie. In EDL werd een significante daling van het 4EBP1 mRNA expressieniveau gevonden in de ORX+E groep (p < 0.001) in vergelijking met de SHAM groep.
3.2.5. MSTN (myostatine) Figuur 16 toont de genexpressies voor myostatine, in SOL en EDL, 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie, voor de 4 testgroepen.
[25]
Figuur 16: genexpressies van MSTN, in SOL en EDL, 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie, voor de 4 testgroepen. [significantie ten opzichte van SHAM wordt aangetoond door #:p<0.05; ##:p<0.01; ###:p<0.001]
Endogene androgeen deprivatie ten gevolge van orchidectomie veroorzaakte een significante onderexpressie van MSTN in SOL (p = 0.004) en een significante overexpressie van MSTN in EDL (p = 0.040). Er werden geen significante verschillen in de MSTN mRNA expressieniveaus gevonden ten gevolge van testosteron suppletie na orchidectomie. In vergelijking met de SHAM groep werd een significante upregulatie van het MSTN mRNA expressieniveau in EDL (p = 0.006) vastgesteld na oestradiol suppletie.
3.2.6. IGF-1 Figuur 17 toont de genexpressies voor IGF-1, in SOL en EDL, 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie, voor de 4 testgroepen.
[26]
Figuur 17: genexpressies van IGF-1, in SOL en EDL, 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie, voor de 4 testgroepen. [significantie ten opzichte van SHAM wordt aangetoond door #:p<0.05; ##:p<0.01; ###:p<0.001]
In EDL werd een significante downregulatie van IGF-1 (p = 0.012) gevonden na endogene androgeen deprivatie ten gevolge van orchidectomie. Zowel in SOL als EDL werden geen significante verschillen in het IGF-1 mRNA expressieniveau waargenomen na orchidectomie en testosteron suppletie. Zowel in SOL als in EDL werd een significante daling van de IGF-1 mRNA expressie gevonden in de ORX+E groep in vergelijking met de SHAM groep (resp. p = 0.029 en p < 0.001).
[27]
4. BESPREKING
4.1. Androgene en oestrogene regulatie van lichaamsgewicht en spiermassa Orchidectomie, veroorzaakte een verlies van lichaamsgewicht alsook een gewichtsverlies van de zaadblaasjes, welke het succes van androgeen deprivatie aantoonde. Beiden werden door testosteron suppletie, maar - zoals verwacht - niet door oestradiol suppletie gecompenseerd. Spieratrofie ten gevolge van orchidectomie gevolgd door spierherstel na testosteron suppletie, vertoonde sterke variaties per spiergroep. Wat betreft de regulatie van de spiermassa, ontstonden hierdoor belangrijke verschillen tussen de skeletspieren SOL en EDL, enerzijds en LA/BC, anderzijds. Er werd aangetoond dat spieratrofie en -hypertrofie in LA/BC sterk gereguleerd werden door testosteron, waardoor LA/BC zich als een androgeen gevoelige skeletspier profileerde. Spieratrofie en -hypertrofie in SOL en EDL - geïnduceerd door androgeen deprivatie en suppletie - vertoonden onderling geen significante verschillen. Nochtans toonden studies aan dat bij verlies van spiermassa door androgeen depletie, type-II spiervezels (fast-twitch, EDL) een grotere voorkeur vertoonden tot atrofie (23), en dat bij toename van spiermassa na testosteron suppletie, type-I spiervezels (slow-twitch, SOL) een grotere sensibiliteit vertoonden tot hypertrofie (14). In tegenstelling tot andere studies waar de catabolische effecten van lange termijn androgeen deprivatie op de skeletspiermassa niet eenduidig aangetoond werden (41,42), bleek uit ons onderzoek dat spieratrofie in zowel SOL, EDL als LA/BC door androgeen deprivatie geïnduceerd werd, waardoor onze studie een goed model bleek te zijn om atrofie signaalwegen te onderzoeken. Daarnaast bevestigde ons onderzoek wat in de literatuur bekend was, namelijk dat skeletspieren - waaronder SOL en EDL - van volwassen knaagdieren, in het algemeen vaak een lage respons hadden op androgeen suppletie, als gevolg van een lage androgeen-receptor expressie (14). Niettemin onderstreept ons onderzoek het belang van androgene suppletie bij dalende endogene androgeen concentraties, waardoor de circulerende concentraties opnieuw binnen de fysiologische grenzen kunnen gebracht worden, resulterend in behoud van lichaamsgewicht en spiermassa (7,16,17).
4.2. Effecten van orchidectomie en sex-steroïden suppletie op genexpressies
4.2.1. Atrofie signaalwegen, door Atrogin-1 en MuRF1 gekarakteriseerd In overeenstemming met de uitgesproken atrofie (56,5% na 30 dagen interventie) in LA/BC [28]
na orchidectomie, werd een significante overexpressie van zowel Atrogin-1 als MuRF1 (resp. x10 en x4, ten aanzien van de SHAM groep) vastgesteld na orchidectomie. Spieratrofie in LA/BC werd sterk door testosteron gereguleerd, waardoor testosteron suppletie na orchidectomie het tegengestelde effect van orchidectomie induceerde. Hierdoor werd een significante onderdrukking van de upregulatie van Atrogin-1 en MuRF1 ten gevolge van androgeen deprivatie in LA/BC veroorzaakt, waardoor beiden zich opnieuw op baselineniveau bevonden. Oestradiol suppletie na orchidectomie, wat het verlies aan spiermassa niet volledig kon reduceren, upreguleerde de expressieniveaus van Atrogin-1 en MuRF1 (tot resp. x4 en x2, ten aanzien van de SHAM groep). Onze studie toonde aan dat oestradiol suppletie na orchidectomie, spieratrofie ten gevolge van orchidectomie niet volledig kon reduceren. Svensson et al (33) echter, toonde aan dat oestrogeenreceptor gemedieerde signalisatie bij C57BL/6-muizen, een positief effect kon hebben op de eiwitsynthese van de skeletspier en dat de toename van spiermassa beperkt merkbaar was, wat de upregulatie van de atrogenen in de ORX+E groep ten opzichte van de ORX+V groep kan verklaren. Er bleek voor wat betreft LA/BC een omgekeerde evenredigheid te bestaan tussen spieratrofie en de expressieniveaus van Atrogin-1 en MuRF1, waardoor Atrogin-1 en MuRF1 zich als belangrijke regulatoren in de atrofie signaalwegen profileerden. In vergelijking met LA/BC toonde onze studie een beperkte, maar significante atrofie in SOL en EDL (resp. 14,5%, 12,8%
na 30 dagen interventie) na orchidectomie. Bovendien
veroorzaakte androgeen suppletie na orchidectomie een significante stijging van de spiermassa voor SOL en EDL. Toch werd in de studie vastgesteld dat de expressieniveaus van Atrogin-1 en MuRF1 in SOL en EDL, na orchidectomie, alsook na testosteron suppletie na orchidectomie, minder uitgesproken waren ten aanzien van LA/BC. Al worden Atrogin-1 en MuRF1 als mastergenen in de atrofie signaalwegen beschouwd (19), hun functie als masterregulatoren in de castratie geïnduceerde atrofie signalering, in SOL en EDL, speelde een minder belangrijke rol. Terwijl Pires-Oliveira et al (42), maar ook anderen veelal LA/BC gebruikten als model om orchidectomie geïnduceerde spieratrofie te onderzoeken, toonde onze studie belangrijke verschillen aan op dat vlak en reageerden skeletspieren als SOL en EDL, in tegenstelling tot het LA/BC, minder uitgesproken op androgenen. In het kader van verdere onderzoeken aangaande de moleculaire regulatie van skeletspieren door androgenen kan dit belangrijke implicaties met zich meebrengen. Niettegenstaande onze studie uitsluitend gericht was op de analyse van genexpressies 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie, lijkt het zinvol te onderzoeken of de genexpressie na kortere interventieperiodes (vb. na 24 uur, na 7 dagen, …, na 30dagen) meer [29]
duidelijkheid kunnen brengen over het verloop van de expressieniveaus van Atrogin-1 en MuRF1 in SOL en EDL, maar ook in LA/BC. Hierdoor kan nagegaan worden of in SOL en EDL, de expressieniveaus van Atrogin-1 en MuRF1 in een vroeger stadium van de spieratrofie detecteerbaar zijn. Daarnaast kan een tijdsspecifieke evaluatie van de expressieniveaus van de atrogenen aanduiding geven wanneer genexpressies een piekwaarde bereiken, constant blijven, dan wel tot ‘baseline’-niveau terugkeren. Verder onderzoek is noodzakelijk om deze moleculaire regulatie te verduidelijken.
4.2.2. Signalisatie van de hypertrofie signaalwegen via S6K1 en 4EBP1 Ons onderzoek toonde aan dat androgeen deprivatie na orchidectomie, wat tot spieratrofie leidde, een significante upregulatie van 4EBP1 in SOL en een significante downregulatie van S6K1 in EDL veroorzaakte. Testosteron suppletie na orchidectomie, wat de spieratrofie reduceerde vertoonde een significante downregulatie van S6K1 in SOL. Oestradiol suppletie na orchidectomie, wat het verlies aan spiermassa niet kon reduceren, induceerde een downregulatie van het S6K1- en 4EBP1 expressieniveau in EDL. Onze studie kon hierdoor geenszins de betrokkenheid van S6K1 en 4EBP1 in de hypertrofie signaalweg bevestigen, zoals deze in de wetenschappelijke literatuur beschreven werd (9,22,23). De analyse van de expressieniveaus van S6K1 en 4EBP1 leverde hiermee geen waardevolle gegevens op om een totaalbeeld te vormen over de moleculaire regulatie in de skeletspieren, laat staan duidelijkheid te scheppen aangaande de signalisatie van de hypertrofie signaalwegen via S6K1 en 4EBP1. 4.2.3. Myostatine, een negatieve regulator in de eiwitsynthese Spieratrofie ten gevolge van endogene androgeen deprivatie na orchidectomie in SOL en EDL (resp. 14,5% en 12,8% gewichtsafname na 30 dagen interventie), induceerde een significante overexpressie van MSTN in EDL. Ondanks de gekende rol van myostatine als endogene inhibitor van spiergroei, vonden we een significante onderexpressie van MSTN in SOL na orchidectomie. Testosteron suppletie na orchidectomie reduceerde deze verandering in expressie, voor zowel SOL als EDL, wat in overeenstemming is met wat in de literatuur door Kovacheva et al (13) aangehaald werd dat testosteron de myostatine mRNA expressieniveaus in de skeletspieren negatief reguleren. Oestradiol suppletie daarentegen, kon het verlies aan spiermassa niet reduceren, maar induceerde een significante upregulatie van het MSTN mRNA expressieniveau in EDL, in vergelijking met SHAM. Deze studie toonde aan dat de moleculaire regulatie van myostatine tijdens atrofie signalering [30]
door androgeen deprivatie, verschillend is tussen spiertypes. Het was opmerkelijk dat de significante overexpressie van het MSTN mRNA expressieniveau zich enkel voordeed in EDL. Belangrijke vaststelling in onze studie was dat het gemiddelde mRNA expressieniveau van MSTN in EDL, 38x hoger was dan in SOL. Vandaar stelt zich de vraag, op welke wijze het spiertype (fast-twitch-EDL vs slow-twitch-SOL), bepalend is om de moleculaire regulatie van MSTN in de atrofie signaalweg aan te geven. Meer nog, zoals Mendler et al (27) in hun studie aangaven is binnen eenzelfde spiertype (fast-twitch-LA/BC) een onderscheid in het mRNA expressieniveau merkbaar. De rol die MSTN hierin heeft is volgens de literatuur nog steeds onduidelijk, al wordt er evenwel van uitgegaan dat de invloed van MSTN op het spiertype gedurende de prenatale myogenesis bepalend wordt voor de ontwikkeling van het volwassen spiertype (24). Verder onderzoek op eiwitniveau en downstream target van myostatine is noodzakelijk om verduidelijking in deze regulatie te brengen.
4.2.4. IGF-1, een mediator in de proteïnesynthese Spieratrofie ten gevolge van androgeen deprivatie na orchidectomie veroorzaakte een significante downregulatie van IGF-1 in EDL. In vergelijking met de SHAM groep, werden zowel in SOL als EDL, geen significante verschillen waargenomen na orchidectomie en testosteron suppletie, maar werd enkel vastgesteld dat testosteron suppletie na orchidectomie de downregulatie onderdrukte. Oestradiol suppletie na orchidectomie daarentegen, dat het verlies aan spiermassa niet kon reduceren, zorgde er voor dat, in vergelijking met de SHAM groep, zowel in SOL als in EDL een significante downregulatie van de IGF-1 expressie vastgesteld werd. Het was opmerkelijk dat significante over- en onderexpressie van IGF-1, ten gevolge van sex-steroïden suppletie en deprivatie, vooral in EDL tot uiting kwam. Verder onderzoek moet verduidelijken of ook in het geval van IGF-1, het spiertype een bepalende factor is om de moleculaire regulatie te determineren.
[31]
5.ALGEMEEN BESLUIT Onze studie onderstreepte het belang van hormonale interventies bij dalende endogene androgeen concentraties. Behoud van lichaamsgewicht en spiermassa werd door testosteron suppletie, maar - zoals verwacht - niet door oestradiol suppletie geïnduceerd. Spieratrofie ten gevolge van orchidectomie, maar ook spierhypertrofie na testosteron suppletie, vertoonde evenwel grote verschillen per spiergroep, wat het voorkomen van androgeen gevoelige spieren aantoonde. Atrogin-1 en MuRF1 profileerden zich als belangrijke regulatoren in de atrofie signaalwegen in de androgeen gevoelige LA/BC, maar in castratie geïnduceerde atrofie signalering in skeletspieren kwam deze functie minder tot uiting. Atrofiesignalering en genexpressies van Atrogin-1 en MuRF1 bleken hierdoor spierspecifiek te zijn. Onderzoek naar genexpressies van Atrogin-1 en MuRF1 over verschillende interventieperiodes kan de moleculaire regulatie van deze atrogenen verduidelijken. Onze studie leverde, voor wat betreft S6K1 en 4EBP1, onvoldoende waardevolle gegevens op over hun moleculaire regulatie in de skeletspieren, waardoor de signalisatie van de hypertrofie signaalwegen via S6K1 en 4EBP1 niet in beeld gebracht kon worden. Ondanks de gekende rol van MSTN als endogene inhibitor van de eiwitsynthese, bleek de moleculaire regulatie van MSTN in de atrofie signalering na androgeen deprivatie te verschillen naargelang het spiertype. Onderzoek op eiwitniveau en downstream target van MSTN is noodzakelijk om verduidelijking in deze regulatie te brengen. Verder onderzoek moet eveneens uitklaren of ook in het geval van IGF-1, het spiertype een bepalende factor is om de moleculaire regulatie te determineren.
[32]
6. REFERENTIES 1. Waters DL et al. Advantages of dietry, exercise-related and therapeutic intervantions to prevent and treat sarcopenia in adult patients: an update. Clinical Interventions in Aging. 2010;5:259-270. 2. Cruz-Jentoft AJ et al. Sarcopenia: European consensus on definition and diagnosis. Age and Aging. 2010;39:412-423. 3. Lang T et al. Sarcopenia: etiology, clinical consequences, intervention and assessment. Osteoporosis Int. 2010;21:543-559. 4. Lenk K et al. Skeletal muscle wasting in cachexia and sarcopenia: molecular physiopathology and impact of exercise training. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2010;1:9-21. 5. Janssen I. Evolution of sarcopenia Research. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 2010;35:707-712. 6.Navarro A et al. Skeletal muscle and aging. Frontiers in Bioscience. 2001;6:26-44. 7.Haren MT et al. Testosteron modulates gene expression pathways regulating nutrient accumulation, glucose metabolism and protein turnover in mouse skeletal muscle. International Journal of Andrology. 2010;34:55-68. 8. Marcell TJ et al. Comparison of GH, IGF-I, and testosteron with mRNA of receptors and myostatin in skeletal muscle in older men. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2001;281:E1159-E1164. 9. Serra C et al. The role of GH and IGF-1 in Mediating Anabolic Effects of Testosteron on AndrogenResponsive Muscle. Endocrinology. 2011;152(1):193-206. 10. Vingren JL et al. Testosteron Physiology in Resistance Exercise and Training. The Up-Stream Regulatory Elements. Sports Med. 2010; 40 (12): 1037-1053. 11. Isidori AM et al. Effects of testosteron on body composition, bone metabolism and serum lipid profile in middle-aged men: a meta-analysis. Clinical Endocrinology. 2005;63:280-293. 12. Basaria S et al. Adverse Events Associated with Testosteron Administration. N Engl J Med. 2010;363:10922. 13. Kovacheva EL et al. Testosteron Supplementation Reverses Sarcopenia in Aging through Regulation of Myostatin, c-Jun NH2-Terminal Kinase, Notch, and Akt Signaling Pathway. Endocrinology. 2010; 151(2): 628– 638. 14. Kadi F. Cellular and molecular mechanisms responsible for the action of testosteron on human skeletal muscle. A basis for illigal performance enhancement. British Journal of Pharmacology. 2008;154: 522–528. 15. Ottenbacher KJ et al. Androgen treatment and muscle strength in eldery males. J Am Geriatr Soc. 2006;54(11): 1666-1673 16. Myers JB et al.. Androgen replacement therapy in the aging male. Reviews in urology. 200;5(4): 216-226 17. Borst SE. Interventions for sarcopenia and muscle weakness in older people. Age and aging. 2004;33(6): 548-555. 18. Haddad F et al. Aging-sensitive cellular and molecular mechanismes associated with skeletal muscle hypertophy. J Appl Physiol. 2006;100:1188-1203. 19. Sandri M. Signaling in muscle atrophy and hypertrophy. Physiology (Bethesda ). 2008;23:160-70.
[33]
20. Wua Y et al. Testosteron-induced hypertrophy of L6 myoblasts is dependent upon Erk and mTOR. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2010; 400: 679-683. 21. Pimentel GD et al. beta-Hydroxy-beta-methylbutyrate supplementation stimulates muscle hypertrophy in rats via the mTOR-pathway. Nutrition & Metabolism. 2011;8:11. 22. Park I-H et al. Skeletal myocyte hypertrophy requires mTOR-kinase activity and SK61. Experimental Cell Research. 2005;309:211-219. 23. Léger B et al. Human sarcopenia reveals an increase in SOCS3 and myostatin and a reduced efficiency of Akt phosphorylation. Rejuvenation Research. 2011;11: 163-175. 24. Siriett V et al. Prolonged Absence of Myostatin Reduces Sarcopenia. Journal of Cellular Physiology. 2006;209:866-873. 25. Kollias HD et al. Transforming growth factor-β and myostatin signaling in skeletal muscle. J Appl Physiol. 2007;104:579-587. 26. Fingar DC et al. Mammalian cell size is controlled by mTOR and its downstream targets S6K1 and 4EBP1/eIF4E. Genes & Development. 2002;16:1472-1478. 27. Mendler L et al. Androgens negatively regulate myostatin expression in an androgen-dependent skeletal muscle. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2007;361:237-242. 28. Kahlert S et al. Effects of estrogen on skeletal myoblast growth. Biochem Biophys Res Commun. 1997;232(2):373-8. 29. Galluzzo P et al. 17beta-Estradiol regulates the First steps of skeletal muscle cell differentiation via ERalpha-mediated-signals. Am J Physiol Cell Physiol. 2009;297(5):C1249-C1262. 30. Moran AL et al. Estradiol replacement reverses ovariectomy-induced muscle contractile and myosin dysfunction in mature female mice. J Appl Physiol. 2007;102(4):1387-93. 31. Boland R et al. 17beta-estradiol signaling in skeletal muscle cells and its relationship to apoptosis. Steroids. 2008;73(9-10):859-63. 32. Vasconsuelo A et al. 17beta-Estrdiol abrogates apoptosis in murine skeletal muscle cells through estrogen receptors: role of the phosphtidylinositol 3-kinase/Akt pathway. J Endrocrinol. 2008;196(2):385-397. 33. Svensson J et al. Stimulation of both estrogen and androgen receptors maintains skeletal muscle mass in gonadectomized male mice but mainly via different pathways. Journal of Molecular Endrocinology. 2010;45:4557. 34. Vanderscheuren D et al. An aged rat model of partial androgen deficiency: prevention of both loss of bone and lean body mass bij low-dose androgen replacement. Endocrinology. 2000;141(5):1942-7. 35. Vandesompele J et al. Accute normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology. 2002;3(7):0034.1–0034.11. 36. Baquet A et al. Effects on sprint training combined with vegetarian or mixed diet on muscle carnosine and buffering capacity. Eur J Appl Physiol. 2011;111(10):2571-80. 37. http://medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/ 38. http://www.biocompare.com/ProductDetails/169190/Primer-Express-software-v20.html 39. http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/ 40. http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/geNorm_manual.pdf.
[34]
41. Ibebunjo C et al. Voluntary running, skeletal muscle gene expression and signaling inversely regulated by orchidectomy and testosterone replacement. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2011; 300:E327-E340. 42. Pires-Oliveira M et al. Testosterone represses ubiquitin ligases Atrogin-1 and MuRF1 expression in an androgen-sensitive rat skeletal muscle in vivo. J Appl Physiol. 2010;108:266-273.
[35]
7. BIJLAGEN
7.1 Goedkeuring van het onderzoeksprotocol voor het dierexperimenteel onderzoek Goedkeuring van het onderzoeksprotocol voor het dierexperimenteel onderzoek door de ethische commissie dierproeven van de faculteit geneeskunde en gezondheidswetenschappen van de Universiteit Gent.
7.2. Statistische gegevens betreffende androgene en oestrogene regulatie van lichaamsgewicht en spiermassa
-
Lichaamsgewicht 30 dagen na orchidectomie en sex-steroïden suppletie
-
Gewicht van de zaadblaasjes
-
Spiermassa van SOL, EDL en LA/BC
7.3. Statistische gegevens betreffende de genexpressies
-
Atrogin-1 en MuRF1
-
S6K1 en 4EBP1
-
Myostatine
-
IGF-1
ONEWAY LICHAAMSGEWICHT_NA BY interventiegroep /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet2] C:\temp\DATA3\invoering spss.sav Descriptives LICHAAMSGEWICHT_NA 95% Confidence Interval for Mean N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
Lower Bound
Upper Bound
sham
11
27,4873
2,44498
,73719
25,8447
29,1298
orx+v
12
24,0525
1,56974
,45315
23,0551
25,0499
orx+t
12
26,8983
2,75199
,79443
25,1498
28,6469
orx+e
12
24,4583
,69079
,19942
24,0194
24,8972
Total
47
25,6866
2,46221
,35915
24,9637
26,4095
Descriptives LICHAAMSGEWICHT_NA Minimum
Maximum
sham
21,60
29,80
orx+v
21,70
26,70
orx+t
21,90
30,52
orx+e
23,40
25,30
Total
21,60
30,52
Test of Homogeneity of Variances LICHAAMSGEWICHT_NA Levene Statistic 4,136
df1
df2 3
Sig. 43
,012 ANOVA
LICHAAMSGEWICHT_NA Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
103,433
3
34,478
Within Groups
175,441
43
4,080
Total
278,874
46
F 8,450
Sig. ,000
Page 1
Robust Tests of Equality of Means LICHAAMSGEWICHT_NA Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
7,966
3
20,513
,001
Brown-Forsythe
8,335
3
29,022
,000
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons LICHAAMSGEWICHT_NA LSD
(I) interventiegroep sham
(J) interventiegroep orx+v orx+t orx+e
orx+v
sham orx+t
orx+t
3,43477
Std. Error
*
,58894 3,02894 -3,43477 -2,84583
* * *
Sig.
,84316
,000
,84316
,489
,84316
,001
,84316
,000
,82462
,001
orx+e
-,40583
,82462
,625
sham
-,58894
,84316
,489
,82462
,001
,82462
,005
,84316
,001
,82462
,625
,82462
,005
orx+v orx+e orx+e
Mean Difference (IJ)
sham orx+v orx+t
2,84583 2,44000 -3,02894
* * *
,40583 -2,44000
*
Multiple Comparisons LICHAAMSGEWICHT_NA LSD 95% Confidence Interval Lower Bound
Upper Bound
orx+v
1,7344
5,1352
orx+t
-1,1114
2,2893
orx+e
1,3286
4,7293
sham
-5,1352
-1,7344
orx+t
-4,5088
-1,1828
orx+e
-2,0688
1,2572
sham
-2,2893
1,1114
orx+v
1,1828
4,5088
orx+e
,7770
4,1030
sham
-4,7293
-1,3286
orx+v
-1,2572
2,0688
orx+t
-4,1030
-,7770
(I) interventiegroep
(J) interventiegroep
sham
orx+v
orx+t
orx+e
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots
Mean of LICHAAMSGEWICHT_NA
28,00
27,00
26,00
25,00
24,00 sham
orx+v
orx+t
orx+e
interventiegroep * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventiegroep MEANSD(LICHA AMSGEWICHT_NA, 1.)[name="MEAN_LICHAAMSGEWICHT_NA" LOW="MEAN_LICHAAMSGEWICHT _NA_LOW" HIGH="MEAN_LICHAAMSGEWICHT_NA_HIGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSIN G=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventiegroep=col(source(s), name("interventiegroep"), unit.cate gory()) DATA: MEAN_LICHAAMSGEWICHT_NA=col(source(s), name("MEAN_LICHAAMSGEWICHT_N A")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_LICHAAMSGEWICHT_NA_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_LICHAAMSGEWICHT_NA_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventiegroep")) Page 3
GUIDE: axis(dim(2), label("Mean LICHAAMSGEWICHT_NA")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventiegroep*MEAN_LICHAAMSGEWICHT_NA), sha pe.interior(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventiegroep*(LOW+HIGH ))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet2] C:\temp\DATA3\invoering spss.sav
LGd30 (g)
30
25
20
sham
orx + V
orx + T
orx + E
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY ZAADBLAASJES_GEWICHT BY interventiegroep /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet1] Descriptives ZAADBLAASJES_GEWICHT 95% Confidence Interval for Mean N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
Lower Bound
Upper Bound
SHAM
11
179,61
23,472
7,077
163,84
195,38
ORX + V
12
21,85
28,705
8,286
3,61
40,08
ORX + T
12
212,28
35,543
10,260
189,70
234,87
ORX + E
12
19,38
6,373
1,840
15,33
23,43
Total
47
106,76
93,141
13,586
79,41
134,11
Descriptives ZAADBLAASJES_GEWICHT Minimum
Maximum
129
212
ORX + V
7
112
ORX + T
148
295
ORX + E
12
32
7
295
SHAM
Total
Test of Homogeneity of Variances ZAADBLAASJES_GEWICHT Levene Statistic 2,381
df1
df2 3
Sig. 43
,083 ANOVA
ZAADBLAASJES_GEWICHT Sum of Squares Between Groups Within Groups Total
df
Mean Square
370147,647
3
123382,549
28916,070
43
672,467
399063,717
46
F 183,478
Sig. ,000
Page 1
Robust Tests of Equality of Means ZAADBLAASJES_GEWICHT Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
246,467
3
19,284
,000
Brown-Forsythe
184,466
3
30,371
,000
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons ZAADBLAASJES_GEWICHT LSD
(I) interventiegroep SHAM
(J) interventiegroep ORX + V
157,761
ORX + T
-32,676
ORX + E ORX + V
160,230 -157,761
SHAM ORX + T
-190,437
ORX + E ORX + T
Std. Error * * * * *
2,469 32,676
SHAM
190,437
ORX + V ORX + E ORX + E
Mean Difference (IJ)
192,906 -160,230
SHAM
* * * *
-2,469
ORX + V ORX + T
-192,906
*
Sig.
10,825
,000
10,825
,004
10,825
,000
10,825
,000
10,587
,000
10,587
,817
10,825
,004
10,587
,000
10,587
,000
10,825
,000
10,587
,817
10,587
,000
Multiple Comparisons ZAADBLAASJES_GEWICHT LSD 95% Confidence Interval Lower Bound
Upper Bound
ORX + V
135,93
179,59
ORX + T
-54,51
-10,85
ORX + E
138,40
182,06
SHAM
-179,59
-135,93
ORX + T
-211,79
-169,09
ORX + E
-18,88
23,82
10,85
54,51
ORX + V
169,09
211,79
ORX + E
171,56
214,26
-182,06
-138,40
ORX + V
-23,82
18,88
ORX + T
-214,26
-171,56
(I) interventiegroep
(J) interventiegroep
SHAM
ORX + V
ORX + T
ORX + E
SHAM
SHAM
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots
Mean of ZAADBLAASJES_GEWICHT
250
200
150
100
50
0 SHAM
ORX + V
ORX + T
ORX + E
interventiegroep * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventiegroep MEANSD(ZAAD BLAASJES_GEWICHT, 1.)[name="MEAN_ZAADBLAASJES_GEWICHT" LOW="MEAN_ZAADBLAAS JES_GEWICHT_LOW" HIGH="MEAN_ZAADBLAASJES_GEWICHT_HIGH"] MISSING=LISTWISE R EPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventiegroep=col(source(s), name("interventiegroep"), unit.cat egory()) DATA: MEAN_ZAADBLAASJES_GEWICHT=col(source(s), name("MEAN_ZAADBLAASJES_G EWICHT")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_ZAADBLAASJES_GEWICHT_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_ZAADBLAASJES_GEWICHT_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventiegroep")) Page 3
GUIDE: axis(dim(2), label("Mean ZAADBLAASJES_GEWICHT")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventiegroep*MEAN_ZAADBLAASJES_GEWICHT), shape.interior(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventiegroep*(LOW+HIG H))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet1]
ZAADBLAASJES_GEWICHT
250
200
150
100
50
0
SHAM
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY SOL_MASSA BY interventiegroep /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet1] C:\temp\23042012\23042012(SPSS).sav Descriptives SOL_MASSA N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
SHAM
10
9,1920000000
1,5335927316
,48496460351
ORX + V
12
7,8616666666
1,0235040820
,29546017865
ORX + T
10
9,1850000000
1,5581916156
,49274345364
ORX + E
12
7,5333333333
1,3651395755
,39408185069
Total
44
8,3752272727
1,5245319352
,22983183682
Descriptives SOL_MASSA 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound
Upper Bound
Minimum
Maximum
SHAM
8,0949338484
10,289066151
7,4200000000
11,580000000
ORX + V
7,2113631980
8,5119701352
6,4500000000
9,6100000000
ORX + T
8,0703368669
10,299663133
7,0400000000
11,950000000
ORX + E
6,6659650280
8,4007016385
5,4900000000
9,6700000000
Total
7,9117272002
8,8387273451
5,4900000000
11,950000000
Test of Homogeneity of Variances SOL_MASSA Levene Statistic ,961
df1
df2 3
Sig. 40
,420 ANOVA
SOL_MASSA Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
24,899
3
8,300
Within Groups
75,042
40
1,876
Total
99,940
43
F 4,424
Sig. ,009
Page 1
Robust Tests of Equality of Means SOL_MASSA Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
3,872
3
21,031
,024
Brown-Forsythe
4,285
3
34,529
,011
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons SOL_MASSA LSD Mean Difference (IJ)
Std. Error
Sig.
(I) interventiegroep
(J) interventiegroep
SHAM
ORX + V
1,3303333333
,58646471784
,029
ORX + T
,00700000000
,61254242029
,991
ORX + E
1,6586666666
,58646471784
,007
SHAM
-1,330333333
,58646471784
,029
ORX + T
-1,323333333
,58646471784
,030
ORX + E
,32833333333
,55917216837
,560
SHAM
-,0070000000
,61254242029
,991
ORX + V
1,3233333333
,58646471784
,030
ORX + E
1,6516666666
,58646471784
,008
SHAM
-1,658666666
,58646471784
,007
ORX + V
-,3283333333
,55917216837
,560
ORX + T
-1,651666666
,58646471784
,008
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Multiple Comparisons SOL_MASSA LSD 95% Confidence Interval (I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Lower Bound
Upper Bound
SHAM
ORX + V
,14504392481
2,5156227418
ORX + T
-1,230994411
1,2449944111
ORX + E
,47337725814
2,8439560751
SHAM
-2,515622741
-,1450439248
ORX + T
-2,508622741
-,1380439248
ORX + E
-,8017957751
1,4584624417
SHAM
-1,244994411
1,2309944111
ORX + V
,13804392481
2,5086227418
ORX + E
,46637725814
2,8369560751
SHAM
-2,843956075
-,4733772581
ORX + V
-1,458462441
,80179577512
ORX + T
-2,836956075
-,4663772581
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots 9,5000000000
Mean of SOL_MASSA
9,0000000000
8,5000000000
8,0000000000
7,5000000000 SHAM
ORX + V
ORX + T
ORX + E
interventiegroep * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventiegroep MEANSD(SOL_ MASSA, 1.)[name="MEAN_SOL_MASSA" LOW="MEAN_SOL_MASSA_LOW" HIGH="MEAN_SOL_M ASSA_HIGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventiegroep=col(source(s), name("interventiegroep"), unit.cat egory()) DATA: MEAN_SOL_MASSA=col(source(s), name("MEAN_SOL_MASSA")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_SOL_MASSA_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_SOL_MASSA_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventiegroep")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean SOL_MASSA")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) Page 3
SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventiegroep*MEAN_SOL_MASSA), shape.inter ior(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventiegroep*(LOW+HIG H))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet1] C:\temp\23042012\23042012(SPSS).sav
11,0
SOL_MASSA
10,0
9,0
8,0
7,0
6,0
SHAM
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY EDL_MASSA BY interventiegroep /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet1] Descriptives EDL_MASSA N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
SHAM
11
10,746363636
,95587941422
,28820848743
ORX + V
12
9,3658333333
1,1542526770
,33320404689
ORX + T
12
10,743333333
1,3286242599
,38354078707
ORX + E
12
9,3050000000
1,2706798466
,36681367576
Total
47
10,025106382
1,3539136064
,19748859668
Descriptives EDL_MASSA 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound
Upper Bound
Minimum
Maximum
SHAM
10,104195108
11,388532164
9,3300000000
12,200000000
ORX + V
8,6324561708
10,099210495
6,9600000000
11,260000000
ORX + T
9,8991657526
11,587500913
9,1800000000
13,210000000
ORX + E
8,4976485431
10,112351456
6,8400000000
10,970000000
Total
9,6275824558
10,422630310
6,8400000000
13,210000000
Test of Homogeneity of Variances EDL_MASSA Levene Statistic ,119
df1
df2 3
Sig. 43
,948 ANOVA
EDL_MASSA Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
23,351
3
7,784
Within Groups
60,971
43
1,418
Total
84,322
46
F 5,489
Sig. ,003
Page 1
Robust Tests of Equality of Means EDL_MASSA Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
5,490
3
23,845
,005
Brown-Forsythe
5,548
3
41,488
,003
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons EDL_MASSA LSD Mean Difference (IJ)
Std. Error
Sig.
(I) interventiegroep
(J) interventiegroep
SHAM
ORX + V
1,3805303030
,49705457255
,008
ORX + T
,00303030303
,49705457255
,995
ORX + E
1,4413636363
,49705457255
,006
SHAM
-1,380530303
,49705457255
,008
ORX + T
-1,377500000
,48612896205
,007
ORX + E
,06083333333
,48612896205
,901
SHAM
-,0030303030
,49705457255
,995
ORX + V
1,3775000000
,48612896205
,007
ORX + E
1,4383333333
,48612896205
,005
SHAM
-1,441363636
,49705457255
,006
ORX + V
-,0608333333
,48612896205
,901
ORX + T
-1,438333333
,48612896205
,005
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Multiple Comparisons EDL_MASSA LSD 95% Confidence Interval (I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Lower Bound
Upper Bound
SHAM
ORX + V
,37812422396
2,3829363820
ORX + T
-,9993757760
1,0054363820
ORX + E
,43895755729
2,4437697154
SHAM
-2,382936382
-,3781242239
ORX + T
-2,357872485
-,3971275144
ORX + E
-,9195391522
1,0412058189
SHAM
-1,005436382
,99937577603
ORX + V
,39712751440
2,3578724855
ORX + E
,45796084774
2,4187058189
SHAM
-2,443769715
-,4389575572
ORX + V
-1,041205818
,91953915225
ORX + T
-2,418705818
-,4579608477
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots 11,0000000000000000
Mean of EDL_MASSA
10,5000000000000000
10,0000000000000000
9,5000000000000000
9,0000000000000000 SHAM
ORX + V
ORX + T
ORX + E
interventiegroep * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventiegroep MEANSD(EDL_ MASSA, 1.)[name="MEAN_EDL_MASSA" LOW="MEAN_EDL_MASSA_LOW" HIGH="MEAN_EDL_M ASSA_HIGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventiegroep=col(source(s), name("interventiegroep"), unit.cat egory()) DATA: MEAN_EDL_MASSA=col(source(s), name("MEAN_EDL_MASSA")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_EDL_MASSA_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_EDL_MASSA_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventiegroep")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean EDL_MASSA")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) Page 3
SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventiegroep*MEAN_EDL_MASSA), shape.inter ior(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventiegroep*(LOW+HIG H))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet1]
13,0
EDL_MASSA
12,0
11,0
10,0
9,0
8,0
SHAM
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY LABC_MASSA BY interventiegroep /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet1] Descriptives LABC_MASSA N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
SHAM
11
74,159090909
17,401770286
5,2468311570
ORX + V
12
32,225833333
14,930929130
4,3101879763
ORX + T
12
87,814166666
10,213809242
2,9484727578
ORX + E
12
37,684166666
7,2915486051
2,1048887749
Total
47
57,626382978
27,054562696
3,9463135577
Descriptives LABC_MASSA 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound
Upper Bound
Minimum
Maximum
SHAM
62,468422558
85,849759259
24,890000000
87,870000000
ORX + V
22,739173560
41,712493106
23,010000000
79,020000000
ORX + T
81,324621881
94,303711451
66,770000000
100,47000000
ORX + E
33,051337709
42,316995624
25,120000000
46,110000000
Total
49,682865786
65,569900171
23,010000000
100,47000000
Test of Homogeneity of Variances LABC_MASSA Levene Statistic ,471
df1
df2 3
Sig. 43
,704 ANOVA
LABC_MASSA Sum of Squares Between Groups Within Groups Total
df
Mean Square
26456,821
3
8818,940
7212,850
43
167,741
33669,671
46
F 52,575
Sig. ,000
Page 1
Robust Tests of Equality of Means LABC_MASSA Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
72,920
3
22,429
,000
Brown-Forsythe
51,348
3
30,953
,000
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons LABC_MASSA LSD
(I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Mean Difference (IJ)
SHAM
ORX + V
41,933257575
5,4062504610
,000
ORX + T
-13,65507575
5,4062504610
,015
ORX + E
36,474924242
5,4062504610
,000
SHAM
-41,93325757
5,4062504610
,000
ORX + T
-55,58833333
5,2874172582
,000
ORX + E
-5,458333333
5,2874172582
,308
SHAM
13,655075757
5,4062504610
,015
ORX + V
55,588333333
5,2874172582
,000
ORX + E
50,130000000
5,2874172582
,000
SHAM
-36,47492424
5,4062504610
,000
ORX + V
5,4583333333
5,2874172582
,308
ORX + T
-50,13000000
5,2874172582
,000
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Std. Error
Sig.
Multiple Comparisons LABC_MASSA LSD 95% Confidence Interval (I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Lower Bound
Upper Bound
SHAM
ORX + V
31,030514443
52,836000707
ORX + T
-24,55781888
-2,752332625
ORX + E
25,572181110
47,377667374
SHAM
-52,83600070
-31,03051444
ORX + T
-66,25142647
-44,92524019
ORX + E
-16,12142647
5,2047598055
SHAM
2,7523326256
24,557818889
ORX + V
44,925240194
66,251426472
ORX + E
39,466906861
60,793093138
SHAM
-47,37766737
-25,57218111
ORX + V
-5,204759805
16,121426472
ORX + T
-60,79309313
-39,46690686
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots 90,000000000000
Mean of LABC_MASSA
80,000000000000
70,000000000000
60,000000000000
50,000000000000
40,000000000000
30,000000000000 SHAM
ORX + V
ORX + T
ORX + E
interventiegroep * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventiegroep MEANSD(LABC _MASSA, 1.)[name="MEAN_LABC_MASSA" LOW="MEAN_LABC_MASSA_LOW" HIGH="MEAN_LA BC_MASSA_HIGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventiegroep=col(source(s), name("interventiegroep"), unit.cat egory()) DATA: MEAN_LABC_MASSA=col(source(s), name("MEAN_LABC_MASSA")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_LABC_MASSA_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_LABC_MASSA_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventiegroep")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean LABC_MASSA")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) Page 3
SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventiegroep*MEAN_LABC_MASSA), shape.inte rior(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventiegroep*(LOW+HIG H))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet1]
100,0
LABC_MASSA
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
SHAM
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY atrogin_sol BY interventieperiode /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet3] C:\temp\data4\test.sav Descriptives atrogin_sol 95% Confidence Interval for Mean N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
Lower Bound
Upper Bound
sham
11
,94621216806
,13080452952
,03943904957
,85833648942
1,0340878467
orx+v
12
1,2255986726
,33041505762
,09538261123
1,0156629607
1,4355343844
orx+t
12
,84420056892
,21847157356
,06306731090
,70539035353
,98301078430
orx+e
11
,87167240222
,22599482622
,06814000392
,71984701210
1,0234977923
Total
46
,97465915590
,27861681078
,04107980759
,89192017620
1,0573981356
Descriptives atrogin_sol Minimum
Maximum
sham
,7448387316
1,2030250361
orx+v
,6790862219
1,6263825787
orx+t
,5433674313
1,2497735102
orx+e
,6008180248
1,2968395547
Total
,5433674313
1,6263825787
Test of Homogeneity of Variances atrogin_sol Levene Statistic 3,925
df1
df2 3
Sig. 42
,015 ANOVA
atrogin_sol Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
1,085
3
,362
Within Groups
2,408
42
,057
Total
3,493
45
F 6,311
Sig. ,001
Page 1
Robust Tests of Equality of Means atrogin_sol Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
3,868
3
22,450
,023
Brown-Forsythe
6,467
3
32,270
,001
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons atrogin_sol LSD
(I) interventieperiode
(J) interventieperiode
Mean Difference (IJ)
sham
orx+v
-,2793865045
,09994487873
,008
orx+t
,10201159913
,09994487873
,313
orx+e
,07453976583
,10209447688
,469
sham
,27938650457
,09994487873
,008
orx+t
,38139810370
,09774801972
,000
orx+e
,35392627041
,09994487873
,001
sham
-,1020115991
,09994487873
,313
orx+v
-,3813981037
,09774801972
,000
orx+e
-,0274718332
,09994487873
,785
sham
-,0745397658
,10209447688
,469
orx+v
-,3539262704
,09994487873
,001
orx+t
,02747183329
,09994487873
,785
orx+v
orx+t
orx+e
Std. Error
Sig.
Multiple Comparisons atrogin_sol LSD 95% Confidence Interval (I) interventieperiode
(J) interventieperiode
Lower Bound
Upper Bound
sham
orx+v
-,4810834356
-,0776895735
orx+t
-,0996853319
,30370853020
orx+e
-,1314952299
,28057476160
sham
,07768957350
,48108343563
orx+t
,18413461362
,57866159379
orx+e
,15222933934
,55562320147
sham
-,3037085302
,09968533192
orx+v
-,5786615937
-,1841346136
orx+e
-,2291687643
,17422509776
sham
-,2805747616
,13149522992
orx+v
-,5556232014
-,1522293393
orx+t
-,1742250977
,22916876436
orx+v
orx+t
orx+e
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots 1,3000000000
Mean of atrogin_sol
1,2000000000
1,1000000000
1,0000000000
,9000000000
,8000000000 sham
orx+v
orx+t
orx+e
interventieperiode * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventieperiode MEANSD(atr ogin_sol, 1.)[name="MEAN_atrogin_sol" LOW="MEAN_atrogin_sol_LOW" HIGH="MEAN _atrogin_sol_HIGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventieperiode=col(source(s), name("interventieperiode"), unit. category()) DATA: MEAN_atrogin_sol=col(source(s), name("MEAN_atrogin_sol")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_atrogin_sol_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_atrogin_sol_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventieperiode")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean atrogin_sol")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) Page 3
SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventieperiode*MEAN_atrogin_sol), shape.in terior(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventieperiode*(LOW+HI GH))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet3] C:\temp\data4\test.sav
Atrogin-1_SOL
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
sham
orx + V
orx + T
orx + E
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY atrogin_edl BY interventieperiode /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet3] C:\temp\data4\test.sav Descriptives atrogin_edl 95% Confidence Interval for Mean N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
Lower Bound
Upper Bound
sham
11
,99698057657
,31397441926
,09466684931
,78604969161
1,2079114615
orx+v
12
,97173527360
,25663532660
,07408423744
,80867696637
1,1347935808
orx+t
12
,84446589442
,31205505825
,09008253594
,64619556962
1,0427362192
orx+e
11
1,2943823603
,58823659435
,17736000649
,89919963906
1,6895650815
Total
46
1,0217262243
,40751816672
,06008527567
,90070826704
1,1427441817
Descriptives atrogin_edl Minimum
Maximum
sham
,5266805180
1,6934906247
orx+v
,4880158804
1,4372722186
orx+t
,4132251591
1,5439934867
orx+e
,6292331862
2,6056921864
Total
,4132251591
2,6056921864
Test of Homogeneity of Variances atrogin_edl Levene Statistic 2,290
df1
df2 3
Sig. 42
,092 ANOVA
atrogin_edl Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
1,232
3
,411
Within Groups
6,242
42
,149
Total
7,473
45
F 2,762
Sig. ,054
Page 1
Robust Tests of Equality of Means atrogin_edl Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
1,687
3
22,451
,198
Brown-Forsythe
2,683
3
25,747
,068
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons atrogin_edl LSD Mean Difference (IJ)
Std. Error
Sig.
(I) interventieperiode
(J) interventieperiode
sham
orx+v
,02524530297
,16091719708
,876
orx+t
,15251468215
,16091719708
,349
orx+e
-,2974017837
,16437817791
,078
sham
-,0252453029
,16091719708
,876
orx+t
,12726937918
,15738012345
,423
orx+e
-,3226470867
,16091719708
,051
sham
-,1525146821
,16091719708
,349
orx+v
-,1272693791
,15738012345
,423
orx+e
-,4499164659
,16091719708
,008
sham
,29740178375
,16437817791
,078
orx+v
,32264708672
,16091719708
,051
orx+t
,44991646590
,16091719708
,008
orx+v
orx+t
orx+e
Multiple Comparisons atrogin_edl LSD 95% Confidence Interval (I) interventieperiode
(J) interventieperiode
Lower Bound
Upper Bound
sham
orx+v
-,2994987481
,34998935407
orx+t
-,1722293689
,47725873325
orx+e
-,6291303769
,03432680944
sham
-,3499893540
,29949874813
orx+t
-,1903365683
,44487532672
orx+e
-,6473911378
,00209696438
sham
-,4772587332
,17222936895
orx+v
-,4448753267
,19033656836
orx+e
-,7746605170
-,1251724147
sham
-,0343268094
,62913037694
orx+v
-,0020969643
,64739113782
orx+t
,12517241479
,77466051700
orx+v
orx+t
orx+e
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots 1,3000000000
Mean of atrogin_edl
1,2000000000
1,1000000000
1,0000000000
,9000000000
,8000000000 sham
orx+v
orx+t
orx+e
interventieperiode * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventieperiode MEANSD(atr ogin_edl, 1.)[name="MEAN_atrogin_edl" LOW="MEAN_atrogin_edl_LOW" HIGH="MEAN _atrogin_edl_HIGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventieperiode=col(source(s), name("interventieperiode"), unit. category()) DATA: MEAN_atrogin_edl=col(source(s), name("MEAN_atrogin_edl")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_atrogin_edl_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_atrogin_edl_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventieperiode")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean atrogin_edl")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) Page 3
SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventieperiode*MEAN_atrogin_edl), shape.in terior(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventieperiode*(LOW+HI GH))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet3] C:\temp\data4\test.sav
Atrogin-1_EDL
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
sham
orx + V
orx + T
orx + E
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY atrogin_labc BY interventieperiode /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet3] C:\temp\data4\test.sav Descriptives atrogin_labc 95% Confidence Interval for Mean N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
Lower Bound
Upper Bound
sham
6
,24435205129
,08520768121
,03478589019
,15493207383
,33377202875
orx+v
6
2,5201975120
,82738652231
,33777913328
1,6519086075
3,3884864165
orx+t
6
,16410576168
,03146740800
,01284651552
,13108274223
,19712878113
orx+e
11
1,0970310007
,47689814053
,14379019957
,77664647049
1,4174155309
Total
29
1,0220438950
,98764198505
,18340051241
,64636497566
1,3977228145
Descriptives atrogin_labc Minimum
Maximum
sham
,1685988577
,3991491932
orx+v
1,6282625352
3,7973684838
orx+t
,1288115025
,2073298865
orx+e
,5052257232
2,0681392589
Total
,1288115025
3,7973684838
Test of Homogeneity of Variances atrogin_labc Levene Statistic 7,685
df1
df2 3
Sig. 25
,001 ANOVA
atrogin_labc Sum of Squares Between Groups Within Groups Total
df
Mean Square
21,574
3
7,191
5,738
25
,230
27,312
28
F 31,330
Sig. ,000
Page 1
Robust Tests of Equality of Means atrogin_labc Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
27,801
3
10,951
,000
Brown-Forsythe
31,237
3
7,825
,000
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons atrogin_labc LSD
(I) interventieperiode
(J) interventieperiode
Mean Difference (IJ)
sham
orx+v
-2,275845460
,27660834850
,000
orx+t
,08024628960
,27660834850
,774
orx+e
-,8526789494
,24315231233
,002
sham
2,2758454607
,27660834850
,000
orx+t
2,3560917503
,27660834850
,000
orx+e
1,4231665113
,24315231233
,000
sham
-,0802462896
,27660834850
,774
orx+v
-2,356091750
,27660834850
,000
orx+e
-,9329252390
,24315231233
,001
sham
,85267894941
,24315231233
,002
orx+v
-1,423166511
,24315231233
,000
orx+t
,93292523902
,24315231233
,001
orx+v
orx+t
orx+e
Std. Error
Sig.
Multiple Comparisons atrogin_labc LSD 95% Confidence Interval (I) interventieperiode
(J) interventieperiode
Lower Bound
Upper Bound
sham
orx+v
-2,845531018
-1,706159902
orx+t
-,4894392681
,64993184735
orx+e
-1,353460510
-,3518973879
sham
1,7061599029
2,8455310184
orx+t
1,7864061925
2,9257773080
orx+e
,92238494987
1,9239480727
sham
-,6499318473
,48943926814
orx+v
-2,925777308
-1,786406192
orx+e
-1,433706800
-,4321436775
sham
,35189738798
1,3534605108
orx+v
-1,923948072
-,9223849498
orx+t
,43214367758
1,4337068004
orx+v
orx+t
orx+e
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots 3,0000000000
Mean of atrogin_labc
2,5000000000
2,0000000000
1,5000000000
1,0000000000
,5000000000
,0000000000 sham
orx+v
orx+t
orx+e
interventieperiode * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventieperiode MEANSD(atr ogin_labc, 1.)[name="MEAN_atrogin_labc" LOW="MEAN_atrogin_labc_LOW" HIGH="M EAN_atrogin_labc_HIGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventieperiode=col(source(s), name("interventieperiode"), unit. category()) DATA: MEAN_atrogin_labc=col(source(s), name("MEAN_atrogin_labc")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_atrogin_labc_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_atrogin_labc_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventieperiode")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean atrogin_labc")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) Page 3
SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventieperiode*MEAN_atrogin_labc), shape.i nterior(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventieperiode*(LOW+HI GH))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet3] C:\temp\data4\test.sav
Atrogin-1_LABC
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
sham
orx + V
orx + T
orx + E
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY murf_sol BY interventieperiode /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet3] C:\temp\data4\test.sav Descriptives murf_sol 95% Confidence Interval for Mean N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
Lower Bound
Upper Bound
sham
11
,66156399304
,24901414547
,07508058982
,49427401383
,82885397225
orx+v
12
,56977663861
,28957526021
,08359317721
,38578929606
,75376398115
orx+t
12
,42644966212
,10664893353
,03078689524
,35868816257
,49421116167
orx+e
11
,37491420423
,13753761976
,04146915266
,28251517402
,46731323444
Total
46
,50773860388
,23269350890
,03430878613
,43863716146
,57684004631
Descriptives murf_sol Minimum
Maximum
sham
,2673249996
1,1134216182
orx+v
,2237562677
1,1394466149
orx+t
,2497113554
,6056963685
orx+e
,2176376408
,6029039138
Total
,2176376408
1,1394466149
Test of Homogeneity of Variances murf_sol Levene Statistic 3,245
df1
df2 3
Sig. 42
,031 ANOVA
murf_sol Sum of Squares Between Groups
df
Mean Square
,580
3
,193
Within Groups
1,857
42
,044
Total
2,437
45
F 4,372
Sig. ,009
Page 1
Robust Tests of Equality of Means murf_sol Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
4,322
3
21,786
,016
Brown-Forsythe
4,394
3
29,073
,011
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons murf_sol LSD Mean Difference (IJ)
Std. Error
Sig.
(I) interventieperiode
(J) interventieperiode
sham
orx+v
,09178735442
,08776660847
,302
orx+t
,23511433091
,08776660847
,011
orx+e
,28664978880
,08965427837
,003
sham
-,0917873544
,08776660847
,302
orx+t
,14332697648
,08583743644
,102
orx+e
,19486243437
,08776660847
,032
sham
-,2351143309
,08776660847
,011
orx+v
-,1433269764
,08583743644
,102
orx+e
,05153545788
,08776660847
,560
sham
-,2866497888
,08965427837
,003
orx+v
-,1948624343
,08776660847
,032
orx+t
-,0515354578
,08776660847
,560
orx+v
orx+t
orx+e
Multiple Comparisons murf_sol LSD 95% Confidence Interval (I) interventieperiode
(J) interventieperiode
Lower Bound
Upper Bound
sham
orx+v
-,0853328322
,26890754111
orx+t
,05799414423
,41223451760
orx+e
,10572013003
,46757944757
sham
-,2689075411
,08533283225
orx+t
-,0298999834
,31655393639
orx+e
,01774224769
,37198262106
sham
-,4122345176
-,0579941442
orx+v
-,3165539363
,02989998342
orx+e
-,1255847287
,22865564457
sham
-,4675794475
-,1057201300
orx+v
-,3719826210
-,0177422476
orx+t
-,2286556445
,12558472879
orx+v
orx+t
orx+e
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots ,7000000000
Mean of murf_sol
,6000000000
,5000000000
,4000000000
,3000000000 sham
orx+v
orx+t
orx+e
interventieperiode * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventieperiode MEANSD(mu rf_sol, 1.)[name="MEAN_murf_sol" LOW="MEAN_murf_sol_LOW" HIGH="MEAN_murf_s ol_HIGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventieperiode=col(source(s), name("interventieperiode"), unit .category()) DATA: MEAN_murf_sol=col(source(s), name("MEAN_murf_sol")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_murf_sol_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_murf_sol_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventieperiode")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean murf_sol")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) Page 3
SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventieperiode*MEAN_murf_sol), shape.inte rior(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventieperiode*(LOW+H IGH))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet3] C:\temp\data4\test.sav
1,0
Murf1_SOL
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0 sham
orx+v
orx+t
orx+e
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY murf_edl BY interventieperiode /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet3] C:\temp\data4\test.sav Descriptives murf_edl 95% Confidence Interval for Mean N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
Lower Bound
Upper Bound
sham
10
,59050388256
,16120969469
,05097898161
,47518141415
,70582635097
orx+v
12
,59055553663
,47010146951
,13570660498
,29186731293
,88924376033
orx+t
12
,43889910139
,13087048887
,03777905599
,35574795979
,52205024299
orx+e
11
,49162029324
,28230003895
,08511666432
,30196854652
,68127203997
Total
45
,52591817128
,29564390714
,04407199156
,43709690853
,61473943402
Descriptives murf_edl Minimum
Maximum
sham
,3873384610
,8506671610
orx+v
,3242098887
1,9884808476
orx+t
,2434448129
,6299605249
orx+e
,1923314594
1,0668322429
Total
,1923314594
1,9884808476
Test of Homogeneity of Variances murf_edl Levene Statistic 1,790
df1
df2 3
Sig. 41
,164 ANOVA
murf_edl Sum of Squares Between Groups
df
Mean Square
,196
3
,065
Within Groups
3,650
41
,089
Total
3,846
44
F ,733
Sig. ,539
Page 1
Robust Tests of Equality of Means murf_edl Statistic Welch Brown-Forsythe
a
df1
df2
Sig.
1,947
3
21,212
,153
,767
3
23,150
,524
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons murf_edl LSD
(I) interventieperiode
(J) interventieperiode
Mean Difference (IJ)
sham
orx+v
-,0000516540
,12775731563
1,000
orx+t
,15160478116
,12775731563
,242
orx+e
,09888358931
,13037021011
,453
sham
,00005165407
,12775731563
1,000
orx+t
,15165643523
,12181182095
,220
orx+e
,09893524338
,12454950707
,432
sham
-,1516047811
,12775731563
,242
orx+v
-,1516564352
,12181182095
,220
orx+e
-,0527211918
,12454950707
,674
sham
-,0988835893
,13037021011
,453
orx+v
-,0989352433
,12454950707
,432
orx+t
,05272119185
,12454950707
,674
orx+v
orx+t
orx+e
Std. Error
Sig.
Multiple Comparisons murf_edl LSD 95% Confidence Interval (I) interventieperiode
(J) interventieperiode
Lower Bound
Upper Bound
sham
orx+v
-,2580627872
,25795947912
orx+t
-,1064063520
,40961591436
orx+e
-,1644043913
,36217156996
sham
-,2579594791
,25806278726
orx+t
-,0943475278
,39766039834
orx+e
-,1525975890
,35046807577
sham
-,4096159143
,10640635202
orx+v
-,3976603983
,09434752787
orx+e
-,3042540242
,19881164053
sham
-,3621715699
,16440439133
orx+v
-,3504680757
,15259758900
orx+t
-,1988116405
,30425402423
orx+v
orx+t
orx+e
Page 2
Means Plots ,6000000000
Mean of murf_edl
,5500000000
,5000000000
,4500000000
,4000000000 sham
orx+v
orx+t
orx+e
interventieperiode * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventieperiode MEANSD(mu rf_edl, 1.)[name="MEAN_murf_edl" LOW="MEAN_murf_edl_LOW" HIGH="MEAN_murf_e dl_HIGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventieperiode=col(source(s), name("interventieperiode"), unit .category()) DATA: MEAN_murf_edl=col(source(s), name("MEAN_murf_edl")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_murf_edl_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_murf_edl_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventieperiode")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean murf_edl")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) Page 3
ELEMENT: interval(position(interventieperiode*MEAN_murf_edl), shape.inte rior(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventieperiode*(LOW+H IGH))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet3] C:\temp\data4\test.sav
1,2
murf1_EDL
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0 sham
orx+v
orx+t
orx+e
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY murf_labc BY interventieperiode /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet3] C:\temp\data4\test.sav Descriptives murf_labc 95% Confidence Interval for Mean N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
Lower Bound
Upper Bound
sham
6
,52847357277
,18762382133
,07659710430
,33157444777
,72537269776
orx+v
6
1,9095985949
,60320940250
,24625920736
1,2765691496
2,5426280403
orx+t
6
,38046622660
,05872704147
,02397521428
,31883597626
,44209647695
orx+e
11
1,0961583127
,41958016924
,12650818098
,81428051956
1,3780361058
Total
29
,99893006228
,66750846931
,12395321094
,74502341973
1,2528367048
Descriptives murf_labc Minimum
Maximum
sham
,3179047916
,8293195458
orx+v
1,2730890473
2,7447346209
orx+t
,2901759786
,4485477044
orx+e
,6162837545
1,8596098852
Total
,2901759786
2,7447346209
Test of Homogeneity of Variances murf_labc Levene Statistic 9,364
df1
df2 3
Sig. 25
,000 ANOVA
murf_labc Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
8,703
3
2,901
Within Groups
3,773
25
,151
12,476
28
Total
F 19,222
Sig. ,000
Page 1
Robust Tests of Equality of Means murf_labc Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
20,703
3
10,849
,000
Brown-Forsythe
20,310
3
10,197
,000
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons murf_labc LSD
(I) interventieperiode
(J) interventieperiode
Mean Difference (IJ)
sham
orx+v
-1,381125022
,22429269327
,000
orx+t
,14800734616
,22429269327
,515
orx+e
-,5676847399
,19716428410
,008
sham
1,3811250222
,22429269327
,000
orx+t
1,5291323683
,22429269327
,000
orx+e
,81344028227
,19716428410
,000
sham
-,1480073461
,22429269327
,515
orx+v
-1,529132368
,22429269327
,000
orx+e
-,7156920861
,19716428410
,001
sham
,56768473994
,19716428410
,008
orx+v
-,8134402822
,19716428410
,000
orx+t
,71569208611
,19716428410
,001
orx+v
orx+t
orx+e
Std. Error
Sig.
Multiple Comparisons murf_labc LSD 95% Confidence Interval (I) interventieperiode
(J) interventieperiode
Lower Bound
Upper Bound
sham
orx+v
-1,843064471
-,9191855733
orx+t
-,3139321027
,60994679506
orx+e
-,9737521842
-,1616172956
sham
,91918557332
1,8430644711
orx+t
1,0671929194
1,9910718172
orx+e
,40737283794
1,2195077266
sham
-,6099467950
,31393210273
orx+v
-1,991071817
-1,067192919
orx+e
-1,121759530
-,3096246417
sham
,16161729561
,97375218428
orx+v
-1,219507726
-,4073728379
orx+t
,30962464177
1,1217595304
orx+v
orx+t
orx+e
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots 2,0000000000
Mean of murf_labc
1,5000000000
1,0000000000
,5000000000
,0000000000 sham
orx+v
orx+t
orx+e
interventieperiode * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventieperiode MEANSD(mu rf_labc, 1.)[name="MEAN_murf_labc" LOW="MEAN_murf_labc_LOW" HIGH="MEAN_mur f_labc_HIGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventieperiode=col(source(s), name("interventieperiode"), unit .category()) DATA: MEAN_murf_labc=col(source(s), name("MEAN_murf_labc")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_murf_labc_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_murf_labc_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventieperiode")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean murf_labc")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) Page 3
SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventieperiode*MEAN_murf_labc), shape.int erior(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventieperiode*(LOW+H IGH))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet3] C:\temp\data4\test.sav
Murf1_LABC
3
2
1
0 sham
orx+v
orx+t
orx+e
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY SOL_S6K1 BY interventiegroep /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet2] C:\temp\DATA3\invoering spss.sav Descriptives SOL_S6K1 95% Confidence Interval for Mean N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
Lower Bound
Upper Bound
sham
9
1,1954215722
,16748657522
,05582885840
1,0666799938
1,3241631505
orx+v
12
1,0655019504
,12723593000
,03672984921
,98466009739
1,1463438035
orx+t
12
,99161327719
,17433436204
,05032599542
,88084650809
1,1023800463
orx+e
10
1,1983448600
,22136132567
,07000059750
1,0399925069
1,3566972130
Total
43
1,1029680344
,18969630436
,02892841521
1,0445881290
1,1613479399
Descriptives SOL_S6K1 Minimum
Maximum
sham
,88884268116
1,4896774631
orx+v
,92338231072
1,3755418181
orx+t
,70710678118
1,2642951789
orx+e
,89502507092
1,5709820174
Total
,70710678118
1,5709820174
Test of Homogeneity of Variances SOL_S6K1 Levene Statistic 1,288
df1
df2 3
Sig. 39
,292 ANOVA
SOL_S6K1 Sum of Squares Between Groups
df
Mean Square
,334
3
,111
Within Groups
1,178
39
,030
Total
1,511
42
F 3,681
Sig. ,020
Page 1
Robust Tests of Equality of Means SOL_S6K1 Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
3,198
3
20,197
,045
Brown-Forsythe
3,572
3
31,740
,025
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons SOL_S6K1 LSD
(I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Mean Difference (IJ)
sham
orx+v
,12991962177
,07663099616
,098
orx+t
,20380829503
,07663099616
,011
orx+e
-,0029232878
,07984766992
,971
sham
-,1299196217
,07663099616
,098
orx+t
,07388867326
,07094651651
,304
orx+e
-,1328429095
,07440933426
,082
sham
-,2038082950
,07663099616
,011
orx+v
-,0738886732
,07094651651
,304
orx+e
-,2067315828
,07440933426
,008
sham
,00292328780
,07984766992
,971
orx+v
,13284290957
,07440933426
,082
orx+t
,20673158283
,07440933426
,008
orx+v
orx+t
orx+e
Std. Error
Sig.
Multiple Comparisons SOL_S6K1 LSD 95% Confidence Interval (I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Lower Bound
Upper Bound
sham
orx+v
-,0250811983
,28492044189
orx+t
,04880747490
,35880911515
orx+e
-,1644304447
,15858386914
sham
-,2849204418
,02508119835
orx+t
-,0696142014
,21739154801
orx+e
-,2833499943
,01766417520
sham
-,3588091151
-,0488074749
orx+v
-,2173915480
,06961420149
orx+e
-,3572386676
-,0562244980
sham
-,1585838691
,16443044476
orx+v
-,0176641752
,28334999436
orx+t
,05622449805
,35723866762
orx+v
orx+t
orx+e
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots 1,200000000000
Mean of SOL_S6K1
1,150000000000
1,100000000000
1,050000000000
1,000000000000
,950000000000 sham
orx+v
orx+t
orx+e
interventiegroep * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventiegroep MEANSD(SOL_ S6K1, 1.)[name="MEAN_SOL_S6K1" LOW="MEAN_SOL_S6K1_LOW" HIGH="MEAN_SOL_S6K1 _HIGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventiegroep=col(source(s), name("interventiegroep"), unit.cat egory()) DATA: MEAN_SOL_S6K1=col(source(s), name("MEAN_SOL_S6K1")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_SOL_S6K1_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_SOL_S6K1_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventiegroep")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean SOL_S6K1")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) Page 3
SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventiegroep*MEAN_SOL_S6K1), shape.interi or(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventiegroep*(LOW+HIG H))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet2] C:\temp\DATA3\invoering spss.sav
S6K1_SOL
1,5
1,0
0,5 sham
orx+v
orx+t
orx+e
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY EDL_S6K1 BY interventiegroep /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet1] C:\temp\spss verwerking_06042012.sav Descriptives EDL_S6K1 N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
sham
11
1,4239548306
,32567532015
,09819480367
orx + V
12
1,1651758547
,20363942019
,05878563703
orx + T
12
1,2880920953
,32043105194
,09250047704
orx + E
11
1,1638359296
,18768573334
,05658937781
Total
46
1,2588024731
,27941282055
,04119717283
Descriptives EDL_S6K1 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound
Upper Bound
Minimum
Maximum
sham
1,2051631735
1,6427464877
1,0692999985
2,1584564730
orx + V
1,0357895400
1,2945621694
,90125046261
1,6529006363
orx + T
1,0844999180
1,4916842726
,86254203199
1,8574628200
orx + E
1,0377469383
1,2899249209
,89089871814
1,6114208563
Total
1,1758271077
1,3417778385
,86254203199
2,1584564730
Test of Homogeneity of Variances EDL_S6K1 Levene Statistic 2,011
df1
df2 3
Sig. 42
,127 ANOVA
EDL_S6K1 Sum of Squares Between Groups
df
Mean Square
,515
3
,172
Within Groups
2,998
42
,071
Total
3,513
45
F 2,403
Sig. ,081
Page 1
Robust Tests of Equality of Means EDL_S6K1 Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
2,106
3
22,736
,128
Brown-Forsythe
2,405
3
34,393
,084
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons EDL_S6K1 LSD Mean Difference (IJ)
Std. Error
Sig.
(I) interventiegroep
(J) interventiegroep
sham
orx + V
,25877897590
,11153323061
,025
orx + T
,13586273533
,11153323061
,230
orx + E
,26011890100
,11393206915
,028
sham
-,2587789759
,11153323061
,025
orx + T
-,1229162405
,10908165145
,266
orx + E
,00133992510
,11153323061
,990
sham
-,1358627353
,11153323061
,230
orx + V
,12291624056
,10908165145
,266
orx + E
,12425616567
,11153323061
,272
sham
-,2601189010
,11393206915
,028
orx + V
-,0013399251
,11153323061
,990
orx + T
-,1242561656
,11153323061
,272
orx + V
orx + T
orx + E
Multiple Comparisons EDL_S6K1 LSD 95% Confidence Interval (I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Lower Bound
Upper Bound
sham
orx + V
,03369580393
,48386214787
orx + T
-,0892204366
,36094590730
orx + E
,03019467688
,49004312512
sham
-,4838621478
-,0336958039
orx + T
-,3430519254
,09721944433
orx + E
-,2237432468
,22642309707
sham
-,3609459073
,08922043663
orx + V
-,0972194443
,34305192547
orx + E
-,1008270062
,34933933764
sham
-,4900431251
-,0301946768
orx + V
-,2264230970
,22374324686
orx + T
-,3493393376
,10082700629
orx + V
orx + T
orx + E
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots 1,450000000000
Mean of EDL_S6K1
1,400000000000
1,350000000000
1,300000000000
1,250000000000
1,200000000000
1,150000000000 sham
orx + V
orx + T
orx + E
interventiegroep * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventiegroep MEANSD(EDL_S 6K1, 1.)[name="MEAN_EDL_S6K1" LOW="MEAN_EDL_S6K1_LOW" HIGH="MEAN_EDL_S6K1_H IGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventiegroep=col(source(s), name("interventiegroep"), unit.cate gory()) DATA: MEAN_EDL_S6K1=col(source(s), name("MEAN_EDL_S6K1")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_EDL_S6K1_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_EDL_S6K1_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventiegroep")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean EDL_S6K1")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) Page 3
SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventiegroep*MEAN_EDL_S6K1), shape.interio r(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventiegroep*(LOW+HIGH ))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet1] C:\temp\spss verwerking_06042012.sav
1,8
S6K1_EDL
1,5
1,3
1,0
0,8
sham
orx + V
orx + T
orx + E
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY SOL_4EBP1 BY interventiegroep /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet2] C:\temp\DATA3\invoering spss.sav Descriptives SOL_4EBP1 95% Confidence Interval for Mean N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
Lower Bound
Upper Bound
sham
11
1,0890486963
,20679058052
,06234970598
,95012489403
1,2279724986
orx+v
12
1,3884468560
,28300359839
,08169610185
1,2086349482
1,5682587638
orx+t
12
,90635684101
,32594857361
,09409324835
,69925899771
1,1134546843
orx+e
12
,88763409535
,18405526734
,05313217907
,77069095768
1,0045772330
Total
47
1,0674210461
,32272441689
,04707419432
,97266560755
1,1621764847
Descriptives SOL_4EBP1 Minimum
Maximum
sham
,78549100874
1,4256962735
orx+v
1,0092848012
1,9656411970
orx+t
,30885465928
1,3835102508
orx+e
,65747138010
1,2760339083
Total
,30885465928
1,9656411970
Test of Homogeneity of Variances SOL_4EBP1 Levene Statistic 1,211
df1
df2 3
Sig. 43
,317 ANOVA
SOL_4EBP1 Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
1,941
3
,647
Within Groups
2,850
43
,066
Total
4,791
46
F 9,762
Sig. ,000
Page 1
Robust Tests of Equality of Means SOL_4EBP1 Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
9,156
3
23,438
,000
Brown-Forsythe
9,866
3
36,600
,000
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons SOL_4EBP1 LSD
(I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Mean Difference (IJ)
sham
orx+v
-,2993981596
,10746324692
,008
orx+t
,18269185531
,10746324692
,096
orx+e
,20141460098
,10746324692
,068
sham
,29939815969
,10746324692
,008
orx+t
,48209001501
,10510112886
,000
orx+e
,50081276068
,10510112886
,000
sham
-,1826918553
,10746324692
,096
orx+v
-,4820900150
,10510112886
,000
orx+e
,01872274566
,10510112886
,859
sham
-,2014146009
,10746324692
,068
orx+v
-,5008127606
,10510112886
,000
orx+t
-,0187227456
,10510112886
,859
orx+v
orx+t
orx+e
Std. Error
Sig.
Multiple Comparisons SOL_4EBP1 LSD 95% Confidence Interval (I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Lower Bound
Upper Bound
sham
orx+v
-,5161184514
-,0826778679
orx+t
-,0340284364
,39941214708
orx+e
-,0153056907
,41813489275
sham
,08267786793
,51611845146
orx+t
,27013338830
,69404664173
orx+e
,28885613396
,71276938739
sham
-,3994121470
,03402843644
orx+v
-,6940466417
-,2701333883
orx+e
-,1932338810
,23067937238
sham
-,4181348927
,01530569078
orx+v
-,7127693873
-,2888561339
orx+t
-,2306793723
,19323388105
orx+v
orx+t
orx+e
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots 1,400000000000
Mean of SOL_4EBP1
1,300000000000
1,200000000000
1,100000000000
1,000000000000
,900000000000
,800000000000 sham
orx+v
orx+t
orx+e
interventiegroep * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventiegroep MEANSD(SOL_ 4EBP1, 1.)[name="MEAN_SOL_4EBP1" LOW="MEAN_SOL_4EBP1_LOW" HIGH="MEAN_SOL_4 EBP1_HIGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventiegroep=col(source(s), name("interventiegroep"), unit.cat egory()) DATA: MEAN_SOL_4EBP1=col(source(s), name("MEAN_SOL_4EBP1")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_SOL_4EBP1_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_SOL_4EBP1_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventiegroep")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean SOL_4EBP1")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) Page 3
SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventiegroep*MEAN_SOL_4EBP1), shape.inter ior(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventiegroep*(LOW+HIG H))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet2] C:\temp\DATA3\invoering spss.sav
4EBP1_SOL
1,5
1,0
0,5 sham
orx+v
orx+t
orx+e
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY EDL_4EBP1 BY interventiegroep /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet1] C:\temp\spss verwerking_06042012.sav Descriptives EDL_4EBP1 N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
sham
11
,94509957319
,22650370441
,06829343646
orx + V
11
,96137746146
,19934143946
,06010370544
orx + T
12
,86837902052
,11985333600
,03459867790
orx + E
12
,53937110723
,10095437084
,02914301659
Total
46
,82313584596
,23782390129
,03506522122
Descriptives EDL_4EBP1 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound
Upper Bound
Minimum
Maximum
sham
,79293231406
1,0972668323
,69898496709
1,3210331469
orx + V
,82745806022
1,0952968627
,67987118641
1,2541124095
orx + T
,79222784389
,94453019714
,70466037757
1,0955586094
orx + E
,47522776019
,60351445427
,41179550863
,66357587117
Total
,75251086505
,89376082687
,41179550863
1,3210331469
Test of Homogeneity of Variances EDL_4EBP1 Levene Statistic 4,665
df1
df2 3
Sig. 42
,007 ANOVA
EDL_4EBP1 Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
1,365
3
,455
Within Groups
1,181
42
,028
Total
2,545
45
F 16,184
Sig. ,000
Page 1
Robust Tests of Equality of Means EDL_4EBP1 Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
26,241
3
21,872
,000
Brown-Forsythe
15,610
3
29,485
,000
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons EDL_4EBP1 LSD
(I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Mean Difference (IJ)
sham
orx + V
-,0162778882
,07148795964
,821
orx + T
,07672055267
,06998278140
,279
orx + E
,40572846596
,06998278140
,000
sham
,01627788827
,07148795964
,821
orx + T
,09299844094
,06998278140
,191
orx + E
,42200635423
,06998278140
,000
sham
-,0767205526
,06998278140
,279
orx + V
-,0929984409
,06998278140
,191
orx + E
,32900791328
,06844451044
,000
sham
-,4057284659
,06998278140
,000
orx + V
-,4220063542
,06998278140
,000
orx + T
-,3290079132
,06844451044
,000
orx + V
orx + T
orx + E
Std. Error
Sig.
Multiple Comparisons EDL_4EBP1 LSD 95% Confidence Interval (I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Lower Bound
Upper Bound
sham
orx + V
-,1605464316
,12799065506
orx + T
-,0645104179
,21795152333
orx + E
,26449749530
,54695943661
sham
-,1279906550
,16054643161
orx + T
-,0482325297
,23422941160
orx + E
,28077538357
,56323732489
sham
-,2179515233
,06451041798
orx + V
-,2342294116
,04823252970
orx + E
,19088129909
,46713452747
sham
-,5469594366
-,2644974953
orx + V
-,5632373248
-,2807753835
orx + T
-,4671345274
-,1908812990
orx + V
orx + T
orx + E
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots 1,00000000000
Mean of EDL_4EBP1
,90000000000
,80000000000
,70000000000
,60000000000
,50000000000 sham
orx + V
orx + T
orx + E
interventiegroep * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventiegroep MEANSD(EDL_4 EBP1, 1.)[name="MEAN_EDL_4EBP1" LOW="MEAN_EDL_4EBP1_LOW" HIGH="MEAN_EDL_4EB P1_HIGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventiegroep=col(source(s), name("interventiegroep"), unit.cate gory()) DATA: MEAN_EDL_4EBP1=col(source(s), name("MEAN_EDL_4EBP1")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_EDL_4EBP1_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_EDL_4EBP1_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventiegroep")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean EDL_4EBP1")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) Page 3
SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventiegroep*MEAN_EDL_4EBP1), shape.interi or(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventiegroep*(LOW+HIGH ))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet1] C:\temp\spss verwerking_06042012.sav
1,2
4EBP1_EDL
1,0
0,8
0,6
0,4
sham
orx + V
orx + T
orx + E
interventiegroep Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY SOL_mstn BY interventiegroep /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet1] C:\temp\23042012\23042012(SPSS).sav Descriptives SOL_mstn N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
SHAM
11
,01735176381
,00714503640
,00215430953
ORX + V
10
,00814798010
,00377826532
,00119479240
ORX + T
9
,01226985600
,00317558140
,00105852713
ORX + E
12
,01490287583
,01000573910
,00288840808
Total
42
,01337172421
,00750140405
,00115749177
Descriptives SOL_mstn 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound
Upper Bound
Minimum
Maximum
SHAM
,01255166304
,02215186458
,00666121000
,02695443800
ORX + V
,00544517190
,01085078829
,00300170900
,01427861600
ORX + T
,00982888805
,01471082394
,00787593400
,01725709400
ORX + E
,00854553250
,02126021915
,00436440300
,03690602100
Total
,01103412215
,01570932627
,00300170900
,03690602100
Test of Homogeneity of Variances SOL_mstn Levene Statistic 3,360
df1
df2 3
Sig. 38
,029 ANOVA
SOL_mstn Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
,000
3
,000
Within Groups
,002
38
,000
Total
,002
41
F 3,382
Sig. ,028
Page 1
Robust Tests of Equality of Means SOL_mstn Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
5,378
3
20,835
,007
Brown-Forsythe
3,799
3
26,091
,022
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons SOL_mstn LSD Mean Difference (IJ)
Std. Error
Sig.
(I) interventiegroep
(J) interventiegroep
SHAM
ORX + V
,00920378371
,00302460174
,004
ORX + T
,00508190781
,00311137454
,111
ORX + E
,00244888798
,00288956085
,402
SHAM
-,0092037837
,00302460174
,004
ORX + T
-,0041218759
,00318061013
,203
ORX + E
-,0067548957
,00296398233
,028
SHAM
-,0050819078
,00311137454
,111
ORX + V
,00412187590
,00318061013
,203
ORX + E
-,0026330198
,00305247884
,394
SHAM
-,0024488879
,00288956085
,402
ORX + V
,00675489573
,00296398233
,028
ORX + T
,00263301983
,00305247884
,394
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Multiple Comparisons SOL_mstn LSD 95% Confidence Interval (I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Lower Bound
Upper Bound
SHAM
ORX + V
,00308079760
,01532676983
ORX + T
-,0012167406
,01138055628
ORX + E
-,0034007221
,00829849812
SHAM
-,0153267698
-,0030807976
ORX + T
-,0105606845
,00231693270
ORX + E
-,0127551642
-,0007546271
SHAM
-,0113805562
,00121674064
ORX + V
-,0023169327
,01056068450
ORX + E
-,0088124401
,00354640052
SHAM
-,0082984981
,00340072215
ORX + V
,00075462719
,01275516427
ORX + T
-,0035464005
,00881244019
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots ,01800000000000
Mean of SOL_mstn
,01600000000000
,01400000000000
,01200000000000
,01000000000000
,00800000000000 SHAM
ORX + V
ORX + T
ORX + E
interventiegroep * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventiegroep MEANSD(SOL_m stn, 1.)[name="MEAN_SOL_mstn" LOW="MEAN_SOL_mstn_LOW" HIGH="MEAN_SOL_mstn_H IGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventiegroep=col(source(s), name("interventiegroep"), unit.cate gory()) DATA: MEAN_SOL_mstn=col(source(s), name("MEAN_SOL_mstn")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_SOL_mstn_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_SOL_mstn_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventiegroep")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean SOL_mstn")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) Page 3
SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventiegroep*MEAN_SOL_mstn), shape.interio r(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventiegroep*(LOW+HIGH ))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet1] C:\temp\23042012\23042012(SPSS).sav
0,025
Mstn_SOL
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
SHAM
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY EDL_mstn BY interventiegroep /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet1] C:\temp\24042012\23042012(SPSS).sav Descriptives EDL_mstn N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
8
,65712082812
,11139889420
,03938545675
ORX + V
10
,84505349260
,11811062700
,03734985972
ORX + T
10
,68475350600
,13754643592
,04349600215
ORX + E
10
,87845954330
,20149036243
,06371684718
Total
38
,77209558010
,17214677862
,02792589507
SHAM
Descriptives EDL_mstn 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound
Upper Bound
Minimum
Maximum
SHAM
,56398902192
,75025263432
,51584159000
,81884748200
ORX + V
,76056223990
,92954474529
,71367212700
1,0460849400
ORX + T
,58635871317
,78314829882
,47467106000
,87863345200
ORX + E
,73432202104
1,0225970655
,51703481500
1,2085970560
Total
,71551234198
,82867881822
,47467106000
1,2085970560
Test of Homogeneity of Variances EDL_mstn Levene Statistic ,652
df1
df2 3
Sig. 34
,587 ANOVA
EDL_mstn Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
,348
3
,116
Within Groups
,748
34
,022
1,096
37
Total
F 5,278
Sig. ,004
Page 1
Robust Tests of Equality of Means EDL_mstn Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
5,704
3
18,615
,006
Brown-Forsythe
5,450
3
27,903
,004
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons EDL_mstn LSD
(I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Mean Difference (IJ)
SHAM
ORX + V
-,1879326644
,07035979038
,012
ORX + T
-,0276326778
,07035979038
,697
ORX + E
-,2213387151
,07035979038
,003
SHAM
,18793266447
,07035979038
,012
ORX + T
,16029998660
,06633584653
,021
ORX + E
-,0334060507
,06633584653
,618
SHAM
,02763267787
,07035979038
,697
ORX + V
-,1602999866
,06633584653
,021
ORX + E
-,1937060373
,06633584653
,006
SHAM
,22133871517
,07035979038
,003
ORX + V
,03340605070
,06633584653
,618
ORX + T
,19370603730
,06633584653
,006
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Std. Error
Sig.
Multiple Comparisons EDL_mstn LSD 95% Confidence Interval (I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Lower Bound
Upper Bound
SHAM
ORX + V
-,3309209621
-,0449443667
ORX + T
-,1706209755
,11535561980
ORX + E
-,3643270128
-,0783504174
SHAM
,04494436679
,33092096215
ORX + T
,02548932670
,29511064649
ORX + E
-,1682167105
,10140460919
SHAM
-,1153556198
,17062097555
ORX + V
-,2951106464
-,0254893267
ORX + E
-,3285166971
-,0588953774
SHAM
,07835041749
,36432701285
ORX + V
-,1014046091
,16821671059
ORX + T
,05889537740
,32851669719
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots ,90000000000
Mean of EDL_mstn
,85000000000
,80000000000
,75000000000
,70000000000
,65000000000 SHAM
ORX + V
ORX + T
ORX + E
interventiegroep ONEWAY EDL_mstn BY interventiegroep /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet1] C:\temp\24042012\23042012(SPSS).sav
Page 3
Descriptives EDL_mstn N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
8
,65712082812
,11139889420
,03938545675
ORX + V
10
,80588902120
,10859317467
,03434017703
ORX + T
9
,70809600000
,12310194756
,04103398252
ORX + E
11
,85620048018
,20491133287
,06178309149
Total
38
,76597173997
,16145801120
,02619194803
SHAM
Descriptives EDL_mstn 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound
Upper Bound
Minimum
Maximum
SHAM
,56398902192
,75025263432
,51584159000
,81884748200
ORX + V
,72820614375
,88357189864
,65444022600
,98282059900
ORX + T
,61347146661
,80272053338
,57038185800
,87863345200
ORX + E
,71853917362
,99386178673
,51703481500
1,2085970560
Total
,71290181228
,81904166766
,51584159000
1,2085970560
Test of Homogeneity of Variances EDL_mstn Levene Statistic
df1
1,233
df2 3
Sig. 34
,313 ANOVA
EDL_mstn Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
,230
3
,077
Within Groups
,734
34
,022
Total
,965
37
F 3,557
Sig. ,024
Robust Tests of Equality of Means EDL_mstn Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
3,784
3
18,569
,028
Brown-Forsythe
3,848
3
28,056
,020
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests
Page 4
Multiple Comparisons EDL_mstn LSD
(I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Mean Difference (IJ)
SHAM
ORX + V
-,1487681930
,06970038809
,040
ORX + T
-,0509751718
,07140064741
,480
ORX + E
-,1990796520
,06827778152
,006
SHAM
,14876819307
,06970038809
,040
ORX + T
,09779302120
,06751487734
,157
ORX + E
-,0503114589
,06420328388
,439
SHAM
,05097517187
,07140064741
,480
ORX + V
-,0977930212
,06751487734
,157
ORX + E
-,1481044801
,06604521187
,032
SHAM
,19907965205
,06827778152
,006
ORX + V
,05031145898
,06420328388
,439
ORX + T
,14810448018
,06604521187
,032
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Std. Error
Sig.
Multiple Comparisons EDL_mstn LSD 95% Confidence Interval (I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Lower Bound
Upper Bound
SHAM
ORX + V
-,2904164240
-,0071199620
ORX + T
-,1960787455
,09412840180
ORX + E
-,3378367986
-,0603225054
SHAM
,00711996206
,29041642408
ORX + T
-,0394137175
,23499975997
ORX + E
-,1807882301
,08016531217
SHAM
-,0941284018
,19607874555
ORX + V
-,2349997599
,03941371757
ORX + E
-,2823244993
-,0138844609
SHAM
,06032250543
,33783679867
ORX + V
-,0801653121
,18078823013
ORX + T
,01388446097
,28232449938
ORX + V
ORX + T
ORX + E
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots
Page 5
,90000000000
Mean of EDL_mstn
,85000000000
,80000000000
,75000000000
,70000000000
,65000000000 SHAM
ORX + V
ORX + T
ORX + E
interventiegroep * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventiegroep MEAN(EDL_mst n)[name="MEAN_EDL_mstn"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventiegroep=col(source(s), name("interventiegroep"), unit.cate gory()) DATA: MEAN_EDL_mstn=col(source(s), name("MEAN_EDL_mstn")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventiegroep")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean EDL_mstn")) SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventiegroep*MEAN_EDL_mstn), shape.interio r(shape.square)) END GPL. [DataSet1] C:\temp\24042012\23042012(SPSS).sav * Chart Builder. Page 6
GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventiegroep MEANSD(EDL_m stn, 1.)[name="MEAN_EDL_mstn" LOW="MEAN_EDL_mstn_LOW" HIGH="MEAN_EDL_mstn_H IGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventiegroep=col(source(s), name("interventiegroep"), unit.cate gory()) DATA: MEAN_EDL_mstn=col(source(s), name("MEAN_EDL_mstn")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_EDL_mstn_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_EDL_mstn_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventiegroep")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean EDL_mstn")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventiegroep*MEAN_EDL_mstn), shape.interio r(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventiegroep*(LOW+HIGH ))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet1] C:\temp\24042012\23042012(SPSS).sav
Page 7
Mstn_EDL
1,0
0,8
0,6
0,4
SHAM
ORX + V
ORX + T
ORX + E
Error Bars: +/- 1. SD
Page 8
ONEWAY SOL_IGF1 BY interventiegroep /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet2] C:\temp\DATA3\invoering spss.sav Descriptives SOL_IGF1 95% Confidence Interval for Mean N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
Lower Bound
Upper Bound
sham
11
,34042381693
,11755000270
,03544265937
,26145265057
,41939498329
orx+v
11
,28681413834
,10024780124
,03022584934
,21946674908
,35416152760
orx+t
10
,38126161890
,20695350572
,06544444478
,23321599936
,52930723843
orx+e
12
,21722110559
,07291208717
,02104790657
,17089497556
,26354723562
Total
44
,30270197646
,14063401449
,02120137540
,25994532807
,34545862484
Descriptives SOL_IGF1 Minimum
Maximum
sham
,23111241505
,53588673127
orx+v
,15318355532
,45956261098
orx+t
,13243288679
,85362046340
orx+e
,10881882041
,33255541478
Total
,10881882041
,85362046340
Test of Homogeneity of Variances SOL_IGF1 Levene Statistic 2,149
df1
df2 3
Sig. 40
,109 ANOVA
SOL_IGF1 Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
,168
3
,056
Within Groups
,683
40
,017
Total
,850
43
F 3,278
Sig. ,031
Page 1
Robust Tests of Equality of Means SOL_IGF1 Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
4,180
3
20,476
,019
Brown-Forsythe
3,059
3
21,579
,050
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons SOL_IGF1 LSD
(I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Mean Difference (IJ)
sham
orx+v
,05360967859
,05570302451
,342
orx+t
-,0408378019
,05707861496
,478
orx+e
,12320271134
,05453019790
,029
sham
-,0536096785
,05570302451
,342
orx+t
-,0944474805
,05707861496
,106
orx+e
,06959303274
,05453019790
,209
sham
,04083780196
,05707861496
,478
orx+v
,09444748055
,05707861496
,106
orx+e
,16404051330
,05593463891
,006
sham
-,1232027113
,05453019790
,029
orx+v
-,0695930327
,05453019790
,209
orx+t
-,1640405133
,05593463891
,006
orx+v
orx+t
orx+e
Std. Error
Sig.
Multiple Comparisons SOL_IGF1 LSD 95% Confidence Interval (I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Lower Bound
Upper Bound
sham
orx+v
-,0589703334
,16618969059
orx+t
-,1561979859
,07452238205
orx+e
,01299307032
,23341235235
sham
-,1661896905
,05897033340
orx+t
-,2098076645
,02091270346
orx+e
-,0406166082
,17980267376
sham
-,0745223820
,15619798598
orx+v
-,0209127034
,20980766458
orx+e
,05099239112
,27708863548
sham
-,2334123523
-,0129930703
orx+v
-,1798026737
,04061660827
orx+t
-,2770886354
-,0509923911
orx+v
orx+t
orx+e
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots ,40000000000
Mean of SOL_IGF1
,35000000000
,30000000000
,25000000000
,20000000000 sham
orx+v
orx+t
orx+e
interventiegroep * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventiegroep MEANSD(SOL_ IGF1, 1.)[name="MEAN_SOL_IGF1" LOW="MEAN_SOL_IGF1_LOW" HIGH="MEAN_SOL_IGF1 _HIGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventiegroep=col(source(s), name("interventiegroep"), unit.cat egory()) DATA: MEAN_SOL_IGF1=col(source(s), name("MEAN_SOL_IGF1")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_SOL_IGF1_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_SOL_IGF1_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventiegroep")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean SOL_IGF1")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) Page 3
SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventiegroep*MEAN_SOL_IGF1), shape.interi or(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventiegroep*(LOW+HIG H))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet2] C:\temp\DATA3\invoering spss.sav
0,6
IGF1_SOL
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0 sham
orx+v
orx+t
orx+e
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
ONEWAY EDL_IGF1 BY interventiegroep /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY BROWNFORSYTHE WELCH /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=LSD ALPHA(0.05).
Oneway [DataSet1] C:\temp\spss verwerking_06042012.sav Descriptives EDL_IGF1 N
Mean
Std. Deviation
Std. Error
sham
10
,39548698407
,13134889579
,04153616788
orx + V
12
,23058430504
,10187820800
,02940970540
orx + T
12
,46150446316
,20588793661
,05943472781
orx + E
12
,14131613718
,11961763112
,03453063576
Total
46
,30338540664
,19187774436
,02829082997
Descriptives EDL_IGF1 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound
Upper Bound
Minimum
Maximum
sham
,30152564437
,48944832377
,27231216403
,72951017212
orx + V
,16585397987
,29531463020
,11744034365
,44906618644
orx + T
,33068950925
,59231941707
,16455783993
,83992553453
orx + E
,06531472029
,21731755406
,03515807764
,45375957765
Total
,24640475012
,36036606315
,03515807764
,83992553453
Test of Homogeneity of Variances EDL_IGF1 Levene Statistic 2,101
df1
df2 3
Sig. 42
,115 ANOVA
EDL_IGF1 Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
,764
3
,255
Within Groups
,893
42
,021
1,657
45
Total
F 11,970
Sig. ,000
Page 1
Robust Tests of Equality of Means EDL_IGF1 Statistic
a
df1
df2
Sig.
Welch
10,998
3
22,522
,000
Brown-Forsythe
12,106
3
31,829
,000
a. Asymptotically F distributed.
Post Hoc Tests Multiple Comparisons EDL_IGF1 LSD
(I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Mean Difference (IJ)
sham
orx + V
,16490267903
,0624384294
,012
orx + T
-,0660174790
,0624384294
,296
orx + E
,25417084689
,0624384294
,000
sham
-,1649026790
,0624384294
,012
orx + T
-,2309201581
,0595327065
,000
orx + E
,0892681678
,0595327065
,141
sham
,0660174790
,0624384294
,296
orx + V
,2309201581
,0595327065
,000
orx + E
,3201883259
,0595327065
,000
sham
-,2541708468
,0624384294
,000
orx + V
-,0892681678
,0595327065
,141
orx + T
-,3201883259
,0595327065
,000
orx + V
orx + T
orx + E
Std. Error
Sig.
Multiple Comparisons EDL_IGF1 LSD 95% Confidence Interval (I) interventiegroep
(J) interventiegroep
Lower Bound
Upper Bound
sham
orx + V
,03889682703
,29090853103
orx + T
-,1920233310
,05998837290
orx + E
,12816499489
,38017669889
sham
-,2909085310
-,0388968270
orx + T
-,3510620240
-,1107782922
orx + E
-,0308736980
,2094100337
sham
-,0599883729
,1920233310
orx + V
,1107782922
,3510620240
orx + E
,2000464600
,4403301918
sham
-,3801766988
-,1281649948
orx + V
-,2094100337
,0308736980
orx + T
-,4403301918
-,2000464600
orx + V
orx + T
orx + E
Page 2
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Means Plots ,500000000000
Mean of EDL_IGF1
,400000000000
,300000000000
,200000000000
,100000000000 sham
orx + V
orx + T
orx + E
interventiegroep * Chart Builder. GGRAPH /GRAPHDATASET NAME="graphdataset" VARIABLES=interventiegroep MEANSD(EDL_I GF1, 1.)[name="MEAN_EDL_IGF1" LOW="MEAN_EDL_IGF1_LOW" HIGH="MEAN_EDL_IGF1_H IGH"] MISSING=LISTWISE REPORTMISSING=NO /GRAPHSPEC SOURCE=INLINE. BEGIN GPL SOURCE: s=userSource(id("graphdataset")) DATA: interventiegroep=col(source(s), name("interventiegroep"), unit.cate gory()) DATA: MEAN_EDL_IGF1=col(source(s), name("MEAN_EDL_IGF1")) DATA: LOW=col(source(s), name("MEAN_EDL_IGF1_LOW")) DATA: HIGH=col(source(s), name("MEAN_EDL_IGF1_HIGH")) GUIDE: axis(dim(1), label("interventiegroep")) GUIDE: axis(dim(2), label("Mean EDL_IGF1")) GUIDE: text.footnote(label("Error Bars: +/- 1. SD")) Page 3
SCALE: cat(dim(1), include("1", "2", "3", "4")) SCALE: linear(dim(2), include(0)) ELEMENT: interval(position(interventiegroep*MEAN_EDL_IGF1), shape.interio r(shape.square)) ELEMENT: interval(position(region.spread.range(interventiegroep*(LOW+HIGH ))), shape.interior(shape.ibeam)) END GPL.
GGraph [DataSet1] C:\temp\spss verwerking_06042012.sav
IGF1_EDL
0,6
0,4
0,2
0,0
sham
orx + V
orx + T
orx + E
Error Bars: +/- 1. SD
Page 4
