Horváth Domonkos
Sokcsatornás agyi elektródokkal patkány hallókérgéből elvezetett spontán aktivitás és kiváltott potenciálok számítógépes elemzése
Pázmány Péter Katolikus Egyetem Információs Technológiai Kar Műszaki Informatika Szak
Témavezető: Dr. Ulbert István Konzulens: Grand László 2010.
1
Tartalmi összefoglaló Diplomamunkám témája a patkány hallókéregről sokcsatornás elektródokkal
rögzített agyi aktivitás számítógépes elemzése. Az elemzéseket krónikus és akut hallókérgi
beültetésekből
nyert
adatokon
végeztem.
Az
elemzések
során
összehasonlítottam egyrészt a hallókérgi spontán aktivitás és kiváltott potenciálok jellemzőit, másrészt pedig a természetes alvás és a ketamin-xylazin altatás alatt tapasztalható különbségeket a spontán aktivitásban és a kiváltott válaszban. A hallókérgi kiváltott potenciálokat elemeztem az alvás-ébrenléti ciklus két szakaszában, ébrenlétben és lassú hullámú alvásban is. A számítógépes elemzésekhez többféle matematikai módszert használtam. A kapott eredményeket összevetettem az általam megismert szakirodalom vonatkozó állításaival. Az általam elemzett adatok alátámasztani látszanak azokat a szakirodalmi eredményeket, melyek szerint a lassú hullámú alvás alatt tapasztalható lassú oszcilláció és a hallókérgi kiváltott potenciálok tulajdonságai eltérőek természetes alvásban és ketamin-xylazin altatásban [4]. Emellett, az ébrenlétben és természetes lassú hullámú alvásban rögzített hallókérgi kiváltott válaszok összevetése alapján úgy tűnik, hogy patkány hallókérgén kiváltható diszfacilitáció természetes alvás során, ami alatt a hallókérgi sejtek tüzelése erősen gátolt. A természetes lassú hullámú alvás alatt patkány hallókérgén kiváltott választ összevetettem macska hallókérgéről rögzített kiváltott válaszokkal is. A patkány és macska hallókérgéről rögzített kiváltott válasz tulajdonságai hasonlóak voltak, így a macskából rögzített adatok is alátámasztották [5], hogy a patkány hallókérgén is ki lehet váltani diszfacilitációt lassú hullámú alvás alatt. Diplomamunkám második feladata a magyar szilícium elektróda in-vivo karakterizációja. A 24 csatornás, szilícium alapú és platina elvezetési kontaktusokkal ellátott elektródát fiziológiás sóoldatban végzett impedancia mérésekkel és akut beültetési kísérletek eredményei alapján jellemeztem. Az impedancia mérési eredmények alapján megállapítható, hogy az elektród impedanciák 24 óra alatt sem változtak, megmaradtak az elvezetésre alkalmas szinten. Az akut kísérletek megmutatták, hogy az elektród alkalmas agykérgi potenciálok elvezetésére, jó minőségű lokális mezőpotenciált és soksejt aktivitást lehetett vele rögzíteni. Ezt a megfigyelést alátámasztotta a rögzített aktivitások jel-zaj viszony elemzése, valamint az, hogy a soksejt aktivitásból egyes sejtek tüzelését is ki lehetett válogatni. A továbbiakban az elektróda elvezetési tulajdonságai javíthatók az elektród
kontaktusokon
alkalmazott
különféle
bevonatokkal
átalakításokkal pedig alkalmassá tehető krónikus beültetésekre is.
3
[6,
7],
megfelelő
2
Abstract In my degree work, I analyse brain electric activity recorded from rat auditory
cortex with multielectrodes in chronic and acute experiments. On one hand, my analyses focus on the comparison of the auditory evoked potentials and spontaneous activity in the auditory cortex. Moreover, I examined the properties of the auditory cortex spontaneous activity and evoked potentials in natural sleep and ketamine-xylazine anaesthesia. The auditory evoked potentials were also analysed during two states of the sleep-wake cycle, slow wave sleep and wakefulness. Multiple mathematical methods were used for the computer analyses. All the results were compared to those found in scientific literature. My findings seem to be in harmony with these literature results, namely, the properties of slow oscillation and evoked potentials are different during natural sleep and ketaminexylazine anaesthesia [4]. In addition, the comparison of the evoked potentials during slow wave sleep and wakefulness suggests that it is possible to evoke disfacilitation, the silent state of nerve cells, during natural slow wave sleep. In order to support this finding, I also compared the data obtained from rat auditory cortex to cat auditory cortex recordings. The properties of the auditory evoked potentials in these two cases were similar [5], further supporting the finding about the evoked disfacilitation in rat auditory cortex during slow wave sleep. In this work I also present in-vivo characterization of the new Hungarian silicon probe. The 24 channel, silicon based multielectrodes with platinum contacts were exposed to 24 hour impedance tests and acute implantations into rat cortices to perform the characterization. According to the impedance test results, the electrode impedances remained at a constant level during the 24 hour testing period, proving the electrodes suitable for acute recordings. These recordings confirmed that the electrode is capable of recording cortical local field potentials and multiunit activity. Signal-to-noise ratio analysis and spike sorting executed on the recorded multiunit activity both demonstrated the electrode’s good performance. In the future, this performance can be increased through application of different impedance reducing coatings on the electrode contacts [6, 7]. What is more, suitable changes to the probe package can adapt the it to chronic experiments too.
4
3
Bevezetés Az elmúlt félévek során a feladatom többrétű volt. Elengedhetetlen volt a témával
kapcsolatos szakirodalom tanulmányozása, mely felöleli a téma biológiai, matematikai és műszaki hátterét. Ennek keretein belül meg kellett ismernem az alvás-ébrenléti ciklus egyes szakaszainak jellemzőit, különös tekintettel a lassú hullámú alvásra. A lassú hullámú alvás alatt tapasztalható lassú oszcilláció tulajdonságait behatóan kellett tanulmányoznom. Ez kiterjedt a lassú oszcilláció mérhető paramétereire, az oszcillációt generáló sejtek és agyi hálózatok tulajdonságaira, és a különböző altatók lassú oszcillációra gyakorolt hatásaira is. Ahhoz, hogy a kiváltott válaszokat jellemezhessem, az agykérgi kiváltott potenciálok jellemzőit is tanulmányoztam a szakirodalom alapján, különös tekintettel a lassú hullámú alvásban tapasztaltakra. Megismertem az elemzésekhez használt matematikai módszereket is. Ezek közé tartozik az up és down state-ek detekciójához használt Hilbert transzformáció, a sejtválogatás során használt algoritmusok, a jel-zaj viszony számítási módszerek, valamint a lokális membránáramokat jellemző áramforrás sűrűség (current source density, CSD). A téma műszaki hátteréből megismertem az elektródák működésének alapjait. Az elektródákon belül behatóan tanulmányoztam a szilícium multielektródák történetét, műszaki megoldásait, alkalmazási területeit és a továbbfejlesztés lehetséges irányait. A szakirodalom megismerésén túl el kellett sajátítanom a legfontosabb elvezetési technikákat, a rögzített adatokat pedig számítógéppel elemeztem. Az elemzett adatokat összevetettem a szakirodalmi eredményekkel, és amikor lehetséges volt, ezekből következtetéseket vontam le. Összehasonlításokat végeztem patkány és macska hallókérgéből elvezetett jeleken is. Az elvezetett jelek lokális mezőpotenciálok, több- és egysejt aktivitások voltak. Az elemzéseket ezek után a lokális mezőpotenciálok átlagai, ezek idő-frekvencia tulajdonságai és CSD értékek alapján hajtottam végre.
5
4 4.1
A lassú hullámú alvás biológiai háttere A talamokortikális oszcillációk A talamusz és az agykéreg alapvető működési állapotainak velejárói a
talamokortikális oszcillációk. Az oszcillációk eredete kétféle lehet, egyrészt az oszcillációban részt vevő sejtek belső tulajdonságai alapján alakulhatnak ki, másrészt pedig lehetnek komplex, hálózati működések is, melyek során a serkentő és gátló idegsejtek bonyolult módon működnek együtt. Ilyen, elsősorban hálózati működés például az – ebben a munkában is vizsgált – alvási lassú oszcilláció [8], de ennek a kialakulásában is fontos szerepet játszanak a részt vevő sejtek belső tulajdonságai. A talamokortikális oszcillációkat a frekvenciájuk alapján osztályozzuk: 0,02 Hz és 0,1 Hz között infra-lassú, 0,1 és 15 Hz között lassú, 20 és 60 Hz között gyors, 100 Hz felett pedig ultragyors oszcillációkat különböztetünk meg [9]. Az alvási lassú oszcillációs tevékenységre jellemző a 0,1-1 Hz-es ritmus, mely természetes alvásban és altatásban is kialakulhat.
4.1. ábra Talamokortikális oszcillációk felosztása. Forrás: [6]
4.2
Az alvás-ébrenléti ciklus A különböző alvási fázisokat a felszínről elvezetett elektroenkefalogram (EEG), a
szem mozgásából keletkező aktivitást rögzítő elektrookulogram (EOG), és az izommozgásokat regisztráló elektromiogram (EMG) jelek alapján különböztetjük meg [10]. Az alvási fázisok elkülönítésében ezeken túl a kortikális rétegekből elvezetett aktivitás is segít. Az alvási jelek, közülük is az NREM, (non REM – non rapid eye movement sleep) azaz nem gyors szemmozgású alvási fázisok legfontosabb jellemzője, hogy – az ébrenléttel szemben – alacsony, leginkább a lassú tartományba eső az EEG hullámok frekvenciája, ugyanakkor az amplitúdójuk megnő az ébrenlétben észlelthez képest. Az alvás mélyülésével csökken az aktivitás frekvenciája, és nő az amplitúdója. Az emberi NREM alvást 4 szakaszra osztják, korai szakaszában, az ún. NREM 2-es fázisban jellemzőek az alvási orsók, melyek vissza-visszatérő magas frekvenciás mintázatok a 6
lassuló EEG-ben. A következő szakasz az ún. lassú hullámú alvás, amely az NREM alvás 3-as és 4-es szakaszának felel meg. Erre a fázisra igazán jellemzőek az alacsony frekvenciás, nagy amplitúdójú hullámok, miközben az izomaktivitás minimális [10]. A lassú hullámú alvási szakaszokat szakíthatja meg a már említett gyors szemmozgásos REM alvás (REM - rapid eye movement sleep), melynek EEG mintázata gyökeresen eltér a fent említett alvási szakaszokétól, és inkább az ébrenléthez hasonlít, miközben az EOG jelen gyors szemmozgásokat láthatunk, az EMG pedig az izomtónus teljes eltűnését jelzi [10]. A fent leírt szakaszok az emberi alvás felosztását tükrözik, állatkísérletekben az NREM alvást nem osztják külön szakaszokra [10], így a továbbiakban én sem fogom külön jelezni az NREM alvás egyes szakaszait, hanem lassú hullámú alvás (slow-wavesleep – SWS) állapotként nevezem.
4.3
A lassú oszcilláció alvás során Mint minden agykérgi oszcilláció, így a lassú oszcilláció kialakulásában is több,
eltérő dimenziójú tényező játszik szerepet. Állatkísérleti eredmények arra utalnak, hogy ez a tevékenység az agykéregből ered, ugyanis kiterjedt talamikus léziók esetén is megmarad a kéregben, ugyanakkor nem alakul ki a talamuszban, ha a kéreg és a talamusz közötti kapcsolatot megszüntetik [4]. A lassú oszcilláció során két állapot váltakozik, egyikük az aktív, depolarizáló (up state), a másik pedig a nyugalomban lévő, hiperpolarizáló (down state) [11]. A felszíni EEG-n a hullám pozitív fázisa felel meg a nyugalomban lévő, a negatív fázis pedig az aktív állapotnak. Az aktív állapot során a kérgi neuronok erősen tüzelnek, down state során azonban akár teljesen csöndben is lehetnek. Mind az up, mind a down state-ek kialakulása igen összehangoltan megy végbe a kéregben, a legutóbbi kísérleti eredmények alapján ráadásul a down state-ek kialakulása fokozott szinkronitást mutat [12]. Az up és down state-ek kialakulásának megértéséhez első lépés az agykérgi és talamikus neuronok belső szerkezetének, működésének megismerése. A talamokortikális oszcillációk kialakulásában négy csoportba tartozó idegsejtek vesznek részt, melyeket elhelyezkedésük és talamokortikális kapcsolatrendszerük alapján különböztetünk meg egymástól [4]. Ezek egyrészt az agykéreg mélyebb rétegeiben elhelyezkedő kérgi neuronok, melyek a talamuszba vetülnek, másrészt pedig a különböző típusú talamikus idegsejtek: a talamokortikális sejtek, melyek a talamuszból az agykéregbe vetülnek, a talamusz retikuláris sejtjei, és a helyi, talamikus összeköttetéseket kialakító sejtek. E négy sejttípus két hurkot képez, egyrészt a glutamáterg kérgi és talamokortikális neuronok közti serkentő hálózatot, másrészt pedig a talamikus retikuláris és a talamokortikális sejtekből álló, GABAerg gátló rendszert. A lassú hullámú alvás során háromféle ritmus figyelhető meg: a lassú oszcilláció (0,1-1 Hz), a delta oszcilláció (1-4 Hz) és az alvási orsók (7-15 7
Hz) [1]. Mindhárom ritmus kialakulásának fontos tényezője a sejtek belső szerkezete, működése, így a következőkben a fent említett sejttípusok jellemzőit fogom áttekinteni.
4.4
A lassú hullámokat kialakító sejtek belső tulajdonságai
4.4.1
A talamokortikális sejtek
A talamokortikális sejteken belül többféle áram is megfigyelhető, így például tranziens és magas küszöbfeszültségű kalcium áramok, különböző kálium áramok, perzisztens nátrium áram és egy hiperpolarizáció-aktivált kation áram is [1]. Ezek a különféle áramok mind fontos szerepet játszanak a talamokortikális oszcillációk kialakításában. A talamokortikális neuronok között a sejttestük mérete alapján tudunk különbséget tenni, így a nagy szómájú sejtek inkább a mélyebb, a kisebb szómájúak pedig a felszíni agykérgi neuronokat idegezik be. A talamokortikális sejtek egymással közvetlenül nem, csak agykérgi és talamikus retikuláris sejtekkel állnak összeköttetésben. A retikuláris sejtek ezzel szemben kiterjedt kapcsolatrendszert tartanak fent egymással hosszú, egymáson szinaptizáló dendritjeiken keresztül. Ez a rendszer igen alkalmas bizonyos típusú oszcillációk kialakulására. A dendritekben a retikuláris sejtekre jellemző hosszú idejű (30-80 ms) tüzelés sorozatok alakulnak ki, amelyeket modulálhat a sejtmembrán hiperpolarizációjának mértéke és a sejt depolarizáló bemeneteinek intenzitása is, alkalmassá téve a sejtet sokféle bemenet integrálására. [4, 8]
4.4.2
Az agykérgi sejtek
Az agykérgi idegsejtek, a talamikus sejtekkel szemben, nagyon változatosak és sokfélék. Tüzelési mintázatuk alapján megkülönböztetünk szabályosan tüzelő (regular spiking - RS) sejteket, melyek szabályos tüskesorozatokban tüzelnek; olyan sejteket, melyek belső tulajdonságaiknál fogva sűrű tüzelési sorozatokban tüzelnek (intrinsically bursting - IB). Ez a két típus általában piramis sejt. Ezeken kívül megtalálhatók még gyors ritmusú tüzelési sorozatokat kibocsátó (fast-rhytmic-bursting - FRB) és gyorsan tüzelő (fast spiking - FS) sejtek is az agykéregben. Ez utóbbiakat hagyományosan GABAerg gátló sejtekként sorolták be, de in-vitro kísérletekben kimutatták, hogy egyes gátló sejtek tüzelési mintázata inkább az RS, másoké pedig a sorozatosan tüzelő (IB) sejtekére hasonlíthat [13]. Az agykéregből a talamuszba vetülő, tehát kortikotalamikus sejtek mindegyike glutamáterg serkentő típusú sejt, tüzelési mintázatuk azonban az őket depolarizáló áram intenzitásától függően változik. Kismértékű depolarizáció hatására e neuronok szabályosan tüzelnek, majd a depolarizáció növelésével tüzelésük átmegy
8
sorozatosan tüzelőbe, végül még nagyobb depolarizáció hatására már gyors tüzelésűvé válnak, amely mintázatot hagyományosan a gátló sejteknek tulajdonítottak. Ilyen depolarizáció változás megy végbe természetes körülmények között az alvás-ébrenléti ciklus különböző szakaszaiban is. Ennek következménye az, hogy a fent említett négy tüzelési típus különböző arányban figyelhető meg az alvás-ébrenléti ciklus különböző fázisaiban, így például az IB típusú sejtek aránya ébrenlétben jelentősen lecsökken a lassú hullámú alváshoz képest, melynek oka a depolarizáció mértékének változása, de az agytörzsi neurotranszmitterek, így például az acetilkolin is hatással lehetnek a tüzelési mintázat megváltozására [6].
4.5
Az idegsejtek bemenő ellenállása Az idegsejtek fontos tulajdonsága a bemenő ellenállásuk (Rin), amely befolyásolja
tüzelési készségüket, és az alvás és ébrenlét különböző állapotaiban eltérő mértékű lehet. Azt várnánk, hogy a bemenő impedancia ébrenlétben lesz a legkisebb, de megfigyelték, hogy a lassú hullámú alvás során megfigyelhető lassú oszcilláció depolarizáló fázisai során a bemenő impedancia jelentősen lecsökken mind a hiperpolarizáló fázis, mind pedig az aktív ébrenlét alatt mérhető értékekhez képest [4]. Ez valószínűleg az ébrenlétben megfigyelhető jóval magasabb agykérgi acetilkolin szint következtében alakulhat ki, ez a neurotranszmitter ugyanis jelentősen megemeli a sejtek bemenő impedanciáját. Ezeknek a neuromodulátoroknak a hatása azonban nagyon sok tényezőtől függ, így nehéz megállapítani, pontosan hogyan is hatnak egy-egy oszcillációs állapot, így például a lassú oszcilláció kialakulására. [4].
4.6
A lassú hullámok mögött rejlő hálózati mechanizmusok A globális hatású neurotranszmitterek éppen globális mivoltuk miatt csak
modulálni tudják az agykérgi és talamikus sejtek alkotta hálózatokban kialakult oszcillációkat, így nagyon fontos ezeknek a hálózatoknak a megismerése is. A lassú oszcilláció az agykéregben alakul ki (erre feljebb már láttuk a bizonyítékokat), de a talamikus eredetű oszcillációkkal együtt komplex hullámokat alkothatnak. A lassú oszcillációt először intracellulárisan írták le altatott állatokban [11], de ezután megfigyelték extracelluláris és intracelluláris akut kísérletekben, természetesen alvó állatokban illetve emberi EEG-ben és magnetoenkefalogramban (MEG) is, és az eredmények konzisztensek voltak az először leírtakkal [4]. Mind a négy, fent leírt sejttípus hasonlóan viselkedik a lassú oszcilláció során: a depolarizációs szakaszok alatt tüzelnek, a hiperpolarizációs szakaszok alatt pedig nagyrészt teljesen csendben vannak, ráadásul ez a 9
váltakozás mind altatásban, mind pedig természetes alvásban megfigyelhető. A depolarizációs szakaszok a folyamatos nátrium áram mellett NMDA függő és NMDA független serkentő posztszinaptikus potenciálok (EPSP) következtében alakulnak ki, de tartalmaznak gátló komponenseket is (IPSP) [14]. A hiperpolarizációs szakaszok pedig kalcium függő kálium áramok és diszfacilitációs mechanizmusok következményeként jönnek létre. A diszfacilitáció lehet természetes és kiváltott is, ezeket később hasonlítom össze. Kérgi szinten nézve, az egymáshoz térben közelebb eső, egymással közvetlen összeköttetésben álló neuronokon gyorsabban jelenik meg ez az oszcilláció, míg a lassú oszcilláció távolabbi területekre terjedése lassabban megy végbe. Megfigyelték, hogy a lassú oszcilláció általában, de nem mindig, antero-posterior irányban, azaz elölről hátrafelé terjed az agykérgen. A kérgi lassú oszcilláció depolarizációs fázisának kialakulási fókuszára két elképzelés is megtalálható a szakirodalomban: egyrészt, hogy egy fókuszból kiindulva terjed szét a depolarizáció a kérgi neuronokon [15], másrészt pedig, hogy több kisebb fókusz egymás hatását erősítve és szinkronizálva depolarizálja a többi agykérgi sejtet is [16]. A legutóbbi in-vivo kísérleti eredmények szerint mindkét eredet megfigyelhető [12]. Bár sok esetben egyetlen fókuszból indult ki a depolarizáció, nem egyszer figyeltek meg egyidejűleg több pontból kiinduló depolarizációt is, mely magyarázat lehet a kérgi lassú oszcilláció nagyfokú szinkronitására is [12]. A lassú hullámú oszcilláció során a depolarizáció mellett a hiperpolarizációs fázisok kialakulása is érdekes. In-vivo kísérletekben kimutatták, hogy a hiperpolarizáció kialakulása jelentősen szinkronizáltabb a depolarizáció kialakulásánál[12]. Erre az érdekes jelenségre már többféle magyarázatot is próbáltak találni. Egyik lehetséges oka lehet egy olyan gátló neuron csoport, amely a többi idegsejttel ellentétes fázisban tüzel, ilyet azonban még nem találtak. Eredhet ez a kérgi sejtek valamilyen belső tulajdonságából is, de a sejtek belső tulajdonságai nagymértékű változatosságot mutatnak az agykéregben. Ezek alapján valószínűnek látszik, hogy komplexebb hálózati működések állhatnak e jelenség hátterében. Ilyen hálózati működés lehet például, hogy a lassú hullámú oszcilláció során megfigyelhető szinkronitás gátló interneuronok egymással elektromos szinapszisokkal kapcsolódó csoportját is szinkronba hozza, így ezek a gátló sejtek az egész hálózatot hiperpolarizált állapotba tudják hozni. A kérgen belüli szinkronizáció mellett hozzájárulhat ehhez a talamokortikális neuronok szinkron működése is, mely a kérgi gátló interneuronok szinkronizációját is fokozhatja, így erősítve a hiperpolarizáció nagyon pontos szinkron kialakulását [12]. Ezt látszanak alátámasztani azok a kísérleti megfigyelések is, melyek szerint a hiperpolarizáció szinkronitása csökken a talamusztól mesterségesen elvágott agykérgi területeken. Ezek után nem meglepő, hogy kísérleti eredmények támasztják alá azt is, hogy az agykérgi lassú oszcilláció a talamusz talamokortikális és retikuláris neuronjaira is konzisztensen továbbterjed. [8, 12] 10
4.7
Az altatásban és természetes alvásban észlelhető lassú oszcilláció összehasonlítása A
különböző
kísérleti
modellekben
fontos
szerepet
játszik,
hogy
a
megfigyeléseket természetesen alvó vagy altatott állaton végzik. A lassú oszcilláció alapvetően megfigyelhető mind természetes alvásban, mind pedig különböző altatókkal altatott állatban [4, 11]. Különbség van azonban a természetes alvásban megfigyelhető lassú oszcilláció, illetve a különböző altatásban megfigyelt lassú oszcilláció tulajdonságai között. Az egyetlen altató típus, amelynél nem vagy csak nehezen figyelhető meg lassú oszcilláció, a barbiturát, amely hatására minden más tevékenységet elnyomó alvási orsók alakulnak ki, így nehézkessé téve a lassú oszcilláció megfigyelését. Megfigyelték, hogy uretán altatásban a lassú oszcilláció nagyon hasonlít a természetes alvásban észlelhetőre, ketamin-xylazin altatásban pedig valamivel megnő a frekvenciája az uretán altatásban előforduló frekvenciához képest [11]. Érdekes a lassú oszcilláció előfordulási gyakorisága a különböző agykérgi területeken is. Szenzormotoros és látókérgi területeken sűrűbben, míg például hallókérgi területeken ritkábban figyelhető meg lassú oszcilláció természetes alvás során, ugyanakkor például ketamin-xylazin altatásban a lassú oszcilláció előfordulása a hallókéregben megnő [4]. Másképp alakul azonban a kiváltott válaszok aránya a természetes alvás és a ketamin-xylazin altatás között: természetes alvásban jóval több kiváltott diszfacilitációt figyelhetünk meg, mint ketamin-xylazin altatásban. Ez a megfigyelés arra enged következtetni, hogy az altatás nem feltétlenül pontos modellje a természetes alvásnak.
11
5
Az akusztikus kiváltott válaszok A kiváltott potenciál az eseményhez kötött potenciálok egy fajtája. Az
eseményhez kötött potenciál valamely diszkrét eseményre való felkészülés, külső vagy belső inger hatására kialakuló, az eseményhez időben kötött, több hullámból álló agyi potenciál oszcilláció. Ezen belül a kiváltott válasz valamely szenzoros inger hatására kialakuló eseményhez kötött potenciál. Ilyen lehet a fény-, hang-, fájdalom ingerhez kötött potenciál. A továbbiakban csak akusztikus, azaz hangingerhez kötött kiváltott válaszokkal foglalkozom. A több hullámból álló eseményhez kötött potenciál egyes hullámait komponenseknek nevezzük. A komponenseket kétféleképpen osztályozhatjuk, latenciájuk, azaz időbeli megjelenésük, és a kiváltó hatás jellege szerint. Latencia alapján megkülönböztetünk korai, közép latenciájú és késői komponenseket. A kiváltó hatás jellege szerint csoportosítva endogén és exogén komponenseket különböztetünk meg. Az exogén komponensek latenciája és amplitúdója az inger fizikai jellemzőitől függenek, míg az endogén komponensek inkább kognitív folyamatokkal mutatnak összefüggést. Az eseményhez kötött potenciál komponenseinek latenciái jól tükrözik az agyi információ feldolgozás folyamatait. Így az exogén komponensek korai, az endogén komponensek pedig késői latenciájúak [5]. A patkány hallókérgében az akusztikus kiváltott válasz jellemzően két pozitív-negatív komponensből (P1-N1-P2-N2) áll, melyek latenciája rendre 7-11, 16-23, 25-35 és 35-55 ms. Ezeken túl megfigyeltek már egy harmadik, P3-N3 komponenst is, melynek latenciája 63-78 és 86-90 ms. Ezek közül a komponensek közül a második, P2-N2 komponens amplitúdója a legnagyobb, a másik két komponens amplitúdója ennél kisebb [5].
5.1 ábra: Akusztikus kiváltott válasz patkány hallókérgén 12
6 6.1
Multielektródák Az elvezető rendszer Az akut és a krónikus elvezetések is poliimid szigetelt platina-irídium
rétegelektródákkal történtek. A 6.1. ábrán látható egy fém kontaktusú elektród helyettesítő kapcsolása [3]. A Ze’-vel jelölt effektív elektród-impedancia legfőbb alkotóeleme a szigeteletlen
elektródvégen
található
elektród-elektrolit
határfelületen
kialakuló
kettősréteg ellenállása (Re) és kapacitása (Ce). Emellett, ahogyan az az ábrán is látható, hozzájárul még az elektrolit ellenállása (Rs) és a fém elektród-kontaktus ellenállása is (Rm). Az elektródához kapcsolódik egy erősítő, melynek effektív impedanciája (Za’) egyrészt magának az erősítőnek az impedanciájából áll (Za), másrészt pedig az erősítőn kívüli, úgynevezett sönt (Rsh és Csh) tipikusan kapacitív impedanciájából áll. Ez a kapacitás főleg az elektród szára és az elektrolit közt fellépő kapacitásból származik, de hozzájárul az elektród és az erősítő között futó vezetékek és csatlakozók impedanciája is. A sönt, amely párhuzamos az erősítővel, csökkenti az erősítő effektív impedanciáját, kapacitív természetének köszönhetően pedig ez a hatás a jel frekvenciájának
6.1. ábra: Az elektród helyettesítő kapcsolása (forrás: [3]) növekedésével nő. Az elektród hegyénél fellépő jelek (Vsig) a sorba kapcsolt elektródon és erősítőn keresztül folyó áramokat generálnak (I(ω)). (6.1.) Az erősítő bemenetén mérhető feszültség (Vin) pedig így adható meg: (6.2) Látható, hogy az effektív elektród-impedancia és az erősítő effektív impedanciája együtt egy feszültségosztót alkot, ennek következtében, hacsak az erősítő impedanciája 13
nem sokkal nagyobb az elektródáénál, az erősítő bemeneti feszültsége kisebb lesz, mint az elektródán mért jel. Emellett még a két jel fázisában is eltérés lesz, mert mind az elektród, mind pedig az erősítő impedanciája komplex érték, melynek abszolút értéke és fázisa is van. A fázistolás mértékét (a fenti képletek szerinti komplex összeadás és osztás miatt) az abszolút értékek aránya befolyásolja, tehát nagyobb abszolút érték nagyobb mértékben befolyásolja a fázistolást. Így a Vsig és Vin közti fázistolás mértéke Za’ és Za’+Ze’ különbségeként számítható. Amennyiben Za’ jelentősen nagyobb Ze’-nél, az impedanciát nagyrészt az előbbi határozza meg, így a fázistolás elhanyagolható lesz. Ellenkező esetben azonban jelentős fázistolás lép fel, mely növekszik mind Ze’ növekedésével Za’-höz képest, mind pedig a két érték közötti fázistolás növekedésével. A fázistolás iránya azon múlik, hogy Ze’ mennyire kapacitív Za’-höz képest. Mivel mindkét érték frekvencia-függő, a Vsig és Vin közötti nagyság- és fázisbeli különbség is fázisfüggő lesz. A szűrő az átviteli függvénye (H(ω)) által meghatározott módon szűri a beérkező jelet: (6.3) Minden szűrő ad a jelhez valamilyen frekvencia-függő fázistolást, ugyanakkor rögzítés után ugyanazt a szűrőt az időben fordított sorrendű adatokra alkalmazva ez a fázistolás teljes mértékben kiküszöbölhető.
6.2
Szilícium multielektródák
6.2.1
Áttekintés, összehasonlítás fém elektródákkal
Az agy működésének megértéséhez elengedhetetlen az egyes sejtek aktivitásának vizsgálata. Ezt hagyományosan fém huzal elektródákkal végzik, de a technológia fejlődésével lehetővé vált a szilícium multielektródák használata. A huzal elektródákat általában valamilyen vezető fémből, például platinából, aranyból, volfrámból vagy irídiumból készítik [17, 18]. A huzalokat szigetelés borítja, hogy a nem kívánt zajok ne juthassanak be az elektródába. A huzalok végét szigeteletlenül hagyják, mert itt történik az elektromos jelek elvezetése. A fém elektródák széles körben elterjedtek, mert könnyen készíthetők belőlük sok elektródából álló tömbök és multielektródák, és igazoltan alkalmasak krónikus illetve mélyagyi elvezetésekre is [19, 20]. Hátrányuk azonban, hogy a fém multielektródák kontaktusainak elhelyezkedése nem pontosan meghatározható egymáshoz képest, mert a beültetés után a fémszálak elhajolhatnak. Így a multielektródák használatából származó előny, azaz az agy térbeli szerkezetéről kapott értékes többletinformáció, a nem pontosan meghatározható elvezetési pontok miatt elvész. A
14
szilícium elektródák erre a problémára nyújtanak megoldást. A szilícium alapú multielektródáknak két fő típusa van: a Utah Electrode Array és a Michigan Probe. Egy Európai Uniós projekt keretében, melyben az MTA Pszichológiai Kutatóintézete is részt vett, a NeuroProbes konzorcium fejlesztett ki új szilícium elektródát. A szilíciumon kívül más szubsztrátból is készítenek elektródát, így például üvegből, poliimidből és kerámiából is.
6.2.2
Utah Electrode Array
A Utah elektródát a Utah Egyetemen fejlesztették ki az 1990-es évek legelején. Ez egy háromdimenziós elektród tömb, amely egyetlen szilícium blokkból készül. Összesen 100 darab tűelektródát alakítanak ki a blokkból tízszer tízes elrendezésben. A tűk végét platinával vonják be az elvezetésekhez. A tűk hossza általában 1,5 mm, vastagságuk a tövüknél kb. 100 µm, a hegyüknél azonban kevesebb, mint 1 µm [1].
6.2. ábra: Utah Electrode Array (forrás: [1])
6.2.3
Michigan Probe
A Michigan Probe-ok, szemben a Utah elektródákkal, nem háromdimenziós, hanem kétdimenziós elektród tömbök. A Michigan elektród is egy szilícium blokkból készül, de az elektród szárak egymás mellett helyezkednek el. Ezeken a szárakon azonban, ellentétben a Utah elektródával, tetszőleges számú elvezetési kontaktus helyezhető el.
15
Több Michigan elektród tömbbé rendezésével ezekből is készíthető háromdimenziós tömb.
6.3. ábra: Michigan Probe (forrás: [2]) 6.2.4
NeuroProbes elektródák
A NeuroProbes konzorcium, amely több európai egyetemet és kutatóközpontot is magában foglal, szilícium alapú multielektródák fejlesztésére jött létre. Ezen belül több fejlesztési célt is meghatároztak, melyek a szilícium alapú technológiát felhasználva növelik az elektród funkcionalitását. A célok között, a háromdimenziós multielektróda kifejlesztésén túl, mikrofluidikai, elektronikus mélységszabályozó és bioszenzor rendszerek integrálása is szerepelt. Az MTA Pszichológiai Kutatóintézete az elektronikus mélységszabályozás fejlesztésében és tesztelésében vett részt.
6.3
A szilícium multielektródák fejlesztési lehetőségei A szilícium elektródák tervezése során pontosan meghatározható az elvezetési
pontok mérete, száma, és elhelyezkedése az elektródán, és könnyen reprodukálhatóak is ezek a paraméterek, ami jelentősen segíti a kísérleti eredmények egységes értelmezését és összehasonlíthatóságát [21, 22]. Ezen kívül kicsi a méretük, így csökkentve a sérülést, amelyet az elektróda az agy szövetében okoz. A szilícium-mikromegmunkálás lehetővé teszi, hogy sokféle rendszer integrálásával specifikus feladatokra tegyék alkalmassá az elektródákat. Így például az előerősítő integrálásával csökkenthető az elvezető rendszer mérete, megkönnyítve az elektróda krónikus alkalmazását [2]. Ezen túl, az integrált erősítő rendszer a felhasználandó vezetékek mennyiségét is csökkenti, ezáltal csökkentve az esélyét annak, hogy a vezetékek sok zajt vegyenek fel a környezetből. Egy másik lehetőség szintén elektronikai eszköz integrálására, ha a sokcsatornás elektródára a 16
csatornákat kiválasztó rendszert integrálják (NeuroProbes konzorcium). Így az elektróda mozgatása nélkül lehet egyrészt az agy különböző területeiről elektromos jelet elvezetni, másrészt pedig egy agyterületet sok csatornán keresztül vizsgálni. Ezen túl különböző mikrofluidikai eszközök is integrálhatók, alkalmassá téve az elektródát arra, hogy irányítottan különböző anyagokat, például gyógyszereket juttasson a beültetés helyére. Ezzel egyrészt új, komplexebb kísérletek végezhetők, másrészt pedig a gyógyításban is hasznos segítséget tud nyújtani.
6.4
Az elektród beültetésre adott agyi reakció A beültetett szilícium elektródára az agy immunreakcióval válaszol. Ez először
egy akut, majd ennek elmúltával egy krónikus válasz a beültetett idegen anyagra. Az eddigi vizsgálati eredmények alapján a krónikus válasz elkerülhetetlen, mindenképpen kialakul az elektróda körül egy főleg gliasejtekből álló réteg, mely elszigeteli az elektródát az őt körülvevő idegsejtektől. Az akut válasz, mely egyrészt az idegsejtek visszahúzódását jelenti az elektródától, másrészt pedig ugyancsak gliasejt reakció, azonban nagyban függ attól, hogy mennyi sérülést okoz az elektróda a beültetéskor. A kísérleti eredmények alapján a cél a beültetéskor a vérzés elkerülése vagy minimálisra csökkentése [23]. A vérzés ugyanis megöli az idegsejteket és a gliasejt reakciót is növeli, mely az elektróda elszigeteléséhez, és így a jelerősség csökkenéséhez vezet. Az elektróda méreteiből és az agy szerkezetéből adódóan azonban a vérzés gyakorlatilag elkerülhetetlen, mértéke viszont csökkenthető. Ehhez többféle módszerrel is próbálkoznak. Egy megközelítés lehet az elektróda beültetési sebességének mértéke [24]. Míg a lassú (125 µm/sec) beültetés hagy időt az agynak, hogy körülfogja az elektródát, addig a gyorsan (2 mm/sec) beültetett eszköz a lehető legkisebb területen okoz sérülést az agyban. Kimutatták, hogy a lassú beültetés során, azon túl, hogy az agy nagyobb mértékben károsodik, az elektród sejteket húzhat magával az agy felszínéről, ezzel is növelve a gliasejt reakció mértékét, így rontva az elvezetés minőségét [24]. Ugyanezen tanulmány mutatta ki azt is, hogy eközben az elektród hegy alakja nincs ekkora hatással a sérülés mértékére, a hegyes és a tompa végű elektródák hasonló mértékű sérülést okoznak. Van azonban olyan tanulmány is [19], mely a nagyszámú rögzített egysejt aktivitást részben a lassú beültetés következményeként értelmezi, bár a kísérleteket fém, és nem szilícium elektródákkal végezték. Egy másik irány az agyi reakció csökkentésére a különböző bevonatok alkalmazása az elektród szilícium felületén. Ezek az anyagok többféleképpen csökkenthetik az agy válaszát. Van köztük gyulladás- illetve vérzéscsökkentő, gliasejt reakciót csillapító, a sejtek adhézióját segítő és sejtnövekedést serkentő anyag is. A sejtadhéziót segítő polipeptid láncokat, mint az IKVAV (izoleucin-lizin-valin-alanin-valin) vagy az RGDS (arginin-glicin-aszpartát17
szerin) láncokat legtöbbször még csak sejtkultúrában vizsgálták [25], igen kevés az invivo adat velük kapcsolatban. Más kísérletek alapján, melyek a vérzéscsökkentő (dextrán) és gliasejt reakciót csillapító (hialuronsav, dexametazon) bevonatokat vizsgálták [23], ezek az anyagok csak kis részben vagy egyáltalán nem változtatják az agynak a beültetésre adott válaszát. Ez a kis változás ráadásul csak az akut válaszban figyelhető meg, a krónikus választ egyáltalán nem befolyásolja.
6.5
Szilícium elektródák krónikus beültetése Kiemelkedően fontos kérdés az elektródák krónikus felhasználhatósága,
elsősorban a bevezetőben említett agy-gép interfészek majdani megvalósításának szempontjából. Az eddigi vizsgálatok alapján a szilícium elektródák megbízhatatlanul viselkednek krónikus beültetések során. Több esetben számoltak be hosszú távú, jó minőségű elvezetésekről [1, 26], de legalább ennyiszer sikertelen krónikus kísérletekről is, sőt, egy kísérleten belül is jelentősen változhat az egyes beültetések sikeressége [17]. A már említett Utah és Michigan elektródákkal is végeztek krónikus beültetéseket. A Utah elektródáról kimutatták, hogy akár 13 hónapig is működőképes maradhat macska agykéregbe ültetve [1]. Ugyanakkor azt is tapasztalták ebben a kísérletben, hogy a szöveti reakció hatására az elektróda folyamatosan lökődött ki az agyból, így nem tudtak stabil, azonos sejtekből származó jeleket rögzíteni. Egy elektródát kivéve minden esetben megfigyelhető volt az is, hogy a reaktív szövetbe betokozódott az elektróda. Ez a heves szöveti reakció hátrányosan érintette az elektródák elvezetési képességét. A Michigan elektródák krónikus beültetéskor több mint egy évig működőképesek maradhatnak patkány hallókéregbe ültetve [26]. Ugyanakkor a Michigan elektróda esetében is tapasztalták
a
Utah
elektródánál
megfigyelt
szöveti
reakciót.
Összefoglalva,
megállapítható, hogy a szilícium alapú elektródák alkalmasak lehetnek hosszú távú krónikus beültetésre, de a szöveti reakció mindenképpen egy olyan probléma, amelyre az elektródatervezési, gyártási és beültetési módszerek fejlesztésével megoldást kell találni a jövőben.
6.6
Az elektródák impedanciája
6.6.1
Az elektród impedancia jelentősége
Ahogyan azt az elvezető rendszer jellemzésében írtam, az impedanciának jelentős szerepe van a jelátvitel minőségében. Ez egyrészt a jelerősség gyengülésében, másrészt a zaj amplitúdó növekedésében, végül pedig a fázistolásban nyilvánul meg [3]. A jelerősség
18
gyengülése nehezebbé teheti az értékes jel megkülönböztetését a háttérzajtól, mely komoly problémát okozhat például sejtválogatás során. A zaj amplitúdójának növekedése, amellett, hogy az előbb említett jel elkülönítést tovább nehezíti, akár teljesen tönkre is teheti az elvezetést. Az elvezetett jel ugyanis egy analóg-digitális átalakítón keresztül jut a számítógépbe, melynek korlátozott a kimeneti tartománya, azaz az átalakító legnagyobb kimenő feszültsége maximált. Ennek következtében az átalakító egy bizonyos bemenő feszültséget meghaladó értékekhez ugyanazt a maximális kimenő értéket fogja rendelni. Ha az elektróda zaja túl nagy, az átalakítóba érkező analóg jel könnyen elérheti ezt a maximális értéket, értékelhetetlenné téve a rögzített jelet. A fázistolás a rögzített jel fázisát változtatja meg az eredeti jelhez képest, mely akár hibás következtetések levonásához is vezethet. A jelerősség, a zaj és a fázistolás mértéke is az elektróda effektív impedanciájától függenek, ezért fontos, hogy az elektróda impedanciája minél kisebb legyen. A fázistolás azonban nem egyenlő mértékű különböző frekvenciáknál, az alacsonyabb frekvenciákon jobban hat, így az alacsony frekvenciás elvezetéseknél különösen fontos az elektróda impedanciájának mértéke. Ez motiválta a kutatókat, hogy különböző módszereket találjanak az elektródák impedanciáinak csökkentésére.
6.6.2
Az impedancia csökkentésének lehetőségei
Az impedancia jelentősen csökkenthető az elektróda felületének növelésével, melyre többféle lehetőség is van. Az egyik lehetőség az elektródák különböző bevonatokkal történő ellátása. A már említett kísérletek [23], melyek a szilícium elektródák biokompatibilitásának növelését vizsgálták, az alkalmazott bevonatokkal az elektródák felületét is növelték, ezzel csökkentve impedanciájukat. Ezeken az anyagokon túl alkalmaztak PEDOT [7]és szén-nanocső bevonatot [6] is kísérletekben. A bevonatokon kívül a gyártási módszerek megfelelő megválasztásával is elérhető, hogy az elektróda felülete megfelelően nagy legyen. Ez azért is előnyös, mert így nem kell tartani attól, hogy a bevonat leválik az elektróda felületéről, hátrányosan befolyásolva az eszköz elvezetési tulajdonságait. Egy esetben például [27] olyan elektrokémiai technikával alakították ki az arany elvezetési kontaktusokat a poliimid elektródán, amellyel több, mint 11%-kal tudták növelni a kontaktus felületét, így javítva az elektróda elvezetési tulajdonságait.
19
7
Módszerek A vizsgálatokat patkányokról elvezetett jeleken végeztem, melyek hallókérgébe
elektródákat ültettünk. A műtéteket akut kísérletek esetén részben a PPKE ITK elektrofiziológiai laboratóriumában, részben az MTA Pszichológiai Kutatóintézetének Összehasonlító Pszichofiziológiai Laboratóriumában végeztük. A krónikus beültetések, majd a krónikusan beültetett elektródákról az elvezetések minden esetben az MTA Pszichológiai Kutatóintézetének Összehasonlító Pszichofiziológiai Laboratóriumában történtek.
7.1
Krónikus és akut elvezetések A krónikus beültetések ketamin-xylazin altatásban (0,2 ml 100 grammonként)
zajlottak. A patkányok feje sztereotaxiás célzókészülékbe lett befogva, hogy biztosan rögzítve legyen, és hogy a patkány agy atlasz koordinátái alapján pontosan megtalálhassuk a kívánt agyterületet, esetünkben a hallókérget. A fejbőr eltávolítása után az agy atlasz segítségével mértük ki a koponya felnyitásának helyét, majd fogorvosi fúróval felnyitottuk azt úgy, hogy az agyat borító agyhártya, a dura mater ne sérüljön meg. Ezek után az elvezetéshez használt elektródát az agy atlasz segítségével kimért ponton fokozatosan az agyba helyeztük. A krónikus elvezetésekhez rétegelektródot és fém tüske elektródákat használtunk. A rétegelektródon összesen 18 elvezetési pont (kontaktus) található. Az elektróda belsejében 18 poliimid szigetelt platina-irídium drót fut, ezek átmetszett része adja az elvezetési kontaktust. Az elektróda vastagsága 350 mikrométer, a drótok vastagsága 25 mikrométer, az elvezetési kontaktusok pedig 100 mikrométer távolságra vannak egymástól. Összesen 24 csatornán vezettünk el, az első 18 csatornán a réteg elektróda, a 19. és 20. csatornán a bal oldali hippocampus, a 21. csatornán a bal oldali hallókéreg felszínéről, a 22. csatornán a jobb oldali motoros kéreg felszínéről elvezetett jelet, a 23. csatornán nyaki izomaktivitást mértünk. A 24. csatornán a kiadott hangingert rögzítettük, hogy a kiváltott válaszok időzítését pontosan meghatározhassuk. A beültetés során folyamatosan monitoroztuk az agyi aktivitást, hogy az elektródák helyét pontosan meg tudjuk határozni. A Dr. Ulbert István által LabView rendszerben kifejlesztett szoftverrel időnként elvezettünk az agyi struktúrából, ahol éppen jártunk az elektródával, és kiértékeltük, hogy valóban jó helyen járunk-e. A megfelelő helyen lévő elektródokat akriláttal rögzítettük. A műtétet 5-6 nap lábadozási időszak követte, ezután következtek a kísérletek. A jeleket 16 bites A/D konverterrel, változó, de a legtöbb esetben 20 kHz-es mintavételi frekvenciával rögzítettük. Az akut elvezetések ketamin-xylazin altatásban (0,2 ml 100 grammonként) történtek. A műtétek menete megegyezett a krónikus beültetéseknél 20
leírtakkal, de az elektródákat nem rögzítettük akriláttal. A beültetett elektródák is hasonlóak voltak a krónikus esetben ismertetetthez. Az agyi elektromos tevékenységet ebben az esetben is 16 bites A/D kártyával rögzítettük, 10 illetve 20 kHz-es mintavételi frekvenciával.
7.2
Adatelemzési módszerek Az elvezetett jeleket a Neuroscan Edit programcsomaggal és a laborban fejlesztett,
Matlab alapú két programcsomaggal, a Multiple Channel Frequency Analyserrel (MCFA) és a Wave Solutionnel elemeztem. A rögzített adatok egy ún. CNT fájlba kerültek, amely egy folytonos adatfájl, és a rögzített sokcsatornás jelet tartalmazza. A Neuroscan Edit programmal dolgozhatjuk fel az adatfájlt. Először megszűrtem a rögzített jelet, két sávon. A lokális mezőpotenciálokat (local field potential, LFP) 0.3 Hz és 50 Hz közötti, nulla fázistolású, 24 dB/dekád meredekségű sávszűréssel kaptam, a soksejt aktivitást (multiunit activity, MUA), pedig 500 Hz és 5000 Hz között, szintén nulla fázistolású és 24 dB/dekád meredekségű szűrőt használva szűrtem ki az eredeti adatfájlból. A mezőpotenciálok elemzéséhez a szűrt CNT fájlból létrehoztam egy EEG fájlt, amely az adatokat időablakokban (epochokban) tárolja. Ezek az időablakok az eseményhez, ebben az esetben hangingerhez illetve a down state kezdetéhez kötöttek, és megadható, hogy az esemény előtt és után milyen hosszú ideig legyen az aktivitás tárolva. Az EEG adatokat ezután átlagoltam, a program az átlag fájlba az egyes csatornák átlag aktivitását tárolja. Ezek után az átlagokat csatornánként és mérésenként is összehasonlíthatjuk. Én mérésenként egy-két jellemző csatornát kiválasztva hasonlítottam össze a mérési eredményeket. Az időfrekvencia diagramokat az MCFA programmal készítettem el. A harmadik program, amelyet a mezőpotenciálok elemzéséhez használtam, a Wave Solution. Ez a program, ahogyan az MCFA is, alkalmas CNT, EEG és AVG fájlok megjelenítésére, többféle elemzést tud végrehajtani az adatokon, ezen kívül a spontán elvezetett jelekben az up és down state-ek megállapítására is használható. Az up és down state-ek meghatározására többféle matematikai módszer is rendelkezésünkre áll a programban, én ezek közül a Hilbert transzformációt használtam. Egy f(t) függvény Hilbert transzformáltja a következő integrállal adható meg:
(7.1)
21
A Hilbert transzformációt az idegtudományban általában az idegsejtek tüzelésének fázisbeli különbségeinek meghatározására használják [28, 29], azonban éppen a fázisra való érzékenysége miatt alkalmas esetünkben az up és down state-ek detekciójára is. Az egyes sejtek aktivitását (single unit activity, SUA) a soksejt aktivitásból válogattam. A válogatáshoz a KlustaWin programot használtam, amely a sejtválogatáshoz a CEM algoritmust implementálja. A CEM algoritmus egy klaszterező algoritmus, amely egy maximum likelihood kritériumot maximalizál [30]. Ez a kritérium úgy van megadva, hogy mind a z partícionáló paraméter vektort, mind pedig a θ vektort maximalizálja. A θ vektor a maximum likelihood becslés paramétereit tartalmazza. Erre a két vektorra a maximum likelihood kritérium a következőképpen írható fel:
(7.2)
Ezt a kritériumot maximalizálja a CEM algoritmus, amely az EM azaz expectation (várható
érték)
–
maximization
(maximalizálás)
algoritmus
egy
klasszifikáló
(classification, C) lépéssel történő kiegészítése. Azaz az E feltételes várható érték képzés:
(7.3)
és az M maximalizálás:
(7.4)
közé
egy
C
klasszifikáló
lépés
ékelődik:
az
partícióját határozza meg a
adatok
egy
feltételes
valószínűség maximalizálásával. A CEM algoritmus egy iterációja a fenti három lépés E – C– M sorrendű végrehajtásából áll. Előnye az EM algoritmussal szemben, hogy biztosan véges számú iterációban konvergál [30]. Ezen tulajdonsága miatt implementálták a KlustaWin program készítői ezt az algoritmust, hiszen a program készítésekor fontos szempont volt a gyors futás. A klaszterező algoritmus végrehajtásához szükség van az idegsejtek tüzelésének jellemzőire. Ezekhez kétféleképpen lehet hozzájutni. A 22
legegyszerűbb mód, ha egy tüskét a legkisebb és legnagyobb amplitúdójának különbségével jellemzünk [31]. Ez azonban nem mindig szolgáltat elég információt a tüzelés jellemzőiről. A megoldást a főkomponens analízis (principal component analysis, PCA) jelenti [31, 32], amely képes a sejttüzelés több jellemzőjét is megragadni. Ezt a jel eredetileg korrelált paramétereinek lineáris kombinálásával teszi, így választva ki a korrelálatlan komponenseket. A PCA algoritmus segítségével így jobban lehet jellemezni a sejttüzelések hullámalakját. A fenti megfontolások miatt a KlustaWin program is a PCA algoritmust
használja
a
jelalakok
jellemzésére.
A
sejtválogatás
helyességének
igazolásához a DataView program segítségével kiszámítottam a sejtek tüzelésének autokorrelációját, amely jellemzi a sejt tüzelésének periodicitását. Az autokorrelációt a következő képlet alapján kaphatjuk meg: (7.5)
C = N(event) ⋅ N(event) ⋅ Bin width / Record dur A képletben C jelenti a binenkénti tüzelések számát, N(event) a teljes felvételben
található tüzelések számát, Bin width egy bin szélessége milliszekundumban, Record dur pedig a felvétel hossza, szintén milliszekundumban. Az autokorrelációt ábrázolva kapjuk az autokorrelogramot, melyet egy saját készítésű rövid Matlab kóddal készítettem el, a DataViewból exportált adatok alapján. Az autokorrelogram segítségével úgy tudjuk igazolni a sejtválogatás helyességét, hogy megvizsgáljuk a nulla időpont körüli néhány ms-ot. Itt a sejtek refrakter periódusa miatt nem szabad tüzelést látni. Ha mégis találtam itt tüzelést, folytattam a sejtválogatást, amíg a más sejtek tüzelését ki nem válogattam teljesen az adott sejt jeleiből. A multiunit jelet ezután, a mezőpotenciálhoz hasonló módon, időablakokra osztottam a kiválogatott sejt tüzelésének kezdete alapján, majd kiszámítottam az egyes sejtek tüzelésének átlagos amplitúdóját és az átlag szórását. Ezután kiválasztottam a 10 legkisebb és 10 legnagyobb amplitúdójú tüzelést, majd ezeket a szemléltetés kedvéért egy ábrára helyeztem az átlaggal és szórással. Amennyiben egy csatornán több sejtet is ki tudtam válogatni, ezek tüzelési átlagát és szórását egy közös ábrán is ábrázoltam a könnyebb összevethetőségért. A CSD és idő-frekvencia analízist használtam a rögzített lokális mezőpotenciál jelek komplex elemzésére. Az idő-frekvencia analízis megmutatja a mezőpotenciálban az egyes frekvencia komponensek teljesítményének időbeli változását. A CSD analízis az összes neuron transzmembrán áramainak az összegét adja meg egy bizonyos területen [5, 33], melyet a lokális mezőpotenciálok második deriváltjaként határoz meg.
23
8
Eredmények
8.1
A magyar fejlesztésű szilícium elektróda in-vivo karakterizációja
8.1.1
A magyar szilícium elektród jellemzői
Az elektródának 24 platina kontaktusa van, melyek szilícium szubsztrátban helyezkednek el. Az elektród szélessége 280 µm, vastagsága pedig 80 µm. A kontaktusok 30x30 µm-esek, négyzet alakúak. A 24 kontaktus egy egyenes vonalban helyezkedik el az elektródán (8.1. ábra), a kontaktusok közötti távolság 100 µm. Az elektród hegyéhez legközelebbi kontaktus 660 µm-re van a hegytől. Az elektróda nyomtatott áramköri laphoz csatlakozik, amely akut elvezetésre lett kialakítva (8.2 ábra).
8.1. ábra: A magyar szilícium elektród és a csatlakozó nyomtatott áramköri lap
8.2. ábra: A magyar szilícium elektród közelről 24
8.1.2
Az in-vivo karakterizáció
A karakterizációt patkány motoros kérgébe ültetve végeztük az MTA Pszichológiai Kutatóintézetének Összehasonlító Pszichofiziológiai Laboratóriumában. A műtéteket Grand László és Fiáth Richárd végezték el. Két elektródát, az Nr. 5-öst és az Nr. 8-ast ültették be patkány motoros kérgébe. Az elektródák beültetése mindkét esetben mikromanipulátorral történt, a dura mater felnyitása nélkül. Mindkét elektród gond nélkül áthatolt a dura materen. A karakterizáció során azt vizsgáltam, hogyan viselkedik az eszköz élő szövetbe ültetve. A jellemzéshez csak az egyik, az Nr. 5-ös elektródról származó adatokat használtam fel. Az elektródával elvezetett mezőpotenciál, soksejt aktivitás és a soksejt aktivitásból válogatott egysejt tüzelések minőségét vettem figyelembe. Mielőtt azonban az elektródát beültethettük volna, ellenőrizni kellett az impedanciájának stabilitását, amelyet 24 órás, fiziológiás sóoldatban végzett impedancia mérések sorozatával (soak test) tettem meg. A méréseket a Bak Electronics Inc. Model Easi-1 nevű eszközével végeztem. A 24 órás vizsgálat lehetővé teszi, hogy az elektróda esetleges gyártási hibáira még a beültetés előtt fény derüljön. Két elektróda (Nr. 10 és Nr. 12) 24 órás tesztje alapján megállapítható (Nr. 10-es elektród: 8.3. ábra), hogy az elektródák impedanciája stabil, nem csökken drasztikusan az idővel. Ez azt jelenti, hogy az elektróda nem ázik be, így alkalmas lehet élő szövetből való elvezetésre is.
8.3. ábra: Az Nr. 10-es elektróda 24 órás soak testjének eredménye
25
8.4. ábra: Az Nr. 5-ös elektródával rögzített lokális mezőpotenciálok egy részlete
8.5. ábra: Az Nr. 5-ös elektródával rögzített soksejt aktivitás egy részlete 26
A 8.4. ábrán az Nr 5-ös elektróddal rögzített lokális mezőpotenciálok, a 8.5. ábrán az ebből sávszűréssel kapott multiunit aktivitások egy részlete látható. Az elektródáról elvezetett jel minőségét jól jelzi a jel-zaj viszony (signal-to-noise ratio, SNR). A jel-zaj viszonyt Matlabban írt kód segítségével számítottam ki. Ez a program a következő képlet alapján számolja a jel-zaj viszonyt: (8.1)
SNR = 20 ⋅ lg(a tüzelések RMS - ének átlaga / átlagos zaj RMS ) Itt az RMS a négyzetes közepet jelenti. A rendelkezésemre bocsátott kész
programot módosítanom kellett, mert a már említett magas elektród impedancia miatt a felvett jel sok olyan szakaszt tartalmazott, amelyen a jelszint nulla volt a túl magas beérkező feszültségérték miatt. Ez azonban jelentősen befolyásolhatja a jel-zaj viszony értékét, az aktivitás átlaga ugyanis e szakaszok miatt alacsonyabb, az ez alapján számított jel-zaj viszony pedig magasabb lesz a valósnál. Ennek kiküszöbölésére készítettem egy olyan kódot, amely 10 ms-os ablakokban vizsgálja a jelet, és törli azokat az ablakokat, amelyekben ez alatt a 10 ms alatt nem változik a jel amplitúdója. A jel-zaj viszonyt ezzel a módosított programmal számítottam ki. Az legfontosabb jel-zaj viszony paramétereket a 8.1. táblázat mutatja. A 8.6. ábrán látható, hogy az elektróddal jó minőségű jelet lehetett rögzíteni. Átlagos jel-zaj viszony
5,76 dB
Legnagyobb jel-zaj viszony
9,23 dB
Legkisebb jel-zaj viszony
4,43 dB
Szórás
1,49dB 8.1. táblázat: Az Nr. 5-ös elektród jel-zaj viszony jellemzői
27
8.6. ábra: A: Az Nr. 5-ös elektród csatornánkénti jel-zaj viszonya. B: A kiemelkedő jel-zaj viszonyú csatornák lokális mezőpotenciál és soksejt aktivitása Az elektróda elvezetési tulajdonságainak további vizsgálatához a multiunit aktivitásra szűrt jelen sejtválogatást végeztem. A multiunit jelet külön megvizsgálva látszik, hogy több csatorna is rögzített egysejt aktivitást, az agy különböző területeiről. Ezt azután a válogatás igazolta is, sőt egy esetben két sejtet is találtam ugyanazon a csatornán (8.8. ábra). Itt három kiválogatott sejtet mutatok be az Nr. 5-ös elektródáról, melyek közül kettőt ugyanaz a kontaktus rögzített. A 8.2. táblázatban olvashatók a kiválasztott három sejt tüzelésének legfontosabb jellemzői. Kiemelkedő a 19/1-es sejt átlagos amplitúdója, amely jól látható a 8.7. ábrán is. A 8.8. ábra pedig a 19-es csatornán rögzített két sejt tüzelési átlagának és szórásának összehasonlítását ábrázolja. Az egyes sejtek tüzelésének
28
átlagos amplitúdóját és szórását a 8.7. ábra mutatja. A kiválogatott sejtek autokorrelogramjain (8.9. ábra) minden esetben jól látszik a már említett refrakter periódus, így ezek a jelek valóban egy sejttől származnak. Ezt igazolja az is, hogy a 10 legkisebb és 10 legnagyobb amplitúdójú jel alakja nem tér el sem az átlagtól, sem pedig egymástól. A sejtválogatás eredménye, amely a 8.10. ábrán látható, is alátámasztja ezt.
Csatorna Sejt
19
19
20
19/1
19/2
20/1
125
213
583
-69,48 µV
-25,16 µV
-34,84 µV
±7,42 µV
±2,88 µV
±4,89 µV
Jel-zaj viszony Tüzelések száma Átlagos amplitúdó Átlagos amplitúdó szórása 8.2. táblázat: A három kiválasztott sejt tüzelésének legfontosabb jellemzői
29 8.7. ábra: A három kiválasztott sejt tüzelésének átlagos amplitúdója és szórása 8.8. ábra: A 19-es csatornán rögzített két sejt átlagos jelalakja és szórása
8.9. ábra: A három kiválasztott sejt átlagos jelalakja, szórása, 10-10 legkisebb és legnagyobb amplitúdójú jelalakja, valamint autokorrelogramja.
8.10. ábra: A 19-es csatorna jele válogatás után. Piros: 19/1-es sejt, világoskék: 19/2-es sejt, zöld és sötétkék: zaj 30
Összefoglalva, jól látható, hogy több elektródával is jó minőségű lokális mezőpotenciál és multiunit jeleket tudtunk elvezetni. Az elektróda jel-zaj viszony értékeit megvizsgálva láthattuk, hogy több olyan csatorna is van, amelyen magas volt a jel-zaj viszony, ami elengedhetetlen jó minőségű jelek rögzítéséhez. A multiunit jelek vizsgálata ezután igazolta is az elvezetések jó minőségét. Az elektród impedancia értékeket megfigyelve, és összevetve ezeket az elektromos aktiválás utáni értékekkel, láthatjuk, hogy az elektród impedanciája még jelentősen csökkenthető, tovább javítva ezzel a jövőbeni elvezetések mértékét. Erre megfelelő módszer lehet a már említett elektródfelszín-növelés. Ezt a platina kontaktusok úgynevezett platina blackkel való elektrokémiai bevonásával lehetne elérni. A platina blacken túl a már említett módszerek, a PEDOT és szén nanocsöves bevonat alkalmazása is segíthet az elektród impedancia csökkentésében. Az elektróda jelenleg csak akut kísérletekre alkalmas, és akut beültetések során lett karakterizálva is. Egy újabb továbblépési pont lehet, ha alkalmassá teszik krónikus beültetésekre is, hiszen érdemes kihasználni a már látott jó elvezetési tulajdonságait. Ehhez a nyomtatott áramköri lapot, amelyhez az elektróda csatlakozik, kellene olyan méretűvé és alakúvá alakítani, hogy alkalmassá váljon krónikus kísérletekre is.
31
8.2
Patkány hallókéregről elvezetett krónikus és akut jelek elemzése
1234567891011121314151617181920212223-
+2048 µV
24400 ms
00:00:09
00:00:10
00:00:11
00:00:12
8.11. ábra: Természetes lassú hullámú alvási mezőpotenciálok hanginger adása közben (3/sec) 1234567891011121314151617181920212223-
+2048 µV
24400 ms
00:00:25
00:00:26
00:00:27
00:00:28
8.12. ábra: Ébrenléti mezőpotenciálok hanginger adása közben (3/sec) 32
8.2.1
Hallókérgi kiváltott válasz természetes lassú hullámú alvás és ébrenlét alatt
Az eredmények kiértékelése során lassú hullámú alvási és ébrenléti adatokat hasonlítottam össze. A krónikus elvezetések egy patkányból történtek, az akut kísérletek eredményei pedig két patkányból származnak. A krónikus kísérletek során 3 Hz-es hangingert játszottunk le, és az ezzel kiváltott potenciálokat vizsgáltam. A lassú hullámú alvási (8.11. ábra) és ébrenléti (8.12. ábra) szakaszokban kiváltott válaszok jelentősen eltértek egymástól. A rendelkezésemre álló kevés adat miatt egy-egy lassú hullámú alvási és ébrenléti elvezetés eredményeit ismertetem. Ébrenlétben az összesen 352 rögzített kiváltott válasz első pozitív komponensének (P1) amplitúdó maximuma átlagosan 8 ms latenciával jelentkezett (8.13. ábra), majd az első negatív (N1) komponens amplitúdó maximuma átlagosan 15 ms latenciával következett. Ezek a komponensek ugyanilyen átlagos latenciával jelentkeztek lassú hullámú alvásban is, amely során összesen 568 kiváltott választ rögzítettünk, az N1-nek azonban nagyobb volt az amplitúdója. A fő különbség a P2 komponensben jelentkezett: ébrenlétben átlagosan 32 ms latenciával a hanginger után volt észlelhető az amplitúdó maximuma, míg lassú hullámú alvásban jóval később, átlagosan 60 ms-nál. Ébrenlétben azonban a P2 komponens átlag 25 ms alatt lecsengett, míg lassú hullámú alvásban ez átlagosan 75 ms-ig tartott. Nagy különbség volt a két állapotban a P2 amplitúdója között is. Míg ébrenlétben a P2 amplitúdója átlagosan 57 µV volt, addig lassú hullámú alvásban ez átlagosan több mint 220 µV volt. Ahogyan az elméleti bevezetőben már említettem, a lassú hullámú alvásban kialakuló lassú oszcilláció során két állapot, az up és a down state váltakozik. A mezőpotenciálban a negatív szakasz felel meg az up, a pozitív szakasz pedig a down state-nek. Ez a kiváltott nagy pozitív hullám is egy ilyen down state, amikor a sejtek nem vagy csak alig tüzelnek. Ezt az állítást az elvezetett mezőpotenciálok idő-frekvencia analízisével lehet igazolni. Az ébrenlét és a lassú hullámú alvás alatt is teljesítmény növekedés látható az inger megérkezése után (8.14. ábra, A és B). A különbség a második pozitív komponens idején látható, ekkor lassú hullámú alvásban alacsony frekvencián teljesítménynövekedés, magas frekvenciákon azonban teljesítmény csökkenés figyelhető meg. Ez megfelel a hiperpolarizációs szakasznak, amikor a sejtek csendben vannak. A sejtek tüzelésének alakulását az időben a CSD térképpel is szemléltetni tudjuk. A CSD, ahogy már említettem, egy makroszkopikus képet ad a lokális membránáramokról, összegezve azokat a tér egy adott részén. Az ébrenléti és alvási CSD térképeket (8.14. ábra, C és D) összehasonlítva láthatjuk, hogy lassú hullámú alvásban az inger megérkezése után mintegy 70 ms-mal egy nagy, hosszan tartó forrás (source) alakul ki. Ez azokat a membrán áramokat jelzi, amelyek meggátolják a sejtek tüzelését a down state alatt. Mivel az elektróda mélyen az agykéregben helyezkedett el, csak a kéreg mélyebb rétegeiből felvett adatokat láthatjuk az ábrákon. 33
200.0 150.0 100.0 50.0 µV 0.0 -50.0 -100.0 -150.0 -200.0 -50.0
0.0
50.0
100.0 ms
150.0
200.0
250.0
8.13. ábra: Kiváltott válaszok átlaga lassú hullámú alvásban (piros) ébrenlétben
8.14. ábra: Kiváltott válasz idő-frekvencia és CSD diagramjai lassú hullámú alvásban és ébrenlétben. A: idő-frekvencia diagram ébrenlétben. B: idő-frekvencia diagram lassú hullámú alvásban. C: CSD diagram ébrenlétben. D: CSD diagram lassú hullámú alvásban
34
8.2.2
Természetes lassú hullámú alvás alatt kialakuló spontán down stateek és kiváltott válasz
Összehasonlítottam a természetes alvás során kialakuló spontán és kiváltott down state-eket is. Az adatok ugyanarról a patkányról származnak, de az elvezetések különböző napokon történtek. Itt is, hasonlóan az előző ponthoz, egy-egy elvezetés eredményeit ismertetem. A természetes és kiváltott down state-ek idő-frekvencia diagramjait (8.15. ábra)
megvizsgálva
látjuk egyrészt,
hogy
a kiváltó hanginger
által
okozott
teljesítménynövekedés a természetes down state-ekből természetesen hiányzik. Fontosabb azonban ennél, hogy a későbbi teljesítmény csökkenés mértéke is eltérő: nagyobb különbség figyelhető meg a kiváltott down state-ek esetén. Ez a megfigyelés, és az, hogy, egy 1035 s hosszú szakaszt vizsgálva összesen 155 spontán down state-et találtam (a már említett Hilbert transzformáció segítségével) azt sejteti, hogy a patkány hallókérgében természetes körülmények között nehezebben alakulnak ki down state-ek, mint kiváltott válaszok esetén.
8.15. ábra: Természetes lassú hullámú alvás alatt kialakuló spontán down state és kiváltott válasz idő-frekvencia diagramja. A: idő-frekvencia diagram spontán down state esetén. B: idő-frekvencia diagram kiváltott válasz esetén.
35
8.2.3
Ketamin-xylazin altatásban és természetes lassú hullámú alvásban kialakuló spontán down state-ek
A ketamin-xylazin altatásban tapasztalható lassú hullámú alvás jellemzéséhez az elemzéseket korábban rögzített, akut kísérletekből származó adatokon végeztem. Elvezetés hossza
Detektált down state-ek száma
266s
162
308s
196
1036s
155
Átlag: 537s
Átlag: 171
8.1. táblázat: Spontán down state-ek előfordulása természetes lassú hullámú
Elvezetés hossza
Detektált down state-ek száma
210s
209
308s
271
448s
357
Átlag: 322s
Átlag: 279
8.2. táblázat: Spontán down state-ek előfordulása ketamin-xylazin altatásban A 8.1. és a 8.2. táblázatban három-három krónikus (természetes lassú hullámú alvás) és akut (ketamin-xylazin altatás) elvezetés adatai láthatók. Ezek az adatok azt sugallják, hogy ketamin-xylazin altatásban több down state alakulhat ki, mint természetes lassú hullámú alvásban. A természetes alvásban és ketamin-xylazin altatásban rögzített spontán down state-ek idő-frekvencia diagramjait összehasonlítva láthatjuk, hogy nincs jelentős különbség a két ábra között. Mindkét esetben igaz, hogy míg az alacsony frekvenciák teljesítménye növekszik, addig a magas frekvenciáké csökken. Ugyanakkor a csökkenés mértéke eltérő: ketamin-xylazin altatásban nagyobb mértékű a csökkenés, mint természetes alvás alatt. A két esetben rögzített spontán down state-ek átlagait összehasonlítva is azt tapasztaljuk, hogy nincs különbség a két jelalak jellemzői között. Ezek alapján az adatok alapján úgy tűnik, hogy a természetes lassú hullámú alvás és a ketamin-xylazin altatás közötti egyik különbség a spontán kialakuló down state-ek szempontjából az, hogy az altatásban gyakrabban fordulhat elő ez a jelenség, mint természetes alvásban. A másik különbség, miszerint a teljesítménycsökkenés mértéke nagyobb ketamin-xylazin altatásban, arra utalhat, hogy ebben az esetben nagyobb mértékű
36
a sejtek gátlása a down state alatt. Mivel az elvezetett jelek mindkét esetben patkány hallókérgéből származnak, ez a megállapítás erre az agyterületre igaz.
8.16. ábra: Spontán down state-ek átlaga ketamin-xylazin altatásban (zöld) és természetes lassú hullámú alvásban (piros)
8.17. ábra: Ketamin-xylazin altatás és természetes lassú hullámú alvás alatt kialakuló spontán down state idő-frekvencia diagramja. A: idő-frekvencia diagram ketamin-xylazin altatásban. B: idő-frekvencia diagram
37
8.2.4
Hallókérgi kiváltott válasz ketamin-xylazin altatásban és természetes lassú hullámú alvásban
Összevetettem a természetes lassú hullámú alvás során és a ketamin-xylazin altatásban
tapasztalható
kiváltott
diszfacilitációkat
is.
Az
altatásban
kiváltott
diszfacilitációk átlagának idő-frekvencia diagramján jól látható a hasonlóság a természetes alvásban kiváltott diszfacilitációk átlagának idő-frekvencia diagramjával. Mindkét esetben tapasztalható teljesítménynövekedés az inger megérkeztekor, de a második pozitív komponens megérkeztekor ketamin-xylazin altatásban a teljesítménynövekedés kisebb mértékű. A kiváltott diszfacilitációk átlagait összehasonlító ábrán megfigyelhető a második pozitív komponens latenciájában érzékelhető különbség. Az ábra ebben az esetben is egy-egy krónikus és akut elvezetés átlagát ábrázolja, a további adatok is ezen elvezetésekből származnak. Láthatjuk, hogy az első negatív (N1) komponens amplitúdó maximumának átlagos latenciája természetes lassú hullámú alvásban kisebb, 15 ms, míg ketamin-xylazin altatásban ugyanezen mérőszám 28 ms-ra nő. Természetes lassú hullámú alvás alatt 568, ketamin-xylazin altatásban pedig 650 kiváltott választ rögzítettünk. Ugyanígy, a második pozitív (P2) komponens amplitúdó maximumának latenciája természetes lassú hullámú alvásban átlagosan 60 ms, míg ketamin-xylazin altatásban ez átlag 90 ms-ra nő. A kétféle kiváltott válasz CSD diagramjait összehasonlítva láthatjuk, hogy a két jelenség időbeli lefutása hasonló. A már említett source azonban, amely a sejtek tüzelését gátló membránáramokat jelzi, nagyobb természetes alvásban, mint altatásban. A két jelalak amplitúdójának jelentős eltérését minden diagramon az adja, hogy a két mérés során eltérő volt az erősítés mértéke. A CSD diagramokon látható rétegbeli eltérések oka, hogy a két kísérlet során a két elektróda a hallókérgében eltérő mélységbe lett beültetve, ezért a valóságban a kéreg azonos rétegében található source-ok és sinkek a két CSD ábrán különböző rétegekben láthatók.
8.18. ábra: Kiváltott válaszok átlaga természetes lassú hullámú alvásban (piros) és ketamin-xylazin altatásban (zöld) 38
8.19. ábra: Kiváltott válasz idő-frekvencia és CSD diagramjai természetes lassú hullámú alvásban és ketamin-xylazin altatásban. A: idő-frekvencia diagram altatásban. B: idő-frekvencia diagram természetes lassú hullámú alvásban. C: CSD diagram altatásban. D: CSD diagram természetes lassú hullámú alvásban
39
8.2.5
Patkány és macska hallókérgi kiváltott válaszának összehasonlítása
A kapott eredményeket összehasonlítottam macskában mért adatokkal [9]. Ahogy a patkánynál, úgy a macskánál is megfigyelhetők a kiváltott diszfacilitációk lassú hullámú alvásban, a latenciájuk azonban eltér. Az adatokat egy-egy patkány és macska krónikus elvezetésből nyertem. Megfigyelhető (8.20. ábra), hogy ebben az esetben mind a negatív (N1), mind a pozitív (P2) komponens átlagos latenciája kisebb a patkány esetében, mint a macskánál. Az idő-frekvencia analízis és CSD adatokat (8.21. ábra) összehasonlítva nem kaptam jelentős eltérést. Az idő-frekvencia analízisben mindkét esetben megállapítható a magas frekvenciás komponensek teljesítmény csökkenése, a CSD térképen pedig hasonlóan alakul a source-ok és sinkek időbeli változása mindkét esetben. Megjegyzendő, hogy mivel az elektróda a patkány és a macska hallókérgében eltérő mélységbe lett beültetve, ezért a valóságban a kéreg azonos rétegében található source-ok és sinkek a két CSD ábrán különböző rétegekben láthatók.
8.20. ábra: Kiváltott válaszok átlaga patkány (zöld) és macska (piros) természetes lassú hullámú alvása során
40
8.21. ábra: Kiváltott válasz idő-frekvencia és CSD diagramjai patkány és macska természetes lassú hullámú alvása során. A: idő-frekvencia diagram patkány természetes lassú hullámú alvása alatt. B: időfrekvencia diagram macska természetes lassú hullámú alvása alatt. C: CSD diagram patkány természetes lassú hullámú alvása alatt. D: CSD diagram macska természetes lassú hullámú alvása alatt
41
9
Összefoglalás A mérési eredményekből és a macskából nyert adatokkal összehasonlítva
megállapítható, hogy patkánynál is kiváltható diszfacilitáció a hallókérgen lassú hullámú (NREM) alvás során. Erre utal a kiváltott mezőpotenciálok átlagának idő-frekvencia diagramja, amely jelentős teljesítménycsökkenést mutat magas frekvenciákon, míg az alacsony frekvenciákon a teljesítmény növekszik. Az ébrenléti kiváltott potenciálokkal összevetve is látszik ez a jelentős különbség. A két állapot CSD diagramját összevetve, a sejtek tüzelését lassú hullámú alvás alatt gátló membránáramok is láthatók. A szakirodalom alapján, hallókérgen nehezen alakul ki lassú oszcilláció lassú hullámú alvás alatt. Ezt igazolják az általam megfigyelt adatok is. A detektált spontán down state-ek amplitúdója jóval kisebb, mint a kiváltott diszfacilitációk esetén. Ugyanakkor a ketaminxylazin altatásban rögzített adatokhoz képest is látható, hogy kevesebb down state alakul ki természetes lassú hullámú alvás alatt, és a gátlás is nagyobb altatásban. Ezek a megállapítások szintén összhangban vannak a szakirodalomban fellelhető eredményekkel. A kiváltott válaszokat összevetve láthatjuk, hogy bár az időbeli lefutásuk azonos, a kiváltott down state alatti gátlás mértéke nagyobb természetes alvásban. Ez is igazolja azt, a szakirodalomban fellelhető eredményt, mely szerint ketamin-xylazin altatásban hallókérgen
ritkábban
váltható
ki
diszfacilitáció,
mint
természetes
alvásban.
Összefoglalva, a mérési eredmények alapján látható, hogy a ketamin-xylazin altatásban kialakuló lassú oszcilláció eltér a természetes lassú hullámú alvás alatti lassú oszcillációtól. Ez alapján a ketamin-xylazin altatás nem feleltethető meg pontos modellként a természetes lassú hullámú alvásnak. Az eredmények konzisztensek a szakirodalom általam megismert eredményeivel. A patkány és macska adatok összehasonlítása szintén megerősíti, hogy patkány hallókérgén kiváltható diszfacilitáció természetes lassú hullámú alvás alatt. A latenciabeli eltérések a két állat esetén az eltérő méretű és bonyolultságú agykéregből adódhatnak. A magyar szilícium elektróda in-vivo karakterizációja szerint az elektróda alkalmas akut elvezetési kísérletekre. A 24 órás soak test kimutatta, hogy az elektród impedancia hosszú távon is stabil marad. Az akut beültetésekből nyert adatok alapján pedig megállapítottam, hogy az elektródával stabilan rögzíthető jó minőségű multiunit jel. Az elvezetés minőségét jellemzi egyrészt a több csatornán is mért kiemelkedő jel-zaj viszony, másrészt pedig a multiunit jelen végzett sejtválogatás eredménye. A sejtválogatási eredmények azt mutatták, hogy az elektróda képes volt egy sejt jelét stabilan jó jelszinttel rögzíteni. Az elektróda továbbfejleszthető egyrészt oly módon, hogy
42
elektrokémiai eljárásokkal csökkentve az elvezetési pontok impedanciáját, még stabilabb és jobb minőségű jel legyen rögzíthető vele. Másrészt pedig a csatlakozó nyomtatott áramköri lap átalakításával az elektróda alkalmassá tehető hosszú távú, krónikus beültetésekre is.
43
10 Köszönetnyilvánítás Köszönöm Dr. Karmos Györgynek és Dr. Ulbert Istvánnak a lehetőséget, hogy az egyetemen és az MTA Pszichológiai Intézetében a témával foglalkozhattam, hogy mindig számíthattam segítségükre, Grand László, Dombovári Balázs, Csercsa Richárd és Fiáth Richárd doktoranduszoknak a folyamatos és odafigyelő konzultáció lehetőségét, Kottra Péternek a kísérleteknél elengedhetetlen segítségét és a laborban velem együtt diplomára felkészülő évfolyamtársaimnak a jó hangulatban, inspirálón együtt töltött időt.
44
11 Irodalomjegyzék [1] P. J. Rousche and R. A. Normann, "Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex," J Neurosci Methods, vol. 82, pp. 1-15, 1998. [2] Q. Bai and K. D. Wise, "Single-unit neural recording with active microelectrode arrays," IEEE Trans Biomed Eng, vol. 48, pp. 911-920, 2001. [3] M. J. Nelson, P. Pouget, E. A. Nilsen, C. D. Patten, and J. D. Schall, "Review of signal distortion through metal microelectrode recording circuits and filters," J Neurosci Methods, vol. 169, pp. 141-157, 2008. [4] M. Steriade, "Corticothalamic resonance, states of vigilance and mentation," Neuroscience, vol. 101, pp. 243-276, 2000. [5] L. Grand and B. Dombovári, "A hallókéregből elvezetett bioelektromos aktivitás neuronális generátorainak számítógépes elemzése," OTDK dolgozat, 2006. [6] E. W. Keefer, B. R. Botterman, M. I. Romero, A. F. Rossi, and G. W. Gross, "Carbon nanotube coating improves neuronal recordings," Nature Nanontechnology, vol. 3, pp. 434-439, 2008. [7] K. A. Ludwig, J. D. Uram, J. Yang, D. C. Martin, and D. R. Kipke, "Chronic neural recordings using silicon microelectrode arrays electrochemically deposited with a poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) film," J Neural Engineering, vol. 3, pp. 5970, 2006. [8] M. Steriade, "The corticothalamic system in sleep," Frontiers in Bioscience, vol. 8, pp. 878-899, 2003. [9] M. Bazhenov and I. Timofeev, "Thalamocortical oscillations," Scholarpedia, vol. 1, p. 1319, 2006. [10]
R. W. McCarley and C. M. Sinton, "Neurobiology of sleep and wakefulness,"
Scholarpedia, vol. 3, p. 3313, 2008. [11]
M. Steriade, A. Nunez, and F. Amzica, "A novel slow (< 1 Hz) oscillation of
neocortical neurons in vivo: depolarizing and hyperpolarizing components," J Neurosci, vol. 13, pp. 3252-3265, 1993. [12]
M. Volgushev, S. Chauvette, M. Mukovski, and I. Timofeev, "Precise long-
range synchronization of activity and silence in neocortical neurons during slow-wave oscillations," J Neurosci, vol. 26, pp. 5665-5672, 2006. [13]
A. M. Thomson, D. C. West, J. Hahn, and J. Deuchars, "Single axon IPSPs
elicited in pyramidal cells by three classes of interneurons in slices of rat neocortex," J Physiol, vol. 496, pp. 81-102, 1996.
45
[14]
M. Steriade, D. A. McCormick, and T. J. Sejnowski, "Thalamocortical
oscillations in the sleeping and aroused brain," Science, vol. 262, pp. 679-685, 1993. [15]
M. V. Sanchez-Vives and D. A. McCormick, "Cellular and network
mechanisms of rhythmic recurrent activity in neocortex," Nature Neurosci, vol. 3, pp. 1027-1034, 2000. [16]
I. Timofeev, F. Grenier, Bazhenov M., T. J. Sejnowski, and M. Steriade,
"Origin of slow cortical oscillations in deafferented cortical slabs," Cerebral Cortex, vol. 10, pp. 1185-1199, 2000. [17]
V. S. Polikov, P. A. Tresco, and W. M. Reichert, "Response of brain tissue to
chronically implanted neural electrodes," J Neurosci Methods, vol. 148, pp. 1-18, 2005. [18]
W. L. C. Rutten, "Selective electrical interfaces with the nervous system," Ann
Rev Biomed Eng, vol. 4, pp. 407-452, 2002. [19]
M. A. L. Nicolelis, D. Dimitrov, J. M. Carmena, R. Crist, G. Lehew, J. D.
Kralik, and S. P. Wise, "Chronic, multisite, multielectrode recordings in macaque monkeys," Proc Natl Acad Sci USA, vol. 100, pp. 11041-11046, 2003. [20]
M. A. L. Nicolelis, A. A. Ghazanfar, B. M. Faggin, S. Votaw, and L. M. O.
Oliveira, "Reconstructing the engram: simultaneous, multisite, many single neuron recordings," Neuron, vol. 18, pp. 529-537, 1997. [21]
P. K. Campbell, K. E. Jones, R. J. Huber, K. W. Horch, and R. A. Normann,
"A silicon-based, three-dimensional neural interface: manufacturing processes for an intracortical electrode array," IEEE Trans Biomed Eng vol. 38, pp. 758-768, 1991. [22]
K. L. Drake, K. D. Wise, J. Farraye, D. J. Anderson, and S. L. Bement,
"Performance of planar multisite microprobes in recording extracellular single-unit intracortical activity," IEEE Trans Biomed Eng, vol. 35, pp. 719-732, 1988. [23]
L. Grand, L. Wittner, S. Herwik, E. Göthelid, P. Ruther, S. Oscarsson, H.
Neves, B. Dombovári, R. Csercsa, G. Karmos, and I. Ulbert, "Short and long term biocompatibility of NeuroProbes silicon probes," J Neurosci Methods, In press, 2010. [24]
C. S. Bjornsson, S. J. Oh, Y. A. Al-Kofahi, Y. J. Lim, K. L. Smith, J. N.
Turner, S. De, B. Roysam, W. Shain, and S. J. Kim, "Effects of insertion conditions on tissue strain and vascular damage during neuroprosthetic device insertion," J Neural Engineering, vol. 3, pp. 196-207, 2006. [25]
L. Kam, W. Shain, J. N. Turner, and R. Bizios, "Selective adhesion of
astrocytes to surfaces modified with immobilized peptides," Biomaterials, vol. 23, pp. 511-515, 2002. [26]
R. J. Vetter, J. C. Williams, J. F. Hetke, E. A. Nunamaker, and D. R. Kipke,
"Chronic neural recording using silicon-substrate microelectrode arrays implanted in cerebral cortex," IEEE Trans Biomed Eng, vol. 51, pp. 896-904, 2004. 46
[27]
Y. Y. Chen, H. Y. Lai, S. H. Lin, C. W. Cho, W. H. Chao, C. H. Liao, S.
Tsang, Y. F. Chen, and S. Y. Lin, "Design and fabrication of a polyimide-based microelectrode array: Application in neural recording and repeatable electrolytic lesion in rat brain," J Neurosci Methods, vol. 182, pp. 6-16, 2009. [28]
M. Le Van Quyen, J. Foucher, J. P. Lachaux, E. Rodriguez, A. Lutz, J.
Martinerie, and F. J. Varela, "Comparison of Hilbert transform and wavelet methods for the analysis of neuronal synchrony," J Neurosci Methods, vol. 111, pp. 83-98, 2001. [29]
S. Vanhatalo, J. M. Palva, M. D. Holmes, J. W. Miller, J. Voipio, and K.
Kaila, "Infraslow oscillations modulate excitability and interictal epileptic activity in the human cortex during sleep," Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 101, pp. 5053-7, Apr 6 2004. [30]
G. Celeux and G. Govaert, "A classification EM algorithm and two stochastic
versions," Stat. Data Anal., vol. 14, pp. 315-332, 1992. [31]
K. D. Harris, D. A. Henze, J. Csicsvari, H. Hirase, and G. Buzsáki, "Accuracy
of tetrode spike separation as determined by simultaneous intracellular and extracellular measurements," J Neurophysiol, vol. 84, pp. 401-414, 2000. [32]
J. Csicsvari, H. Hirase, A. Czurkó, and G. Buzsáki, "Reliability and state
dependence of pyramidal cell interneuron synapses in the hippcampus an ensemble approach in the behaving rat," Neuron, vol. 21, pp. 179-189, 1998. [33]
C. Nicholson and J. A. Freeman, "Theory of current source-density analysis
and determination of conductivity tensor for anuran cerebellum," J Neurophysiol, vol. 38, pp. 356-368, 1975.
47
