Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd
Současné moţnosti laboratorní diagnostiky anémií (Bakalářská práce)
V Hradci Králové, 2016
Monika Šmídlová
Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Filip Vrbacký Autor bakalářské práce: Monika Šmídlová Studijní obor: Zdravotní laborant Klíčová slova: anémie, diagnostika anémií, laboratorní diagnostika, laboratorní metody
Poděkování Chtěla bych velmi mnoho poděkovat vedoucímu mé bakalářské práce Mgr. Filipu Vrbackému především za trpělivost, ochotu, věcné a cenné připomínky a rady, které mi věnoval při řešení problematiky práce. Velké poděkování patří také mé rodině a přátelům za podporu a povzbuzení po celou dobu mého studia.
2
Prohlášení „Prohlašuji, že tato bakalářská práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichž jsem pro zpracování čerpala, řádně cituji. Práce nebyla využita pro získání jiného nebo stejného kvalifikačního titulu.“ V Hradci Králové
podpis 3
OBSAH
1.
Seznam pouţitých zkratek ......................................................................................................... 6
2.
ABSTRAKT.................................................................................................................................... 9
3.
ABSTRACT.................................................................................................................................. 10
4.
ÚVOD (ZADÁNÍ PRÁCE- CÍL PRÁCE) .................................................................................... 11
5.
ANÉMIE ........................................................................................................................................ 11 5.1 Morfologické dělení anémií ................................................................................................... 12
6.
5.2
Anémický syndrom, klinický obraz .............................................................................. 12
5.3
Kompenzační mechanismy lidského organismu ....................................................... 14
ETIOPATEGENETICKÉ ROZDĚLENÍ ANÉMIÍ ....................................................................... 14 6.1
Anémie z poruchy tvorby erytrocytů ............................................................................ 15
6.1.1
Porucha syntézy hemu ............................................................................................... 15
6.1.2
Porucha syntézy globinu ............................................................................................ 16
6.1.3
Porucha syntézy DNA- megaloblastové anémie.................................................... 16
6.1.4
Porucha proliferace a diferenciace .......................................................................... 17
6.2
Anémie ze zvýšené destrukce erytrocytů ................................................................... 19
(hemolytické anémie, neboli HA) ............................................................................................... 19 Korpuskulární HA......................................................................................................... 19
6.2.1 6.2.1.1
Defekt membrány erytrocytů ................................................................................. 19
6.2.1.2
Defekt enzymové výbavy erytrocytů (enzymopatie) ......................................... 22
6.2.1.3
Nestabilní strukturální varianty Hb (hemoglobinopatie) .................................. 24 Extrakorpuskulární HA................................................................................................ 25
6.2.2
7
6.2.2.1
Imunitní extrakorpuskulární HA ............................................................................ 25
6.2.2.2
Neimunitní extrakorpuskulární HA ....................................................................... 26
6.3
Anémie z krevních ztrát (akutní posthemorhagické) ................................................ 27
6.4
Anémie ze smíšených příčin (multifaktoriální) ........................................................... 28
LABORATORNÍ VYŠETŘENÍ V DIAGNOSTICE ANÉMIÍ ..................................................... 29 7.1 7.1.1
Druhy vyšetřovaného biologického materiálu a jeho odběr ................................... 29 Vyšetřovaný biologický materiál v diagnostice anémií: ...................................... 29
4
Odběr biologického materiálu ................................................................................... 29
7.1.2
Konvenční hematologická vyšetření ............................................................................ 31
7.2
Morfologická vyšetření v mikroskopu ..................................................................... 33
7.2.2 7.2.2.1
Zhotovení a barvení nátěru periferní krve (ČHS ČLS JEP).............................. 33
7.2.2.2
Hodnocení nátěru PK v mikroskopu .................................................................... 34
7.2.3
Stanovení retikulocytů ................................................................................................ 36
7.2.4
Morfologické hodnocení nátěru kostní dřeně ........................................................ 37 Biochemická vyšetření, speciální instrumentální metody ....................................... 38
7.3 7.3.1
Elektroforéza hemoglobinu ........................................................................................ 38
7.3.2
Absorpční spektrofotometrie .................................................................................... 40
7.4
Cytochemie ........................................................................................................................ 40
7.5
Molekulárně- biologické metody ................................................................................... 41
7.5.1
Příprava vzorku ............................................................................................................ 41
7.5.2
Cytogenetické metody ................................................................................................ 42
DĚDIČNÉ ANÉMIE- LABORATORNÍ NÁLEZY U NĚKTERÝCH TYPŮ .............................. 44
8.
8.1
Thalassemie ...................................................................................................................... 44
8.2
Blackfen-Diamondova anémie (DBA) ........................................................................... 46
8.3
Hemoglobinopatie S- Srpkovitá anémie ...................................................................... 47
8.4
Hereditární sférocytóza ................................................................................................... 50
8.5
Defekt G-6-PD.................................................................................................................... 54
8.6
Kongenitální Fanconiho anémie (FA)........................................................................... 55
ZÁVĚR- SHRNUTÍ PRÁCE ........................................................................................................ 59
9. 10.
SEZNAM ZDROJŮ INFORMACÍ- POUŢITÁ LITERATURA ............................................. 62
11.
SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ ...................................................................................... 72
11.1
Seznam tabulek ................................................................................................................ 72
11.2
Seznam obrázků ............................................................................................................... 72
5
1. Seznam pouţitých zkratek 2,3-DPG… 2,3-bisfosfoglycerát AIHA… autoimunitní hemolytická anémie AK… aminokyselina ARC… absolutní počet retikulocytů (absolute reticulocyte counts) AS…anemický syndrom ATP… adenosintrifosfát BASO… bazofily C… komplement CAE… celulóza-acetát elektroforéza cDNA… komplementární DNA CTT… chronická transfúzní terapie ČHS ČLS JEP….Česká hematologická společnost České lékařské společnosti Jana Evangelisty Purkyně DBA… Diamond-Blackfen anémie DEB… diepoxybutan DIF… diferenciální rozpočet leukocytů DNA…deoxyribonukleová kyselina EMA… eosin-5-maleimid EOS… eozinofily EPO… erytropoetin Ery… erytrocyt/y Fe…. ţelezo FISH… fluorescenční in situ hybridizace G-6-P… glukóza-6-fosfát G-6-PD… glukóza-6-fosfátdehydrogenáza GPI kotva… glykosylfosfatidylinositolová kotva HA… hemolytická anémie Hb…hemoglobin HbA…. Hemoglobin A HbC… Hemoglobin C HbS…. Hemoglobin S HCT… hematokrit 6
HE… hereditární eliptocytóza HELLP… Hemolysis-Elevated Liver enzymes-Low Platelets HGB… hemoglobin HNSHA…hereditary nonspherocytic hemolytic anemia HON… hemolytické onemocnění novorozence HPLC… vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC-MS… spojení HPLC a hmotnostní spektrometrie HPV… Lidský Papilomavirus (Human Papilomavirus) HS… hereditární sférocytóza HUS… hemolyticko-uremický syndrom IEF… izoelektrická fokusace IPF… immature platelet fiction K3EDTA… draselná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové KD… kostní dřeň KO… krevní obraz Leuko… leukocyt/y LYM… lymfocyty MCV…mean cell volume MCV…Mean corpuscular volume MDS… myelodysplastický syndrom MCH… mean corpuscular haemoglobin MCHC… mean corpuscular hemoglobin concentration MMS… monocyto-makrofágový systém MONO… monocyty MPV… mean platelet volume NADP…nikotinamidadenindinukleotidfosfát NADPH… redukovaná forma NADP+ Na-K… sodíko-draslíkové NEU… neutrofily NK… nukleová/é kyselina/y NO… oxid dusnatý NRBC… normoblast PAT… přímý antiglobulinový test 7
PCT… plateletcrit PDW… platelet distribution width PIG-A… gen fosfatidylinositol glykan třídy A PK… periferní krev PK… pyruvátkináza PLT,,, platelets POCT… point of care test RBC… Red blood cells RDW… red distribution width RES… retikulo-endotheliální systém RET#... absolutní počet retikulocytů RET…Relativní počet retikulocytů RI… retikulocytární index RNA…ribonukleová kyselina SDS-PAGE… elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného (sodium dodecylsulphate- polyacrylamid gel electrophoresis) SLE… systémový lupus erythematoides SNP… single nukleotide polymorphism sTfR… sérový transferinový receptor Tab…. tabulka Trombo… trombocyt/y TTP…trombotická trombocytopenická purpura Vit…. Vitamin WBC… white blood cells WHO… Světová zdravotnická organizace (World Health Organization)
8
2. ABSTRAKT Tato bakalářská práce pojednává o celkovém zhodnocení a shrnutí problematiky anémií z hlediska etiopatogeneze a moţností laboratorní diagnostiky. Práce je především blíţe zaměřena na laboratorní diagnostiku dědičných typů anémií. Anémie neboli anémický syndrom je patologický stav vyznačující se sníţením hladiny hemoglobinu a hematokritu pod fyziologickou mez. Projevy anémie jsou různě závaţné dle rychlosti rozvoje a stupně závaţnosti konkrétního typu anémie. Dochází k poklesu oxygenace tkání, od kterého se odvíjí řada příznaků tkáňové hypoxie. Mezi další následky patří hypovolemie a hyperkinetická cirkulace. U hemolytických anémií se navíc vyskytují příznaky intravaskulární či extravaskulární hemolýzy v organismu. Primární (dědičné) anémie jsou vrozené, jejich příčina tkví ve změně genotypu následkem různých mutací chromozomů, coţ má za následek změnu fenotypu v oblasti vlastností erytrocytů. Proces diagnostiky dědičných anémií zahrnuje správné určení rodinné anamnézy, příslušná podrobná lékařská vyšetření a metody laboratorních vyšetření, které jsou nedílnou součástí současné medicíny. Důleţitá jsou klasická morfologická vyšetření (parametry krevního obrazu, morfologie krevních buněk) i speciální laboratorní vyšetření (cytogenetické
a
molekulární
genetické
metody),
parametry
biochemických vyšetření a také mikroskopické vyšetření kostní dřeně mívá velký význam v diagnostice. Důleţitou
roli
má
poskytování
genetického
poradenství
na
odděleních klinické a lékařské genetiky ve zdravotnických zařízeních, která pacientům poskytují edukaci a poradenství v oblasti problematiky dědičných onemocnění. Správná a včasná diagnostika přispívá ke zlepšení prognózy díky moţnostem včasného nasazení léčby. Ta bývá v případě geneticky podmíněných anémií substituční, nejčastěji se provádí podávání transfuzních přípravků.
9
3. ABSTRACT This bachelor thesis discusses the general informations and summary of etiopathogenetical
classification
of
anaemia
and
possibilities
of
laboratory diagnostics. Thesis is mainly focused on laboratory diagnosis of inherited types of anaemia. Anaemia
or
anaemia
syndrome
is
a
pathological
condition
characterized by low levels of haemoglobin and hematocrit under the physiological
limit.
Clinical
manifestations
are
variously
severe
depending on development of disease and type of anaemia. Anaemia patient suffer from reduced oxygenation of tissues which determinates many symptoms of tissue hypoxia. Other symptoms are associated with hypovolemia and hyperkinetic circulation that can occur. In haemolytic anaemia, patients have symptoms of intravascular or extravascular haemolysis. Primary (hereditary) anaemia are congenital, the cause lies in genetic mutations that result a changes of phenotype properties of erythrocytes. The process of diagnosis determinating includes correct identification of family history, relevant medical examinations and laboratory testing methods, which are essential part of modern medicine. Important are methods such as routine morphological examinations (blood counts, blood cell morphology) or specific laboratory tests (cytogenetic and molecular genetic methods), biochemical parameters examination and microscopic examination of bone marrow. All the examinations have great importance in the diagnosis. Providing of genetic counselling have
importance role. It includes
education and counselling on issues of inherited disease and psychosocial support. It is available at the department of clinical and medical genetics in health care facilities. Correct and early diagnosis contributes to a better prognosis due to early initiation of treatment options. In the case of genetically inherited anaemia, there is available replacement therapy, the most common is the administration of transfusion blood products.
10
4. ÚVOD (ZADÁNÍ PRÁCE- CÍL PRÁCE) Při tvorbě bakalářské práce jsem se zaměřila na charakterizování anémií z hlediska laboratorních parametrů. Soustředila jsem se především na dědičné typy anémií, čili primární anémie, které nejsou následkem jiného onemocnění. Cílem mé práce je zhodnotit současná laboratorní vyšetření a porovnat význam klasických (konvenčních) i moderních vyšetřovacích laboratorních metod aplikovaných v diagnostice u dědičných typů anémií. Práce má charakter rešerše. Anemičtí pacienti tvoří přibliţně 30 % lidské populace, z čehoţ pacienti s dědičnými typy anémií tvoří pouze velmi malý zlomek. Některé typy ale mohou být klinicky závaţné a proto je důleţitý vývoj v diagnostice, od kterého se odvíjí i vývoj léčby. Z hlediska diagnostiky jsem se zaměřila na význam jak konvenčních rutinních hematologických metod, tak i na význam novějších moderních metod v oblasti cytogenetiky, také jsem se zaměřila na významnost genetického poradenství vzhledem k moţnostem léčby některých dědičných typů anémií.
5. ANÉMIE Anémie, nebo také chudokrevnost, je patologický stav charakteristický sníţenou hladinou hemoglobinu (Hb) a hematokritu (Hct) periferní krve pod fyziologická rozmezí, která se liší v závislosti na pohlaví a věku. U ţen je dolní fyziologická mez pro Hb 120 g/l a pro Hct 0,35, u muţů je dolní fyziologická mez pro Hb 135 g/l a pro Hct 0,40. Počet erytrocytů v periferní krvi nehraje tak důleţitou roli, neboť u některých typů anémií můţe být v normě (např. mikrocytární anémie) nebo dokonce zvýšený (např. thalassémie). Hodnoty erytrocytární sloţky krve se mohou také jevit jako sníţené např. při hypervolemii (těhotenství, hypersplenismus, městnavá srdeční 11
slabost aj.), v tomto případě se jedná o tzv. relativní anémii. Pokud dojde k opačnému stavu, tedy hypovolemii (dehydratace při průjmech, nadměrném pocení, polyurické fázi renální insuficience aj.), jedná se o tzv. skrytou anémii.[1] [2] [3]
5.1 Morfologické dělení anémií Díky tomuto systému dělení anémií na ucelenější skupiny, z nichţ kaţdá tvoří určité stavy s charakteristickými změnami v erytrocytech, je moţné postupovat v určování příčiny a přesné diagnózy díky pouţití dalších cílených laboratorních vyšetření či zobrazovacích metod. Uvedené parametry v závorkách níţe odpovídají dospělé populaci. [3] [4]
Podle hodnoty MCV: Mikrocytární (< 82 fl) Normocytární (82-98 fl) Makrocytární (> 98 fl) Podle hodnoty MCH (nebo MCHC): Hypochromní (< 28 pg) Normochromní (28-32 pg) Podle hodnoty RDW: s anizocytózou s homogenní populací Podle hodnoty RET (relativní počet): stav se zachovalou kompenzační schopností dřeně stavy, kdy je porušena schopnost krvetvorby nahradit nedostatek [3] [4]
5.2
Anémický syndrom, klinický obraz
Anémie nejsou obecně povaţovány za onemocnění, nýbrţ za syndrom, čili soubor subjektivních příznaků a klinických projevů, které jsou následkem nedostatečného zásobování tkání kyslíkem- hypoxie. Stupeň klinických projevů a rozvoj anémického syndromu (AS) se odvíjí od typu (závaţnosti) anémie, ale také především od rychlosti rozvoje samotné 12
anémie. Další důleţité faktory mající vliv na závaţnost AS jsou věk a zdravotní stav nemocného (stav kardiovaskulárního a jiných systémů, současný výskyt a stupeň závaţnosti jiných onemocnění aj.). Některé klinické projevy anémického syndromu jsou často společné pro většinu typů anémií (projevy tkáňové hypoxie atd.), jiné příznaky mohou být naopak částečně charakteristické pro určité typy anémií (např. angulární stomatitidy,
glositidy,
třepivost
nehtů,
předčasné šedivění
vlasů u
sideropenické anémie). [2] Obecně se klinické projevy mohou zařadit do třech základních skupin: Odvozené od poklesu transportu kyslíku Mezi subjektivní příznaky (příznaky pociťované pacientem) patřící do první skupiny patří únava, slabost, malátnost, pokles fyzické kondice, zhoršení paměti, zpomalení psychomotorického tempa, zhoršení zraku, dyspeptický syndrom, stenokardie (svíravá bolest na hrudi) a cephalea (bolest hlavy). Objektivní nálezy spadající do této skupiny mohou být tachypnoe, ischemie/infarkt myokardu, srdeční slabost, klaudikace (kulhání v důsledku bolesti při nedostatečném prokrvení svalů) dolních končetin, řídnutí kštice či pokles hmotnosti. [2] Odvozené od poklesu krevního objemu (hypovolemie) S hypovolemií jsou spojené tyto subjektivní příznaky: ortostatická hypotenze, kolaps/synkopa, závratě, tinnitus („hučení“ v uších), akroparestézie (mravenčení v akrálních částech těla), pocit chladných aker, přecitlivělost na chlad a sníţení libida. Objektivní projevy odvozené od hypovolemie jsou pak: hypotenze, bledost kůţe (také nehtových lůţek, dlaňových rýh), bledost sliznic a spojivek, tranzitorní ischemie CNS, amaurosis fugax (částečná či úplná přechodná ztráta zraku trvající obvykle několik minut), akrohypotermie.
13
Odvozené od hyperkinetické cirkulace (zvýšený srdeční výdej, pokles periferní rezistence, snížení viskozity krve) K subjektivním příznakům vzniklým díky hyperkinetické cirkulaci, patří palpitace, nespavost, tepání ve spáncích, tinnitus, srdeční dilatace, edémy končetin. K objektivním nálezům patří systolická hypertenze, vysoká tlaková amplituda, průtokové anemické šelesty či sinusová tachykardie (event. extrasystolie). [2]
5.3
Kompenzační mechanismy lidského organismu
Dle rychlosti rozvoje anémie se odvíjí moţnost a stupeň uplatnění kompenzačních mechanismů v organismu, které jsou vzájemně provázané, patří mezi ně [3]: Posun
disociační
křivky
Hb
doprava
(zvýšená
hladina
2,3-
difosfoglycerátu v erytrocytech) – jedná se o okamţitou a citlivou odpověď na hypoxii v tkáních Sníţené prokrvování tkání méně citlivých na nedostatek kyslíku (kůţe, ledviny)- přesun krve do orgánů náchylnějších k nedostatku kyslíku Zvýšení minutového srdečního výdeje- umoţněn také niţší viskozitou krve při anémii, díky tomuto mechanismu se organismus snaţí zvýšit obsah kyslíku v arteriální krvi Stimulace
erytropoézy-
zvýšená
produkce
erytropoetinu
(EPO)
ledvinami díky jejich sníţenému prokrvení [3]
6. ETIOPATEGENETICKÉ ROZDĚLENÍ ANÉMIÍ Pod
pojem
etiopatogenetické
dělení
řadíme
klasifikační
systém
rozřazující anémie s ohledem na příčinu a způsob jejich vzniku. I tento způsob klasifikace je velmi uţitečný a důleţitý, neboť zjištění přesné příčiny je obligátní pro zahájení správné a cílené léčby a tím pádem i pro zlepšení prognózy, pokud je to moţné. [3] V tomto systému klasifikace rozlišujeme čtyři obecné základní skupiny 14
anémií dle příčiny a způsobu vzniku [2]: Anémie z poruchy tvorby erytrocytů (poruchy krvetvorby) Anémie ze zvýšené destrukce erytrocytů (hemolytické) Anémie z krevních ztrát (posthemorhagické) Anémie z kombinovaných příčin (multifaktoriální) [2]
6.1
Anémie z poruchy tvorby erytrocytů
6.1.1 Porucha syntézy hemu Sideropenická anémie Tento typ anémie je vyvolán nedostatkem ţeleza v organismu kvůli nadměrným ztrátám, nedostatečnému příjmu potravou či zvýšenými nároky organismu. Jedná se o nejčastější typ anémie vůbec. Tento typ anémie patří mezi z počátku normocytární a s rozvojem později mezi mikrocytární hypochromní. Nedostatek ţeleza se pak ještě řadí do třech stupňů [3]: -
prelatentní sideropenie- postupné sniţování zásob Fe bez vlivu na dodávku do erytroblastů kostní dřeně
-
latentní sideropenie- dochází k vyčerpání zásob Fe v organismu a dodávka do erytropoézy se sniţuje, ještě ale není přítomna anémie
-
sideropenická anémie- poslední fáze, kdy chybí zásoby Fe úplně a rozvíjí se anémie [3] Sideroblastická anémie Jedná se o skupinu vzácnějších onemocnění, pro která je charakteristický výskyt prstenčitých sideroblastů, coţ jsou zralejší jaderné prekurzory červené řady v kostní dřeni, v jejichţ mitochondriích se kumuluje ţelezo ve formě amorfních depozit. Základní princip příčiny spočívá v poruše inkorporace ţeleza do molekuly hemu. Existují dědičné a získané formy. U dědičné sideroblastické anémie se vyskytují vrozené defekty enzymů důleţitých pro syntézu hemu- sníţená aktivita δ-aminolevulinátsyntetázy (koenzym
pyridoxalfosfát),
sníţená
koncentrace
koproporfyrinu
či
protoporfyrinu nebo můţe dojít k mutaci mitochondriálních genů pro
15
cytochromoxidázu. Získané formy těchto anémií bývají způsobené nedostatkem pyridoxinu v potravě, alkoholismem, léky (reverzibilní typ), otravou olovem či nedostatkem mědi a nadbytkem zinku. [3]
6.1.2 Porucha syntézy globinu Thalasémie Pokud dochází k poruše syntézy jednoho či více polypeptidových řetězců molekuly globinu, jedná se o tzv. thalasémie. Podle převaţujícího typu řetězce, u kterého je porušena syntéza, rozlišujeme thalasemie na αthalasémii a β-thalasémii (existují i typy γ- a δ-). Porucha spočívá ve sníţené rychlosti tvorby globinových řetězců nebo aţ jejich zástavě. Dále rozlišujeme thalasémie na minor (heterozygotní) a major (homozygotní či dvojitě heterozygotní). [3]
Strukturální varianty hemoglobinu Do této skupiny poruch syntézy globinových řetězců patří choroba hemoglobinu H, při které jsou postiţeny tři geny pro α-řetězec, kdy pak vzniká hemoglobin H, který intracelulárně precipituje. Další onemocnění patřící do této skupiny je choroba hemoglobinu Barts. Při této chorobě chybí všechny geny pro hemoglobin α. Vzniká hemoglobin Barts, který má vysokou afinitu ke kyslíku, ale nedokáţe ho předávat do tkání. Jedná se o stav neslučitelný s ţivotem a k úmrtí nejčastěji dochází jiţ během nitroděloţního ţivota. [3]
6.1.3 Porucha syntézy DNA- megaloblastové anémie Jedná se o skupinu anémií, u kterých je typická megaloblastová přestavba v kostní dřeni. Příčinou můţe být porucha metabolismu vitaminu
B12
či
kyseliny
listové,
působení
léků
(cytostatika,
antimetabolity), porucha v genetické výbavě buňky (MDS). Buňky díky poruše tvorby DNA mají prodlouţený metabolismus a setrvávají v S-fázi mitózy. Následně vznikají krátké Okazakiho fragmenty DNA a dochází k poruše zrání jádra. Cytoplazma vyzrává běţnou rychlostí, neboť
16
Tvorba RNA a bílkovin není porušena. Vzniká tedy plazmojaderná asynchronie. Postiţení bývá i u granulocytární a trombocytární řady. Mezi megaloblastové anémie řadíme také perniciózní anémie, při které bývá nedostatek vnitřního faktoru pro resorpci vit B12 díky protilátkám proti parietálním buňkám nebo proti samotnému vnitřnímu faktoru. [3]
6.1.4 Porucha proliferace a diferenciace Aplastické anémie Aplastické anémie tvoří různorodou skupinu anémií, jejichţ společným rysem
je
pancytopenie
v periferní
krvi
(anémie,
leukopenie,
trombocytopenie). Příčinou je porucha normální erytropoézy, kdy je poškozena kmenová buňka ve smyslu schopnosti regenerace a udrţování konstantního poolu kmenových buněk. Dle způsobu vzniku dělíme aplastické anémie na vrozené (Fanconiho, Diamond-Blackfanova aj.), získané, idiopatické a sekundární. Dle stupně závaţnosti je dělíme na chronické cytopenie, těţkou aplastickou anémii a velmi těţkou aplastickou anémii. [3] Izolované aplazie erytropoézy Jedná se o získané typy aplastických anémií, které mohou mít různý průběh:
Akutní
erytroblastopenie
(Gasserova)-
krátkodobá
aplazie
s absencí normoblastů v kostní dřeni u dětí po virové infekci
Akutní čistá aplazie červené řady- zástava erytropoézy u chronických hemolytických anémií či virových infekcí, jedná se o těţkou anémii
Přechodná anémie s aplazií červené řady- u kojenců a malých dětí, trvá několik týdnů aţ měsíců, prognóza je dobrá
Chronická čistá aplazie červené řady- chronická forma získané hypoplazie erytropoézy z různých příčin [3]
17
Získaná aplastická anémie- sekundární dřeňový útlum Toto
onemocnění
je
definováno
jako
selhání
proliferace
a/nebo
diferenciace hematopoetických buněk. Následkem je pak hypocelularita kostní dřeně a cytopenie v periferní krvi (postiţení jedné, více či všech vývojových řad krevních buněk). Postiţen můţe být jakýkoliv stupeň krvetvorby, včetně pluripotentní kmenové buňky. Mezi příčiny patří působení myelotoxických vlivů (cytostatika, ionizační záření) nebo můţe být příčina nejasná, často bývá dané onemocnění podmíněné také imunitně. Klinický obraz se odvíjí od pancytopenie, kdy se kromě anémického syndromu objevují také sklony ke krvácení (trombocytopenie) a infekční komplikace (granulocytopenie). [3] Kongenitální dyserytropoetické anémie (KDA) KDA tvoří skupinu několika vzácných chorob (výskyt bývá sporadický) charakteristických refrakterní anémií, inefektivní erytropoézou, změnami v morfologii a sloţení membrány, změnami antigenní výbavy erytrocytů a také v metabolismu erytrocytů. Často jsou doprovázené lehkou aţ středně těţkou periferní hemolýzou. [3] Rozlišujeme tři typy KDA:
KDA typ I- vrozená, autozomálně recesivní vada na genu CDAN1,
coţ
způsobí
poruchu
syntézy
nukleoproteinů
s následnými abnormálními mitózami a změnami v apoptóze, jsou doprovázeny ţloutenkou a splenomegalií
KDA typ II- HEMPAS- vrozená, autozomálně recesivní vada genu CDAN2, coţ způsobuje defekt v enzymatické glykosylaci membránových proteinů
KDA typ III- autozomálně dominantní onemocnění s postiţením genu CDAN3, vyskytují se ataky slabosti a intravaskulární hemolýzy nebo jsou bezpříznakové [3]
Myelodysplastický syndrom (MDS) Klonální onemocnění postihující hematopoetickou buňku, které je 18
charakteristické dysplazií v jedné i více hematopoetických řadách. Nejvíce postiţeni jsou pacienti kolem 60 let věku. MDS je povaţován za preleukemické podmínky a je zde velká pravděpodobnost transformace do akutní myeloidní leukemie. [52] [53]
6.2
Anémie ze zvýšené destrukce erytrocytů (hemolytické anémie, neboli HA)
6.2.1 Korpuskulární HA 6.2.1.1
Defekt membrány erytrocytů
Jedná se o skupinu dědičných chorob, u kterých dochází k poruše buněčné membrány na základě deficitu membránových proteinů případně narušení jejich vazeb mezi sebou, a tím dochází také k poruše normální funkce erytrocytů. Hereditární sférocytóza Jedná se o vrozené onemocnění s defektem membrány erytrocytů, charakteristické různými stupni extravaskulární hemolýzy a přítomností sférocytů v periferní krvi. Většinou se jedná o autozomálně dominantní dědičnost s různou expresivitou, v některých případech se ale můţe vyskytovat i recesivní dědičnost. Při tomto onemocnění dochází k poruše periferních bílkovin membrány erytrocytu, které jsou důleţité pro formování cytoskeletu. [3] Existuje několik typů: -
Částečný deficit spektrinu (mutace SPTA1 a ANK1 genu)
-
Těţký deficit spektrinu (mutace SPTA1 genu kombinovaná se Spa alelou s nízkou expresí)
-
Kombinovaný deficit spektrinu a ankyrinu
-
Částečný deficit pásu 3 Následkem daných mutací je pak nestabilita lipidové dvouvrstvy membrány, sniţování mnoţství cholesterolu a fosfolipidů a větší 19
propustnost pro sodík. Vzniká sférocyt, jehoţ Na-K pumpy v membráně musí „vypumpovat“ velké mnoţství sodíku proti gradientu, coţ je energeticky neúnosné, buňka se stává rigidnější a méně deformovatelná, ztrácí další membránový povrch, aţ dojde k jejímu zadrţení a fagocytóze ve slezině. Klinickými příznaky jsou anémický syndrom, ţloutenka, splenomegalie. [3] Hereditární eliptocytóza (HE) a přidruţená onemocnění Hereditárních eliptocytóza je různorodá skupina onemocnění, pro která je společným
znakem
dominantní
dědičnost
membránových
poruch
erytrocytů a přítomností eliptocytů v periferní krvi. Jde o molekulární poruchy α i β řetězce spektrinu. Přesný mechanismus příčiny vzniku eliptocytu není objasněn. Normální erytrocyty mají také eliptický tvar např. při průchodu mikrocirkulací, který je ale dočasný. U tohoto onemocnění dochází k oslabení vazby heterodimerů spektrinu, reorganizaci cytoskeletu a při opakovaném průchodu mikrocirkulací pak zřejmě dochází k trvalé elongaci erytrocytu. Následně jsou více poškozené eliptocyty vychytány slezinou. [3] Existuje několik podtypů s odlišným klinickým průběhem a různými stupněmi anémie, hemolýzy a splenomegalie: -
Běţná HE
-
Homozygotní (dvojitě heterozygotní) HE
-
Hereditární pyropoikilocytóza
-
Sférocytární eliptocytóza
-
Jihovýchodní asijská ovalocytóza [3]
Hereditární stomatocytóza Jedná se opět o heterogenní skupinu HA, které jsou autozomálně dominantně dědičné a jejich společným znakem je přítomnost stomatocytů v nátěru periferní krve. Příčiny nejsou jednoznačné. Jedna z moţností je nedostatek bílkoviny
20
stomatinu díky změnám v genu pro xerocytózu v oblasti 16q23-q24. Následkem je pak zvýšená propustnost membrány a erytrocyt následně můţe zvětšit (hyperhydratace) či zmenšit (xerocytóza) svůj objem. Také dojde ke změně koncentrace intracelulárního sodíku a draslíku. Stupeň hemolýzy a závaţnost anémie bývají různé. [1] Hereditární akantocytóza Hereditární akantocytóza je vzácný typ anémie, která je charakteristická výskytem akantocytů v periferní krvi. Příčina spočívá v absenci β lipoproteinů v plazmě (abetaproteinemii). Konkrétně se jedná o poruchu syntézy apolipoproteinu B a následné absenci několika frakcí lipoproteinů. Mechanismus vlivu poruchy obsahu lipidů v plazmě na změnu tvaru erytrocytů zatím není objasněn. Akantocyty vznikají aţ po přechodu erytrocytů do periferní cirkulace (včetně erytrocytů transfundovaných dárcovských). Mezi nejvýznamnější příznaky patří porucha růstu, mentální retardace, steatorea, kolem 5-10 let se objevuje renitis pigmentosa a progresivní ataxie. Pacienti s tímto onemocněním umírají mezi 20.- 30. rokem ţivota, objevuje se u nich srdeční arytmie a selhání srdce. [1] Paroxysmální noční hemoglobinurie (PNH) PNH je jedinou získanou korpuskulární hemolytickou anémií. Patří mezi nemaligní
klonální
onemocnění
zapříčiněné
somatickou
mutací
pluripotentní kmenové buňky. PNH je charakteristická intravaskulární hemolýzou a hemoglobinurií, dále náchylností k trombózám a relativní nedostatečností kostní dřeně. Příčina spočívá v postiţení genu PIG-A na krátkém raménku chromosomu X. Produkt tohoto genu je nezbytný pro vznik N-acetylglukasamin-fosfatidylinositolu, coţ je první meziprodukt GPI kotvy. Pokud je tento mechanismus narušen zmíněnou mutací, vznikají defekty bílkovin v buněčné membráně, které by za normálních okolností tlumily
aktivaci
komplementu.
Následně
jsou
erytrocyty
lyzovány
komplementem. [1] Rozlišujeme několik typů fenotypického postiţení erytrocytů u PNH: -
PNH I- normální citlivost k C (komplement) 21
-
PNH II- 3-4 krát vyšší citlivost k C
-
PNH III- 15-20 krát vyšší citlivost k C Ve výsledku je pak buněčná membrána nadměrně citlivá na aktivovaný komplement, který způsobí i v nepatrné koncentraci lýzu erytrocytů a v plazmě se pak nachází volný Hb způsobující konzumpci NO. Membránový defekt postihuje také trombocyty a granulocyty. Klinické projevy závisí na zastoupení PNH III krvinek, pokud mají pacienti méně neţ 20% PNH III krvinek, mohou být asymptomatičtí. Při vyšším zastoupení (od 50%) se zvyšuje riziko těţkých trombotických komplikací, mnohdy dochází k trombózám v atypických lokalizacích. Dále pacienty provází opakované a nepravidelné epizody hemolýzy (při infekci, menstruaci, po transfúzi, aj, nebo často z neodhalených příčin). Jmenované komplikace mívají velmi často fatální následky (aţ u 50% nemocných s PNH). [1]
6.2.1.2
Defekt enzymové výbavy erytrocytů (enzymopatie)
Hereditární enzymopatie erytrocytů jsou dědičná onemocnění postihující geny, které kódují klíčové enzymy erytrocytů. Jedná se o specifický typ anémií označovaných jako dědičné nesférocytové hemolytické anémie (HNSHA). Dle základní klasifikace anémií patří tyto mezi normocytární normochromní anémie. Na rozdíl od ostatních typů HA se v tomto případě vyskytují nespecifické morfologické abnormality. Příčina obecně tkví v poruše enzymů buněčného metabolismu- především anaerobní a aerobní
glykolýzy,
glutationového
metabolismu
a
nukleotidového
metabolismu. Nejčastější jsou poruchy enzymů G-6-PD a PK, existuje ale i řada poruch dalších enzymů. [6] Deficit glukózo-6-fosfátdehydrogenázy (G-6-PD) Princip příčiny spočívá ve vrozené genetické odchylce vázané na chromosom X. Díky sníţené aktivitě G-6-PD je narušen iniciální stupeň hexozo-monofosfátového zkratu (aerobní glykolýzy), který je nezbytný pro ochranu
erytrocytu
před
oxidačním
stresem.
Vzniká
nedostatek
redukovaného NADPH a glutathionu, hemoglobin je pak nedostatečně 22
chráněn před oxidací. Oxidovaný hemoglobin můţe pak precipitovat ve formě Heinzových tělísek. Dále dochází k oxidaci membránových lipidů a následně k lýze erytrocytů. [1] Při oxidační zátěţi různého původu pak dochází k akutním hemolytickým epizodám, nebo vzácně k chronické hemolýze. Existuje více variant G-6-PD, která jsou řazeny do tříd I-V dle zvyšující se aktivity enzymu. Enzymové varianty vznikají na základě různých mutací (často bodových). Deficit G-6-PD patří k nejrozšířenějším vrozeným HA i genetickým defektům. Nejvyšší výskyt variantní mutace genu pro G-6-PD je popsán u černošské populace, ve Středomoří a v Asii. V celé lidské populaci se vyskytuje zřejmě 300 milionů nosičů variantní mutace. Vyskytují se čtyři základní typy klinické manifestace: -
Akutní
hemolytická
anémie-
hemolytické epizody 2-4 dny od
vyvolávající příčiny -
Kongenitální nesférocytová hemolytická anémie- anémie a ţloutenka od narození, mimo dětský věk málo vyjádřené známky hemolýzy
-
Neonatální hyperbilirubinémie- příčina není plně objasněna
-
Favismus- výskyt ve Středomoří, akutní intravaskulární hemolýza po expozici
bobům
doprovázeno
Vicia
bolestmi
fava
v potravě,
mateřském
hlavy
a
hemoglobinurií,
hrudi,
mléce
aj.,
pokles
hemoglobinu výrazný aţ fatální [1] Deficit pyruvátkinázy (PK) Jde o autozomálně recesivní onemocnění, díky kterému dochází k vrozenému nedostatku enzymu PK, coţ je důleţitý enzym glykolytického cyklu erytrocytů, díky kterému vzniká ATP jako důleţitý zdroj makroergní fosfátové vazby. Daný proces je nezbytný pro energeticky náročné pochody v buňce, např. pro aktivní přenos látek membránovou na ATP závislou pumpou a tím i deformovatelnost erytrocytu. Při deficitu daného enzymu mají erytrocyty zvýšenou rigiditu a jsou vychytány slezinou. Dále dochází k zásahu do apoptózy a vyzrávání erytroidních progenitorů. Anémie ale bývá dobře tolerována, neboť není postiţen vznik 2,3-DPG, 23
který zabezpečí díky sníţení afinity ke kyslíku uvolnění dostatečného mnoţství kyslíku pro tkáňové dýchání. Dané onemocnění se vyskytuje spíše v severní a střední Evropě a je druhou nejčastější příčinou hemolýzy z nedostatku enzymu. Závaţnost je široce heterogenní- od těţkých forem s trvalou substituční terapií aţ po klinicky němé formy. Můţe dojít také ke komplikaci aplastickými krizemi po infekcích parvoviry či při nedostatku folátů. [1]
Nestabilní strukturální varianty Hb (hemoglobinopatie)
6.2.1.3 Tato
skupina
vrozených,
geneticky
podmíněných
anémií
je
charakteristická změnami v primární struktuře hemoglobinových řetězců. Postiţen můţe být kterýkoliv řetězec (α, β, δ, γ, ε). Obecně jsou tato onemocnění způsobena bodovou mutací či inzercí, delecí a jejich kombinacemi. Některé hemoglobinopatie jsou spojené s hemolýzou, popřípadě s polyglobulií a cyanózou. [1] Hemoglobinopatie S (srpkovitá anémie) Jde o skupinu hemoglobinopatií vyskytujících se především v oblastech s výskytem malárie. [1] Základním znakem onemocnění je dědičná změna v genu pro β-řetězec hemoglobinu. Pozměněný gen se značí βS. Vzniklý abnormální hemoglobin se nazývá HbS. Pokud je postiţený homozygot (zdědil βS od obou rodičů), je postiţen váţným onemocněním- srpkovitou anémií. [5] βS gen má velkou incidenci v tropických a subtropických oblastech, coţ je dáno výskytem malárie. HbS slouţí jako jakási ochrana před malárií způsobenou krevním parazitem Plasmodium falciparum. Rozdíl mezi HbS a normálním HbA spočívá v záměně kyseliny glutamové za valin na pozici 6. AK z N-konce β-globinového řetězce. Klinické následky vyplývají ze sklonu erytrocytů obsahujících HbS měnit tvar na drepanocyty (srpky). V odkysličeném stavu HbS podstupuje konformační změnu vedoucí ke vzniku tetrametrů Hb, které pak agregují za vzniku velkých polymerů. Erytrocyty díky tomuto jevu ztrácí svou deformabilitu,
vznikají
drepanocyty, 24
které
mají
navíc
poškozenou
membránu (zvýšení tuhosti). Drepanocyty jsou pak sekvestrovány RES, coţ vede k HA. Drepanocyty také mohou uvíznout v mikrocirkulaci a způsobit obstrukci a městnání krve. Klinický obraz: chronická HA, vaskulo-okluzivní krize, sekvestrační krize a náchylnost k infekcím. [5]
Hemoglobinopatie C Touto autozomálně recesivní chorobou jsou postiţeni homozygoti s HbC, heterozygotní nosiči jsou bezpříznakoví. Příčina je analogická jako u hemoglobinopatie S, jen je zde kyselina glutamová zaměněna za lyzin. Vzniklý HbC má odlišnou rozpustnost, v odkysličené formě tvoří krystaly. Erytrocyty následně ztrácí deformovatelnost a jejich přeţívání je kratší. [1] Další typy hemoglobinopatií: -
Choroby z hemoglobinu D
-
Hemoglobinopatie E
-
Choroby z nestabilních hemoglobinů
-
Hemoglobinopatie M
-
Hemoglobinopatie s odchylkou v afinitě ke kyslíku
6.2.2 Extrakorpuskulární HA Extrakorpuskulární HA zahrnují širokou škálu získaných hemolytických stavů, u kterých je příčina v okolních podmínkách a vlivech.
6.2.2.1
Imunitní extrakorpuskulární HA
Způsobené aloprotilátkami: -
potransfuzní hemolytické reakce
-
HON (hemolytické onemocnění novorozence) Způsobené autoprotilátkami (AIHA)
-
Autoimunitní HA- selhání kontrolních mechanismů imunity
-
2 typy autoprotilátek: -tepelné (IgG)- vazba při tělesné teplotě
25
-chladové (IgM)- optimální vazba při nízkých teplotách (22-31°C) V obou případech mohou být protilátky třídy IgG (senzibilizace erytrocytů), kdy následně dojde k sekvestraci slezinou. Nebo se můţe jednat o protilátky typu IgM, které jsou schopny způsobit přímo intravaskulární hemolýzu s aktivací komplementu. [1][2]
6.2.2.2
Neimunitní extrakorpuskulární HA
Opět se jedná o širokou škálu hemolytických syndromů, které mají velmi heterogenní příčiny. [1] Chemické, metabolické a biologické příčiny -
Nedostatek
fosfátů-
nedostatek
ATP,
sníţená
deformormabilita
erytrocytů, při parenterální výţivě či léčbě antacidy, erytrocyty vychytávány MMS -
Měď- blokace enzymů glykolýzy (Wilsonova choroba)
-
Olovo- porucha syntézy Hb, prudká hemolýza
-
Kyslík- ojediněle (hyperbarická komora)
-
Jedy- bodnutí hmyzem (vosa, včela, pavouk), štírem
-
Alkohol- jistý stupeň hemolýzy Fyzikální příčiny
-
Popáleniny- fyzikální a osmotická hemolýza
-
Mechaničtí činitelé- umělé chlopně, extrakorporální oběh (operační zákroky na srdci)
-
Pochodová hemoglobinurie- dlouhé tratě (běh, pochod) Infekční příčiny
-
Clostridium perfringens- exotoxin (rychlá a rapidní destrukce erytrocytů)
-
Malárie- extravaskulární hemolýza, splenomegalie
-
Trypanosomiáza- toxické i imunitní vlivy infekce
-
Leptospiróza- charakter MAHA
-
Bartonelóza 26
-
Babezióza
-
Borelióza- lehká splenomegalie MAHA (mikroangiopatické hemolytické anémie) U tohoto typu anémií dochází k intravaskulární hemolýze fragmentací erytrocytů.
-
HUS- hemolyticko-uremický syndrom
-
TTP- trombotická trombocytopenická purpura
-
HELLP syndrom- komplikace těhotenství
-
Katastrofický antifosfolipidový syndrom [1]
6.3
Anémie z krevních ztrát (akutní posthemorhagické)
Tato samostatná skupina anémií vzniká kvůli nadměrné ztrátě erytrocytů během krátké doby. Nermocný je tedy ohroţen prudkým sníţením objemu krve v cirkulaci a tím i hypovolemickým šokem aţ úmrtím (dle závaţnosti krevních ztrát). Příčiny jsou zde rozmanité: úrazy, jícnové varixy,
perforace
ţaludečního
či
duodenálního
vředu,
rozsáhlá
pooperační krvácení, ruptura aneurysmatu atd. Po náhlé ztrátě krve nastávají dvě fáze, kdy v první dominuje problematika hypovolemie bez známek vyplývajících z anémie a ve fázi druhé se projevují známky anémie, dojde k doplnění objemu a probíhá aktivní regenerace erytrocytů. Při masivní krevní ztrátě dochází také k rozvoji koagulopatie, která můţe také potencovat krvácivý stav. [3]
27
6.4
Anémie ze smíšených příčin (multifaktoriální)
Tato široká skupina anémií vzniká jako jeden ze sekundárních následků jiného onemocnění, které se přímo netýká erytrocytů. [2]
Tabulka č. 1: Přehled příčin multifaktoriálních anémií Chronické infekce -plicní (pneumonie, pleuritida, TBC aj.) -infekční endokarditida (bakteriální, mykotická) -renální a urologické záněty- nedostatečnost ledvin- porucha tvorby EPO -systémové mykózy -záněty v dutině břišní a pánevní -meningitida -esteomyelitida, pyogenní artritida -AIDS, TBC, lepra, tularemie, břišní tyfus, brucelóza, lymská borelióza aj. Chronické neinfekční zánětlivé stavy -nespecifické střevní záněty -hluboká tromboflebitida aj. Autoimunitní choroby -revmatická horečka -revmatoidní artritida -systémová onemocnění pojiva (SLE, nodózní polyarteritida, revmatická polymyalgie aj.) Maligní onemocnění -solidní tumory (karcinomy, sarkomy atd.) -hemoblastózy (maligní lymfomy aj.) Traumatické a pooperační stavy -poškození vysokou teplotou -potransplantační stavy Ostatní příčiny -chronická městnavá srdeční slabost -idiopatické stavy [2]
28
7 LABORATORNÍ ANÉMIÍ 7.1
VYŠETŘENÍ
V DIAGNOSTICE
Druhy vyšetřovaného biologického materiálu a jeho
odběr 7.1.1 Vyšetřovaný biologický materiál v diagnostice anémií: - Venózní periferní krev - Aspirát kostní dřeně [15]
7.1.2 Odběr biologického materiálu Odběr
biologického
materiálu
je
stěţejní
část
preanalytické
fáze
laboratorního vyšetření. Pro zamezení chyb je důleţité dodrţet obecné zásady odběru: -
Přesná a jednoznačná identifikace vzorku (předcházení záměně vzorků)- označení štítkem s čárovým kódem, jménem a rodným číslem pacienta atd.
-
Přiložení správně vyplněné žádanky s požadovanými vyšetřeními
-
Dodržení správného způsobu odběru, který je adekvátní pro daný typ materiálu (např. vhodná stabilizační a protisráţlivá činidla)
-
Správné poučení a příprava pacienta před odběrem
-
Šetrný a včasný transport odebraného vzorku do laboratoře [15]
Odběr plné krve pro morfologická vyšetření Odebírá se venózní krev do zkumavky s antikoagulačním činidlem K3EDTA (má malý vliv na většinu laboratorních stanovení obecně). Pacient by měl před odběrem přijmout dostatek tekutin. Venózní krev se získá venepunkcí většinou z kubitální ţíly ve fossa antebrachii nebo z ţíly v loketním ohbí. Popis průběhu odběru: -
Desinfekce místa vpichu a jeho úplné zaschnutí
-
Odběr pomocí vakuového systému, který je uzavřený, chrání pacienta (jednorázové pomůcky) i zdravotní personál (není zde kontakt s krví)
-
Ošetření místa vpichu
29
Poznámky k odběru: -
Odběr by neměl být prováděn z paţe se zavedenými katetry a přívody infuzí (zkreslení hematokritu, další interference).
-
Je důleţité odebrat předepsané mnoţství krve pro dodrţení poměru krve a protisráţlivého činidla.
-
Stabilita vzorku na morfologické vyšetření je 5 hodin (nutné do té doby transportovat do laboratoře). [15]
Odběr plné krve pro molekulární diagnostiku -
Odběr se provádí stejným způsobem jako na morfologické vyšetření, ale odebírá se menší mnoţství krve (2-10 ml)
-
Antikoagulancia: citrát sodný, sodná či draselná sůl EDTA
-
Pouţívají se komerčně dostupné odběrové sady pro odběr krve na izolaci NK (princip chemické stabilizace) [19]
Odběr aspirátu kostní dřeně Odběr aspirátu kostní dřeně provádí lékař ze spina iliaca posteriori superior nebo ze sterna pomocí cytologické jehly. Odběr se provádí do nádobky s protisráţlivým činidlem (EDTA) nebo se provede nativní aspirát. Je nutné provést punkci lege artis a okamţitě po odběru zhotovit na místě dobře hodnotitelné nátěry na podloţní sklíčka. [17] [18] Zhotovení nátěru: -
rozprostření kapky KD na hraně roztíracího skla
-
poté pouţití nového podloţního skla nebo provedení rozprostření na roztírací sklo v nakloněné Petriho misce
Barvení nátěru KD: -
panoptické barvení (May-Grünwald, Giemsa-Romanowsky)
Indikace: -
pokud nestačí klinické vyšetření a vyšetření PK
-
zhodnocení stavu krvetvorby [17] [18]
30
7.2
Konvenční hematologická vyšetření
7.2.1 Krevní obraz Vyšetření krevního obrazu na automatických analyzátorech V současné době se ke stanovení parametrů krevního obrazu (KO) pouţívá široká škála hematologických analyzátorů, které jsou na trhu. Obecnou výhodou automatických analyzátorů je moţnost zpracování velkého počtu vzorků během poměrné krátké doby a zajištění stejných podmínek stanovení pro všechny vzorky. Analyzátory jsou schopné rozlišit jednotlivé buněčné řady a v případě patologických neobvyklých nálezů vydají hlášku (flag), kdy je následně třeba provést mikroskopické vyšetření. Nejširší
uplatnění
mají
analyzátory
fungující
na
principu
měření
impedančním a optickém. Impedanční princip: Naředěná suspenze krevních buněk putuje nosným proudem do měřící kyvety. Na obou stranách kyvety je polarizované stejnosměrné elektrické pole, při průchodu buňky měřící aperturou dojde ke změně odporu prostředí a vybuzení napětí. Při průchodu buněk tak vznikají napěťové impulzy úměrné objemu buněk a na základě integrace počtu impulzů přístroj vyhodnotí i počet daných buněk. Nevýhodou tohoto systému je moţnost mnoha interferencí, neboť jsou měřeny prakticky všechny částice. Optický princip: Daná analýza je zaloţena na principu průtokové cytometrie, kdy dochází k interakci buněk s laserovým paprskem. Je zde detekováno rozptýlené světlo či fluorescence. Buňky zde procházejí průtokovou kyvetou pomocí hydrodynamické fokusace a při jejich průchodu jsou vyhodnoceny různé analýzy [1][16][17]: -
Analýza prošlého světla- počet buněk
-
Analýza rozptýleného světla- buněčný povrch, tvar, reflektivita
-
Analýza po fytochemickém obarvení buněk
-
Analýza fluorescence- detekce a specifikace buněk na základě povrchových CD znaků [1] [16] [17]
31
Parametry krevního obrazu: Tabulka č. 2: Parametry KO z analyzátoru Parametr
Zkratka
Princip stanovení
Počet ery Hemoglobin Hematokrit Střední objem ery Průměrné mnoţství Hb v ery Průměrná koncentrace Hb v ery Distribuční šíře ery Normoblasty Počet leukocytů Neutrofily Lymfocyty Monocyty Eosinofily Basofily Počet trombocytů Trombocytární hematokrit Střední objem trombocytů Distribušní šíře trombocytů Frakce nezralých trombo
RBC HGB HCT MCV
Dle principu analyzátoru spektrofotometrie Výpočet (RBCxMCV)/10 Dle principu analyzátoru
MCH
Výpočet (HGB/RBC)x10
MCHC
Výpočet (HGB/HCT)x100
RDW NRBC WBC NEU LYM MONO EOS BASO PLT
Odvození z objemu RBC Dle principu analyzátoru Dle principu analyzátoru
PCT
% dané populace x WBC/100 Dle principu analyzátoru Výpočtem (PLTxMPV)/10000
MPV
Dle principu analyzátoru
PDW
Odvození z objemu trombo
IPF
Nezralé PLT/všechny PLT [1]
32
Fyziologická rozmezí dle ČHS JEP Tabulka č. 3: Referenční rozmezí parametrů KO dle ČHS JEP-nad 15 let
Parametr
Ref. rozmezí
jednotka
WBC
4 - 10 Ţeny: 3,8 - 5,2 Muţi: 4,0 - 5,8 Ţeny:120 - 160 Muţi: 135 - 175 Ţeny: 0,35 - 0,47 Muţi:0,40 – 0,50 82,0 – 98,0 28 - 34 320 - 360 10,0 – 15,2 150 - 400 7,8 – 11,0 12 – 18 1,2 – 3,5 25 - 100 0 DIF leuko 45 – 70 20 – 45 2 – 12 0–5 0-2
109/l
RBC HGB HCT MCV MCH MCHC RDW PLT MPV PDW PCT RET# NRBC# NEU LYM MONO EOS BAS
1012/l g/l l/l fl pg g/l % 109/l fl % ml/l 109/l 109/l
%
[4]
7.2.2 Morfologická vyšetření v mikroskopu 7.2.2.1
Zhotovení a barvení nátěru periferní krve (ČHS ČLS JEP)
Nátěr PK se provádí za účelem zhotovení mikroskopického preparátu pro mikroskopické hodnocení morfologie krevních buněk. Provedení nátěru: -
Nanesení kapky PK (K3EDTA) k okraji podloţního skla
-
Přiloţení roztíracího skla před kapku pod úhlem 30-40 °
-
Vytvoření nátěru plynulým tahem
-
Zaschnutí nátěru cca 10min na vzduchu 33
Panoptické barvení: -
Základní barvení v hematologii
-
Pouţití kyselých a zásaditých barviv
-
Obarvení buněčných struktur a fixace (methanol pro archivaci)
-
Pouţití roztoků May-Grünwald a Giemsa-Romanowsky
Barvení se můţe provádět ručně dle předepsaného návodu nebo ve větších provozech laboratoří spíše na barvicích a nátěrových automatech [18]
7.2.2.2
Hodnocení nátěru PK v mikroskopu
Morfologické hodnocení erytrocytů Fyziologický erytrocyt (normochromní, normální MCV i tvar- normocyt):
Obrázek č. 1: Normocyt Převzato z:http://www.sekk.cz/eqa/2011/DIF211_Photo.htm (citováno 26.4.2016) Odchylky velikosti Mikrocyty- menší průměr neţ 6,7 µm a MCV pod 80 fl (anémie sideropenické, sideroblastické, některé hemoglobinopatie) Makrocyty- průměr větší neţ 7,7 µm, MCV nad 97 fl (nedostatek vit. B12 a kyseliny listové, MDS…) Anizocytóza- více neţ 10% erytrocytů o nestejné velikosti [16]
Obrázek č. 2: Mikrocyty Obrázek č. 3: Makrocyty Obrázky č. 2 a č. 3 převzaty z: https://quizlet.com/24010266/rbc-morphology-flash-cards/ (citováno 27.4.2016) 34
Obrázek č. 4: Anizocytóza Převzato z: https://quizlet.com/24010266/rbc-morphology-flash-cards/ (citováno 27.4.2016)
Odchylky barvitelnosti Hypochromie- sníţený obsah Hb v ery Polychromazie- ery s modravým nádechem, mladé formy částečně bazofilní (RNA, DNA) Anizochromie- nestejný obsah Hb v ery (odlišná barvitelnost) [16] Odchylky tvaru (morfologické anomálie) Akantocyty- ery s ostnatými výběţky, hereditární akantocytóza Dakryocyty- ery slzovitého tvaru, myelofibróza, perniciózní anémie, thalassemie, některé HA Drepanocyty- srpkovité ery, srpkovitá anémie, thalassemie Eliptocyty, ovalocyty- oválný tvar, dědičná ovalo či eliptocytóza Keratocyty- rohovité ery s 1-2 výběţky Poikilocytóza- různý aţ bizarní tvar, těţké anémie Sférocyty- kulovité aţ bochníkovité ery, sytě barvitelné, hereditární sférocytóza Schistocyty- fragmenty ery tvaru helmice či skořápky, MAHA Stomatocyty- ery s centrálním projasněním ve tvaru pootevřených úst, vrozená stomatocytóza, cirhóza jater Terčovité
ery-
tvarově
podobné
klobouku,
tenké
hemoglobinopatie (thalassemie, hemoglobinopatie C) [16]
35
ery,
HA-
Inkluze v erytrocytech Bazofilní tečkování- jemná tmavomodrá zrnka v ery (agregáty RNA, ribozomů), anémie z otrav kovy, z těţkých infekcí Cabotovy
prstence-
zbytky
jaderné
membrány
erytroblastů,
megaloblastové anémie Howell-Jollyho tělíska- zbytky jaderných chromozomů, červenofialová zářivá tělíska, 1-3 v jednom ery, perniciozní anémie, splenektomie Heinzova tělíska- denaturovaný Hb (precipitace oxidovaného Hb a bílkovin stromatu membrány), deficit G-6-PD, uţití oxidačních látek, nestabilní hemoglobiny Papenheimerova tělíska- granula ţeleza v mitochondriích, téţké anémie, thalassemie, splenektomie [16]
7.2.3 Stanovení retikulocytů Technologický pokrok analyzátorů poskytuje v dnešní době i zhodnocení rovnováhy mezi mírou erytropoézy a zásobami Fe či neefektivní erytropoézu. V posledním desetiletí se podstatně změnily poznatky ohledně homeostázy Fe. Centrálním regulátorem vstřebávání Fe je malý peptidický hormon hepcidin, který inhibuje tok Fe do plazmy z makrofágů recyklujících staré erytrocyty. Vliv na expresi hepcidinu mají zásoby Fe, erytropoetická aktivita, Hb, obsah kyslíku v krvi, přítomnost zánětů. Anémie z nedostatku ţeleza nastává při vyčerpání jeho zásob v těle. Spolehlivý biomarker stavu Fe je hladina sérového transferinového receptoru (sTfR). Pokud dojde k anémii u chronického onemocnění ledvin, příčina spočívá v nedostatečné syntéze EPO. Příčina anémie můţe být i na straně sníţené proliferační aktivity erythroidních prekurzorů v kostní dřeni, zkrácené přeţívání erytrocytů či sníţená dostupnost Fe. Parametr,
pomocí
kterého
dobře
posoudíme
účinnost
erytropoézy
vzhledem k hladině Fe je stanovení retikulocytů. [20- 24] Retikulocyty jsou nezralé formy erytrocytů, které jiţ nemají jádro a obsahují zbytky jaderné RNA. Při
kompenzatorně zvýšené erytropoéze jsou
36
retikulocyty zvýšeně vyplavovány do periferní krve (při substituci Fesideropenické anémie, při nedostatku B12-megaloblastové anémie atd.). Zmíněný děj se nazývá retikulocytární krize. Při hemolytických anémiích je počet retikulocytů zvýšen trvale. U anémií z chronických onemocnění je vyplavování retikulocytů sníţeno (nedostatek EPO, zvýšená hladina cytokinů). [15]
Retikulocytární index Přesně vystihuje stupeň nedostatečnosti dřeňové erytropoézy s ohledem na hladinu RTC vzhledem ke stupni anémie, čili odpověď organismu na anémii. [15] 𝑛𝑎𝑚ěř𝑒𝑛á ℎ𝑜𝑑𝑛𝑜𝑡𝑎 𝐻𝑏 𝑅𝐼 = 𝑅𝑇𝐶 . 𝑛𝑜𝑟𝑚í𝑙𝑛í ℎ𝑜𝑑𝑛𝑜𝑡𝑎 𝐻𝑏 Metody pro stanovení retikulocytů: -
Automatické analyzátory- průtoková fluorescenční cytometrie
-
Mikroskopické stanovení- ruční supravitální barvení (brylantkresolová modř- obarvení RNA struktur) [16]
Shrnutí významu: -
Posouzení aktivity a regenerace KD (chemoterapie, transplantace)
-
Diagnostika a terapie anémií
-
Posouzení léčby chronických onemocnění- léčba erytropoetinem při chronickém selhání ledvin [16]
7.2.4 Morfologické hodnocení nátěru kostní dřeně Součástí hodnocení je stanovení relativního rozpočtu hematopoetických buněk (myelogram) a morfologický popis hematopoetických vývojových řad a dalších buněk přítomných v kostní dřeni. [14] Pro celkové hodnocení a interpretaci výsledků je také důleţité znát: -
vstupní a suspektní klinickou diagnózu (popř. diferenciálně diagnostická rozvaha)
-
zhodnocení stavu hematopoetických orgánů (uzliny, slezina, játra)
-
další klinické a laboratorní nálezy (osobní anamnéza aj.)
-
druh podávané léčby [14] 37
Mikroskopické hodnocení: Nejdříve při 100-400 násobném zvětšení ve všech místech nátěru: -
kvalita
-
buněčnost
-
přítomnost a morfologie megakaryocytů
-
orientační zastoupení vývojových řad
-
přítomnost ostrůvků erytropoézy
-
přítomnost velkých fyziologických i patologických buněk
-
přítomnost ojedinělých patologických buněk u těţce hypocelulárních nátěrů
-
výběr úseku, kde jsou buňky náleţitě rozprostřeny a je vhodnýpro větší zvětšení [14] Kvantitativní hodnocení- zvětšení 1000x - provádí garant výkonu (hematolog lékař) - součástí výsledku je interpretace myelogramu s klinickou rozvahou - započítává se granulopoéza, erytropoéza, lymfocytopoéza a monocytopoéza - nezahrnují se: makrofágy, megakaryocyty, promegakaryocyty, osteoblasty/osteoklasty, nádorové buňky - hodnocení morfologických změn- slovní komentář [14]
7.3 Biochemická vyšetření, speciální metody 7.3.1 Elektroforéza hemoglobinu Vyuţití: -
Charakterizace poruchy Hb
-
Diagnostika thalassemií
-
Detekce běţných variant Hb
-
Identifikace vzácných variant Hb
38
instrumentální
Elektroforéza je metoda zaloţená na migraci elektricky nabitých molekul v elektrickém poli. Jedná se o jednu z nejdůleţitějších metod v detekci abnormálních Hb. Poprvé byla pro tyto účely pouţita v roce 1949 pro odhalení HbS (β6 glu>val)- Pauling. [91] V dnešní době existuje mnoho variant elektroforézy: Zónová ELFO na acetát-celulózových prouţcích (CAE)- stále pouţívaná metoda pro svoji jednoduchost a niţší cenu, dochází k dělení Hb molekul při alkalickém pH, molekuly migrují ke katodě (mají negativní náboj) [25] Izoelektrická fokusace (IEF)- v gradientu pH vytvořeném nosnými amfolyty migrují molekuly Hb v elektrickém poli gradientem, dokud nedosáhnou polohy s celkovým neutrálním nábojem (izoelektrický bod), jednotlivé typy Hb se pak koncentrují do ostře ohraničených pásů, výhodou je vysoká citlivost oproti CAE, ale finančně je tato metoda náročnější a vyţaduje zkušenější laboratorní personál [27]
Obrázek č. 5: Izoelektrická fokusace hemolyzátu obsahujícího různé varianty Hb Převzato z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3237254/figure/F1/ (citováno 27.4. 2016) CE-HPLC- jedná se o moderní perspektivní metodu, kde je sloučena kapilární elektroforóza s HPLC detekcí, tato metoda je vysoce citlivá, mezi výhody patří online detekce, semiautomatizace a přímá kvantifikace normálních a abnormálních frakcí Hb [28][29]
39
7.3.2 Absorpční spektrofotometrie Průkaz nedostatku erytrocytárních enzymů Absorpční spektrofotometrie je metoda zaloţená na detekci změny absorbance, ke které dochází po proběhnutí specifické reakce (oxidace, redukce) mezi enzymem a substrátem. Měření se provádí v UV-VIS oblasti spektra elektromagnetického záření. Změna absorbance je přímo úměrná aktivitě enzymu. Pro stanovení koncentrací jednotlivých metabolitů se pouţívají přímé kvantitativní metody (např. HPLC-MS). Aktivita enzymů mnohdy souvisí se stářím erytrocytů, zvýšená retikulocytóza můţe následně zvýšit aktivitu některých enzymů (aldolázy, PK, G-6-PD) a způsobit tak falešnou negativitu. Také při niţším průměrném přeţívání erytrocytů se mohou enzymatické aktivity lišit např. u dětí oproti dospělým. [19] Stanovení G-6-PD NADP je redukován enzymem G-6-PD za přítomnosti G-6-P. Mnoţství vzniklého NADPH je přímo úměrné aktivitě enzymu, která se měří spektrofotometricky. Vyhodnocení mnoţství enzymu se provádí z nárustu absorbance při určité vlnové délce. [1] Stanovení PK (pyruvátkinázy) Ke vzorku pacienta se přidá nadbytek fosfoenolpyruvátu, ADP a NADH. V přítomnosti PK a LD dochází k reakcím za spotřeby NADH. Následně se po reakci spektrofotometricky zjistí mnoţství NADH. Pokles NADH je pak nepřímo úměrný aktivitě PK. [1]
7.4
Cytochemie
Stanovení HbF Princip: Fixované nátěry periferní krve se inkubují v roztoku chloridu ţelezitého s hematoxylinem. Dojde k vyplavení HbA z buněk, v nátěru tedy zůstanou jen stromata erytrocytů, ve kterých zůstává HbF. HbF se následně dobarví erytrozinem a mikroskopicky se odečte. Hodnotí se počet plných sytě růţových erytrocytů na 1000 erytrocytů. 40
Zvýšené hodnoty: sférocytární anémie, erytroleukemie, aplastická anemie, dědičné setrvávání HbF v ery, megaloblastové anémie, PNH, myelofibrózy, refrakterní anémie, β-thalassemie minor, homozygotní β-thalassemie [1] Barvení Heinzových tělísek Přímé barvení: -
smíchání plné krve s barvicím roztokem, zhotovení nátěru a následné hodnocení přítomnosti Heinzových tělísek v mikroskopu
-
pozitivita: nestabilní Hb, hemoglobinopatie, po splenektomii [1]
Barvení s acetylfenylhydrazinem: -
inkubace plné krve s acetylfenylhydrazinem, coţ je redukující látka, díky které Heinzova tělíska vzniknou
-
následné provedení nátěru a obarvení [1]
7.5 Molekulárně- biologické metody 7.5.1 Příprava vzorku Izolace NK V běţné praxi se dnes pouţívá několik různých technologií izolace (dle druhu a mnoţství biologického materiálu): Izolace na kolonkách- nejrychlejší metoda, NK je navázána na silikagelovou membránu filtru, nečistoty jsou vymyty a NK se eluuje, výhodou jsou zde dobré parametry čistoty, jednoduchost a rychlost Izolace s pouţitím směsi fenolu a chaotropních solí -
Lýza buněk vzorku (quanidium izothiokyanát a fenol)
-
Přidání chloroformu
-
Centrifugace (rozdělení do fází- horní vodná obsahuje RNA, na rozhraní se nachází DNA a v organické spodní fázi jsou bílkoviny)
-
Precipitace RNA z vodné fáze alkoholem
-
Nevýhoda- technická a časová náročnost
-
Výhoda- moţnost současné izolace RNA, DNA a proteinů
Po izolaci se provede ošetření RNA enzymem DNAzou.
41
Další metody izolace NK: -
Např.
magnetická
separace-
vazba
NK
na
povrch
fixovaných
magnetických částic [19]
Kontrola kvality NK Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty- základní metoda -
Hodnocení absorbance při 260nm a při 280nm, poměr těchto absorbancí vypovídá o kontaminaci (proteiny). [19]
-
Očekávané poměry jsou 1,8 pro DNA a 2,0 pro RNA. [31]
-
Poměr absorbancí menší neţ 1,75 svědčí pro obsah kontaminujících bílkovin (v případě vyššího obsahu nečistot se provede reprecipitace vzorku). [31] Denaturační gelová ELFO Gelová ELFO Přístroj BioAnalyzer (Agilent) Zkušební PCR amplifikace vzorku [19]
7.5.2 Cytogenetické metody Konvenční cytogenetické metody Cytogenetika je odvětví genetiky umoţňující sledovat změny genomu na úrovni chromosomů. Spektrum metod je široké a stále se rozvíjí nové moderní metody. Slouţí ke stanovení karyotypu. Nejdůleţitějšé a nejpouţívanější cytogenetické metody: G-pruhování- základní vyšetřovací metoda, od které se odvíjí další cytogenetické a molekulárně genetické vyšetření. Metoda je zaloţena na působení enzymu trypsinu a barvení Giemsa-Romanowski. Výhodou je stabilita zhotovených preparátů, které jsou vhodné k rutinním vyšetřením. [19] C- pruhování- specifické barvení centromerických oblastí chromosomů bohatých na repetitivní sekvence. Metoda je zaloţena na působení nasyceného roztoku hydroxidu barnatého při vysokých teplotách. Dojde ke zvýraznění bloků konstitutivního heterochromatinu. [19] 42
Molekulárně cytogenetické motedy -
Nejčastěji se pouţívá dvoubarevná FISH na základě pouţití DNA sond, které hybridizují k předem známým cílovým sekvencím
-
Při vyšetření chromosomových abnormalit, které jsou dostatečně zmapované [19]
FISH (fluorescenční in situ hybridizace) -
exaktnější identifikace chromozomálních změn- napomáhá zpřesnit cytogenetický výsledek klasických analýz zaloţených na G-pruhování
-
umoţňuje zviditelnit sekvence NK přímo na mikroskopických preparátech (obsahují morfologicky zachovalé chromosomy, jádra či tkáňové řezy)
-
metoda
zaloţená
na
pouţití
značené
hybridizační
sondy
(jednořetězcové) sondy - v důsledku komplementarity bází se sonda můţe navázat po denaturaci na cílovou sekvenci DNA ve vzorku [19]
-
konjugované s fluorochromy (SpectrumGreen, SpectrumOrange)
-
identifikace míst s navázanými sondami ve fluorescenčním mikroskopu
-
počet a poloha jednotlivých fluorescenčních signálů informuje o početních i strukturních změnách chromosomů
-
dle počtu cílových sekvencí rozlišujeme jedno a vícebarevné FISH [19]
Kroky metody:
fixace materiálu, zhotovení preparátu
příprava a značení sond
denaturace sondy a cílového místa
hybridizační reakce mezi sondou a cílovým místem
odmytí
barvení pozadí
vyhodnocení a dokumentace [19] [31]
43
8. DĚDIČNÉ ANÉMIE- LABORATORNÍ NÁLEZY U NĚKTERÝCH TYPŮ 8.1
Thalassemie
Pro tuto heterogenní skupinu dědičných onemocnění je společným znakem porucha syntézy Hb. Dle základní klasifikace anémií se thalassemie řadí mezi hypochromní mikrocytární anémie s různou závaţností. Nevyváţená syntéza α a β globinových řetězců ovlivňuje destrukci erytrocytů dvěma způsoby: První mechanismus- selhání rovnováhy mezi syntézou α a β globinových řetězců vede ke sníţení hemoglobinizace erytrocytů, mnohdy aţ na úroveň neslučitelnou s jejich přeţíváním. Hypochromní erytrocyty pak špatně uvolňují kyslík do cirkulace. Druhý
mechanismus
poškození
erytrocytů
je
agregace
vadných
globinových řetězců a vznik inkluzí, coţ vede k urychlené apoptóze erytroidních prekurzorů v KD (neúčinná erytropoéza). Zralé erytrocyty jsou zvýšeně vychytávány slezinou, kde jsou hemolyzovány. Klinická závaţnost thalassemie je přímo úměrná stupni nerovnováhy syntézy α a β globinových řetězců. Thalassemie patří mezi nejčastější dědičné anémie. Nosiči mutantního genu mají určitou ochranu před malárií (Plazmodium falciparum). Výskyt ve většině populace je sporadický, ale nejvyšší frekvence výskytu je v oblasti Středozemního moře, blízkého východu, Indie a jihovýchodní Asie. [5] Klasifikace Tabulka č. 4: Klasifikace thalassemií [5]: Heterozygoti homozygoti Typ thalassemie α-thalassemie α0 (- -/) α+ (-α/)
Thalassemia minor Hydrops fetalis Thalassemia minor Thalassemia minor
β- thalassemie β0 β+
Thalassemia minor Thalassemia major Thalassemia minor Thalassemia Major nebo intermedia 44
Laboratorní nálezy: Krevní obraz: -
Hypochromie, počet RBC normální, MCH sníţený, makrocytóza při pouze mírné anizocytóze, u dětských pacientů je důleţité přihlédnout k hodnotám MCV a MCH závislým na věku [17] Morfologické zhodnocení krevního nátěru:
-
Někdy terčovité erytrocyty, často bazofilní tečkování, moţný výskyt erytroblastů (zvýšení erytropoézy) [17]
Obrázek č. 6: Nátěr periferní krve při thalassemii Převzato: http://www.pathologystudent.com/?p=1233 (citováno 20.4.2016) Důleţité klinické příznaky: -
Splenomegalie [17]
Prenatální diagnostika: Genetické poradenství a prenatální diagnostika hrají důleţitou roli v úspěšnosti preventivních programů. Vše závisí na včasné identifikaci ohroţených párů. Vyšetření je moţné provést z adekvátního mnoţství fetální DNA získané kolem 10. týdne těhotenství odběrem vzorku choriových
klků.
Současné
moderní
metody
umoţňují
spolehlivou
identifikaci bodové mutace i z velmi malých vzorků DNA. Vyšetření je také 45
moţné provádět ze vzorku maternální plazmy či periferní krve, neboť 3-10 % celkové DNA extrahované z maternální plazmy je fetální DNA a její koncentrace stoupá se zvyšujícím se gestačním věkem. Při výzkumu na Malajské univerzitě bylo prokázáno, ţe u ohroţených párů fetální DNA obsahuje minimálně jeden paternální SNP. Tuto metodu s vyuţitím SNP sternální alely lze tedy pouţít jako neinvazivní prenatální diagnostickou metodu u párů s ohroţením plodu β-thalassemií. [5] [32- 36]
Blackfen-Diamondova anémie (DBA)
8.2
Vzácná kongenitální aplazie červené řady, která vzniká na základě mutace v ribozomálních proteinech (RP). [7] Klinicky se jedná o heterogenní skupinu, přibliţně třetina nemocných je postiţena potransfúzním přetíţením ţelezem (u DBA závislých na transfúzích). Závaţnost anémie a závoslost na transfúzích je srovnatelná s β-thalassemií major. [8- 10] Hodnocení markerů erytropoetické aktivity a metabolismu ţeleza včetně klíčové molekuly- hepcidinu je důleţité kvůli hrozícímu přetíţení Fe. [11] [12] Při opakovaném podávání krevních transfúzí hrozí srdeční, jaterní či pankreatické přetíţení Fe, neboť jeho hladina v séru i v játrech je nadměrně zvýšena a tělo jej nedokáţe spotřebovat, současně je výrazně potlačena erytropoéza. [13] Při léčbě steroidy a leucinem dochází ke zlepšení erytropoézy (lepší poměr hepcidin-ferritin). Také se podávají chelátory Fe. [12] Hodnota hepcidinu u DBA odráţí erytropoetickou aktivitu v KD. [12] Laboratorní nálezy: -
Makrocytární
anémie,
perzistence
fetální
erytrocytární adenosindeamináza [19] Klinické nálezy: -
Vady skeletu, srdce, ledvin, malý vzrůst [19]
46
erytropoézy,
zvýšená
8.3
Hemoglobinopatie S- Srpkovitá anémie
Srpkovitá anémie je chronická anémie vyznačující se okluzí cév a endotheliálním poškozením, následkem pak bývá progresivní poškození orgánů, často neurologická poškození. Přibliţně 11% pacientů má mrtvici ještě před dosaţením 20 let věku. U 70% nemocných pak hrozí opakované mrtvice, pokud se neléčí. Navzdory trvalé transfuzní terapie pacienti, kteří jiţ mrtvici měli, trpí neurologickým poškozením (zjevný i tichý mozkový infarkt). [40- 42]
Rozvoj v diagnostice Univerzální screening a včasná intervence výrazně napomáhají sníţení úmrtnosti dětí v zemích s vysokým výskytem tohoto onemocnění. Bohuţel monoho dětských pacientů ţijících v nízkozdrojových podmínkách (země s válečnými konflikty, zasaţení přírodní katastrofou a jiné extrémní podmínky) často ani není diagnostikováno, dokud se neobjeví závaţné klinické potíţe v pozdním dětství. Současné diagnostické metody jsou zaloţené na pokročilých laboratorních systémech, často jsou příliš drahé a časově náročné pro lokality s nízkozdrojovými situacemi. Pro tyto situace byl vyvinut SickleSCAN™test, coţ je test pro diagnostiku srpkovité anémie v místě poskytování péče (POCT)- pro situace bez elektřiny a moderního vybavení. Test je zaloţen na kvalitativní laterální průtokové technologii, principem je imunochromatografie. Pro diagnostiku se pouţívá kapilární krev a testuje se přítomnost Hb A, S a C. Detekce výsledků probíhá pouhým okem. Dochází k vazbě na detekční protilátky (myší monoklonální protilátky konjugované s modrými nanočásticemi). Celková diagnostická přesnost je 99%. Daný test má velký potenciál pro význam v diagnostice a léčbě srpkovité anémie po celém světě. Kromě diagnostických metod je velmi důleţité genetické poradenství v rámci prevence. [37- 39]
47
Obrázek č. 7: Sickle SCAN™test Převzato: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4573998/figure/Fig1/ (citováno 29.4.2016)
Stanovení RTC při chronické transfuzní terapii (CTT) u srpkovité anémie CTT je v dnešní době standardní léčbou u pacientů se srpkovitou anémií, kteří prodělali mrtvici. Cílem léčby je sníţení HbS na 30% či méně a zvýšení hladiny HbA pro zlepšení oxygenace tkání. Při srpkovité anémii se projevuje erytropoéza celoţivotní retikolocytózou (kompenzační mechanismus). K identifikaci RTC se pouţívá průtoková cytometrie. Cerebrovaskulopatie je při zahájení CTT léčby spojená s nárustem retikulocytózy. Absolutní počet retikulocytů (ARC) můţe být vhodným ukazatelem závaţnosti srpkovité anémie. Niţší hladiny HbS korelují s niţším ARC, nicméně u CTT nebylo prokázaná přímá souvislost s významným sníţením ARC při porovnání s výchozími hodnotami ARC před zahájením CTT léčby. Vlastnosti retikulocytů je proto do budoucna potřeba ještě prostudovat a objasnit souvislosti v kinetice retikulocytózy posttransfuzně a identifikovat signalizační procesy vedoucí k adhezi retikulocytů k endothelu. [43- 51] Laboratorní nález: Krevní obraz: -
Většinou normocytární normochromní
-
Těţká anémie (Hb 60-100 g/l)
-
Zvýšený počet RTC 48
-
Často současně leukocytóza s neutrofilií a trombocytemie (atrofie sleziny a ztráta fyziologické sekvestrace) [1] Nátěr PK:
-
Anizocytóza, poikilocytóza
-
Variabilní mnoţství srpkovitých ery (drepanocytů), mohou se nacházet terčovité ery, Howell-Jollyho tělíska, ovalocyty
-
Moţný nález normoblastů (při autosplenektomii) [1]
Obrázek č. 8: Drepanocyty v nátěru periferní krve (označeno šipkami) Převzato z: http://www.medical-labs.net/sickle-cell-anemia-and-drepanocytes-onsmear-202/ (citováno 23.4.2016)
ELFO Hb: HbS má aditivní kladný náboj, tudíţ je pomalejší oproti jiným molekulám Hb, coţ se významně projeví při elektroforéze. [25] Prenatální screening Genetické poradenství je potřeba u postiţených homozygotní formou i u heterozygotních dvojic. Prenatální diagnostika je moţná analýzou mutací s PCR amplifikované DNA z choriových klků. [30]
49
8.4
Hereditární sférocytóza
Hereditární sférocytóza je jedna z nejčastějších dědičných chronických hemolytických anémií v Severní Evropě a Severní Americe a v kavkazské populaci vůbec. Klinické příznaky onemocnění jsou různé dle stupně závaţnosti proteinových defektů v erytrocytární membráně. U lehkých forem můţe být identifikace obtíţná, neboť tito pacienti mohou mít normální hladinu Hb i bilirubinu. Mírné formy se mohou zhoršit po prodělání infekčního
onemocnění
(např.
infekční
mononukleóza).
Laboratorní
diagnostika obvykle nebývá obtíţná, pro konečné určení diagnózy je také důleţité zhodnocení klinické i rodinné anamnézy a výsledky fyzikálních a jiných vyšetření (splenomegalie, ikterus aj.). [54][55] O tom, jaká laboratorní vyšetření jsou potřeba provést, rozhoduje míra souvislostí či nejasností při určování diagnózy. U pacientů s rodinnou anamnézou s typickými klinickými projevy postačí k určení správné diagnózy
výsledky
běţných
laboratorních
vyšetření
hematologické
laboratoře- sférocytóza, zvýšené MCHC, zvýšený počet RTC. Nebývají potřeba další testy. Pokud je diagnóza nejasná, často jsou uţitečné screeningové metody s vysokou predikcí pro HS. Mezi tyto testy patří např. Kryohemolýza, EMA. U atypických případů můţe být provedena gelová elektroforéza
pro
analýzu
membránových
proteinů.
HS
můţe
být
diagnostikována v kaţdém věku, ale nejčastěji bývá odhalována v dětském věku a u mladých lidí. [69] Morfologické vyšetření erytrocytů Kromě sférocytů se mohou v periferní krvi vyskytovat i erytrocyty s jinou morfologií jako akantocyty (pacienti s mutací β-spektrinu), erytrocyty houbovitého tvaru či ovalostomatocyty (mutace u japonských pacientů s HS- mutace genu pro protein 4.2). Je důleţité odlišit hereditární sférocytózu od hereditární stomatocytózy a podobných poruch. Všechny tyto poruchy erytrocytární membrány jsou vzácné a výsledky morfologie nemusí být zcela typické. [56- 60] [65]
50
Artefakt- makrosférocyty Tento artefakt můţe vznikat v krevním nátěru v důsledku uchovávání krevních vzorků při niţších teplotách u pacientů s kryohydrocytózou (variantní forma hereditární stomatocytózy). Mohlo by pak dojít k chybnému návrhu diagnostiky atypické hereditární sférocytózy. Odlišení je důleţité, neboť sférocyty mají abnormální propustnost membrány pro kationty, která není spojena s defektem specifického membránového proteinu.[61] Diagnostika HS u novorozenců V novorozeneckém věku můţe být diagnostika HS obtíţná. Nejdříve je důleţité vyloučit hemolýzu způsobenou mateřskými nepravidelnými protilátkami (negativní PAT). V případě, ţe je dítě v dobrém klinickém stavu, diagnostika můţe být odloţena minimálně do 6 měsíců věku, kdy uţ bývají výsledky morfologie méně matoucí. Test vazby eozin-5maleimidu (EMA) slouţící jako screeningová metoda, bývá pozitivní bez ohledu na morfologii. [66] V současné době je uţitečnějším indikátorem hodnota MCHC nad 360g/l. Děti narozené rodičům s HS je třeba pečlivě sledovat v průběhu několika dní po porodu kvůli závaţné hyperbilirubinemii. Často bývá potřebné podání transfúzí kvůli nedostatečné odpovědi erytropoézy na hemolýzu, obvykle se tak stává v prvním roce ţivota. Opakovaným transfúzím je ale třeba se, pokud moţno, vyhnout. Přínosem pro zábranu opakovaných transfúzí můţe být léčba erytropoetinem. [70] Screeningové testy Jako screeningová metoda se pouţívá EMA, která je zaloţená na vazbě eosin-5-maleimidu na specifické transmembránové receptory. K detekci se pouţívá průtoková cytometrie, kdy se stanovuje míra fluorescence. [67] Pouţití SDS-PAGE metody Tato metoda se provádí: - pokud je klinický fenotyp váţnější, neţ bylo předpokládáno dle výsledků 51
morfologie RBC - pokud je morfologie RBC dítěte závaţnější neţ tomu bylo u krevních nátěrů rodičů s HS - pokud je diagnóza nejasná a je třeba odlišit HS od jiných poruch erytrocytárních membrán, pokud se uvaţuje o provedení splenektomie. Splenektomie totiţ nemusí být vţdy vhodná a přináší riziko trombóz. [68] Metoda SDS-PAGE je elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti
dodecylsulfátu
sodného.
Slouţí
k
identifikaci
deficu
membránových proteinů spojených s cytoskeletem erytrocytu a k potvrzení diagnózy HS. Kvatifikace membránových proteinů pomocí SDS-PAGE není nezbytná ve většině případů. [62- 64] Genetická analýza Pro detekci genetických mutací erytrocytárních membránových proteinů mohou být pouţity metody na bázi DNA. Rychlý screening je zaloţený na konfirmaci jednovláknových polymorfismů a můţe být pouţit k detekci mutací v kódující oblasti cDNA všech genů spojených s HS. [62- 64] Laboratorní nález Krevní obraz - lehčí aţ středně těţká normocytární normochromní anémie - zvýšené MCHC (350-380 g/l) - někteří pacienti i normální hodnoty krevního obrazu - zvýšená hladina retikulocytů [1] Další vyšetření - osmotická rezistence erytrocytů sníţená (důleţitý nález) - vysoká specifita a senzitivita- barvení eozin-5-maleimidem, detekce průtokovou cytometrií - zvýšený bilirubin (známka hemolýzy)
52
Nátěr kostní dřeně - hyperplazie erytropoézy, zásoby ţeleza normální aţ zvýšené [1] Nátěr periferní krve - v různém počtu sférocyty [1]
Obrázek č. 9: Sférocyty v nátěru periferní krve Převzato z: http://www.medical-labs.net/hereditary-spherocytosis-988/ (citováno 23.4.2016)
Obrázek č. 10: Howel-Jollyho tělísko v erytrocytu, mohou se nacházet při HS Převzato z: http://www.medical-labs.net/hereditary-spherocytosis-988/ (citováno 23.4.2016) 53
8.5
Defekt G-6-PD
Deficit G-6-PD, nejčastější enzymatický defekt u pacientů po celém světě zahrnuje řadu příznaků- neonatální hyperbilirubinémii, akutní hemolýzu či chronickou hemolýzu. Někteří pacienti s touto diagnózou mohou být i bezpříznakoví. Celosvětově je danou poruchou postiţeno asi 400 milionů lidí. Závaţnější bývá u homozygotních jedinců. [88] Základem diagnostických testů je přeměna NADP na redukovanou formu v erytrocytech. Obvykle jsou testy zaloţeny na fluorescenční detekci. Rozdílné genové mutace způsobují vznik různých forem deficitního enzymu, od čehoţ se odvíjí stupeň závaţnosti onemocnění. [80- 82]
Diagnostika Diagnostický test je zaloţen na kvantitativní spektrofotometrické analýze nebo se jedná o rychlý fluorescenční test s detekcí NADPH vzniklého z NADP. Test je pozitivní, jestliţe skvrna s kapkou krve nefluoreskuje pod UV lampou. Testy zaloţené na PCR detekují specifické mutace a pouţívají se pro screening populace, rodinné studie či v prenatální diagnostice. U pacientů s akutní hemolýzou mohou být testy falešně negativní, neboť starší erytrocyty s vyšším deficitem G-6-PD jiţ hemolyzovaly. Mladé erytrocyty a retikulocyty mají normální či mírně sníţenou aktivitu enzymu. Stejně tak v případě heterozygotních ţen můţe být diagnostika obtíţnější, protoţe mozaicismus vázaný na chromozom X vede jen k částečnému deficitu enzymu, který nemusí být detekován spolehlivě pomocí klasických testů. [80- 86] Deficit G-6-PD je jednou z vrozených hemolytických anémií a její diagnóza by měla být prováděna u dětí s rodinnou anamnézou zahrnující ţloutenku, anémie, splenomegalii či cholelithiázu, a to zejména v oblasti Středomoří. Testování by také mělo být zváţeno u dětí a dospělých, kteří prodělali akutní hemolytickou reakci způsobenou infekcí, oxidačním činidlem či poţitím fazolí fava. [86] 54
Přestoţe je deficit G-6-PD vzácné onemocnění, mělo by se k němu přihlíţet jako na moţnou příčinu u jakékoliv chronické nesférocytové hemolytické anémie napříč všemi skupinami obyvatel. Novorozenecký screening se o tohoto onemocnění běţně neprovádí, WHO přesto doporučuje provádět daná vyšetření v oblastech s prevalencí od 3 aţ 5 %. [3][13] Laboratorní parametry pro akutní hemolýzu: - střední aţ těţká anémie - RTC počet- zvýšený 4-7 dní po hemolýze - nátěr periferní krve- Heinzova tělíska - Haptoglobin- zvýšený - funkční zkoušky jater- zvýšený nepřímý bilirubin - Coombsův test- negativní [87] Laboratorní nález- shrnutí: - nátěr periferní krve- Heinzova tělíska v průběhu hemolytické krize - pozitivní methemoglobinový redukční test- vznik čokoládově hnědého zabarvení po přidání methylenové modři - fluorescenční test- průkaz nedostatku redukované formy NADPH - stanovení aktivity G-6-PD- pro potvrzení diagnózy - ELFO erytrocytárních enzymů- nedostatek G-6-PD [1]
8.6 Tato
Kongenitální Fanconiho anémie (FA) geneticky
i
fenotypově
heterogenní
recesivní
porucha
je
charakteristická různými vývojovými vadami a progresivní pancytopenií. Je zde také predispozice k hematologickým malignitám. Mezi charakteristické znaky patří pancytopenie, hyperpigmentace, malformace skeletu, malý vzrůst, urogenitální abnormality a familiární výskyt. [79] Přecitlivělost na klastogenní efekt DNA-zesíťovacích činidel (cross-linking činidla) představuje jedinečný marker pro FA genotyp. Tato buněčná vlastnost můţe být pouţita pro identifikaci pre-anemických případů, stejně 55
tak u pacientů s aplastickou anémií či leukémií, kteří nemají charakteristický klinický obraz. Toto je důleţité pro prenatální i postnatální diagnostiku FA. [71][72] FA se vyskytuje u všech ras a etnických skupin, frekvence přenašečů je 1 na 300. Aţ 0,5% celkové populace můţe být heterozygotní na FA lokusu. Buňky přenašečů nemají zvýšenou citlivost na DNA zesíťovací (crosslinking) činidla. Současné pokroky v hybridizaci in situ a dalších molekulárních (cytogenetických) metodách umoţňuje lépe a definitivně charakterizovat klonální abnormality. [73]
Predispozice rakoviny Kromě mimořádně časté frekvence AML u pacientů s FA (52% riziko vývoje MDS či AML od 40 let) je zde také vysoký výskyt nehematologických malignit. Tito pacienti bývají neobvykle mladí, kdyţ se u nich rozvine rakovina. Paradoxně menší výskyt těchto malignit bývá u pacientů s delší průměrnou délkou ţivota. Většina nehematologických nádorů u těchto pacientů jsou spinocelulární karcinomy, incidence tohoto typu nádoru je u pacientů s FA 500-700 krát vyšší neţ u běţné populace. FA je také spojena se zvýšenou citlivostí na HPV-indukované karcinogeneze. Je tedy zcela jasné, ţe FA je významný syndrom se selháním KD a zároveň syndrom s vysokou citlivostí a predispozicí k rozvoji malignit kvůli charakteristickým změnám v genotypu. Převládajícím klinickým problémem jsou dle epidemiologických analýz solidní nádory, neboť hematologické malignity jsou díky moţnostem transplantace hematopoetických buněk lépe léčitelné. [74- 77] Diagnistické testy Přecitlivělost buněk u FA na klastogenní účinek zesíťovacích (cross linking) činidel
poskytuje spolehlivý buněčný
marker pro
diagnózu tohoto
onemocnění. DEB a mytomycin C jsou nejrozšířeněji pouţívaná činidla pro danou diagnózu. Rozsáhlé zkušenosti s těmito činidly prokázaly senzitivitu, specifitu a reprodukovatelnost výsledků. Dané vyšetření se doporučuje u všech pacientů, kteří vykazují nějaké kongenitální malformace spojené s FA 56
či aplastickou anémií v jakémkoliv věku, nebo u MDS s komplexními cytogenetickými abnormalitami. Pro vyšetření se odebírá vzorek plné krve a následně se testuje hypersenzitivita na cross-linker. Kvůli nedostatečné shodě
FA
fenotypu
screeningovým
mezi
vyšetřením
afektovanými podrobit
sourozenci
všichni
by
sourozenci
se
měli
v rodinách
s výskytem FA. [71][78] Kliničtí lékaři musí být informováni o nutnosti včasné diagnostiky, aby rodinám bylo včas poskytnuto genetické poradenství týkající se dostupnosti prenatální i preimplantační diagnostiky včetně moţnosti selekce embryí k zajištění
zdravého
HLA-
identického
sourozence
pro
transplantaci
hematopoetických kmenových buněk. Pokud jiţ takový sourozenec existuje, tato trasplantace by měla být provedena před vznikem závaţné pancytopenie, MDS či leukémie. Přesná a včasná diagnostika je esenciální pro zahájení vhodné terapie pacientů a pro umoţnění informovaných reprodukčních rozhodnotí rodičům. [71][78] Laboratorní nález: Krevní obraz: -
leukopenie (často neutropenie, ale můţe postihnout všechny řady leukocytů)
-
trombocytopenie
-
anémie normocytární aţ lehce makrocytární
-
konstatně zvýšený fetální Hb (HbF)
-
lehce zvýšený relativní počet RTC (0,060- 0,100)
-
absolutní počet RTC redukován [1][16]
Nátěr periferní krve: -
moţný výskyt terčovitých erytrocytů [1][16]
Nátěr kostní dřeně (KD): -
zpočátku hyperplastická KD
-
dysplastické rysy v erytropoéze 57
-
zmnoţení plazmatických buněk a mastocytů
-
při rozvoji choroby těţká dřeňová hypoplazie [1][16]
Cytogenetická vyšetření: - průkaz četných chromozomálních zlomů [1][16]
(A)
(B)
Obrázek č. 11: (A): Metafázické chromosomy lymfocytů- spontánní chromozomální aberace (B):Metafázické chromozomy lymfocytů- po aplikaci DEB- stoupající počet chromozomálních aberací (komplexní chromozomová přestavba) Převzato z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2742943/figure/F2/ (citováno 25.5.2016)
58
9. ZÁVĚR- SHRNUTÍ PRÁCE Ve své bakalářské práci jsem se věnovala nejdříve celkovému zhodnocení a klasifikaci většiny typů anémií z hlediska etiopatogeneze a klinických příznaků. Poté jsem se zaměřila na některé konkrétní typy anémií primárních, čili dědičných. Soustředila jsem se na laboratorní metody vyuţívané k jejich diagnostice a na konkrétní laboratorní nálezy. Moje práce má být tedy jakýmsi shrnutím problematiky anémií a jejich laboratorní diagnostiky. Informace v této práci mohou být uţitečné pro studenty či pracovníky nelékařských zdravotnických oborů, kteří se podílejí přímo či nepřímo na diagnostice anemií a jiných hematologických onemocnění. Pro určení správné a přesné diagnózy je nezbytné komplexní zhodnocení zdravotního stavu pacienta z více hledisek a především zhodnocení výsledků různých typů vyšetření. Aspekty diagnózy zahrnují rodinnou anamnézu, zhodnocení klinického obrazu (objektivní i subjektivní nálezy), různá lékařská vyšetření (např. zobrazovací metody) a v neposlední řadě významná součást současné medicíny- výsledky laboratorního vyšetření. Po získání těchto komplexních informací o pacientovi lze snadněji dojít ke konečné diagnóze, stanovit typ léčby a její zahájení. Od včasné diagnostiky a včasného zahájení léčby se pak odvíjí prognóza. Nevýhodou dědičných anémií jakoţto u většiny dědičných onemocnění bývá nemoţnost kauzální léčby. Existují ale moţnosti terapie zaměřující se na některé příznaky onemocnění, čili léčba symptomatická. V mnohých případech se provádí podávání transfúzí (např. thalassemie, hereditární sférocytóza) jako substituční léčba pro udrţení oxygenace tkání nebo podávání erytropoetinu. Dále mohou být pacienti léčeni kortikoidy (BlackfanDiamondova anémie). Další nadějnou moţností v léčbě je transplantace hematopoetických
kmenových
buněk
Fanconiho anémie). [1] 59
u
aplastických
anémií
(např.
U některých typů anémií dochází ke klinickým potíţím vţdy po vystavení vyvolávající příčině. V těchto případech je nejúčinnější prevence, neboli vyhnout se těmto příčinám. Např. u deficitu G-6-PD se doporučuje zamezení styku s léky s oxidačním potenciálem a jiné oxidační zátěţi, také infekcím a diabetické acidóze. [1] Obrovský význam má genetické poradenství, coţ je sluţba poskytovaná na odděleních lékařské či klinické genetiky ve zdravotnických zařízeních. Cílem tohoto vzdělávacího a poradenského procesu je pomoci jednotlivcům činit informovaná rozhodnutí o manţelství, reprodukci a v dalších problémech týkajících se genetických chorob, dostupnosti diagnostických testů a program. Obvykle je nabízena také psychosociální podpora. Základem pro tzv. genetické konzultace je získání rodinné anamnézy, tedy kompletní informace o zdravotním stavu vyšetřovaného pacienta a všech členů jeho rodiny včetně znalosti příčiny a věku úmrtí u zemřelých členů rodiny. V případě, ţe konzultace probíhá v souvislosti s těhotenstvím, je důleţité poskytnutí anamnézy obou rodičů budoucího potomka. Následuje sestavení rodokmenu a vyhodnocení rizika objevení určitých chorob v dané rodině. U kaţdé choroby je výpočet rizika různě přesný. [89, 90] Případy, kdy je genetické poradenství na místě: I. Pacienti, v jejichţ rodině se vyskytlo dědičné onemocnění nebo vrozená vada jeden či oba partneři trpí dědičným či jiným chronickým onemocněním se narodilo postiţené dítě se vyskytl nebo plánuje příbuzenský sňatek se vyskytly 2 a více spontánních potratů nebo sterilita jeden nebo oba partneři byli vystaveni mutagenním vlivům (ionizační záření, chemikálie, drogy - př. cytostatika) jeden nebo oba partneři byli léčeni pro maligní onemocnění v návaznosti na pozitivní novorozenecký screening [90]
60
II. Těhotné ţeny, které byly vystavené ionizačnímu záření (RTG, CT) uţívaly léky s mutagenním či teratogenním účinkem prodělaly akutní horečnaté onemocnění v prvních 3 měsících těhotenství jejichţ výsledky ultrazvukového nebo biochemického screeningu jsou abnormální jejichţ věk je nad 35 let nebo věk partnera je nad 45 let [90] Význam laboratorních vyšetření v diagnostice dědičných anémií je stěţejní. Existuje široké spektrum laboratorních metod vyuţívaných v klinické hematologické laboratoři. V současné době roste význam speciálních genetických vyšetření, která jsou často potřebná k určení konkrétního typu dědičné anémie na základě cytogenetických metod (získání karyotypu, vyšetření chromozomálních aberací a další metody), pomocí kterých lze určit, o jakou konkrétní změnu genotypu se jedná. Na druhou stranu, svůj význam mají i konvenční klasické hematologické metody, jako je vyšetření krevního obrazu pro zjištění hodnot parametrů krevních buněk, nebo mikroskopické vyšetření nátěru periferní krve pro určení morfologických abnormalit, coţ je také velmi důleţitá součást diagnostiky, například u srpkovité anémie, thalassemie či hereditární sférocytózy. Mnoho dědičných anémií patří mezi hemolytické anémie, proto je v diagnostice také důleţité vyšetření známek hemolýzy, jako je biochemické stanovení bilirubinu, volného Fe, volného Hb. Dále se provádí vyšetření na průkaz regenerace erytrocytů, např. stanovení retikulocytů. Nelze tedy selektovat jen jednu určitou metodu pro určení diagnózy, vţdy je nutné provedení více různých vyšetřovacích metod a poté přihlíţet na výsledky těchto vyšetření vzhledem k dalším vyšetřením navzájem.
61
10. SEZNAM LITERATURA
ZDROJŮ
INFORMACÍ-
POUŢITÁ
[1] Miroslav Penka, Eva Tesařová a kol.; Hematologie a transfúzní lékařství I- Hematologie; 1. vydání; Praha 2011; Grada Publishing a.s.; počet stran 424+64 stran barevných příloh; ISBN: 978-80-247-3459-0; pouţité strany: 61-66, 83-85; 163-207 [2] Karel Indrák a kolektiv; Hematologie; 1. vydání; Praha 2006; TRITON; 278 stran; ISBN: 80-7254-868-9; pouţité strany: 27-72 [3] Miroslav Penka, Alena Buliková a kolektiv; Neonkologická hematologie; 2., doplněné a zcela přepracované vydání; Praha 2009; Grada Publishing a.s.; počet stran 240+8 stran barevné přílohy; ISBN: 978-80-247-2299-3; pouţité strany: 39-93 [4] členové Laboratorní sekce ČHS ČSL JEP; Doporučení ČHS ČLS JEP Referenční meze krevního obrazu, retikulocytů, normoblastů a diferenciálního rozpočtu leukocytů dospělých; 2. verze, platné od 1. 3. 2015; [cit.2016-03-25] Dostupné z www:
[5] Martin R Howard, Peter J Hamilton; Haematology- An illustrated colour text; 4. vydání; 2013 ELSEVIER Ltd. CHURCHILL LIVINGSTONE ELSEVIER, počet stran: 125; ISBN: 978-0-7020-5139-5; pouţité strany: 2237 [6] Koralkova, P., van Solinge, W. W. and van Wijk, R. (2014), Rare hereditary red blood cell enzymopathies associated with hemolytic anemia – pathophysiology, clinical aspects, and laboratory diagnosis. International Journal of Laboratory Hematology, 36: 388–397. doi: 10.1111/ijlh.12223; [cit. 2016-04-21]- pouţito pouze shrnutí (summary) Dostupné z www: < http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/ijlh.12223/epdf> [7] Boria I, Garelli E, Gazda HT, Aspesi A, Quarello P, Pavesi E, et al. The ribosomal basis of Diamond-Blackfan Anemia: mutation and database update. Hum Mutat. 2010;31(12):1269–79
62
[8] Vlachos A, Ball S, Dahl N, Alter BP, Sheth S, Ramenghi U, et al. Diagnosing and treating Diamond Blackfan anaemia: results of an international clinical consensus conference. Br J Haematol. 2008;142(6):859–76 [9] Tanno T, Noel P, Miller JL. Growth differentiation factor 15 in erythroid health and disease. Curr Opin Hematol. 2010;17(3):184–90 [10] Origa R, Galanello R, Ganz T, Giagu N, Maccioni L, Faa G, et al. Liver iron concentrations and urinary hepcidin in betathalassemia. Haematologica. 2007;92(5):583–8 [11] Pospisilova D, Cmejlova J, Ludikova B, Stary J, Cerna Z, Hak J, et al. The Czech National Diamond-Blackfan Anemia Registry: clinical data and ribosomal protein mutations update. Blood Cells Mol Dis. 2012;48(4):209–18 [12] Pospisilova D, Cmejlova J, Hak J, Adam T, Cmejla R. Successful treatment of a Diamond-Blackfan anemia patient with amino acid leucine. Haematologica. 2007;92(5):e66–7 [13] Berdoukas V, Nord A, Carson S, Puliyel M, Hofstra T, Wood J, et al. Tissue iron evaluation in chronically transfused children shows significant levels of iron loading at a very young age. Am J Hematol. 2013;88(11):E283–5 [14] Buliková A., Mikulenková D.; Doporučení laboratorní sekce ČHS ČLS JEP- HODNOCENÍ NÁTĚRU ASPIRÁTU KOSTNÍ DŘENĚ; verze 1.; platné od 1.2.2016; [cit. 27.4.2016] Dostupné z www: [15] Tomáš Zima; LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA; 3. Doplněné a přepracované vydání; Praha 2013; nakladatelství Galén; počet sran 1146; ISSN 978-80-7492-062-2;pouţité strany: 7-9 ,54 [16] Miroslav Pecka; LABORATORNÍ HEMATOLOGIE V PŘEHLEDU IIFyziologie a patofyziologie krevní buňky; Český Těšín 2006; nakladatelství FININDR s.r.o., 304 stran; ISBN 80-86682-02-1; pouţité strany: 135-141 [17] Torsten Haferlach, Ulrike Bacher, Harald Thelm, Heinz Diem; Kapesní atlas hematologie; překlad 6. přepracovaného vydání; Praha 2014; Grada publishing a.s.; 232 stran; ISBN 978-80-247-4787-3; pouţité strany: 19, 28, 31, 154-155, 161-163 63
[18] D.Mikulenková, M.Matýšková, L.Bourková; DOPORUČENÍ ČHS ČLS JEPPŘÍPRAVA A BARVENÍ NÁTĚRU PERIFERNÍ KRVE A ASPIRÁTU KOSTNÍ DŘENĚ vč. kontrolní činnosti; 2013; platné od 1.1.2014; [cit. 26.4.2016] Dostupné z www: http://www.hematology.cz/doporuceni/laboratorni_sekce/files/k_cinnostem/D oporuceni_LS_CHS_CLS_JEP-Barveni_nateru_2013.pdf [19] Pospíšilová Š., Dvořáková D., Mayer J. et al.; Molekulární hematologie; Praha 2013; nakladatelství Galén; 316 stran; ISBN: 978-80-7262-942-8; pouţité strany: 103, 106-109, 112-112, 287-288, 291 [20] T. Ganz and E. Nemeth, “Iron sequestration and anemia of inflammation,” Seminars in Hematology, vol. 46, no. 4, pp. 387–393, 2009. [21] R. E. Fleming and B. R. Bacon, “Orchestration of iron homeostasis,” The New England Journal of Medicine, vol. 352, no. 17, pp. 1741–1744, 2005. [22] B. S. Skikne, “Serum transferrin receptor,” The American Journal of Hematology, vol. 83, no. 11, pp. 872–875, 2008. [23] G. Weiss, “Iron metabolism in the anemia of chronic disease,” Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1790, no. 7, pp. 682–693, 2009. [24] C. E. Lankhorst and J. B. Wish, “Anemia in renal disease: diagnosis and management,” Blood Reviews, vol. 24, no. 1, pp. 39–47, 2010. [25] Wajcman H. Electrophoretic Methods for Study of Haemoglobins. In: Nagel RL, editor. Methods in molecular medicine. Vol. 82. Totowa, NJ: Humana Press Inc; 2003. pp. 93–100. Haemoglobin disorders: Molecular methods and protocols. [26] Pauling L, Itano HA, Singer SJ, Wells IC. Sickle cell anemia a molecular disease. Science. 1949;110:543–8. [27] Righetti PG. Isoelectric focusing: Theory, methodology applications. Amsterdam, The Netherlands: Elsevier; 1983.
64
and
[28] Van Delft P, Lenters E, Bakker-Verweij M, de Korte M, Baylan U, Harteveld CL, et al. Evaluating five dedicated automatic devices for hemoglobinopathy diagnostics in multi-ethnic populations. Int J Lab Hematol.2009;31:484–95. [29] Cotton F, Malaviolle X, Vertongen F, Gulbis B. Evaluation of an automated capillary electrophoresis system in the screening for hemoglobinopathies. Clin Lab. 2009;55:217–21.¨ [30] Ducrocq R, Pascaud O, Bévier A, Finet C, Benkerrou M, Elion J. Strategy linking several analytical methods of neonatal screening for sickle cell disease. J Med Screen. 2001;8:8–14. [31] Richard Průša; Základy analytických metod v klinické molekulární biologii; 1. vydání; Praha 1997; 2. Lékařská fakulta UK a LAMBDA-MED Spol. s.r.o.; 45 stran; ISBN: 80-238-0940-7; pouţité strany: 5-17 [32] Chu T, Burke B, Bunce K et al. A microarray-based approach for the identification of epigenetic biomarkers for the noninvasive diagnosis of fetal disease. Prenat Diagn 2009;29:1020–30. doi:10.1002/pd.2335 [PubMed] [33] Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet1997;350:485–7. doi:10.1016/S01406736(97)02174-0 [PubMed]
[34] Lo YM, Tein MS, Lau TK et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: Implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am J Human Genet 1998;62:768–75. doi:10.1086/301800 [PMC free article][PubMed] [35] Zhong XY, Holzgreve W, Hahn S Detection of foetal Rhesus D and sex using foetal DNA from maternal plasma by multiplex polymerase chain reaction. BJOG 2000;107:766–9. doi:10.1111/j.14710528.2000.tb13338.x[PubMed] [36]Ding C, Chiu RW, Lau TK et al. MS analysis of single-nucleotide differences in circulating nucleic acids: application to noninvasive prenatal diagnosis. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:10762– 7.doi:10.1073/pnas.0403962101 [PMC free article] [PubMed]
65
[37] Platt OS, Brambilla DJ, Rosse WF, Milner PF, Castro O, Steinberg MH, et al. Mortality in sickle cell disease. Life expectancy and risk factors for early death. N Engl J Med. 1994;330:1639–44. doi: 10.1056/NEJM199406093302303. [PubMed] [Cross Ref] [38] McCavit TL. Sickle cell disease. Pediatr Rev. 2012;33:195–204. doi: 10.1542/pir.33-5-195. [PubMed][Cross Ref] [39] Quinn CT, Rogers ZR, McCavit TL, Buchanan GR. Improved survival of children and adolescents with sickle cell disease. Blood. 2010;115:3447–52. doi: 10.1182/blood-2009-07-233700. [PMC free article] [PubMed][Cross Ref] [40] Ohene-Frempong K, Weiner SJ, Sleeper LA, Miller ST, Embury S, Moohr JW, et al. Cerebrovascular accidents in sickle cell disease: rates and risk factors. Blood. 1998;91(1):288–94. pmid:9414296 [41] Kennedy BC, McDowell MM, Yang PH, Wilson CM, Li S, Hankinson TC, et al. Pial synangiosis for moyamoya syndrome in children with sickle cell anemia: a comprehensive review of reported cases. Neurosurg Focus. 2014;36(1):E12. doi: 10.3171/2013.10.FOCUS13405. pmid:24380478 [42] Hulbert ML, McKinstry RC, Lacey JL, Moran CJ, Panepinto JA, Thompson AA, et al. Silent cerebral infarcts occur despite regular blood transfusion therapy after first strokes in children with sickle cell disease. Blood. 2011;117(3):772–9. doi: 10.1182/blood-2010-01-261123. pmid:20940417 [43] Josephson CD, Su LL, Hillyer KL, Hillyer CD. Transfusion in the patient with sickle cell disease: a critical review of the literature and transfusion guidelines. Transfus Med Rev. 2007;21(2):118–33. pmid:17397762 doi: 10.1016/j.tmrv.2006.11.003 [44] Pegelow CH, Adams RJ, McKie V, Abboud M, Berman B, Miller ST, et al. Risk of recurrent stroke in patients with sickle cell disease treated with erythrocyte transfusions. J Pediatr. 1995;126(6):896–9. pmid:7776091 doi: 10.1016/s0022-3476(95)70204-0 [45]Russell MO, Goldberg HI, Reis L, Friedman S, Slater R, Reivich M, et al. Transfusion therapy for cerebrovascular abnormalities in sickle cell disease. J Pediatr. 1976;88(3):382–7. pmid:1245948 doi: 10.1016/s00223476(76)80251-x
66
[46] Wilimas J, Goff JR, Anderson HR Jr., Langston JW, Thompson E. Efficacy of transfusion therapy for one to two years in patients with sickle cell disease and cerebrovascular accidents. J Pediatr. 1980;96(2):205–8. pmid:7351580 doi: 10.1016/s0022-3476(80)80803-1 [47] Browne PV, Hebbel RP. CD36-positive stress reticulocytosis in sickle cell anemia. J Lab Clin Med. 1996;127(4):340–7. pmid:8656036 doi: 10.1016/s0022-2143(96)90181-x [48] Sugihara K, Sugihara T, Mohandas N, Hebbel RP. Thrombospondin mediates adherence of CD36+ sickle reticulocytes to endothelial cells. Blood. 1992;80(10):2634–42. pmid:1384794 [49] Borrione P, Spaccamiglio A, Parisi A, Salvo RA, Pautasso M, Pigozzi F, et al. A biparametric flow cytometry analysis for the study of reticulocyte patterns of maturation. Int J Lab Hematol. 2010;32(1 Pt 2):65–73. doi: 10.1111/j.1751-553X.2008.01128.x. pmid:19196377 [50] Telen MJ. Red blood cell surface adhesion molecules: their possible roles in normal human physiology and disease. Semin Hematol. 2000;37(2):130–42. pmid:10791882 doi: 10.1016/s0037-1963(00)90038-6 [51] Tancabelic J, Sheth S, Paik M, Piomelli S. Serum transferrin receptor as a marker of erythropoiesis suppression in patients on chronic transfusion. Am J Hematol. 1999;60(2):121–5. pmid:9929103 doi: 10.1002/(sici)10968652(199902)60:2<121::aid-ajh6>3.0.co;2-2
[52] Cazzola M, Malcovati L. Myelodysplastic syndromes: coping with ineffective hematopoiesis. N Engl J Med.2005;352(6):536–538. [PubMed] [53] Akaike H. A new look at the statistical model identification. IEEE Trans Automatic Control. 1974;19(6):716–723. [54] Kerr, R., Rawlinson, T.S. & Cachia, P.G. (2000) Direct antiglobulin test negative, non-spherocytic autoimmune haemolytic anaemia.Clinical and Laboratory Haematology, 22, 365–367. [55] Gehlbach, S.H. & Cooper, B.A. (1970) Haemolytic anaemia in infectious mononucleosis due to inapparent congenital spherocytosis.Scandinavian Journal of Haematology, 7, 141–144.
67
[56] Wolfe, L.C., John, K.M., Falcone, J.C., Byrne, A.M. & Lux, S.E. (1982) A genetic defect in the binding of protein 4.1 to spectrin in a kindred with hereditary spherocytosis. New England Journal of Medicine, 307, 1367– 1374. [57] Hassoun, H., Vassiliadis, J.N., Murray, J., Njolstad, P.R., Rogus, J.J., Ballas, S.K., Schaffer, F., Jarolim, P., Brabec, V. & Palek, J. (1997)Characterization of the underlying molecular defect in hereditary spherocytosis associated with spectrin deficiency. Blood, 90,398–406. [58] Yawata, Y., Kanzaki, A., Inoue, T., Ata, K., Wada, H., Okamoto, N., Higo, I., Yawata, A., Sugihara, T. & Yamada, O. (1994) Red cell membrane disorders in the Japanese population: clinical, biochemical, electron microscopic, and genetic studies. International Journal of Hematology, 60, 23–38. [59] Stewart, G.W., Amess, J.A., Eber, S.W., Kingswood, C., Lane, P.A., Smith, B.D. & Mentzer, W.C. (1996) Thrombo-embolic disease after splenectomy for hereditary stomatocytosis. British Journal of Haematology, 93, 303–310. [60] Stewart, G.W. & Turner, E.J. (1999) The hereditary stomatocytoses and allied disorders: congenital disorders of erythrocyte membrane permeability to Na and K. Baillieres Best Practice and Research Clinical Haematology, 12, 707–727. [61] De Franceschi, L., Olivieri, O., Miraglia del Giudice, E., Perrotta, S., Sabato, V., Corrocher, R. & Iolascon, A. (1997) Membrane cation and anion transport activities in erythrocytes of hereditary spherocytosis: effects of different membrane protein defects. American Journal of Hematology, 55, 121–128. [62] Costa, F.F., Agre, P., Watkins, P.C., Winkelmann, J.C., Tang, T.K., John, K.M., Lux, S.E. & Forget, B.G. (1990) Linkage of dominant hereditary spherocytosis to the gene for the erythrocyte membrane-skeleton protein ankyrin. New England Journal of Medicine,323, 1046–1050. [63] Garbarz, M., Bibas, D., Cynober, T., Galand, C., Bournier, O., Devaux, I., Tchernia, G. & Dhermy, D. (1996) Search for the candidate genes in dominant hereditary spherocytosis using linkage analysis. Comptes Rendus de l’ Academie des Sciences, Paris, Sciences de la Vie III, 319, 913–919.
68
[64] Garbarz, M., Galand, C., Bibas, D., Bournier, O., Devaux, I., Harousseau, J.L., Grandchamp, B. & Dhermy, D. (1998) A 5′ splice region G–>C mutation in exon 3 of the human beta-spectrin gene leads to decreased levels of beta-spectrin mRNA and is responsible for dominant hereditary spherocytosis (spectrin Guemene-Penfao). British Journal of Haematology, 100, 90–98. [65] Haines, P.G., Jarvis, H.G., King, S., Noormohamed, F.H., Chetty, M.C., Fisher, J., Hill, P., Nicolaou, A. & Stewart, G.W. (2001) Two further British families with the „cryohydrocytosis‟ form of hereditary stomatocytosis. British Journal of Haematology, 113, 932–937. [66] Christensen, R.D. & Henry, E. (2010) Hereditary spherocytosis in neonates with hyperbilirubinemia. Pediatrics, 125, 120–125. [67] King, M.J., Smythe, J.S. & Mushens, R. (2004) Eosin-5-maleimide binding to band 3 and Rh-related proteins forms the basis of a screening test for hereditary spherocytosis. British Journal of Haematology, 124, 106–113. [68] Delaunay, J., Stewart, G. & Iolascon, A. (1999) Hereditary dehydrated and overhydrated stomatocytosis: recent advances. Current Opinion in Hematology, 6, 110–114. [69] Bolton-Maggs, P.H., Stevens, R.F., Dodd, N.J., Lamont, G., Tittensor, P. & King, M.J. (2004) Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis. British Journal of Haematology, 126, 455–474. [70] Delhommeau, F., Cynober, T., Schischmanoff, P.O., Rohrlich, P., Delaunay, J., Mohandas, N. & Tchernia, G. (2000) Natural history of hereditary spherocytosis during the first year of life. Blood, 95, 393–397. [71] Auerbach AD, Rogatko A, Schroeder-Kurth TM. International Fanconi Anemia Registry. Relation of clinical symptoms to diepoxybutane sensitivity. Blood. 1989;73:391–396. [PubMed] [72] Auerbach AD. Fanconi anemia diagnosis and the diepoxybutane (DEB) test. Exp Hematol. 1993;21:731–733. [PubMed] [73] Giampietro PF, Verlander PC, Davis JG, Auerbach AD. Diagnosis of Fanconi anemia in patients without congenital malformations: an International Fanconi Anemia Registry study. Am J Med Genet. 1997;68:58– 61.[PubMed]
69
[74] Butturini A, Gale RP, Verlander PC, Adler-Brecher B, Gillio A, Auerbach AD. Hematologic abnormalities in Fanconi anemia. An International Fanconi Anemia Registry study. Blood. 1994;84:1650–1655. [PubMed] [75] Kutler DI, Singh B, Satagopan J, Batish SD, Berwick M, Giampietro PF, Auerbach AD. A 20-year perspective of The International Fanconi Anemia Registry (IFAR) Blood. 2003;101:1249–1256. [PubMed] [76] Rosenberg PS, Greene MH, Alter BP. Cancer incidence in persons with Fanconi anemia. Blood.2003;101:822–826. [PubMed] [77] Kutler DI, Auerbach AD, Satagopan J, Giampietro PF, Batish SD, Huvos AG, Goberdhan A, Shah JP, Singh B. High incidence of head and neck squamous cell carcinoma in patients with Fanconi anemia. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 2003;129:106–112. [PubMed] [78] Giampietro PF, Adler-Brecher B, Verlander PC, Pavlakis SG, Davis JG, Auerbach AD. The need for more accurate and timely diagnosis in Fanconi anemia: a report from the International Fanconi Anemia Registry.Pediatrics. 1993;91:1116–20. [PubMed] [79] Auerbach AD. Fanconi Anemia and its Diagnosis. Mutation research. 2009;668(1-2):4-10. doi:10.1016/j.mrfmmm.2009.01.013.; [cit. 10.5.2016]pouţit abstrakt Dostupné z www: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2742943/ [80] Beutler E. G6PD deficiency. Blood. 1994;84:3613–36. [81] Gregg XT, Prchal JT. Red cell enzymopathies. In: Hoffman R, ed. Hematology: basic principles and practice. 4th ed. Philadelphia: Churchill Livingstone, 2000:657–60. [82] Glucose-6-phosphate dehyrdogenase deficiency. Accessed online July 20, 2005, at:http://www.answers.com/glucose-6-phosphate-dehydrogenasedeficiency. [83] WHO Working Group. Glucose-6-phosphate deficiency. Bull World Health Organ. 1989;67:601–11.
dehydrogenase
[84] Ainoon O, Alawiyah A, Yu YH, Cheong SK, Hamidah NH, Boo NY, et al. Semiquantitative screening test for G6PD deficiency detects severe deficiency but misses a substantial proportion of partially-deficient females. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2003;34:405–14. 70
[85] Reclos GJ, Hatzidakis CJ, Schulpis KH. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency neonatal screening: preliminary evidence that a high percentage of partially deficient female neonates are missed during routine screening. J Med Screen. 2000;7:46–51. [86] Hermiston ML, Mentzer WC. A practical approach to the evaluation of the anemic child. Pediatr Clin North Am. 2002;49:877–91. [87] Edwards CQ. Anemia and the liver. Hepatobiliary manifestations of anemia. Clin Liver Dis. 2002;6:891–907.,viii.z [88] Jennifer E. Frank, MAJ, MC, USA, Martin Army Community Hospital, Fort Benning, Georgia; Diagnosis and Management of G6PD Deficiency; American Family Physician; Volume 27, number 7, October 1, 2005; 127782; [cit. 27.5.2016]- pouţit abstrakt Dostupné z www: < http://www.aafp.org/afp/2005/1001/p1277.html> [89] WHO, Genetic counselling services, [cit. 30.5.2016] Dostupné z www: http://www.who.int/genomics/professionals/counselling/en/ [90] FN Motol, Oddělení klinické genetiky Dostupné z www: http://www.fnmotol.cz/ublg/struktura-ustavu/oddeleni-klinicke-genetiky/ [91] Pauling L, Itano HA, Singer SJ, Wells IC. Sickle cell anemia a molecular disease. Science. 1949;110:543–8.[PubMed]
71
11.
SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ
11.1 Seznam tabulek Tabulka č. 1: Přehled příčin multifaktoriálních anémií……………….…28 Tabulka č. 2: Parametry KO z analyzátoru…………………………...……32 Tabulka č. 3: Referenční rozmezí parametrů KO dle ČHS JEP……...…33 Tabulka č. 4: Klasifikace thalassémií…………………………………....…44
11.2 Seznam obrázků Obrázek č. 1: Normocyt…………………………………………………..…….34 Obrázek č. 2: Mikrocyty……………………………………………………...…34 Obrázek č. 3: Makrocyty………………………………………………………..34 Obrázek č. 4: Anizocytóza………………………………………………….…..35 Obrázek č. 5: Izoelektrická fokusace hemolyzátu obsahujícího různé varianty Hb………39 Obrázek č. 6: Nátěr periferní krve při thalassemii……………………..….…45 Obrázek č. 7: Sickle SCANTM test………………………………………..….…48 Obrázek č. 8: Drepanocyty v nátěru periferní krve (označeno šipkami)....49 Obrázek č. 9: Sférocyty v nátěru periferní krve………………………………53 Obrázek č. 10: Howel-Jollyho tělíska v erytrocytu………………………......53 Obrázek č. 11: (A):Metafázické chromosomy lymfocytů- spontánní chromozomální aberace (B):Metafázické chromozomy lymfocytů- po aplikaci DEB- stoupající počet chromozomálních aberací (komplexní chromozomová přestavba)………………….…………………………………………………..…58
72
