Stanovení PNH klonů průtokovou cytometrií

Stanovení PNH klonů průtokovou cytometrií

Iuri Marinov, ÚHKT, Praha Motolský minikurz - Praha, 2015

Paroxysmální noční hemoglobinurie (PNH)vzácné onemocnění s život ohrožujícími komplikacemi Přežití po stanovení diagnózy (1)

100

 2-6 případů/milion/ročně (3)

80

Kontrolní skupina (věk / pohlaví)

 Úmrtnost do 5 let: 35% (1)

 Nízká kvalita života (1,6)

Přežití (%)

 Výskyt u všech věkových skupin (med=30 let) (4,5)

60 40 Nemocní s PNH

20

 Progrese onemocnění (1,2) 0 0

5

10

15

20

25

Roky (1) Hillmen P et al. NEJM 1995; 333:1253-8; (2) Parker C et al. Blood 2005;106(12):3699-709; (3) Hill A et al. Blood 2006;108:985; (4) Moyo VM et al. BJH 2004;126:133-38; (5) Nishimura J et al. Med 2004;83:193–207; (6) Socié G et al. Lancet 1996;348:573-7; (7) Peffault de Latour R et al. Blood 2008;112(8):3099-106.

PNH- patofyziologie • Somatická mutace v genu pig-a, který kóduje protein nezbytný pro iniciální fázi syntézy GPI-kotvy 1,2 • Částečný nebo kompletní deficit GPI-kotvených proteinů

CD59

GPI kotva

CD55

1. McKeage K. Drugs. 2011;71(17):2327-2345. Adapté de : Johnson RJ et al. J Clin Pathol: Mol Pathol. 2002;55:145-152. 2. Brodsky R. Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria. dans : Hematology - Basic Principles and Practices. 4th ed. R Hoffman; EJ Benz; S Shattil et al. eds. Philadelphie, PA: Elsevier Churchill Livingstone; 2005;419-427.

PNH- patogeneze Absence povrchových antigenů CD55 a CD59 vede k deficitu inhibičních systémů aktivovaného komplementu

Expanze PNH klonu1 1 etapa

2 etapa

3 etapa

Somatická mutace v genu PIG-A

Imunitní ataka proti GPI kotveným proteinům

Selekce, růst, expanze PNH klonu

1. Adaptováno od Inoue N et al. Int J Hematol. 2003;77:107-112.

Chronická hemolýza – hlavní příčina klinických komplikací a úmrtnosti Trombóza Renální insuficience Plicní hypertenze

Vliv na celkové přežití

Mezenteriální trombóza Aktivace komplementu

Dyspnoe Dysfagie

Volný hemoglobin/Anémie

Únava Hemoglobinurie

NO↓ (oxid dusnatý)

Vliv na kvalitu života

Nevýkonnost

1. International PNH Interest Group. Blood. 2005;106:3699-3709. 2. Brodsky R. Hematology - Basic Principles and Practices. 4th ed. 2005;419-427. 3. Rother RP et al. JAMA. 2005;293:1653-1662. 4. Socie G et al. Lancet. 1996;348:573-577. 5. Hill A et al. Br J Haematol. 2007;137:181-192. 6. Lee JW et al. Hematologica. 2010;95(s2): Abstract #505 and 506. 7. Hill A et al. Br J Haematol. 2010; May;149(3):414-425. 8. Hillmen P et al. Am J Hematol. 2010;85: 553-559.

Proč provádět PNH screening • 35% pacientů umírá v rámci 5 let i přes podpůrnou terapii

• Časný záchyt ovlivňuje terapeutickou strategii a úspěšnost léčby u PNH s aplazií kostní dřeně • Přítomnost PNH klonů u PNH s aplazií KD předpovídá odpověď na imunosupresivní terapii • Může dojit k nárůstu malých PNH klonů • V současné době existuje efektivní terapie (1) Hillmen P et al. NEJM 1995; 333:1253-8; (2) Sugimori C et al. Blood 2006;107:1306-1314

Průtoková cytometrie - časová osa • Od r. 1990 - implementace FCM

• Od r. 1996 - metoda volby pro stanovení PNH klonů

• Od r. 2010 - ICCS guidelines • Od r. 2012 - Practical guidelines: podklad pro standardizaci • Od r. 2013 - Harmonizace a Standardizace • Od r. 2014 - Nové techniky

Validace PNH vyšetření • Pre-analytické požadavky - požadavky na vzorek (odběr, skladování, doprava…) - požadavky na reagencie (selekce klonů, titrace MoAb, výběr vhodných kontrol)

• Analytické požadavky - linearita a preciznost hodnot relativní fluorescence - rozlišení slabě positivních populací - reprodukovatelnost výsledků měření - reprodukovatelnost výsledků v čase a sérii v jednotlivých a mezi jednotlivými laboratořemi (harmonizace, standardizace)

• Post-analytické požadavky - přesnost: porovnávání k očekávaným výsledkům - specifičnost: série měření ve vztahu k referenční metodě - citlivost: schopnost odlišit abnormální populaci od normálních populací - opakovatelnost (v sérii) mezilehlá preciznost (mezi sériemi) - odhad nejistoty výsledků měření (alespoň formou mezilehlé preciznosti)

Pre-analytické požadavkypožadavky na vzorek Materiál

Periferní krev

Antikoagulační činidlo

EDTA nebo heparin

Množství

1-3 mL

Stabilita vzorku

≤ 7 dní pro Ery, ≤ 48 h pro Leuko

Skladování

4oC po 24 h

Lyzační činidlo

• Ery - neprovádí • Komerční lyzační roztok, NH4Cl

Cílové populace

• • • •

Ery Granulocty Monocyty pro konfirmaci Lymfocyty nevyšetřujeme

1. Borowitz et al.;Cytometry 2010;178B;211-230. 2. Sutherland et al. ;Cytometry 2012; 82B;195-208. 3. Marinov et al.;Cytometry 2013;84B;229-236.. 4. Sutherland et al. Cytometry 2014:. 5. Marinov et al.;IJLH:2014 accepted

Doporučené reagencie pro analýzu PNH Ery 2 barevný test: CD235a-FITC / CD59-PE

• CD235a optimální pro gate na Ery • CD235a způsobuje agregaci Ery (nutná titrace) • FITC je preferovaný fluorochrom

• CD59 vykazuje lepší signal:noise poměr • PE je preferovaný fluorochrom pro CD59 • CD55 se nedoporučuje - slabá intenzita signálu (nízká epitopová denzita) - špatné rozlišení PNH Erytrocytů typu II a III

1. Borowitz et al.;Cytometry 2010;178B;211-230. 2. Sutherland et al. ;Cytometry 2012; 82B;195-208.

Doporučené reagencie pro analýzu PNH Leuko Reagencie Buňky

1

2

3

4

4 barevný

G

FLAER

CD24

CD15

CD45

4 barevný

M

FLAER

CD14

4 barevný

G+M

FLAER

CD24

CD14

CD33

5 barevný

G+M

FLAER

CD24

CD14

CD15

5 barevný

G+M

FLAER

CD24

CD14

CD15 CD64/33

5 barevný

G+M

FLAER

CD157

CD15

CD45

CD64

6 barevný

G+M

FLAER

CD24

CD14

CD15

CD45

CD64

6 barevný

G+M

FLAER

CD24

CD14

CD15

CD45

CD33

GPI- reagencie Reagencie na gate 1. Borowitz et al.;Cytometry 2010;178B;211-230. 2. Sutherland et al. ;Cytometry 2012; 82B;195-208.

5

6

CD64 (33) CD45

CD45

Doporučené klony pro PNH Leuko Cílová populace

Ery

Leuko

MP / Fluorochrom (BD/BC)

Význam

Becton Dickinson

Beckman Coulter

CD59 (PE/PE)

GPI-kotvený

MEM-43 OV9A2

MEM-43 OV9A2

CD235a (FITC/FITC)

Gate na Ery

KC16 JC159

KC16 JC159

CD15 (APC/PC5)

Gate na Gr

H198

80H5

CD15 (eFluor450)

Gate na Gr

MMA

MMA

FLAER

GPI-kotvený

NA

NA

CD24 (PE/PE)

GPI-kotvený

SN3 ML5

SN3 ALB9

CD64 (APC/PC5)

Gate na Mo

10.1

22

CD14 (PE/PE)

GPI-kotvený

61D3 MφP9

61D3 RMO52

CD157 (PE/PE)

GPI-kotvený

SY11B5

SY11B5

CD45 (PerCPCy5.5/PC7

Vyloučení debris

2D1

J33

Sutherland et al.; Cytometry; 2012; 82B:195-208

Pre-analytické požadavkypožadavky na reagencie Titrace monoklonálních protilátek

Snížení množství

Sériové ředění

Analytické požadavky • Linearita a preciznost hodnot relativní fluorescence • Rozlišení slabě positivních populací • Reprodukovatelnost výsledků měření • Reprodukovatelnost výsledků v čase a sérii v jednotlivých a mezi jednotlivými laboratořemi

Analytické požadavky Plně automatizovaný proces pro digitální přístroje: • Baseline setting (1-2 krát do roka, kdykoliv po údržbě): 10-15 min - kontrola linearity - kontrola citlivosti - nastavení PMT voltage - nastavení optického pozadí - optimalizace elektronického šumu - nastavení cílových hodnot fluorescenční intenzity pro optimální rozlišení - nastavení časové prodlevy laserů (BD přístroje)

• Performance check (denně): 5 min - stanovuje a koriguje odchylky od základního (baseline) nastavení

Analytické požadavky • Nastavení pro specifickou aplikaci (application setting): - area scaling (korekce hodnot pro FS-area a FS-height ) - optimalizace PMT signálů - digitální korekce spektrálního přísvitu

• PNH- kontrola nastavení cytometru „na lymfocytech“

B-ly

PNH Ly

Ba T-ly

Post analytické požadavky • Přesnost - shoda mezi průměrnými hodnotami získanými z velkého počtu měření a příslušnou referenční hodnotou - není aplikovatelná pro FCM testy (chybí referenční materiál)

• Specifičnost - analytická specifičnost (MP) - klinická specifičnost: testování série vzorků a hodnocení abnormality ve srovnání s příslušnou referenční metodou (série měření ve vztahu k referenční metodě)

• Citlivost - schopnost odlišit abnormální populaci od normálních populací - diluční testy

1. Barnett et al.; Cytometry 2013; 84B; 309-314 1. Wood et al.;Cytometry 2013;84B;315-323

Post analytické požadavky • Nepřesnost 1,2 - opakovatelnost: > 5 vzorků připravit a 3 krát změřit v jednom pracovním cyklu. CV <10% (<20% pro populace < 0.1%) - mezilehlá preciznost: > 5 vzorků 3 krát připravit a 3 krát změřit v samostatných pracovních cyklech (restart a re-kalibrace přístroje). CV <10% (<20% pro populace < 0.1%)

• Účast v cyklech EKK a/nebo MLP 3

1. Barnett et al.;Cytometry 2013; 84B; 309-314 2. Wood et al.;Cytometry 2013;84B;315-323. , 3. Marinov et al.;Cytometry 2013;84B;229-236.

Post analytické požadavky • Hlášení výsledků - velikost PNH klonů v Ery, Gr a Mo populacích - vždy uvádět aktuální citlivost vyšetření (LOD) - používat správnou terminologii

> 1%

PNH clone

0.1-1%

Minor PNH clone

≤ 0.1%

Rare cells with GPI deficiency

PNH Ery: 2 barevný test • Periferní krev (EDTA) vždy ředit 1:100 • 50-100 µl výchozího ředění na test • Přidáváme příslušné množství titrovaných CD59-PE a CD235a-FITC

• Inkubujeme ve tmě při pokojové teplotě cca 20 minut • Nutno promýt v PBS • Nastavení objemu na 0.5-1ml (PBS) • Důkladně protřepat !!! (< 2% agregátů) • Akvizice na průtokovém cytometru

PNH Ery- ruční nastavení cytometru

Nastavení Light scatter and PMT • Optimalizace FS a SS neznačených Ery v Log : Log scatter plotu • Gate na singlety • Vynulovat kompenzační nastavení

• Nastavit PMT pro FL-1 a FL-2 pro optimální zobrazení Ery


• Akvizice CD59 značených Ery a nastavit FL1 – Fl2 kompenzace

• Akvizice CD235 značených Ery a nastavit FL2 – FL1 kompenzace


• Akvizice CD235a a CD59 značených Ery a stanovit umístění normálních Ery ( typ I) • Akvizice vyšetřovaného vzorku

PNH Ery- automatické nastavení cytometru • Korekce signálů pro FS-area a FS-height

• Nastavení PMT (> 2,5 rSD z baseline) • Digitální kompenzace spektrálního přísvitu

PNH Ery

Nefiltrované PBS !!!

PNH Ery

Poorly stained normal RBC

Courtesy of A. Illingworth

Hodnocení z dot plot, z histogramu méně přínosné

PNH Ery-výkonnostní charakteristiky

Clone

PNH clone

N*

Min.

Max.

Mean

SD

CV (%)

>20%

RBC II+III

3/10

33.2/32.3 33.6/33.6 33.5/32.8 0.2/0.4

0.5/1.2

1-20%

RBC II+III

3/10

11.8/2.5

11.8/3

11.8/2.8

0.1/0.1

0.6/5.3

<1%

RBC II+ III

3/10

0.4/0.4

0.4/0.4

0.4/0.4

0.0/0.0

4.1/6.1

size

* Opakovatelnost v sérii / mezilehlá preciznost Marinov et al.;Clin HemLab Med, 2013; 51: 2133-2139 Marinov et al.;ClinLab, 2014;60:;217-224.

PNH Ery-mezilaboratorní opakovatelnost v sérii PNH Ery type III (big clone)-precision analysis PNH Ery type III (small clone)-precision analysis PNH Ery type III (minor clone)-precision analysis 14

> 20% Ref. Center center 1 1. 46,87 47,85 2. 46,38 48,37 3. 47,02 48,14 Mean 46,76 48,12 SD 0,27 0,21 CV 0,58 0,44

Center 3 49,28 48,65 48,71 48,88 0,28 0,58

Center 4 49,84 48,58 47,76 48,73 0,86 1,76

5%20% 1. 2. 3. Mean SD CV

Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B; 229-236

4 C

en

te r

3 en

te r

2

R

C

.c

te r

en te

r

4 Ce

nt er

3 Ce

nt er

2 Ce

nt er

1 nt er

ce f.

C

Re

Center 2 47,71 47,70 47,38 47,60 0,15 0,32

Ce

nt er

r4 en

te

r3 C

en

te

r2 te C

en

te en C

R

ef

.c

en

te r

r1

8

en

9

C

10

te r

11

en

12

C

13

1

0.75 0.70 0.65 0.60 0.55 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10

ef

53 52 51 50 49 48 47 46 45 44 43

Ref. center 10,10 9,96 10,24 10,10 0,11 1,13

Center Center 1 2 11,16 10,45 10,77 10,59 10,86 10,39 10,93 10,48 0,17 0,08 1,53 0,80

Center Center 3 4 11,48 9,91 11,72 9,95 11,45 10,44 11,55 10,10 0,12 0,24 1,05 0,24

< 1% 1. 2. 3. Mean SD CV

Ref. center 0,44 0,39 0,42 0,42 0,02 4,93

Center Center 1 2 0,37 0,40 0,39 0,41 0,47 0,42 0,41 0,41 0,04 0,01 10,54 1,99

Center Center 3 4 0,48 0,40 0,49 0,42 0,44 0,38 0,47 0,40 0,02 0,02 4,60 4,08

PNH Ery-mezilaboratorní mezilehlá preciznost PNH Ery type III (minor clone)-reproducibility

PNH Ery type III (big clone)- reproducibility

0.8

60 55

0.6

50 0.4

45 0.2

40

4 C

en

te r

3 C

en

te r

2 te r en

R

C

te r C

.c ef

en C

en

en te

4 te r

3 C

en

te r

2 te r en C

te r en

R

ef

C

.c

en te

r

1

r

1

0.0

35

Ref. Center > 20% Center 1

Center 2

Center 3

Center 4

5%20%

Ref. Center

Center 1

Center 4

< 1%

1.

46,12

48,56

49,06

51,34

48,85

1.

10,27

11,59

11,01

10,97

10,59

1.

0,45

0,42

0,44

0,47

0,46

2.

47,64

47,96

48,58

50,71

48,95

2.

10,69

11,27

10,88

12,49

10,76

2.

0,42

0,44

0,44

0,44

0,46

3.

48,10

48,61

47,66

49,98

49,49

3.

10,67

11,07

10,83

11,50

10,86

3.

0,48

0,42

0,45

0,50

0,43

4.

47,58

47,93

46,95

50,65

48,97

4.

10,11

11,34

10,97

11,44

10,99

4.

0,44

0,44

0,45

0,48

0,40

5.

46,73

47,76

46,86

50,42

49,27

5.

9,97

11,12

10,49

11,30

10,86

5.

0,39

0,38

0,41

0,43

0,36

Mean

47,23

48,16

47,82

50,62

49,11

Mean

10,34

11,28

10,84

11,54

10,81

Mean

0,44

0,42

0,44

0,46

0,42

SD

0,71

0,35

0,87

0,44

0,24

SD

0,29

0,18

0,18

0,51

0,13

SD

0,03

0,02

0,01

0,03

0,04

CV

1,51

0,73

1,83

0,87

0,48

CV

2,82

1,63

1,70

4,41

1,23

CV

6,90

5,22

3,36

5,55

9,04


Center Center 2 3

Ref. Center Center Center Center Center 1 2 3 4

PNH Ery- lineární regrese Ref. center vs center 1 (RBC)

Ref. center vs center 2 (RBC)

60

60

y = 1,0227x R² = 0,9999

50

y = 1,0092x R² = 1

50

40

40

30

30

20

20

10

10

0 0

10

20

30

40

50

60

0 0

Pearson r: 1.0000

30

40

50

60

Ref. center vs center 4 (RBC)

60 60

y = 1,0387x R² = 0,9997

40

20

Pearson r: 1.0000

Ref. center vs center 3 (RBC) 50

10

y = 1,0157x R² = 1

50

40

30

30

20

20 10 10 0 0

10

20

30

40

50

60

0 0

Pearson r: 0.9999

10

20

Pearson r: 1.0000


30

40

50

60

PNH Ery- Bland Altmann

Wilcoxon rank test: P= 0,08 (> 0.05)





PNH Leuko  50-100 µl periferní krev (EDTA)  Příslušné množství titrovaných MP  Inkubace ve tmě a pokojové teplotě 30 minut  Lyzace erytrocytů (Immunoprep, Optilyse, FACS Lyse, NH4Cl..)  1 promytí v PBA  Nastavení objemu na 0.5-1ml (PBA)

 Akvizice na průtokovém cytometru

PNH Leuko – 4 barevný protokol • Beckman Coulter Gr

FLAER-Alexa Fluor 488

CD24-PE (SN3,ALB9)

CD15-PC5 (80H5)

CD45-PC7 (J33)

Mo


CD14-PE (61D3,RMO52)

CD64-PC5 (22)

CD45-PC7 (J33)

• Becton Dickinson Gr


CD24-PE (SN3,ML5)

CD15-APC (H198)

CD45-PerCP-C5.5 (2D1)

Mo


CD14-PE (61D3,MφP9)

CD64-APC (10.1)


Sutherland et al.; Cytometry; 2012; 82B:195-208

PNH Leuko - manuální nastavení cytometru (4 barevný test) Nastavení PMT signálů 1. Gr + GPI + MP na gate: umístění normálních Gr

2. Gr + MP na gate: umístění PNH Gr

3. Akvizice vyšetřovacího vzorku

PNH Leuko-nastavení cytometru (≥ 5 barev) Application settings • Korekce hodnot pro FS-Area a FS-Height (area scaling)

PNH Leuko analýza - nastavení cytometru (≥ 5 colors) • Nastavení optimálních PMT signálů (>2,5 rSD z nastavení baseline)

PNH Leuko analýza - nastavení cytometru (≥ 5 colors) Digitální kompenzace spektrálního přísvitu

Zobrazení PNH Granulocytů

Zobrazení PNH Monocytů

PNH Leuko -výkonnostní charakteristiky (4 barevný test) Clone size PNH clone

Gr > 20%

Mo

Gr 1-20%

Mo

< 1%

Gr

Protocol

N

Min.

Max.

Mean

SD

CV (%)

4-color

3/10

99.4/98.2

99.5/99

99.4/98.5

0.1/0.3

0.1/0.3

5-color

3/10

99.4/98.9

99.4/99.2

99.4/99.1

0.01/0.1

0.01/0.1

6-color

3/10

99.5/98.4

99.6/98.7

99.5/98.5

0.03/0.1

0.03/0.1

4-color

3/10

99.5/99.3

99.8/99.6

99.6/99.5

0.1/0.1

0.1/0.1

5-color

3/10

99.3/99.3

99.5/99.5

99.4/99.4

0.1/0.1

0.1/0.1

6-color

3/10

99.4/98.8

99.9/99.1

99.8/99

0.3/ 0.2

0.3/0.2

4-color

3/10

12.5/11.7

12.8/12.9

12.7/12.2

0.1/0.4

0.9/3.6

5-color

3/10

12.3/12.2

12.4/12.5

12.3/12.4

0.1/0.2

0.7/1.7

6-color

3/10

12.5/11.8

12.7/12.3

12.6/12

0.1/0.2

0.8/1.5

4-color

3/10

9.9/15.3

10.5/16.7

10.1/15.9

0.3/.1

2.6/3.1

5-color

3/10

9.6/15.7

10.4/21.4

10.1/17.7

0.4/1.9

3.9/10.9

6-color

3/10

10.1/15.4

10.3/2

10.2/18.4

0.1/2.1

0.9/11.6

4-color

3/10

0.5/0.5

0.5/0.6

0.5/0.5

0.0/0.0

2.6/3.1

5-color

3/10

0.5/0.5

0.5/0.5

0.5/0.5

0/0.02

1/2.9

6-color

3/10

0.5/0.5

0.5/0.5

0.5/0.5

0/0.01

0.9/2.9

Marinov et al.;Clin HemLab Med, 2013; 51: 2133-2139 Marinov et al.;ClinLab, 2014;60:;217-224.

Lineární regrese – Bland Altmann (Gra)


Lineární regrese – Bland Altmann (Mo)


PNH Gr: mezilaboratorní opakovatelnost v sérii PNH Gr (big clone)-precision analysis 103 102 101 100 99 98 97 96 95 94 93

PNH Gr (small clone)-precision analysis

PNH Gr (minor clone)-precision analysis

9 1.00

8 0.75

7

0.50

6

0.25

4 C

en

te r

3 C

en

te r

2 te r en C

te r C

.c

Ref. center 0,64 0,64 0,59 0,62 0,02 3,78

R

ef

en C

en

en te

4 te r

3 C

en

te r

2 C

en

te r

1 te r en C

en te ef .c

< 1% 1. 2. 3. Mean SD CV

R

> 20% Ref. Center center 1 1. 99,66 98,31 2. 99,64 98,64 3. 99,65 98,57 Mean SD CV

r

4 C

en te r

3 C

en te r

2 C

en te r

1 en te r C

R

ef

.c

en te r

r

1

0.00

5

99,65 0,01 0,01

98,51 0,14 0,14

Center 2 99,74 99,72 99,73

Center 3 99,73 99,65 99,71

Center 4 99,60 99,63 99,23

99,73 0,01 0,01

99,70 0,03 0,03

99,49 0,18 0,18

5%20% 1. 2. 3. Mean SD CV


Ref. center 6,73 6,84 6,76 6,78 0,05 0,69

Center Center 1 2 6,56 6,53 6,67 6,47 6,85 6,69 6,69 0,12 1,79

6,56 0,09 1,41

Center Center 3 4 6,32 8,10 6,21 7,95 6,29 7,79 6,27 0,05 0,74

7,95 0,13 1,59

Center Center 1 2 0,53 0,51 0,51 0,72 0,50 0,56 0,51 0,60 0,01 0,09 2,43 15,01

Center Center 3 4 0,53 0,26 0,58 0,22 0,51 0,26 0,54 0,25 0,03 0,02 5,45 7,64

PNH Mo: mezilaboratorní opakovatelnost v sérii PNH Mo (big clone)-precision analysis 103 102 101 100 99 98 97 96 95 94 93

PNH Mo (small clone)-precision analysis 12

PNH Mo (minor clone)-precision analysis 1.45

11

1.20 10

0.95

8

0.70

7

0.45

6

0.20

4 C

en

te r

3 C

en

te r

2 C

en

te r

1 te r en

.c ef

C

R

C

en te r

4 en

te r

3 C

en

te r

2 te r C

en

te r en C

R

ef .c

en te

r

1

4 C

en te r

3 C

en te r

2 en te r C

en te r C

R ef

.c

en te

r

1

9

> 20% Ref. Center center 1 1. 99,65 95,29 2. 99,66 96,41 3. 99,70 95,77 Mean 99,67 95,82 SD 0,02 0,46 CV 0,02 0,48

Center 2 99,27 99,06 99,22 99,18 0,09 0,09

Center 3 98,95 98,18 98,35 98,49 0,33 0,34

Center 4 99,28 99,33 99,54 99,38 0,11 0,11

5%20% 1. 2. 3. Mean SD CV


Ref. center 8,89 8,91 8,90 8,90 0,01 0,09

Center Center 1 2 8,42 9,64 8,72 10,10 9,32 9,80 8,82 9,85 0,37 0,19 4,24 1,94

Center Center 3 4 8,44 9,77 8,58 8,98 8,55 9,01 8,52 9,25 0,06 0,37 0,71 3,95

< 1% 1. 2. 3. Mean SD CV

Ref. center 0,70 0,65 0,73 0,69 0,03 4,76

Center Center 1 2 0,79 0,88 0,81 1,01 0,78 1,24 0,79 1,04 0, 01 0,15 1, 57 14,27

Center Center 3 4 0,93 1,24 0,93 1,23 0,97 1,12 0,94 1,20 0,02 0,05 2,00 4,54

PNH Gr: mezilaboratorní mezilehlá preciznost PNH Gr (small clone)-reproducibility

PNH Gr (big clone)-reproducibility

PNH Gr (minor clone) - reproducibility

102

10 101

9

100

8

99

7

1.00 0.75 0.50

6 98

5

4 C

en te r

3 C

en te r

2 C

en te r

1 C

.c R

ef

C

en te r

en te

r

4 en te r

3 C

en te r

2 en te r C

en te r C

en te r .c R ef

1

0.00

te r en C

te r en C

te r en C

C

en

te r

r en te .c ef R


0.25

4

3

3

96

2

4

1

97

Center 2

Center 3

Center 4

5%20%

Ref. Center

Center 1

Center Center 2 3

Center 4

< 1%


1.

99,67

99,22

99,76

99,63

99,65

1.

6,58

6,23

6,23

5,30

7,78

1.

0,56

0,46

0,63

0,49

0,26

2.

99,71

98,74

99,70

99,25

99,69

2.

6,35

6,86

6,28

5,63

7,90

2.

0,66

0,54

0,55

0,54

0,23

3.

99,72

98,97

99,73

99,45

99,66

3.

6,47

6,84

6,29

5,41

8,19

3.

0,67

0,44

0,63

0,53

0,24

4.

99,74

98,87

99,67

99,34

99,70

4.

6,41

6,59

6,17

5,99

8,23

4.

0,59

0,48

0,53

0,55

0,19

5.

99,76

98,35

99,78

99,54

99,68

5.

6,61

6,63

6,71

6,06

8,15

5.

0,67

0,49

0,57

0,52

0,25

Mean

99,72

98,83

99,73

99,44

99,68

Mean

6,48

6,63

6,34

5,68

8,05

Mean

0,63

0,48

0,58

0,53

0,23

SD

0,03

0,29

0,04

0,14

0,02

SD

0,10

0,23

0,19

0,53

0,18

SD

0,05

0,03

0,04

0,02

0,02

CV

0,03

0,29

0,04

0,14

0,02

CV

1,52

3,43

3,03

5,34

2,20

CV

7,31

6,99

7,08

3,91

10,33


PNH Mo: mezilaboratorní mezilehlá preciznost

4 C

en

te r

3 C

en

te r

2 te r en C

C

en

te r

r en te R

ef

Center Center 2 3

.c

en te r

C

Center 1

R ef

C

C

en te r

C

en te r

en te r .c

en

Ref. Center

C

5%20%

C

Center 4

1

0.2

4

5

3

0.7

2

7

1

1.2

4

9

te r

3 en

te r

2 te r en

1.7

Center 3

C

te r en


PNH Mo (minor clone) - reproducibility

11

Center 2

R

ef

C

.c

en te

r

1

103 102 101 100 99 98 97 96 95 94 93

PNH Mo (small clone) - reproducibility

en te r

PNH Mo (big clone)- reproducibility

Center 4

< 1%


1.

99,58

96,31

99,09

98,86

99,57

1.

7,75

9,29

9,97

8,84

9,19

1.

0,79

0,83

1,05

0,93

1,14

2.

99,64

95,23

99,36

98,12

99,56

2.

8,10

8,04

10,42

8,22

9,03

2.

0,85

0,80

0,74

1,15

1,16

3.

99,55

96,35

99,16

98,28

99,56

3.

9,10

8,49

9,85

8,59

8,67

3.

0,82

1,02

0,97

0,93

1,61

4.

99,50

95,61

99,34

98,39

99,45

4.

8,45

9,09

10,39

8,01

8,48

4.

0,89

0,57

0,93

0,96

1,14

5.

99,64

96,05

99,00

98,28

99,68

5.

8,86

9,08

9,95

7,96

8,65

5.

0,92

0,79

0,80

0,84

1,11

Mean

99,58

95,91

99,19

98,39

99,56

Mean

8,45

8,80

10,12

8,32

8,80

Mean

0,85

0,8

0,90

0,96

1,23

SD

0,05

0,43

0,14

0,25

0,07

SD

0,49

0,46

0,24

0,34

0,26

SD

0,05

0,14

0,11

0,10

0,19

CV

0,05

0,45

0,14

0,25

0,07

CV

5,80

5,27

2,37

4,09

2,90

CV

5,47

17,83

12,59

10,63

15,40


PNH Leuko- mezilaboratorní lineární regrese Ref. center vs center 2 (WBC)

Ref. center vs center 1 (WBC) 120

120

y = 0,9755x R² = 0,9996

100

y = 0,9984x R² = 0,9999

100

80

80

60

60

40

40

20

20

0

0 0

20

40

60

80

100

120

Pearson r: 0.9998

0

20

60

80

100

120

Pearson r: 1.0000

Ref. center vs center 3 (WBC)

Ref. center vs center 4 (WBC)

120

120

y = 0,9933x R² = 0,9999

100

40

y = 0,9975x R² = 0,9999

100

80

80

60

60

40

40

20

20

0 0

20

40

60

Pearson r: 0.9999

80

100

120

0 0

20

40

Pearson r: 1.0000


60

80

100

120

PNH Leuko-Bland Altmann



Wilcoxon rank test: P= 0,21 (> 0.05) Marinov et al. Cytometry; 2013; 84B; 229-236


PNH Leuko – 6 barevný test • Beckman Coulter platform – v průběhu validace

• Becton Dickinson platform Gr+ Mo

FLAERAlexa 488

CD24-PE (SN3)


CD15-APC (H198)


CD64-PC7 (10.10

CD45-APC-H7 (2D1)

PNH Leuko -výkonnostní charakteristiky (6 barevný test)

Clone size PNH clone

Gr > 20%

Mo

Gr 1-20%

Mo

< 1%

Gr

Protocol

N

Min.

Max.

Mean

SD

CV (%)

4-color

3/10

99.4/98.2

99.5/99

99.4/98.5

0.1/0.3

0.1/0.3

5-color

3/10

99.4/98.9

99.4/99.2

99.4/99.1

0.01/0.1

0.01/0.1

6-color

3/10

99.5/98.4

99.6/98.7

99.5/98.5

0.03/0.1

0.03/0.1

4-color

3/10

99.5/99.3

99.8/99.6

99.6/99.5

0.1/0.1

0.1/0.1

5-color

3/10

99.3/99.3

99.5/99.5

99.4/99.4

0.1/0.1

0.1/0.1

6-color

3/10

99.4/98.8

99.9/99.1

99.8/99

0.3/ 0.2

0.3/0.2

4-color

3/10

12.5/11.7

12.8/12.9

12.7/12.2

0.1/0.4

0.9/3.6

5-color

3/10

12.3/12.2

12.4/12.5

12.3/12.4

0.1/0.2

0.7/1.7

6-color

3/10

12.5/11.8

12.7/12.3

12.6/12

0.1/0.2

0.8/1.5

4-color

3/10

9.9/15.3

10.5/16.7

10.1/15.9

0.3/.1

2.6/3.1

5-color

3/10

9.6/15.7

10.4/21.4

10.1/17.7

0.4/1.9

3.9/10.9

6-color

3/10

10.1/15.4

10.3/2

10.2/18.4

0.1/2.1

0.9/11.6

4-color

3/10

0.5/0.5

0.5/0.6

0.5/0.5

0.0/0.0

2.6/3.1

5-color

3/10

0.5/0.5

0.5/0.5

0.5/0.5

0/0.02

1/2.9

6-color

3/10

0.5/0.5

0.5/0.5

0.5/0.5

0/0.01

0.9/2.9


PNH Leuko – 6 barevný protokol

PNH Leuko – 5 barevný protokol (CD157) • Beckman Coulter platform Gr+ Mo


CD157-PE (SY11B5)

CD15-PC5 (80H5)

CD64-ECD (22)

CD45 PC7 (J33)

CD15-APC (H198)

CD64-PC7 (10.1)

CD45 PerCP-C5.5 (2D1)

• Becton Dickinson platform Gr+ Mo


Sutherland et al.:Cytometry; 2013 Marinov et al.;IJLH, 2014

CD157-PE (SY11B5)

PNH Leuko – 5 barevný protokol

PNH Leuko-výkonnostní charakteristiky (5 barevný test) Clone size

PNH

Protocol

N

Min.

Max.

Mean

SD

CV (%)

5-color

3/3

51.3/97.7

52.4/97.9

51.8/97.8

0.5/0.1

0.9/0.1

6-color

3/3

51.5/97.6

51.7/97.8

51.6/97.7

0.1/0.1

0.2/0.1

5-color

3/3

73.5/90.3

74.1/91.4

73.7/90.9

0.3/0.4

0.7/0.7

6-color

3/3

74.6/95.4

75.4/96.2

74.7/95.4

0.5/0.7

0.7/0.7

5-color

3/3

7.4/16.4

7.8/16.6

7.6/16.5

0.2/0.1

2.4/0.7

6-color

3/3

6.9/14.8

6.9/15.4

18.9/15.1

0/0.3

0.3/1.6

5-color

3/3

18.4/32.6

19.4/34.5

18.9/33.6

0.4/0.7

2.3/2.6

6-color

3/3

18.8/25.2

18.9/36.5

18.8/36

0.1/0.6

0.3/1.6

5-color

3/3

0.3/0.2

0.3/0.2

0.3/0.2

0/0

3/3.7

Gr

6-color

3/3

0.3/0.2

0.3/0.2

0.3/0.2

0/0

5.8/4

Mo

5-color

3/3

0.8/0.5

0.9/0.5

0.8/0.5

0/0

8.1/4.8

6-color

3/3

0.8/0.6

0.9/0.7

0.8/0.6

0/0

5.4/3.2

clone

Gr > 20% Mo

Gr 1-20% Mo

< 1%

Marinov et al.;IJLH, 2014

PNH Leuko- opakovatelnost v sérii (5 barevný test) (a )

In t r a - a s s a y p r e c i s i o n - b i g c l o n e

(b )

In t r a - a s s a y p r e c i s io n - m e d i u m c lo n e

(c )

30

80

2.5

60

20

% p o s i t iv e

% p o s i t iv e

70 % p o s i t iv e

In t r a - a s s a y p r e c is i o n - m i n o r c l o n e

5.0

10

0.0

-2 . 5

50

-5 . 0

0

40 G r-5 c

G r-6 c

M o -5 c

M o -6 c

P o p u la tio n -p r o to c o l

VC 5c: 0.88%-0.20% VC 6c: 0.42%-0.72%


G r-5 c

G r-6 c

M o -5 c

M o -6 c


VC 5c: 2.40%-0.31% VC 6c: 2.29%-0.28%

G r-5 c

G r-6 c

M o -5 c

M o -6 c


VC 5c: 3.02%-5.83% VC 6c: 8.14%-5.41%

PNH Leuko: mezilehlá preciznost (5 barevný test) (d )

In t e r - a s s a y p r e c is io n -b ig c lo n e

(e )

100

In t e r - a s s a y p r e c i s i o n - m e d i u m c l o n e

(f)

50

In t e r - a s s a y p r e c i s io n - m i n o r c l o n e 5.0

40

80

% p o s i t iv e

% p o s i t iv e

% p o s i t iv e

2.5

90

30

20

-2 . 5

10

0

70 G r-5 c

G r-6 c

M o -5 c

M o -6 c


VC 5c: 0.09%-0.08% VC 6c: 0.49%-0.72%


0.0

G r-5 c

G r-6 c

M o -5 c

M o -6 c


VC 5c: 0.71%-1.63% VC 6c: 2.15%-1.55%

-5 . 0 G r-5 c

G r-6 c

M o -5 c

M o -6 c


VC 5c: 3.71%-4.04% VC 6c: 4.80%-3.19%

PNH Leuko: lineární regrese (5 barevný test) (a)

5c vs. 6c (Monocytes)

(b)

5c vs. 6c (Granulocytes)

100

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

y = 1.0045x r² = 0.9995

y = 0.997x r² = 0.9986

90 80 70 60 50 40 30 20 10

0

20

40

Pearson r: 0.99


60

80

100

0 0

20

40

Pearson r: 0.99

60

80

100

PNH Leuko: Bland Altmann (5 barevný test)

(c )

(d )

M e a n b ia s : 0 .3 9

2.5

0.0 50

100

-2 . 5

-5 . 0

D if f e r e n c e in r e s u lt s

D i f f e r e n c e i n r e s u lt s

5.0

0

M e a n b ia s : 0 .8 2

5.0

2.5

0.0 0

50

100

-2 . 5

-5 . 0 M e a n o f r e s u lt s (5 c v s . 6 c ) (G r a n u lo c y t e s )

Wilcoxon rank test: P= 0.23 (> 0.05)


M e a n o f r e s u lt s ( 5 c v s . 6 c )( M o n o c y te s )

Wilcoxon rank test: P=0.08 (> 0.05)

Monitorování minoritních PNH klonů (AA)

FLAER-GPI Anchor Marker

Březen 2009

CD24-Granulocytes

CD14-Granulocytes

CD24-Granulocytes

CD24-Granulocytes

Prosinec 2008


Květen 2009

CD24-Granulocytes

Září 2008



Gr. klon: 3.8%

Gr klon : 7.6%

Gr klon : 14.2%

Gr klon : 23.3%

Ery klon : 0.8%

Ery klon : 1.6%

Ery klon : 1.8%

Ery klon : 2.4%

CD59 –GPI Anchor Protein

3 months


6 months


9 měsíců

Vývoj PNH klonu v průběhu jednoho roku Source- Dahl-Chase Diagnostic Services.


Stanovení PNH klonů průtokovou cytometrií

Recommend Documents