SEMMELWEIS EGYETEM O r v o s i B i o k é m i a i I nt é z e t 1094 Budapest, Tűzoltó u. 37-47.
SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS
A tejsavdehidrogenáz enzim izoenzimeinek vizsgálata című gyakorlat előkészítése
Készítette:
2011.02.21. Dr. Bauer Pál egyetemi docens
Jóváhagyta:
Dátum
2011.02.21.
Dr. Kolev Kraszimir tanulmányi felelős MIR szempontból ellenőrizte:
Dátum 2011.02.21.
Dr. Kolev Kraszimir minőségirányítási megbízott
Nyilvántartott példány:
A dokumentáció kódja:
SE-OBI-OKTMU-16
Változat száma: Érvénybelépés időpontja:
01
2011.02.21
Oldalak száma:
6
Mellékletek száma:
0
Dátum
Munkapéldány:
A példány sorszáma:
Ezen Szabványműveleti előírás a Semmelweis Egyetem szellemi tulajdona. Továbbadása, sokszorosítása írásos engedélyhez kötött. A Munkautasításban szereplő információt csak a minőség- és környezetirányítási rendszer működtetéséhez lehet felhasználni.
SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS A tejsavdehidrogenáz enzim izoenzimeinek vizsgálata
MÓDOSÍTÁSOK JEGYZÉKE Módosította Dátum/Aláírás
Módosított oldalszám
A dokumentum kódja: SE-OBI-OKT-MU-16 Érvénybelépés időpontja: 2011.02.11.
Jóváhagyta Dátum/Aláírás
Ellenőrizte Dátum/Aláírás
Kibocsátás időpontja
Oldal:2/6 Verziószám:01
SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS A tejsavdehidrogenáz enzim izoenzimeinek vizsgálata TARTALOMJEGYZÉK
A SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS CÉLJA............................................................................................................. 4 A SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS ÉRVÉNYESÉGI TERÜLETE.......................................................................4 ILLETÉKESÉG ÉS FELELŐSSÉG MEGHATÁROZÁSA.........................................................................................4 A SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS LEÍRÁSA.........................................................................................................4
A dokumentum kódja: SE-OBI-OKT-MU-16 Érvénybelépés időpontja: 2011.02.11.
Oldal:3/6 Verziószám:01
SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS A tejsavdehidrogenáz enzim izoenzimeinek vizsgálata
A SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS CÉLJA Összefoglalja a rutinszerűen alkalmazott technológiai eljárás részleteit. A SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS ÉRVÉNYESÉGI TERÜLETE Orvosi Biokémiai Intézet oktatási előkészítő laboratóriuma. ILLETÉKESÉG ÉS FELELŐSSÉG MEGHATÁROZÁSA
A dokumentum kidolgozásáért felelős: Tanulmányi felelős A dokumentum alkalmazásáért felelős: Vezető laborasszisztens A dokumentumban foglaltak végrehajtásáért felelős: Beosztott laborasszisztensek. A dokumentumban szabályozott tevékenység rendszer felülvizsgálat alkalmával történő felülvizsgálatáért felelős: A Minőségirányítási megbízott A SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS LEÍRÁSA
A tejsavdehidrogenáz enzim izoenzimeinek vizsgálata I.
I./1
Szubsztrátspecificitás mérés spektrofotometriával Szükséges oldatok 3 L foszfátpuffer, 50 mM, pH 7.5 20 ml NADH (0.76 g / 20 ml foszfát puffer), napi adagokban -20 C0 –on tartva 50 ml piruvát oldat, 10 mM ( 55 mg/ 50 ml foszfát puffer) 50 ml 2-ketobutirát, 250 mM (1.78 g/50 ml foszfát puffer) LDH1 (H enzim) Sigma termék, 10 ul szuszpenzió / 990 ul foszfát puffer, két naponta Készítve, gyakorlatok előtt 20szorosra higítva LDH5 (M enzim), Sigma, 100 szorosra higítva foszfátpufferrel két naponta, gyakorlatok előtt 40szeresre higítva
A dokumentum kódja: SE-OBI-OKT-MU-16 Érvénybelépés időpontja: 2011.02.11.
Oldal:4/6 Verziószám:01
SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS A tejsavdehidrogenáz enzim izoenzimeinek vizsgálata I/2
Bekészített eszközök Fotométerek, mérés 340 nm. 3 x 30 ml foszfátpuffer (szobahőn) 3 x 300 ul 10 mM NAD 3 x 200 ul piruvát 3 x 200 ul ketobutirát 3 x 200 ul LDH H 3 x 200 ul LDH M (fentiekkel együtt jégen) 3 x 4 db szükített műanyag küvetta keverőbotokkal Mm papír Pipetta hegyek Időmérő I /3 Gyakorlat kivitelezése Fotométer küvettájába bemérünk: 910 ul foszfát puffer, LDH1 vagy LDH5 30 ul, piruvát vagy 2-ketobutirát 30 ul, a küvettát a műszerbe helyezzük. A NAD hozzáadásával indítunk, leolvasás percenként, vagy a fotométertől függően folyamatosan, adatok ábrázolása, iránytangens meghatározása I/4 Gyakorlat kiértékelése a gyakorlatvezetővel közösen
II:
Laktát dehidrogenáz izoenzimek natív gélelektroforetikus vizsgálata II./1 Szükséges oldatok 500 ml foszfát puffer, 50 mM, pH 7.5 Fehérje higító: 23 ml glicerin, 25 ml Tris-HCl, 0.4 M, pH 8.5, 50 mg Brómfenolkék NAD 10 mM előhíváshoz, higítás naponta 50 mM törzsoldatból ( 1.83 g / 55 ml víz), napi adagokban – 20 C0) TRIS-HCl 50 mL ,0.4M, pH 8.5 TRIS-HCl, 5 L, 0.2M, pH 8.0 1 l Tejsav, 0.5 M, pH 8.0 Tankpuffer 99 g TRIS, 475 g glicin / 3L (15 ször tömény) Előregyártott nativ poliakrilamid gelek (7.5%)
II/2 Bekészített eszközök Tápegység és futtató kád Előre elkészített gél kazettában Szervkivonatok Szűrőpapír Vízfürdő 45C0, tetővel Pipetta hegyek A dokumentum kódja: SE-OBI-OKT-MU-16 Érvénybelépés időpontja: 2011.02.11.
Oldal:5/6 Verziószám:01
SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS A tejsavdehidrogenáz enzim izoenzimeinek vizsgálata gumikesztyű II/3 Szervkivonat készítése Patkányból: máj 15g/30 ml víz, szív 7.5g/ 30 ml víz, Izom 12g/30 ml víz, vese 12g/ 30 ml víz Leölt állatból kivett szerveket ollóval feldaraboljuk, homogenizáljuk foszfát pufferben és centrifugáljuk (400 rpm / 0 perc / 4C0). Felülúszót használjuk, végső higítás kipróbálandó II/4 Előhívó 1 gélre számítva/ 3 gyakorlat: 15 ml tejsav, 70 ml TRIS-HCL, 0.2 M, pH 8.0, 3.3 ml NAD 10 mM, 10 ml nintrotetrazoliumkék (1 mg/ml), 10 ml 1.6 mg/ml fenazinmetaszulfát II/5
A géleket a készülékbe helyezzük, mintafelvitel a gyakorlatvezető utasítása szerint, elektroforézis a gyakorlatvezető által megadott körülmények között, ügyelve, hogy a hőmérséklet túl magas ne legyen. Gélek kivétele és előhívó kádba helyezése. Előhívás sötétben.
II/6
Kiértékelés a gyakorlatvezetővel együtt.
A dokumentum kódja: SE-OBI-OKT-MU-16 Érvénybelépés időpontja: 2011.02.11.
Oldal:6/6 Verziószám:01
