Směrnice správné laboratorní praxe pro vyšetřování nejčastějších mutací v mitochondriální DNA Pozn.: 1) Směrnice nezahrnují kritéria klinické indikace k vlastnímu molekulárně genetickému vyšetření a obecné postupy, předcházející diagnostice (izolace a uchovávání nukleových kyselin). 2) Směrnice nezahrnují indikace pro molekulárně genetickou analýzu jaderně-kódovaných genů vedoucích k mitochondriálním onemocněním. Ve většině případů jsou tyto geny analyzovány až na základě biochemického (stanovení množství a funkce OXPHOS) nebo molekulárně-genetického (mtDNA delece, deplece) vyšetření.
Mitochondrie a mitochondriální DNA Mitochondriální onemocnění přes svou klinickou a genetickou heterogenitu jsou charakterizovány poruchami funkce komplexů dýchacího řetězce, respektive systému oxidativní fosforylace (OXPHOS)[1]. Systém OXPHOS je lokalizován ve vnitřní mitochondriální membráně. Jeho 5 enzymových komplexů je tvořeno z více než 80 podjednotek, velká většina z nich je kódována jadernou DNA a do mitochondrií importována. 13 klíčových podjednotek komplexů OXPHOS je kódováno mitochondriální DNA (mtDNA), jedinou nechromozomální DNA přítomnou v lidských buňkách[2]. MtDNA je malá (16,5 kb) cirkulární molekula, v buňkách je přítomna v tisíci kopiích a vykazuje maternální dědičnost. Proteiny zodpovědné za údržbu, replikaci a expresi mtDNA jsou kódovány jaderně, defekt ve kterémkoliv z nich může vést k mitochondriálnímu onemocnění[3, 4]. MtDNA – heteroplazmie, threshold a segregace Přítomnost tisíců molekul mtDNA v buňkách hraje důležitou roli v projevu patogenních mtDNA mutací na úrovni fenotypu, jak biochemického, tak i klinického. Homoplazmie je stav, kdy jsou všechny molekuly mtDNA v buňce identické. Naproti tomu, většina pacientů nesoucích patogenní mutaci v mtDNA mají ve svých buňkách směs mutovaných a nemutovaných (normálních) molekul mtDNA, stav označovaný jako heteroplazmie. K projevům heteroplazmické mutace dojde tehdy, pokud množství mutovaných molekul mtDNA v buňce přesáhne určitou prahovou hodnotu (threshold). V průběhu buněčného dělení jsou mutované a normální molekuly mtDNA pravděpodobně rozděleny náhodně do dceřiných buněk. Náhodná segregace vede k různým hladinám heteroplazmie mezi jednotlivými buňkami, tkáněmi a jednotlivci, což následně ovlivňuje fenotypové projevy mitochondriální onemocnění a jeho dědičnost. V post-mitotických tkáních (např. kosterní sval, bývá často i klinicky postižený) dochází k akumulaci mutovaných molekul mtDNA (vyšší hladina heteroplazmie), proto je DNA z těchto tkání preferována pro diagnostiku některých mutací v mtDNA, ačkoli řadu mutací lze spolehlivě detekovat i v krvi. Klinické projevy onemocnění způsobených mutacemi mtDNA Přestože mitochondriální onemocnění představují klinicky heterogenní skupinu onemocnění, existuje řada dobře definovaných mitochondriálních 5.3.2009
Strana 1 (celkem 8)
syndromů charakterizovaných konkrétními klinickými projevy. Mezi nejznámější syndromy patří chronická progresivní externí oftalmoplegie (CPEO), Kearns-Sayreův syndrom (KSS) – externí oftalmoplegie, ptóza a rozsáhlé přestavby mtDNA (jednoduché nebo násobné). Mitochondriální encefalomyopatie s laktátovou acidózou a iktu podobnými příhodami (MELAS syndrom), myoklonická epilepsie s „ragged-red“ svalovými vlákny (MERRF syndrom) a neurogenní svalová slabost, ataxie a retinitispigmentosa (NARP syndrom) jsou spojovány s bodovými mutacemi v mtDNA (3243A>G, 8344A>G a 8993T>G,C). Dalším častým mitochondriálním onemocněním, diagnostikovaným obvykle oftalmology, je Leberova hereditární optická neuropatie (LHON syndrom) je způsobena bodovými mutacemi v mtDNA (3460G>A, 11778G>A nebo 14484T>C). Laboratorní diagnostika mitochondriálních onemocnění Stanovení diagnózy mitochondriálního onemocnění vyžaduje kombinaci informací z řady vyšetření. Vedle klinických údajů jsou to výsledky specifických analýz: histochemické vyšetření svalové biopsie, biochemické stanovení aktivit komplexů dýchacího řetězce a jejich složení a molekulárně-genetické vyšetření. V ideálním případě by klinická, biochemická a histochemická data měla nasměrovat molekulárně genetické vyšetření, ať už zahrnující analýzu mtDNA nebo genů lokalizovaných na jaderné DNA. Výše uvedené mutace v mtDNA jsou však vyšetřovány často jako první bez ohledu na výsledky biochemických vyšetření jenom na základě klinických projevů, screeningově jsou tyto mutace vyšetřovány v krvi.
Diagnostika Pozn.: Jsou uvedeny metody, které jsou rutinně používány v Laboratoři pro studium mitochondriálních poruch, KDDL 1.LF UK a VFN v Praze. Sekvenování mtDNA není popsáno neboť nepatří mezi rutinní vyšetření, je indikováno až po detailním biochemickém vyšetření a vyloučení častých mutací v mtDNA. Přestože i pro diagnostiku mutací v mtDNA jsou zaváděny nové metody, uvedené postupy jsou stále používány v bežném screeningu v řadě evropských laboratoří.
Mutace 3243A>G v mtDNA Tkáň vhodná k zachycení mutace:
krev(*), močový sediment(**), sval(***) OMIM: *590050 (klinické projevy spojené s mutací), #54000 (syndrom MELAS – další mutace, nebývají součástí screeningu) Metoda: PCR-RFLP Amplifikace úseku mtDNA od 3135 do 3562. Sekvence primerů: F 5´AGGACAAGAGAAATAAGGC 3´ R 5´TAGAAGAGCGATGGTGAGAG 3´ Podmínky PCR reakce: 30 x (95°C 10 sec, 58°C 15 sec, 72°C 45 sec), konečná elongace 72°C 5 min. PCR produkt o délce 428 bp je štěpen restrikčním enzymem ApaI. Jeli mutace přítomna, dojde k rozštěpení části (heteroplazmie) PCR produktu na fragmenty o délce 308 a 120 bp. Produkty jsou rozděleny ve 2,5% agarózovém gelu, obarveny etidiumbromidem a 5.3.2009
Strana 2 (celkem 8)
vizualizovány pod UV světlem. S vyšetřovanými pacienty je vyšetřována vždy i pozitivní a negativní kontrola. V případě pozitivního nálezu je stanovena hladina heteroplazmie (množství mutovaných mtDNA molekul). Do posledního cyklu PCR reakce je přidán 1μl 20x ředěného izotopu [α32P-dCTP](Amersham Biosciences, kat. č. A0005-250μCi). Následuje restrikce enzymem ApaI a separace restrikčních fragmentů na 8% vertikálním polakrylamidovém gelu v 1xTBE. Po vysušení je gel exponován přes noc v kazetě Storage Phosphor Screen (Molecular Dynamics). Následuje analýza pomocí PhosphorImageru, programem ImageQuant (Amersham Biosciences). Hladina heteroplazmie je stanovena jako intenzita rozštěpených fragmentů k intenzitě nerozštěpeného produktu. Na gelu je vždy přítomna pozitivní i negativní kontrola. Pozn. Radioaktivní značení je v některých laboratořích nahrazováno fluorescenčním a restrikční fragmenty jsou separovány kapilární elektroforézou a detekovány laserem. Od jara 2009 je v Laboratoři pro studium mitochondriálních poruch nově záváděna metoda detekce heteroplazmické mutace 3243A>G pomocí real-time PCR s využitím TaqMan sond.
Interpretace: V případě pozitivního nálezu je vždy uvedena hladina heteroplazmie ve vyšetřované tkáni. K prognóze onemocnění však nemůže být použita, doposud nebyla jednoznačně prokázána souvislost mezi hladinou heteroplazmie v jednotlivých tkáních a závažností klinických projevů. Mutace 8344A>G Tkáň vhodná k zachycení mutace: krev(**), sval(***) OMIM: *590060 (klinické projevy spojené s mutací), #545000 (syndrom MERRF) Metoda: PCR-RFLP Amplifikace úseku mtDNA od 8278 bp do 8385 bp. Sekvence primerů: F 5´CTACCCCCTCTAGAGCCCAC 3´ R 5´GTAGTATTTAGTTGGGGCATTTCACTGTAAAGC*C*GTGTTGG 3´ Podmínky PCR reakce: počáteční denaturace 95°C 2 min, 30 x (94°C 20 sec, 62°C 15 sec, 72°C 20 sec), konečná elongace 72°C 5 min. PCR produkt o délce 108 bp je štěpen restrikčním enzymem BglI. Je-li mutace přítomna, dojde k rozštěpení části (heteroplazmie) PCR produktu na fragmenty o délce 73 a 35 bp. Restrikční fragmenty jsou separovány v 3,5% agarózovém gelu, obarveny etidiumbromidem a vizualizovány pod UV světlem. S vyšetřovanými pacienty je vyšetřována vždy i pozitivní a negativní kontrola. V případě pozitivního nálezu je stanovena hladina heteroplazmie (množství mutovaných mtDNA molekul). Do posledního cyklu PCR reakce je přidán 1μl 20x ředěného izotopu [α32P-dCTP](Amersham Biosciences, kat. č. A0005-250μCi). Následuje restrikce enzymem BglI a separace restrikčních fragmentů na 10% vertikálním polakrylamidovém gelu v 1xTBE. Po vysušení je gel exponován přes noc v kazetě Storage Phosphor Screen (Molecular Dynamics). Následuje analýza pomocí PhosphorImageru, programem ImageQuant (Amersham Biosciences). Hladina heteroplazmie je stanovena jako intenzita rozštěpených 5.3.2009
Strana 3 (celkem 8)
fragmentů k intenzitě nerozštěpeného produktu. Na gelu je vždy přítomna pozitivní i negativní kontrola. Interpretace: V případě pozitivního nálezu je vždy uvedena hladina heteroplazmie ve vyšetřované tkáni. K prognóze onemocnění však nemůže být použita, doposud nebyla jednoznačně prokázána souvislost mezi hladinou heteroplazmie v jednotlivých tkáních a závažností klinických projevů. Mutace 8993T>G,C Tkáň vhodná k zachycení mutace: krev(***), sval(***) OMIM: *516060 (klinické projevy spojené s mutací), #551500 (syndrom NARP) Metoda: PCR-RFLP Amplifikace úseku mtDNA od 8798 bp do 9086 bp. Sekvence primerů: F 5´ CATTTACACCAACCACCCAAC 3´ R 5´ GGAAGGTTAATGGTTGATATTGC 3´. Podmínky PCR reakce: počáteční denaturace 95°C 2 min, 29 x (95°C 30 sec, 58°C 20 sec, 72°C 40 sec), konečná elongace 72°C 2 min. PCR produkt o velikosti 289 bp je štěpen restrikčním enzymem HpaII. Je-li přítomna mutace (G nebo C), dojde k rozštěpení většiny (bývá vysoká hladina heteroplazmie) PCR produktu na fragmenty o velikosti 194 a 95 bp. Pro rozlišení o jakou variantu mutace se jedná (G nebo C), je PCR produkt štěpen restrikčním enzymem AvaI. Je-li přítomna varianta G, dojde k rozštěpení PCR produktu na fragmenty o velikosti 193 a 96 bp. Variantu C enzym AvaI neštěpí. Restrikční fragmenty jsou separovány na 3,5% agaróze, obarveny etidiumbromidem a vizualizovány pod UV světlem. S vyšetřovanými pacienty je vyšetřována vždy i pozitivní a negativní kontrola. V případě pozitivního nálezu je stanovena hladina heteroplazmie (množství mutovaných mtDNA molekul). Do posledního cyklu PCR reakce je přidán 1μl 20x ředěného izotopu [α32P-dCTP](Amersham Biosciences, kat. č. A0005-250μCi). Následuje restrikce enzymem HpaII a separace restrikčních fragmentů na 10% vertikálním polakrylamidovém gelu v 1xTBE. Po vysušení je gel exponován přes noc v kazetě Storage Phosphor Screen (Molecular Dynamics). Následuje analýza pomocí PhosphorImageru, programem ImageQuant (Amersham Biosciences). Hladina heteroplazmie je stanovena jako intenzita rozštěpených fragmentů k intenzitě nerozštěpeného produktu. Na gelu je vždy přítomna pozitivní i negativní kontrola. Interpretace: V případě pozitivního nálezu je vždy uvedena hladina heteroplazmie ve vyšetřované tkáni. Hladina heteroplazmie bývá většinou velmi vysoká i v DNA izolované z krve, byla pozorována korelace mezi hladinou heteroplazmie a závažností klinických projevů onemocnění.
5.3.2009
Strana 4 (celkem 8)
Mutace 3460G>A, 11778G>A a 14484T>C – Leberova hereditární optická neuropatie Tkáň vhodná k zachycení mutace: krev(***) OMIM: #535000 (syndrom LHON, vyšetřují se pouze 3 nejčastější mutace) Metoda: PCR-RFLP Mutace 3460G>A: Amplifikace mtDNA v úseku od 3130 do 3557 bp. Sekvence primerů F 5´AGGACAAGAGAAATAAGGC 3´ R 5´TAGAAGAGCGATGGTGAGAG 3´. Podmínky PCR reakce: 29x(95°C 10 sec, 58°C 15 sec, 72°C 30 sec), konečná elongace 72°C 5 min. PCR produkt o délce 428 bp je štěpen restrikčním enzymem BsaHI. Je-li mutace přítomna, PCR produkt se neštěpí. V nepřítomnosti mutace dochází k jeho rozštěpení na fragmenty o velikosti 329 a 99 bp. Produkty jsou rozděleny ve 2,5% agarózovém gelu, obarveny etidiumbromidem a vizualizovány pod UV světlem. S vyšetřovanými pacienty je vyšetřována vždy i pozitivní a negativní kontrola. V případě pozitivního nálezu je stanovena hladina heteroplazmie (množství mutovaných mtDNA molekul). Do posledního cyklu PCR reakce je přidán 1μl 20x ředěného izotopu [α32P-dCTP](Amersham Biosciences, kat. č. A0005-250μCi). Následuje restrikce enzymem BsaHI a separace restrikčních fragmentů na 8% vertikálním polakrylamidovém gelu v 1xTBE. Po vysušení je gel exponován přes noc v kazetě Storage Phosphor Screen (Molecular Dynamics). Následuje analýza pomocí PhosphorImageru, programem ImageQuant (Amersham Biosciences). Hladina heteroplazmie je stanovena jako intenzita nerozštěpeného produktu k intenzitě rozštěpených fragmentů. Na gelu je vždy přítomna pozitivní i negativní kontrola. Mutace 11778G>A: Amplifikace oblasti mtDNA od 11682 do 11854 bp. Sekvence primerů: F 5´GCTTCACCGGCGCAGTCATTCTC 3´ R 5´AGCGAGGCTTGCTAGAAGTCATC 3´. Podmínky PCR reakce: počáteční denaturace 95°C 2 min, 33x(95°C 15 sec, 66°C 25 sec, 72°C 15 sec), konečná elongace 72°C 5 min. PCR produkt o délce 174 bp je štěpen restrikčním enzymem MaeIII. Je-li mutace přítomna, PCR produkt se rozštěpí na fragmenty o velikosti 94 bp a 80 bp. V nepřítomnosti mutace se PCR produkt neštěpí. Produkty jsou rozděleny ve 3,5% agarózovém gelu, obarveny etidiumbromidem a vizualizovány pod UV světlem. S vyšetřovanými pacienty je vyšetřována vždy i pozitivní a negativní kontrola. V případě nálezu mutace je stanovena hladina heteroplazmie. K jejímu stanovení se využívá restrikčního enzymu AciI, protože enzym MaeIII neštěpí úplně všechny mutované molekuly mtDNA. Amplifikace mtDNA v oblasti od 11752 do 11854 bp. Sekvence primerů: F 5´CTCAAACTACGAACGCACTCACAGC*C 3´ R 5´ AGCGAGGCTTGCTAGAAGTCATC 3´.
5.3.2009
Strana 5 (celkem 8)
Podmínky PCR reakce: počáteční denaturace 95°C 2 min, 33x(95°C 15 sec, 66°C 25 sec, 72°C 15 sec), konečná elongace 72°C 5 min. Do posledního cyklu PCR reakce je přidán 1μl 20x ředěného izotopu [α32P-dCTP](Amersham Biosciences, kat. č. A0005-250μCi). PCR produkt o délce 104 bp je štěpen restrikčním enzymem AciI. Je-li mutace přítomna, PCR produkt se neštěpí. V nepřítomnosti mutace dochází k jeho rozštěpení na fragmenty o velikosti 78 a 26 bp. Restrikční fragmenty jsou separovány na 10% vertikálním polakrylamidovém gelu v 1xTBE. Po vysušení je gel exponován přes noc v kazetě Storage Phosphor Screen (Molecular Dynamics). Následuje analýza pomocí PhosphorImageru, programem ImageQuant (Amersham Biosciences). Hladina heteroplazmie je stanovena jako intenzita nerozštěpeného produktu k intenzitě rozštěpených fragmentů. Na gelu je vždy přítomna pozitivní i negativní kontrola. Mutace 14484T>C: Amplifikace mtDNA v úseku od 14260 do 14510 bp. Sekvence primerů: F 5´ ATCCTCCCGAATCAACCCTGA 3´ R 5´ TTTTTTTAATTTATTTAGGGGGC*C*TG 3´ Podmínky PCR reakce: 29x(95°C 10 sec, 45°C 15 sec, 72°C 30 sec) , konečná elongace 72°C 5 min. PCR produkt o délce 250 bp je štěpen restrikčním enzymem MvaI. Jeli mutace přítomna, dojde k rozštěpení části (heteroplazmie) PCR produktu na fragmenty o délce 235 bp a 15 bp. Restrikční fragmenty jsou separovány v 3,5% agarózovém gelu, obarveny etidiumbromidem a vizualizovány pod UV světlem. S vyšetřovanými pacienty je vyšetřována vždy i pozitivní a negativní kontrola. V případě pozitivního nálezu je stanovena hladina heteroplazmie (množství mutovaných mtDNA molekul). Do posledního cyklu PCR reakce je přidán 1μl 20x ředěného izotopu [α32P-dCTP](Amersham Biosciences, kat. č. A0005-250μCi). Následuje restrikce enzymem MvaI a separace restrikčních fragmentů na 10% vertikálním polakrylamidovém gelu v 1xTBE. Po vysušení je gel exponován přes noc v kazetě Storage Phosphor Screen (Molecular Dynamics). Následuje analýza pomocí PhosphorImageru, programem ImageQuant (Amersham Biosciences). Hladina heteroplazmie je stanovena jako intenzita rozštěpených fragmentů k intenzitě nerozštěpeného produktu. Na gelu je vždy přítomna pozitivní i negativní kontrola. Interpretace: V případě pozitivního nálezu je vždy uvedena nalezená mutace a hladina její heteroplazmie ve vyšetřované tkáni. Mutace bývají většinou homoplazmické i v krvi. Detekce nejčastějších mutací pro syndrom LHON je problematická, její nález je dobré ověřit další nezávislou metodou. Od jara 2009 je v Laboratoři pro studium mitochondriálních poruch nově záváděna metoda detekce heteroplazmické mutace 11778G>A pomocí real-time PCR s využitím TaqMan sond.
5.3.2009
Strana 6 (celkem 8)
Rozsáhlé delece v mtDNA Tkáň vhodná k zachycení delece: sval (***), močový sediment (**pouze LX-PCR), krev (*pouze LX-PCR, nemusí být přítomny delece u všech pacientů s mtDNA delecemi) OMIM: #530000 (syndrom Kearns-Sayre), #557000 (Pearsonův syndrom), #157640, #609286, #603041, *605290 (progresivní externí oftalmoplegie) Metoda: Southern blot Celková DNA je štěpena restrikčním enzymem PvuII nebo BamHI, což vede k její linearizaci. Po elektroforetické separaci na 0,8% agaróze je přenesena na nylonovou membránu a hybridizována se sondou specifickou ke kontrolní oblasti mtDNA (často je používaná i sonda specifická pro celou molekulu mtDNA). Značení sondy pomocí [α32P]dCTP probíhá v průběhu PCR reakce. Na membráně je vždy přítomna pozitivní a negativní kontrola. Jsou-li ve vyšetřovaném vzorku přítomny deletované molekuly mtDNA, na membráně je patrno více signálů pro daný vzorek. Množství deletovaných molekul mtDNA se udává jako podíl intenzity signálu kratších fragmentů k intenzitě signálu o velikosti 16,5 kb. Primery: F 5´TACCATAAATACTTGACCACCTGTA 3´ R 5´GCGGGGGTTGTATTGATGAGATTAG 3´ Podmínky PCR reakce: 95°C 2 min, 30 x (95°C 10 sec, 59°C 30 sec, 72°C 1 min), konečná elongace 72°C 10 min. Interpretace: V případě pozitivního nálezu je vždy uvedena hladina heteroplazmie. Při interpretaci pozitivního nálezu je nutno si uvědomit, že delece mtDNA mohou být přítomny i v důsledku věku pacienta nebo z důvodu jiných svalových onemocnění. Tyto „sekundární“ mtDNA delece bývají detekovány pomocí Southern blotu tehdy, je-li použito větší množství DNA (cca 10 μg). Naopak negativní nález pomocí Southern blotu neznamená, že deletované molekuly mtDNA nejsou ve vzorku vůbec přítomny. Malé množství deletovaných mtDNA bývá zjištěno u pacientů s některými mutacemi v genu POLG1 (kóduje mitochondriální polymerázu gama), jejich přítomnost je vodítkem pro další vyšetření. Pro jejich vyloučení je dobré použít větší množství DNA nebo citlivější metodu. Pozn. Metoda Southern blot je v současné době v Laboratoři pro studium mitochondriálních poruch prováděna pouze u vybraných pacientů a v rámci diagnostiky je plně nahrazenametodou long-range PCR (viz níže).
Metoda: Long-range PCR (LX-PCR) Pomocí specifických primerů lokalizovaných v oblasti D-loopu nebo v genu 12S rRNA je amplifikována celá molekula mtDNA. Přítomnost dalších (kratších) PCR produktů reprezentuje deletované molekuly mtDNA ve vzorku. Metoda je vysoce citlivá a může detekovat i velmi malá množství deletovaných mtDNA, která nemusí přispívat ke klinickému fenotypu. Interpretace těchto nálezů je vždy obtížná a je nutné doplnit další vyšetření (Southern blot) nebo nález korelovat s biochemickým/klinickým nálezem. Při interpretaci nálezu LX-PCR je nutné si uvědomit, že násobné delece v mtDNA mohou vznikat důsledkem stárnutí nebo mohou být způsobeny mutacemi v genech aparátu replikace mtDNA. V takovém případě je dědičnost násobných 5.3.2009
Strana 7 (celkem 8)
mtDNA delecí autosomálně dominantní nebo recesivní a je nutné s přihlédnutím ke klinickému fenotypu a rodinné anamnéze analyzovat další, jaderně kódované geny (POLG1, PEO1, ANT1, TYMP, OPA1). K rozhodnutí zda, zjištěné delece v mtDNA jsou způsobené stárnutím nebo jsou příčinou klinického fenotypu, může pomoci intenzita PCR produktu odpovídajícího normální nedeletované molekule mtDNA. Deplece mtDNA Tkáň vhodná pro detekci sníženého množství mtDNA: sval, játra OMIM: #609560, #251880 (syndrome deplece mitochondriální DNA svalová, resp. hepatocerebrální forma), #203700 (Alpersův syndrom) Metoda: kvantitativní real-time PCR Syndrom deplece mtDNA je autosomálně recesivní onemocnění s nástupem v dětském věku a je charakterizováno výraznou ztrátou mtDNA molekul v postižené tkáni/tkáních. Množství mtDNA v tkáních se stanovuje pomocí real-time PCR, v Laboratoři pro studium mitochondriálních poruch s využitím SybrGreen a 1 páru specifických primerů pro mtDNA a 1 páru specifických primerů pro vhodný referenční jaedrný gen (GAPDH), a vyjadřuje je se jako poměr množství mtDNA a jaderného genu. Interpretace: Pro interpretaci nálezu, je nutné mít větší množství (5-10) věkově srovnatelných kontrol pro každou analyzovanou tkáň. Množství mtDNA se mění s věkem a k poměrně výrazným změnám dochází i v průběhu prvního roku života. V případě pozitivního nálezu je nezbytné analyzovat kandidátní, jaderně kódované geny (POLG1, TK2, DGUOK, RRMB2, MPV17, SUCLA2, SUCLG1). Závěr: Je nutné si uvědomit, že mutace v mtDNA mohou být přítomny v jakékoliv její části. Pro jejich úspěšnou detekci (např.pomocí sekvenování) je nutné analyzovat DNA izolovanou z postižené tkáně. Nepřítomnost jakékoli mutace v mtDNA nevylučuje mitochondriální onemocnění.
1. 2. 3. 4.
DiMauro S, Schon EA. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 2003; 348:2656-68. Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, de Bruijn MH, Coulson AR, Drouin J, Eperon IC, Nierlich DP, Roe BA, Sanger F and others. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 1981; 290:457-65. Shoubridge EA. Nuclear genetic defects of oxidative phosphorylation. Hum Mol Genet. 2001; 10:2277-84. Zeviani M, Spinazzola A, Carelli V. Nuclear genes in mitochondrial disorders. Curr Opin Genet Dev. 2003; 13:262-70.
5.3.2009
Strana 8 (celkem 8)
