Svět RNA a bílkovin. Sestřih pre-mrna. Sestřih pre-mrna. SESTŘIH pre-mrna. Trans-sestřih. Zrání pre-mrna. Posttranskripční modifikace

Zrání pre-mRNA Posttranskripční modifikace

Vytvoření čepičky (capping) Polyadenylace Sestřih Editace

Svět RNA a bílkovin SESTŘIH pre-mRNA

Sestřih pre-mRNA

Sestřih pre-mRNA

Spliceosomální sestřih

Spliceosomální sestřih

Mechanismus sestřihu snRNA a snRNP Spliceosom

Mechanismus sestřihu snRNA a snRNP Spliceosom

Alternativní sestřih


Trans-sestřih

Trans-sestřih

Samosestřih

Samosestřih

Introny II. typu Introny I. typu Twintrony


1

Typické geny a rekordy

Sestřih (splicing) Vystřižení intervenujících sekvencí (intronů) následované spojením odpovídajících částí kódující oblasti (exonů) Kvasinky Introny v 235 z 6000 genů

Savci

E

Delší introny: Často několik kb 3-10 intronů / gen ozprostřených v oblasti 2 000-10 000 nt Kratší exony: cca 300 nt

C

Rostliny

H

Kratší introny: 60-10 000 nt, průměrně 150 nt Může být až 40 / gen Delší exony

M

A Obratlovci a rostliny Introny v 80 - 85 % všech genů

N I

Lidský gen pro dystrofin

78 intronů: 99.4 % délky genu Pre-mRNA: 2 500 000 nt / 79 exonů mRNA: 14 000 nt

S Alternativní sestřih Významný podíl na regulaci genové exprese Lidské buňky - 40% genů Rostliny - zatím asi 5% genů

Rozpoznání místa sestřihu Sestřihové signály

Nutné kroky při sestřihu: 1. Rozpoznání místa sestřihu 2. Excize intronu Pravidlo GT-AG 3. Ligace exonů

M

Alternativní sestřih Drosophila; gen pro Down syndrome cell adhesion molecule: teoreticky až 38 000 isoforem

U S

Rozpoznání místa sestřihu Sestřihové signály

Obratlovci

Pravidlo GT-AG

Konsensus 5’-místa sestřihu ¾ Dinukleotid GU ¾ 5’-CAG|GUAAGUA-3’ ¾ Rozpoznán U1 snRNA Konsensus místa větvení ¾ Většinou nukleotid A ¾ 5’-UACUAAC-3’ ¾ Nejprve rozpoznáno SF1 (BBP) ¾ Vazba U2 snRNA

Konsensus 3’-místa sestřihu ¾ Nejméně konzervovaný ¾ 5’-C/U/AAG|G-3’ ¾ Pyrimidinový trakt

¾rozpoznán U2AF ¾ kooperativní rozpoznávání místa větvení (SF1) a 3’-SS (U2AF)

¾ Účast tří konsensus sekvencí – místa větvení, pyrimidinového traktu a 3’-SS

2

Rozpoznání místa sestřihu - Sestřihové signály

Nekonsensuální introny Odchylky od pravidla GT-AG: Introny AT-AC Konsensus sekvence • 5’-SS: 5’-|ATATCCTT-3’ • Místo větvení: 5’-CCTTRACCY-3’ • 3’-SS: 5’-YAC|-3’

Rostliny • nižší míra konsensu 5’SS, 3’SS a místa větvení • polypyrimidonový trakt nahrazen sekvencemi bohatými UA • U důležitější než A

• Rozdílné zastoupení bazí: Introny bohaté AU, exony bohaté GC

Sestřih minoritními U12 spliceosomy • Mechanismus analogický klasickému sestřihu • Homology: • U1 snRNA – U11 snRNA • U2 snRNA – U12 snRNA • U4 snRNA – U4atac snRNA • U6 snRNA – U6atac snRNA • U5 snRNA v obou typech Existuje částečná funkční zastupitelnost obou typů spliceosomů

Pomocné sestřihové signály mimo vlastní místa sestřihu Konsensus sekvence krátké a nedokonale komplementární •Pomocné signály – zesilovače, supresory, nukleotidové složení intronů a exonů Zesilovače (enhancers) • Stimulují sestřih, 40-200 nt od míst sestřihu • Exonové i intronové • Rozpoznávány SR proteiny (splicing factor-related proteins) • Dvě „RS“ domény – Arg-Ser dipeptidové repetice Zeslabovače (suppressors) • Váží hnRNP bílkoviny - PTB (polypyrimidine tract-binding proteins) či hnRNP A Nukleotidové složení intronů a exonů • Dvouděložné rostliny • Obsah AT: exony (50%) X introny (>70%) • Oligo(U) řetězce v intronech • Savci - Oligo(G) řetězce v intronech

Rozpoznány minoritními snRNP • snRNP U11 a U12

Nutnost • nalézt všechny introny a exony • vystřihnout introny na správných místech

Definice exonů a intronů

Chybné rozpoznání signálů: • nevystřižení intronu • intron skipping • přeskočení exonu • exon skipping • použití kryptického 5’-SS

Rozpoznávání intronů/exonů jako párů správně vzdálených vzájemně odpovídajících míst sestřihu • Párování SS přes intron • Párování SS přes exon

3



Čepička - analog 5’-SS prvního exonu ¾ CBP (20+80 kDa) interaguje s U1 snRNP Poly(A) řetězec - analog 3’-SS posledního exonu ¾ PABP (33 kDa) interaguje s U5 snRNP

Predikce sestřihu in silico • odhalí cca 80% míst sestřihu

snRNP Bílkovinné faktory ¾ U1 snRNP ¾ U2AF (U2 association factor) ¾ U2 snRNP ¾ SR bílkoviny ¾ 70K hnRNP protein ¾ BBP/SF1 (Branching point-binding protein) ¾ UBP (Uridylate-specific RNA-binding hnRNP-like protein)

Sestřih pre-mRNA

snRNA a snRNP Malé jaderné RNA a RNP

Spliceosomální sestřih Mechanismus sestřihu snRNA a snRNP Spliceosom


Trans-sestřih Samosestřih Introny II. typu Introny I. typu Twintrony

Obecné funkce ¾ Interakce s pre-mRNA a spolu navzájem prostřednictvím interakcí RNA-RNA ¾ Kostra pro přepravu a asociaci specifických spliceosomálních bílkovin ¾ Katalytické centrum spliceosomu

4

Primární a sekundární struktura snRNA Obecně krátké: 60 - 300 nt

Primární a sekundární struktura snRNA Dvě skupiny snRNA 1) U1, U2, U4, U5, U11, U12 a U4atac snRNA

Primární sekvence vysoce konzervativní

2) U6 a U6atac snRNA

Sekundární strukturní elementy ještě konzervativnější Určité úseky primární sekvence téměř 100% konzervativní jednořetězcové úseky 1) RNA-RNA interakce (snRNA:mRNA a snRNA:snRNA) 2) vazebná místa bílkovin

RNA-RNA interakce ve spliceosomu

Bílkovinné sestřihové faktory mimo snRNP

Klíčové pro správné zformování a funkci spliceosomu 4 typy interakcí 1. Intramolekulární interakce v rámci jedné U snRNA 2. Intermolekulární interakce snRNA / pre-mRNA U1 snRNA - 5’-SS U2 snRNA - Místo větvení U6 snRNA - 5’-SS U5 snRNA - konce exonů

CBP (cap-binding protein) ¾ 2 podjednotly, 20 + 80 kDa

¾ usnadnění navázání U1 snRNP k 5’-místu sestřihu ¾ definice prvního (5’-) exonu PABP (poly(A)-binding protein) ¾ 33 kDa ¾ interakce s U5 snRNA ¾ definice posledního (3’-) exonu

3. Intermolekulární interakce snRNA / snRNA U4/U6 snRNA U6 snRNA - U2 snRNA

DExD/H-box RNA helikasy ¾ řada bílkovin ¾ změna konformace RNA

4. Intramolekulární interakce v rámci pre-mRNA

5

DExD/H-box ATP-dependentní RNA helikasy

Bílkovinné sestřihové faktory mimo snRNP U2AF (U2 auxiliary factor) - esenciální sestřihový faktor; 65 + 35 kDa ¾ p65: N-terminální RS doména, 3 RRM domény, vazba k polypyrimidin. traktu ¾ p35: neváže se k RNA, nejasná úloha BBP (kvasinky) / SF1 (člověk) ¾ 75 kDa, vazba k místu větvení a U2AF ¾ N-terminální KH doména (RNA-protein) ¾ C-konec bohatý prolinem (protein-protein) SR bílkoviny ¾ jedna či více N-terminálních RRM domén ¾ C-terminální RS (Arg-Ser) doména ¾ regulace fosforylací serinu ¾ vazba k zesilovačům sestřihu

Součást U5 snRNA 8 různých RNA helikas potřebných pro správný průběh jediného procesu důkaz důležitosti strukturálních změn RNA během sestřihu pre-mRNA

UBP1 (Uridylate-specific RNA-binding hnRNP-like protein), rostliny ¾ vazba k AU-bohaté oblasti intronu ¾ 3 RBD domény ¾ definice intronu, zprostředkování vazby U snRNP k intronu

Tri-snRNP model asociace/disociace spliceosomu

Sestřih pre-mRNA Spliceosomální sestřih Mechanismus sestřihu snRNA a snRNP Spliceosom

Komplex E commitment complex



fosforylace defosforylace

6

Modely formování spliceosomu Spliceosomální cyklus

Tri-snRNP model

¾ Původní a obecně přijímaný

Tetra-snRNP model

¾ HeLa buňky – isolován komplex U2/U4/U6 snRNP ¾ párování U2/U6 stabilizuje vazbu U4/U6 ¾ U2 součástí komplexu E savců isolovanéha za jemných podmínek

Penta-snRNP (Holospliceosome) model (2002)

¾ holospliceosom isolován z kvasinkového extraktu při nízkých koncentracích solí

Katalytické jádro spliceosomu

Katalytické jádro spliceosomu

Spliceosom velice pravděpodobně ribozym Fosfát vážící Mg++

Přímé důkazy neexistují

U6 intramolecular stem-loop

Místo 2’,3’,5’-fosfotriesterové vazby s A v místě větvení

Nepřímé indicie: 1) Závislost první i druhé transesterifikační reakce na kovovém iontu (Mg++)

Párování k 5’-SS

2) Popsání slabé katalytické aktivity in vitro v trimolekulárním komplexu (2001) • Jen RNA: U2 snRNA, U6 snRNA, fragment RNA hoologní k místu větvení • Reakce analogická první transesterifikační reakci • 0.15% za 24 hodin při plné saturaci U2 i U6 snRNA

3) Větvící A tvoří 2’,3’,5’-fosfotriesterovou vazbu s A a G u 5‘-konce U6 ISL 4) Uracil U80 v U6 ISL (intramolecular stem-loop) váže hořečnatý ion

Párování k místu větvení

Formování terciálních interakcí mezi U6 a U2 snRNA (pseudoknot)

7


Alternativní sestřih Sestřih pre-mRNA • Nezbytná součást genové exprese • Významný regulační krok Člověk - 40 % genů

( podle 5 000 000 EST / 33 000 genů )

Arabidopsis - zatím asi 5 % genů

( podle 179 000 EST / 27 000 genů )

Variabilní užití potenciálních míst setřihu Komplexní transkripční jednotka • Jedna pre-mRNA může dát vzniknout mnoha zralým mRNA • Mnoho bílkovin může být kódovanáno jedním genem



Základní typy alternativního sestřihu

Mechanismus alternativního sestřihu Neexistuje jednotný mechanismus

Zapomenutý intron Konkurující 3’ místa sestřihu Konkurující 5’ místa sestřihu

Rozpoznání konstitutivních a alternativních míst sestřihu • nízký stupeň konzervace • regulační sekvence i sekvence míst sestřihu krátké a degenerované • malý informační obsah • snad čím blíže konsensu, tím silnější místa sestřihu Sestřihové zesilovače/supresory

Alternativní promotory Alternativní polyadenylační místa Kazetovité exony Vzájemně se vylučující exony

SR bílkoviny - definice exonů, vazba k zesilovačům sestřihu hnRNP bílkoviny (PTB, hnRNP A1) - většinou inhibitory sestřihu Sekundární struktura pre-mRNA Poměr koncentrací a aktivit jednotlivých obecných a specifických sestřihových faktorů Komplexní proces - kombinace pozitivně a negativně působících faktorů

8

Alternativní sestřih Sestřih pre-mRNA • Nezbytná součást genové exprese • Významný regulační krok Člověk - 40 % genů

( podle 5 000 000 EST / 33 000 genů )

Arabidopsis - zatím asi 5 % genů

( podle 179 000 EST / 27 000 genů )

Alternativní sestřih genu pro Dscam

Variabilní užití potenciálních míst setřihu Komplexní transkripční jednotka • Jedna pre-mRNA může dát vzniknout mnoha zralým mRNA • Mnoho bílkovin může být kódovanáno jedním genem

Drosophila

¾ gen pro DS cell adhesion molecule (DSCAM): ¾ teoreticky až 38 016 isoforem

Funkční kategorizace alternativně stříhaných genů Člověk (75 % genů) • Signalizace • Stres • Regulace genové exprese • Receptory • Přenos signálů • Transkripční faktory

Arabidopsis (většina genů) • Regulace genové exprese • Receptory • Přenos signálů • Transkripční faktory • Stres Příklady rostlinných alternativně sestříhaných stresových genů

Funkční důležitost alternativního sestřihu

Produkce zcela rozdílných produktů jednoho genu • Člověk: calcitonin (CT) X calcitonin gene-related peptide (CGRP) • Alternativní sestřih a polyadenylace CT/CGRP genu • Štítná žláza - exon 4 -> 32 aa CT (hormon, hladina Ca v krvi) • Neurony - Vystřižení exonu 4 -> 37 aa CGRP (vasodilatátor)

Rýže: dvě mitochondriální bílkoviny • Společný exon 1 - mitochondriální lokalizační signál • Exon 2 - mt ribosomální protein S14 (RPS14) • Exon 3 - podjednotka B mt sukcinát dehydrogenasy (SDHB) • vznik: integrace původně mitochondriálního genu rps14 do intronu jaderného genu sdhB

9

Funkční důležitost alternativního sestřihu

Alternativní sestřih genu slo

Vyjmutí či náhrada funkčních domén bílkovin • Modulární struktura bílkovin, různé domény s různou funkcí • Transkripční faktory - DNA vazebná a aktivační doména Lokalizace bílkovin • Rozdílná buněčná lokalizace stejné bílkoviny Změna nepřekládaných oblastí (UTR) • ovlivnění translatability, stability a lokalizace mRNA v cytoplasmě • Drosophila: mRNA pro ferritin - přítomnost / absence IRE Zpětnovazebná smyčka • kvasinková ribosomální bílkovina L32 • vazba k vlastní pre-mRNA, inhibice sestřihu, narušení ORF, syntéza nefunkční bílkoviny

Alternativní sestřih genů pro neurexiny

Další příklady komplexních transkripčních jednotek Fibroblast growth factor receptor 2 (savci) Vzájemně se vylučující exony mění vazebnou specificitu

Neural cell adhesion molecule (mozek krys) Variable alternatively spliced exon (VASE)

RUBISCO activase (rostliny) Obě aktivují RUBISCO, jen delší je regulována změnou redox potenciálu

α-Tropomyosin (krysy) 9 isoforem s rozdílnou buněčnou specificitou 2 alternativní promotory (A), 2 páry vzájemně se vylučujících exonů (B), řada alternativních míst polyadenylace (C)

10

Trans-sestřih




Široce rozšířený ¾ zejména organely ¾ Protista (Kinetoplastida, Euglena) ¾ Hlísti, ploštěnci, obratlovci Každý exon kódován jinou RNA ¾ pre-mRNA ¾ PTM (pre-transsplicing molecule)

¾ dříve SL RNA (spliceleader RNA) ¾=

Často spolu s alternativním sestřihem ¾ Časté u parazitů; vznik různých antigenních determinant

Introny II. typu

Sestřih pre-mRNA

Mitochondriální genom:

Fylogeneticky značně rozšířené


1) rRNA, tRNA, mRNA • Mitochondrie, plastidy • Protista, houby, rostliny 2) mRNA • Eubacteria Dosud neobjeveny u Archebakterií

Arabidopsis – 23 Marchantia – 25

Chloroplastový genom Euglena – 155 (40% genomu)



Délka intronů: • Variabilní; 389 nt - 3.4 kb bez ORF • většinou 0.6 – 2.5 kb (dle přítomnosti ORF) • ORF cca 500-800 nt

Samosestřih - ribozymy Mobilní genetické elementy

Mechanismus sestřihu stejný jako u spliceosomů • snad jejich evoluční předchůdci • teorie vzniku snRNA rozpadem intronů II. typu

11

Mechanismus sestřihu intronů II. typu Transesterifikace

Kofaktor

Hydrolýza Součást katalytickéha jádra

Definice míst sestřihu

ORF

Nejkonzervovanější, Ribozym?

Obsahuje nukleofil (A)

Hydrolýza - alternativní způsob • prvním nukleofilem voda, výsledkem lineární intron • snad evoluční předchůdce transesterifikace

Bílkoviny účastnící se sestřihu intronů II. typu

Kódované intronem (doména IV)

Kódované jádrem

¾ maturasa

¾ RNA vazebné bílkoviny ¾ RNA helikasa

¾ stabilizace konformace intronu

¾ reversní transkriptasa ¾ endonukleasa ¾ twintrony

¾ RNA chaperony ¾ aa-tRNA synthetasy

¾ sestřihové faktory

¾ často společné se spliceosomálním sestřihem

Sekundární struktura intronů II. typu

Introny II. typu – mobilní genetické elementy

Retrohoming

Retrotransposice

Bílkovina kódovaná intronovým ORF • reversní transkriptasa • endonukleasa Ribozym (intronová RNA)

12



Sestřih pre-mRNA

Introny I. typu



Fylogeneticky značně rozšířené • Eukaryota,viry, Eubakterie, bakteriofágy • Dosud neobjeveny u Archebakterií • Abundantní zejména v mtDNA hub

Trans-sestřih

1) rRNA, tRNA, mRNA • Mitochondrie, plastidy • Protista, houby, rostliny 2) tRNA, mRNA • Eubacteria, bakteriofágy 3) rRNA • jádro • Protista, houby 4) mRNA • Mitochondrie • Živočichové (Žahavci)

Samosestřih Introny II. typu Introny I. typu Twintrony

Jederná pre-23S rRNA z Tetrahymena thermophila (413 nt)

Samosestřih - ribozymy zrychlení reakce 1011-krát

Mobilní genetické elementy

13

Primární a sekundární struktura intronů I. typu

Sekundární struktura intronů I. typu

Velice jednotná a komplexní sekundární a terciální struktura Délka 200-400 nt Mohou obsahovat ORF • Maturasa • Stabilizace terciální struktury • Endonukleasa • Mobilita intronů Takřka žádná konzervace primární nukleotidové sekvence • Upstream exon končí U • Intron končí G • Čtyři téměř konzervované oblasti: P, Q, R a S

Substrátová doména • Vlásenky P1, P10 (začátek a konec intronu) a P2 • IGS - internal guide sequence, párování s konci exonů

Extrémní konzervace sekundární struktury • Vlásenky (P) se smyčkami (L), pseudoknoty, jednořetězcové oblasti (J)

Katalytické jádro • Domény P4-P6 a P3-P7 • Dvě téměř rovnoběžbé dvoušroubovice, mezi nimi substrátová doména

Intron I. typu

Mechanismus sestřihu intronů I. typu Mechanismus podobný klasickému spliceosomu • Dvě transesterifikační reakce Prvním nukleofilem volný guanosin • Nevzniká laso, ale lineární intron • První a druhý krok představují přímý a zpětný chod téže reakce (i intron končí G) • Jen jedno katalytické jádro • Jen jedna funkční konformace • Statická struktura • Cirkularizace intronu • Mobilita - nejen vystřižení, ale i homing Závislost na přítomnosti dvojmocných kovových iontů • Zaujetí správné funkční konformace (folding) • Mg++, Mn++, Ca++, Sr++ • Účast při vlastní sestřihové reakci (donor/akceptor protonů) • Takřka výhradně Mg++

14

Další reakce katalyzované ribozymy I. typu Retrohoming Reverzní sestřih -> reverzní transkripce -> rekombinace (integrace do genomu) Transesterifikace či hydrolýza fosfoesterových vazeb Analogie I. kroku: Cirkularizace intronu

Endonukleolytické štěpení RNA a DNA (endonukleasa)



Hydrolýza aminoacylesterů (aminoacylester hydrolasa) není hydrolýza fosfoesterové vazby !

Trans-sestřih

Analogie II. kroku:


Ligace RNA (ligasa)

Polymerace RNA (polymerasa)

Samosestřih

Přenos nukleotidů (nukleotidyltransferasa)

Twintrony I. typu Didymium iridis (Myxomycetes)

Naegleria gruberi (Amoeboflagellata)

Podobnost: životní cyklus, buněčná morfologie, organizace rDNA (extrachromozomální, Di 20 kb lineární, Ng 14 kb cirkulární)

Twintrony v rRNA genech v konzervovaných částech rDNA

Twintrony I. typu Intron I (160-190 mt) • Nejmenší známý ribozym I. typu • Hydrolytické štěpení dvou interních míst v RNA • Ne sestřih, ale vyštěpení ORF z twintronu Intron II • Klasický ribozym I. Typu • Sestřih twintronu ORF - homing endonukleasa • Mobilita twintronu

Intron ribozym I. typu

1.3-1.4 kb

ORF (75O nt) homing endonukleasa

Horizontální přenos: • Přítomnost v tak evolučně vzdálených organismech jen v extrachromozomální DNA

15

Svět RNA a bílkovin. Sestřih pre-mrna. Sestřih pre-mrna. SESTŘIH pre-mrna. Trans-sestřih. Zrání pre-mrna. Posttranskripční modifikace

Recommend Documents