Úloha č. 5 STANOVENÍ PURINOVÝCH BÁZÍ S VYUŽÍTÍM ELIMINAČNÍ VOLTAMETRIE Úvod Eliminační voltametrie s lineární polarizací elektrody (Elimination Voltammetry with Linear Scan – EVLS) je relativně nová elektrochemická metoda umožňující na základě matematického zpracování voltmetrických dat (LSV – Linear Sweep Voltammetry nebo CV – Cyclic Voltammetry) získat další informace o elektrodových procesech a získat výhody vyššího rozlišení, větší citlivosti a rozšíření potenciálového měřícího rozsahu. Teoretický základ EVLS podal v roce 1996 Dračka [1] a od té doby se s úspěchem rozvíjí, zejména po stránce experimentální [2-4]. Teorie eliminační voltametrie s lineární polarizací elektrody Při zpracovávání dat v eliminační voltametrii se uvažuje předpoklad, že výsledný voltmetrický proud I se skládá z proudů částečných (parciálních) Ij , které odpovídají jednotlivým dílčím procesům probíhajícím při elektrodovém procesu (např. redukci) zkoumané látky. Tuto skutečnost vyjadřuje rovnice (1): I=
n
∑I j =1
(1)
j
Parciálními procesy se rozumí procesy uplatňující se v
elektrochemickém systému.
Nejběžnějšími procesy jsou [5-9]: 1) Transport látky k elektrodě (přídavkem dostatečného množství indiferentního elektrolytu potlačíme migraci a jako jediný transportní proces se uplatňuje difúze). 2)
Předřazená chemická reakce v blízkosti elektrody (např. protonizace).
3) Vlastní přenos elektronu z elektrody (redukce depolarizátoru). 4) Nabíjením elektrodové dvojvrstvy, nebo redukce adsorbované částice. 5) Transport zredukovaného depolarizátoru od elektrody. Podle toho, který z těchto procesů je v daném případě řídící, nazýváme parciální proudy odpovídající např. jednotlivým případům: proud řízený pouze difúzí (Id), kinetikou (Ik) a nebo
0
kapacitou (Ic). Jednotlivé dílčí proudy závisí různým způsobem na rychlosti polarizace v, což je jeden ze základních předpokladů, který byl využit teorií EVLS pro eliminaci zvoleného proudu (případně pro eliminaci více zvolených proudů). Parciální proudy z hlediska EVLS Jednotlivé parciální proudy vykazují závislost jednak na potenciálu a jednak na rychlosti polarizace v. Funkční vyjádření lze je pro většinu případů psát ve tvaru součinu dvou na sobě nezávislých funkcí (2), Y j (E ) a W j (v) , kde Y j (E ) je funkce potenciálová a W j (v ) funkce
rychlosti polarizace. I j = Y j ( E ) W j (v )
(2)
Pokud je tvar rovnice (2) aplikován pro jednotlivé parciální proudy, pak dostaneme: I d = Yd ( E ) v 1 / 2
(3)
I k = Yk ( E ) v 0
(4)
I c = Yc ( E ) v 1
(5)
Základním předpokladem, ze kterého EVLS vychází, je platnost rovnice (1) a (2). Na základě těchto rovnic a rovnic (3-5) je možno pro měření při různých rychlostech polarizace v sestrojit lineární kombinaci proudů I(vi) z těchto měření (rovnice 6). Výsledkem je proudová funkce f(I), ve které je vliv (k-1) parciálních proudů potlačen (eliminován), ostatní dílčí proudy jsou buďto zkresleny nebo si zachovávají svou skutečnou hodnotu. n
f ( I ) = ∑ a i I (v i )
(6)
i =1
O tom, který z dílčích proudů bude eliminován, zkreslen, či zachován rozhodují koeficienty lineární kombinace ai. Hodnoty těchto koeficientů pro jednotlivé typy eliminace lze odvodit. Následuje příklad takovéhoto odvození pro eliminaci kinetického a kapacitního proudu se zachováním proudu difúzníhoního. Je-li požadována eliminace dvou proudů, je nutné mít k dispozici měření při třech různých rychlostech polarizace. Mohou se například zvolit rychlosti v/4, v, 4v, (v je nazývána rychlostí referenční), změří se tedy proudy Iv/4 , Iv, I4v, a Iv je proud referenční, ke kterému jsou všechny celkové proudy vztaženy. Potom lze na základě vztahů (1-5) můžeme sestavit soustavu rovnic (7):
1
Iv/4 = Yr(E)(1/2)v1/2 + Yk(E)vo + Yc(E)(1/4)v1 Iv = Yd(E)v1/2 + Yk(E)vo + Yc(E)v1 I4v = Yr(E)2v1/2 + Yk(E)vo + Yc(E)4v1
/ . a2 / . a1
(7)
/ . a3
Hledané hodnoty koeficientů a1, a2, a3 musí splňovat podmínku, aby po roznásobení a součtu soustavy rovnic (8) byl výsledek ve tvaru a1Iv + a2Iv/4 + a3I4v = Yr(E)v1/2 + 0 + 0.
(8)
To nastane tehdy, pokud budou platit následující vztahy: a1 + (1/2)a2 + 2a3 = 1 a1 + a2 + a3 = 0
(9)
a1 + (1/4)a2 + 4a3 = 0 Řešením této soustavy rovnic jsou hodnoty a1 = 5, a2 = -4, a3 = -1. Výsledný tvar lineární kombinace tedy je: f(I) = 5Iv - 4Iv/4 - I4v
(10)
Ve výsledné proudové funkci jsou eliminovány složky kinetického a kapacitního proudu, stejně tak první člen rozvoje proudu ireverzibilního. Proud reverzibilní si zachovává svou velikost, a případné ostatní proudy odpovídající neuvažovaným minoritním procesům jsou určitým způsobem zkresleny. Na základě těchto výpočtů bylo odvozeno celkem šest typů lineárních kombinací, které ve výsledku poskytují šest proudových funkcí (eliminací), ve kterých jsou eliminovány, zachovány nebo zkresleny zvolené parciální proudy: 1. eliminace kinetického proudu (Ik) se zachováním proudu reverzibilního (Ir) f(Ik)= 0
f(Ir) = Ir
f(I) = 3.4142 Iv - 3.4142 Iv/2
(11)
2. eliminace kapacitního proudu (Ic) se zachováním Ir f(Ic) = 0
f(Ir) = Ir
f(I) = 4.8284 Iv/2 - 2.4142 Iv
(12)
3. eliminace Ir se zachováním Ik f(Ir) = 0
f(Ik) = Ik
f(I) = 3.4142 Iv/2 - 2.4142 Iv
(13)
2
4. eliminace Ik a Ic se zachováním Ir f(Ik) = 0
f(Ic) = 0
f(Ir) = Ir
f(I) = 17.485 Iv - 11.657 Iv/2 - 5.8284 I2v
(14)
5. eliminace Ir a Ic se zachováním Ik f(Ir) = 0
f(Ic) = 0
f(Ik) = Ik
f(I) = 2.4142 I2v + 6.8284 Iv/2 - 8.2426 Iv
(15)
6. eliminace Ik a Ir se zachováním Ic f(Ik) = 0
f(Ir) = 0
f(Ic) = Ic
f(I) = 3.4142 I2v + 4.8284 Iv/2 - 8.2426 Iv
(16)
Jak již bylo naznačeno výše, eliminace proudu kinetického Ik má za následek i eliminaci prvního členu rozvoje proudu ireverzibilního Iir (rovnice 14) a naopak, eliminace Iir má za následek eliminaci Ik . Tab. II: Přehled eliminací
Číslo eliminace 1. 2. 3. 4. 5. 6.
zachová se
Eliminuje se
i(r)+i(c) i(r)+i(k) i(k)+i(c) i(r) i(k) i(c)
i(k) i(c) i(r) i(k)+i(c) i(r)+i(c) i(r)+i(k)
Pro vyhodnocování průběhů eliminačních křivek je výhodné zavedení eliminačního proudového koeficientu (b). Tento koeficient je dán vztahem (17) a na obr. 1 je vynesena jeho závislost na rychlostním koeficientu x. Pomocí této závislosti byly posuzovány tvary křivek získaných eliminačních voltametrií. V grafu jsou vyznačeny oblasti třech základních typů proudů a dá se pozorovat průběh křivek v dané oblasti.
b=
f (I ) I
3
(17)
4 3
4
4
1
3
2 1
β
2
0
5
6
-1 3
1
-2
6
5
-3
2
Ik
Id
Ic
0
0,5
1
-4 -5 -0,5
1,5
x Obr. 1. Závislost eliminačního proudového koeficientu na rychlostním koeficientu Elektrochemická měření (Linear sweep voltammetry – LSV) byla prováděna na analyzátoru AUTOLAB 20 firmy EcoChemie z Holandska ve spojení se zařízením pro rtuťovou visící kapkovou elektrodu (VA-Stand 663 firmy Metrohm ze Švýcarska). Tříelektrodový systém se skládal z rtuťové pracovní elektrody, z Ag/AgCl/3M KCl referenční elektrody a platinové pomocné elektrody. Potenciálový rozsah byl od –1.0 V do –1.75 V, step 2 mV a rychlosti polarizace 50, 100, 200 a 400 mV/s. Ostatní parametry, jako rychlost míchání, akumulační čas a akumulační potenciál byly optimalizovány. Zásobní roztoky ODNs byly připraveny z lyofilizovaných syntetických vzorků (Thermo, Electron Corporation, Německo) a jejich koncentrace v roztoku byla stanovena pomocí UV/Vis spektrometru (UV 4, Spectronic Unicam, Cambridge z Velké Británie). pH elektrolytů bylo měřeno přístrojem Sentron s ISFETovou elektrodou. Pro měření a zpracování dat bylo využito softwaru GPES 4.8. K výpočtu eliminačních funkcí byly voltmetrické křivky exportovány a zpracovány v Excelu. Úkol Stanovte detekční limity (LOD limit of detection) adeninu a cytosinu ve směsi a) metodou EVLS, b) metodou konfidenčních elips
4
Potřeby a chemikálie Autolab se stojanem na elektrodový systém (VA Stand), PC, mikropipety, měřící nádobka na malé objemy roztoku, Adenin, cytosin, fosfatový pufr (hydrogenfosforečnan sodný a dihydrogenfosforečnan sodný) Pracovní postup Připravíme si fosfátový pufr o určitém pH (určí asistent). Zapneme přístroj, zpustíme program GPES, nastavíme výchozí podmínky viz návod u přístroje. Do měřící nádobky napipetujeme 2 ml pufru. Roztok necháme důkladně probublat argonem na začátku až 5 minut, aby byl odstraněn kyslík. Několikrát po sobě změříme tento základní elektrolyt, pokud se při tomto měření objeví nějaké píky je elektrolyt znečištěn a musíme ho vyměnit, měřící nádobku důkladně vyčistit a celé měření opakovat. Pokud je elektrolyt čistý přidáme 10 µl připraveného adeninu, necháme opět důkladně probublat a změříme. Měření se provádí při třech rychlostech polarizace při 100, 200 a 400 mV/s. Do vyčištěné a suché měřící nádobky opět napipetujeme 2 ml pufru pokračujeme stejným způsobem (pokud je elektrolyt čistý) přidáme 10 µl připraveného cytosinu, necháme opět důkladně probublat a změříme při třech rychlostech polarizace. Nakonec totéž opakujeme se směsí adenin a cytosin. U této směsi uděláme pět přídavků. Protokol 1. Krátká teorie o eliminační voltametrii EVLS 2. Graf závislosti velikosti signálu na koncentraci (kalibrační závislost) 3. Z naměřených kalibrační závislosti vypočítejte limitu detekce a) metodou EVLS – přiložte grafy vytvořené programem EVLS b) metodou konfidenčních elips (návod bude dodán) – přiložte grafy konfidenčních elips 4. Závěr a diskuse nad výsledky Literatura 1. Dračka, O., Theory of current elimination in linear scan voltammetry. J. Electroanal. Chem., 1996. 402: p. 19-28. 2. Trnková, L. and O. Dračka, Elimination voltammetry. Experimental verification and extension of theoretical results. J. Electroanal. Chem., 1996. 413: p. 123-129. 3. Trnková, L., Elektrochemické eliminační metody. Chem. Listy, 2001. 95: p. 518-527. 4. Trnkova, L., Identification of current nature by elimination voltammetry with linear scan. J. Electroanal. Chem., 2005. 582(1-2): p. 258-266. 5. Zýka, J. and a. kol., Analytická příručka, díl I a II. 1988: SNTL Praha. 6. Brett, C.M.A. and A.M.O. Brett, Electroanalysis. 1998: Oxford Univ. Pr. Published. 7. Bard, A.J. and R.L. Faulkner, Electrochemical methods. Fundamentals and applications. 1980: John Wiley and Sons. 8. Scholz, F., Electroanalytical methods. 2002, Germany: Springer. 9. Wang, J., Analytical Electrochemistry, 2nd ed. 2000: John Wiley & Sons,
5
