Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
TEKNIK ISOLASI CAMPYLOBACTER JEJUNI DARI USUS AYAM PENDERITA SINDROMA KEKERDILAN SUPARTONO
Balai Penelitian Veteriner, Jl. R.E. Martadinata 30, Bogor 16114
RINGKASAN Pada penelitian ini dilakukan isolasi Campylobacter jejuni dari usus ayam penderita sindroma kekerdilan. Teknik isolasi C. jejuni yang dipakai berdasarkan metode yang dikembangkan oleh Bolton dan Robertson dengan memakai medium selektif Sampel usus bagian jejunum dikoleksi secara aseptis (2-5 gram) dan dimasukkan dalam kantong plastik. Usus dihancurkan dengan cara ditumbuk/digerus dan kemudian dibuat suspensi dengan 0,2% pepton. Sebanyak 1 ml suspensi tersebut ditanam pada Preston selective enrichment broth yang telah ditambah 5% darah kuda lisis. Spesimen diemulsifikasikan sebelum diinkubasikan secara anaerobik (ditambah gas generating kits) untuk campylobacter (OZ 5%, COz 10%, N2 85%) pada suhu 42 ° C selama dua hari . Setelah diinkubasikan, biakan cair yang tumbuh kemudian disubkultur pada Preston campylobacter selective agar yang ditambah 5% darah kuda lisis dan diinkubasikan pada kondisi atmosfere yang sama. Karakteristik koloni campylobacter adalah halus, cembung, mengkilat, berwarna putih keabu-abuan dan non hemolitik dan morfologinya dengan pengecatan fuschin dapat berbentuk huruf S, kurva atau spiral . Kemudian dipilih 1-2 koloni untuk dimurnikan sebelum dilakukan identifikasi secara biokimia untuk menentukan spesiesnya. Kata Kunci: Campylobacter jejuni, Isolasi, Ayam, Preston .
PENDAHULUAN Sindroma kekerdilan pada ayam disebabkan oleh agen virus dan bakteri. Menurut laporan pada kasus ayam kerdil banyak ditemukan bakteri Campylobacter jejuni (ROSENBERGER DAN OLSON, 1991). C. jejuni adalah bakteri gram negatip, motile, berbentuk spiral rods dan hanya tumbuh pada suhu 42 ° C. Bentuk koloni C. jejuni kecil sekali seperti gulungan spiral, cepat sekali berubah bila berhubungan dengan udara sehingga membentuk formasi membulat antara batang dan coccus . Pada isolasi awal bisa dilihat dua tipe koloni yaitu koloni mendatar warna keabu-abuan, bulat, pada bagian pinggir tidak beraturan menyebar sesuai arah dari bidang goresan ose. Pada isolasi yang kedua koloni bulat 1-2 mm, lembut berwarna seperti kotor agak gelap, koloni pada media agar darah tidak terjadi hemolisa .
192
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
C. jejuni adalah bakteri yang mudah rusak dan sangat sensitif terhadap oksigen serta suhu RUANG, oleh karena itu untuk isolasi secara optimal diperlukan media selektif (STERN, 1981) . Isolasi C. jejuni selain membutuhkan medium selektif untuk tumbuhnya juga perlu penambahan 6-7 % darah kuda lisis dan supplemen antibiotik. Ada banyak medium untuk isolasi C. jejuni diantaranya adalah dari Preston, Skirrows, Butzler, Blaser's dan Campy. BAP (BOLTON DAN ROBERTSON, 1982, DOYLE DAN ROMAN, 1982, ROGOL et al., 1985, BLASER et al ., 1979) . Preston Campylobacter selektive medium diformulasikan oleh BOLTON DAN ROBERTSON (1982) . Media ini sangat cocok untuk mengisolasi C . jejuni dari semua tipe spesimen baik dari manusia, hewan, burung, dan lingkungan. Campylobacter jejuni membutuhkan teknik khusus/selektif, sebab kuman tersebut berada dalam lingkungan mikro aerophilik dan didalam lingkungan kuman oleh kuman lain, serta kuman ini membutuhkan sedikit sekali oksigen (3-6 % 02). Oksigen yang akan terlalu banyak meracuni kuman tersebut, namun dengan penambahan 0,025% ferrous sulfat dan sodium meta bisulfit dan sodium pyruvate dapat mempertahankan hingga konsentrasi oksigen 15-20% (GEORGE et al, 1978) . Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa Preston medium lebih selektif untuk isolasi C. jejuni dibandingkan dengan Skirrows medium Preston juga cocok untuk isolasi dari segala macam sampel (BOLTON DAN ROBERTSON et al., 1982). Oleh karena itu pada penelitian ini untuk isolasi C. jejuni dari usus ayam penderita sindroma kekerdilan dilakukan dengan menggunakan teknik tersebut.
BAHAN DAN CARA Sampel Dapat pulih sampel berupa usus ayam penderita sindroma kekerdilan dikoleksidari lapang . Pengambilan sampel usus dilakukan di ruang bedah bangkai bagian Patologi secara aseptis, yaitu dengan cara memotong usus bagian jejunum. Sampel yang dikoleksi segera disimpan dalam pendingin untuk mencegah terjadinya membuuhkan. Setelah tiba di laboratorium Bakteriologi, usus dihancurkan dan dibuat suspensi dengan ditambah 0,2% pepton. Bahan Pembuatan Media 1 . Campylobacter Agar Base (CM689, Difco) 2 . Campylobacter selective supplement (Preston SRI 17, Oxoid) 3 . Campylobacter growth supplemnet (Preston SR 84, Oxoid) 4. Nutrient Broth No. 2 (Oxoid) 5 . Darah kuda lisis (Biofarma) 6. Tabung bejana anaerobik 7. Gas generating kits untuk campylobacter (BR 56, Oxoid)
193
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
Preston campylobacter selective agar Media yang digunakan untk isolasi C. jejuni adalah media selektif (Preston) yang diformulasikan oleh BOLTON DAN ROBERTSON (1982) . Media selektif dibuat dengan cara mensuspensikan 18,5 gram campylobacter agar base dalam 475 ml air destilasi dan kemudian dididihkan hingga larut. Media agar tersebut didinginkan dan kemudian berturut-turut ditambah 5% darah kuda lisis, 1 vial Preston campylobacter selective supplement yang telah dilarutkan dalam 2 ml aceton (50/50) . Setelah tercampur rata agar kemudian dituangkan pada petri dish steril . Preston campylobacter selective broth Media broth dibuat dengan cara melarutkan 12,5gram Nutrient broth No .2 ke dalam 475 ml destilasi air dan dididihkan . Media broth kemudian didinginkan lalu ditambahkan 25 ml darah kuda lisis, 1 vial Preston campylobacter selective supplement dan 1 vial campylobacter growth supplement . Campur sampai rata dan kemudian secara aseptik dimasukkan ke dalam botol kecil yang tertutup berisi 5 ml. Selektive Enrichment Broth dapat disimpan selama 7 hari pada temperatur 4°C. Isolasi bakteri Untuk mendapatkan isolat kuman campylobacter, isolasi harus segera dilakukan mengingat kuman ini tidak tahan terhadap oksigen . Adapun cara isolasi kuman sebagai berikut : Usus diambil kurang lebih sekitar 2-5 gram masukkan dalan kantong plastik steril untuk pembuatan suspensi dengan cara penggerusan . Dengan menggunakan pipet ambil 1 ml suspensi usus dan masukkan pada media cair No . 2 yang sudah ditambahkan ke dalam media tersebut darah, supplement dan anti biotik. Penanaman pada temperatur 42°C dalam kondisi anaerobik menggunakan gaspack atau gas generating kit sehingga diperoleh kondisi kandungan oksigen 2-5 % , 10% COZ dan 85% N2, lamanya inkubasi bisa variasi antara 2-3 hari. Pertumbuhan dapat dilihat setelah biakan cair di sub kultur pada media agar darah, koloni yang dicurigai dilakukan pengecatan dengan Fuchsin . Pengamatan segera dilanjutkan jangan sampai kultur terlalu lama di dalam keadaan terbuka bebas berlebihan oksigen yang dapat bersifat toksik . Identifikasi bakteri Identifikasi bakteri C. jejuni dilakukan berdasarkan uji biokimia 1984) . Diambil 1 koloni dari media agar dan dipindahkan ke dalam media heart infusion agar yang ditambah 5% darah kelinci dan diinkubasikan pada suhu 42 °C selama 24 jam . Setelah diinkubasikan, diambil kultur segar dengan ose dan dipindahkan ke dalam heart infusion broth . Kekeruhan disesuaikan dengan standard Mc Farland No I dan kemudian dilakukan test secara biokimia yaitu catalase, oksidase, reduksi nitrat, produksi H2S, toleransi (BERGEY'S,
194
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
tehadap glisin 1%, NaCI 3,5%, produksi indole, temperatur dan hidrolisis hippurat.
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil isolasi C. jejuni dari usus ayam kerdil dengan menggunakan media selektif dari Preston ini menunjukkan dari 40 sampel usus dapat diisolasi sebanyak 10 isolat . Dengan demikian tingkat keberhasilannya mencapai 40% . Menurut pengalaman yang terjadi di laboratorium pada waktu isolasi ternyata lamanya waktu untuk subkultur bakteri ini sangat mempengaruhi hasil akhir isolasi . Jika waktu untuk melakukan subkultur tertunda hingga 1 jam maka biasanya bakteri ini akan mati karena C. jejuni ini sangat sensitif terhadap oksigen . Berdasarkan pengalaman ini maka sebelum siap untuk dilakukan subkultur, cawan petri yang berisi koloni bakteri tetap dibiarkan dalam anaerobik jar. Tingkat keberhasilan untuk mengisolasi bakteri Campylobacter jejuni sangat dipengaruhi oleh media yang digunakan, temperatur, lama inkubasi dan juga kondisi atmosfernya . Hal ini terjadi karena bakteri C. jejuni sangat fragile dan sensitif terhadap oksigen serta tidak dapat tumbuh pada temperatur 37°C. Tingkat optimal oksigen yang diperlukan pada waktu inkubasi dilaporkan 6%. Penyimpanan kultur bakteri ini juga harus ditambah gliserol dan disimpan pada freezer - 80°C. Banyak media yang telah dikembangkan untuk isolasi bakteri C. jejuni dengan tingkat keberhasilan yang beragam. Salah satu media yang diketahui mempunyai tingkat keberhasilan cukup tinggi untuk isolasi bakteri tersebut adalah Preston selective media yang diformulasikan oleh BOLTON dan ROBERTSON (1982) . Media ini dipilih karena cocok untuk isolasi C. jejuni dari semua tipe spesimen baik dari manusia, mamalia, ayam dan juga dari lingkungan. Media selektif dari Preston diperkaya oleh penyubur dan antibiotik sebagai suplemen tambahan. Kandungan antibiotiknya terdiri dari polymixin B, Rifampicin, Trimethoprim lactate dan cycloheximide. Adanya antibiotik tersebut memudahkan untuk isolasi C. jejuni karena mampu untuk menghambat pertumbuhan bakteri cemaran seperti Bacillus spp. dan Proteus spp . (BOLTON DAN ROBERTSON, 1982) .
KESIMPULAN Teknik isolasi Campylobacter jejuni dengan memakai media selektif Preston mampu untuk mengisolasi bakteri dari jejenum ayam kerdil dengan tingkat keberhasilan mencapai 40% .
195
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
DAFTAR BACAAN BLASER, M.C.,I.D. BERKOWITZ, F.M. LAFORCE, J. CRAVENS, L.B. RELLER, DAN WANG W.L 1979. Campylobacter enteritis : Clinical DAN epidemilogic features. Ann. Intern . Med . 91 :1979. BOLTON F.J. DAN L. ROBERTSON . 1982 . A selective medium for isolating Campylobacter jejuni/coli. J. Clin. Pathol . 35:462 . BERGEY,S . 1984. Mannual of systematic Bacteriology, Vol . I Williams dan Wilkins Baltimore, London . DOYLE, M.P. DAN D.J. ROMAN . 1982. Sensitivit y of Campylobacter jejuni to drying. J.Food Prot. 45:507. GEORGE, H.A., P.S . HOFFMAN, R.M. SMIBERT, DAN N.R. KRIEG . 1978. Improved media for growth dan aerotolerance of Campylobacter fetus. J. Clin. Microbiol . 8 :36. ROGOL, M., B . SHPAK, D. RITHMAN, DAN I. SECHTER . 1985. Enrichment medium for isolation of Campylobacter jejuni- Camoylobacter coli. Appl. Environ . Microbiol . 50:125. ROSENBERGER, M.D. DAN N.O. OLSON . 1991 . Reoviru s Infections . In: Disease of Poultry 9th ed. Edited by Calneck, B.W., H.J. Barnes, C.W. Beard, W.M. Reid DAN H.W. Yoder, JR. P. 639-647 . Ames, Iowa State University Press. STERN, N.J. 1981 . Campylobacter fetus ssp . jejuni: recovery methodology dan isolation from lamb carcasses . J. Food Sc. 46:660 .
