Tudományos Diákköri Dolgozat
BÉRCES BIANKA
Ibuprofen rezolválása kristályosítási módszerekkel
Témavezető: Dr. Nemes Anikó Szerves kémiai Tanszék
Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2016
Köszönetnyilvánítás Szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Nemes Anikónak, aki lehetőséget biztosított egy érdeklődésemnek megfelelő témában való elmélyedésre. Hálásan köszönöm folyamatos útmutatását, tanácsait, figyelmét és a rengeteg időt, amit rám szánt. Köszönöm Dr. Rábai József szakmai segítségét, állandó biztatását, és a lelkesedést, amit keltett bennem a preparatív munka iránt. Hálásan köszönöm a családomnak és a barátaimnak, hogy mellettem álltak és támogattak.
2
Tartalom 1. Bevezetés ................................................................................................................................ 4 2. Irodalmi áttekintés .................................................................................................................. 5 2.1. Kiralitás ........................................................................................................................... 5 2.2. Optikailag tiszta enantiomerek leggyakoribb előállítási módszerei ................................ 6 2.3. Enantiomerek tisztaságának jellemzése .......................................................................... 8 2.4. Racém módosulatok ........................................................................................................ 8 2.5. Rezolválás kristályosítással ............................................................................................. 9 2.5.1. Spontán kristályosítás ............................................................................................... 9 2.5.2. Rezolváló ágens használatával ............................................................................... 10 2.6. Fázisdiagramok ............................................................................................................. 10 2.7. Az Ibuprofen ................................................................................................................. 11 3. Célkitűzések ......................................................................................................................... 11 4. Rezolválási kísérletek ........................................................................................................... 12 4.1. Oldhatósági próba ......................................................................................................... 12 4.2. Reakciók kis méretben .................................................................................................. 12 4.2.1. Rezolválószerek ..................................................................................................... 12 4.2.2. Eljárás ..................................................................................................................... 13 4.2.3. Bemérés .................................................................................................................. 14 4.2.4. Az R-Ibuprofen sója ............................................................................................... 14 4.2.4. Az S-Ibuprofen ....................................................................................................... 15 4.2.5. Következtetés ......................................................................................................... 15 4.3. Méretnövelési kísérletek ............................................................................................... 16 4.3.1 Első kísérlet ............................................................................................................. 16 4.3.1. Második kísérlet ..................................................................................................... 17 4.4. Enantiomerek tisztaságának vizsgálata ......................................................................... 18 4.4.1. Olvadáspont mérés ................................................................................................. 18 4.4.2. Optikai forgatás mérés ........................................................................................... 19 5. Összefoglalás ........................................................................................................................ 20 6. További tervek...................................................................................................................... 20 7. Irodalomjegyzék ................................................................................................................... 21
3
1. Bevezetés Az anyagi világban meglehetősen gyakori a kiralitás jelensége, melynek vizsgálata a preparatív kémiában rendkívül fontos. Ennek egyik legfőbb oka, hogy az általánosan használt gyógyszerhatóanyagaink jelentős része királis molekula, és az enantiomerek emberi szervezetre gyakorolt hatása meglehetősen különböző lehet. Ennek oka az, hogy az élő szervezetek enzimjei másként kezelik az enantiomereket. A királis felismerés mechanizmusát az 1. ábra szemlélteti.
1. ábra: a királis felismerés mechanizmusa
A modern idők egyik legnagyobb orvosi tragédiájaként említett eset szintén a kiralitáshoz kapcsolható. A Thalidomid forgalmazását 1957-ben kezdték Nyugat-Németországban, mint nyugtató, altató gyógyszer. A készítmény rendkívüli népszerűségre tett szert Európában. Sajnos hamarosan nem kívánt mellékhatásaira derült fény: a készítmény idegrendszeri romlást okozott a végtagokban, továbbá jelentősen nőtt a fejletlen kezekkel és lábakkal, valamint az ezek nélkül született gyermekek száma. A Thalidomidot racém formában lehetett kapni. Azóta tudjuk, hogy az R-Thalidomid nyugtató, az S-Thalidomid pedig teratogén, vagyis a magzatban fejlődési rendellenességet okoz. Próbálkoztak a hatóanyag rezolválásával, de mivel a májban található enzimek hatására az R-Thalidomid racemizálódik, ez nem jelentett megoldást. A tragédia után 1961-ben több országban, majd 1962-ben az egész világon betiltották a Thalidomidot. Mindez rávilágított az enantiomerek vizsgálatának fontosságára. A történtek után szigorították a gyógyszerek forgalomba hozását.
2. ábra: az R-Thalidomid (balra) és az S-Thalidomid (jobbra)
4
Munkám során egy széles körben elterjedt, nem szteroidos gyulladásgátló, az Ibuprofen rezolválási lehetőségeivel foglalkoztam. Az általánosságban forgalmazott készítmények a racém formát tartalmazzák. A kívánt hatást az S-Ibuprofennek köszönhetjük, az R-Ibuprofen e tulajdonság szempontjából inaktív, de az emberi szervezetet nem károsítja. A szervezetben az R-Ibuprofen is a gyulladásgátló S-Ibuprofenné alakul. Viszont hatékonyabb, gyorsabb hatás érhető el azonos mennyiségű, tiszta S-Ibuprofen bevitelével, ezért a gyógyszeriparban megjelent az igény azokra a technológiákra, melyekkel az S-Ibuprofen gazdaságosan elérhető.
3. ábra: Az az R- Ibuprofen (balra) és az S-Ibuprofen (jobbra)
2. Irodalmi áttekintés 2.1. Kiralitás A szerves kémiában akkor beszélünk izomériáról, ha több molekula azonos összegképlettel írható fel, de szerkezetük – és ebből adódóan fizikai és kémiai tulajdonságaik is – különböző. Ha az atomok kapcsolódási sorrendje vagy a kémiai kötések elrendeződése különbözik, akkor szerkezeti (vagy konstitúciós) izomereknek nevezzük őket. Amennyiben ezek egyeznek, a különbség csupán a térszerkezetben figyelhető meg, akkor sztereoizomereknek nevezzük őket. A sztereoizoméria egyik fajtája a kiralitás. A szó a görög „kéz” szóból ered, ami utal az izoméria jellegére. Az angol nyelvű irodalomban ma is találkozhatunk a „handedness” kifejezéssel is. A királis vegyületek fizikai és kémiai tulajdonságaik azonosak, az oldataik optikai forgatóképességet kivéve, melynek intenzitása azonos, iránya ellentétes. A királis vegyületekben általában található legalább egy kiralitáscentrum, ami a legtöbbször egy szénatom, más esetekben egy heteroatom. A királis szénatom esetében az atomhoz négy különböző atom vagy atomcsoport kapcsolódik. Ezek tetraéderesen helyezkednek el a királis szénatom körül úgy, hogy két azonos szerkezetű, de különböző térszerkezetű molekulát kapunk, amelyek egymással fedésbe nem hozhatóak. Ezeket enantiomereknek hívjuk.
5
A „handedness” elnevezés rendkívül találó, a kiralitás lényegét úgy érthetjük meg legkönnyebben, ha megnézzük a kezeinket. A jobb kezünk tükörképe a bal, és fordítva, de a kezeinket soha nem tudjuk egymással fedésbe hozni. Ezt szemlélteti a 4. ábra.
4. ábra: „handedness”
A kiralitást más néven optikai izomériának, az enantiomereket pedig optikai izomereknek is nevezzük. Az elnevezés abból ered, hogy a különböző enantiomerek oldata elforgatja a poláros fény síkját, méghozzá ellentétes irányba. Ezért az enantiomereket optikailag aktívak, a racém vegyületeket, amelyek a két enantiomert 1:1 arányban tartalmazzák, optikailag inaktívak. A királis vegyületek abszolút konfigurációjának leírására a Cahn-Ingold-Prelog (CIP) konvenciót használjuk, mely alapján egyértelműen megkülönböztethetjük az úgynevezett R és S enantiomereket. Az elnevezések a latin „rectus”, vagyis jobb és a „sinister”, vagyis bal szavakból erednek. A természetben nagy számban fordulnak elő királis vegyületek, mint például a cukrok és az aminosavak (5. ábra). Érdekes módon a természetben jellemzően az egyik enantiomer található meg, viszont a kémiai szintézisek során a szimmetrikus reakciókban racém vegyület képződik.
5. ábra: aminosavak általános képlete
2.2. Optikailag tiszta enantiomerek leggyakoribb előállítási módszerei A királis vegyületek szétválasztása nem egyszerű feladat, ugyanis az enantiomerek fizikai és kémiai tulajdonságaik – az optikai forgatás irányt kivéve – azonosak. A konstitúciós izomerek esetében alkalmazható frakcionált desztilláció vagy frakcionált kristályosítás enentiomereknél nem vezet eredményre. Tiszta enantiomerhez többféle módon juthatunk. Ezek közül a legrégebben alkalmazott módszer a rezolválás. Rezolválás alatt azoknak a folyamatoknak az összességét értjük, melyek
6
során egy optikailag inaktív, racém vegyületből optikailag aktív, nem 1:1 enantiomer-arányú vegyület keletkezik. A rezolválásra több ismert módszer létezik, ezek közül a kristályosítással történő rezolválással fogunk részletesebben foglalkozni. Lehetőség van az enantiomerek elválasztására folyadékkromatográfiás módszerrel is. Ehhez speciális oszlopokat használnak. Az enantiomerek diasztereomer-párokat képeznek az állófázissal, melyeknek különböző kötéserőssége fordítottan arányos az oszlopon való áthaladás sebességével. A folyadékkromatográfiás módszerek jól használhatóak elválasztásra, mégsem igazán elterjedtek. Nagyon jól alkalmazható kis mennyiségek esetén, de nagyobb tömegű, ipari méretekben történő előállítás esetén problémás, mivel az elválasztás viszonylag lassú, és a drága berendezés, valamint az elhasználódó oszlopok miatt nem is igazán költséghatékony. Manapság a legnépszerűbbek a különböző biokémiai eljárások. Ezeket logikailag két csoportra oszthatjuk. Ez egyik esetében a kívánt enantiomert állítják elő megfelelően kiválasztott, sztereospecifikus enzimmel. A másik módszerrel pedig a már előállított racém vegyület nem kívánt enantiomerét bontják el egy alkalmas mikroorganizmussal. A biokémiai eljárások azért népszerűek az iparban, mert a folyamatuk egyszerű, kevésbé költséges, nem jellemzőek a szélsőséges reakciókörülmények, mint például erősen savas vagy lúgos közeg, magas hőmérséklet vagy nyomás. Az iparban tiszta enantiomerek előállítására általában biokémiai módszereket használnak, amennyiben erre van lehetőség. Ha az előállítani kívánt enantiomerhez nem áll rendelkezésre megfelelő enzim, vagy a folyamat nem oldható meg gazdaságosan, akkor jellemzően rezolválással dolgoznak. A rezolválás előnyei a biokémiai eljárásokhoz képest, hogy annál szélesebb körben alkalmazható, lehetőség van szélsőségesebb reakciókörülmények használatára is, dolgozhatunk tömény oldatokkal, amelynek a nagyméretű termelés során nagy előnyei vannak. Adott mennyiségű királis vegyület rezolváláshoz így lényegesen kevesebb oldószerre lehet szükség, ami csökkenti a költséget, valamint a munkát és a szükséges berendezéseket is tovább egyszerűsíti, ha kisebb térfogatú oldatokkal dolgozhatunk. Rezolválás esetén mindkét enantiomert kinyerhetjük, esetenként a nem kívánt enantiomert racemizálva újra felhasználhatjuk. Ez lényeges előny a biokémiai eljárások képest, ahol mindig csak az egyik enantiomerhez juthatunk hozzá. A rezolválás hátrányának tekinthető, hogy a hatékonyan használható rezolválószerek többsége erősen mérgező, használatukat munkavédelmi előírások szigorítják.
7
2.3. Enantiomerek tisztaságának jellemzése Az enantiomerek tisztaságának jellemzésére két általánosan használt fogalom létezik, melyeket gyakran összekevernek: az enantiomer tisztaság (ep, mint enantiomer purity) és az enantiomer felesleg (ee, mint enantiomer excess). Az enantiomer tisztaság egy százalékos érték, mely megmutatja, hogy az adott enantiomer hány százalékát teszi a teljes anyagnak. A következő képletekben R és S a megfelelő enantiomer arányát jelöli. 𝑒𝑝 (%) =
𝑅 𝑅+𝑆
∙ 100 vagy 𝐸𝑃 (%) =
𝑆 𝑅+𝑆
∙ 100
Az enantiomer felesleg azt fejezi ki, hogy az anyagunkban mennyivel van több az egyik enantiomerből. 𝑒𝑒 (%) =
𝑅−𝑆
∙ 100 vagy 𝐸𝐸 (%) = 𝑅+𝑆
𝑆−𝑅 𝑅+𝑆
∙ 100
A gyakorlatban inkább az ee értékét adják meg, mivel ez enantiomer felesleg értéke az, ami kapcsolatban áll az optikai forgatással. Ugyanis sem az EP, sem az ee értéke nem mérhető közvetlenül. Meghatározható viszont mágneses magrezonancia (NMR) módszerek segítségével a két enantiomer aránya, amelyből a fenti értékek számíthatóak. Mérhető továbbá királis kromatográfiás módszerekkel, mint például gázkromatográfia (GC), nagy teljesítményű folyadék-kromatográfia (HPLC) vagy kapilláris elektroforézis (CE), de a legpontosabb, leggyorsabb, és a legáltalánosabban használt módszer az NMR. Az optika izomerek jellemző tulajdonsága az optikai forgatóképesség, amely oldatukból közvetlenül mérhető. A tiszta anyagok esetében a fajlagos optikai forgatóképesség jellemző tulajdonság, amit a hullámhossz, a hőmérséklet, az oldószer és a koncentráció függvényében adunk meg. A fajlagos optikai forgatás mérésével határozzuk meg az optikai tisztaságot (op, mint optical purity), amely az ismeretlen összetételű minta fajlagos forgatóképeségéből ([𝛼]𝑡𝑚é𝑟𝑡 ) és az azonos körülmények között mért tiszta enantiomer fajlagos forgatóképességéből ([𝛼]𝑡𝑚𝑎𝑥 ) képzett százalékos érték. 𝑜𝑝 (%) =
[𝛼]𝑡𝑚é𝑟𝑡 ∙ 100 [𝛼]𝑡𝑚𝑎𝑥
2.4. Racém módosulatok A racém vegyületeknek különböző megjelenési formái léteznek, melyek meghatározzák a rezolválási lehetőségeiket. A formák a következők lehetnek: konglomerátum, racemát, izomorf elegykristály.
8
A konglomerátumok esetében az enantiomerek egymástól függetlenül, külön kristályokat alkotva kristályosodnak ki. Kellően fejlett kristályok esetén az enantiomerek hemiéderes (vagyis feles lapszámú) kristályai elválaszthatók egymástól egyszerű szétválogatással. Viszont ilyen kristályok ritka esetekben, szigorú körülmények között kristályosodnak csak. Továbbá a válogatás időigényessége miatt a módszer ipari méretben egyáltalán nem használható. Egy példa konglomerátumra a 6. ábrán látható kálium-hidrogén-tartarát kristályai.
6. ábra: Kálium-hidrogén-tartarát kristályok
A racemátok az enantiomerek 1:1 arányú keverékei, megyek molekuláris szintű vegyületek. Kristályszerkezetük egységes, holoéderes (teljes lapszámú), a konglomerátumok esetében alkalmazott módszerek itt nem használhatóak. Egy ilyen módosulat rezolválásával foglalkozom. A harmadik módosulat az úgynevezett izomorf elegykristály, amely esetén a két az enantiomerek egymás kristályát növelik tovább, változatos arányokat mutatva. Erre a módosulatra kevés példát ismerünk, a későbbiekben erre nem fogok kitérni.
2.5. Rezolválás kristályosítással 2.5.1. Spontán kristályosítás Konglomerátumok esetén rezolválószerre, (más néven rezolváló ágensre) nincs szükség, a kristályosítás során a rezolválás spontán indul. A spontán kristályosításra példa a történelem első rezolválása, Pasteur kísérlete, amely során elválasztotta a szőlősav enantimerjeit, és kimérte, hogy az enantiomerek oldata forgatja az a poláros fény síkját, méghozzá azonos mértékben, és ellenkező irányba. Ezzel szemben a racém forma optikailag inaktív. A racém elnevezés is tőle származik, a latin „racemus”, vagyis szőlő szóból eredően.
9
2.5.2. Rezolváló ágens használatával [1] A módszer lényege a racém vegyület rezolválása diasztereomer vegyületpár képzésével. Általánosságban a racém vegyületet egy megfelelő rezolválószer és oldószer használatával kristályosítjuk át. Az alkalmas rezolválószer – szintén optikailag aktív anyag – a királis vegyülettel diasztereomer sót képez. A különböző enantiomerekkel képzett sók fizikai és kémiai tulajdonságaik már eltérőek, elérő oldhatóságuk alapján szétválaszhatóak. A frakcionált kristályosítás szükséges feltétele, hogy a sók kristályosodjanak, ráadásul különböző körülmények között. [2, 3, 4, 5] Általában az előzőekben leírtak szerint, ekvivalens mennyiségű rezolválóágenssel rezolválnak. Viszont lehetőség van félekvivalens mennyiség használatára is. Ebben az esetben a rezolválószer az egyik enantiomerrel alkot sót, ami kiválik az oldatból, a másik enaniomert pedig egy a rezolválószerrel azonos kémiai karakterű akirális vegyülettel tartjuk oldatban, majd a csapadék eltávolítása után ezt is kicsapjuk. Ekkor a termelés a rosszabbul oldódó só oldhatóságától, az optikai tisztaság pedig a két só oldhatóságának arányától függ. Az akirális reagenssel képződött só lényegesen jobban oldódik, mint a rezolválószerrel alkotott só, így egyrészt nagyobb optikai tisztaságot érhetünk el, mint ekvivelens mennyiségű rezolválóágens használatával, ráadásul töményebb oldatokkal is dolgozhatunk. Továbbá ilyenkor az anyalúgban maradó enantiomer a pH változtatásával leválasztható az oldatból, nem kell a szerves sóból felszabadítani. A felhasznált akirális vegyület jellemzően sósav vagy nátriumhidroxid, esetleg ammónium-hidroxid, attól függően, milyen karakterű molekula szükséges a reakcióhoz. [6] A sikeres rezolválás tekintetében fontos, hogy a rezolválószer és a racém anyag oldatban legyenek. A kikristályosodott sóban az egyik enantiomer dúsul, de a másik is jelen van szennyezőként, míg az oldatban is megfigyelhető ugyanez. Ezzel a módszerrel nem várhatunk tökéletes elválasztást, a kitermelés ritkán éri el a 90%-ot.
2.6. Fázisdiagramok Amennyiben rendelkezésünkre áll a két enantiomer tiszta állapotban, és megmérjük a különböző arányú keverékek olvadáspontját, elkészíthetjük a keverék fázisdiagramját. Mindez az eutektikus pont meghatározása miatt lényeges. Ehhez a ponthoz tartozó összetétel kulcsfontosságú. Ha bármilyen módszerrel el tudjuk érni, hogy az racém vegyületünkben az enantiomerek arányát legalább ennyire eltoljuk, akkor utána a tisztítás egyszerűen ismételt átkristályosítással folytatható. [7]
10
Az enantiomerek fázisdiagramját a 7. ábra szemlélteti.
7. ábra: Fázisdiagram
2.7. Az Ibuprofen Az Ibuprofen nemzetközi szabadnévvel rendelkező hatóanyag egy propionsavszármazék, a Magyar Gyógyszerkönyvben Ibuprofenumként hivatkoznak rá. Egy úgynevezett nemszteroidos gyulladásgátló (NSAID, vagyis Non Steoridal Anti-Inflammatory Drug), ami azt jelenti, hogy nem szteránvázas, hatása a szteroid hormonok receptoraitól független. Az Ibuprofen gyulladásgátló, fájdalomcsillapító és lázcsillapító hatású, melyet különböző gyógyszerek hatóanyagaként az egész világon használnak.
8. ábra: Az az R- Ibuprofen (balra) és az S-Ibuprofen (jobbra)
Az Ibuprofen, vagyis IUPAC nevén az (RS)-2-[4-(2-metilprofil)fenil]propánsav egy királis vegyület. Az R-Ibuprofen a szervezetben inaktív, de máj enzimei hatására S-Ibuprofenné alakul, aminek gyulladáscsökkentő hatás köszönhető. A tiszta formában forgalmazott SIbuprofen egyre nagyobb százalékban váltja fel a racém formát a kereskedelemben. Az S-Ibuprofen olvadáspontja 53°C, forgatása fajlagos forgatása a D vonal közelében 2 vegyesszázalékos etanol oldatban +59°. Ezeket ez értékeket fogom felhasználni a rezolválások sikerességének becsléséhez. Eutektikus összetétel: 66%. [8]
3. Célkitűzések Munkám során Ibuprofent fogok rezolválni kristályosításos módszerrel. Először több kiválasztott rezolválószerel kisebb méretben dolgozom. Az R-Ibuprofent só formájában eltávolítom, majd az S-Ibuprofent kisavanyítom az oldatból. A só és az S-Ibuprofen optikai forgatását, valamint olvadáspontját egyaránt mérem.
11
Az eredmények ismeretében a legsikeresebbnek bizonyuló kísérletet nagyobb méretben megismétlem. Reményeim szerint sikerül olyan enantiomer felesleget elérnem, ahonnan az SIbuprofen már egyéb anyag hozzáadása nélkül, átkristályossal tisztítható. Ezen a ponton az átkristályosítást addig ismétlem, amíg észlelhető lesz az optikai forgatás és az olvadáspont változása. Ezek alapján levonom a következtetést az említett feltevés sikerességéről.
4. Rezolválási kísérletek 4.1. Oldhatósági próba A munkát az oldószer kiválasztásával kezdtem. Mivel savas karakterű molekuláról van szó, lúgos kémhatású oldatban gondolkoztam. Első lépésként az ibuprofen vízben való oldhatóságát próbáltam meghatározni. Az Ibuprofen szobahőmérsékleten 0,1 M koncentrációban nem oldódik, azonban hőlégfúvóval melegítve feloldódik. Amint az oldat hűlni kezdett, azonnal elkezdett kiváltni. A rezolválás sikerességéhez mindenképpen oldott formában lenne rá szükségem, ezért lúgos oldatokkal próbálkoztam tovább. Készítettem 0,1M koncentrációjú NaOH és KOH oldatokat, és ekvivalens mennyiségű Ibuprofent próbáltam feloldani bennük. Az oldás szintén nehézkes volt, de rázogatás és melegítés hatására mindig sikerült feloldani. Az NaOH oldatban valamivel gyorsabb volt az oldódás, így oldószernek a 0,1M koncentrációjú NaOH oldatot választottam.
4.2. Reakciók kis méretben 4.2.1. Rezolválószerek Témavezetőmmel közösen kiválasztottunk hét rezolválószert, melyeket a szerkezeti sajátosságok és az irodalmi adatok alapján az Ibuprofen rezolválására alkalmasak lehetnek. Mivel az Ibuprofen savas karakterű, mindenképpen a bázikus rezolválószerek közül választottunk. Az általam kiválasztottak a természetben is előforduló anyagok, mindkét enantiomerük olcsón elérhető 100% ee-vel. Ezek a következők: cinkonin, cinkonidin, kinin, kinidin, sztrichnin, optochin, brucin. Mivel vizes közegben dolgozunk, ezeknek különböző sóit használtuk a rezolváláshoz a jobb oldódás érdekében. A sók a következők voltak: cinkonin-hidroklorid, cinkonidin-szulfát, kinin-szulfát, kinidin-szulfát, sztrichnin-nitrát, optochin-hidroklorid, brucin-szulfát. A rezolválószerek szerkezeti képlete a 9. ábrán látható.
12
N HO R R
R N
O
HO
N
N
R N
N
O sztrichnin R = H brucin R = OCH3
cinkonidin R = H kinin R = OCH3 optochin R = OCH 2CH3
cinckonin R = H kinidin R = OCH3
9. ábra: Rezolválószerek
4.2.2. Eljárás Analitikai mérlegen bemértem 0,2g (1,0 mmol) Ibuprofent, amit 97 ml [9,7 mmol] 0,1M koncentrációjú NaOH oldatban oldottam egy 250ml-es, csiszolatos gömblombikban rázogatva. Ezek után félekvivalens mennyiségű rezolválószert adtam hozzá, majd vízfürdőre tettem egy léghűtővel. A vízfürdő fűtését 2 óra elteltével kapcsoltam le, majd hagytam az anyaggal együtt lassan lehűlni. A teljes lehűlést követően levettem a már szobahőmérsékletű vízfürdőről. Ekkorra minden esetben fehér csapadék vált le, feltehetően az R-Ibuprofen rezolválószerrel alkotott csapadéka. A csapadékot üvegszűrőn leszűrtem, anyalúggal két-háromszor mostam, majd vákuumos száríróba tettem P2O5-n száradni. Az anyalúgot tömény HCl-oldat hozzácsepegtetésével 2-es pH-júra savanyítottam. Ekkor mikroszemcsés csapadék vált le, az oldat tejszerűvé vált. Kezdetben az oldatokat jégen megkapartam, de beláttam, hogy hatékonyabb félretenni pár napra, mert a szemcseméret állás közben szűrhető méretűre növekedett. Ez alól egy kivétel volt, az optochin-hidroklorid használata mellett ezen a ponton egy hét állás után sem volt megfelelő méretű a csapadék. Ezután jéggel hosszasan hűtöttem, többször kapargattam, így körülbelül három óta után lett szűrhető a csapadékom. A kivált anyag tartalmazott egy fél cukorborsónyi, félgömb alakú sárga színű anyagot, ami megszilárdult olvadékra hasonlított, széttörni nem sikerült. A kisavanyított enantiomert, ami feltehetőelg az S-Ibuprofen, szintén leszűrtem, anyalúggal két-háromszor mostam, majd vákuumos szárítóba tettem P2O5-n száradni. A száraz R-Ibuprofen sókat és az S-Ibuprofen optikai forgatását mértem a rezolválás sikerességének vizsgálatához.
13
4.2.3. Bemérés A kísérletek során a bemért tömegeket az 1. táblázat foglalja össze. A bemérés során törekedtem rá, hogy minél pontosabban mérjem be a számított értéket. rezolválószer
rezolválószer (g)
cinkonin-hidroklorid cinkonidin-szulfát kinin-szulfát kinidin-szulfát sztrichnin-nitrát optochin-hidroklorid brucin-szulfát
0,1606 0,1756 0,1902 0,1900 0,1927 0,1829 0,2459
racém ibuprofen (g) 0,2000 0,2000 0,2000 0,2000 0,2000 0,2003 0,2000
1. táblázat: a bemért tömegek
A rezolválószer bemérését úgy számoltam ki, hogy a bemért racém Ibuprofenre nézve félekvivalens mennyiségű legyen. Az 1. táblázat nem a számított, hanem a valós beméréseket tartalmazza.
4.2.4. Az R-Ibuprofen sója Mind a hét rezolválási kísérlet során sikerült leválasztani az Ibuprofen a rezolváló ágenssel képzeld sóját. Minden só fehér színű volt. A sók adatait a 2. táblázatban foglaltam össze. rezolválószer
tömeg (g)
cinkonin-hidroklorid cinkonidin-szulfát kinin-szulfát kinidin-szulfát sztrichnin-nitrát optochin-hidroklorid brucin-szulfát
termelés (%)
0,112 0,128 0,124 0,142 0,133 0,148 0,078
43,0 46,5 42,7 49,0 45,4 52,3 22,6
optikai forgatás olvadáspont 546 nm-en (°) (°C) (+)152 230-257 (-)68 178-190 (-)98 167-171 (+)72 165-169 (-)170 * (-)68 * (-)155 166-173
2. táblázat: Az R-Ibuprofen sójának adatai
A 2. táblázatban közölt kitermelést a bemért rezolválószerre és a racém Ibuprofen mennyiségének a felére számoltam. Az Ibuprofen sztrichnin sójának mérésekor az anyag a mérhető tartományban (260°C-ig) nem olvadt meg, viszont elkezdett bomlani, láthatóan megbarnult. Az Ibuprofen optochin sójának mérése közben azt figyeltem meg, hogy az anyag nagyrésze megolvadt 115-125°C között, de a cseppekben jól látszott, hogy tartalmaz még szilárd anyagot. Tovább melegítettem 200°C-ig, de akkor sem lett teljesen folyékony halmazállapotú, és elkezdett bomlani, jól láthatóan barnult ez a só is.
14
4.2.4. Az S-Ibuprofen Szintén mind a hét esetben sikerült leválasztani és leszűrni a sóképzés után oldatban maradt S-Ibuprofent. Az így kapott anyagok adatait a 3. táblázatban foglaltam össze. rezolválószer cinkonin-hidroklorid cinkonidin-szulfát kinin-szulfát kinidin-szulfát sztrichnin-nitrát optochin-hidroklorid brucin-szulfát
tömeg (g) 0,183 0,165 0,173 0,175 0,187 0,186 0,174
termelés optikai forgatás olvadáspont (%) 546 nm-en (˚) (°C) 183 0 70-73 165 0 71-72 86,5 (+)6,67 62-66 87,5 (+)1,64 65-69 194 (-)5,00 66-69 203 (-)4,88 67-69 174 (+)37,1 63-69
3. táblázat: Az S-Ibuprofen adatai
A 3. táblázatban közölt kitermelést a racém Ibuprofen mennyiségének a felére számoltam.
4.2.5. Következtetés A kristályosodás az optochin esetét leszámítva rendben ment, de abban is esetben is sikerült kikristályosítani a sót, illetve az Ibuprofent. A cinkonin-hidroklorid és a cinkonidin-szulfát használata mellett a kisavanyított Ibuprofen egyáltalán nem mutatott optikai forgatást, és ezek esetén volt az olvadáspont a legtávolabb az irodalmi értékről. Ezek alapján ezeket a rezolválószereket nagyobb méretben nem használom. A sztrichnin-nitrátot és az optochin-hidrokloridot azért zártam ki, mert az S-Ibuprofen pozitív irányba forgatja a poláris fényt, ezek esetén pedig a sóra és a kisavanyított ibuprofenre egyaránt negatív értéket mértem. Mivel a kitermelés mindkét esetben közel 200% volt a kisavanyított sóra, ezért elképzelhetőnek tartom, hogy a rezolválószer maradéka is kivált, és annak köszönhető a negatív irányú forgatás. A kinidin-szulfát esetén a só és a kisavanyított Ibuprofen is pozitív irányba forgatott. De mivel nagyon keveset forgatott, kételkedtem benne, hogy ez az összetétel elérte az eutektikus pontot. Ráadásul olvadáspont alapján is volt nála jobb, így ezt a rezolválószert sem használtam később. A legsikeresebbnek a kinin-szulfáttal és a brucin-szulfáttal végzett rezolválási kísérleteket értékeltem. A só negatív, a kisavanyított Ibuprofen pozitív irányba forgatott mindkét esetben. A legalacsonyabb olvadáspontokat is ezekben az esetekben mértem. A kinin-szulfát esetében bár kisebb volt a forgatás csak körülbelül ötöde volt a brucin-szulfáttal tapasztaltnak, itt a kitermelés 100% alatti érték volt. Mivel a mért vegyületek egyformán jól meg voltak szárítva,
15
arra következtetek, hogy itt nagyobb valószínűsége annak, hogy nem vált ki más anyag az Ibuprofenen kívül. Mivel a brucin-szulfáttal történő rezolválás esetében lényegesen nagyobb forgatást mértem, mégis ezzel kezdtem meg a nagyobb méretben történő rezolválást. Mivel úgy vettem észre, hogy mindegyik esetben eléggé kis kitermeléssel sikerült a rezolválás, felmerült bennem, hogy az általam alkalmazott oldószer mennyisége túl sok, ezért a későbbiekben ennek arányát lecsökkentettem.
4.3. Méretnövelési kísérletek A kisebb méretű, 0,2g racém Ibuprofenből kiinduló rezolválásokat egyfajta próbának szántam az anyagköltségek minimalizálása érdekében. A második tisztítási lépésnek tervezett átkristályosítást ilyen mennyiségű termékeknél problémás megoldani, és mivel ezt sokszor (akár 20-szor) terveztem ismételni, ezért ehhez mindenképpen több anyag szükséges.
4.3.1 Első kísérlet A bemérést 2,5g Ibuprofenre számítottam. Egy 250ml-es, csiszolatos gömblombikba bemértem 2,5007g [12,14 mmol] racém Ibuprofent, amit ekvivalens mennyiségű [121,4ml] 0,1M-os NaOH oldatban próbáltam feloldani. Ez szobahőmérsékleten nem sikerült teljes mértékben. Vízfürdőn kevertetve, léghűtőt alkalmazva az összes anyagot sikerült feloldani. A teljes feloldódás után fél ekvivalens mennyiségégű, 3,0791g [3,03mmol] brucin-szulfátot adtam hozzá, ami kevertetve szintén feloldódott. Két órán át vízfürdőn hagytam, majd a vízfürdővel együtt hagytam lassan lehűlni másnapig. Sajnos a hűlés után nem kristályosodott, méz állagú olajos csapadék volt a lombik alján. Sem a jégen kaparás, sem a többnapos állás nem volt eredményes. Próbáltam visszaoldani, majd gyorsan, jéggel hűteni, de az eredmény szintén olajos csapadék volt. Ekkor az olajos csapadékból kivettem egy keveset üvegbottal egy óraüvegre, majd ott kapargattuk. Ekkor mintha elkezdett volna kristályosodni, ezért leöntöttem az oldatot a csapadékról, hátha ez megindítja a kristályosodást. Hagytam így állni napokig, de nem kristályosodott. Ezután jégen megkapartam, majd újra állni hagytam, de ez sem indította meg a kristályosodást. Ezen a ponton úgy döntöttem, hogy máshogy próbálom kinyerni az enantiomereket. Az olajos csapadékhoz két ekvivalens mennyiségű [24,34ml] 1,0M NaOH oldatot adtam, ekkor túrós jellegű csapadékot kaptam. Adtam hozzá 25 ml diklórmetánt (DCM) és még kevés vizet [10,0ml] adtam hozzá. Ekkor mindent fel tudtam oldani, és extraháltam az anyagot. Az extrahálást még kétszer 25ml DCM-mel megisméterltem, a szerves fázisokat egyesítettem. A szerves fázist félretettem. A vizes fázist 15 percre a rotációs vákuumbepárlóra
16
tettem, ahol szobahőmérsékleten eltávolítottam a beoldódott DCM nagy részét, mivel az a későbbi kristályosodást akadályozhatja. Tömény HCl-oldattam mindegyik fázis 2-es pH-júra savanyítottam, ekkor mikroszemcsés csapadék vált le, az oldatok tejszerűek lettek. Ekkor állni hagytam őket 3 napig a szemcseméret növekedése céljából, ami eddig jól működő módszernek bizonyult a kisméretű reakcióknál. Viszont ebben az esetben 3 nap múlva a lombik alján ismét mézszerű, olajos csapadékot találtam. A DCM-es fázis ekkor háromszor 30ml, a vizes fázist háromszor 10ml dietil-éterrel extraháltam. Az éteres fázisokat vízmentes Na2SO4-en tettem el szárítás céljából. A száraz, éteres fázisokat egy-egy csiszolatos gömblombikba szűrtem, majd rotációs vákuumbepárló segítségével bepároltam. Ekkor ismét olajos jellegű anyagok maradt a lombik alján. Mindkettőt jégen megkapartam, ekkor elkezdtek kristályosodni. A kikristályosodott fehér anyagokat (vélhetően az Ibuprofen két enantiomerjét) leszűrtem és vákuumos szárítóba tettem P2O5-on száradni. A száradás után elvégeztem a méréseket. A DCM-es fázisból kinyert Ibuprofen termelése 93,4%, a vizes fázisból kinyerté 69,7% volt. Mindkettő 72-74°C-on olvadt, és egyik sem mutatott optikai forgatást. Vagyis a rezolválás ilyen módon sikertelenül végződött. A rezolválási próbák sikere után meglepő volt az első kísérlet sikertelensége, legalábbis ami a kristályosodás megindulását. Ennek egyik lehetséges okának a laborhőmérséklet erős eltérését tartottam. A preparatív labor, ahol a munkámat végeztem, nem légkondícionált. A próbákat februárban és márciusban végeztem, az első kísérletet augusztusban. A két kísérlet körülményei nagyjából 15°C-kal eltértek, ami okozhatott jelentős eltérést a kristályosodás módjában. Azt feltételezem továbbá, hogy az ilyen módon történő rezolválás sikerességéhez szükséges a kristályosodás.
4.3.1. Második kísérlet Októberben újra megpróbáltam a még rendelkezésre álló racém Ibuprofen rezolválását, remélve, hogy az ismét hűvösebb laboratóriumban a megindul a kristályosodás. A termelést 1,73g Ibuprofenre számoltam. Az eljárás során egy 250ml-es, csiszolatos gömblombikba bemértem 1,7301g [8,4mmol] racém Ibuprofent. Ekvivalens mennyiségű 0,1M koncentrációjú NaOH oldatban próbáltam feloldani, de ez szobahőmérsékleten nem sikerült maradéktalanul. Vízfürdőn, léghűtővel ellátva, kevertetés közben sikerült teljesen feloldani. Ekkor hozzáadtam fél ekvivalens
17
mennyiségű, 2,1265g brucin-szulfátot, ami szintén feloldódott. Két órán át kevertettem vízfürdőn, majd a vízfürdővel együtt hagytam lehűlni. A hűlés után ebben az esetben is olajos csapadék jelent meg. 100ml víz hozzáadása után újraforraltam, majd jéggel hűtöttem, de újra olajos csapadék vált le. Mivel a korábban sikeresen végrehajtott próbák esetén az oldószer mennyisége, ezzel együtt a NaOH aránya az Ibuprofenéhez képest lényegesen nagyobb volt, ezért az oldatot tízszeresére lúgosítottam és felforraltam. Ahogy hűlt, azonnal látható volt a kristályosodás megindulása. Hagytam lassan, szobahőmérsékleten kristályosodni. A kivált dús, szálas, fehér csapadékot leszűrtem, és vákuumos szárítóba tettem P2O5-on száradni. Az oldatot tömény HCl-oldattal 2-es pH-júra savanyítottam, ekkor mikroszemcsés csapadék vált le, az oldat leginkább a felvert tojásra hasonlított. Ezt állni hagytam a szemcseméret szűrhetőre növekedése céljából. Pár nap múlva szűrtem ki a homokszínű csapadékot a meggypiros oldatból. Ezt a csapadékot is hagytam pár napig P2O5-on száradni vákuumos szárítóban, majd utána elvégeztem a méréseket. A só esetében a termelés 155,26%, a kisavanyított Ibuprofen esetében 182,08% volt. A só 115-123°C-on nagyrészt megolvadt, de a cseppekben látszott még kevés szilárd anyag. Melegítettem tovább, majd az anyag 140°C-on újra teljes mértékben kristályos lett, apróbb, szabályosabb kristályokat alkotva. Ezután 168-170°C-on újra megolvadt, de a cseppekben ismét jól látszódott némi szilárd anyag. Ez nem olvadt meg, 200°C-on elbomlott, miközben a mért anyag megbarnult. A só optikai forgatása 546nm-en -120° volt, viszont a kisavanyított Ibuprofen nem mutatott optikai forgatást.
4.4. Enantiomerek tisztaságának vizsgálata A rezolválások során a sóként kicsapott R-Ibiprofent só formájában mértem. Az enantiomereket, illetve a sóikat optika forgatásméréssel és olvadáspont méréssel vizsgáltam.
4.4.1. Olvadáspont mérés A méréseket Boetius olvadáspontmérő készülékkel végeztem, a mért értékeket nem korrigáltam. A minta kis részletét két különböző méretű üveglap közé tettem, és az üveglapok összenyomásával és finom dörzsölésével próbáltam vékonyabb réteget képezni. Ez egy fűthető lapra került, melynek közepén egy kis résen fényforrás világított át. A minta a fényforrás fölé került, és egy megfelelő eszközzel mozgatható volt. A fűtőlap melegedésének
18
sebességét állítani lehetett. Az olvadást egy mikroszkópon keresztül figyeltem. A készülékbe több hőmérőt is be lehetett illeszteni, én egy 260°C-ig mérőt választottam, ami az összes méréshez megfelelőnek bizonyult. Az olvadás kezdő- és végpontját, valamint az esetleges speciális jelenségeket egyaránt feljegyeztem. A sók esetén a mérés tájékozódó jellegű volt. A kisavanyított Ibuprofen esetén az irodalmi adathoz viszonyítottam a mért értéket az enantiomer felesleg becsléséhez.
4.4.2. Optikai forgatás mérés A mérésekhez a sók körülbelül, de pontosan bemért 12mg-ját mérőlombikban oldottam 2ml DMF-ben. A kisavanyított Ibuprofen esetén 10mg-ot oldottam 2ml metanolban. Az oldatokkal egy-egy speciális kialakítású küvettát töltöttem meg, ezek kerültek egyesével a polariméterbe. Az általam használt polariméterben a fényforrás egy higanylámpa volt. Ennek fénye halad át egy polárszűrőn, amin át a polarizált komponens áthalad a mintán, majd onnan egy újabb polárszűrőre jut. Gyakorlatilag azt mérjük, hogy a második polárszűrőt mennyivel kell elforgatni ahhoz, hogy a fény a detektorba jusson, ugyanis pontosan ennyivel forgatta el a minta a polarizált. A mérés függ az oldószertől, a hőmérséklettől és a hullámhossztól. Az általam megadott értékeket 546 nm-en adtam meg, mivel ezen a hullámhosszon az összes mintám mérhető volt az általam használt készülékkel, és ez aránylag közel van az irodalomban általánosan megjelölt hullámhosszhoz, a nátrium D-vonalának megfelelő hullámhosszhoz (589 nm). A méréseket egy Zeiss, Jena, Polamat A típúsú készülékkel végeztem. A mérés során az elforgatás szögét mértem, melyből a fajlagos forgatást a következő képlettel számoltam: [𝛼]𝑇𝜆 =
𝛼∙𝑙∙𝑉 𝑚
Ahol [𝛼]𝑇𝜆 a fajlagos optikai forgatóképesség megadott hőmérsékleten és hullámhosszon, 𝛼 az elforgatás szöge, l fény útjának hossza a mintában (1dm), vagyis a küvetta hossza, V a méréshez készült oldat térfogata (2ml), és m az oldatkészítéshez bemért anyag tömege g-ban.
19
5. Összefoglalás Munkám során egy nagy gyógyszeripari jelentőségű nem-szteroidos gyulladáscsökkentő, az Ibuprofen rezolválásával foglalkoztam. Az Ibuprofen aktív enantiomerjét, az S-Ibuprofent kristályosításos módszerrekkel próbáltam kinyerni. Célom az volt, hogy kisméretű rezolválások során találjak olyan rezolválószert, amellyel az Ibuprofen enantiomer-arányát el tudjam tolni az eutektikus ponton túlra, majd a kiválasztott rezolválás nagyobb méretben történő megismétlése után a már nem racém enantiomer-elegyet segédanyagok hozzáadása nélkül, kristályosítással tisztítsam tovább, így közel 100%-os tisztaságú S-Ibuprofenhez jussak. A munka kezdetén kiválasztottam hét rezolválószert és egy megfelelő oldószert. A megfelelőnek tartott rezolválószerek hatékonyságát a racém Ibuprofennel kisméretű reakciók során teszteltem. Az R-Ibuprofent só formájában eltávolítottam, majd az S-Ibuprofent kisavanyítottam az oldatból. Az R-Ibuprofen sójának és az S-Ibuprofen optikai forgatását, valamint olvadáspontját egyaránt mértem minden reakció esetében. A kivált anyagok enantiomer-arányára a mért olvadáspont és az optikai forgatás értékekből következtettem. A kisméretű rezolválások során alapvetően két rezolválószert találtam arra alkalmasnak, hogy segítségével elérhessem az eutektikus ponthoz tartozó enantiomer-arányt. Ezek közül az egyikkel, brucin-szulfáttal elvégeztem két nagyobb méretű rezolválást. Nagyobb méretben nem sikerültek a rezolválások. Ezekben az esetekben máshogy kristályosodtak az anyagok, és bár mindegyik esetben sikerült kinyerni az Iburofent, az enantiomerek elválasztása sikertelen volt.
6. További tervek A továbbiakban teszek még egy kísérletet nagyméretű kristályosításra a másik rezolválószerrel, ami a próbák során alkalmasnak mutatkozott, a Kinin-szulfáttal. Tervezem továbbá az Ibuprofen rezolválását más rezolválási módszerrekkel is.
20
7. Irodalomjegyzék [1] J. Jaques, A. Collet, S. H. Wilen, Enantiomers, Racemates, and Resolutions, Wiley, New York, 1981. [2] D. Kozma (Ed.), CRC Handbook of Optical Resolutions via Diastereomeric Salt Formation, CRC Press, Boca Raton, 2000. [3] K. Kinbara, K. Sakai, Y. Hashimoto, H. Nohira, K. Saigo, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1996, 2615. [4] K. Kinbara, Y. Kobayashi, K. Saigo, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1998, 1767. [5] S. Larsen, D. Kozma, M. Ács, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1994, 1091. [6] D. Szabó, A. Nemes, I. Kövesdi, V. Farkas, M. Hollósi, J. Rábai, J. Fluorine Chem., 2006, 127, 1405. [7] F. Faigl, E. Fogassy, M. Nógrádi, E. Pálovics, J. Schindler, Tetrahedron Asy., 2008, 19, 519-536. [8] E. J. Ebbers, B. J. M. Plum, G. J. A. Ariaans, B. Kaptein, Q. B. Broxterman, A. Bruggink, B. Zwanenburg, Tetrahedron Asy., 1997, 24, 4047-4057. [9] B. Csákvári, M. Beck, Gy. Hardy, J. Holló, L. Markó, K. Polinszky, E. Punkgor, G. Schay, Cs. Szántay, F. Tüdős, A kémia újabb eredményei, 1987, 65, 166-305. [10] E. Fogassy, M. Nógrádi, D. Kozma, G. Egri, E. Pálovics, V. Kiss, Org. Biomol. Chem., 2006, 4, 3011-3030. [11] J. Rábai: Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1992, 12, 31. [12] D. Szabó, Sz, Szendeffy, I. Kapovits, Á. Kucsman, Gy. Argay, A. Kálmán, L. Párkányi, Tetrahedron Asy., 1997, 14, 2403-2410. [13] J. V. McCullagh, J. Chem. Ed., 2008, 85, 7. [14] Gy. Bruckner, Szerves kémia, 1961, I-1, 332-384.
21
