Het effect van carnosine en β alanine supplementatie op de carnosine concentratie in de skeletspier en op de progressie van diabetes type II

Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen Opleiding Lichamelijke Opvoeding en Bewegingswetenschappen Academiejaar 2010 -2011

Het effect van carnosine en β – alanine supplementatie op de carnosine concentratie in de skeletspier en op de progressie van diabetes type II Masterproef voorgelegd tot het behalen van de graad Master in de Lichamelijke Opvoeding en Bewegingswetenschappen

Door : Goethals Kimara en Poot Lien Promotor : Prof. Dr. Derave Wim Begeleider : Lic. Stegen Sanne

I

II

Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen Opleiding Lichamelijke Opvoeding en Bewegingswetenschappen Academiejaar 2010 -2011

Het effect van carnosine en β – alanine supplementatie op de carnosine concentratie in de skeletspier en op de progressie van diabetes type II Masterproef voorgelegd tot het behalen van de graad Master in de Lichamelijke Opvoeding en Bewegingswetenschappen

Door : Goethals Kimara en Poot Lien Promotor : Prof. Dr. Derave Wim Begeleider : Lic. Stegen Sanne

III

VOORWOORD Waarom wij voor dit onderwerp hebben gekozen, komt vooral door onze interesse in het sportmedische bij specifieke doelgroepen binnen onze opleiding. Als LO‟ers geloven wij er steevast in dat sport en fysieke activiteit kunnen bijdragen tot een betere gezondheid. Door onze grote interesse in dit vak bleven wij ook gedurende het volledige proces van “thesissen” geïnteresseerd en enthousiast om onze kennis verder te ontwikkelen. Een klein dipje ontstond wel op het moment dat we in januari te horen kregen dat ons onderzoek zou veranderen. Dit doordat ons thesisonderwerp reeds onderzocht was. Bij de stap van een humane studie naar een dierexperimentele hebben we toch eventjes moeten slikken. Maar aangezien de basis hetzelfde bleef en we verder konden met dezelfde onderzoekslijn was het dipje van korte duur en vlogen we er weer volledig in. Wij hebben een periode van bloed, zweet en tranen achter de rug, maar zonder de steun en hulp van verschillende mensen hadden we deze opdracht niet kunnen volbrengen. Allereerst willen we onze ouders bedanken, die ons de mogelijkheid hebben gegeven om te studeren om ons zo te kunnen verdiepen in onze interesses. Ze zijn ons blijven steunen tijdens het proces van onze thesis. Ook een groot woord van dank aan onze promotor, lic. Sanne Stegen, die ons stimuleerde, inspireerde en bleef steunen gedurende het proces waar maar geen eind aan leek te komen. Haar deur stond altijd voor ons open en we werden telkens met een vriendelijke glimlach ontvangen. Talloze keren heeft ze ons werk nagelezen en verbeterd. Ze stuurde ons onderzoeksproces en onze zoektocht naar relevante literatuur. Prof. Dr. Derave willen we danken voor zijn kritische blik op ons werk en voor de mogelijkheid die we hebben gekregen om onze scriptie bij hem uit te voeren. Niet alleen voor deze mogelijkheid willen we prof. Dr. Derave bedanken, maar ook voor de vele interessante hoorcolleges die hij ons gaf. Deze vormden onder andere de basis voor onze interesse in deze scriptie. Verder bedanken we ook het onderzoeksteam in Leuven om ons doorheen de operaties, perfusies en IVGTT te leiden bij de ratten. Ze hebben ons heel veel informatie gegeven en

IV

goed uitgelegd waarom wat aan het gebeuren was. Door hen kregen we een duidelijk inzicht in de methodologie van dit onderzoek. Als laatste een verontschuldiging aan onze vrienden voor al ons gezaag en geklaag die ze hebben moeten doorstaan. Bedankt om ons op die momenten toe te snellen met vele woorden van moed. Het schrijven van deze scriptie was een zeer leerrijk proces. Vele emoties zijn naar boven gekomen. De samenwerking liep op wieltjes en we zijn tevreden over ons resultaat.

V

ABSTRACT Doelstelling : Carnosine (β-Alanine en L-histidine) is een dipeptide die aanwezig is in humane en dierlijke skeletspieren en bij dieren ook in het plasma terug te vinden is. Dit aminozuur heeft verschillende beschermende functies en beschermt het lichaam ook tegen processen die bij diabetes voorkomen. Door middel van humaan onderzoek wil men nagaan of er bij diabetes patiënten (zowel type I als II) een deficiëntie voorkomt van carnosine. Dierexperimenteel is reeds aangetoond dat diabetes ratten een lagere carnosine concentratie hebben in het plasma en de diafragma spier dan gezonde ratten.

Daarnaast wou men zowel dierexperimenteel als humaan onderzoeken of deze

deficiëntie terug tot normale waarden kan gebracht worden door middel van β-alanine en carnosine supplementatie. Verder werden de effecten van deze carnosine aanvulling op de complicaties van diabetes nagegaan. Onderzoeksmethode : De humane studie bestond uit het uitvoeren van een Magnetische Resonantie Imaging en een Magnetische Resonantie Spectroscopie op 58 proefpersonen. Voor elke deelnemer met type I diabetes (n=15) werd een controlepersoon gezocht die matcht op verschillende vlakken. Hetzelfde geldt voor de 15 proefpersonen met type II diabetes. Bij de dierexperimentele studie werden 36 ratten ingedeeld in 4 gelijke groepen. De eerste groep kreeg een high fat dieet toegediend, de tweede groep kreeg een high fat dieet en β-Alanine supplementatie in het drinkwater, de derde groep kreeg een high fat dieet en carnosine supplementatie in het drinkwater. De laatste groep was de controlegroep en kreeg een normaal dieet. Op alle ratten werd er na een 8 weken durende supplementatie periode een IVGTT en een achterpoot perfusie uitgevoerd. Resultaten: De carnosine concentraties in de spier verschilden significant tussen de diabetes type II en de controle groep voor de M. Gastrocnemius. Op het einde van de metingen van de bloedglucose vond men significant lagere waarden bij de β-alanine groep in vergelijking met de controlegroep. Bij de bloedglucose AUC vond men significant hogere waarden bij de high fat groep in vergelijking met de controlegroep. Na insuline inspuiting ziet men significant hogere waarden bij het glucosetransport bij de witte Gastrocnemius in vergelijking met de M. Plantaris. Conclusie: Carnosine deficiëntie is enkel gevonden bij type II diabetes patiënten. De pilootstudie toonde aan dat de supplementatie van carnosine de carnosine concentratie significant doet stijgen. Of deze carnosine supplementatie effectief een beter glucosetransport induceert, is nog niet helemaal duidelijk. Verder onderzoek is essentieel om dit te bepalen.

VI

INHOUDSTAFEL

1.

LITERATUURSTUDIE .................................................................................................. 1 1.1

SITUERING ................................................................................................................ 1

1.2

DEFINITIES ................................................................................................................ 3

1.2.1

Diabetes mellitus .................................................................................................. 3

1.2.2

Insulineresistentie ................................................................................................. 5

1.2.3

Carnosine .............................................................................................................. 8

1.2.3.1

Metabolisme .................................................................................................. 8

1.2.3.2

Functies ....................................................................................................... 12

1.3

LINK TUSSEN DIABETES EN CARNOSINE ....................................................... 16

1.3.1

Tekort aan carnosine bij diabeten ....................................................................... 16

1.3.2

Carnosine en ontwikkeling van diabetes ............................................................ 17

1.3.3

Supplementatie van carnosine ............................................................................ 18

1.4 2.

ONDERZOEKSVRAGEN EN HYPOTHESEN ...................................................... 20 METHODIEK ............................................................................................................... 21

2.1

POPULATIE ............................................................................................................. 21

2.2

STUDIEDESIGN ...................................................................................................... 22

2.3

METINGEN .............................................................................................................. 23

2.4

STATISTISCHE ANALYSE .................................................................................... 30

3.

RESULTATEN ............................................................................................................. 31 3.1

HUMANE STUDIE .................................................................................................. 31

3.1.1 3.2

Carnosine concentratie in spier bij mensen............................................................ 31 DIEREXPERIMENTELE STUDIE .......................................................................... 32

3.2.1

Metingen tijdens supplementatie ........................................................................... 32

3.2.1.1

Gewicht ....................................................................................................... 32

3.2.1.2

Epididymaal vet .......................................................................................... 34

3.2.1.3

Calorie inname ............................................................................................ 35

3.2.2

Bloedglucose via IVGTT ....................................................................................... 36

3.2.3

Absolute bloedglucose ........................................................................................... 37

3.2.4

Glucosetransport .................................................................................................... 38

VII

4.

DISCUSSIE ................................................................................................................... 41 4.1 CARNOSINE DEFICIËNTIE IN DE SKELETSPIER.................................................. 41 4.2

CORRECTIE CARNOSINE DEFICIËNTIE ADHV SUPPLEMENTATIE ........... 42

4.2.1 Dierexperimentele studie ......................................................................................... 42 4.3

EFFECTIVITEIT VAN CARNOSINE ..................................................................... 45

4.4

BEPERKINGEN VAN DIT ONDERZOEK ............................................................. 47

4.5

TOEKOMST ............................................................................................................. 47

4.6

CONCLUSIE ............................................................................................................. 48

5.

REFERENTIELIJST ..................................................................................................... 49

6.

BIJLAGEN ...................................................................................................................... 1

VIII

IX

Scriptie Goethals Kimara en Poot Lien

LITERATUURSTUDIE

1. LITERATUURSTUDIE 1.1 SITUERING

Diabetes mellitus is een ziekte die tegenwoordig over de hele wereld verspreid is. Wereldwijd zijn er maar liefst 285 miljoen mensen die aan deze ziekte lijden (Misra, et al., 2011). Dit aantal blijft stijgen. Binnen 15 jaar zal 7,3% van de wereldbevolking aan suikerziekte lijden (International Diabetes Federation, diabetes atlas third edition, 2006). Belangrijke redenen hiervoor zijn de vergrijzing van de bevolking en de ongezonde levensstijl van de Westerse bevolking. De ziekte brengt heel wat maatschappelijke problemen met zich mee. Door gezondheidsproblemen lopen de kosten van de gezondheidszorg enorm hoog op. Patiënten worden arbeidsongeschikt, de levenskwaliteit daalt en er treden heel wat psychosociale problemen op. De levensverwachting van diabetici ligt aanzienlijk lager dan die van gezonde individuen.

Diabetes mellitus wordt gekenmerkt door een verstoring in de homeostase, namelijk een herhaaldelijk gestegen bloedglucosespiegel. Er is bewijs gevonden dat hyperglycemie resulteert in de vorming van reactieve zuurstof radicalen (ROS). Dit leidt uiteindelijk tot een stijging van oxidatieve stress in verschillende weefsels. De vorming van ROS gebeurt voornamelijk in de mitochondriën. Dit omdat superoxide een bijproduct is van de elektronentransportketen (ETS). (Rosca, et al., 2005) Oxidatie en glycatiestress, beiden een rechtstreeks gevolg van hyperglycemie, zijn verantwoordelijk voor schadelijke producten zoals Advanced Glycation Endproducts (AGE‟s) en protein carbonyls (Goh & Cooper, 2008). Hyperglycemie, samen met oxidatie en glycatie, induceren weefselschade waardoor complicaties ontstaan. Dit zowel op microvasculair als macrovasculair gebied.

Streven naar normale bloedglucosewaarden is dus een belangrijke opdracht voor de patiënt. Deze waarden kan hij bereiken door aangepaste voeding, voldoende fysieke activiteit en eventueel door medicatie. Het dipeptide carnosine heeft beschermende eigenschappen en zou hierdoor een rol kunnen spelen in het ziektebeeld van diabetes mellitus. Carnosine vinden we vooral terug in de skeletspier van mensen. Bij ratten is het ook in het bloed aanwezig. Het dipeptide treedt op als

1


LITERATUURSTUDIE

anti-oxidant en antiglycator (Alhamdani, et al., 2007) (Hipkiss,1995). Het heeft functies als scavenger voor afgeleide producten als proteïn carbonyls (Brownson, 2000). Carnosine onderdrukt AGE vorming (Hipkiss A. P., 1998) en AGE- geïnduceerde eiwitmodificatie (Hipkiss A. C., 1998). AGE (Advanced Glycation End Product) is een eiwit die onherstelbaar beschadigd is. Dit is het gevolg van een te hoge bloedglucosespiegel, waardoor glucose aan het eiwit verankerd zal zijn.

Dierexperimenteel onderzoek bij muizen en ratten heeft aangetoond dat diabetes gepaard gaat met carnosinedeficiëntie in het diafragma en in plasma (Nagai, et al., 2003)( Aerts, et al., 2001)( Buse, et al. 1980).

In deze scriptie willen we onderzoeken of er een verschil is in spiercarnosineconcentratie in de skeletspier tussen patiënten met type II diabetes en gezonde controle patiënten. We willen dit ook dierexperimenteel onderzoeken bij diabetes geïnduceerde insuline resistente ratten en gezonde ratten. Verder willen we ook nagaan of supplementatie van carnosine enerzijds en βalanine anderszijds een effect heeft op het glucosemetabolisme bij diabetes geïnduceerde insuline resistente ratten.

2


LITERATUURSTUDIE

1.2 DEFINITIES 1.2.1 Diabetes mellitus Diabetes mellitus is een endocriene ziekte die wordt gekenmerkt door een relatief of absoluut insulinegebrek en dit manifesteert zich in hyperglycemie. Mensen hebben insuline nodig om glucose vanuit het bloed naar de cellen te transporteren. We kunnen twee soorten diabetes onderscheiden. Als eerste hebben we type I diabetes. Dit type is insuline afhankelijk. Er is een auto-immune destructie van de β-cellen van de eilandjes van Langerhans. Wat betekent dat er weinig of geen insuline geproduceerd wordt door de β cellen. Op deze manier blijft het glucose aanwezig in de bloedbaan en onstaat hyperglycemie. Hier spreken we van een absoluut insuline tekort. Deze patiënten hebben nood aan een insuline injectie, zodoende dat de glucose toch door de cellen wordt opgenomen.

Type II diabetes daarentegen is niet insuline afhankelijk. Het heeft een veel hogere prevalentie dan type I, namelijk 85% van de diabetespatiënten lijdt aan deze vorm (International Diabetes Federation, diabetes atlas third edition, 2006). Dit is 6% van de totale wereldbevolking (Sauerhöfer S., 2007). Bij deze vorm produceert de pancreas wel insuline. Absoluut is er dus voldoende insuline aanwezig, maar het lichaam reageert onvoldoende op insuline. Wat leidt tot een relatief insuline tekort. Oorzaken hiervan zijn te weinig insulinereceptoren in de cellen of perifere insulineresistentie. Na lange tijd kan er ook een absoluut tekort aan insuline ontstaan. De β-cellen proberen om het tekort aan insuline goed te maken, door aan overproductie te doen. Op deze manier worden de cellen enorm uitgeput en moet de patiënt toch insuline gaan inspuiten. Het risico op diabetes type II stijgt met de leeftijd, overgewicht en gebrek aan fysieke activiteit. Er is ook een stevige genetische predispositie.

Diabetici hebben een groter risico op het ontwikkelen van chronische complicaties. Als gevolg van type I diabetes ontstaan er vaak microvasculaire complicaties. Hierbij worden de binnenwanden van de kleine bloedvaten beschadigd. Met als gevolg een verminderde bloedcirculatie waardoor verschillende organen worden aangetast. Een voorbeeld hiervan is nefropathie. Deze aandoening ontstaat doordat de glomeruli in de nieren worden beschadigd door de suikerziekte. Door de hoge glucosewaarde in het bloed stijgt de bloeddruk. Daardoor gaan de glomeruli te veel bloed filteren, ze raken overwerkt en lopen schade op. De afvalstoffen hopen zich op in het lichaam en er gaan belangrijke bloedeiwitten verloren.

3


LITERATUURSTUDIE

Ongeveer 10% - 20% van de diabeten ontwikkelt nefropathie. Het is belangrijk dat een gepaste behandeling wordt gestart. Indien dit niet gebeurt kan chronisch nierfalen het gevolg zijn.

Een andere microvasculaire aandoening is retinopathie, dit wordt gekenmerkt door beschadigingen van de bloedvaten die het netvlies voeden. Dit kan leiden tot een slecht zicht. Als het niet wordt behandeld, is het eindstadium blindheid.

Ook neuropathie is een microvasculaire aandoening als gevolg van diabetes. Kenmerken hiervan zijn beschadigde zenuwen door te hoge bloedglucosewaarden. Bloedvaten zijn aangetast en zenden schadelijke stoffen naar de zenuwcellen. Die krijgen ook te weinig zuurstof vanuit de bloedbaan. (Ahmed, 2005)

Bij type II diabetes ontstaan er bovenop de microvascualire aandoeningen ook macrovasculaire aandoeningen. Hierbij worden de grote bloedvaten beschadigd. Aan de basis van type II diabetes liggen hypercholesterolemie en hypertensie. Als deze factoren gecombineerd worden met hoge bloedglucosewaarden, worden de grote bloedvaten aangetast. Dit brengt onder andere atherosclerose met zich mee. Dit verklaart de hoge mortaliteit bij diabetes type II patiënten in vergelijking met gezonde individuen. (Panzram, 1987) De UK prospective diabetes study (UKPDS) heeft aangetoond dat hyperglycemie niet de belangrijkste determinant is voor macrovasculaire aandoeningen. Een hoge insuline resistentie verhoogt de risico‟s op cardiovasculaire aandoeningen met een factor van 2,5. (Brownlee, 2005). Een gevolg van insuline resistentie is een stijging van de vrije vetzuren (VVZ). Deze stijging induceert ook een verhoogde VVZ oxidatie. Gestegen VVZ oxidatie veroorzaakt overproductie van ROS door de mitochondriën op precies dezelfde manier als geïnduceerd door hyperglycemie. Intracellulaire hyperglycemie doet de spanning over de mitochondriale membraan stijgen boven de kritische grens. Op deze manier stijgt de generatie van superoxide (Du, et al., 2001). Bij de beschadigde celtypes, door hyperglycemie, zagen we telkens een gestegen productie van ROS (Du, et al., 2000).

Hyperglycemie veroorzaakt autoxidatie van glucose en glycatie van eiwitten. Deze veranderingen versnellen de aanmaak van ROS en de modificaties van lipiden, DNA en eiwitten in verschillende weefsels (Osawa & Kato, 2005).

4


1.2.2

LITERATUURSTUDIE

Insulineresistentie

Insulineresistentie is één van de twee fysiologische defecten die aan de basis ligt van de pathogenese van type II diabetes. Het andere defect situeert zich in de pancreas. Insuline resistentie ontstaat door een daling van insuline geïnduceerde glucose opname en het uitvallen van de onderdrukking van glucose output in de lever. De skeletspier staat in voor 85% van glucose opname na een maaltijd. Dit gebeurt via een insuline afhankelijk metabolisme. Als er resistentie optreedt, is de opname van glucose in de spier merkbaar gedaald. (DeFronzo, 2004). Het exact mechanisme van insuline resistentie ter hoogte van de skeletspier is nog niet volledig begrepen. Verschillende ontstaanmechanismen worden in de literatuur voorgesteld (Figuur 1). Ten eerste lijken gestegen metabolieten van intramyocellulair vet en vetzuren zoals diacylglycerol en ceramiden, een zeer belangrijke rol te spelen in de ontwikkeling van insuline resistentie ter hoogte van de spier. (Petersen & Shulman, 2006).

Figuur 1 : insuline gestimuleerde glucose opname en pathways van insuline resistentie in skeletspier

Ten tweede zijn verhoogde spiegels van reactive oxigen species (ROS) gecorreleerd met een staat van chronische insuline resistentie , zoals type II diabetes, obesitas, hypertensie en harten vaatziekten. ROS zijn chemisch reactieve moleculen die zuurstof bevatten. In tijden van stress kunnen de ROS levels drastisch toenemen. Dan spreken we van oxidatieve stress. De hersenen zijn heel gevoelig voor oxidatieve stress, die kan ontstaan door onder andere hoge concentraties van meervoudige onverzadigde lipiden. De reactieve zuurstofverbindingen beschadigen alle delen van de cel, inclusief proteïnen, lipiden en DNA.

5


LITERATUURSTUDIE

Bonnard et al. dienden een high-fat en high-sucrose dieet (HFHSD) toe bij muizen. Hierbij bekeken ze de rol van oxidatieve stress in de ontwikkeling van mitochondriale afwijkingen. Er is een groeiend bewijs dat mitochondriale dysfunctie in de skeletspier een belangrijke rol speelt in de ontwikkeling van insuline resistentie. Dit omdat een verminderde werking van de mitochondriën voor een verminderde vetzuuroxidatie (verminderde oxidatieve capaciteit van de skeletspier) zorgt en dit rechtstreeks verband houdt met de gevoeligheid van insuline.

Figuur 2 : Oppervlakte mitochondrieën per sectie ( relatief aan sucrose dieet van 16 weken) (Bonnard, et al., 2008)

Tabel 1 : Karakteristieken van de onderzochte muizen (Bonnard, et al., 2008) Ap < 0.001vs. resp SD, B p < 0.05 vs. resp SD. SD = sucrose dieet, HFHSD = high fat high sucrose dieet

SD 4 weken

SD 16 weken

HFHSD 4 weken

HFHSD 16 weken

Lichaamsgewicht (g)

24.08 ± 0.38

27.7 ± 0.36

28.9 ± 0.6A

44 ± 1.02A

Gewicht van vet (g)

0.25 ± 0.02

0.61 ± 0.05

1.1 ± 0.07A

2.5 ± 0.08A

H2O2

29.9 ± 8

28.8 ± 3.4

33.02 ± 5.7

44 ± 4.5B

De resultaten verduidelijken dat dieet-diabetische muizen een toename vertoonden van hyperglycemie en hyperlipidemie geïnduceerde ROS productie in de skeletspier. Ten derde zal TNF-α ook een rol spelen in het ontstaan van insuline resistentie. Houstis et al. onderzochten insuline resistentie die resulteerde uit de behandeling met de inflammatoire cytokine TNF-α (tumornecrosefactor α) bij muizen. TNF-α is een cytokine die inflammatie bevordert. Hierbij treden ROS op als signalerende tussenproducten

(Chang-Hoon Woo,

6


LITERATUURSTUDIE

2000). Bij het TNF-α model van Houstis et al. werden er verhoogde concentraties van ROS waargenomen. Hun bevindingen suggereren dat een toename van ROS levels een belangrijke trigger is voor insuline resistentie. Ook een recente studie toonde de link aan tussen ROS en insuline resistentie. Een overexpressie van superoxide dismutase 2, die de mitochondriale ROS levels deed verlagen, beschermde muizen tegen de ontwikkeling van acute insuline resistentie in de lever (Lidong Zhai, 2011). Bij een studie op de skeletspieren van insuline resistente ratten kon men uit de resultaten waarnemen dat de TNF-α levels significant hoger waren bij de insuline resistente ratten in vergelijking met de controlegroep. Hierbij werden de levels in de M. Soleus en M. Extensor Digitorum Longus gemeten, evenals deze in het epididymis vet. De TNF-α levels bij het epididymis vet waren niet significant verschillend tussen de twee groepen. De resultaten van deze studie suggereren dat de TNF-α in de skeletspier gelinkt is aan insuline resistentie (Togashi, et al., 2000).

In een studie op diabetes muizen met obesitas gerelateerde insuline resistentie vonden Sugita et al. dat de iNOS expressie was verhoogd in de skeletspier in vergelijking met gezonde muizen. Nitric oxide-synthase (iNOS) is een bemiddelaar van ontsteking en is eveneens betrokken bij tal van ziekten zoals insuline resistentie. Het zorgt voor een verminderde insulinegestimuleerde glucose opname door de behandeling met onder andere TNF-α in gekweekte spiercellen. Suggesties zijn dat wat aan de oorzaak ligt van inusline resistentie ook de iNOS expressie doet verhogen.

Figuur 3: iNos expressie (%) in skeletspier van obese muizen en de effecten van verlaging van iNOS expressie op insuline gevoeligheid via bloedglucose levels (%) (Sugita, et al., 2005)

Stampler et al. suggereren dat S-nitrosylatie van kritische thiol groepen een mogelijk mechanisme is voor de modificatie van eiwitten met belangrijke regulerende functies.

7


LITERATUURSTUDIE

Nitrosylatie is een vorm van eiwitmodificatie waarbij een nitrosylgroep post-translationeel wordt toegevoegd aan een eiwit. Bij S-nitrosylatie krijgen we een reactie van stikstofmonoxide (NO), waarbij een thiol groep wordt omgevormd tot een S-nitrosothiolgroep (RSNO) . Yasukawa et al. onderzochten het effect van S-nitrosylatie in de skeletspier van muizen met diabetes op insuline resistentie. Hun resultaten suggereren dat activiteit van S-nitrolysatie kan bijdragen tot de pathogenese van insulineresistentie bij oxidatieve stress. Ook ander onderzoek toonde aan dat S-nitrosylatie van de thiol groepen een oorzaak kan zijn van schade aan de insuline pathway (Panagiotidis G, 1995).

1.2.3

Carnosine

1.2.3.1 Metabolisme Het dipeptide carnosine werd 100 jaar geleden ontdekt door Gulevitch en Amiradgibi (Hipkiss & Brownson, 2000). Carnosine (β-alanyl – L –histidine) is een dipeptide van de aminozuren β-alanine en L-histidine.

Figuur 4 : Carnosine (β-alanyl – L –histidine) (G. Aldini et al. 2005)

Deze molecule is vooral aanwezig in hoge concentraties (5-8 mM/L) in de skeletspier bij mensen en in zenuwcellen. (Begum, et al., 2005) In andere organen is deze molecule vrijwel niet terug te vinden, behalve in bepaalde gebieden van de hersenen. Het is eveneens afwezig in planten, en dus in vegetarisch voedsel, en in ongewervelde dieren. Carnosine is het enige histidine bevattende dipeptide (HCD) die terug te vinden is in de menselijke skeletspier. Het wordt gesynthetiseerd uit β-alanine en L-histidine door carnosinesynthase. (H. Horinishi et al. 1978) Carnosinase zorgt dan voor de hydrolyse van dit dipeptide. De hydrolyse van carnosine vindt plaats in het bloed, de synthese in de skeletspier en in bepaalde gebieden van de hersenen. In tegenstelling tot carnosine is carnosinase wel aanwezig in vele weefsels, nieren,

8


lever en

LITERATUURSTUDIE

plasma. Lenney et al. hebben zelfs aangetoond dat de skeletspier een kleine

hoeveelheid carnosinase bevat, maar deze activiteit is zo klein dat ze amper een invloed heeft.

Figuur 5 : Metabolisme van carnosine (Boldyrev & Severin, 1990)

De literatuur heeft aangetoond dat de skeletspier zorgt voor de grootste hoeveelheid productie en voorraad van carnosine, namelijk meer dan 99%. Wanneer deze molecule gesynthetiseerd is, blijft ze gedurende een lange periode in de skeletspier. In een onderzoek op de cel-culturen van de nier toonden de resultaten dat carnosine zodanig gesecreteerd wordt, dat ze in de

9


LITERATUURSTUDIE

circulatie door een gereguleerd transportproces terechtkomt. Het transport kan verlopen zonder enige aanpassing aan de structuur van de molecule door middel van proton gekoppelde oligopeptide transporters (PEPT 1, PEPT2, PHT ) (Jappar, 2009) Natuurlijk kan carnosine ook via voeding in de bloedbaan terechtkomen. Zo toonden Park et al. aan dat rundsvlees veel carnosine bevat. En ook Chann en Decker vonden bepaalde hoeveelheden carnosine in verschillende soorten vlees en vis. In een andere studie werd aangetoond dat vegetarische personen een lagere hoeveelheid carnosine bevatten in de spier (10 – 14 mmol/kg dm) (Everaert, et al., 2011).

Er zijn een aantal factoren die een grote invloed hebben op de concentratie carnosine in de skeletspier.

Een spier bestaat uit verschillende spiervezeltypes. Spiervezeltype II bevat meer carnosine dan spiervezeltype I (Dunnet, 1997). Een studie heeft aangetoond dat een spier met een capaciteit voor hoge intensieve inspanning een tot 5 maal hogere concentratie carnosine kan bevatten dan een spier die type I vezels bevat (Hill et al. 2006). De type II spiervezels worden vooral gebruikt bij anaërobe inspanningen. Hieraan is dan ook het optreden als pH buffer door carnosine gekoppeld. Bij Tallon et al. bleek uit de resultaten dat

mannen die aan

krachttraining doen, een hogere concentratie carnosine hebben in de skeletspier. Men heeft aangetoond dat de trainingstatus geen rol zal spelen in de carnosine concentratie in de spier, maar wel het initieel trainingsniveau zal belangrijk zijn. Hoe getrainder men is, hoe hoger de carnosine concentratie in de spier. Hierdoor blijkt dat de vezeltypering van de skeletspier een invloed heeft op de concentratie carnosine van die spier.

Door onderzoek op ratten wordt er verondersteld dat door spiercontractie en inspanning de hoeveelheid carnosine stijgt in het bloed (Nagai et al., 2003). Dit komt doordat protonopeenhoping (acidose) een invloed heeft op de stimulatie van PEPT 2.Deze invloed zou helaas slechts beperkt zijn.

Het geslacht speelt ook een belangrijke rol in de hoeveelheid carnosine in de spier. Mannen hebben doorgaans 20 - 25% meer carnosine dan vrouwen (Mannion, 1995). Dat mannen een superieure anaërobe prestatie capaciteit hebben, kan hier toe bijdragen.

10


LITERATUURSTUDIE

De leeftijd is ook een bepalende factor. Men kan dit opsplitsen in twee fasen. Een duidelijke stijging van carnosine in de spier is te zien van de prepuberale tot de postpuberale fase. Peñafiel et al. toonde aan bij muizen dat de concentratie carnosine 3 tot 7 maal hoger ligt vanaf het ogenblik dat de volwassenheid is bereikt, in vergelijking met de prepuberale fase. Bij vrouwelijke muizen werd er geen significant verschil gevonden. In de volgende fase vindt men echter dat de carnosine concentratie significant daalt met de leeftijd. Dus hoe ouder men wordt, hoe lager de carnosine concentratie in de spier.

Figuur 6: Het effect van leeftijd op de spiercarnosine concentratie in zowel vrouwelijke als mannelijke omnivoren. Een negatieve correlatie van leeftijd op de carnosine concentratie is gevonden in de soleusspier (p < 0.05, r = -0.260, n=58) (Everaert, et al., 2011)

Tabel 2 : alanine, histidine en carnosine in de skeletspier van achterpoot bij muizen (resultaten zijn de gemiddelden ± SD van 5-6 dieren per groep) A) p < 0.001 vs mannelijke muizen (Penafiel R, 2004)

Aminozuur (nmol/g)

Mannelijke muizen

Vrouwelijke muizen

Alanine

2.386 ± 197

1.343 ± 141A

Histidine

212 ± 21

228 ± 33

Carnosine

1.947 ± 244

547 ± 140A

11


LITERATUURSTUDIE

1.2.3.2 Functies Hieronder wordt de rol van carnosine bij de verschillende pathways van insuline resistentie besproken.

Een belangrijke functie van carnosine is anti-veroudering. Beschadiging van lichaamseiwitten ziet men als belangrijke oorzaak voor verouderingsprocessen. Deze beschadiging gebeurt onder andere door oxidatie, carbonylering, glycatie, lipide-peroxidatie, crosslinking en de productie van AGE‟s. Dit leidt tot functieverlies van de lichaamseiwitten, op deze manier wordt het lichaam gevoeliger voor degeneratieve ziekten, zoals diabetes en de complicaties er van.

Carnosine staat bekend voor zijn werking als antioxidant. De meest destructieve vrije radicalen (hydroxylradicaal, superoxide, singletzuurstof en het peroxylradicaal) worden gevangen door carnosine. Het werkt ook effectief tegen de schadelijke verbindingen die als gevolg van de vrije radicalen kunnen ontstaan. Carnosine is superieur aan andere antioxidanten omdat het naast de bescherming tegen oxidatieve beschadigingen, ook die tegengaat van andere degeneratieve processen zoals glycatie en carbonylering. Nagasawa et al. deden onderzoek naar de antioxidant werking van carnosine in de skeletspier zowel in vitro als in vivo. Ze testten de antioxidant activiteit tegen lipide en proteïne peroxidatie. De resultaten van de in vitro experimenten toonden aan dat carnosine significant (p ≤ 0.05) de FeH2O2 geïnduceerde stijging van zowel spier lipide peroxidatie als proteïne oxidatie verlaagt (Figuur 7) (Nagasawa, et al., 2001).

Figuur 7 : In vitro effecten van carnosine op lipiden peroxidase (A) en proteïne oxidatie (B) bij Fe 2+-H2O2 in spier homogenaat (Nagasawa, et al., 2001)

12


LITERATUURSTUDIE

Verder zien we ook een significante daling van thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) bij een toename van de carnosine concentratie in de spier. TBARS zijn een maat voor lipide peroxidatie. Deze bevindingen gelden ook voor de proteïne oxidatie in de spier (Figuur 8).

Figuur 8: In vitro effecten van carnosine concentratie op lipide peroxidatie (A) en proteïne oxidatie (B) bij Fe 2+ H2O2 in spier homogenaat. Elke waarde stelt het gemiddelde van vier samples voor. *p <0.05 versus zonder carnosine (0 mM). Open bolletjes = zonder Fe 2+ H2O2 en carnosine. (Nagasawa, Yonekura, Nishizawa, & Kitts, 2001)

De minimale carnosineconcentratie, nodig om significant de lipide peroxidatie en proteïne oxidatie te doen dalen, was respectievelijk 5 en 2.5 mM. In vivo vond men de volgende resultaten: een histidine supplementatie doet de carnosineconcentratie in de skeletpsier significant stijgen (p ≤0.05) (Tabel 3).

Tabel 3 : Effecten van een histidine supplementatie dieet op voedselinname, lichaamsgewicht en carnosine gehalte in skeletspier bij rat. C- ratten gevoed met controle dieet en ingespoten saline; C-Fe ratten gevoed met een controle dieet en ingespoten met Fe-nitrilotriaccetaat; H-Fe ratten gevoed met een histidine gesupplementeerd dieet en ingespoten met Fe-nitrilotriaccetaat. Waarden zijn gemiddelden ± SD van 5 ratten. Ap ≤ 0.05 vs C. (Nagasawa, et al., 2001)

Dieren

Finaal lichaamsgewicht (g)

Voedselinname (g/13 dagen)

Carnosine (mmol/g spier)

C

204 ± 6

222 ± 10

6.48 ± 0.36

C-Fe

207 ± 4

234 ± 8

6.31 ± 0.34

H-Fe

202 ± 4

227 ± 5

9.30 ± 0.47A

Verder vinden we in vivo ook een significante daling (p ≤ 0.05) van de TBARS bij de ratten met een histidine supplementatie tegenover de controle groep. Hetzelfde vinden we voor de

13


LITERATUURSTUDIE

carbonyl inhoud. Ratten die een histidine supplementatie toegediend krijgen, zijn beschermd tegen de oxidatieve stress. Dit wordt bewezen door een lage carbonyl inhoud in de spier (Figuur 9).

Figuur 9: In vivo lipide peroxidatie (A) en proteïne oxidatie (B) in de skeletspier na een inspuiting van Fe-nitrilotriacetaat van ratten gevoed met een 2% histidine gesupplementeerd dieet. Elke waarde toont het gemiddelde van 6 ratten + SD. Waarden met verschillende letters zijn significant verschillend bij p ≤ 0.05. C- ratten gevoed met een 20% caseïne dieet en ingespoten met saline; C-Fe ratten gevoed met een 20% caseïne dieet en ingespoten met Fenitrilotriacetaat; H-Fe ratten gevoed met een histidine supplementatie bovenop het 20% caseïne dieet en ingespoten met Fe-nitrilotriacetaat.

Anti-glycolysering is misschien wel de belangrijkste functie van carnosine. Bij hoge glucosespiegels, die we zien bij diabetespatiënten, reageert het glucose met bepaalde aminozuren op belangrijke lichaamseiwitten. Hierdoor ontstaan niet-functionerende eiwitstructuren. Deze oxideren verder tot Advanced Glycation Endproducts (AGE‟s). Deze AGE‟s induceren een stijging in vrije radicalen. Ze gaan pathologische crosslinking aan met naburige eiwitten. Dit is een fundamenteel proces voor het verouderen. De schade, opgelopen door de opstapeling van AGE‟s, draagt deels bij aan verschillende ouderdomsziekten. Diabetici vormen relatief vroeg in hun leven al grote hoeveelheden AGE‟s. Carnosine speelt hier een belangrijke rol. Het dipeptide zal zichzelf opofferen om het doeleiwit te sparen. Het bindt aan reeds gevormde AGE‟s, het inactiveert en verwijdert ze.

Carbonylering kan ervoor zorgen dat eiwitten worden afgebroken, dit kan uiteindelijk leiden tot het afsterven van de cel. Carnosine gaat dit tegen door te reageren met de carbonylgroep. Zo wordt een inerte proteïne-carbonyl-carnosine-verbinding gevormd. Proteïnen worden beschermd en denaturatie wordt tegengegaan. Denaturatie van fosfolipiden komt ook voor. Dit veroorzaakt vooral schade in het centrale en perifere zenuwstelsel. Carnosine heeft dus

14


LITERATUURSTUDIE

neuroprotectieve eigenschappen, omdat het de carbonylering van fosfolipiden tegengaat (Hipkiss & Brownson, 2000). Men heeft aangetoond dat patiënten met diabetes gestegen waarden hebben van TNF-α en IL6 in het plasma (Aso, et al., 2003) (Geerlings, et al., 2000). Aangezien deze cytokines betrokken zijn in de ontwikkeling van de complicaties ten gevolge van diabetes, is het zeer belangrijk om deze te bestrijden. Carnosine bevordert de downregulatie van TNF-α en IL-6 (Tabel 4). Een gevolg hiervan is dat de endotheel dysfunctie en coagulaties risico‟s, door inflammaties, worden verminderd. (Lee, et al., 2005) Tabel 4: Interleukine - 6 (IL - 6) en tumor necrose factor (TNF - α) concentratie in plasma van controle muizen en diabetische muizen behandeld met water die histidine of carnosine bevat 1 (Lee, et al., 2005)

Carnosine kan optreden als een pHbuffer in de spieren. (Begum, et al., 2005). Tijdens korte spierinspanningen van hoge intensiteit zal melkzuur accumuleren in de spiercellen als gevolg van aërobe afbraak van glycogeen. Het melkzuur dissocieert in lactaat en H+. Het zijn die waterstofionen die spiermoeheid veroorzaken. De pH in de spier zal dalen, waardoor de depolarisatie minder sterk zal zijn. Als verdedigingsmechanisme tegen de dalende pH waarden, zijn cellen geëvolueerd tot buffersystemen. Dit wordt gecontroleerd door de imidazole groep, die is terug te vinden in carnosine. Slechts 7% van de totale buffering in de humane spieren wordt veroorzaakt door carnosine. (Mannion, et al., 1992).

Verder verbetert carnosine ook de spierfunctie. Carnosine komt in grote hoeveelheden in de spier voor en zorgt voor een effectievere contractie van het spierweefsel. Inspanning gaat gepaard met oxidatieve stress, aangezien spiercontracties het oxidatief metabolisme doen stijgen. ROS zijn de hoofdreden van verstoringen in de homeostase van de spier die

15


LITERATUURSTUDIE

geassocieerd zijn met spiermoeheid. Ze verstoren de calciumpomp, deze staat in voor het relaxatie-contractie mechanisme van de spier. Om de accumulatie van geoxideerde producten in de spier te voorkomen of te vertragen zijn er endogene anti-oxidanten aanwezig in de spier. Namelijk vitamine E, anserine en carnosine (Quinn, et al., 1992). Carnosine kan ook optreden als binder van zware metalen. Het kan toxisch zware metalen cheleren en zo uit het lichaam verwijderen (Quinn, et al., 1992).

1.3 LINK TUSSEN DIABETES EN CARNOSINE 1.3.1

Tekort aan carnosine bij diabeten

De enige studie die de carnosine concentratie in de spier onderzocht was deze van Buse et al. Hierbij werd de diafragma spier van diabetes ratten vergeleken met die van gezonde ratten. De resultaten toonden aan dat diabetes ratten een tot zelfs 53 % lagere concentratie carnosine hadden in de spier (Buse M, et al., 1980). Nagai et al. konden met hun onderzoek aantonen dat er bij diabetes ratten een lagere concentratie aan carnosine in het plasma werd gemeten in vergelijking met gezonde ratten. Deze ratten werden behandeld met streptozotocin. Dit is een chemische stof die vooral toxisch is voor de insuline producerende β – cellen van de pancreas bij zoogdieren. Streptozotocin wordt gebruikt in medisch onderzoek om bij dieren een model te creëren voor type I diabetes (Nagai, et al., 2003). Bij ratten is carnosine zowel in het bloed als in de spier aanwezig. Bij mensen is het zeer moeilijk om de carnosine concentratie te meten in het bloed omdat het serumcarnosinase dit dipeptide te snel afbreekt. De concentratie in de spier kan wel gemeten worden, aangezien dit enzyme daar weinig aanwezig is.

16


1.3.2

LITERATUURSTUDIE

Carnosine en ontwikkeling van diabetes

Er zijn 2 verschillende invalshoeken in verband met de beschermde functies van carnosine op de complicaties van diabetes. Ten eerste zouden we kunnen stellen dat carnosine zich opoffert zodat er geen schadelijke proteïnen en lipiden worden gevormd. Patiënten met diabetes hebben een verhoogde concentratie ROS in hun lichaam. Carnosine zal zich opofferen zodat deze ROS niet verder kunnen omgezet worden tot schadelijke producten, door oxidatie of glycatie (Nagasawa, et al., 2001).

Zolang insuline resistentie niet optreedt, zullen er op vlak van regulatie van bloedglucose geen problemen optreden en ontstaat er dus ook geen plotse stijging van het bloedglucose. Doordat er zich geen hyperglycemie voordoet, zullen de hieraan gelinkte complicaties uitblijven.

Ten tweede zouden we kunnen aannemen dat door een daling van de carnosinase activiteit in het bloed, er een hogere hoeveelheid carnosine naar de organen kan gaan. In die organen heeft carnosine door zijn beschermende functies een invloed op de voorkomende complicaties. De link tussen spiercarnosine en carnosinase is tot nu toe nog niet aangetoond. Diabetische nefropathie is één van meest ernstige complicaties van type I en type II diabetes. Nu kunnen we ons de vraag stellen, waarom de ene meer kans heeft op de ontwikkeling van deze complicatie dan de andere. Volgens een studie heeft dit met erfelijkheid te maken. Deze studie toont aan dat het CNDP1 gen een rol kan spelen in de gevoeligheid op het verkrijgen van nefropathie. Het CNDP1 gen is een carnosinase gen en is gelegen op het chromosoom 18q (Janssen, 2005). Het is verantwoordelijk voor het aantal leucine herhalingen. Zo bestaat er een 5-5 gen, 5-6 gen, 6-6 gen, 5-7gen, 6-7 gen en een 7-7 gen. Een eerdere studie heeft aangetoond dat er een link bestaat tussen het 18q chromosoom en diabetische nefropathie (Vardarli, 2002). Hoe lager het leucinenummer, hoe minder carnosinase er aanwezig zal zijn in het bloed. Dit betekent dat carnosine daar wel een beetje aanwezig is en op die manier zijn beschermende functies kan uitoefenen (Everaert, et al., 2011).

17


LITERATUURSTUDIE

1.3.3 Supplementatie van carnosine Carnosineconcentratie in de spier Zoals eerder aangegeven bestaat carnosine uit β-alanine en L-histidine. Vele studies hebben reeds aangetoond dat L-histidine voldoende aanwezig is in ons lichaam, maar dat de beschikbaarheid van β-alanine gelimiteerd is. Daarom hebben Bakardjiev et al. een onderzoek uitgevoerd waar de precursor β-alanine werd gesupplementeerd bij kippen. De resultaten toonden dat de carnosine concentratie in de M. Pectoralis aanzienlijk verhoogde bij de groep die β-alanine supplementatie kreeg (Bakardjiev, 1994). Ook een andere studie die werkte met β-alanine supplementatie bij paarden, toonde aan dat de carnosine concentratie in de M. Gluteus Medius steeg (Dunnett, 1999). Hill et al. onderzochten het effect van 4 weken en 10 weken β-alanine supplementatie bij mannen. De resultaten waren een stijging van respectievelijk 58.8% en 80.1% van de concentratie carnosine gemeten in de M. Vastus Lateralis. Deze stijging was gelijk bij zowel type I als type II vezels, ondanks type II vezels initieel een hogere concentratie carnosine bevatten (Hill, 2006). Nog een ander onderzoek op mensen, bevestigt de vorige resultaten. In deze studie kregen mannelijke sprintatleten β-alanine supplementatie gedurende 4-5 weken. De carnosine concentratie in de M. Soleus en M. Gastrocnemius werd gemeten. Ook hier verkreeg men een stijging van het dipeptide (Derave, 2007). Glucosemetabolisme Een studie toonde aan dat L-carnosine een effect heeft op het glucose metabolisme. Door carnosine supplementatie daalde de hoeveelheid plasmaglucose bij de diabetes muizen en was er een aanzienlijke toename van plasma L-carnosine. Daarnaast zag men bij de diabetes muizen, die een overexpressie van carnosinase hadden en die geen L-carnosine toegediend kregen, dat het glucose metabolisme meer geïnhibeerd werd dan de gewone diabetes muizen. Dit werd aangetoond door een steeds toenemende lichaamsmassa en hoge plasmaglucose waarden. De insulinewaarden bij de L-carnosine muizen lagen beduidend veel hoger dan de CN 1 muizen en controlegroep. Dit toont aan dat het glucosemetabolisme bij de L-carnosine muizen werd gestimuleerd door die hogere insulinesecretie. Deze verhoogde secretie is

18


LITERATUURSTUDIE

voornamelijk te wijten aan een verhoogde massa β-cellen in de pancreas, die op zijn beurt te wijten is aan een hogere carnosine concentratie (Sauerhöfer S., 2007). Proteïn/lipidenoxidatie Aangezien carnosine een antioxidant is, beschermt het dipeptide tegen oxidatie van lipiden en proteïnen. Zo toont Hipkiss aan dat een dieet, bestaande uit veel vlees, oxidatie tegengaat (Hipkiss A. , 2005). In een ander onderzoek op varkens onderzocht men de invloed van carnosine supplementatie via een dieet op de antioxidatie capaciteit. Gedurende 8 weken kregen 72 varkens 0, 25, 50 of 100 mg carnosine per kg dieet. De 100 mg carnosine supplementatie zorgde voor een verhoogde activiteit van onder andere super oxide dismutase (SOD) en gluthation peroxidase (GSH –Px) in de spier. Dus hierdoor verbetert de antioxidatie capaciteit van de varkens (Ma X. Y., 2010).

19


LITERATUURSTUDIE

1.4 ONDERZOEKSVRAGEN EN HYPOTHESEN Allereerst willen we in deze scriptie nagaan of er een carnosine deficiëntie zal optreden ter hoogte van de spier bij diabetespatiënten. Dit gaan we na bij zowel mensen als dieren (ratten). Onze hypothese stelt dat er een carnosine deficiëntie zal gevonden worden ter hoogte van de skeletspier bij de patiënten met type II diabetes. We verwachten dit bij de beide studiedesigns.

Verder willen we onderzoeken of we de eventuele deficiëntie kunnen corrigeren. Dit aan de hand van supplementatie van β-alanine en carnosine. Onze hypothese stelt dat de carnosine concentratie zal stijgen in de spier tot normale waarden of zelfs daarboven. We gaan ook op zoek naar het verschil tussen de supplementatie van β-alanine en die van carnosine. Wat zijn de voor- en nadelen van beide aminozuren?

Als laatste willen we de effectiviteit van carnosine, in de bestrijding van de ontwikkeling van de complicaties ten gevolge van diabetes, nagaan. We verwachten dat carnosine doeltreffend zal zijn in die bestrijding.

Deze scriptie kan een belangrijke stap zijn in het verkrijgen van inzichten in de bestrijding van de complicaties ten gevolge van diabetes.

20


METHODIEK

2. METHODIEK

2.1 POPULATIE

a. Humane studie Voor zowel de studie bij type I als bij type II diabetes patiënten, namen er 58 nietvegetarische subjecten deel. Dit onderzoek bestond uit 2 analoge studies: één studie spitste zich vooral toe op type I diabetes patiënten. Deze vond plaats in Gent, België. Een andere studie richtte zich vooral op type II diabetes patiënten (in Sao Paulo, Brazilië). Voor de studie bij type I diabetes patiënten waren er 15 deelnemers. Deze (geslacht : man, leeftijd : 35 ± 7 jr, duur ziekte : 18 ± 8 jr, HbA1c : 7.4 ± 0.9%, BMI: 24 ± 2 Kg/m²) werden gematched (leeftijd, BMI en geslacht) met een controlepersoon (n = 15). Het onderzoek met type II diabetes patiënten werd uitgevoerd met 14 proefpersonen (geslacht: 8 vrouwen en 6 mannen, leeftijd: 60 ± 6 jr, duur ziekte: 7 ± 3 jr, HbA1c: 7.5 ± 0.3%, BMI: 32 ± 1 Kg/m²). Ook voor deze werden er controlepersonen gezocht op basis van leeftijd, BMI, geslacht en dieet. De studieprotocols werden goedgekeurd door het Ethisch Comité van de Universiteit van Gent en Sao Paulo.

b. Dierexperimentele studie Voor de dierexperimentele studie werd er gebruik gemaakt van 36 (9 per groep) mannelijke Sprague Dawley ratten, die 3 weken oud waren en na een acclimatisatie periode van 2 weken werden ze gebruikt voor de studie. Bij de leeftijd van 5 weken hadden zij een gewicht van 122-178 g. Deze ratten hadden de hele dag de mogelijkheid tot eten en drinken en werden onderhouden aan een constante licht-donker cyclus (12u / 12u) en aan een temperatuur van 22°C. Deze dieren bevonden zich in het Proefdierencentrum in Leuven. Het studieprotocol voor de dierexperimentele studie werd goedgekeurd door het Ethisch Comité voor dieren van de KU Leuven.

21


METHODIEK

2.2 STUDIEDESIGN

a. Humane studie Er werd door middel van een cross-sectionele studie gemeten of de carnosine concentraties in de kuitspier (M. Gastrocnemius en M. Soleus ) verschilden tussen de 2 groepen (proefgroep en controlegroep). De M. Gastrocnemius is een spier die vooral type II vezels bevat en de M. Soleus vooral type I vezels. Door middel van Magnetische Resonantie Imaging en Magnetische Resonantie Spectroscopie kon het carnosine gehalte in de spieren worden gemeten.

b. Dierexperimentele studie De ratten werden ingedeeld in 4 groepen : 9 ratten behoorden tot de controlegroep, 9 ratten kregen een vetrijk dieet, 9 ratten kregen een vetrijk dieet en carnosine (1,8 % in drinkwater) toegediend en de laatste 9 kregen een vetrijk dieet en β-alanine (1% in drinkwater). De controlegroep kreeg een normaal dieet waarvan het voedsel slechts 10% vet en 0% sucrose bevatte (Charles River, D01060501) en het drinken uit normaal drinkwater bestond. Het voedsel van de proefgroep echter bevatte 60 % vet en 9% sucrose (Charles River, D12492).

De supplementatie werd toegepast gedurende

8 weken. Tijdens die weken werd het

lichaamsgewicht en de calorie inname (voedsel + drank) 2x/week bijgehouden. Na het doorlopen van de 8 weken durende supplementatie werd er een IVGTT (intraveneuse glucose tolerantie test) uitgevoerd en werd het glucosetransport in de spieren onderzocht (door middel van geperfuseerde achterpoten ). Ook nam men samples van het bloed, de spier en de nier.

22


METHODIEK

2.3 METINGEN

a. Humane studie Om een goed beeld te krijgen van de spierdoorsnede werd er een scan gemaakt door middel van Magnetische Resonantie Imaging. Op dit beeld werd er dan een voxel geplaatst om de carnosine concentraties te kunnen meten. Met een voxel wordt er een waarde gegeven aan een volumecel die in een driedimensionale ruimte gebonden is (Figuur 10).

Figuur 9 : MRI beeld met axiale dwarsdoorsnede van de M. Gastrocnemius met voxel

Vervolgens gebeurde het meten van het carnosine gehalte met een 3-Tesla niet-invasieve proton magnetische resonantie spectroscopie (H1-MRS) scanner (Figuur 12). Met behulp van spectroscopie worden stoffen gedetecteerd en hun concentraties bepaald. Met de scan krijgen we een goed beeld van het volledige protonenspectrum van de onderzochte spier. De werking van een protonspectroscopiescanner gaat als volgt: wat er moet verkregen worden, is dat de atomen in een bepaalde richting gaan roteren. De rotatie gebeurt als de protonen en neuronen in de atoomkern oneven zijn. Dit heet een angulair momentum. De scanner zorgt voor een elektromagnetische stoot, waardoor de atoomkernen zich op een specifieke manier gaan schikken. Hierdoor ontwikkelt er zich een magnetisch veld, waarvan de veldlijnen door de te onderzoeken spieren gaan. De dipole atomen worden beïnvloed en gaan in een bepaalde richting rond deze veldlijnen draaien. De metabolieten worden gemeten in de periode waarin de atomen zich aan het voortbewegen zijn naar de plots ontstane veldlijnen. Bij carnosine

23


METHODIEK

kijken we naar de protonen op koolstof 2 en 4 in de imidazole ring van L-histidine. De C2-H en C4-H pieken bevinden zich in de regio tussen 6,5 en 8,5 ppm (zie figuur 10).

Figuur 11 : Scanresultaat van de M. Gastrocnemius met de C2 en C4 pieken van de imidazole ring van carnosine

Vooraleer de proefpersonen in de scanner gingen, moesten ze alle metalen voorwerpen verwijderen van het lichaam. Deze objecten zouden immers het meetproces kunnen beïnvloeden. De personen werden in de scanner gebracht in ruglig en met het hoofd laatst. Om hun rechteronderbeen te fixeren werd er een coil gebruikt. Deze is opgevuld met kussens om een stabiele lig te garanderen. De enkel moest in een hoek van 20° worden geplaatst (plantaire flexie). Omdat de proefpersonen niet zouden worden gehinderd door het lawaai van de scanner kregen ze een koptelefoon met microfoon en oordoppen. Door de microfoon stonden de proefpersonen ook tijdens het uitvoeren van de scan in contact met de onderzoekers. Een volledige scansessie duurde ongeveer veertig minuten.

24


METHODIEK

Figuur 12: 3T MRI Scanner (SIEMENS)

b. Dierexperimentele studie

IVGTT (intraveneuze glucose tolerantie test) De IVGTT is een test waarbij glucose wordt gegeven via een infuus om te onderzoeken hoe het lichaam van de rat reageert door het vrijgeven van insuline in het bloed. Daarnaast kan men ook zien hoe goed het lichaam op zijn beurt reageert op die insuline. Hiervoor worden vooral de concentratie van glucose en insuline in het bloed opgevolgd en geanalyseerd. Type II diabetes is voornamelijk het gevolg van een beperkte afgifte van insuline in reactie op glucose en ook een verminderde insulinegevoeligheid. Bij prediabetische patiënten wordt er eerst een verhoogde insuline productie en eventueel licht verhoogde glucosewaarden waargenomen (Figuur 13). Daarom kan men met deze test een idee krijgen van hoe ernstig de eventuele insulineresistentie of het risico op het voorkomen van diabetes of hoge bloeddruk en dergelijke is. Deze test kan ook gebruikt worden om de effectiviteit van een behandeling van insuline resistentie na te gaan.

25


METHODIEK

Figuur 13 : Glucose (mg/dl) en insuline concentratie (µU/ml) in bloed bij verschillende stadia bij diabetes type II (OGTT)

Figuur 13 geeft een mooi overzicht van de progressie van diabetes type II op vlak van glucose en insuline. Dit is een representatie van metingen tijdens een OGTT in plaats van een IVGTT. Een orale glucose tolerantie test wordt vooral bij mensen uitgevoerd. Hierbij wordt er suikerwater toegediend in plaats van de glucose rechtstreeks in het bloed te infuseren. Aangezien het bij een OGTT wat langer duurt vooraleer de glucose zich in het bloed bevindt, zal de grafiek er ook wat anders uitzien. Het enige verschil is dat bij een OGTT de glucose- en insuline waarden geleidelijk veranderingen zullen aantonen, waar we bij de IVGTT onmiddellijk een piek zullen waarnemen. Ter voorbereiding op de IVGTT werden de ratten, na een nacht vasten (16 – 18u) geanestheseerd en klaargemaakt voor de chirurgische ingreep. Hierbij werd een katheter in de linker vena jugularis gebracht. Wanneer de ratten, de ochtend erna, terug bij bewustzijn waren, werd een injectie toegediend met 0,8g glucose / kg lichaamsmassa, door gebruik te maken van een 30 % bevattende glucose oplossing in een HCl-oplossing (pH = 4,4). Voor de bepaling van de bloedglucose werd een bloeddruppel genomen van de ader in de staart. Deze werden voor de glucose injectie en 5, 10, 15, 30, 60, 90 en 120 erna verzameld. De

26


METHODIEK

bloedglucose concentraties worden onmiddellijk gemeten en geanalyseerd door gebruik te maken van een automatische glucose analyzer. Vervolgens werd ook bloed, afkomstig van de staart (150 µl plasma) verzameld in Na-heparine bevattende capillairen voor de bepaling van plasma insuline bij 0, 5, 15, , 30 en 90 min. De plasma insuline werd getest door middel van een gevoelige rat insuline RIA kit. Het AUC (Area Under the Curve) voor insuline en glucose werd gemeten, alsook de insulinogene index in nuchtere toestand ( nuchtere insuline concentratie / nuchtere glucose concentratie) en de Matsuda Insulinegevoeligheidsindex (ISI).

Geperfuseerde achterpoten Enkele dagen na de IVGTT werden de perfusies uitgevoerd. Om de invloed van het dieet en de supplementaties te evalueren, werd er op het einde van de 8 weken durende interventieperiode bij iedere rat een perfusie gedaan. Tijdens een perfusie wordt de glucoseopname door de spieren gemeten. Deze is gerelateerd aan de werking van insuline. De ratten moeten hiervoor nuchter zijn (een nacht vasten). Ze werden geanestheseerd en klaargemaakt voor de chirurgische ingreep op de achterste ledematen. Eerst werden de poten geveld (Figuur 14 en 15). Dit is nodig omdat na de perfusie spierbiopten worden genomen van de achterste ledematen. Daarna werd er een insnede gemaakt ter hoogte van de buik. Alle organen die door de grote bloedsomloop worden bevloeid, werden afgebonden en weggesneden. Om de perfusie zo optimaal mogelijk te laten verlopen, moet het perfusaat namelijk enkel door de onderste ledematen vloeien en hier komen dus geen organen aan te pas. De laatste stap van de voorbereiding bestaat uit het plaatsen van de katheters. Eén in de aorta, waar het perfusaat het lichaam binnenkomt en één in de vena cava, waar het perfusaat het lichaam terug verlaat. Daarna is de rat klaar voor de perfusie.

27


Figuur 14 : Beide achterpoten worden ontveld

METHODIEK

Figuur 15 : Alle organen worden afgebonden en weggesneden

Per groep wordt bij 6 à 7 ratten het insuline gestimuleerd glucose transport bekeken, en bij 2 à 3 ratten het basale glucose transport. Het initieel perfusiemedium (490 ml , 35°C) bestond uit Krebs-ringer bicarbonaat buffer oplossing, 4% BSA (bovine serum albumine), 0.15 mM pyruvaat en 4.2 IU/ ml heparine. Vertrekkende vanuit het initieel perfusiemedium werden 3 media gemaakt (medium A, B en C) (tabel 5).

Tabel 5: Samenstelling van de drie gebruikte perfusiemedia

MEDIUM A 150 ml 150 ml stabilisatiemedium

MEDIUM B 160 ml 160 ml stabilisatiemedium

MEDIUM C 180 ml 180 ml stabilisatiemedium

160 µl insuline (1000 µU)

180 µl insuline (1000µU)

enkel bij insuline

1.44 ml 2-DG

gestimuleerd glucose

0.36 ml mannitol

transport

13.5 µl 3H-2DG 90 µl 14C-mannitol

De 3 perfusiemedia werden gedurende de perfusie begast met een mix van 95% O2 en 5% CO2 aan een gemiddelde pO2 van 630 ± 13 mm Hg en een pH van 7.33 ± 0.02 (Figuur 16).

28


METHODIEK

Het stabilisatiemedium perfuseert gedurende 12 min de 2 achterpoten. Dit is nodig om de spieren van de rat te laten herstellen van de operatie. Dit gebeurde aan een snelheid van 20 ml/min. Vervolgens werd de linkerachterpoot (poot 1) afgebonden en de spieren gedissecteerd. De rechterpoot (poot 2) werd gedurende 10 min geperfuseerd met medium B. Enkel bij de insuline gestimuleerde metingen werd er 160 µl aan het stabilisatimedium toegevoegd. De flow werd aangepast (12.5 ml/min). Daarna werden er verschillende bestanddelen aan het medium toegevoegd. Eveneens werd het mengsel aangevuld met twee radioactieve stoffen, namelijk het gemerkte 2-deoxy-d-2,6[3H]glucose en D-1-[14C]mannitol (Medium C). Dit perfusiemiddel werd gedurende 12 minuten toegediend. Nadat de perfusie voltooid was, werden ook van de rechter achterpoot (poot 2) spierbiopten genomen.

Figuur ?16: rat in in perfusiecabinet Figuur : Rat perfusiecabinet (foto + tekening)

Zowel van poot 1 als van poot 2 werden de witte gastrocnemius (type IIx vezels), rode gastrocnemius (type IIa vezels), soleus (type I vezels) en plantaris (type II vezels) gedissecteerd. De spieren werden onmiddellijk ingevroren met vloeibaar stikstof en bewaard op -80°C. De spierbiopten van poot 1 werden gebruikt voor het onderzoeken van de carnosine concentratie (via HPLC methode) en deze van poot 2 voor het onderzoeken van het basaal en insuline gestimuleerd glucosetransport. De „radioactieve suikers‟, namelijk 2-deoxy-d-2,6[3H]glucose en D-1-[14C]mannitol, die zijn opgenomen door de spier worden geteld door een scintillatieteller (Beckman – Coulter Tricarb).

29


METHODIEK

2.4 STATISTISCHE ANALYSE

a. Humane studie

Voor het uitvoeren van de analyses hebben we gebruik gemaakt van PASW ® Statistics 18 , SPSS INC. , Chicago, USA. De resultaten werden als significant geïnterpreteerd bij p < 0,05. Om de carnosine concentraties voor de spieren afzonderlijk te vergelijken tussen de diabetesen controlegroep, werd een Paired-Sample T-test gebruikt. Dit om de gemiddelde carnosine concentraties per spier te vergelijken en zo na te gaan of er een significant verschil was tussen de groepen. Deze resultaten werden verwerkt door de Braziliaanse onderzoeksgroep onder leiding van Gualano.

b. Dierexperimentele studie.

Voor het uitvoeren van de analyses hebben we gebruik gemaakt van PASW ® Statistics 18 , SPSS INC. , Chicago, USA. De verschillende groepen werden vergeleken met elkaar door middel van een One Way Anova. Bij niet-significante resultaten werd een Paired-Sample T-test uitgevoerd om na te gaan of de groepen met het vetrijk dieet verschillen ten opzichte van de controle groep. Het significantie niveau werd vastgelegd op p < 0.05. De evolutie van het gewicht, drank en voedselinname werden geanalyseerd door een repeated measures design.

30


RESULTATEN

3. RESULTATEN 3.1 HUMANE STUDIE

3.1.1 Carnosine concentratie in spier bij mensen

Figuur 17 : Gemiddelde waarden en standaarddeviaties van de carnosine concentratie (arbitraire eenheden) in M. Gastrocnemius en M. Soleus tussen personen met type I diabetes en controlegroep (Gualano, et al.)

Noch bij de M. Gastrocnemius als bij de M. Soleus konden er significante verschillen worden gevonden. Er is geen significante deficiëntie gevonden bij patiënten met diabetes type I.

31


RESULTATEN

Figuur 18 : Gemiddelde waarden en standaarddeviaties van de carnosine conentraties (arbitraire eenheden) bij de M. Gastrocnemius en M. Soleus bij personen met type II diabetes en de controlegroep (Gualano, et al.)

De resultaten toonden aan dat type II diabetes patiënten een significant lagere carnosine concentratie hebben in de M. Gastrocnemius (p = 0.004) in vergelijking met de controlegroep. Er werden bij de waarden van de M. Soleus geen significante verschillen gevonden. Bij deze spier kunnen de twee groepen dus niet vergeleken worden ten opzichte van elkaar.

3.2 DIEREXPERIMENTELE STUDIE

3.2.1 Metingen tijdens supplementatie 3.2.1.1 Gewicht Tijdens de supplementatieperiode werden de ratten, op vaste tijdstippen, gewogen. Voor de berekeningen werden de drie high fat groepen samengenomen.

32


RESULTATEN

Figuur 19 : Gewicht bij de vier condities. Met een significant verschil (p< 0.05) vanaf de tweede meting van de tweede week tussen de high fat groepen en de controle groep. Bij de laatste meting zien we een significant verschil (p<0.001) tussen de drie high fat groepen en de controle groep.

De resultaten geven weer dat elke high fat groep significant verschilt van de controle groep op het einde van de supplementatieperiode. De HF car (x = 572.44 ± 47.27) verschilt significant (p < 0.01) van de controle groep (x = 486.33 ± 57.43). Verder zijn wordt er ook een significant verschil (p < 0.01) gevonden tussen de HF ala (x = 584.33 ± 60.01) en de controle groep (x = 486.33 ± 57.43). Als laatste resultaat vinden we een significant verschil (p = 0.03) tussen de HF (x = 545.11 ± 46.90) en de controle groep(x = 486.33 ± 57.43). Als alle high fat groepen (x = 567.30 ± 52.46) samen worden genomen, dan zie men uiteraard ook een significant verschil (p < 0.001) ten opzichte van de controle groep (x = 486.33 ± 57.43). Men ziet een significant verschil (p = 0.048) in lichaamsgewicht tussen de high fat groepen en de controle groep vanaf de tweede meting van de tweede week. Bij de laatste meting vindt men uiteindelijk een significant verschil van p<0.001 tussen beide groepen. Uit deze resultaten konden er echter geen significante verschillen gevonden worden tussen de 3 high fat groepen onderling (HF car – HF ala : p= 0.973 , HF car – HF : p = 0.757, HF ala – HF : p = 0.495).

33


RESULTATEN

3.2.1.2 Epididymaal vet

Figuur 20 : Gemiddelde waarden en bijhorende standaarddeviaties van hoeveelheid epididymaal vet (g) bij de 4 condities.

Vooraleer de rat volledig geopereerd werd en voor de bloedvaten werden afgebonden, werd het epididymaal vet weggesneden. Dit is het vet rond de bijballen van de ratten. Deze hoeveelheid vet correleert goed met de hoeveelheid lichaamsvet. De resultaten voldoen aan de verwachtingen. Er werd een significant verschil gevonden voor alle high fat groepen apart in vergelijking met de controle groep (x = 8.87 ± 2.89). Voor HF car (x= 16.92 ± 6.31) en HF ala (x = 16.48 ± 5.90) werd een p-waarde gevonden kleinder dan 0.01. Voor de HF groep (x = 12.33 ± 6.19) werd een p-waarde gevonden van 0.05. Alle drie high fat groepen (x = 15.80 ± 6.04) samen, hebben significant (p = 0.002) meer epididymaal vet dan de controle groep (x = 8.87 ± 2.89). De 3 high fat groepen toonden echter geen significante verschillen ten opzichte van elkaar (HF car – HF ala : p = 0.999 , HF car – HF : p = 0.706 , HF ala – HF : p = 0.792).

34


RESULTATEN

3.2.1.3 Calorie inname

Figuur 21 : Gemiddelde waarden van de calorie inname per dag.

Bij de calorie inname voldoen de resultaten ook aan de verwachtingen. Namelijk dat de high fat groepen (x = 229.89 ± 30.69) een significant (p = 0.024) hogere calorie inname hebben dan de controle groep (x = 188.65 ± 16.86). Significantie werd ook berekend tussen de 3 high fat groepen onderling, maar hier konden geen significante verschillen worden aangetoond (HF car – HF ala : p = 0.751, HF car – HF : p = 0.787 , HF ala – HF : p= 0.260).

35


RESULTATEN

3.2.2 Bloedglucose via IVGTT

Figuur 22 : Bloedglucose (mg/dl) bij de vier condities op verschillende tijdstippen gemeten

De bloedglucose wordt gemeten op verschillende tijdstippen na de IVGTT. We zien een significant verschil (p = 0.024) na vijf minuten tussen de high fat groep (x = 429.6 ± 77.6) en de controlegroep (x = 392.0 ± 53.5). Ook na tien, minuten vinden we een significant verschil (p = 0.027) tussen de high fat (x = 358.0 ± 52.5) en de controlegroep (x = 330.6 ± 45.8). Na 60 minuten en 120 minuten zien we nog een significant verschil tussen de high fat groep en de β-alanine groep, met p waarden van respectievelijk p = 0.035 en p = 0.05 , gemiddelden van HF x = 166.2 ± 56.5 en x = 118.9 ± 34.8 en gemiddelden van de β-alanine groep x = 143.3 ± 21.1 en x = 101.1 ± 12.0. De rode cirkel duidt op de nuchtere bloedglucose. Deze is voor alle vier de groepen gelijk.

36


3.2.3

RESULTATEN

Absolute bloedglucose

AUC bloedglucose 35000.0

*

Bloedglucose (mg/dl)

30000.0 25000.0 20000.0 15000.0 10000.0 5000.0 0.0 Controle

*

HF

HF + Carn

HF + β Ala

p = 0.05 HF vs Controle

Figuur 23: gemiddelde waarden + bijhorende standaarddeviaties van absolute bloedglucose waarden onder de curve voor de verschillende condities

Bij het bekijken van de resultaten voor de absolute bloedglucose waarden onder de curve dan is er een significant verschil (p = 0.05) tussen de high fat groep (x = 22729.0 ± 5487.8) en de controle groep (x = 20583.9 ± 1676.0). Bij het verschil tussen de high fat groep (x = 22729.0 ± 5487.8) en de β-alanine groep (x = 21079.7 ± 2296.9) werd een trend tot significantie gevonden (p = 0.06). Tussen de high fat groep (x = 22729.0 ± 5487.8) en de carnosine groep (x = 24040.3 ± 5546.2) werd geen significant verschil (p = .70) gevonden. Bij de vergelijking tussen alle high fat groepen (x = 23327.1 ± 4761.97) samen en de controle groep (x = 20583.9 ± 1676.0) werd ook geen significant verschil (p = 0.12) gevonden.

37


RESULTATEN

3.2.4 Glucosetransport

Absoluut glucose transport (per groep afzonderlijk) Glucose transport (µmol/g/h)

14 12 10 8

CONTR

6

HF HF+CARN

4

HF+B-alan

2 0 SOL

GW

GR

PL

Spieren

Figuur 24 : Gemiddelde waarden en standaarddeviaties van het absoluut glucosetransport (µmol/g/h) per groep bij de 4 onderzochte spieren.

Bij het analyseren van de resultaten van het absoluut glucosetransport per groep bij de 4 onderzochte spieren werd er nergens een significant verschil gevonden. Binnen iedere spier werden de groepen vergeleken met elkaar. Noch bij de M. Soleus (p = 0.55) , witte M. Gastrocnemius (p = 0.70), rode M. Gastrocnemius (p = 0.45) als bij de M. Plantaris (p = 0.60) waren de resultaten significant verschillend genoeg om te kunnen vergelijken. Na het uitvoeren van een Anova Test en Post Hoc op de resultaten van het absoluut glucose transport van alle groepen samen bij de 4 onderzochte spieren, vonden we een significant verschil (p = 0.044) tussen de waarden van de witte M. Gastocnemius en de M. Plantaris. Hieruit kunnen we besluiten dat de witte M. Gastrocnemius ( x = 5.40 ± 2.31) significant lagere waarden heeft bij het glucose transport, in vergelijking met de waarden van de M. Plantaris ( x = 7.83 ± 3.12 ).

38


RESULTATEN

Figuur 25: Gemiddelde waarden en standdaarddeviaties van het glucosetransport. Het glucosetransport na een insuline inspuiting is hier absoluut weergegeven. De 4 condities zijn samengenomen.

Er wordt een significant verschil gevonden op basaal niveau tussen de GW (x = 1.54 ± 0.26) en GR (x = 2.29 ± 0.84), maar ook tussen GW (x = 1.54 ± 0.26) en PL (x = 2.43 ± 0.80) (voor beide is p = 0.03). Verder wordt ook een significant verschil (p = 0.005) gevonden na inspuiting van insuline tussen GW (x = 5.54 ± 2.31) en PL (x = 7.83 ± 3.12). Een trend tot significantie (p = 0.06) wordt na deze inspuiting gevonden tussen de GW (x = 5.54 ± 2.31) en de GR (x = 7.02 ± 3.24). Bij de vergelijking van het basaal glucose transport en het insuline gestimuleerd glucose transport binnen eenzelfde spier, vinden we telkens significantie of een trend tot significantie. Het insuline gestimuleerd glucose transport ligt voor iedere spier significant hoger dan het basaal glucose transport. (SOL p = 0.07 , GW p = 0.01 , GR p = 0.05 , PL p = 0.02).

39


RESULTATEN

Relatief glucose transport (per groep afzonderlijk) Glucose transport (µmol/g/h)

12 10 8 CONTR

6

HF HF+CARN

4

HF+B-alan 2 0 SOL

GW

GR

PL

Spieren

Figuur 26 : Gemiddelde waarden en standaarddeviaties van het relatief glucosetransport per groep bij de 4 onderzochte spieren.

Bij het relatief glucose transport per groep bij de onderzochte spieren werd er nergens significante verschillen gevonden. Het analyseren van de resultaten zorgde voor een p = 0.25 bij de groepen bij de M. Soleus , p= 0.48 bij de witte M. Gastrocnemius, p= 0.16 bij de rode M. Gastrocnemius en p= 0.20 bij de M. Plantaris.

40


DISCUSSIE

4. DISCUSSIE 4.1 CARNOSINE DEFICIËNTIE IN DE SKELETSPIER De humane studie heeft aangetoond dat er bij type I diabetes geen carnosine deficiëntie optreedt ter hoogte van de spier (Figuur 17). Bij type II diabetes zien we wel een significante (p = 0.004) deficiëntie (Figuur 18) optreden in de gastrocnemius spier in vergelijking met de controlegroep. In de soleus spier vinden we dan weer geen deficiëntie in vergelijking met de controlegroep. Hoe het komt dat er bij type I diabetes patiënten geen verschil gevonden is, ligt waarschijnlijk aan het feit dat de pathologie van type I diabetes en type II diabetes verschillend is. Perifere insuline resistentie, die veroorzaakt wordt door oxidatieve stress en chronische lage inflammatie (Wei, et al., 2008), ligt aan de basis van diabetes type II en niet van diabetes type I. De skeletspier zal ook een belangrijke rol spelen in de etiologie van diabetes type II. Dunnet et al. hebben aangetoond dat type II spiervezels meer carnosine bevatten dan type I spiervezels. Dit kan een verklaring zijn waarom er in de soleusspier geen verschil gevonden is in carnosine concentratie tussen diabetes type II patiënten en gezonde patiënten. Daar de soleus vooral opgebouwd is uit type I spiervezels bevat deze initieel al minder carnosine.

Type I diabetes heeft als gevolg microvasculaire complicaties. Bij deze complicaties worden de kleine bloedvaten aangetast, als een gevolg van glycatie en oxidatie. Dit heeft een effect op de nieren, de zenuwen en op de retina. Verder wordt ook inflammatie geïnduceerd. Bij type I diabetes heeft dit volgens onze data geen effect op de spier. Bovenop de microvasculaire complicaties ontstaan er bij type II diabetes ook macrovasculaire complicaties. Als gevolg van de stijging van de bloedglucose en de VVZ worden de grote bloedvaten aangetast. Inflammatie wordt ook hier geïnduceerd. De overdreven stijging van VVZ leidt tot een overvloedige VVZ oxidatie wat op zijn beurt de productie van schadelijke stoffen induceert. Nagasawa et al., hebben aangetoond dat carnosine supplementatie de markers van oxidatieve stress in de spier doet afnemen. Spiercarnosine zal zichzelf opofferen om de schadelijke producten te vangen om zo oxidatie en glycatie tegen te gaan. Dit kan nog een reden zijn waarom er bij type II diabetes wel een significante lagere carnosine concentratie wordt gevonden in vergelijking met controle patiënten.

41


DISCUSSIE

Hier kunnen we opmerken dat de spier zeer belangrijk is in het hele carnosine metabolisme. 95% van de totale carnosine concentratie is aanwezig in de spier. Dus dit is een goede maat voor de carnosine concentratie in het hele lichaam. Als de spier niet is aangetast, zoals bij diabetes type I patiënten, kan dat een aanleiding geven tot het niet vinden van significante verschillen in spier carnosine concentratie in patiënten vergeleken met de controlegroep.

Leeftijd kan ook een rol spelen in het verschil in bevindingen tussen type I en II diabetes. Type I diabetes is een pathologie die vooral voorkomt bij jonge mensen. Terwijl type II diabetes gekend is als ouderdomsdiabetes. De proefpersonen binnen deze studie hadden een leeftijd van 35 ± 7 jaar (type I) of 60 ± 6 jaar (type II). Everaert et al. hebben aangetoond dat hoe ouder men wordt, hoe minder carnosine men zal hebben in de spier. Daardoor zou het verschil in carnosine gehalte tussen de twee types diabetes ook door de verschillende leeftijdsgroepen kunnen worden verklaard. Als we dierexperimenteel gaan kijken, tonen de resultaten ons dat de ratten die een high fat dieet hebben gekregen, significant (p < 0.001) meer wegen dan de controlegroep. De reden hiervoor is dat de ratten een significant (p = 0.024) hogere calorie inname hadden dan de controle groep (Figuur 21). Inactiviteit is geen reden voor de significant hogere gewichtstoename.

De waarden van de carnosine concentratie in de spieren bij ratten hebben we nog niet ter onzer beschikking. We verwachten dat de carnosine concentratie lager zal zijn bij de high fat groepen dan bij de controlegroep. Als dit significant zal zijn weten we niet. De ratten die een high fat dieet kregen zijn nog niet diabeet. Op figuur 22 hebben we de nuchtere bloedglucose aangeduid met een rode cirkel. Deze toont aan dat de nuchtere waarden voor alle vier de groepen gelijk zijn. Dit kan, aangezien de ratten zich in de prediabetische fase bevonden en er daardoor op vlak van nuchtere bloedglucose nog geen verschillen zullen op te merken zijn.

4.2 CORRECTIE CARNOSINE DEFICIËNTIE ADHV SUPPLEMENTATIE 4.2.1 Dierexperimentele studie Nu men veronderstelt dat er een deficiëntie van carnosine voorkomt bij type II diabetes patiënten, wil men onderzoeken of dit door middel van supplementatie kan worden tegengegaan. Dit uitgevoerd aan de hand van een dierexperimentele studie. Hierin werden vier condities opgesteld. Drie high fat groepen en één controle groep. Binnen de high fat

42


DISCUSSIE

groepen zijn er twee groepen die een supplementatie kregen, de ene groep kreeg carnosine toegediend en de andere β-alanine. Eén van de doelen van deze studies was het meten van de carnosine concentratie in de skeletspieren van de achterpoten.. De resultaten hiervan werden verzameld tijdens de pilootstudie (Figuur 27). Er zijn significant hogere carnosine concentraties gevonden bij de high fat groepen die een carnosine supplementatie kregen. Deze significante verschillen werden gevonden in elke spier. De spiercarnosine stijgt meer in typeI dan in type IIx/b , wat andersom is bij de mens (Baguet, et al., 2011).

[carnosine]spier (mmol/kg/DW)

Spiercarnosine $

35 30 25 20

$

$

$

CONTR

15

HF

10

HF+CARN

5 0 GW

GR

SOL

PL

Spieren Figuur 27: Pilootstudie. Gemiddelde carnosineconcentratie in de skeletspier (mmol/kg/DW) en bijhorende standaarddeviaties. $ p < 0.05.(GW: + 32%, GR: + 60%, SOL, +48%, PL, +38%)

Of de supplementatie van β – alanine al dan niet effect zal hebben op het carnosine gehalte in de spier zal effectief kunnen aangetoond worden wanneer de resultaten van de carnosine concentraties binnen de gedissecteerde spieren onze bevindingen zullen volgen. Deze resultaten zijn echter nog niet ter onze beschikking. Er wordt gesuggereerd dat de concentraties in de witte M. Gastrocnemius (type IIx vezels) groter zullen zijn dan deze in de M. Plantaris (type IIa vezels). Want zoals reeds aangegeven in de literatuurstudie kon aangetoond worden dat type I vezels minder carnosine bevatten dan type II vezels (Dunnet, 1997). Bij de vergelijking van de verschillende gemeten groepen worden er lagere waarden verwacht bij de high fat groep in vergelijking met de controlegroep. Dit omdat carnosine zich waarschijnlijk zal opofferen om de vele complicaties, gerelateerd aan de obesitas geïnduceerde insuline resistentie, tegen te gaan. De hoogste waarden zullen waarschijnlijk

43


DISCUSSIE

gevonden worden bij de β – alanine groep. omdat verschillende studies reeds hebben aangetoond dat β – alanine supplementatie zorgt voor verhoogde carnosine waarden (Bakardjiev, 1994) (Dunnet, 1997) (Derave, 2007) (Hill, 2006). Carnosine supplemenatie daarentegen toonde grote veranderingen in het plasma bij dieren (Sauerhöfer S., 2007). Effecten op de spier werden niet onderzocht. Bakardjiev et al., toonden aan dat een supplementatie van β-alanine een significante stijging van carnosine in de spier van kippen induceerde. De waarden lagen na de supplementatie tot 4 maal hoger dan initieel gemeten. De beschermende functies van het dipeptide zijn in deze scriptie duidelijk naar voor gekomen. Als de supplementatie effectief voor een stijging van de carnosineconcentratie zorgt, kan dit belangrijk zijn naar de behandeling van diabetes type II toe. Door toename van carnosine in de spier zouden verschillende processen die voorkomen bij diabetes, zoals oxidatie en glycatie, kunnen worden tegengegaan. Aangezien oxidate en glycatie een belangrijke invloed hebben op de ontwikkeling van macro- en microvasculaire complicaties, zal dit een belangrijk effect hebben op de morbiditeit van de aandoening (Panzram, 1987).

Uit de resultaten van deze studie blijkt dat carnosine supplementatie een ander effect heeft dan het supplementeren van zijn precursor β-alanine. Carnosine is een aminozuur dat zowel in het bloed, als in de spier zijn beschermende functies kan uitvoeren. Het supplementeren van carnosine heeft dus op dit vlak heel veel voordelen. Nagenoeg moet het dipeptide eerst worden afgebroken vooraleer het in de spier terug kan worden aangemaakt. Door deze omweg duurt het langer eer carnosine ook actief kan zijn in de skeletspier. Daarom wordt er tijdens supplementaties vaak gewerkt met de precursor β-alanine. Dit peptide wordt namelijk onmiddellijk omgezet tot carnosine. Aan de andere kant heeft de aanwezigheid van β-alanine in het bloed geen positieve effecten, aangezien het geen beschermende functies bevat. Wij opteren voor het gebruik van β-alanine tijdens supplementatie, aangezien onze resultaten en ook deze van andere studies positieve uitkomsten tonen. De supplementatie van carnosine daarentegen, kon de verwachtingen niet bevestigen.

44


DISCUSSIE

4.3 EFFECTIVITEIT VAN CARNOSINE Een belangrijke vraag binnen deze studie is of het glucosemetabolisme wordt beïnvloed door een high fat dieet en/ of supplementatie van β – alanine en carnosine. Tijdens de IVGTT werd er via een katheter glucose door het lichaam van de ratten gestuurd. De glucose en insuline waarden werden gemeten en geanalyseerd. Dit om te onderzoeken wat het effect zou zijn op de vrijgave van insuline in het lichaam. Op zijn beurt wordt er dan ook gekeken hoe het lichaam reageert op deze insuline concentratie in het bloed. De resultaten vertellen ons dat er na 5 minuten en na 10 minuten een verschil is tussen de bloedglucose concentratie van de high fat groep en de controlegroep ( resp. p = 0.024 en p = 0.027). De waarden van de high fat groep liggen beduidend hoger dan die van de controlegroep. Dit toont aan dat vetrijk dieet leidt tot een verstoord glucosemetabolisme (Bergman & Ader, 2000). Bij de laatste twee metingen, namelijk na 60 en 120 minuten wordt er een verschil gemeten tussen de β – alanine groep en de high fat groep (resp. p= 0.035 en p = 0.05). De supplementatie van β – alanine heeft dus een reducerend effect op de bloedglucose waarden bij ratten met obesitas geïnduceerde insuline resistentie. Deze resultaten neigen in de richting van de verwachtingen binnen deze studie. Namelijk dat β – alanine, een precursor van carnosine, waarschijnlijk de verstoring van het glucosemetabolisme zal tegengaan. Bij het vergelijken van de initiële waarden van bloedglucose bij de verschillende groepen tijdens de metingen van de IVGTT wordt er iets opgemerkt. Deze nuchtere bloedglucose waarden liggen bij iedere groep op hetzelfde niveau. Dit is, zoals eerder vermeld, normaal bij ratten die zich in de prediabetische fase bevinden. Aangezien de insuline waarden in het bloed, die gemeten werden tijdens de IVGTT, nog niet ter onze beschikking zijn, kan er niet bevestigd worden dat β – alanine effectief strijdt tegen de verstoring van het glucosemetabolisme door een vetrijk dieet. . Voor deze waarden zal de Matsuda insuline gevoeligheidsindex (ISI, Insulin Sensivity index) berekend worden. Ook de insuline resistentie wordt gemeten aan de hand van de HOMA insuline resistentie index (HOMA – IR). De ratten in deze studie bevonden zich in de prediabetische fase. Dit wil zeggen dat de insuline waarden beduidend hoger zouden moeten liggen in vergelijking met de controlegroep (Figuur 13). Er wordt gesuggereerd dat de resultaten van de insuline metingen dit ook zullen bevestigen. Als reactie op de verhoogde insuline waarden kan er af en toe ook verhoogde

45


DISCUSSIE

bloedglucose waarden worden waargenomen. Dit is echter niet altijd van toepassing. Het zou ook een reden kunnen zijn waarom er bij de IVGTT niet bij iedere meting significant hogere glucose waarden werden waargenomen. Waarom supplementatie van carnosine geen effect heeft op de verstoring van het glucosemetabolisme kan terug te verklaren zijn door wat eerder werd aangehaald in de discussie. Bij de mens zien we dat eer carnosine actief kan zijn in het lichaam, het eerst nog afgebroken wordt door carnosinase in het bloed, om daarna pas terug aangemaakt te worden door carnosinesynthase in de spier. Men suggereert dat dit proces een veel te grote omweg maakt, zodat er geen effecten worden waargenomen. Β – alanine daarentegen, wordt in het lichaam onmiddellijk omgezet tot carnosine. Bij dieren is er wel carnosine aanwezig in het bloed, maar als carnosine zijn beschermende functies wil uitoefenen in de spier, moet het toch daar eerst worden aangemaakt. De absolute bloedglucose waarden (Figuur 23) geven aan dat het bloedglucosegehalte significant (p = 0.05) hoger ligt bij de high fat groep in vergelijking met de controle groep. Een trend tot significantie (p = 0.06) werd gevonden in het bloedglucosegehalte bij de vergelijking tussen de high fat groep en de β-alanine groep. Zoals verwacht toonde de βalanine groep een lager bloedglucosegehalte dan de high fat groep. Een eerdere studie toonde reeds aan dat een verhoogde carnosine concentratie in het plasma, door middel van Lcarnosine supplementatie, zorgt voor bevordering van het glucosemetabolisme (Sauerhöfer S., 2007). Men veronderstelt dat dit verhaal hetzelfde zal zijn in de spier en dat β-alanine supplementatie dezelfde effecten zal hebben op de carnosine concentratie. Tijdens de achterpoot perfusies werd er bij 6 à 7 ratten per groep gekeken naar het insuline gestimuleerd glucose transport. Bij 2 à 3 ratten per groep werd het basaal glucose transport onderzocht. Bij het absoluut glucosetransport werden er geen significante verschillen gevonden tussen de groepen binnen het glucosetransport van de vier onderzochte spieren. Verder werd er gekeken naar het relatief glucose transport tussen de verschillende groepen binnen de vier onderzochte spieren. Dit is het absoluut glucosetransport met vermindering van het basaal glucosetransport. De relatieve waarden tonen resultaten die de bevindingen volgen. Namelijk dat het glucosetransport van de high fat groepen lager ligt dan deze van de controlegroep en dat de β – alanine groep de hoogste waarden heeft. Maar ook deze resultaten zijn niet significant bevonden.

46


DISCUSSIE

4.4 BEPERKINGEN VAN DIT ONDERZOEK Aangezien de ratten geen duidelijke kenmerken tonen van insuline resistentie, kan dit een teken zijn dat het toegediende dieet niet effectief genoeg is. Ook merkten we dat er af en toe een te grote hoeveelheid eten over was. Ook kan het uitblijven van significante waarden een gevolg zijn van de kleine hoeveelheid proefdieren. Tijdens de tests vielen er reeds enkele af en misschien lag het effectief gebruikte aantal proefdieren te laag om goede uitspraken te kunnen doen. Tijdens het uitvoeren van de perfusies moesten er 2 katheters in de aorta en vena cava worden geplaatst. Aangezien dit precisie werk is en daardoor wat tijd in beslag nam, gebeurde het dat de rat hierbij reeds overleed.

4.5 TOEKOMST Het toedienen van het voedsel via een infuus zou mogelijks kunnen zorgen voor het optimaliseren van de ontwikkeling van obesitas en insuline resistentie. Door het gebruiken van een infuus is er zekerheid dat de proefdieren een bepaalde hoeveelheid calorieën per dag innemen. Ook het gebruiken van meer ratten per groep zou aanleiding kunnen zijn van het voorkomen van meer en grotere significantie. Een manier om het overlijden tijdens het insteken van katheters te beperken kan het werken met een incubatietechniek zijn. De nadelen van deze techniek zijn natuurlijk een lagere nauwkeurigheid, die men bij de perfusies niet heeft.

47


DISCUSSIE

4.6 CONCLUSIE

Diabetes is een ernstige, veelvoorkomende aandoening. Het brengt heel wat complicaties met zich mee. Bij type I diabetes zijn dat vooral microvasculaire complicaties, bij type II diabetes micro- en macrovasculaire. Carnosine zou een belangrijke rol kunnen spelen in het tegengaan van deze complicaties. Allereerst wordt hij gezien als anti-oxidant. Maar ook de anti-glycatie (Nagasawa, et al., 2001) en de anti-inflammatoire functies (Lee, et al., 2005) zijn zeer belangrijk. Na onderzoek van carnosine concentratie in de spier bij type I diabetes, gaat men in deze scriptie de carnosine concentratie na in type II diabetes patiënten. Want bij type I werden humaan geen significante verschillen gevonden. Het onderzoek op type II diabetes gebeurde zowel humaan als dierexperimenteel. Humaan werden de verwachtingen bevestigd, namelijk type II diabeten hebben minder carnosine in de skeletspier dan controle patiënten. Dierexperimenteel zijn deze resultaten nog niet verwerkt. De pilootstudie heeft aangetoond dat supplementatie van carnosine/βalanine een significante stijging van carnosine concentratie in de spier induceert. Door supplementatie is men in staat om de carnosine waarden bij diabetespatiënten weer op normale hoogte te krijgen, of zelfs hoger. De effectiviteit van carnosine/β-alanine supplementatie wordt in deze scriptie aangetoond door de bloedglucose waarden na te gaan tijdens een IVGTT, maar ook door naar het glucosetransport in de spier te kijken. Bij de bloedglucose zien bij de meting na 120 min, na supplementatie van β-alanine, significant (p = 0.05) lagere waarden dan bij de high fat groep. Bij het bekijken van het glucosetransport zijn geen significante waarden gevonden. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat de ratten nog niet diabeet zijn.

Met deze scriptie kan niet aangetoond worden dat de spier de belangrijkste rol speelt in de bestrijding van complicaties ten gevolge van diabetes. Maar wij, als bewegingsdeskundige, geloven er nog steeds in dat dit wel zo is. Wij hopen dat deze scriptie een aanzet kan zijn tot verder onderzoek.

48


REFERENTIELIJST

5. REFERENTIELIJST Aerts, L., & Van Assche, F. (2001). Low taurine, gamma-aminobutyric acid and carnosine levels in plasma of diabetic pregnant rats: consequences for the offspring. Journal of perinatal medicine, 81-84. Ahmed, N. (2005). Advanced glycation endproducts - role in pathology of diabetic complications. Diabetes research and clinical practice, 3-21. Aldini, G., Facino, R., Beretta , G., & Carini, M. (2005). Carnosine and related dipeptides as quenchers of reactive carbonyl species: From structural studies to therapeutic perspectives. BioFactors, 77–87. Alhamdani, M., Al-Kassir, A., abbas, F., Jaleel, N., & Al-Taee, M. (2007). Antiglycation and antioxidant effect of carnosine against glucose degradation products in peritoneal mesothelial cells. Nephron clinical practice, C26-C34. Aso, Y., Okumura, Y., Yoshida, N., Tayama, K., Kanda, T., Kobayashi, I., et al. (2003). Plasma interleukin-6 is associated with coagulation in poorly controlled patients with Type 2 diabetes. diabet med, 930 - 934. Bakardjiev, A. B. (1994). Transport of β-alanine and biosynthesis of carnosine by skeletal muscle cells in primary culture. European journal of biochemistry, 617-623. Begum, G., Cunliffe, A., Leveritt, M., Asgate, A., Franklin, M., & Chowdrey, C. (2005). Effect of basic and advanced formulation carbohydrate-electrolyte drinks. on physical and mental performance during high-intensity intermittent exercise. Proceedings of the nutrition society, 52A-52A. Bergman, R., & Ader, M. (2000). Free fatty acids and pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. Trends in endocrinology and metabolism, 351-356 . Boldyrev, A., & Severin, S. (1990). The histidine containing dipeptides, carnosine and anserine - distribution , properties and biological significance. Advances in enzyme regulation, 175-&. Bonnard, C., Durand, A., Peyrol, S., Chanseaume, E., Chauvin, M., Morio, B., et al. (2008). mitochondrial dysfunction results from oxidative stress in the skeletal muscle of dietinduced insulin-resistant mice. J. Clin. Invest, 789–800. Brownlee, M. (2005). The Pathobiology of diabetic complications. Diabetes, 1615 -1625. Brownson, C. H. (2000). Carnosine reacts with a glycated proteïn. Free radical biology and medicine , 1564-1570.

49


REFERENTIELIJST

Buse, M., Weigand, D., Peeler, D., & Hedden, M. (1980). The effect of diabetes and the redox potential on amino-acid content and release by isolated rat hemidiaphragms. Metabolism clinical and experimental, 605-616. Chan, K. e. (1994). Endogenous skeletal muscle antioxidants. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 403-426. Chang-Hoon Woo, Y.-W. E.-H.-J.-S.-H. (2000). Tumor Necrosis Factor-a Generates Reactive Oxygen Species via a Cytosolic Phospholipase A2-linked Cascade. The journal of biological chemistry, 32357- xx. DeFronzo, R. (2004). Dysfunctional fat cells, lipotoxicity and type 2 diabetes. International journal of clinical practice, 9-21. Derave, W. Ö. (2007). β-alanine supplementation augments muscle carnosine content and attenuates fatigue during repeated isokinetic contraction bouts in trained sprinters. J Appl Physiol , 1736-1743. Du, X., Edelstein, D., Dimmeler, S., Ju, Q., Sui, C., & Brownlee, M. (2001). Hyperglycemia inhibits endothelial nitric oxide synthase activity by posttranslational modifications at the Akt site. J Clin Invest, 1341 - 1348. Du, X., Edelstein, D., Rossetti, L., Fantus, I., Goldberg, H., Ziyadeh, F., et al. (2000). Hyperglycemia-induced mitochondrial superoxide overproduction activates the hexosamine pathway and induces plasminogen activator inhibitor-1 expression by increasing Sp1 glycosylation. Proc Natl Acad Sci, 12222 - 12226. Dunnet, M. H. (1997). Carnosine, anserine and taurine contents in individual fibres from the middle guiteal muscle of the camel. Research in veterinary science, 213-216. Dunnett, M. ,. (1999). Influence of oral beta-alanine and L-histidine supplementation on the carnosine content of the gluteus medius. Equine Vet J Suppl. , 499-504. Everaert, I., Mooyaart, A., Baguet, A., Zutinic, A., Baelde, H., Achten, E., et al. (2011). Vegetarianism, female gender and increasing age, but not CNDP1. Amino Acids, 1221 - 1229. Geerlings, S., Brouwer, E., Van Kessel, K., Gaastra, W., Stolk, R., & Hoepelman, A. (2000). Cytokine secretion is impaired in women with diabets mellitus. Eur. J Clin, 995 1001. Goh, S.-Y., & Cooper, M. E. (2008). The Role of Advanced Glycation End Products in Progression and Complications of Diabetes. Clinical endocrinology & metabolism, 1143 - 1152. Gualano, B., Everaert, I., Stegen, S., Artioli, G., Taes, Y., Roschel, H., et al. (sd). Reduced muscle carnosine content in type II, but not in type I diabetic patients. unpublished.

50


REFERENTIELIJST

Hill, C. H. (2006). Influence of β-alanine supplementation on skeletal muscle carnosine concentrations and high intensity cycling capacity. Amino Acids , 225–233. Hipkiss , A. (2005). Glycation, ageing and carnosine: Are carnivorous diets beneficial? Mechanisms of Ageing and Development, 1034–1039. Hipkiss, A. C. (1998). Carnosine protects against methylglyoxalmediated modifications. Biochem Biophys Res Commun. , 28-32. Hipkiss, A. M. (1995). Non-enzymic glycosylation of the dipeptide L-carnosine, a potential anti-protein-cross-linking agent. Febs letters, 81-85. Hipkiss, A. P. (1998). Pluripotent protective effects of carnosine,a naturally-occurring dipeptide. In Towards prolongation of the healthy life span - practical approaches to intervention (pp. 37-53 ). Hipkiss, A., & Brownson, C. (2000). Carnosine reacts with protein carbonyl groups: another possible role for the anti-ageing peptide? BIOGERONTOLOGY, 217-223. Horinishi, H., Grillo, M., & Margolis, F. (1978). Purification and characterization of carnosine synthase from mouse olfactory bulbs. Journal of neurochemistry, 909-919. Houstis N., E. D. (2006). Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature, 944-948. Janssen, B. H. (2005). Carnosine as a protective factor in diabetic Nephropathy. Diabetes, 2320-2327. Jappar, D. H. (2009). Transport mechanisms of camosine in SKPT cells: contribution of apical and basolateral membrane transporters. Pharm Res. , 172-181. Lee, Y.-t., Hsu, C.-c., Lin, M.-h., Liu, K.-s., & Yin, M.-c. (2005). Histidine and carnosine delay diabetc deterioration in mice and protect human low density lipoprotein against oxidation and glycation. European Journal of Pharmacology, 145 - 150. Lenney, J., Peppers, S., Kucerarllo, C., & George, R. (1985). Characterization of humantissue carnosinase. Biochemical journal, 653-660. Lidong Zhai, S. W. (2011). Role of Reactive Oxygen Species in Injury-Induced Insulin Resistance. Mol. Endocrinol, 492-502. Ma X. Y., J. Z. (2010). Dietary supplementation with carnosine improves antioxidant capacity and meat quality of finishing pigs. Journal of animal physiology and animal nutrition, 1439 - 0396. Mannion AF., J. P. (1992). Carnosine and anserine concentrations in the quadriceps femoris muscle of healthy humans. European journal of applied physiology and accupational physiology, 47-50.

51


REFERENTIELIJST

Mannion, A. J. (1995). Skeletal muscle buffer value, fibre type distribution and high intensity exercise performance in man. Exp Physiol. , 89-101. Misra, P., Upadhyay, R., Misra, A., & Anand, K. (2011). A review of the epidemiology of diabetes in rural India. Diabetes research and clinical practice, 508 - 517. Nagai, K., Niijima, A., Yamano, T., Otani , H., OkumraN, Tsuruoka, N., et al. (2003). Possible role of L-carnosine in the regulation of blood glucose through controlling autonomic nerves. Experimental biology and medicine, 1138-1145. Nagasawa, T., Yonekura, T., Nishizawa, N., & Kitts, D. (2001). In vitro and in vivo inhibition of muscle lipid and protein oxidation by carnosine. Molecul and Cellular Biochemestry, 29 - 34. Osawa, t., & Kato, Y. (2005). Protective role of antioxidative food factors in oxidative stress caused by hyperglycemia. Ann. N.Y. Acad. Sci., 440 - 451. Panagiotidis G, A. B. (1995). Influence of nitric oxide synthase inhibition, nitric oxide and hydroperoxide on insulin release induced by various secretagogues. British journal of pharmacology, 289-296. Panzram, G. (1987). Mortality and survival in type 2 (non-insuline-dependent) diabetes mellitus. diabetologia, 123-131. Park, Y. J. (2005). Quantification of carnosine in humans plasma after dietary consumption of beef. J. Agric. Food Chem, 4736-4739. Penafiel R, R. C. (2004). Gender-related differences in carnosine. anserine and lysine content of marine skeletal muscle. Amino Acids. , 53-58. Petersen, K., & Shulman, G. (2006). Etiology of insulin resistance. American journal of medicine, 10S-16S. Quinn, P., Boldyrev, A., & Formazuyk, V. (1992). Carnosine - its properties, functions and potential therapeutic aplications. Molecular apsects of medicine, 379-444. Rosca, M., Mustata, T., Kinter, M., Ozdemir, A., Kern, T., Szweda, L., et al. (2005). Glycation of mitochondrial proteins from diabetic rat kidney is associated. Physiol Renal Physiol, 420 - 430. Sauerhöfer S., Y. G. (2007). L- Carnosine, a substrate of carnosinase-1 , influences glucose metabolisme. Diabetes, 2425-2432. Stampler JS, S. D. (1992). S-Nitrosylation of proteins with nitric oxide : Synthesis and characterization of biologically active compound. Journal of Pharmacology, 444-448. Sugita, H., Fujimoto, M., Yasukawa, T., Shimizu, N., Sugita, M., Yasuhara, S., et al. (2005). Inducible Nitric-oxide Synthase and NO Donor Induce Insulin Receptor Substrate-1

52


REFERENTIELIJST

Degradation in Skeletal Muscle Cells. The journal of biological chemistry, 14203– 14211. Tallon, M. H. (2005). The carnosine content of vastus lateralis is elevated in resistance-trained bodybuilders. J Strength Cond Res. , 725-729. Togashi, N., Ura, N., Higashiura, K., Murakami, H., & Shimamoto, K. (2000). The contribution of skeletal muscle tumor necrosis factor-a to insulin resistance and hypertension in fructose-fed rats. Journal of hypertension, 1605-1610. Vardarli, I. B. (2002). Gene for susceptibility to diabetic nephropathy in type 2 diabetes maps to 18q22.3-23. Kidney International, 2176-2183. Wei, Y., Chen, K., Whaley-Conell, A., Stum, C., Ibdah, J., & Sowers, J. (2008). Skeletal muscle insulin resistance: role of inflammatory cytokines and reactive oxygen species . AM J Physiol Regul Integr Comp Physiol, R673 - R680. Yasukawa, T., Tokunaga, E., Ota, H., Sugita, H., Martyn, J., & Kaneki , M. (2005). SNitrosylation-dependent inactivation of Akt/Protein kinase B in insulin resistance. The journal of biological chemistry, 7511-7518.

53


BIJLAGEN

6. BIJLAGEN

VOEDSEL Week 1 ……… Pre Kooi 1 Kooi 2 Kooi 3 Kooi 4 Kooi 5 Kooi 6 Kooi 7 Kooi 8 Kooi 9 Kooi 10 Kooi 11 Kooi 12 Kooi 13 Kooi 14 Kooi 15 Kooi 16 Kooi 17 Kooi 18 Kooi 19 Kooi 20

Post

Week 2 …..

Pre

Post

…. Pre

Post

Week 3 ….

Pre

Post

….. Pre

Post

Week 4 …..

Pre

Post

….. Pre

Post

….. Pre

Post


BIJLAGEN

DRANK Di

Wo

Do

Vr

Ma

Di

Wo

Do

6/jul

7/jul

8/jul

9/jul

12/jul

13/jul

14/jul

15/jul

Pre

Post

Pre-1d

Post

Pre-1d

Post

Pre-3d

Post

Pre-1d

Post

Pre-1d

Post

Pre-1d

Post

Pre-1d

Kooi 1 Kooi 2 Kooi 3 Kooi 4 Kooi 5 Kooi 6 Kooi 7 Kooi 8 Kooi 9 Kooi 10 Kooi 11 Kooi 12 Verantwoordelijke: Animalium

Verantwoordelijke: Animalium

Verantwoordelijke: Sanne Stegen


Verantwoordelijke: Sanne Stegen



Het effect van carnosine en β alanine supplementatie op de carnosine concentratie in de skeletspier en op de progressie van diabetes type II

Recommend Documents