I. GYAKORLAT A fénymikroszkóp A sejtek, a mikroorganizmusok és a finom szöveti struktúrák oly’ kicsinyek, hogy néhány kivételtõl eltekintve szabad szemmel nem láthatók. A mikroszkóp egy olyan eszköz, amellyel a sejteket, szöveteket tanulmányozhatjuk, jellemezhetjük. A mikroszkóp elnevezése a görög eredetû. A "mikrosz" (kicsiny) és a "szkopoeo" (nézek) szavak összetételébõl származik. A fénymikroszkóppal nemcsak az eukariota (7-30 µm), hanem gyakran a prokariota sejtek (1-8 µm) is jól tanulmányozhatók, sõt, a nagyobb sejtalkotók is. A mikroszkóppal, illetve a képalkotással kapcsolatos fontosabb fogalmak: Fény: Elemi részecskékbõl (fotonokból) álló, rendezett, több síkban haladó térbeli hullám. Monokromatikus fény: olyan fény, amelyben csak egyetlen hullámhosszúságú sugarak vannak. Összetett fény: Több, különféle hullámhosszúságú fényhullám keveréke. A látható fény hullámhossztartománya nagyjából 400-700 nm. A fény hullámtani jellemzõi Hullámhossz: két azonos fázisban lévõ hullám távolsága (?, nm-ben kifejezve). Frekvencia: Az egy másodperc alatti rezgések száma. Amplitúdó: A rezgés hullámok szélsõ értékeinek távolsága, vagyis a hullámok kitérésének mértéke. A
3
B C 1
2 7
4
8
5 9 6
1. ábra. Egy összetett fénymikroszkóp felépítése. 1. A mikroszkóp felépítése Egy fénymikroszkóp a következõ fõbb alkotórészekbõl áll (1. ábra): Mechanikai alkotók l. állvány 2. tárgyasztal 3. tubus (csõ) 1
Az állítószerkezet részei 4. makrométer csavar 5. mikrométer csavar Az optikai rész alkotói A megvilágító rendszer részei 6. fényforrás 7. diafragma (fényrekesz) 8. kondenzor 9. színszûrõ Az optikai nagyító rendszer részei A. okulár (B. objektívrevolver) C. objektív (tárgylencse) 2. A mikroszkóp mûködésének elvi alapjai A mikroszkóp egy közös fémcsõbe (tubusba) foglalt közös optikai tengelyen elhelyezkedõ két különálló gyûjtõlencse rendszerbõl áll (2. ábra). A tárgyhoz közeli gyûjtõlencse az objektív (tárgylencse), a szemünkhöz közeli lencse az okulár (szemlencse). A fényt egy állítható tükrön, a diafragmán, a színszûrõn és a kondenzor (gyûjtõ) lencserendszeren át a tárgyasztalon elhelyezett tárgyra vetítik. A vizsgált tárgyról az objektív elõször nagyított, valódi és fordított állású képet á1lít elõ. Az elsõdlegesen alkotott képet nézzük és nagyítjuk tovább az okulárral. A tárgyat az objektív gyújtópontján kívül, ahhoz közel helyezzük el. A tárgy valódi fordított állású képe az okulár gyújtópontján belül esik és így az okulár számára tárgyként, szerepel. Az okulár a tárgyról egyenes állású (a tárgyhoz viszonyítva fordított állású) virtuális, nagyított képet alkot.
okulár
prizma
objektív
tárgy kondenzor
fényforrás
2. ábra A fény útja a mikroszkópban.
2
A mikroszkóp nagyítása A tárgyról eredõ fény az objektíven a majd az okuláron és keresztül áthaladva a kép lencsék nagyításának függõen jelentõsen felnagyítottá válik. A mikroszkóp nagyítása (Nm) egyenlõ az objektív (Nob) és okulár (Nok) nagyításának szorzatával: Nm = Mob · Mok A binokuláris mikroszkópoknál a prizmás köztidarabbal is nõ a fény útja, amelyet a nagyítás kiszámításánál figyelembe kell venni. A prizma közbeiktatásával a fenti képlettel számított nagyítást még be kell szorozni az ún. tubusfaktorral (a faktor értékét a tubusra gravírozzák), hogy a végsõ nagyítást megkapjuk. Az objektívvel maximálisan l00-szoros, az okulárral 25-szörös nagyítás érhetõ el, vagyis a közönséges fénymikroszkóp nagyítása elméletileg mintegy 2500-szoros lehet. Gyakorlatban a mikroszkóp véges felbontóképessége miatt 1500-szoros nagyításnál nagyobbat nem érdemes alkalmazni. 1000-1500-szoros nagyítás felett ugyanis már nem növekszik a kép részletgazdagsága, csupán a tárgy pontjai válnak nagyobbakká, de a tárgyon belüli különálló pontok száma nem nõ tovább. Vagyis a mikroszkóp használhatóságát nem a nagyítás, hanem a felbontóképesség korlátozza! A mikroszkóp felbontóképessége: A mikroszkóp felbontóképessége ( ) optimális megvilágítás esetén: ( )=
A
fényhullámhossz , numerikus appertura
ahol A = n·sin?. Itt n a tárgyat takaró fedõlemez és a frontlencse közötti közeg törésmutatója; n értéke a következõ levegõre n=1, desztillált vízre n=1,33, cédrusolajra n=1,51. ? = az optikai fõtengely és a legszélsõ fénysugár által bezárt szög (azaz az objektív nyílásszögének a fele; 3. ábra). A mikroszkóp felbontási határa azt a két tárgyrészlet (tárgypont) közötti távolságot jelenti a vizsgált tárgyon belül, amelynek végpontjait még különálló pontokként lehet észlelni. Érthetõen optikai eszközünk felbontóképessége annál jobb, ha egymáshoz minél közel álló pontokat különállónak láthatunk. A felbontás megértésére Abbe vezette be a numerikus apertúra fogalmát. A fenti összefüggésbõl világosan következik, hogy a felbontóképesség növelésére két mód kínálkozik. (i) A számlálóban szereplõ érték csökkentése, vagyis rövid hullámhosszúságú fény alkalmazása. Ultraibolya fény alkalmazásával a felbontási határ akár 0,1 µm-re csökkenthetõ, ám mivel költséges kvarc lencséket kell alkalmazni és olyan detektort, amely érzékeli az ultraibolya fényt, az ultraibolya-fénymikroszkóp csak elméleti lehetõség.
objektív
tárgy
3. ábra. Az objektív fél nyílásszöge
3
(ii) A nevezõ, vagyis a numerikus apertúra értékének növelése. Minthogy a fénymikroszkópokban látható fénysugarakat használunk, értéke nem lehet kisebb, mint 400 nm, a mikroszkóp feloldóképességét a numerikus apertúra értékének növelésével javíthatjuk. Cédrus olaj használata esetén a numerikus apertúra értéke 1,43 (sin72°=0,95; 0,95x1,51= 1,43, vagyis ekkor a fénymikroszkóp felbontási határa 0,28 µm). Az úgynevezett „száraz” objektívek esetén a tárgy és az objektív frontlencséje között levegõ van, amely esetben a numerikus apertúra értéke az 1-et sem éri el, hiszen sin? elméleti maximális értéke 1. Azonban a lencse fél nyílásszögét hozzávetõleg 72°-ig lehet fokozni, mert a nagyobb beesési szöggel érkezõ fénysugarak már teljes visszaverõdést szenvednek. Minthogy a levegõ törésmutatója 1, a legjobb felbontású száraz objektívek numerikus apertúrája 0,95. (A numerikus apertúra értéke minden objektíven fel van tüntetve; lásd az 5. ábrát.) A fénymikroszkóp felbontóképességét úgy fokozhatjuk, hogy a fedõlemez és a frontlencse közé a levegõnél nagyobb törésmutatójú anyagot teszünk. Többnyire folyadékot cseppentünk, és a frontlencsét a folyadékcseppbe merítjük. Azokat a lencséket (leggyakrabban a 100-szoros nagyítású objektíveket), amelyek az itt említett megoldásra készültek, immerziós (bemerülõ) objektíveknek nevezzük. Immerziós folyadékként leggyakrabban a fent említett cédrus olajat használjuk. Az olajba érõ objektívek az ún. olajimmerziós, vagy más néven homogén immerziós objektívek (jelük HI). Ha az objektíven a WI jel van, az objektív és a fedõlemez közé desztillált vizet kell csöppenteni. A homogén immerziós elnevezés azt jelenti, hogy az immerziós folyadék fénytörése azonos az objektív és a fedõlemez fénytörésével, vagyis a fénysugár a tárgy elhagyása után optikailag homogén közegben halad (4. ábra).
immerziós objektív
száraz objektív
frontlencse immerziós folyadék fedõlemez tárgylemez
4. ábra. Sugármenet száraz objektív és immerziós objektív alkalmazásakor A fénymikroszkópok objektívrevolver foglalatában általában 4 különbözõ nagyítású objektív van: 10-szeres, 20-szoros, 40-szeres, és 100-szoros nagyításúak (1. ábra). A revolver lehetõvé teszi, hogy az objektíveket egy mozdulattal cserélhessük, változtassuk a nagyítás, és a felbontóképesség mértékét. Az objektíveken a gyártási számon kívül a kisnagyítású tárgylencséken három, a nagyobb nagyításúakon négy szám olvasható: pl. 40/0,65 és alatta 160/0,17 (5. ábra). Az elsõ szám (40) az objektív nagyításának fokát, a második (0,65) a numerikus apertúrát jelzi. A harmadik szám (160) az objektív használatához szükséges tubushosszat adja meg mm-ben, míg a negyedik szám (0,17) a tárgy lefedésére szolgáló fedõlemez legnagyobb vastagságát mutatja. Az utóbbi számot csak a nagy nagyítású tárgylencséken tüntetik fel, amikor a lencse és a tárgy közötti távolság kicsi.
4
a színkorrekció jelzése az immerzió jelzése
a numerikus apertúra értéke
az objektív nagyítása
javasolt fedõlemez vastagság a különleges rendeltetés jelzése
mechanikus tubushossz (mm)
immerziós jelzõcsík az objektív frontlencséje
5. ábra. Az objektív jelölési rendszere. 3. A mikroszkóp kezelése A mikroszkópot úgy kell elhelyezni a munkaasztalon, hogy fölé hajolva kényelmesen, esetenként hosszan-tartóan tudjunk az okulárba nézni. A binokuláris mikroszkópok két tubusát az egyéni pupillatávolságnak megfelelõen kell beállítani. Úgy, hogy egybeesõ éles látómezõt lássunk. A mikroszkóp beállítása a fényforrás fényének a mikroszkóp optikai tengelyébe való vetítésével kezdõdik. Ügyeljünk arra, hogy a látótér egyenletesen legyen megvilágítva, és ne vakítson. A vizsgálandó preparátumot helyezzük a tárgyasztalra, majd a szorítókarokkal rögzítsük. Tartós készítmény vizsgálatakor vigyázzunk arra, hogy a fedõlemez felülre kerüljön. Az éles kép beállítása a lencsék és a vizsgált tárgy közötti távolság durvább, majd finomabb változtatásával történik, a makrométer, illetve a mikrométer csavarral. Figyelem, a durvább beállítást úgy hajtsuk végre, hogy oldalról nézve a legkisebb nagyítású objektívet süllyesszük le a fedõlemezig, majd emeljük addig, amíg a tárgy élesen látszik. Nagyobb nagyítású objektíveknél a javasolt megoldás különösen ajánlott, mert objektívvel könnyen eltörhetjük a fáradtságos munkával elkészített preparátumot. (Arról nem is beszélve, hogy egy kis tárgyat könnyebb megtalálni a kis objektívvel, mint egy naggyal!) Majd a makrométer csavart magunk felé tekerve emeljük a tubust addig, míg megközelítõen éles képet kapunk. A kép élességét a mikrométer csavarral finomítjuk. (A mikrométer csavart 180 foknál jobban nem szabad elfordítani.) A revolver foglalat elfordításával nagyobb nagyítású objektívet állíthatunk az optikai tengelybe. A kép kontrasztosságát a kondenzor süllyesztésével és a diafragma szûkítésével fokozhatjuk. A Köhler-féle megvilágítás alapelveit követve lehet legkönnyebben a fénymikroszkópot optimálisan beállítani. (i) Érkezzenek merõlegesen a tárgyra a fénynyalábok. (ii) Legyen a látómezõ megvilágítása egyenletes. (iii) A képalkotásban részt nem vevõ fénysugarakat ki kell zárni, a diafragma csökkentésével.(iv) Állítsuk a kondenzort olyan helyzetbe, hogy a diafragma képe éles legyen, és éppen a látótér szélére essen. 4. A mikroszkóp tisztítása és tárolása Használat elõtt és után puha flanelruhával, finom szarvasbõrrel vagy speciális szilikonos törlõruhával kell letörölni a mikroszkóp tartozékait. Az okulár esetleges szennyezõdéseit (pl. ujjlenyomat) puha flanelruhával távolíthatjuk el. Az objektívet szennyezõdéseitõl (pl. festék, kanadabalzsam) gyorsan párolgó oldószerrel (alkohol, benzin, éter) tisztít-hatjuk meg. Óvjuk meg a lencséket a porosodástól is. 5
5. Mikroszkópizálást zavaró tényezõk Az esetleges elforduló szennyezõdések közül elsõként a légbuborék említendõ meg. A légbuborék általában kör alakú, vastag falú, fényes képlet. („Falvastagsága” a közegek relatív törésmutatójától, és a buborék nagyságától függõen változik, minél kisebb a buborék, annál vastagabb a „fala”). A tárgylemezek tisztításakor elfordulhat, hogy a törlésre használt textíliákból szabad szemmel nem látható rost kerül. Egy biztos: minél tisztább anyagokkal, minél tisztábban dolgozunk, annál nagyobb hasznunk, örömünk lesz munkánkban. 6. Gyakorlati feladatok 6.1. A mikroszkóp használata Nézzük meg gyakorlómikroszkópunk alkotórészeit az 1. ábra felhasználásával és a leírtak szerint tanuljuk meg, gyakoroljuk használatát. 6.2. Szennyezõdések felismerése Csöppentsünk tárgylemezre vizet, majd a vízcseppre ejtsünk rá egy fedõlemezt úgy, hogy a fedõlemez alá légbuborék kerüljön. Figyeljük meg a levegõbuborék mikroszkópban látott képét és rajzoljuk le. Vizsgáljuk meg a gyapot, a gyapjú és a mûszálas textília elemi szálait. Rögzítsük rajzban a látottakat. 6.3. Mikroszkópos mérések: távolságmérés okulár mikrométer felhasználásával A mikroszkópos képletek méreteinek mérése ún. okulár mikrométerrel történik. Az okulár mikro-méter kör alakú, finom skálabeosztással ellátott üveg-korongocska, mely a mikroszkóp okulárjába helyezhetõ. Az okulár mikrométer finom beosztását a mikroszkópban felnagyítva, és élesen látjuk. A beosztás távolságértékét objektív mikrométerrel (tárgylemez mikrométerrel) kalibrálni kell, minden objektívre külön-külön. Az objektív mikrométer egy olyan speciális tárgylemez, amelyen egy 1 mm hosszú szakasz száz egységre van beosztva finom optikai skálán (6. ábra). Úgy, hogy két szomszédos rovátka közötti távolság = 10 µm. Az okulár mikrométer kalibrálását a következõ módon kell elvégezni. Az objektív mikrométert a tárgyasztalra helyezzük és a mikroszkóp legkisebb nagyításával élesre állítjuk. Majd az okulár mikrométer beosztását úgy forgatjuk, hogy a tárgylemez mikrométer skálája párhuzamosan álljon (7. ábra). Határozzuk meg, hogy az objektív mikrométer egy beosztása (vagyis 10 µm) hány okulár mikrométer beosztásnak felel meg. A továbbiakban aránypárral ki tudjuk számítani, hogy az okulár mikrométer valahány beosztása hány a tárgyon hány µm-nek felel meg. Kalibráljuk az okulár mikrométert a mikroszkóp valamennyi objektívéhez.
6. ábra. Az objektív (baloldalon) és az okulár mikrométer (jobboldalon).
6
hajszál objektív mikrométer skála
okulár mikrométer skála
okulár mikrométer skála
7. ábra. Az okulár mikrométer skála kalibrálása objektív mikrométer skálával. Feladat - Készítsünk birka vörösvértestbõl kenetet. Miután az okulár mikrométert gondosan kalibráltuk, tegyük a tárgyasztalra, a tárgylemez mikrométer helyére a beszáradt birkavérkenetet. Állítsuk élesre a vérkenetet elõször 200-szoros nagyítással. Az okulár mikrométer skálabeosztását állítsuk párhuzamosra egy vértest átmérõjével, és határozzuk meg a fent leírt módon a vértest átmérõjét. Ugyanezt ismételjük meg 400-szoros nagyítással is. - Mérjük meg egy hajszál vastagságát. 6.4. A felbontóképesség meghatározása Állapítsuk meg a felbontási határt az ismert összefüggés segítségével valamelyik objektívre (tételezzük fel, hogy = 500 nm). 6.5. Látótér visszakeresés A modern mikroszkópok tárgyasztalára két, egymásra merõleges skála van. Velük egy adott preparátum adott pontja gyorsan, és kényelmesen visszakereshetõ. Állítsuk be egy preparátum adott pontját, és határozzuk meg helyét a tárgyasztalon a két skála-érték meghatározásával, feljegyzésével. Vegyük ki a tárgylemezt, majd helyezzük vissza, és állítsuk be a két skálát a korábbi értékre. Ha a mikroszkópban felbukkanó kép ismerõs, akkor pontosan dolgoztunk. 6.6. A sejt organellumainak vizsgálata fénymikroszkópos technikával A sejtmag vizsgálata - Készítsünk hagyma allevelébõl epidermisz nyúzatot. Cseppentsünk rá vizet és fedjük le fedõlemezzel. Nézzük meg mikroszkóppal, és a látottakat rögzítsük a jegyzõkönyvbe. Cseppentsünk a fedõlemez széléhez 10%-os ecetsavat, szívassuk át a folyadékot a fedõlemez alatt szûrõpapírcsíkkal és figyeljük meg, hogy az ecetsav rögzítõ hatására hogyan tûnnek elõ a sejtmagok. - Fessük meg a hagyma allevél epidermisz nyúzatot metilzölddel. A nyúzatokat a kikészített üvegedényekben az alábbiak szerint kezeljük. Fixálás Carnoy fixálóban 20 percig (60 ml abszolút alkohol, 30 ml kloroform és 10 ml jégecet). Mosás csapvízben 1-2 percig, festés metilzölddel l0 percig (összetétele: 0,5%-os metilzöld 0,l M-os acetát pufferben, pH=4). Mosás, majd 50%-os alkoholos kezelés 5 percig. Lefedés, majd a festett készítmény vizsgálata. A festett készítményt ecsettel a tárgylemez közepére helyezzük, az esetleges gyûrõdést megszüntetjük. Fénymikroszkóppal, növekvõ nagyítású objektívek-kel megvizsgáljuk. Vizsgáljuk meg a sejtmagokat festett készítményen. Vizsgáljuk meg a sejtmagokat elektronmikroszkópos felvételeken. Oldjuk meg az album feladatait és a helyes megoldásokat, írjuk be a gyakorlati jegyzõkönyvbe. 7
- Négy-öt hagymasejtet és sejtmagját lemérve, állapítsuk meg a hagymasejt és sejtmag átlagos méretét. 6.7. Sejtszám meghatározása Bürker kamrával A fénymikroszkóppal szuszpenzióban lévõ sejtek számát is meghatározhatjuk. A számoláshoz speciális beosztású tárgylemezre van szükség, mint pl. egy Bürker kamrára (8. ábra).
8. ábra A Bürker kamra
9. ábra. A Bürker kamra beosztásai. A fedõlemez és tárgylemez közötti távolság 0,1 mm. - Készítsünk elõ 2-3 kémcsövet, rendezzük sorba az állványban. Automata pipettával mérjünk 990 µl PBS-t (foszfát puffer) az elsõ csõbe, majd 900-900 µl-t a következõkbe. Készítsünk hígítási sorozatot. A birka vörösvértest szuszpenziót alaposan felrázva 10 µl-t pipettázunk az elsõ csõhöz, majd összekeverve a PBS-sel, 100 µl-t átpipettázunk a következõ csõbe. Alapos összekeverés után az utolsó hígítási kémcsõbõl vörösvértest szuszpenziót csöppentünk a Bürker kamra fedõlemeze alá. (Ha a mikroszkópban ellenõrizve a sejtek száma túl sûrûnek bizonyul, akkor a harmadik csõbe kell folytatni a hígítást, és abból kell mintát csöppenteni a Bürker kamrába.) Számolja meg, hogy - a szuszpenzió sûrûségétõl függõen - a Bürker kamrában 25 négyzet, vagy 10 téglalap területén hány vörösvértest van (9. ábra). Az átlag értékei alapján a hígítás mértéke alapján határozza meg, hogy hány vörösvértest van az eredeti sejtszuszpenzió egy milliliterében.
8
