2014.04.23.
Sejt
Biofizikai módszerek a citoszkeleton vizsgálatára I: Kinetikai és steady-state spektroszkópiai módszerek Citoszkeletális rendszerek Orbán József, 2014 április Citoszkeleton: Aktin Mikrotubulusok Intermedier filamentumok
Institute of Biophysics
Aktin alapú mikrofilamentális rendszer
Dinamikus!!!
Fotométer Fluoriméter
Aktin működés, dinamika plus / barbed end pozitív / szakállas vég
1. nukleáció 2. elongáció (hosszabbodás) 3. dinamikus egyensúly
Milyen gyors? Milyen tartós? Dinamizmus?
On-rate Kötési állandó On/off rate
On/off-rate Kötési/disszociációs állandó Rigiditás/flexibilitás Hossz Kölcsönhatás más fehérjékkel minus / pointed end negatív / hegyes vég
http://www.nature.com/nature/journal/v422/n6933/fig_tab/nature01598_F1.html
Aktin működés, dinamika plus / barbed end pozitív / szakállas vég
Aktin-kötő fehérjék működése, aktin dinamika
plus / barbed end 1. aktív nukleálás
(aktív) nukleálás
2. elongáció (hosszabbodás)
sapkázás (capping)
3. dinamikus egyensúly
filamentum törés (severing) sequestration
(felépülést) nukleáló faktor (assembly) nucleation factor
profilin (-szerű)
Sapkázás (capping) ? minus / pointed end
minus / pointed end
negatív / hegyes vég
1
2014.04.23.
-
-
Capping Barbed-end (+) growth
CP
-
Atomok abszorpciója és emissziója
Severing
Pointed-end (-) depolymerization
alapállapot +
ADP
-
+
e-
ADF Profilin CP
ADP
ATP
profilin
ADF Tb
Gerjesztett állapot
-
ATP
Sequestration
Eabs = hn
+
-
1. Spontaneous assembly
+
2. Facilitated assembly -
Arp2/3 complex machinery: autocatalytic branching Formins: nucleation and processive elongation WH2-domain nucleators
+
(foton) Abszorpció
+
(elektron) Excitáció Gerjesztés
e-
e-
+ assembly factor nucleator
e-
e-
Eem = hn
+
+
(elektron) De-excitation Visszagerjesztődés (foton) Emisszió Kibocsátás
adapted from Renault L. Bugyi B. Carlier MF. Trends in CB 2008.
Az aktin molekula (fehérje) sávos (abszorpciós) spektruma
Fehérjék abszorpciója - aminosavak
2,0
3 aminosav nyel el az UV-ban. Ezek segítségével lehet pl. fehérje koncentrációt meghatározni, egy adott fehérje tiszta oldata esetén.
1,5 1,0 0,5
Extinction coefficient
Abszorbancia (-)
2,5
G-aktin
0,0 260
270 280 290 300 Hullámhossz (nm)
310
320
wavelength
Hogyan mérjük az abszorpciót?
Hogyan mérjük a fluoreszcenciát?
Egy fotométer működésének elméleti sémája
Egy fluoriméter működésének elméleti sémája
monokromátor (rács v. prizma)
Minta
Detektor 1 gerjesztési monokromátor
fényforrás
Minta
fényforrás Referencia csatorna
Fény Elektromos jel
Referencia (blank)
Detektor 2 emissziós monokromátor
Kiértékelés (PC)
A mérés során hullámhosszonként határozzuk meg az abszorbancia értékét egy széles (spektrális) tartományban.
Fény (gerjesztés) Fény (emisszió) Elektromos jel Detektor
Kiértékelés (PC)
2
2014.04.23.
aktin
• struktúra → változás • kölcsönhatás dinamikája
Aktin-kötő profilin molekula
monomer
Mire következtethetünk az eredményekből?
filamentum
Milyen információt nyerhetünk ki a rendszerből?
Aktin-kötő (WH2-szerű) Tb4 molekula
Röntgen szórási eredmények (X-ray diffraction)
Röntgen szórási eredmények (X-ray diffraction)
biokémiai bizonyítékok!
biokémiai bizonyítékok!
• csökkent polimerizációs sebesség és F-aktin mennyiség • profilin-aktin a filamentum csak egyik végéhez tapad
• gátolt polimerizáció • Tβ4-aktin csak monomer formában fordul elő
Irobi, EMBO J. , Sep. 2004
Reakció kinetika
A B AB
KD
A B AB
Sebesség függ: • Használt anyagok minőségétől • koncentrációktól • hőmérséklettől • katalizátorok / inhibítorok
KD , disszociációs állandó, meghatározza egyensúlyban a szabad (A, B) és komplexben (AB) lévő molekulák mennyiségét. Staedy state – dinamikus egyensúly!
gln41
monomer
k-
aktin
k+ és k- sebességi állandók: Összeszerelés/felépülés és szétszerelés/leválás (AB komplexre nézve) egy kétirányú biokémiai reakcióban
filamentum
k+
cys374
3
2014.04.23.
Pirén → N-(1-Pyrene) iodoacetamide
FITC → Fluorescein isothiocyanate
Folyamat: (De)Polimerizáció mérhető: intenzitás
Alexa Fluor® 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester
IAEDANS → 5-({2-[(iodoacetyl)amino]ethyl}diamino)naphthalene-1-sulfonic acid Folyamat: kötési esszé mérhető: intenzitás vagy anizotrópia Folyamat: quenching (→ szerkezet) mérhető : intenzitás Folyamat : FRET (→ szerkezet) + IAF! mérhető : intenzitás
(De)Polimerizációs folyamat mérhető: intenzitás mikroszkópia
Polimerizációs esszé
Szekvesztrálás (VopF) – steady state
Pirén fluoreszcencia intenzitás (a.u.)
2 mM 10% pirén jelölt aktin (spectrin nélkül, változó [VopF V0]) 1,0 0,8
0-100 nM • összeszerelés seb. • steady state szint
Fss (mM)
[actin]
100 - nM • összeszerelési seb. • steady state szint
1,0 0,5 0,25
0,6 0,4 0,2 0,0
0
500 1000 1500 2000 2500 3000 VopF concentration (nM)
• depolimerizáció [VopF] • platót a G-aktin szinten éri el
Idő (perc)
Nukleálás vagy elongációs sebesség változás? • Aktin szekvesztrálás
• G-aktin szekvesztrálás
• 3 WH2 domén
• max. depolimerizáció • változás a kritikus koncentrációban
• szakállas vég kötés?
2 mM 10% pyrene labeled actin, no spectrin seeds, varied VopF, KME (hs), pH7.8
G-aktin kötés – steady state AEDANS aktin – VopF kötési kinetika
AEDANS jelölt G-aktin, fluoreszcencia intenzitás
stopped flow
1.1 mM AEDANS Data 1 aktin 1,2
B
DI/DImax
0,6
0,4
• 1:2 VopF:actin arány • nagy affinitás
0,2
0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
A
[VopF]
3 WH2 domén van, de csak kettő köt aktint!
Kd= 0.03 mM-1 1.1/2.2 mM 90% AEDANS labeled actin, varied VopF, in G buffer, pH7.8
10,00
AEDANS intensity (au)
• 25-30% AEDANS fluoreszcencia intenzitás kioltás (quenching)
1
0,8
[VopF V0] (mM)
9,75
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.5 1.0 2.0 2.5
9,50 9,25 9,00 8,75 8,50 8,25 8,00 0,0
0,5
1,0 time (s)
1,5
2,0
4
2014.04.23.
1 aktin monomer donor-akceptor párral jelölve
FRET Förster type resonance energy transfer
Gln-41 labelled by FITC (Acceptor)
ATP
intramolekuláris flexibilitás A D A D
A
D Cys-374 labelled by IAEDANS (Donor)
IMD-lipid FRET hatékonyság a membránlipidek függvényében
aktin
IRSp53-IMD Homo sapiens
monomer
filamentum
gln41
cys374
1 mM IMD növekvő lipidkoncentráció mellett - 100 % PS - 70% PS, 30% PC -100% PC -15 % PIP2, 85 % PC -4 % PIP2, 96 % PC
Kd (uM) PS 70
143,38
PS 100
78,86
PC 100
168,87
PIP2/PC 15/85
87,73
PIP2/PC 4/96
99,35
5
